1 UNIVERSIDADE ESTADUAL DO CEARÁ - UECE PRÓ-REITORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO E PESQUISA FACULDADE DE VETERINÁRIA - FAVET PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS VETERINÁRIAS - PPGCV HUDSON HENRIQUE VIEIRA CORREIA CILOSTAMIDA AFETA DE FORMA DEPENDENTE DE CONCENTRAÇÃO E TEMPO DE EXPOSIÇÃO A VIABILIDADE E A CINÉTICA DE MATURAÇÃO IN VITRO DE OÓCITOS CAPRINOS E BOVINOS FORTALEZA - CEARÁ 2014 2 HUDSON HENRIQUE VIEIRA CORREIA CILOSTAMIDA AFETA DE FORMA DEPENDENTE DE CONCENTRAÇÃO E TEMPO DE EXPOSIÇÃO A VIABILIDADE E A CINÉTICA DE MATURAÇÃO IN VITRO DE OÓCITOS CAPRINOS E BOVINOS Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias da Faculdade de Veterinária da Universidade Estadual do Ceará, como requisito parcial para a obtenção do grau de Mestre em Ciências Veterinárias. Área de Concentração: Reprodução e Sanidade Animal. Linha de Pesquisa: Reprodução e Sanidade de Pequenos Ruminantes. Orientador: Prof. Dr. José Ricardo de Figueiredo. FORTALEZA - CEARÁ 2014 3 4 5 Dedico, A minha Avó, Vera Lucia Magalhães Vieira (in memoriam) 6 AGRADECIMENTOS À Universidade Estadual do Ceará (UECE) e ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias (PPGCV) pela capacitação profissional que me proporcionaram. Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) pelo incentivo concedido na forma de bolsa de estudo, à Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES), à Rede Nordeste de Biotecnologia (Renorbio), à Financiadora de Estudos e Projetos (FINEP) e à Fundação Cearense de Apoio ao Desenvolvimento Científico e Tecnológico (FUNCAP) pelo auxílio financeiro dessa pesquisa. A Deus por estar presente me guiando, dando força, discernimento e protegendo durante todos os momentos desta caminhada. Ao meu orientador Prof. Dr. José Ricardo de Figueiredo por ter me recebido e orientado de forma competente e dedicada, sempre me fornecendo apoio acadêmico e incentivo profissional. Ao Prof. Dr. Isaac Neto por toda a sua ajuda e contribuição em meu crescimento pessoal e profissional e por ter se mostrado sempre disponível em me ajudar. Ao Prof. Dr. Claudio Cabral Campello por toda a sua ajuda de forma competente e dedicada, contribuição neste trabalho e por estar sempre disponível em me ajudar. Ao Prof. Dr. José Roberto Viana Silva por toda a sua ajuda e contribuição neste trabalho, por ter se mostrado sempre disponível em me ajudar. A Dr. Ana Beatriz Graça Duarte por ter me ensinado os primeiros passos metodológicos para a realização desse estudo. A minha equipe de trabalho Msc. Ivina Rocha Brito, Msc. Rebeca Magalhães Pedrosa Rocha, Msc. Juliana Zani, Msc. Debora Sales, Denise Querreiro, Naiza Arcanjela que me ensinaram e deram todo o suporte técnico para a realização desse trabalho. A minha “mãe, pai e madrasta profissional”, Drs. Valdevane Rocha Araújo, Luis Alberto Vieira e Carolina Maside Mielgo, a quem não tenho palavras para agradecer toda ajuda durante o período de mestrado. Agradeço muito pela atenção e ensinamentos sempre de forma carinhosa e amiga. As minhas amigas Rebeca, Laritza e Naiza por me receber em suas vidas de forma tão generosa. Agradeço pela amizade e por toda ajuda durante o tempo que estiveram no 7 laboratório. Agradeço imensamente pelo ombro amigo, pelas histórias compartilhadas, pelos risos divididos comigo. Ao Laboratório de Manipulação de Oócitos e Folículos Pré-Antrais (LAMOFOPA) da UECE, por todo o suporte oferecido para realização deste estudo. E a toda equipe LAMOFOPA que o compõe e já compôs: Profa. Dra. Ana Paula Ribeiro Rodrigues, Dr. Fabricio Sousa Martins, Dra. Ana Beatriz Graça Duarte, Dra.Carolina Maside Mielgo, Dra. Jamily Bezerra Bruno, Dr. Carlos Henrique Lobo, Dr. Anderson, Dr. Cleidson Manoel Gomes da Silva, Dra. Luciana Faustino, Dra. Giovanna Quintino Rodrigues, Dra. Adeline de Andrade, Dra. Geovania Canafístula Carvalho, Simone Vieira Castro, Gerlane Modesto, Francisco Léo, Juliana Zani, Débora Sales, Johanna Leiva, Jesús Cadenas, Nathalie Jiatsa, Allana Pessoa, Patricia, Denise Guerreiro, Naiza Arcângela, Victor Macedo, Érica Suzane, Livia Brunetti, Julian Pontes, Marcela Pinheiro Paz, Lidiane Sousa, Renato Felix da Silva, Juliana Menezes, Luana Gaudêncio, Lorena Andrade, José Arnaldo Moreira de Sousa, Alzenira de Andrade Ferreira, Adriana Maria S. Albuquerque, Sr. João e Cezar pela convivência amistosa durante todos esses anos, além de todos os conhecimentos transmitidos. A minha família, agradeço pelo apoio, carinho e compreensão durante esses anos em que estive ausente. Obrigado em especial a minha avó Vera Lucia Magalhães Vieira (in memoriam) que foi e sempre será um exemplo de vida, alegria, dedicação e força. A minha mãe Rosemeire Magalhães Vieira da Silva e ao meu Pai Carlos Henrique Correia que foram meus exemplos de vida, caráter e dedicação. A minha esposa Mônica Freitas Miranda Correia que foi a base mais sólida de sustentação que eu poderia ter e que me deu todo apoio e ombro amigo para que eu continuasse forte nesses dois anos de mestrado. Finalmente, agradeço a todos que aqui não foram citados, mas ajudaram direta ou indiretamente para que essa dissertação fosse feita. 8 RESUMO O objetivo deste estudo foi avaliar o efeito da pré-maturação in vitro com cilostamida associada à parede folicular sobre a viabilidade e a cinética de maturação nuclear de oócitos caprinos e bovinos. Complexos cumulus-oócitos foram maturados in vitro por 30 h (maturação in vitro convencional - Controle) ou submetidos à pré-maturação in vitro com cilostamida (10 e 20 µM) por 6, 12 e 18 h associados à parede folicular seguido de 24, 18 e 12 h de maturação in vitro. Os resultados mostraram que a cilostamida a 10 µM (caprinos - 6 e 18 h, bovinos - 12 e 18 h) e 20 µM (bovinos - 6, 12 e 18 h) reduziu (P < 0,05) a percentagem de oócitos viáveis em comparação ao controle. No que diz respeito à cinética de maturação, a cilostamida a 10 µM (caprinos - 6 e 18 h; bovinos -12 e 18 h) e 20 µM (caprinos - 12 e 18 h; bovinos-6 e 12 h) causou um atraso na progressão meiótica e reduziu (P < 0,05) a taxa de metafase II (MII). Por outro lado, a exposição à cilostamida a 10 µM (caprinos - 12 h, bovino - 6 h) e a 20 µM (caprinos 6 h; bovino - 18 h) mostrou taxas de MII semelhantes a do controle. Em conclusão, a cilostamida associada à parede folicular afeta de forma dependente da concentração e do tempo de exposição a porcentagem de oócitos viáveis, bem como a cinética de maturação de oócitos caprinos e bovinos. Palavras-chave: Cilostamida, Pré-maturação, Parada meiótica, Caprino, Bovino. 9 ABSTRACT The aim of this study was to evaluate the effect of in vitro pre-maturation with cilostamide associated with follicular wall on viability and nuclear maturation kinetics of caprine and bovine oocytes. Cumulus-oocyte complexes were either in vitro matured for 30 h (conventional in vitro maturation - Control) or submitted to in vitro prematuration with cilostamide (10 and 20 µM) for 6, 12 and 18 h associated with follicular wall followed by 24, 18 and 12 h of in vitro maturation. The results showed cilostamide at 10 µM (caprine - 6 and 18 h, bovine - 12 and 18 h) and 20 µM (bovine 6, 12 and 18 h) significantly reduced the percentage of viable oocytes compared to the control. Regarding to maturation kinetics, cilostamide at 10 µM (caprine - 6 and 18 h; bovine -12 and 18 h) and 20 µM (caprine - 12 and 18 h; bovine-6 and 12 h) caused a delay in the meiotic progression and significantly reduced the rate of metaphase II (MII). On the other hand, the exposure to cilostamide at 10 µM (caprine - 12 h, bovine 6 h) and 20 µM (caprine 6 h; bovine- 18 h) showed MII rates similar to the control. In conclusion, the cilostamide associated with follicular wall affected by the concentration and exposure time-dependent the percentage of viable oocytes and the kinetics of maturation of caprine and bovine oocytes. Keywords: Cilostamide, Pre-maturation, Meiosis arrest, Caprine, Bovine. 10 LISTA DE TABELAS Revisão de Literatura Tabela 1. Lista de inibidores específicos da fosfodiesterase..........................................22 Capítulo 1. Table 1. Conventional IVM (control) and IVPM of caprine and bovine oocytes. IVPM: In Vitro Pre-Maturation (cilostamide plus follicle walls). IVM: In Vitro Maturation. Cilo: Cilostamide. FW: Follicular wall……………………………………………………………………………36 Table 2. Percentages of viable caprine and bovine oocytes after IVPM with different exposure time and concentration of cilostamide. Different lowercase letters denote significant differences among the different exposure time, concentration of cilostamide and control (P<0.05)…………………………………………37 Table 3. Meiotic stages of caprine and bovine oocytes after different time points of IVM. Significant differences between different time of maturation in the same line are indicated by uppercase letters (P<0.05)……………………………………………………..………………...37 Table 4. Meiotic stages of caprine oocytes after IVPM with different exposure time and concentration of cilostamide. Significant differences between treatments in the same column are indicated by uppercase letters (P<0.05)……………………………………..………………………………...38 Table 5. Meiotic stages of bovine oocytes after IVPM with different exposure time and concentrations of cilostamide. Significant differences between treatments in the same column are indicated by uppercase letters (P<0.05)…………………………………..…………………………………...38 11 LISTA DE ABREVIATURAS ATP : Adenosina Trifosfato BSA : Bovine serum albumin (Albumina sérica bovina) °C : Graus Celsius CaCl2 : Cloreto de cálcio Calceína - AM : Calceína acetoximetil CAPES : Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior CNPq : Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico CO2 : Dióxido de Carbono COCs : Cumulus–oocyte complexes (Complexos cumulus-oócito) DNA : Deoxyribonucleic acid (Ácido desoxirribonucleico) Dr. : Doutor Dra. : Doutora EGF : Epidermal growth factor (Fator de crescimento epidermal) FSH : Hormônio Folículo Estimulante G : Gauge GH : Growth hormone (Hormônio do crescimento) GV : Germinal vesicle (Vesícula germinal) h : Horas HC : Histologia clássica ITS : Insulin, tranferrin and selenium (Insulina, transferrina e selênio) IGF-I :Insulin-like growth factor-I (Fator de crescimento semelhante à insulina - I) IVC : In vitro culture (cultivo in vitro) IVM : In vitro maturation (Maturação in vitro) kg : Quilograma LH : Luteinizing hormone (Hormônio Luteinizante) LAMOFOPA : Laboratório de Manipulação de Oócitos e Folículos Pré-Antrais M : Molar MAPK : Mitogen-activated protein kinase (Proteína quinase ativada por mitógenos) MEM : Minimal essential medium (Meio essencial mínimo) 12 MEM+ :Supplemented minimal essential medium (Meio essencial mínimo suplementado) mg : Miligrama MI : Metaphase I (Metáfase I) MII : Metaphase II (Metáfase II) min : Minutos mL : Mililitro MOIFOPA : Manipulação de Oócitos Inclusos em Folículos Ovarianos Pré-antrais mRNA : Messenger ribonucleic acid (Ácido ribonucléico mensageiro) Na+ : Íon sódio ng : Nanograma O2 : Oxigênio p < 0.05 : Probabilidade de erro menor do que 5% p. : Página PPGCV : Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias RENORBIO : Rede Nordeste de Biotecnologia RVG : Rompimento de vesícula germinal SAS : Statistical analysis system (Sistema de análise estatística) sec : Second (Segundo) SD : Standard deviation (Desvio padrão) SEM : Standard error of means (Erro padrão da média) TE : Transferência de embriões TCM-199 : Tissue culture medium (Meio de cultivo tecidual- 199) U : Unidade UECE : Universidade Estadual do Ceará VGBD : Germinal vesicle breakdown (Quebra da vesícula germinal) α-MEM : Alpha minimal essential medium (Meio essencial mínimo alfa) μg : Microgramas μL : Microlitro μm : Micrômetro µM : Micromolar % : Porcentagem ~ : Aproximadamente 13 < : Menor = : Igual > : Maior ± : Mais ou Menos ≥ : Maior ou igual SUMÁRIO 14 1 INTRODUÇÃO ............................................................................................. 14 2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ..................................................................... 16 2.1 OOGÊNESE E FOLICULOGÊNESE .............................................................. 16 2.2 COMPETÊNCIA OOCITÁRIA ....................................................................... 17 2.2.1 Maturação citoplasmática ............................................................................ 17 2.2.2 Maturação nuclear ........................................................................................ 18 2.3 CO-CULTIVO DURANTE A MATURAÇÃO IN VITRO (MIV) ................. 20 2.3.1 Co-cultivo de oócitos ................................................................................... 20 2.3.2 Co-cultivo com células somáticas ................................................................ 21 2.3.3 Co-cultivo com parede folicular e o bloqueio temporário da maturação . 21 2.4 FOSFODIESTERASES (PDES) ...................................................................... 22 2.4.1 Fosfodiesterases tipo 3 ................................................................................. 23 2.4.2 Fosfodiesterases tipo 4 ................................................................................. 24 3 JUSTIFICATIVA ............................................................................................ 25 4 HIPÓTESE CIENTÍFICA .............................................................................. 27 5 OBJETIVOS .................................................................................................... 28 5.1 OBJETIVO GERAL ......................................................................................... 28 5.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ............................................................................ 28 6 CAPÍTULO 1 ................................................................................................... 29 7 CONCLUSÃO .................................................................................................. 46 8 PERSPECTIVAS ............................................................................................. 47 9 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ........................................................... 48 14 1. INTRODUÇÃO A maturação de oócitos de mamíferos é um processo complexo que envolve a sincronização entre a maturação citoplasmática e maturação nuclear. A maturação citoplasmática consiste na reorganização das organelas intracelulares, no armazenamento de RNA, proteínas e fatores de transcrição, enquanto que a maturação nuclear envolve principalmente a segregação cromossômica (WATSON, 2007; MAO et al., 2014). Oócitos maturados in vitro apresentam uma redução na capacidade de completar a maturação citoplasmática e retomar a meiose, simultaneamente, limitando seu potencial de desenvolvimento (CHIAN et al., 2004). Esta assincronia é devido a maturação nuclear espontânea que leva a condensação da cromatina, impedindo assim a síntese de RNA e o acúmulo de várias moléculas essenciais para o desenvolvimento precoce (BILODEAU; COTÊ, 2012). A utilização de estratégias para regular o ciclo celular meiótico seria uma alternativa útil para evitar essa assincronia entre a maturação nuclear e citoplasmática. Nos últimos anos, alguns estudos têm demonstrado que o monofosfato de adenosina cíclico (AMPc) desempenha um papel fundamental na manutenção da parada meiótica em mamíferos (FIMIA; SASSONE-CORSI, 2001; CONTI et al., 2002). CONTI et al. (2002) verificaram que o aumento dos níveis intra-oocitários de AMPc é essencial para manter a parada meiótica in vitro, melhorando a sincronização entre a maturação nuclear e a citoplasmática (NOGUEIRA et al., 2003). Além disso, numerosos estudos sugerem que, durante a maturação, o bloqueio temporário pode sincronizar a maturação nuclear e citoplasmática, quer in vivo (WIERSMA et al., 1998) ou in vitro (vaca, MAYES et al, 2002; THOMAS et al., 2002; macaco JENSEN et al., 2002; camundongo, COTICCHIO et al., 2004). O mecanismo mais aceito atualmente sobre o bloqueio meiótico está diretamente relacionado a elevadas concentrações intraoocitárias de AMPc, reguladas pela atividade entre as enzimas adenilato-ciclase (AC) e as fosfodiesterases (PDE). Essas enzimas são responsáveis pela síntese e degradação de AMPc, respectivamente (FIMIA; SASSONE-CORSI, 2001; CONTI et al., 2002). Em oócitos humanos, a parada temporária da maturação nuclear com a cilostamida, um inibidor da fosfodiesterase tipo 3 (iPDE3), tem provado ser benéfica para obter a configuração do fuso meiótico e cromossomas normais após a maturação in 15 vitro (MIV), resultando na sincronização de oócitos no estágio de vesícula germinal (VG) (VANHOUTTE et al., 2007). Além disso, a utilização de iPDE3 a 10 µM por 24 h de pré-maturação aumentou as taxas de maturação nuclear sem comprometer o desenvolvimento embrionário humano (NOGUEIRA et al., 2006). Complexos cumulus oócitos (CCOs) de bovinos co-cultivados com parede folicular por 24 h mantiveram todos os seus oócitos no estágio de VG (LOOS et al., 1994). Em suínos, iPDE3 a 1µM por 24 h de pré-maturação melhorou a capacidade de desenvolvimento de oócitos maturados in vitro (DIECI et al., 2013) e aumentou as taxas de fertilização e desenvolvimento embrionários. Tendo em vista a importância do presente estudo, a revisão de literatura a seguir abordará aspectos relacionados à oogênese e foliculogênese, competência oocitária, cocultivo celular durante a MIV e o papel das enzimas fosfodiesterases (PDEs) na maturação. 16 2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 2.1 OOGÊNESE E FOLICULOGÊNESE A oogênese consiste na formação e diferenciação das células germinativas primordiais (CGP) até a formação do oócito haplóide fecundado. Este processo inicia-se antes e termina após o processo de foliculogênese (VAN DEN HURK; ZHAO, 2005). As CGP migram para a crista genital e colonizam a gônada ainda indiferenciada, onde recebem a denominação de oogônias e começam a multiplicar-se por divisões mitóticas. Posteriormente, as oogônias entram na primeira divisão meiótica e param no estádio de diplóteno, sendo chamadas de oócitos primários, os quais apresentam-se com seus núcleos em vesícula germinativa (VG) (FIGUEIREDO et al., 2008). Nessa fase, os oócitos são circundados por uma camada de células da pré-granulosa e são denominados folículos primordiais. O folículo, por sua vez, é considerado a unidade morfofuncional do ovário, cuja função é proporcionar um ambiente adequado para o crescimento e maturação do oócito, mantendo sua viabilidade (CORTVRINDT; SMITZ, 2001). A foliculogênese é um processo complexo que envolve a formação, crescimento e maturação folicular sob a ação de hormônios e fatores de crescimento. O processo de foliculogênese tem seu início com a formação dos folículos primordiais, culminando com a formação dos folículos pré-ovulatórios ou de De Graaf (FIGUEIREDO et al., 2008; VAN DEN HURK; ZHAO, 2005). Durante o seu desenvolvimento, a estrutura folicular sofre alterações devido ao crescimento oocitário, diferenciação e multiplicação das células da granulosa (HONDA et al., 2007), sendo os folículos classificados em préantrais (primordial, primário e secundário) e antrais (terciários e pré-ovulatórios) (FIGUEIREDO et al., 2008). Na maioria das espécies, os folículos pré-ovulatórios são caracterizados por apresentarem um oócito maturo no momento da ovulação. A maturação oocitária consiste em uma etapa crucial pela qual o oócito sofre modificações citoplasmáticas, completa sua primeira divisão meiótica (maturação nuclear), progredindo até a metáfase II (MEHLLMANN, 2005). Este processo é composto por inúmeras modificações estruturais e moleculares no citoplasma (maturação citoplasmática). Didaticamente, essa maturação citoplasmática pode ser subdivida em: redistribuição das organelas, dinâmica dos filamentos do citoesqueleto e maturação molecular. 17 2.2 COMPETÊNCIA OOCITÁRIA A competência oocitária é a capacidade do oócito assegurar o desenvolvimento embrionário após a fecundação. Ela é adquirida de maneira gradual e sincronizada ao longo da maturação oocitária que culmina com a configuração cromossômica em metáfase II – MII. A maturação oocitária pode ser dividida em maturação citoplasmática, nuclear e molecular. A maturação citoplasmática engloba todas as mudanças estruturais e a distribuição e organização das organelas citoplasmáticas. A maturação nuclear corresponde ao processo de reversão do primeiro bloqueio meiótico do oócito em estádio de vesícula germinal (VG) até o segundo bloqueio meiótico em estádio de MII. Já a maturação molecular corresponde ao legado de instruções acumuladas durante a fase de VG que controla tanto a maturação nuclear, quanto a citoplasmática (SIRARD, 2001). 2.2.1 Maturação Citoplasmática A maturação citoplasmática compreende as mudanças estruturais e organizacionais das organelas que ocorrem no citoplasma do oócito, iniciando no estágio de VG e culminando no estágio de MII. Ela envolve uma série de eventos complexos, incluindo a síntese de proteínas e de RNA citoplasmático. A maturação citoplasmática pode ser avaliada pela distribuição das organelas, reorganização das mitocôndrias no citoplasma, complexo de Golgi e grânulos corticais (MAO et al., 2014). No oócito imaturo de suínos, bovinos, camundongos e humanos, as mitocôndrias e o complexo de Golgi estão concentrados em torno da VG, afastando-se da região perinuclear na ruptura da vesícula germinal (RVG) e ocupando a maior parte do volume do oócito em MII (oócitos maduros) (CRAN, 1985; FAIR, 1995; MAO et al., 2014). Além disso, o número de complexos de Golgi, também aumenta com o diâmetro do oócito. Localizados um pouco mais concentrados no interior do oócito produzem grânulos corticais durante o crescimento oocitário (AUSTIN, 1956). Esses grânulos são dispersos aleatoriamente ao longo do citoplasma dos oócitos imaturos e migram para a região cortical do citoplasma durante a maturação meiótica em suínos (YOSHIDA et al., 1993) e bovinos (HOSOE; SHIOYA, 1997). Esta mudança de direção dos grânulos corticais é talvez o sinal mais facilmente observado na maturação citoplasmática. 18 As funções do reticulo endoplasmático (RE) estão relacionadas ao enovelamento de proteínas e metabolismo de lipídios, sendo o RE a principal reserva interna de íons de cálcio. O RE sofre redistribuição e mudanças estruturais durante a maturação do oócito. Em camundongos, in vivo na fase VG o RE é uniformemente distribuído ao longo do ooplasma (MANN et al., 2010), migrando para as regiões corticais em pequenos grupos ao longo do citoplasma ao atingir MII (MEHLMANN et al., 1995; KLINE, 2000; FITZHARRIS; BALTZ 2006; MAO et al., 2014). Outro aspecto que pode ser utilizado para predizer a competência citoplasmática é o diâmetro do oócito, devido ao aumento do volume citoplasmático durante o crescimento folicular. Em suínos, oócitos com diâmetro menor que 100 µm são incompetentes, porém, aqueles que atingem diâmetro igual ou superior a 110 µm possuem capacidade para alcançar a competência meiótica (MORBECK et al., 1992). Igualmente, a avaliação desse processo pode ser feita de forma indireta através dos aspectos morfológicos, tais como a expansão das células do cumulus (SANTIQUET et al., 2014). A expansão do cumulus é um mecanismo independente da maturação citoplasmática e nuclear do oócito. Entretanto, a ausência ou o pequeno número de células de cumulus afeta negativamente a taxa de desenvolvimento embrionário em bovinos (BLONDIN; SIRARD, 1995; LISLE et al., 2003). As interações entre as células do cumulus e os oócitos é, portanto, contínua e essencial para a competência ao desenvolvimento embrionário. Muitos autores consideram que a melhor forma de avaliar a maturação é dada pela submissão do oócito maduro à fecundação, clivagem e posterior desenvolvimento embrionário e fetal (KRISHER, 2004). Portanto, a maturação citoplasmática deve ser interpretada como sendo um processo de capacitação gradual (FERREIRA et al., 2009), produzindo uma estrutura fertilizável. 2.2.2 Maturação Nuclear Maturação nuclear refere-se ao processo de reversão do primeiro bloqueio meiótico do oócito em estádio de VG até o segundo bloqueio meiótico em estádio de MII. A fase de VG é mantida por vários anos no animal, sendo seu mecanismo ainda um mistério. A retomada da meiose de oócitos inclusos em folículos antrais grandes in vivo ocorre durante o pico do Hormônio Luteinizante (LH) (HYTTEL et al., 1986), 19 enquanto que se cultivados in vitro, os oócitos podem retomar espontaneamente a meiose (PINCUS; ENZMANN, 1935). O primeiro sinal de retomada da meiose é a etapa de RVG (SZOLLOSI et al., 1972). No entanto, a maturação nuclear continua a sua progressão para metáfase I (MI), sofrendo uma nova parada em MII, permanecendo assim até a fecundação. Os estágios de maturação nuclear podem ser classificados de acordo com sua configuração nuclear (LANDIM-ALVARENGA; CHOI, 1999), a saber; o estágio de VG é caracterizado pela presença de um núcleo esférico rodeado por uma membrana nuclear integra e cromatina descondensada; RVG é a fase intermediária da maturação nuclear onde ocorre a primeira retomada da meiose, havendo condensação cromossômica e a desintegração da membrana nuclear; MI é caracterizada pela presença de uma placa metafásica localizada perifericamente no ooplasma; MII ou maturação nuclear é caracterizada pela presença dos cromossomos metafásicos na periferia do ooplasma, bem como pela extrusão do primeiro corpúsculo polar. 2.2.3 Maturação Molecular Maturação molecular consiste na transcrição, estoque e processamento de RNAm que serão traduzidos em proteínas através dos ribossomos. Sendo, diretamente relacionada com os processos de maturação e subsequentes eventos celulares, tais como fertilização, formação de pró-núcleos e a fase inicial da embriogênese (CROCOMO et al., 2013). A transcrição e estoque de RNAm ocorre durante a fase de foliculogênese, período em que o núcleo encontre-se quiescente, cessando com a retomada da meiose. A maior parte de RNAm apresenta-se no ooplasma em forma inativa, após a ação de sinais específicos gerados durante a maturação, fertilização e desenvolvimento embrionário ocorre o início da tradução do RNAm. Assim, o sucesso do armazenamento e reativação do RNAm, determina a competência do oócito para suportar seus posteriores estágios de desenvolvimento (GOTTARDI; MINGOTI, 2009). 20 2.3 CO-CULTIVO DURANTE A MATURAÇÃO IN VITRO (MIV) Conforme mencionado anteriormente é bem conhecido que os oócitos necessitam atingir a maturação citoplasmática, bem como a maturação nuclear para se tornarem capazes de assegurar a fecundação e o desenvolvimento do embrião (MERMILLOD et al., 1999; TROUNSON; PERA, 2001). Com o intuito de melhorar ainda mais as taxas de MIV, diferentes tipos celulares têm sido utilizados para enriquecer os meios de cultivo in vitro. Oócitos suínos, humanos e de camundongos já foram maturados in vitro utilizando células do próprio folículo ovariano (células da granulosa ou da teca) (CASILLAS et al., 2014) ou de outros tecidos, tais como células do oviduto (CHAN et al., 2013), células endoteliais e fibroblastos (KARIMPOUR MALEKSHAH et al., 2014), ou mesmo o próprio oócito (SUDIMAN et al., 2014). Maiores detalhes sobre esses sistemas de co-cultivo serão descritos a seguir. 2.3.1 Co-cultivo de oócitos O crescimento e o desenvolvimento durante a fase antral são dependentes do contato íntimo dos oócitos com as células do cumulus, as quais desempenham uma função crucial na secreção de fatores de crescimento, regulando a comunicação bidirecional entre ambos (GILCHRIST et al., 2008). Dentre esses fatores, podemos citar o fator de crescimento e diferenciação 9 (GDF-9) e proteína morfogenética óssea 15 (BMP-15), os quais são membros da superfamília TGF-β e na maioria das espécies são encontrados exclusivamente no oócito (CRAWFORD; MCNATTY, 2012). Estudos têm demonstrado que fatores secretados pelo próprio oócito aumentam a capacidade de desenvolvimento de complexos cumulus-oócitos (CCOs) bovinos obtidos a partir de ovários de matadouros (HUSSEIN et al., 2006). VANDERHYDEN (1993) demonstrou que a regulação da expansão do cumulus é diferente em suínos e camundongos. A expansão das células do culmulus em CCOs suíno in vitro não é dependente do oócito, ao contrário da espécie murina (PROCHÁZKA et al, 1991). Os oócitos mantêm um microambiente altamente especializado, através de sinais parácrinos (LI et al., 2000). XIA et al. (1994) relataram que os fatores secretados pelas células do cumulus, durante o co-cultivo de oócitos 21 desnudos, induzem a maturação nuclear e citoplasmática. Este microambiente aumenta o número de oócitos com maturação citoplasmática e nuclear, o que assegura o desenvolvimento embrionário precoce (GILCHRIST et al., 2004). 2.3.2 Co-cultivo com células somáticas As células do cumulus podem promover a maturação citoplasmática de oócitos ao longo do desenvolvimento folicular na fase antral, pois é durante este estágio que os oócitos vão gradualmente adquirindo competência (LI et al., 2000). Especula-se que alguns fatores secretados pelas células do cumulus, tais como o GDF-9 e a BMP-15 podem agir no oócito auxiliando a maturação dos oócitos co-cultivados com monocamadas de células do cumulus (FENG et al., 2013), promovendo a sua competência para o desenvolvimento embrionário subsequente (JU; RUI, 2012). Visando mimetizar o microambiente natural do trato reprodutivo e produzir fatores antioxidantes para neutralizar espécies reativas de oxigênio, vários tipos de células têm sido utilizados em monocamadas, favorecendo a nutrição dos embriões cultivados in vitro (JOO et al., 2001; JOHNSON et al., 2008; OMAR FAROUK; VLAD, 2008). Desta forma, a utilização de células somáticas, independentemente de sua origem, tem um papel importante na produção de embriões viáveis. 2.3.3 Co-cultivo com parede folicular e o bloqueio temporário da maturação Acredita-se que o baixo desenvolvimento de oócitos maturos in vitro é devido à assincronia entre maturação nuclear e citoplasmática (EPPIG et al., 1994). Diante disso, numerosos estudos sugerem que o bloqueio temporário da meiose pode sincronizar a maturação nuclear e citoplasmática, tanto in vivo (WIERSMA et al., 1998) quanto in vitro (ratos: TSAFRIRI et al., 1996; COTICCHIO et al., 2004, bovinos: MAYES et al., 2002; THOMAS et al., 2002; macaco: JENSEN et al., 2002). Portanto, o conhecimento sobre o processo de bloqueio meiótico da maturação oocitária é fundamental para o aprimoramento de técnicas eficazes na produção in vitro de embriões. O mecanismo mais aceito atualmente sobre o bloqueio meiótico está diretamente relacionado a elevadas concentrações intra-oocitárias de AMPc, reguladas pela atividade entre as enzimas adenilato-ciclase (AC) e as fosfodiesterases (PDE). Essas 22 enzimas são responsáveis pela síntese e degradação de AMPc, respectivamente (FIMIA; SASSONE-CORSI, 2001; CONTI et al., 2002). Pelo menos 11 isoenzimas de PDE já foram identificadas (MANGANIELLO et al, 1995; SODERLING; BEAVO, 2000). Entretanto, apenas as PDE do tipo 1, 3, 4, 8 e 9 estão localizadas nos compartimentos foliculares. A PDE3 está principalmente envolvida no metabolismo de AMPc em oócitos, enquanto que a PDE4 está envolvida no metabolismo do AMPc nas células da granulosa (CONTI et al., 2002; SASSEVILLE et al., 2006). Considerando essas características, LOOS et al (1994) utilizaram paredes de folículos antrais imaturos (3-6 mm) bovinos como protocolo para o bloqueio da meiose, mantendo os oócitos em estádio de vesícula germinal intacta, permitindo a sincronização das maturações citoplasmática e nuclear, (LOOS et al., 1994). Desta forma, a presença da PDE 4 pode ter favorecido o bloqueio da progressão da meiose. 2.4 FOSFODIESTÉRASES (PDES) Fosfodiesterases - PDEs são enzimas que degradam nucleotídeos cíclicos intracelulares, o AMPc ou o monofosfato cíclico de guanosina (GMPc), inativando-os. Em mamíferos, estas enzimas compreendem atualmente uma família de onze fosfodiesterases (tabela 1) (CONTI, 2000). Elas estão presentes em todos os órgãos, incluindo o coração, os pulmões, os olhos, o cérebro e tecidos eréteis. As PDEs podem hidrolisar AMPc e GMPc. As PDEs 4, 7 e 8 são enzimas que degradam AMPc (CONTI, 2000; SODERLING; BEAVO, 2000) e as PDEs 5, 6 e 9 degradam GMPc. Já as PDEs 1, 2, 3, 10 e 11 degradam tanto o AMPc como o GMPc (BEAVO, 1995; CONTI, 2000; SODERLING; BEAVO, 2000). Cinco das onze famílias das PDEs estão presentes nos ovários: PDE1, PDE3, PDE4, PDE8 e PDE9 (BEAVO, 1995; CONTI, 2000; CONTI; JIN, 1999; CONTI et al., 1991; FISHER et al., 1998; GILULA et al., 1978). A PDE1 está presente nas células da granulosa e células da teca em ratos (CONTI et al., 1984) e no oócito de camundongos (BORNSLAEGER et al., 1984). Entretanto, a expressão da PDE3 foi relatada unicamente no oócito (NOGUEIRA et al., 2003; JENSEN et al., 2002; RICHARD et al., 2001; TSAFRIRI et al., 1996; REINHARDT et al., 1995) ao contrário da PDE4 que é expressa tanto nas células da granulosa como nas células da teca (TSAFRIRI et al., 1996). 23 Tabela 1: Lista de inibidores específicos da fosfodiesterase (Francis et al., 2001). Inibidores Família Vinpocetine, Zaprinast e SCH5 1866 PDE1 EHNA PDE2 Cilostamine. Milrinone, Amrinone, Enoximone e Lixazinone PDE3 Rolipram, RO 20-111724, Denbufyline e Sadarverine PDE4 Sidenafil (Viagra), Zaprinast, DMPPO, E4021, SCH5 1866 e GF248 PDE5 Sidenafil (Viagra), Zaprinast, DMPPO, E4021 e GF248 PDE6 Benzothieno-et benzothiadiazine dioxides PDE7 PDE8 Dipyridamole e (IBMX - insensible) Zaprinast e (IBMX - insensible) PDE9 Papaverine PDE10 Zaprinast e Dipyridamole PDE11 2.4.1 Fosfodiesterase tipo 3 As fosfodiesterases do tipo 3 degradam AMPc em 5'-AMP. Contudo, esta é a única família de fosfodiesterases que é bloqueada pela ação do GMPc (REINHARDT et al., 1995). A PDE3 tem dois genes que codificam para as enzimas A (A1, A2 e A3: CHOI et al., 2001; SHITSUKAWA et al., 2001) e B (3B: DEGERMAN et al., 1997). A PDE 3A e 3B têm a mesma organização estrutural. Estas duas formas são expressas e reguladas em diferentes tipos celulares. Por exemplo, o PDE3A encontrada nas plaquetas, no coração (OKRUHLICOVA et al., 1,996) e na placenta (CHOI et al., 2001). O PDE3A está envolvida na agregação plaquetária (FEIJGE et al., 2004) e no controle da contração cardíaca (HERRING et al., 2001). Já a PDE3B é encontrada nos adipócitos, promovendo a sua diferenciação (TAIRA et al., 1993), nas células pancreáticas β (HARNDAHL et al., 2002), nos mecanismos da lipólise e da glicólise, bem como na regulação da ingestão de nutrientes, no hipotálamo em resposta à leptina através PI-3kinases (ZHAO et al., 2002). Ambas PDE3 A e B estão também envolvidas no relaxamento das células do musculo liso vascular (REINHARDT et al., 1995; UCKERT et al., 2004). A PDE3A é a forma predominante expressa em oócitos de mamíferos. No folículo ovariano, a PDE3 foi localizada em oócitos de camundongos (TSAFRIRI et al., 1996; SHITSUKAWA et al., 2001), macacos (JENSEN et al., 2002) e humanos 24 (NOGUEIRA et al., 2003). Para promover a parada meiótica dos oócitos pode ser usado inibidores não-específicos (DEKEL; BEERS, 1978; 1980) ou o uso de inibidor específico da PDE-3 (TSAFRIRI et al., 1996; WIERSMA et al., 1998). A inibição desta enzima bloqueia o recomeço da meiose in vitro e in vivo em camundongos (TSAFRIRI et al., 1996; WIERSMA et al., 1998), bem como sua utilização aumenta a taxa de formação de blastocistos, promovendo o desenvolvimento embrionário em camundongos (NOGUEIRA et al., 2003). 2.4.2 Fosfodiesterase tipo 4 A família da fosfodiesterase tipo 4 tem uma afinidade elevada para a hidrólise de AMPc. Ela é encontrada nos pulmões (TOWARD; BROADLEY, 2004), cérebro ou neurônios corticais (D'Sa et al., 2002). Elas são codificadas por quatro genes: PDE4 A, B, C e D. Há mais de 20 variantes de PDE4 presentes em células do ovário. No folículo de camundongos, utilizando a hibridação in situ revelou-se a presença de PDE4B nas células da teca, enquanto PDE4D foi encontrada nas células da granulosa (TSAFRIRI et al., 1996). Camundongos knockout para PDE4D apresentaram uma taxa muito baixa de fertilidade, bem como diminuição da taxa de ovulação em comparação com camundongos selvagens (JIN et al., 1999) provavelmente devido à diminuição da expressão do gene durante a diferenciação em células da granulosa (JIN et al., 1999; RICHARD et al., 2003). Em todos os casos, a expressão in vivo de PDE4D é importante para a diferenciação normal de células da granulosa e uma taxa normal de ovulação e fertilização. 25 3. JUSTIFICATIVA A execução de um projeto de pesquisa com enfoque na biotecnologia da reprodução animal se justifica pela importância do modelo animal, do protocolo escolhido, bem como na provável contribuição original dos resultados obtidos para a ciência. De forma sucinta será abordado a seguir os três aspectos da justificativa mencionados acima. 1. Escolha da espécie: As espécies caprina e bovina são de grande interesse sócio-econômico no Brasil, em função de seu importante papel na produção de carne, pele e leite, bem como modelo experimental para animais que estão em risco de extinção, apresentam alto valor genético ou ainda em humanos. 2. Escolha da técnica de pré-maturação in vitro: A remoção dos complexos cumulus oócitos do ambiente ovariano pode provocar o reinício precoce da maturação nuclear, sem que a maturação citoplasmática tenha ocorrido, consequentemente diminuindo sua competência ao desenvolvimento. Frente a esse problema a técnica de pré-maturação in vitro visa retardar a maturação nuclear permitindo sua sincronização com a maturação citoplasmática. Assim torna-se potencialmente possível obter uma população homogênea de oócitos no mesmo estágio de maturação, aumentando, de forma significativa, a quantidade de oócitos competentes. Além disso, esta técnica permite a flexibilização do tempo de transporte de oócitos do campo ao laboratório, preservando sua viabilidade. Ainda, no que diz respeito à oócitos inclusos em folículos pré-antrais crescidos in vitro, essa técnica pode auxiliar a elevar as taxas de maturação impedindo que os oócitos retomem a meiose durante o cultivo in vitro. 3. Originalidade do trabalho: Até o presente momento diversos inibidores foram testados no intuito de retardar o reinicio da maturação nuclear em bovinos. Entretanto, a associação destes inibidores com a parede folicular ainda não foi testado. Além disso, em caprinos não existem estudos utilizando protocolos de pré-maturação utilizando inibidores da retomada da 26 meiose. Portanto, a originalidade deste trabalho foi à investigação dos efeitos in vitro da pré-maturação com cilostamida associada à parede folicular sobre a cinética de maturação e viabilidade in vitro de oócitos caprinos e bovinos. 27 4. HIPÓTESE CIENTÍFICA - A utilização de um inibidor da fosfodiesterase tipo 3 (cilostamida) associada à parede folicular afeta de forma concentração e tempo de exposição dependentes o percentual de oócitos viáveis e a cinética de maturação oocitária em caprinos e bovinos. 28 5. OBJETIVOS 5.1. Geral: - Estudar a cinética de maturação in vitro em oócitos caprinos e bovinos. - Avaliar o efeito da cilostamida associada à parede folicular durante a pré-maturação sobre a taxa de viabilidade oocitária e a cinética de maturação nuclear. 3.2. Específicos: - Determinar as taxas de VG, RVG, MI e MII após 6, 12, 18 e 30 horas de maturação in vitro nas espécies caprina e bovina. - Investigar o efeito de duas concentrações de cilostamida (10 µM e 20 µM) e tempos de exposição (6, 12 e 18 horas) durante a pré-maturação in vitro sobre as taxas de viabilidade e maturação oocitária. 29 6. CAPÍTULO 1 Cilostamida afeta de modo concentração e tempo de exposição dependente a viabilidade e a cinética da maturação in vitro de oócitos caprinos e bovinos Cilostamide affects in a concentration and exposure time dependent manner the viability and the kinetics of in vitro maturation of caprine and bovine oocytes Artigo submetido ao periódico: Animal Reproduction Em: novembro de 2014 30 Cilostamide affects in a concentration and exposure time dependent manner the viability and the kinetics of in vitro maturation of caprine and bovine oocytes H.H.V. Correia¹*, L.A. Vieira¹, C.M. Mielgo¹, V.R. Araújo¹, R.M.P. Rocha¹, N.A. Ribeiro de Sá¹, A.P.R. Rodrigues¹, J.R. Viana², J.R. Figueiredo¹ ¹ Laboratory of Manipulation of Oocytes and Preantral Follicles (LAMOFOPA www.lamofopa.com.br) - State University of Ceará (UECE) - +55 (85) 3101.9852. ² Federal University of Ceará - Sobral, Brazil * Corresponding author: [email protected] Phone/Fax: +55(85)8578-8684. 31 Abstract The aim of this study was to evaluate the effect of in vitro pre-maturation with cilostamide associated with follicular wall on viability and nuclear maturation kinetics of caprine and bovine oocytes. Cumulus-oocyte complexes were either in vitro matured for 30 h (conventional in vitro maturation) or submitted to in vitro pre-maturation with cilostamide (10 µM and 20 µM) for 6, 12 and 18 h associated with follicular wall followed by 24, 18 and 12 h of in vitro maturation. The results showed cilostamide at 10 µM (caprine - 6 and 18 h, bovine - 12 and 18 h) and 20 µM (bovine - 6, 12 and 18 h) significantly reduced the percentage of viable oocytes compared to the control. Regarding to maturation kinetics, cilostamide at 10 µM (caprine - 6 and 18 h; bovine 12 and 18 h) and 20 µM (caprine - 12 and 18 h; bovine-6 and 12 h) caused a delay in the meiotic progression and significantly reduced the rate of metaphase II (MII). On the other hand, the exposure to cilostamide at 10 µM (caprine - 12 h, bovine - 6 h) and 20 µM (caprine 6 h; bovine- 18 h) showed MII rates similar to the control. In conclusion, the cilostamide associated with follicular wall affected in a concentration and exposure time manner the percentage of viable oocytes and the kinetics of oocyte maturation in caprine and bovine species. Keywords: cilostamide, pre-maturation, meiosis arrest, caprine, bovine. 32 1. Introduction The maturation of mammalian oocytes is a complex process involving synchronization between cytoplasmic maturation which consists in the reorganization of the intracellular organelles, the mRNA storage, proteins and transcription factors, and nuclear maturation that involves mainly chromosome segregation (Watson, 2007; Mao et al., 2014). In vitro matured oocytes are not able to complete cytoplasmic maturation and resume meiosis simultaneously limiting their potential for development (Chian et al., 2004). This asynchrony is due to the spontaneous nuclear maturation which leads to chromatin condensation, thus preventing RNA synthesis and the accumulation of several molecules essential for early development (Bilodeau, 2012). The use of strategies to regulate the meiotic cell cycle would be a useful alternative to avoid the asynchrony between nuclear and cytoplasmic maturation. It is believed that cyclic adenosine monophosphate (cAMP) plays a fundamental role in the maintenance of mammalian meiotic arrest. The increase of intra-oocyte levels of cAMP is essential to maintain meiotic arrest in vitro (Conti et al., 2002) and improve the synchronization between nuclear and cytoplasmic maturation (Nogueira et al., 2003). In addition, numerous studies suggested that during maturation, temporary blockage can synchronize nuclear and cytoplasmic maturation, either in vivo (Wiersma et al., 1998) or in vitro (bovine, Mayes et al., 2002; Thomas et al., 2002; monkey, Jensen et al., 2002 and mice, Coticchio et al., 2004). The temporary arrest of nuclear maturation of human oocytes with the specific phosphodiesterase type 3 inhibitor (iPDE3) has proven to be beneficial to obtain meiotic spindle configuration and normal chromosomes after the in vitro maturation (IVM), and also resulted in synchronization of germinal vesicle (GV) stage oocytes (Vanhoutte et al., 2007). In bovine cumulus oocyte complexes (COCs) cocultured with the follicular wall for 24 h maintained all of their enclosed oocytes in GV stage (Loos et al., 1994). Furthermore, in human IVM, the use of iPDE3 at 10 µM for 24 h pre-maturation increased the rates of nuclear maturation without compromising embryonic development (Nogueira et al., 2006). In porcine, iPDE3 at 1µM for 24 h prematuration improved developmental competence of in vitro matured oocytes (Dieci et al., 2013) and increased the fertilization and embryo development rates. Despite the importance of the synchronization of cytoplasmic and nuclear maturation reported in the aforementioned studies, there are no in vitro reports on the 33 utilization of cilostamide in caprine oocytes. Therefore, the aim of this study was to evaluate the effect of pre-maturation with follicular wall associated with cilostamide, at different concentrations (10 µM and 20 µM) and exposure times (6, 12 and 18 h), on the viability and the kinetics of nuclear maturation of caprine and bovine oocytes. 2. Materials and methods The reagents and chemical used in this study were obtained from Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, USA) unless otherwise indicated. 2.1. Source of ovaries Ovaries (n = 80) of 40 adult crossbred cows and goats were collected at a local slaughterhouse. Immediately post mortem, each pair of caprine and bovine ovaries was washed twice in physiological saline solution (0,9% (w/v) NaCl) supplemented with antibiotics (100 μg/mL kanamycin sulphate). Ovaries were transported to the laboratory in an insulated container in physiological saline solution 0.9% at 33 °C within 4 h of collection (Coy et al., 2008; Santiquet et al., 2014). 2.2. Collection and In vitro maturation of cumulus-oocytes complexes In the laboratory, COCs were aspirated from medium-sized follicles (2-4 mm in diameter in caprine and 4-6 mm in bovine) using 18-G needles connected to 10-mL disposable syringes. Oocytes with a compact cumulus mass and a dark, evenly granulated, cytoplasm were washed in 5 mL of tissue culture medium (TCM-199) supplemented with 1% polyvinyl alcohol, 4.2 mM sodium bicarbonate, 10 mM HEPES, 2 mM glutamine, 50 UI/mL penicilin and 50 µg/mL streptomycin for bovine oocytes and TCM-199 supplemented with 10 mM HEPES, 15% fetal calf serum (FCS) and 1% antibiotics (streptomycin and penicillin) for caprine oocytes. Thus, COCs were washed twice in the maturation medium without hormones previously equilibrated for at least 2 h at 38.5 ºC. The selected caprine and bovine oocytes were washed three times in the maturation medium consisting of TCM-199 supplemented with 10% FCS, 0.2 mM sodium pyruvate, 2 mM L-Glutamine, 0.05 μg/mL gentamicin, 10 UI/mL eCG and 10 34 UI/mL hCG for bovine oocytes. For caprine oocytes, the maturation medium was TCM199 supplemented with 1 mg/mL BSA, 1 mM/mL pyruvate, 0,5 µg/mL FSHr, 5 µg/mL LH, 1 µg/mL 17β-estradiol, 10 ng/mL epidermal growth factor, 50 ng/mL insulin-like growth factor 1 and 100 µM/mL cysteamine. Group of 25 to 30 oocytes were cultured in 4-well multidish (Nunc, Roskilde, Denmark) containing 400 µL of maturation medium for both species and incubated for 30 h at 39 °C and 5% CO2 in air. 2.3. Isolation of follicular walls Follicles with 2-4 mm in caprine and 4-6mm in bovine were obtained by isolation using forceps and scalpel blade. After isolation, follicles were divided into two halves with a blade and transferred into petri dishes (35×10 mm; Corning, USA) containing TCM-199 HEPES and antibiotics. After isolation, follicular walls (two halves for each well) were co-cultured with COCs in medium supplemented with cilostamide during in vitro pre-maturation as described further in the experimental design. 2.4. Preparation of stock solutions of cilostamide Cilostamide was diluted in dimethylsulfoxide at a concentration of 1.5 M and stored at -20 ºC. These stock solutions were diluted in IVM medium to produce the final concentrations of 10 mM/L or 20 mM/L. 2.5. Morphological evaluation Only those COCs that showed an intact zona pellucida, bright and homogeneous cumulus cells and no dark oocyte were selected. COCs were classified as degenerated when the oocytes and surrounding cumulus cells appeared dark or if the oocytes were misshapen. 35 2.6. Assessment of viability and nuclear chromatin configuration of caprine and bovine oocytes after conventional in vitro maturation After maturation for 6, 12, 18 and 30 h COCs were denuded mechanically by repeated pipetting, with a pre-calibrated eyepiece micrometer using a stereomicroscope (SMZ 645 Nikon, Tokyo, Japan) at 100× magnification, assessed for viability and nuclear chromatin configuration. The oocytes were labeled with 4 μM calcein-AM (488 nm), 2 μM ethidium homodimer-1 (568 nm) and 10 μM Hoechst 33342 (483 nm), mounted on slides and examined using a fluorescence microscope (Nikon, Eclipse 80i, Tokyo, Japan). The oocytes were considered viable when the cytoplasm positively marked by calcein-AM in green and non-viable if the core is marked by ethidium homodimer-1 in red. Calcein demonstrated the activity of intracellular esterases of viable cells and the ethidium homodimer-1 marked the nucleic acids of non-viable cells with ruptured membranes. Hoechst 33342 staining was used to assess of chromatin configuration viewing of the stages of intact GV, the germinal vesicle breakdown (GVBD), metaphase I (MI) and metaphase II (MII). 2.7. Experimental design This experiment was conducted to evaluate the effect of in vitro pre-maturation (IVPM) with different concentrations of cilostamide and exposure times on the viability and chromatin configuration of caprine and bovine oocytes. The IVPM medium consisted of IVM medium without hormones. Briefly, COCs were randomly allocated in 4-well multidish plates containing IVM medium alone (control) or IVPM medium supplemented with cilostamide (10 mM/L and 20 mM/L) both concentrations associated with 2 halves of follicular walls. Thus, 20-30 oocytes were transferred to 400 µL of IVPM in the multidish and incubated for 6, 12 and 18 h at 39 °C and 5% CO2 in air. After the exposure times and the removal of cilostamide and follicular walls, the COC were transferred to fresh IVM medium without cilostamide and follicular walls and cultured for additional 24, 18 and 12 h, respectively totaling a maximum period of 30 h of culture for all seven treatments (see Table 1). At the end of IVM, all COCs were completely denuded using hyaluronidase, and the chromatin configuration and the viability of their oocytes were evaluated. 36 Table 1. Conventional IVM (control) and IVPM of caprine and bovine oocytes. Treatments Control IVPM (h) IVM (h) TOTAL (h) - 30 30 Cilo 10 µM 6 24 30 + 12 18 30 FW 18 12 30 Cilo 20 µM 6 24 30 + 12 18 30 FW 18 12 30 (Conventional IVM) IVPM: In Vitro Pre-Maturation (cilostamide plus follicle walls). IVM: In Vitro Maturation. Cilo: Cilostamide. FW: Follicular wall. 2.9. Statistical analysis Data were analyzed as a dispersion of frequency by using Chi-square test (or Fisher’s Exact Test when observed frequency was less than five). Differences were considered significant when P<0.05, and the results were expressed as percentages. 3. Results The rate of oocyte viability is shown in the Table 2. A total of 240 caprine and 235 bovine oocytes were evaluated. COCs exposed to 10 µM (caprine - 6 and 18 h; bovine - 12 and 18 h) and 20 µM cilostamide (bovine - 6, 12 and 18 h) showed a significant reduction in the percentage of viable oocytes compared to the control. However, when COCs were exposed to 10 µM (caprine - 12 h; bovine - 6 h) and 20 µM (caprine - 6, 12 and 18 h) no significant difference was observed. 37 Table 2. Percentages of viable caprine and bovine oocytes after IVPM with different exposure time and concentration of cilostamide. Oocyte survival (viable) (%) Treatments IVPM Caprine Bovine Control 0 100.00 (30/30)a 100.00 (25/25)a 10µM 6 74.29 (26/35)b 88.57 (31/35)ab cilostamide 12 91.43 (32/35)ab 82.86 (29/35)b 18 80.00 (28/35)b 82.86 (29/35)b 20 µM 6 88.57 (31/35)ab 80.00 (28/35)b cilostamide 12 97.14 (34/35)a 80.00 (28/35)b 18 88.57 (31/35)ab 80.00 (28/35)b Different lowercase letters denote significant differences among the different exposure times, concentrations of cilostamide and control (P<0.05). Table 3. Meiotic stages of caprine and bovine oocytes after different time points of IVM. Time Points of IVM Meiotic stages (%) Caprine Bovine 6 12 18 30 GV ------ ------ ------ ------ GVBD 20.00 (6/30)A 13.33 (4/30)A 13.33 (4/30)A A -----33.33 (10/30)B 60.00 (18/30) MII 20.00 (6/30)B 13.33 (4/30)B 66.67 (20/30)A 66.67 (20/30)A GV ------ ------ ------ ------ ------ ------ 16.00 (4/25) B 20.00 (6/30) B MI A 73.33 (22/30) A GVBD 60.00 (15/25) MI 32.00 (8/25)A 44.00 (11/25)A 24.00 (6/25)A 32.00 (8/25)A MII ------ 32.00 (8/25)B 76.00 (19/25)A 60.00 (15/25)A Significant differences among different times of maturation in the same line are indicated by uppercase letters (P<0.05). Table 3 presents the percentage of caprine and bovine oocytes in different stages of maturation (GV, GVBD, MI and MII) after different time points during conventional IVM (6, 12, 18 and 30 h). In both species, the rates of MII were similar (P>0.05) after 18 and 30 h of maturation, being superior to 6 and 12 h of IVM (P<0.05). 38 Regarding to the maturation kinetics, the exposure to 10 µM cilostamide (caprine - 6 and 18 h, bovine - 12 and 18 h) and 20 µM (caprine -12 and 18 h, bovine - 6 and 12 h) caused a delay in the meiotic progression and reduced significantly MII rates (Table 4 and 5). On the other hand, the exposure to 10 µM (caprine - 12 h, bovine - 6 h) and 20 µM (caprine - 6 h; bovine - 18 h) showed rates of MII similar to the control. Table 4. Meiotic stages of caprine oocytes after IVPM with different exposure time and concentration of cilostamide. Table 4 Treatment GV GVBD MI MII Control Exposure time (h) 0 ------ 6.66 (2/30)a 26.67 (8/30)c 66.67 (20/30)a 10 µM 6 ------ 22.86 (8/35)a 31.43 (11/35)bc 20.00 (7/35)cd 10 µM 12 ------ 22.86 (8/35)a 17.14 (6/35)c 51.43 (18/35)a 10 µM 18 ------ 11.43 (4/35)a 57.14 (20/35)a 11.43 (4/35)d 20 µM 6 ------ 11.43 (4/35)a 34.29 (12/35)abc 42.86 (15/35)ab 20 µM 12 ------ 14.29 (5/35)a 45.71 (16/35)ab 37.14 (13/35)bc 20 µM 18 ------ 20.00 (7/35)a 45.71 (16/35)ab 22.86 (8/35)bcd Significant differences among treatments in the same column are indicated by lowercase letters (P<0.05). Table 5. Meiotic stages of bovine oocytes after IVPM with different exposure time and concentrations of cilostamide. Treatment GV GVBD MI MII Controle Exposure time (h) 0 ------ ------ 32.00 (8/25)ab 68.00 (17/25)a 10 µM 6 ------ 5.71 (2/35)a 28.57 (10/35)b 54.29 (19/35)ab 10 µM 12 ------ 5.71 (2/35)a 42.86 (15/35)ab 34.29 (12/35)bc 10 µM 18 ------ 11.43 (4/35)a 48.57 (17/35)ab 22.86 (8/35)c 20 µM 6 ------ 2.86 (1/35)a 57.14 (20/35)a 20.00 (7/35)c 20 µM 12 ------ 2.86 (1/35)a 54.29 (19/35)a 22.86 (8/35)c 20 µM 18 ------ ------ 42.86 (15/35)ab 37.14 (13/35)abc Significant differences among treatments in the same column are indicated by lowercase letters (P<0.05). 39 4. Discussion This study investigated for the first time the effects of IVPM with cilostamide (different concentrations and exposure times) associated with the follicular wall on the viability and kinetics of IVM of caprine oocytes. The results showed that the concentration and exposure time of cilostamide affected the percentages of viable oocytes and the kinetics of IVM in caprine and bovine species. Cilostamide is a phosphodiesterase-3 inhibitor that has been used to block nuclear meiosis inducing its synchronization with the cytoplasmic maturation of oocytes (Nogueira et al., 2003, 2006; Stouffer and Zelinski-Wooten, 2004; Vanhoutte et al., 2008). This inhibitory effect of the phosphodiesterase-3 has been demonstrated in several species such as mice (Nogueira et al., 2003), bovine (Albuz et al., 2010; Luciano et al., 2011) and human (Nogueira et al., 2006). Regarding to oocyte viability, the results showed that caprine oocytes exposed to 10 µM cilostamide associated with the follicular wall for 6 and 18 h decreased the percentage of viable oocytes compared to the control. However, in bovine only 10 µM cilostamide for 6 h did not reduce significantly the viability when compared to the control. It is quite possible that these two species have different metabolic properties and the tolerance to cilostamide (concentrations and exposure time), responding disparately to the high level of cAMP within the oocyte (Bilodeau et al., 1993). With regard to the kinetics of oocyte maturation, cilostamide at 10 µM (caprine - 6 and 18 h, bovine - 12 and 18 h) and 20 µM cilostamide (caprine - 12 and 18 h, bovine - 6 and 12 h) caused a delay in the meiotic progression reducing significantly the MII rates. Several studies have shown that exist a large variability of bovine oocytes in response to the arrest of meiosis induced by cilostamide (Mayes and Sirard, 2002; Luciano et al., 2011). Thomas et al, (2002) demonstrated meiotic arrest occurred when bovine COCs and denuded oocytes were exposed to 50 µM cilostamide during 16 h of pre-IVM. Although, the arrest of meiosis at MI with cilostamide can be possible in caprine, in other species such as mice, there have been observed more than 90 % of the meiotic arrest in GV stage (Vanhoutte et al., 2008). The reason for the diverse response to cilostamide on meiotic arrest in different stage of development, in addition to the species differences, could be due to the source of the oocytes. Caprine oocytes are usually obtained from slaughterhouse ovaries being extremely heterogeneous in terms 40 of quality and development, unlike to the mouse oocytes recovery that is more controlled (Thomas et al., 2002; Albuz et al., 2010). The combination of concentration-exposure time to cilostamide seems to influence markedly the rates of in vitro maturation. In ovine, the MII rates of oocytes pre-matured for 22 h with 10 and 20 µM cilostamide were significantly lower than the control (Gharibi et al., 2013). Nevertheless, when it was used a lower concentration (1 µM) no significant difference was observed when compared to the control. The present study examined the kinetics (GV, GVBD, MI and MII) of IVM in caprine and bovine oocytes after different culture periods (6, 12, 18 and 30 h). The results showed higher rates of MII in caprine and bovine oocytes at 18 h of culture without any significant increase in longer culture periods. Similar results were obtained by other authors, which reported that the time required for IVM of bovine oocytes was 18-24 h (Sirard et al., 1989; Wu et al, 1996; Dode and Adona, 2001; Merton et al., 2003). In contrast, caprine oocytes required longer culture period (32 h) to complete IVM (Sharma et al., 1996). In the present study, caprine oocytes exposed to 10 µM cilostamide for 12 h or 20 µM cilostamine for 6 h and pre-maturation bovine oocytes exposed to 10 µM cilostamine for 6 h and 20 µM cilostamine for 18 h showed no significant difference in the rates of maturation when compared to their respective controls without cilostamide. We believed that this good result is due to the optimal combination of concentrationexposure time to cilostamide with exposure times of 6 and 12 h during pre-maturation. We suggest that in such conditions the presence of the inhibitor has provided adequate cAMP levels (Conti et al., 2012) which could contribute to a better synchronization between nuclear and cytoplasmic maturation (Nogueira et al., 2003). In addition, supporting this idea, Albuz et al. (2010) have reported some advantage of the PDE inhibitors in pre-IVM, i.e., avoiding aging and the loss of oocyte and cumulus cells. In conclusion, the combination of concentration-exposure time to cilostamide associated with the follicular wall during pre-IVM influenced the viability and the kinetics of IVM of caprine and bovine oocytes. Exposure to 10 µM cilostamide (caprine - 12 h; bovine - 6 h) maintained survival rates and MII comparable to the control, and may be used to increase in vitro embryo production in the future. 41 Acknowledgments This research was supported by grants from the National Council for Scientific and Technological Development (CNPq-79/2013 linha 3 – Rede Nordeste de Biotecnologia (Rede de pesquisa do ovário artificial) – Processo N° 407594/2013-2). Hudson Henrique Vieira Correia is the recipient of a grant from CNPq (Brazil). The authors thank José Roberto Viana for donating cilostamide. Luis Alberto Vieira and Caroline Maside Mielgo for assistance in manuscript preparation. 42 References Albuz FK, Sasseville M, Lane M, Armstrong DT, Thompson J, Gilchrist RB. 2010. 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