1
UNIVERSIDADE ESTADUAL DO CEARÁ - UECE
PRÓ-REITORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO E PESQUISA
FACULDADE DE VETERINÁRIA - FAVET
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS
VETERINÁRIAS - PPGCV
HUDSON HENRIQUE VIEIRA CORREIA
CILOSTAMIDA AFETA DE FORMA DEPENDENTE DE CONCENTRAÇÃO E
TEMPO DE EXPOSIÇÃO A VIABILIDADE E A CINÉTICA DE MATURAÇÃO
IN VITRO DE OÓCITOS CAPRINOS E BOVINOS
FORTALEZA - CEARÁ
2014
2
HUDSON HENRIQUE VIEIRA CORREIA
CILOSTAMIDA AFETA DE FORMA DEPENDENTE DE CONCENTRAÇÃO E
TEMPO DE EXPOSIÇÃO A VIABILIDADE E A CINÉTICA DE MATURAÇÃO IN
VITRO DE OÓCITOS CAPRINOS E BOVINOS
Dissertação apresentada ao Programa de
Pós-Graduação em Ciências Veterinárias
da Faculdade de Veterinária da
Universidade Estadual do Ceará, como
requisito parcial para a obtenção do grau
de Mestre em Ciências Veterinárias.
Área de Concentração: Reprodução e
Sanidade Animal. Linha de Pesquisa:
Reprodução e Sanidade de Pequenos
Ruminantes.
Orientador: Prof. Dr. José Ricardo de
Figueiredo.
FORTALEZA - CEARÁ
2014
3
4
5
Dedico,
A minha Avó, Vera Lucia Magalhães Vieira (in memoriam)
6
AGRADECIMENTOS
À Universidade Estadual do Ceará (UECE) e ao Programa de Pós-Graduação em
Ciências Veterinárias (PPGCV) pela capacitação profissional que me proporcionaram.
Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) pelo
incentivo concedido na forma de bolsa de estudo, à Coordenação de Aperfeiçoamento
de Pessoal de Nível Superior (CAPES), à Rede Nordeste de Biotecnologia (Renorbio), à
Financiadora de Estudos e Projetos (FINEP) e à Fundação Cearense de Apoio ao
Desenvolvimento Científico e Tecnológico (FUNCAP) pelo auxílio financeiro dessa
pesquisa.
A Deus por estar presente me guiando, dando força, discernimento e protegendo durante
todos os momentos desta caminhada.
Ao meu orientador Prof. Dr. José Ricardo de Figueiredo por ter me recebido e orientado
de forma competente e dedicada, sempre me fornecendo apoio acadêmico e incentivo
profissional.
Ao Prof. Dr. Isaac Neto por toda a sua ajuda e contribuição em meu crescimento pessoal
e profissional e por ter se mostrado sempre disponível em me ajudar.
Ao Prof. Dr. Claudio Cabral Campello por toda a sua ajuda de forma competente e
dedicada, contribuição neste trabalho e por estar sempre disponível em me ajudar.
Ao Prof. Dr. José Roberto Viana Silva por toda a sua ajuda e contribuição neste
trabalho, por ter se mostrado sempre disponível em me ajudar.
A Dr. Ana Beatriz Graça Duarte por ter me ensinado os primeiros passos metodológicos
para a realização desse estudo.
A minha equipe de trabalho Msc. Ivina Rocha Brito, Msc. Rebeca Magalhães Pedrosa
Rocha, Msc. Juliana Zani, Msc. Debora Sales, Denise Querreiro, Naiza Arcanjela que
me ensinaram e deram todo o suporte técnico para a realização desse trabalho.
A minha “mãe, pai e madrasta profissional”, Drs. Valdevane Rocha Araújo, Luis
Alberto Vieira e Carolina Maside Mielgo, a quem não tenho palavras para agradecer
toda ajuda durante o período de mestrado. Agradeço muito pela atenção e ensinamentos
sempre de forma carinhosa e amiga.
As minhas amigas Rebeca, Laritza e Naiza por me receber em suas vidas de forma tão
generosa. Agradeço pela amizade e por toda ajuda durante o tempo que estiveram no
7
laboratório. Agradeço imensamente pelo ombro amigo, pelas histórias compartilhadas,
pelos risos divididos comigo.
Ao Laboratório de Manipulação de Oócitos e Folículos Pré-Antrais (LAMOFOPA) da
UECE, por todo o suporte oferecido para realização deste estudo. E a toda equipe
LAMOFOPA que o compõe e já compôs: Profa. Dra. Ana Paula Ribeiro Rodrigues, Dr.
Fabricio Sousa Martins, Dra. Ana Beatriz Graça Duarte, Dra.Carolina Maside Mielgo,
Dra. Jamily Bezerra Bruno, Dr. Carlos Henrique Lobo, Dr. Anderson, Dr. Cleidson
Manoel Gomes da Silva, Dra. Luciana Faustino, Dra. Giovanna Quintino Rodrigues,
Dra. Adeline de Andrade, Dra. Geovania Canafístula Carvalho, Simone Vieira Castro,
Gerlane Modesto, Francisco Léo, Juliana Zani, Débora Sales, Johanna Leiva, Jesús
Cadenas, Nathalie Jiatsa, Allana Pessoa, Patricia, Denise Guerreiro, Naiza Arcângela,
Victor Macedo, Érica Suzane, Livia Brunetti, Julian Pontes, Marcela Pinheiro Paz,
Lidiane Sousa, Renato Felix da Silva, Juliana Menezes, Luana Gaudêncio, Lorena
Andrade, José Arnaldo Moreira de Sousa, Alzenira de Andrade Ferreira, Adriana Maria
S. Albuquerque, Sr. João e Cezar pela convivência amistosa durante todos esses anos,
além de todos os conhecimentos transmitidos.
A minha família, agradeço pelo apoio, carinho e compreensão durante esses anos em
que estive ausente. Obrigado em especial a minha avó Vera Lucia Magalhães Vieira (in
memoriam) que foi e sempre será um exemplo de vida, alegria, dedicação e força. A
minha mãe Rosemeire Magalhães Vieira da Silva e ao meu Pai Carlos Henrique Correia
que foram meus exemplos de vida, caráter e dedicação.
A minha esposa Mônica Freitas Miranda Correia que foi a base mais sólida de
sustentação que eu poderia ter e que me deu todo apoio e ombro amigo para que eu
continuasse forte nesses dois anos de mestrado.
Finalmente, agradeço a todos que aqui não foram citados, mas ajudaram direta ou
indiretamente para que essa dissertação fosse feita.
8
RESUMO
O objetivo deste estudo foi avaliar o efeito da pré-maturação in vitro com cilostamida
associada à parede folicular sobre a viabilidade e a cinética de maturação nuclear de
oócitos caprinos e bovinos. Complexos cumulus-oócitos foram maturados in vitro por
30 h (maturação in vitro convencional - Controle) ou submetidos à pré-maturação in
vitro com cilostamida (10 e 20 µM) por 6, 12 e 18 h associados à parede folicular
seguido de 24, 18 e 12 h de maturação in vitro. Os resultados mostraram que a
cilostamida a 10 µM (caprinos - 6 e 18 h, bovinos - 12 e 18 h) e 20 µM (bovinos - 6, 12
e 18 h) reduziu (P < 0,05) a percentagem de oócitos viáveis em comparação ao controle.
No que diz respeito à cinética de maturação, a cilostamida a 10 µM (caprinos - 6 e 18 h;
bovinos -12 e 18 h) e 20 µM (caprinos - 12 e 18 h; bovinos-6 e 12 h) causou um atraso
na progressão meiótica e reduziu (P < 0,05) a taxa de metafase II (MII). Por outro lado,
a exposição à cilostamida a 10 µM (caprinos - 12 h, bovino - 6 h) e a 20 µM (caprinos 6
h; bovino - 18 h) mostrou taxas de MII semelhantes a do controle. Em conclusão, a
cilostamida associada à parede folicular afeta de forma dependente da concentração e do
tempo de exposição a porcentagem de oócitos viáveis, bem como a cinética de
maturação de oócitos caprinos e bovinos.
Palavras-chave: Cilostamida, Pré-maturação, Parada meiótica, Caprino, Bovino.
9
ABSTRACT
The aim of this study was to evaluate the effect of in vitro pre-maturation with
cilostamide associated with follicular wall on viability and nuclear maturation kinetics
of caprine and bovine oocytes. Cumulus-oocyte complexes were either in vitro matured
for 30 h (conventional in vitro maturation - Control) or submitted to in vitro prematuration with cilostamide (10 and 20 µM) for 6, 12 and 18 h associated with
follicular wall followed by 24, 18 and 12 h of in vitro maturation. The results showed
cilostamide at 10 µM (caprine - 6 and 18 h, bovine - 12 and 18 h) and 20 µM (bovine 6, 12 and 18 h) significantly reduced the percentage of viable oocytes compared to the
control. Regarding to maturation kinetics, cilostamide at 10 µM (caprine - 6 and 18 h;
bovine -12 and 18 h) and 20 µM (caprine - 12 and 18 h; bovine-6 and 12 h) caused a
delay in the meiotic progression and significantly reduced the rate of metaphase II
(MII). On the other hand, the exposure to cilostamide at 10 µM (caprine - 12 h, bovine 6 h) and 20 µM (caprine 6 h; bovine- 18 h) showed MII rates similar to the control. In
conclusion, the cilostamide associated with follicular wall affected by the concentration
and exposure time-dependent the percentage of viable oocytes and the kinetics of
maturation of caprine and bovine oocytes.
Keywords: Cilostamide, Pre-maturation, Meiosis arrest, Caprine, Bovine.
10
LISTA DE TABELAS
Revisão de Literatura
Tabela 1. Lista de inibidores específicos da fosfodiesterase..........................................22
Capítulo 1.
Table 1. Conventional IVM (control) and IVPM of caprine and bovine oocytes.
IVPM: In Vitro Pre-Maturation (cilostamide plus follicle walls). IVM: In Vitro
Maturation.
Cilo:
Cilostamide.
FW:
Follicular
wall……………………………………………………………………………36
Table 2. Percentages of viable caprine and bovine oocytes after IVPM with different
exposure time and concentration of cilostamide. Different lowercase letters
denote significant differences among the different exposure time, concentration
of cilostamide and control (P<0.05)…………………………………………37
Table 3. Meiotic stages of caprine and bovine oocytes after different time points of
IVM. Significant differences between different time of maturation in the same
line
are
indicated
by
uppercase
letters
(P<0.05)……………………………………………………..………………...37
Table 4. Meiotic stages of caprine oocytes after IVPM with different exposure time and
concentration of cilostamide. Significant differences between treatments in the
same
column
are
indicated
by
uppercase
letters
(P<0.05)……………………………………..………………………………...38
Table 5. Meiotic stages of bovine oocytes after IVPM with different exposure time and
concentrations of cilostamide. Significant differences between treatments in the
same
column
are
indicated
by
uppercase
letters
(P<0.05)…………………………………..…………………………………...38
11
LISTA DE ABREVIATURAS
ATP
: Adenosina Trifosfato
BSA
: Bovine serum albumin (Albumina sérica bovina)
°C
: Graus Celsius
CaCl2
: Cloreto de cálcio
Calceína - AM
: Calceína acetoximetil
CAPES
: Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior
CNPq
: Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico
CO2
: Dióxido de Carbono
COCs
: Cumulus–oocyte complexes (Complexos cumulus-oócito)
DNA
: Deoxyribonucleic acid (Ácido desoxirribonucleico)
Dr.
: Doutor
Dra.
: Doutora
EGF
: Epidermal growth factor (Fator de crescimento epidermal)
FSH
: Hormônio Folículo Estimulante
G
: Gauge
GH
: Growth hormone (Hormônio do crescimento)
GV
: Germinal vesicle (Vesícula germinal)
h
: Horas
HC
: Histologia clássica
ITS
: Insulin, tranferrin and selenium (Insulina, transferrina e selênio)
IGF-I
:Insulin-like growth factor-I (Fator de crescimento semelhante à
insulina - I)
IVC
: In vitro culture (cultivo in vitro)
IVM
: In vitro maturation (Maturação in vitro)
kg
: Quilograma
LH
: Luteinizing hormone (Hormônio Luteinizante)
LAMOFOPA
: Laboratório de Manipulação de Oócitos e Folículos Pré-Antrais
M
: Molar
MAPK
: Mitogen-activated protein kinase (Proteína quinase ativada por
mitógenos)
MEM
: Minimal essential medium (Meio essencial mínimo)
12
MEM+
:Supplemented minimal essential medium (Meio essencial mínimo
suplementado)
mg
: Miligrama
MI
: Metaphase I (Metáfase I)
MII
: Metaphase II (Metáfase II)
min
: Minutos
mL
: Mililitro
MOIFOPA
: Manipulação de Oócitos Inclusos em Folículos Ovarianos Pré-antrais
mRNA
: Messenger ribonucleic acid (Ácido ribonucléico mensageiro)
Na+
: Íon sódio
ng
: Nanograma
O2
: Oxigênio
p < 0.05
: Probabilidade de erro menor do que 5%
p.
: Página
PPGCV
: Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias
RENORBIO
: Rede Nordeste de Biotecnologia
RVG
: Rompimento de vesícula germinal
SAS
: Statistical analysis system (Sistema de análise estatística)
sec
: Second (Segundo)
SD
: Standard deviation (Desvio padrão)
SEM
: Standard error of means (Erro padrão da média)
TE
: Transferência de embriões
TCM-199
: Tissue culture medium (Meio de cultivo tecidual- 199)
U
: Unidade
UECE
: Universidade Estadual do Ceará
VGBD
: Germinal vesicle breakdown (Quebra da vesícula germinal)
α-MEM
: Alpha minimal essential medium (Meio essencial mínimo alfa)
μg
: Microgramas
μL
: Microlitro
μm
: Micrômetro
µM
: Micromolar
%
: Porcentagem
~
: Aproximadamente
13
<
: Menor
=
: Igual
>
: Maior
±
: Mais ou Menos
≥
: Maior ou igual
SUMÁRIO
14
1
INTRODUÇÃO ............................................................................................. 14
2
REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ..................................................................... 16
2.1
OOGÊNESE E FOLICULOGÊNESE .............................................................. 16
2.2
COMPETÊNCIA OOCITÁRIA ....................................................................... 17
2.2.1
Maturação citoplasmática ............................................................................ 17
2.2.2
Maturação nuclear ........................................................................................ 18
2.3
CO-CULTIVO DURANTE A MATURAÇÃO IN VITRO (MIV) ................. 20
2.3.1
Co-cultivo de oócitos ................................................................................... 20
2.3.2
Co-cultivo com células somáticas ................................................................ 21
2.3.3
Co-cultivo com parede folicular e o bloqueio temporário da maturação . 21
2.4
FOSFODIESTERASES (PDES) ...................................................................... 22
2.4.1
Fosfodiesterases tipo 3 ................................................................................. 23
2.4.2
Fosfodiesterases tipo 4 ................................................................................. 24
3
JUSTIFICATIVA ............................................................................................ 25
4
HIPÓTESE CIENTÍFICA .............................................................................. 27
5
OBJETIVOS .................................................................................................... 28
5.1
OBJETIVO GERAL ......................................................................................... 28
5.2
OBJETIVOS ESPECÍFICOS ............................................................................ 28
6
CAPÍTULO 1 ................................................................................................... 29
7
CONCLUSÃO .................................................................................................. 46
8
PERSPECTIVAS ............................................................................................. 47
9
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ........................................................... 48
14
1. INTRODUÇÃO
A maturação de oócitos de mamíferos é um processo complexo que envolve a
sincronização entre a maturação citoplasmática e maturação nuclear. A maturação
citoplasmática
consiste
na
reorganização
das
organelas
intracelulares,
no
armazenamento de RNA, proteínas e fatores de transcrição, enquanto que a maturação
nuclear envolve principalmente a segregação cromossômica (WATSON, 2007; MAO et
al., 2014).
Oócitos maturados in vitro apresentam uma redução na capacidade de completar
a maturação citoplasmática e retomar a meiose, simultaneamente, limitando seu
potencial de desenvolvimento (CHIAN et al., 2004). Esta assincronia é devido a
maturação nuclear espontânea que leva a condensação da cromatina, impedindo assim a
síntese de RNA e o acúmulo de várias moléculas essenciais para o desenvolvimento
precoce (BILODEAU; COTÊ, 2012). A utilização de estratégias para regular o ciclo
celular meiótico seria uma alternativa útil para evitar essa assincronia entre a maturação
nuclear e citoplasmática.
Nos últimos anos, alguns estudos têm demonstrado que o monofosfato de
adenosina cíclico (AMPc) desempenha um papel fundamental na manutenção da parada
meiótica em mamíferos (FIMIA; SASSONE-CORSI, 2001; CONTI et al., 2002).
CONTI et al. (2002) verificaram que o aumento dos níveis intra-oocitários de AMPc é
essencial para manter a parada meiótica in vitro, melhorando a sincronização entre a
maturação nuclear e a citoplasmática (NOGUEIRA et al., 2003). Além disso,
numerosos estudos sugerem que, durante a maturação, o bloqueio temporário pode
sincronizar a maturação nuclear e citoplasmática, quer in vivo (WIERSMA et al., 1998)
ou in vitro (vaca, MAYES et al, 2002; THOMAS et al., 2002; macaco JENSEN et al.,
2002; camundongo, COTICCHIO et al., 2004). O mecanismo mais aceito atualmente
sobre o bloqueio meiótico está diretamente relacionado a elevadas concentrações intraoocitárias de AMPc, reguladas pela atividade entre as enzimas adenilato-ciclase (AC) e
as fosfodiesterases (PDE). Essas enzimas são responsáveis pela síntese e degradação de
AMPc, respectivamente (FIMIA; SASSONE-CORSI, 2001; CONTI et al., 2002).
Em oócitos humanos, a parada temporária da maturação nuclear com a
cilostamida, um inibidor da fosfodiesterase tipo 3 (iPDE3), tem provado ser benéfica
para obter a configuração do fuso meiótico e cromossomas normais após a maturação in
15
vitro (MIV), resultando na sincronização de oócitos no estágio de vesícula germinal
(VG) (VANHOUTTE et al., 2007). Além disso, a utilização de iPDE3 a 10 µM por 24 h
de pré-maturação aumentou as taxas de maturação nuclear sem comprometer o
desenvolvimento embrionário humano (NOGUEIRA et al., 2006). Complexos cumulus
oócitos (CCOs) de bovinos co-cultivados com parede folicular por 24 h mantiveram
todos os seus oócitos no estágio de VG (LOOS et al., 1994). Em suínos, iPDE3 a 1µM
por 24 h de pré-maturação melhorou a capacidade de desenvolvimento de oócitos
maturados in vitro (DIECI et al., 2013) e aumentou as taxas de fertilização e
desenvolvimento embrionários.
Tendo em vista a importância do presente estudo, a revisão de literatura a seguir
abordará aspectos relacionados à oogênese e foliculogênese, competência oocitária, cocultivo celular durante a MIV e o papel das enzimas fosfodiesterases (PDEs) na
maturação.
16
2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
2.1 OOGÊNESE E FOLICULOGÊNESE
A oogênese consiste na formação e diferenciação das células germinativas
primordiais (CGP) até a formação do oócito haplóide fecundado. Este processo inicia-se
antes e termina após o processo de foliculogênese (VAN DEN HURK; ZHAO, 2005).
As CGP migram para a crista genital e colonizam a gônada ainda indiferenciada, onde
recebem a denominação de oogônias e começam a multiplicar-se por divisões mitóticas.
Posteriormente, as oogônias entram na primeira divisão meiótica e param no estádio de
diplóteno, sendo chamadas de oócitos primários, os quais apresentam-se com seus
núcleos em vesícula germinativa (VG) (FIGUEIREDO et al., 2008). Nessa fase, os
oócitos são circundados por uma camada de células da pré-granulosa e são denominados
folículos primordiais. O folículo, por sua vez, é considerado a unidade morfofuncional
do ovário, cuja função é proporcionar um ambiente adequado para o crescimento e
maturação do oócito, mantendo sua viabilidade (CORTVRINDT; SMITZ, 2001).
A foliculogênese é um processo complexo que envolve a formação, crescimento
e maturação folicular sob a ação de hormônios e fatores de crescimento. O processo de
foliculogênese tem seu início com a formação dos folículos primordiais, culminando
com a formação dos folículos pré-ovulatórios ou de De Graaf (FIGUEIREDO et al.,
2008; VAN DEN HURK; ZHAO, 2005). Durante o seu desenvolvimento, a estrutura
folicular sofre alterações devido ao crescimento oocitário, diferenciação e multiplicação
das células da granulosa (HONDA et al., 2007), sendo os folículos classificados em préantrais (primordial, primário e secundário) e antrais (terciários e pré-ovulatórios)
(FIGUEIREDO et al., 2008).
Na maioria das espécies, os folículos pré-ovulatórios são caracterizados por
apresentarem um oócito maturo no momento da ovulação. A maturação oocitária
consiste em uma etapa crucial pela qual o oócito sofre modificações citoplasmáticas,
completa sua primeira divisão meiótica (maturação nuclear), progredindo até a metáfase
II (MEHLLMANN, 2005). Este processo é composto por inúmeras modificações
estruturais e moleculares no citoplasma (maturação citoplasmática). Didaticamente, essa
maturação citoplasmática pode ser subdivida em: redistribuição das organelas, dinâmica
dos filamentos do citoesqueleto e maturação molecular.
17
2.2 COMPETÊNCIA OOCITÁRIA
A competência oocitária é a capacidade do oócito assegurar o desenvolvimento
embrionário após a fecundação. Ela é adquirida de maneira gradual e sincronizada ao
longo da maturação oocitária que culmina com a configuração cromossômica em
metáfase II – MII. A maturação oocitária pode ser dividida em maturação
citoplasmática, nuclear e molecular. A maturação citoplasmática engloba todas as
mudanças estruturais e a distribuição e organização das organelas citoplasmáticas. A
maturação nuclear corresponde ao processo de reversão do primeiro bloqueio meiótico
do oócito em estádio de vesícula germinal (VG) até o segundo bloqueio meiótico em
estádio de MII. Já a maturação molecular corresponde ao legado de instruções
acumuladas durante a fase de VG que controla tanto a maturação nuclear, quanto a
citoplasmática (SIRARD, 2001).
2.2.1 Maturação Citoplasmática
A
maturação
citoplasmática
compreende
as
mudanças
estruturais
e
organizacionais das organelas que ocorrem no citoplasma do oócito, iniciando no
estágio de VG e culminando no estágio de MII. Ela envolve uma série de eventos
complexos, incluindo a síntese de proteínas e de RNA citoplasmático. A maturação
citoplasmática pode ser avaliada pela distribuição das organelas, reorganização das
mitocôndrias no citoplasma, complexo de Golgi e grânulos corticais (MAO et al.,
2014). No oócito imaturo de suínos, bovinos, camundongos e humanos, as mitocôndrias
e o complexo de Golgi estão concentrados em torno da VG, afastando-se da região
perinuclear na ruptura da vesícula germinal (RVG) e ocupando a maior parte do volume
do oócito em MII (oócitos maduros) (CRAN, 1985; FAIR, 1995; MAO et al., 2014).
Além disso, o número de complexos de Golgi, também aumenta com o diâmetro do
oócito. Localizados um pouco mais concentrados no interior do oócito produzem
grânulos corticais durante o crescimento oocitário (AUSTIN, 1956). Esses grânulos são
dispersos aleatoriamente ao longo do citoplasma dos oócitos imaturos e migram para a
região cortical do citoplasma durante a maturação meiótica em suínos (YOSHIDA et al.,
1993) e bovinos (HOSOE; SHIOYA, 1997). Esta mudança de direção dos grânulos
corticais é talvez o sinal mais facilmente observado na maturação citoplasmática.
18
As funções do reticulo endoplasmático (RE) estão relacionadas ao enovelamento
de proteínas e metabolismo de lipídios, sendo o RE a principal reserva interna de íons
de cálcio. O RE sofre redistribuição e mudanças estruturais durante a maturação do
oócito. Em camundongos, in vivo na fase VG o RE é uniformemente distribuído ao
longo do ooplasma (MANN et al., 2010), migrando para as regiões corticais em
pequenos grupos ao longo do citoplasma ao atingir MII (MEHLMANN et al., 1995;
KLINE, 2000; FITZHARRIS; BALTZ 2006; MAO et al., 2014).
Outro aspecto que pode ser utilizado para predizer a competência citoplasmática
é o diâmetro do oócito, devido ao aumento do volume citoplasmático durante o
crescimento folicular. Em suínos, oócitos com diâmetro menor que 100 µm são
incompetentes, porém, aqueles que atingem diâmetro igual ou superior a 110 µm
possuem capacidade para alcançar a competência meiótica (MORBECK et al., 1992).
Igualmente, a avaliação desse processo pode ser feita de forma indireta através dos
aspectos morfológicos, tais como a expansão das células do cumulus (SANTIQUET et
al., 2014).
A expansão do cumulus é um mecanismo independente da maturação
citoplasmática e nuclear do oócito. Entretanto, a ausência ou o pequeno número de
células de cumulus afeta negativamente a taxa de desenvolvimento embrionário em
bovinos (BLONDIN; SIRARD, 1995; LISLE et al., 2003). As interações entre as
células do cumulus e os oócitos é, portanto, contínua e essencial para a competência ao
desenvolvimento embrionário. Muitos autores consideram que a melhor forma de
avaliar a maturação é dada pela submissão do oócito maduro à fecundação, clivagem e
posterior desenvolvimento embrionário e fetal (KRISHER, 2004). Portanto, a
maturação citoplasmática deve ser interpretada como sendo um processo de capacitação
gradual (FERREIRA et al., 2009), produzindo uma estrutura fertilizável.
2.2.2 Maturação Nuclear
Maturação nuclear refere-se ao processo de reversão do primeiro bloqueio
meiótico do oócito em estádio de VG até o segundo bloqueio meiótico em estádio de
MII. A fase de VG é mantida por vários anos no animal, sendo seu mecanismo ainda
um mistério. A retomada da meiose de oócitos inclusos em folículos antrais grandes in
vivo ocorre durante o pico do Hormônio Luteinizante (LH) (HYTTEL et al., 1986),
19
enquanto que se cultivados in vitro, os oócitos podem retomar espontaneamente a
meiose (PINCUS; ENZMANN, 1935). O primeiro sinal de retomada da meiose é a
etapa de RVG (SZOLLOSI et al., 1972). No entanto, a maturação nuclear continua a sua
progressão para metáfase I (MI), sofrendo uma nova parada em MII, permanecendo
assim até a fecundação.
Os estágios de maturação nuclear podem ser classificados de acordo com sua
configuração nuclear (LANDIM-ALVARENGA; CHOI, 1999), a saber; o estágio de
VG é caracterizado pela presença de um núcleo esférico rodeado por uma membrana
nuclear integra e cromatina descondensada; RVG é a fase intermediária da maturação
nuclear onde ocorre a primeira retomada da meiose, havendo condensação
cromossômica e a desintegração da membrana nuclear; MI é caracterizada pela presença
de uma placa metafásica localizada perifericamente no ooplasma; MII ou maturação
nuclear é caracterizada pela presença dos cromossomos metafásicos na periferia do
ooplasma, bem como pela extrusão do primeiro corpúsculo polar.
2.2.3 Maturação Molecular
Maturação molecular consiste na transcrição, estoque e processamento de
RNAm que serão traduzidos em proteínas através dos ribossomos. Sendo, diretamente
relacionada com os processos de maturação e subsequentes eventos celulares, tais como
fertilização, formação de pró-núcleos e a fase inicial da embriogênese (CROCOMO et
al., 2013).
A transcrição e estoque de RNAm ocorre durante a fase de foliculogênese,
período em que o núcleo encontre-se quiescente, cessando com a retomada da meiose.
A maior parte de RNAm apresenta-se no ooplasma em forma inativa, após a ação de
sinais específicos gerados durante a maturação, fertilização e desenvolvimento
embrionário ocorre o início da tradução do RNAm. Assim, o sucesso do
armazenamento e reativação do RNAm, determina a competência do oócito para
suportar seus posteriores estágios de desenvolvimento (GOTTARDI; MINGOTI, 2009).
20
2.3 CO-CULTIVO DURANTE A MATURAÇÃO IN VITRO (MIV)
Conforme mencionado anteriormente é bem conhecido que os oócitos
necessitam atingir a maturação citoplasmática, bem como a maturação nuclear para se
tornarem capazes de assegurar a fecundação e o desenvolvimento do embrião
(MERMILLOD et al., 1999; TROUNSON; PERA, 2001).
Com o intuito de melhorar ainda mais as taxas de MIV, diferentes tipos celulares
têm sido utilizados para enriquecer os meios de cultivo in vitro. Oócitos suínos,
humanos e de camundongos já foram maturados in vitro utilizando células do próprio
folículo ovariano (células da granulosa ou da teca) (CASILLAS et al., 2014) ou de
outros tecidos, tais como células do oviduto (CHAN et al., 2013), células endoteliais e
fibroblastos (KARIMPOUR MALEKSHAH et al., 2014), ou mesmo o próprio oócito
(SUDIMAN et al., 2014). Maiores detalhes sobre esses sistemas de co-cultivo serão
descritos a seguir.
2.3.1 Co-cultivo de oócitos
O crescimento e o desenvolvimento durante a fase antral são dependentes do
contato íntimo dos oócitos com as células do cumulus, as quais desempenham uma
função crucial na secreção de fatores de crescimento, regulando a comunicação
bidirecional entre ambos (GILCHRIST et al., 2008). Dentre esses fatores, podemos citar
o fator de crescimento e diferenciação 9 (GDF-9) e proteína morfogenética óssea 15
(BMP-15), os quais são membros da superfamília TGF-β e na maioria das espécies são
encontrados exclusivamente no oócito (CRAWFORD; MCNATTY, 2012). Estudos têm
demonstrado que fatores secretados pelo próprio oócito aumentam a capacidade de
desenvolvimento de complexos cumulus-oócitos (CCOs) bovinos obtidos a partir de
ovários de matadouros (HUSSEIN et al., 2006).
VANDERHYDEN (1993) demonstrou que a regulação da expansão do cumulus
é diferente em suínos e camundongos. A expansão das células do culmulus em CCOs
suíno in vitro não é dependente do oócito, ao contrário da espécie murina
(PROCHÁZKA et al, 1991). Os oócitos mantêm um microambiente altamente
especializado, através de sinais parácrinos (LI et al., 2000). XIA et al. (1994) relataram
que os fatores secretados pelas células do cumulus, durante o co-cultivo de oócitos
21
desnudos, induzem a maturação nuclear e citoplasmática. Este microambiente aumenta
o número de oócitos com maturação citoplasmática e nuclear, o que assegura o
desenvolvimento embrionário precoce (GILCHRIST et al., 2004).
2.3.2 Co-cultivo com células somáticas
As células do cumulus podem promover a maturação citoplasmática de oócitos
ao longo do desenvolvimento folicular na fase antral, pois é durante este estágio que os
oócitos vão gradualmente adquirindo competência (LI et al., 2000). Especula-se que
alguns fatores secretados pelas células do cumulus, tais como o GDF-9 e a BMP-15
podem agir no oócito auxiliando a maturação dos oócitos co-cultivados com
monocamadas de células do cumulus (FENG et al., 2013), promovendo a sua
competência para o desenvolvimento embrionário subsequente (JU; RUI, 2012).
Visando mimetizar o microambiente natural do trato reprodutivo e produzir
fatores antioxidantes para neutralizar espécies reativas de oxigênio, vários tipos de
células têm sido utilizados em monocamadas, favorecendo a nutrição dos embriões
cultivados in vitro (JOO et al., 2001; JOHNSON et al., 2008; OMAR FAROUK;
VLAD, 2008). Desta forma, a utilização de células somáticas, independentemente de
sua origem, tem um papel importante na produção de embriões viáveis.
2.3.3 Co-cultivo com parede folicular e o bloqueio temporário da maturação
Acredita-se que o baixo desenvolvimento de oócitos maturos in vitro é devido à
assincronia entre maturação nuclear e citoplasmática (EPPIG et al., 1994). Diante disso,
numerosos estudos sugerem que o bloqueio temporário da meiose pode sincronizar a
maturação nuclear e citoplasmática, tanto in vivo (WIERSMA et al., 1998) quanto in
vitro (ratos: TSAFRIRI et al., 1996; COTICCHIO et al., 2004, bovinos: MAYES et al.,
2002; THOMAS et al., 2002; macaco: JENSEN et al., 2002). Portanto, o conhecimento
sobre o processo de bloqueio meiótico da maturação oocitária é fundamental para o
aprimoramento de técnicas eficazes na produção in vitro de embriões.
O mecanismo mais aceito atualmente sobre o bloqueio meiótico está diretamente
relacionado a elevadas concentrações intra-oocitárias de AMPc, reguladas pela
atividade entre as enzimas adenilato-ciclase (AC) e as fosfodiesterases (PDE). Essas
22
enzimas são responsáveis pela síntese e degradação de AMPc, respectivamente (FIMIA;
SASSONE-CORSI, 2001; CONTI et al., 2002). Pelo menos 11 isoenzimas de PDE já
foram identificadas (MANGANIELLO et al, 1995; SODERLING; BEAVO, 2000).
Entretanto, apenas as PDE do tipo 1, 3, 4, 8 e 9 estão localizadas nos compartimentos
foliculares. A PDE3 está principalmente envolvida no metabolismo de AMPc em
oócitos, enquanto que a PDE4 está envolvida no metabolismo do AMPc nas células da
granulosa (CONTI et al., 2002; SASSEVILLE et al., 2006). Considerando essas
características, LOOS et al (1994) utilizaram paredes de folículos antrais imaturos (3-6
mm) bovinos como protocolo para o bloqueio da meiose, mantendo os oócitos em
estádio de vesícula germinal intacta, permitindo a sincronização das maturações
citoplasmática e nuclear, (LOOS et al., 1994). Desta forma, a presença da PDE 4 pode
ter favorecido o bloqueio da progressão da meiose.
2.4 FOSFODIESTÉRASES (PDES)
Fosfodiesterases - PDEs são enzimas que degradam nucleotídeos cíclicos
intracelulares, o AMPc ou o monofosfato cíclico de guanosina (GMPc), inativando-os.
Em mamíferos, estas enzimas compreendem atualmente uma família de onze
fosfodiesterases (tabela 1) (CONTI, 2000). Elas estão presentes em todos os órgãos,
incluindo o coração, os pulmões, os olhos, o cérebro e tecidos eréteis. As PDEs podem
hidrolisar AMPc e GMPc. As PDEs 4, 7 e 8 são enzimas que degradam AMPc (CONTI,
2000; SODERLING; BEAVO, 2000) e as PDEs 5, 6 e 9 degradam GMPc. Já as PDEs
1, 2, 3, 10 e 11 degradam tanto o AMPc como o GMPc (BEAVO, 1995; CONTI, 2000;
SODERLING; BEAVO, 2000).
Cinco das onze famílias das PDEs estão presentes nos ovários: PDE1, PDE3,
PDE4, PDE8 e PDE9 (BEAVO, 1995; CONTI, 2000; CONTI; JIN, 1999; CONTI et al.,
1991; FISHER et al., 1998; GILULA et al., 1978). A PDE1 está presente nas células da
granulosa e células da teca em ratos (CONTI et al., 1984) e no oócito de camundongos
(BORNSLAEGER et al., 1984). Entretanto, a expressão da PDE3 foi relatada
unicamente no oócito (NOGUEIRA et al., 2003; JENSEN et al., 2002; RICHARD et al.,
2001; TSAFRIRI et al., 1996; REINHARDT et al., 1995) ao contrário da PDE4 que é
expressa tanto nas células da granulosa como nas células da teca (TSAFRIRI et al.,
1996).
23
Tabela 1: Lista de inibidores específicos da fosfodiesterase (Francis et al., 2001).
Inibidores
Família
Vinpocetine, Zaprinast e SCH5 1866
PDE1
EHNA
PDE2
Cilostamine. Milrinone, Amrinone, Enoximone e Lixazinone
PDE3
Rolipram, RO 20-111724, Denbufyline e Sadarverine
PDE4
Sidenafil (Viagra), Zaprinast, DMPPO, E4021, SCH5 1866 e GF248
PDE5
Sidenafil (Viagra), Zaprinast, DMPPO, E4021 e GF248
PDE6
Benzothieno-et benzothiadiazine dioxides
PDE7
PDE8
Dipyridamole e (IBMX - insensible)
Zaprinast e (IBMX - insensible)
PDE9
Papaverine
PDE10
Zaprinast e Dipyridamole
PDE11
2.4.1 Fosfodiesterase tipo 3
As fosfodiesterases do tipo 3 degradam AMPc em 5'-AMP. Contudo, esta é a
única família de fosfodiesterases que é bloqueada pela ação do GMPc (REINHARDT et
al., 1995). A PDE3 tem dois genes que codificam para as enzimas A (A1, A2 e A3:
CHOI et al., 2001; SHITSUKAWA et al., 2001) e B (3B: DEGERMAN et al., 1997). A
PDE 3A e 3B têm a mesma organização estrutural. Estas duas formas são expressas e
reguladas em diferentes tipos celulares. Por exemplo, o PDE3A encontrada nas
plaquetas, no coração (OKRUHLICOVA et al., 1,996) e na placenta (CHOI et al.,
2001). O PDE3A está envolvida na agregação plaquetária (FEIJGE et al., 2004) e no
controle da contração cardíaca (HERRING et al., 2001). Já a PDE3B é encontrada nos
adipócitos, promovendo a sua diferenciação (TAIRA et al., 1993), nas células
pancreáticas β (HARNDAHL et al., 2002), nos mecanismos da lipólise e da glicólise,
bem como na regulação da ingestão de nutrientes, no hipotálamo em resposta à leptina
através PI-3kinases (ZHAO et al., 2002). Ambas PDE3 A e B estão também envolvidas
no relaxamento das células do musculo liso vascular (REINHARDT et al., 1995;
UCKERT et al., 2004).
A PDE3A é a forma predominante expressa em oócitos de mamíferos. No
folículo ovariano, a PDE3 foi localizada em oócitos de camundongos (TSAFRIRI et al.,
1996; SHITSUKAWA et al., 2001), macacos (JENSEN et al., 2002) e humanos
24
(NOGUEIRA et al., 2003). Para promover a parada meiótica dos oócitos pode ser usado
inibidores não-específicos (DEKEL; BEERS, 1978; 1980) ou o uso de inibidor
específico da PDE-3 (TSAFRIRI et al., 1996; WIERSMA et al., 1998). A inibição desta
enzima bloqueia o recomeço da meiose in vitro e in vivo em camundongos (TSAFRIRI
et al., 1996; WIERSMA et al., 1998), bem como sua utilização aumenta a taxa de
formação
de
blastocistos,
promovendo
o
desenvolvimento
embrionário
em
camundongos (NOGUEIRA et al., 2003).
2.4.2 Fosfodiesterase tipo 4
A família da fosfodiesterase tipo 4 tem uma afinidade elevada para a hidrólise de
AMPc. Ela é encontrada nos pulmões (TOWARD; BROADLEY, 2004), cérebro ou
neurônios corticais (D'Sa et al., 2002). Elas são codificadas por quatro genes: PDE4 A,
B, C e D. Há mais de 20 variantes de PDE4 presentes em células do ovário. No folículo
de camundongos, utilizando a hibridação in situ revelou-se a presença de PDE4B nas
células da teca, enquanto PDE4D foi encontrada nas células da granulosa (TSAFRIRI et
al., 1996).
Camundongos knockout para PDE4D apresentaram uma taxa muito baixa de
fertilidade, bem como diminuição da taxa de ovulação em comparação com
camundongos selvagens (JIN et al., 1999) provavelmente devido à diminuição da
expressão do gene durante a diferenciação em células da granulosa (JIN et al., 1999;
RICHARD et al., 2003). Em todos os casos, a expressão in vivo de PDE4D é importante
para a diferenciação normal de células da granulosa e uma taxa normal de ovulação e
fertilização.
25
3. JUSTIFICATIVA
A execução de um projeto de pesquisa com enfoque na biotecnologia da
reprodução animal se justifica pela importância do modelo animal, do protocolo
escolhido, bem como na provável contribuição original dos resultados obtidos para a
ciência. De forma sucinta será abordado a seguir os três aspectos da justificativa
mencionados acima.
1. Escolha da espécie:
As espécies caprina e bovina são de grande interesse sócio-econômico no Brasil,
em função de seu importante papel na produção de carne, pele e leite, bem como
modelo experimental para animais que estão em risco de extinção, apresentam alto valor
genético ou ainda em humanos.
2. Escolha da técnica de pré-maturação in vitro:
A remoção dos complexos cumulus oócitos do ambiente ovariano pode provocar
o reinício precoce da maturação nuclear, sem que a maturação citoplasmática tenha
ocorrido, consequentemente diminuindo sua competência ao desenvolvimento. Frente a
esse problema a técnica de pré-maturação in vitro visa retardar a maturação nuclear
permitindo sua sincronização com a maturação citoplasmática. Assim torna-se
potencialmente possível obter uma população homogênea de oócitos no mesmo estágio
de maturação, aumentando, de forma significativa, a quantidade de oócitos competentes.
Além disso, esta técnica permite a flexibilização do tempo de transporte de oócitos do
campo ao laboratório, preservando sua viabilidade. Ainda, no que diz respeito à oócitos
inclusos em folículos pré-antrais crescidos in vitro, essa técnica pode auxiliar a elevar as
taxas de maturação impedindo que os oócitos retomem a meiose durante o cultivo in
vitro.
3. Originalidade do trabalho:
Até o presente momento diversos inibidores foram testados no intuito de retardar
o reinicio da maturação nuclear em bovinos. Entretanto, a associação destes inibidores
com a parede folicular ainda não foi testado. Além disso, em caprinos não existem
estudos utilizando protocolos de pré-maturação utilizando inibidores da retomada da
26
meiose. Portanto, a originalidade deste trabalho foi à investigação dos efeitos in vitro da
pré-maturação com cilostamida associada à parede folicular sobre a cinética de
maturação e viabilidade in vitro de oócitos caprinos e bovinos.
27
4. HIPÓTESE CIENTÍFICA
- A utilização de um inibidor da fosfodiesterase tipo 3 (cilostamida) associada à parede
folicular afeta de forma concentração e tempo de exposição dependentes o percentual de
oócitos viáveis e a cinética de maturação oocitária em caprinos e bovinos.
28
5. OBJETIVOS
5.1. Geral:
- Estudar a cinética de maturação in vitro em oócitos caprinos e bovinos.
- Avaliar o efeito da cilostamida associada à parede folicular durante a pré-maturação
sobre a taxa de viabilidade oocitária e a cinética de maturação nuclear.
3.2. Específicos:
- Determinar as taxas de VG, RVG, MI e MII após 6, 12, 18 e 30 horas de maturação in
vitro nas espécies caprina e bovina.
- Investigar o efeito de duas concentrações de cilostamida (10 µM e 20 µM) e tempos de
exposição (6, 12 e 18 horas) durante a pré-maturação in vitro sobre as taxas de
viabilidade e maturação oocitária.
29
6. CAPÍTULO 1
Cilostamida afeta de modo concentração e tempo de exposição dependente a
viabilidade e a cinética da maturação in vitro de oócitos caprinos e bovinos
Cilostamide affects in a concentration and exposure time dependent manner the viability
and the kinetics of in vitro maturation of caprine and bovine oocytes
Artigo submetido ao periódico: Animal Reproduction
Em: novembro de 2014
30
Cilostamide affects in a concentration and exposure time dependent manner the
viability and the kinetics of in vitro maturation of caprine and bovine oocytes
H.H.V. Correia¹*, L.A. Vieira¹, C.M. Mielgo¹, V.R. Araújo¹, R.M.P. Rocha¹, N.A. Ribeiro de
Sá¹, A.P.R. Rodrigues¹, J.R. Viana², J.R. Figueiredo¹
¹ Laboratory of Manipulation of Oocytes and Preantral Follicles (LAMOFOPA www.lamofopa.com.br) - State University of Ceará (UECE) - +55 (85) 3101.9852.
² Federal University of Ceará - Sobral, Brazil
* Corresponding author: [email protected]
Phone/Fax: +55(85)8578-8684.
31
Abstract
The aim of this study was to evaluate the effect of in vitro pre-maturation with
cilostamide associated with follicular wall on viability and nuclear maturation kinetics
of caprine and bovine oocytes. Cumulus-oocyte complexes were either in vitro matured
for 30 h (conventional in vitro maturation) or submitted to in vitro pre-maturation with
cilostamide (10 µM and 20 µM) for 6, 12 and 18 h associated with follicular wall
followed by 24, 18 and 12 h of in vitro maturation. The results showed cilostamide at 10
µM (caprine - 6 and 18 h, bovine - 12 and 18 h) and 20 µM (bovine - 6, 12 and 18 h)
significantly reduced the percentage of viable oocytes compared to the control.
Regarding to maturation kinetics, cilostamide at 10 µM (caprine - 6 and 18 h; bovine 12 and 18 h) and 20 µM (caprine - 12 and 18 h; bovine-6 and 12 h) caused a delay in the
meiotic progression and significantly reduced the rate of metaphase II (MII). On the
other hand, the exposure to cilostamide at 10 µM (caprine - 12 h, bovine - 6 h) and 20
µM (caprine 6 h; bovine- 18 h) showed MII rates similar to the control. In conclusion,
the cilostamide associated with follicular wall affected in a concentration and exposure
time manner the percentage of viable oocytes and the kinetics of oocyte maturation in
caprine and bovine species.
Keywords: cilostamide, pre-maturation, meiosis arrest, caprine, bovine.
32
1. Introduction
The maturation of mammalian oocytes is a complex process involving
synchronization between cytoplasmic maturation which consists in the reorganization of
the intracellular organelles, the mRNA storage, proteins and transcription factors, and
nuclear maturation that involves mainly chromosome segregation (Watson, 2007; Mao
et al., 2014). In vitro matured oocytes are not able to complete cytoplasmic maturation
and resume meiosis simultaneously limiting their potential for development (Chian et
al., 2004). This asynchrony is due to the spontaneous nuclear maturation which leads to
chromatin condensation, thus preventing RNA synthesis and the accumulation of
several molecules essential for early development (Bilodeau, 2012). The use of
strategies to regulate the meiotic cell cycle would be a useful alternative to avoid the
asynchrony between nuclear and cytoplasmic maturation. It is believed that cyclic
adenosine monophosphate (cAMP) plays a fundamental role in the maintenance of
mammalian meiotic arrest. The increase of intra-oocyte levels of cAMP is essential to
maintain meiotic arrest in vitro (Conti et al., 2002) and improve the synchronization
between nuclear and cytoplasmic maturation (Nogueira et al., 2003). In addition,
numerous studies suggested that during maturation, temporary blockage can
synchronize nuclear and cytoplasmic maturation, either in vivo (Wiersma et al., 1998) or
in vitro (bovine, Mayes et al., 2002; Thomas et al., 2002; monkey, Jensen et al., 2002
and mice, Coticchio et al., 2004). The temporary arrest of nuclear maturation of human
oocytes with the specific phosphodiesterase type 3 inhibitor (iPDE3) has proven to be
beneficial to obtain meiotic spindle configuration and normal chromosomes after the in
vitro maturation (IVM), and also resulted in synchronization of germinal vesicle (GV)
stage oocytes (Vanhoutte et al., 2007). In bovine cumulus oocyte complexes (COCs) cocultured with the follicular wall for 24 h maintained all of their enclosed oocytes in GV
stage (Loos et al., 1994). Furthermore, in human IVM, the use of iPDE3 at 10 µM for
24 h pre-maturation increased the rates of nuclear maturation without compromising
embryonic development (Nogueira et al., 2006). In porcine, iPDE3 at 1µM for 24 h prematuration improved developmental competence of in vitro matured oocytes (Dieci et
al., 2013) and increased the fertilization and embryo development rates.
Despite the importance of the synchronization of cytoplasmic and nuclear
maturation reported in the aforementioned studies, there are no in vitro reports on the
33
utilization of cilostamide in caprine oocytes. Therefore, the aim of this study was to
evaluate the effect of pre-maturation with follicular wall associated with cilostamide,
at different concentrations (10 µM and 20 µM) and exposure times (6, 12 and 18 h), on
the viability and the kinetics of nuclear maturation of caprine and bovine oocytes.
2. Materials and methods
The reagents and chemical used in this study were obtained from Sigma
Chemical Co. (St. Louis, MO, USA) unless otherwise indicated.
2.1. Source of ovaries
Ovaries (n = 80) of 40 adult crossbred cows and goats were collected at a local
slaughterhouse. Immediately post mortem, each pair of caprine and bovine ovaries was
washed twice in physiological saline solution (0,9% (w/v) NaCl) supplemented with
antibiotics (100 μg/mL kanamycin sulphate). Ovaries were transported to the laboratory
in an insulated container in physiological saline solution 0.9% at 33 °C within 4 h of
collection (Coy et al., 2008; Santiquet et al., 2014).
2.2. Collection and In vitro maturation of cumulus-oocytes complexes
In the laboratory, COCs were aspirated from medium-sized follicles (2-4 mm in
diameter in caprine and 4-6 mm in bovine) using 18-G needles connected to 10-mL
disposable syringes. Oocytes with a compact cumulus mass and a dark, evenly
granulated, cytoplasm were washed in 5 mL of tissue culture medium (TCM-199)
supplemented with 1% polyvinyl alcohol, 4.2 mM sodium bicarbonate, 10 mM HEPES,
2 mM glutamine, 50 UI/mL penicilin and 50 µg/mL streptomycin for bovine oocytes
and TCM-199 supplemented with 10 mM HEPES, 15% fetal calf serum (FCS) and 1%
antibiotics (streptomycin and penicillin) for caprine oocytes. Thus, COCs were washed
twice in the maturation medium without hormones previously equilibrated for at least 2
h at 38.5 ºC. The selected caprine and bovine oocytes were washed three times in the
maturation medium consisting of TCM-199 supplemented with 10% FCS, 0.2 mM
sodium pyruvate, 2 mM L-Glutamine, 0.05 μg/mL gentamicin, 10 UI/mL eCG and 10
34
UI/mL hCG for bovine oocytes. For caprine oocytes, the maturation medium was TCM199 supplemented with 1 mg/mL BSA, 1 mM/mL pyruvate, 0,5 µg/mL FSHr, 5 µg/mL
LH, 1 µg/mL 17β-estradiol, 10 ng/mL epidermal growth factor, 50 ng/mL insulin-like
growth factor 1 and 100 µM/mL cysteamine. Group of 25 to 30 oocytes were cultured
in 4-well multidish (Nunc, Roskilde, Denmark) containing 400 µL of maturation
medium for both species and incubated for 30 h at 39 °C and 5% CO2 in air.
2.3. Isolation of follicular walls
Follicles with 2-4 mm in caprine and 4-6mm in bovine were obtained by
isolation using forceps and scalpel blade. After isolation, follicles were divided into two
halves with a blade and transferred into petri dishes (35×10 mm; Corning, USA)
containing TCM-199 HEPES and antibiotics. After isolation, follicular walls (two
halves for each well) were co-cultured with COCs in medium supplemented with
cilostamide during in vitro pre-maturation as described further in the experimental
design.
2.4. Preparation of stock solutions of cilostamide
Cilostamide was diluted in dimethylsulfoxide at a concentration of 1.5 M and
stored at -20 ºC. These stock solutions were diluted in IVM medium to produce the final
concentrations of 10 mM/L or 20 mM/L.
2.5. Morphological evaluation
Only those COCs that showed an intact zona pellucida, bright and homogeneous
cumulus cells and no dark oocyte were selected. COCs were classified as degenerated
when the oocytes and surrounding cumulus cells appeared dark or if the oocytes were
misshapen.
35
2.6. Assessment of viability and nuclear chromatin configuration of caprine and
bovine oocytes after conventional in vitro maturation
After maturation for 6, 12, 18 and 30 h COCs were denuded mechanically by
repeated pipetting, with a pre-calibrated eyepiece micrometer using a stereomicroscope
(SMZ 645 Nikon, Tokyo, Japan) at 100× magnification, assessed for viability and
nuclear chromatin configuration. The oocytes were labeled with 4 μM calcein-AM (488
nm), 2 μM ethidium homodimer-1 (568 nm) and 10 μM Hoechst 33342 (483 nm),
mounted on slides and examined using a fluorescence microscope (Nikon, Eclipse 80i,
Tokyo, Japan). The oocytes were considered viable when the cytoplasm positively
marked by calcein-AM in green and non-viable if the core is marked by ethidium
homodimer-1 in red. Calcein demonstrated the activity of intracellular esterases of
viable cells and the ethidium homodimer-1 marked the nucleic acids of non-viable cells
with ruptured membranes. Hoechst 33342 staining was used to assess of chromatin
configuration viewing of the stages of intact GV, the germinal vesicle breakdown
(GVBD), metaphase I (MI) and metaphase II (MII).
2.7. Experimental design
This experiment was conducted to evaluate the effect of in vitro pre-maturation
(IVPM) with different concentrations of cilostamide and exposure times on the viability
and chromatin configuration of caprine and bovine oocytes. The IVPM medium
consisted of IVM medium without hormones. Briefly, COCs were randomly allocated
in 4-well multidish plates containing IVM medium alone (control) or IVPM medium
supplemented with cilostamide (10 mM/L and 20 mM/L) both concentrations associated
with 2 halves of follicular walls. Thus, 20-30 oocytes were transferred to 400 µL of
IVPM in the multidish and incubated for 6, 12 and 18 h at 39 °C and 5% CO2 in air.
After the exposure times and the removal of cilostamide and follicular walls, the COC
were transferred to fresh IVM medium without cilostamide and follicular walls and
cultured for additional 24, 18 and 12 h, respectively totaling a maximum period of 30 h
of culture for all seven treatments (see Table 1). At the end of IVM, all COCs were
completely denuded using hyaluronidase, and the chromatin configuration and the
viability of their oocytes were evaluated.
36
Table 1. Conventional IVM (control) and IVPM of caprine and bovine oocytes.
Treatments
Control
IVPM (h) IVM (h) TOTAL (h)
-
30
30
Cilo 10 µM
6
24
30
+
12
18
30
FW
18
12
30
Cilo 20 µM
6
24
30
+
12
18
30
FW
18
12
30
(Conventional IVM)
IVPM: In Vitro Pre-Maturation (cilostamide plus follicle walls). IVM: In Vitro
Maturation. Cilo: Cilostamide. FW: Follicular wall.
2.9. Statistical analysis
Data were analyzed as a dispersion of frequency by using Chi-square test (or
Fisher’s Exact Test when observed frequency was less than five). Differences were
considered significant when P<0.05, and the results were expressed as percentages.
3. Results
The rate of oocyte viability is shown in the Table 2. A total of 240 caprine and
235 bovine oocytes were evaluated. COCs exposed to 10 µM (caprine - 6 and 18 h;
bovine - 12 and 18 h) and 20 µM cilostamide (bovine - 6, 12 and 18 h) showed a
significant reduction in the percentage of viable oocytes compared to the control.
However, when COCs were exposed to 10 µM (caprine - 12 h; bovine - 6 h) and 20 µM
(caprine - 6, 12 and 18 h) no significant difference was observed.
37
Table 2. Percentages of viable caprine and bovine oocytes after IVPM with different
exposure time and concentration of cilostamide.
Oocyte survival (viable) (%)
Treatments
IVPM
Caprine
Bovine
Control
0
100.00 (30/30)a
100.00 (25/25)a
10µM
6
74.29 (26/35)b
88.57 (31/35)ab
cilostamide
12
91.43 (32/35)ab
82.86 (29/35)b
18
80.00 (28/35)b
82.86 (29/35)b
20 µM
6
88.57 (31/35)ab
80.00 (28/35)b
cilostamide
12
97.14 (34/35)a
80.00 (28/35)b
18
88.57 (31/35)ab
80.00 (28/35)b
Different lowercase letters denote significant differences among the different exposure
times, concentrations of cilostamide and control (P<0.05).
Table 3. Meiotic stages of caprine and bovine oocytes after different time points of
IVM.
Time Points of IVM
Meiotic stages
(%)
Caprine
Bovine
6
12
18
30
GV
------
------
------
------
GVBD
20.00 (6/30)A
13.33 (4/30)A
13.33 (4/30)A
A
-----33.33 (10/30)B
60.00 (18/30)
MII
20.00 (6/30)B
13.33 (4/30)B
66.67 (20/30)A
66.67 (20/30)A
GV
------
------
------
------
------
------
16.00 (4/25)
B
20.00 (6/30)
B
MI
A
73.33 (22/30)
A
GVBD
60.00 (15/25)
MI
32.00 (8/25)A
44.00 (11/25)A
24.00 (6/25)A
32.00 (8/25)A
MII
------
32.00 (8/25)B
76.00 (19/25)A
60.00 (15/25)A
Significant differences among different times of maturation in the same line are
indicated by uppercase letters (P<0.05).
Table 3 presents the percentage of caprine and bovine oocytes in different stages
of maturation (GV, GVBD, MI and MII) after different time points during conventional
IVM (6, 12, 18 and 30 h). In both species, the rates of MII were similar (P>0.05) after
18 and 30 h of maturation, being superior to 6 and 12 h of IVM (P<0.05).
38
Regarding to the maturation kinetics, the exposure to 10 µM cilostamide
(caprine - 6 and 18 h, bovine - 12 and 18 h) and 20 µM (caprine -12 and 18 h, bovine - 6
and 12 h) caused a delay in the meiotic progression and reduced significantly MII rates
(Table 4 and 5). On the other hand, the exposure to 10 µM (caprine - 12 h, bovine - 6 h)
and 20 µM (caprine - 6 h; bovine - 18 h) showed rates of MII similar to the control.
Table 4. Meiotic stages of caprine oocytes after IVPM with different exposure time and
concentration of cilostamide.
Table 4
Treatment
GV
GVBD
MI
MII
Control
Exposure
time (h)
0
------
6.66 (2/30)a
26.67 (8/30)c
66.67 (20/30)a
10 µM
6
------
22.86 (8/35)a
31.43 (11/35)bc
20.00 (7/35)cd
10 µM
12
------
22.86 (8/35)a
17.14 (6/35)c
51.43 (18/35)a
10 µM
18
------
11.43 (4/35)a
57.14 (20/35)a
11.43 (4/35)d
20 µM
6
------
11.43 (4/35)a
34.29 (12/35)abc
42.86 (15/35)ab
20 µM
12
------
14.29 (5/35)a
45.71 (16/35)ab
37.14 (13/35)bc
20 µM
18
------
20.00 (7/35)a
45.71 (16/35)ab
22.86 (8/35)bcd
Significant differences among treatments in the same column are indicated by lowercase
letters (P<0.05).
Table 5. Meiotic stages of bovine oocytes after IVPM with different exposure time and
concentrations of cilostamide.
Treatment
GV
GVBD
MI
MII
Controle
Exposure
time (h)
0
------
------
32.00 (8/25)ab
68.00 (17/25)a
10 µM
6
------
5.71 (2/35)a
28.57 (10/35)b
54.29 (19/35)ab
10 µM
12
------
5.71 (2/35)a
42.86 (15/35)ab
34.29 (12/35)bc
10 µM
18
------
11.43 (4/35)a
48.57 (17/35)ab
22.86 (8/35)c
20 µM
6
------
2.86 (1/35)a
57.14 (20/35)a
20.00 (7/35)c
20 µM
12
------
2.86 (1/35)a
54.29 (19/35)a
22.86 (8/35)c
20 µM
18
------
------
42.86 (15/35)ab
37.14 (13/35)abc
Significant differences among treatments in the same column are indicated by lowercase
letters (P<0.05).
39
4. Discussion
This study investigated for the first time the effects of IVPM with cilostamide
(different concentrations and exposure times) associated with the follicular wall on the
viability and kinetics of IVM of caprine oocytes. The results showed that the
concentration and exposure time of cilostamide affected the percentages of viable
oocytes and the kinetics of IVM in caprine and bovine species. Cilostamide is a
phosphodiesterase-3 inhibitor that has been used to block nuclear meiosis inducing its
synchronization with the cytoplasmic maturation of oocytes (Nogueira et al., 2003,
2006; Stouffer and Zelinski-Wooten, 2004; Vanhoutte et al., 2008). This inhibitory
effect of the phosphodiesterase-3 has been demonstrated in several species such as mice
(Nogueira et al., 2003), bovine (Albuz et al., 2010; Luciano et al., 2011) and human
(Nogueira et al., 2006).
Regarding to oocyte viability, the results showed that caprine oocytes exposed to
10 µM cilostamide associated with the follicular wall for 6 and 18 h decreased the
percentage of viable oocytes compared to the control. However, in bovine only 10 µM
cilostamide for 6 h did not reduce significantly the viability when compared to the
control. It is quite possible that these two species have different metabolic properties
and the tolerance to cilostamide (concentrations and exposure time), responding
disparately to the high level of cAMP within the oocyte (Bilodeau et al., 1993). With
regard to the kinetics of oocyte maturation, cilostamide at 10 µM (caprine - 6 and 18 h,
bovine - 12 and 18 h) and 20 µM cilostamide (caprine - 12 and 18 h, bovine - 6 and 12
h) caused a delay in the meiotic progression reducing significantly the MII rates.
Several studies have shown that exist a large variability of bovine oocytes in response to
the arrest of meiosis induced by cilostamide (Mayes and Sirard, 2002; Luciano et al.,
2011). Thomas et al, (2002) demonstrated meiotic arrest occurred when bovine COCs
and denuded oocytes were exposed to 50 µM cilostamide during 16 h of pre-IVM.
Although, the arrest of meiosis at MI with cilostamide can be possible in caprine, in
other species such as mice, there have been observed more than 90 % of the meiotic
arrest in GV stage (Vanhoutte et al., 2008). The reason for the diverse response to
cilostamide on meiotic arrest in different stage of development, in addition to the
species differences, could be due to the source of the oocytes. Caprine oocytes are
usually obtained from slaughterhouse ovaries being extremely heterogeneous in terms
40
of quality and development, unlike to the mouse oocytes recovery that is more
controlled (Thomas et al., 2002; Albuz et al., 2010).
The combination of concentration-exposure time to cilostamide seems to
influence markedly the rates of in vitro maturation. In ovine, the MII rates of oocytes
pre-matured for 22 h with 10 and 20 µM cilostamide were significantly lower than the
control (Gharibi et al., 2013). Nevertheless, when it was used a lower concentration (1
µM) no significant difference was observed when compared to the control. The present
study examined the kinetics (GV, GVBD, MI and MII) of IVM in caprine and bovine
oocytes after different culture periods (6, 12, 18 and 30 h). The results showed higher
rates of MII in caprine and bovine oocytes at 18 h of culture without any significant
increase in longer culture periods. Similar results were obtained by other authors, which
reported that the time required for IVM of bovine oocytes was 18-24 h (Sirard et al.,
1989; Wu et al, 1996; Dode and Adona, 2001; Merton et al., 2003). In contrast, caprine
oocytes required longer culture period (32 h) to complete IVM (Sharma et al., 1996).
In the present study, caprine oocytes exposed to 10 µM cilostamide for 12 h or
20 µM cilostamine for 6 h and pre-maturation bovine oocytes exposed to 10 µM
cilostamine for 6 h and 20 µM cilostamine for 18 h showed no significant difference in
the rates of maturation when compared to their respective controls without cilostamide.
We believed that this good result is due to the optimal combination of concentrationexposure time to cilostamide with exposure times of 6 and 12 h during pre-maturation.
We suggest that in such conditions the presence of the inhibitor has provided adequate
cAMP levels (Conti et al., 2012) which could contribute to a better synchronization
between nuclear and cytoplasmic maturation (Nogueira et al., 2003). In addition,
supporting this idea, Albuz et al. (2010) have reported some advantage of the PDE
inhibitors in pre-IVM, i.e., avoiding aging and the loss of oocyte and cumulus cells.
In conclusion, the combination of concentration-exposure time to cilostamide
associated with the follicular wall during pre-IVM influenced the viability and the
kinetics of IVM of caprine and bovine oocytes. Exposure to 10 µM cilostamide (caprine
- 12 h; bovine - 6 h) maintained survival rates and MII comparable to the control, and
may be used to increase in vitro embryo production in the future.
41
Acknowledgments
This research was supported by grants from the National Council for Scientific and
Technological Development (CNPq-79/2013 linha 3 – Rede Nordeste de Biotecnologia
(Rede de pesquisa do ovário artificial) – Processo N° 407594/2013-2). Hudson
Henrique Vieira Correia is the recipient of a grant from CNPq (Brazil). The authors
thank José Roberto Viana for donating cilostamide. Luis Alberto Vieira and Caroline
Maside Mielgo for assistance in manuscript preparation.
42
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46
7. CONCLUSÃO
Em conclusão, a combinação de concentração/tempo de exposição à cilostamida
associada com parede folicular durante a pré-MIV influenciou a viabilidade e a cinética
de MIV de oócitos caprinos e bovinos. A exposição a 10 µM de cilostamida (caprinos 12 h; bovina - 6 h) manteve as taxas de sobrevivência e MII comparáveis ao controle
podendo ser potencialmente utilizadas no futuro como estratégia para aumentar a
produção in vitro de embriões no futuro.
47
8. PERSPECTIVAS
O presente trabalho definiu condições básicas (concentração e tempo de
exposição à cilostamida associada à parede folicular) para a pré-maturação in vitro de
CCOs caprinos e bovinos. A etapa seguinte será avaliar o efeito da pré-maturação nas
taxas de produção embrionária in vitro a partir de oócitos crescidos in vivo (aspiração
folicular) e in vitro (cultivo de folículos pré-antrais) caprinos e bovinos.
48
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