COOMBS DIRETO
PESQUISA DE ANTICORPOS IRREGULARES
PROVA DE COMPATIBILIDADE
TÉCNICA DO COOMBS DIRETO (CD) OU
TESTE DA ANTIGLOBULINA HUMANA DIRETO (TAD)
O Teste de Coombs direto (CD) ou teste da Antiglobulina humana direto
(TAD), demonstra a presença de hemácias sensibilizadas por anticorpos ou
frações do complemento “in vivo”.
É utilizado no estudo de diversas patologias:
Doença Hemolítica do Recém-nato.
Anemias hemolíticas auto-imune (AHAI)
Reação hemolítica transfusional.
TÉCNICA DO COOMBS DIRETO (CD) OU
TESTE DA ANTIGLOBULINA HUMANA DIRETO (TAD)
AGH
Ctl
1. Coletar a amostra de sangue
2. Preparar uma suspensão de hemácias à mais ou menos 3-5%.
3. Colocar uma gota desta suspensão em um tubo de hemólise.
4. Lavar três vezes com salina fisiológica.
5. Adicionar 2 gotas da antiglobulina humana poli-específica (anti-IgG e
anti-C3d)
6. Centrifugar 3400 rpm 15 segundos
7. Ressuspender suavemente o botão de hemácias
8. Observar a presença ou não de aglutinados
9. Anotar os resultados
Teste de Coombs direto


Ausência de aglutinação = Coombs direto
negativo
Presença de aglutinação - Coombs direto positivo
Hemácias sensibilizadas “in vivo” por anticorpos ou fracões
do Complemento
AGH
AGH
IgG
Complemento
INTERPRETAÇÃO DOS RESULTADOS
Ocorrendo ausência de aglutinação o teste é negativo – Teste de Coombs direto
negativo
Ocorrendo aglutinação o teste é positivo - Teste de Coombs direto positivo
VALIDAÇÃO DA REAÇÃO COM ANTIGLOBULINA HUMANA
Sempre que a AGH for utilizada e necessário a realização do Controle de Coombs
10. Quando a reação for negativa adicionar 1 gota do Reagente Controle de Coombs.
11. Centrifugar e ler
O resultado deverá ser agora positivo caso contrário houve falha técnica


Ausência de aglutinação
Falha Técnica
Presença de aglutinação
Validação da reação
CAUSAS DE ERRO NA INTERPRETAÇÃO QUANDO UTILIZA-SE A AGH
São causas de reação Falso-positivo:
•
Vidraria mal lavada
•
Centrifugação excessiva
•
Salina contendo partículas de sílica coloidal
São causas de reação Falso-negativo:
•
Lavagem inadequada das hemácias
•
Reagente AGH sem reatividade
•
Preparo inadequado das suspensões de hemácias
•
Sub-centrifugação
Considerações sobre o teste
O teste de Coombs direto positivo pode não estar associado a Anemia
hemolítica auto-imune e ainda assim não ser falso-positivo.
3% dos pacientes que recebem penicilina e 15% dos que recebem alfametildopa podem desenvolver Coombs direto positivo mas só 1% destes
indivíduos terão Anemia hemolítica Auto-imune.
6 a 8% dos pacientes internados em hospitais podem ter CD positivo sem
manifestações clinicas de destruição acelerada das hemácias (Garratty G,
Transfusion Medicine Review 1987; 1:47-57)
Com os reagentes atuais , cuja sensibilidade é maior para detectar moléculas
de imunoglobulinas e Complemento, a possibilidade de encontrarmos teste de
Coombs direto positivo sem hemólise é maior.
TESTE DE COOMBS DIRETO POLIESPECÍFICO
POSITIVO
NEGATIVO
SENSIBILIZAÇÃO
“IN VIVO”
AUTOANTICORPOS
AUSÊNCIA DE
SENSIBILIZAÇÃO
“IN VIVO”
ALOANTICORPOS
COOMBS DIRETO
MONOESPECÍFICO
IgG / IgM / IgA / Frações do
Complemento
SENSIBILIZAÇÃO NÃO
DETECTADA
ELUIÇÃO DIRETA
OBRIGATÓRIA NOS CASOS DE
REAÇÃO TRANSFUSIONAL
Sistemas de grupos sanguíneos, genes, localização
cromossômica
No
Sistema
Símbolo
Gene
001
ABO
ABO
ABO
9q34.1-q34.2
002
MNS
MNS
GYPA,
GYPB,GYPE
4q28-q31
003
P
P1
P1
22q11.2-qter
004
Rh
RH
RHD,RHCE
1p36.20-34
005
Lutheran
LU
LU
19q12-q13
006
Kell
KEL
KEL
7q33
007
Lewis
LE
FUT3
19p13.3
008
Duffy
FY
FY (DARC)
1q22-q23
009
Kidd
JK
JK
18q11.1-q11.2
010
Diego
DI
AE1 (SLC3AE1)
17q12-q21
011
Yt
YT
ACHE
7q22
012
Xg
XG
XG
Xp22.32
013
Scianna
SC
SC
1p36.2-p22.1
Localização Cromossômica
Sistemas de grupos sanguíneos, genes, localização
cromossômica
No
Sistema
014
Dombrock
DO
DO
12p13.2-12p12.1
015
Colton
CO
AQP1
7p14
016
Landsteiner-Wiener
LW
LW
19p13.2-cen
017
Chido/Rodgers
CH/RG
C4A, C4B
6p21.3
018
Hh
H
FUT1
19q13
019
Kx
XK
XK
Xp21.1
020
Gerbich
GE
GYPC
2q14-q21
021
Cromer
CROM
DAF
1q32
022
Knops
KN
CR1
1q32
023
Indian
IN
CD44
11p13
024
Ok
OK
CD147
10pter-p13.2
025
Raph
RAPH
MER2
11p15.5
Símbolo
Gene
Localização
Cromossômica
Sistemas de grupos sanguíneos, genes, localização
cromossômica
No
Sistema
Símbolo
026
John Milton Hagen
I
JMH
SEMA7A
15q23-q24
I
CGNT2
6p24
027
028
Globoside
029
GIL
GLOB
GIL
Gene
Localização
Cromossômica
LW
3q25
AQP3
9p13
Inserção das Proteínas na Membrana Eritrocitária
ABO
Lea/Leb
P+
MNSs
Knops
Gerbich LW
Indian
Xg
Kell
Lutheran
NH2
COOH
H
P1
I,I*
Cromer
Yt
Dombrock
JMH*
Rh
Duffy
Kx
NH2
CHO
Endofacial
COOH
NH2
Diego
Colton
Kidd
COOH
NH2
Single-pass
Multipass
Exofacial
GPI-linked
Kn
(CR1)
Ina/Inb
Urea
transporter
(CD44)
Lu
Fy
Cromer
(CD55,DAF)
Jk
LW
Xk
Kell
Yt
(AChE)
F
y
Cytokine
receptor
Cell
adhesion
molecules
Transport
proteins
Surface
enzymes
Complement
Control
PESQUISA DE ANTICORPOS IRREGULARES
(PAI)
A Pesquisa de anticorpos irregulares é realizada
em doadores de sangue e na seleção pré-transfusional.
I
II
Ao procedermos a PAI submetemos o soro ou plasma a testar a pelo menos 2
hemácias do Grupo “O” com perfil antigênico conhecido e documentado no
Diagrama de antígenos incluso no Kit.
Devemos aplicar técnicas que revelem anticorpos sensibilizantes,
aglutinantes e hemolizantes.
Em caso de positividade deveremos proceder a identificação destes
anticorpos.
Diagrama de Antígenos
I
II
Lote: -------------
I
II
auto
Diagrama de
antígenos
N. doador Genotipo D
206011
R1R1 +
502858
R2r
+
Rh-Hr
C
+
0
E
0
+
c
0
+
Kell
Kidd
Duffy
Lewis
Validade: --------------------------
MNS
e Cw K k Kpa Kpb Jsa Jsb Jka Jkb Fya Fyb Lea Leb S s M
+ 0 + + 0
+
0 + + 0 + +
0
+ + + +
+ 0 0 + 0
+
0 + 0 + + 0
+
+ 0 + +
Modo usual da reação Albumina /enzima/ Antiglobulina
Antiglobulina
Variável
P
N
+
+
Lutheran
P1 Lua Lub
0 0
+
+ 0
+
Frio
Observações: ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
PESQUISA DE ANTICORPOS IRREGULARES
Técnica de Coombs albuminoso
Fase Salina Imediata:
Esta fase revela anticorpos frios de natureza IgM em geral. (anti-M, anti-P, anti-Lea)
1.
2.
3.
4.
5.
6.
Rotular dois tubos de hemólise como I e II;
Nos dois tubos, colocar duas gotas de soro a ser testado;
No tubo I, adicionar 1 gota de suspensão a 5% de hemácias de triagem I e no tubo II,
idem para hemácia de triagem II;
Misturar bem e centrifugar a 3400 rpm por 15 segundos;
Observar o sobrenadante para hemólise.
Ressuspender delicadamente o "botão" de hemácias e ler macroscopicamente para
aglutinação;
I


II


Anotar os resultados
em cruzes
(intensidade de
aglutinação);
PESQUISA DE ANTICORPOS IRREGULARES
Fase albumina imediata
A albumina é uma proteína que atua aumentando a constante dielétrica do meio, diminui o
potencial zeta e facilita a aglutinação. Nesta fase alguns anticorpos de natureza IgG já
podem ser revelados. Detecta a presença de anticorpos para o sistema Rh e ocasionalmente
anti-K e anti-Fya.
7.
8.
9.
10.
A cada um dos tubos I e II, adicionar duas gotas de Albumina bovina a 22%;
Misturar bem e centrifugar a 3400 rpm por 15 segundos;
Observar o sobrenadante para hemólise.
Ressuspender delicadamente o "botão" de hemácias e
ler macroscopicamente para aglutinação;
I

II

Alb
Anotar os resultados
em cruzes
(intensidade de
aglutinação);
PESQUISA DE ANTICORPOS IRREGULARES
Fase Térmica
Este artifício físico auxilia na revelação de anticorpos IgG. Quando os tubos são
incubados a 370C, são revelados anticorpos, através de aglutinação (anti-D, antiK) ou de hemólise (anti-Lea).
12. Incubar ambos os tubos durante 15 minutos, em banho-Maria a 370C;
13. Misturar bem e centrifugar a 3400 rpm por 15 segundos;
14. Observar o sobrenadante para hemólise.
15. Ressuspender delicadamente o "botão" de hemácias e ler macroscopicamente para
aglutinação;
16. Anotar os resultados em cruzes (intensidade de aglutinação);
PESQUISA DE ANTICORPOS IRREGULARES
Fase anti-globulina humana (Coombs indireto)
Esta é uma fase onde através da antiglobulina humana que é um artifício imunológico se revela a
aglutinação de hemácias sensibilizadas por IgG. São revelados a maioria dos anticorpos (
anticorpos quentes).
17.
18.
19.
20.
21.
22.
Lavar as hemácias dos tubos I e II, em salina, por três vezes;
Após a terceira lavagem, retirar todo o sobrenadante por inversão rápida dos tubos;
Agitar bem e adicionar a cada tubo, duas gotas da anti-globulina humana
Misturar bem e centrifugar a 3400 rpm por 15 segundos;
Observar o sobrenadante para hemólise.
Ressuspender delicadamente o "botão" de hemácias e ler macroscopicamente para
aglutinação;
23. Anotar os resultados em cruzes (intensidade de aglutinação);
Validação da AGH
24. Nos tubos negativos, adicionar uma gota do Reagente Controle de Coombs;
25. Misturar bem, centrifugar adequadamente, ressuspender gentilmente o "botão de hemácias" e
ler macroscopicamente para aglutinação, a qual deverá forçosamente ocorrer.
I
II
FASE ANTI-GLOBULINA HUMANA (COOMBS INDIRETO)
AGH
D
D
D
I

II

Ctl
Ctl
Anotar os resultados
em cruzes
(intensidade de
aglutinação);
PROVA DE COMPATIBILIDADE MAIOR (PCM)
Técnica Coombs albuminoso em tubo
A Prova de Compatibilidade (PC) ou Prova Cruzada consiste em, antes da transfusão, colocar
em contacto o soro do receptor com os GV do doador (PCM-maior) e o soro do doador com os
GV do receptor (Pcm-menor), afim de assegurar ao receptor um sangue compatível.
A técnica utilizada deve revelar anticorpos sensibilizantes, aglutinantes e hemolizantes
Separar uma amostra do segmento da bolsa
selecionada ABO compatível
Preparar uma suspensão de hemácias de a 5%
adicionando em um tubo de hemólise:
1 gota do concentrado de hemácias + 19 gotas de
salina
PROVA DE COMPATIBILIDADE MAIOR
Fase de leitura imediata:
1.
2.
3.
4.
Para cada unidade de sangue a testar, identificar um tubo como PC 1
Colocar duas gotas de soro do paciente, e 1 gota de GV a 5% da bolsa
selecionanda;
Centrifugar o tubo a 1.000 rpm por um minuto ou 3.400 rpm por 15
segundos;
Observar a presença de hemólise ou aglutinação.
PC
1


Anotar os resultados em
cruzes (intensidade de
aglutinação);
FASE ALBUMINA IMEDIATA
5.
Adicionar duas gotas de Albumina bovina a 22%;
6.
Centrifugar o tubo a 1.000 rpm por um minuto ou 3.400
rpm por 15 segundos;
7.
Alb
Observar a presença de hemólise ou aglutinação.
PC 1

Anotar os resultados
em cruzes
(intensidade de
aglutinação);
PROVA DE COMPATIBILIDADE MAIOR
FASE TÉRMICA
8.
Incubar em banho-Maria a 370C durante 15 minutos, no mínimo;
9.
Centrifugar o tubo a 1.000 rpm por um minuto ou 3.400 rpm por 15 segundos;
10. Observar a presença de hemólise ou aglutinação. Anotar o resultado;
FASE DA ANTIGLOBULINA HUMANA
11.
12.
13.
14.
Preencher o tubo com salina, centrifugar a 3.400 rpm durante 1 minuto e 30 segundos e decantar o
sobrenadante.
Repetir essa lavagem por 3 vezes e após a última lavagem decantar o sobrenadante o mais completamente
possível;
Adicionar duas gotas de AGH, homogeneizar bem;
Centrifugar a 3.400 rpm por 15" ou a 1.000 rpm por um minuto. Examinar macroscopicamente para
aglutinação. Anotar os resultados;
Validação da AGH
15.
Sendo ausente a aglutinação, colocar no tubo, uma gota do Reagente Controle Coombs;
A reação com o Controle de Coombs deverá ser positiva.
PC
1
AGH
FASE ANTI-GLOBULINA HUMANA (COOMBS INDIRETO)
D
D
D
PC 1

PC 1
Ctl
Ctl
Presença de aglutinação
PROVA INCOMPATÍVEL
PC 1
Ausência de aglutinação
PROVA COMPATÍVEL
Ao analisarmos um painel também e importante termos em mente o COMPORTAMENTO DO
ANTICORPO de determinados anticorpos. Assim são importantes a temperatura ideal, a melhor
técnica de revelação e o comportamento dos antígenos correspndentes frente ao tratamento
enzimático.
Reatividade
Especificidade
do
Anticorpo
Natureza do Ac
Natural Imune
Anti-D
Não
Sim
Anti-C
Não
Sim
Anti-c
Não
Sim
Anti-E
Sim
Sim
Anti-e
Não
Sim
Anti-Cw
Sim
Sim
Anti-K
Não
Sim
Anti-k
Não
Sim
Anti-Jka
Não
Sim
Anti-Jkb
Não
Sim
Anti-Jk3
Não
Sim
Anti-Fya
Não
Sim
Anti-Fyb
Não
Sim
Anti-Fy3
Não
Sim
Temperatura
4ºC
20ºC
37ºC
Fase de
Enzima
Coombs
37ºC
Positivo
Aumenta
Positivo
Aumenta
Positivo
Aumenta
Positivo
Aumenta
Positivo
Aumenta
Positivo
Aumenta
Positivo
Pode Aumentar
Positivo
Pode Aumentar
Positivo
Aumenta
Positivo
Aumenta
Positivo
Aumenta
Positivo
Diminui
Positivo
Diminui
Positivo
Aumenta
= Reatividade aumenta com o aquecimento
COMPORTAMENTO DO ANTICORPO
Reatividade
Especificidade
do
Natureza do Ac
Anticorpo
Natural Imune
Anti-S
Sim
Sim
Anti-s
Não
Sim
Anti-M
Sim
Alguns
Anti-N
Sim
Sim
Anti-U
Não
Sim
Anti-Lea
Sim
Não
Anti-Leb
Sim
Não
Anti-Lex
Sim
Não
Anti-Lua
Sim
Raro
Anti-Lub
Raro
Sim
Anti-P1
Sim
Não
Anti-P
Sim
Não
Anti-Tja
Sim
Não
Temperatura
4ºC
20ºC
37ºC
Fase de
Enzima
Coombs
37ºC
Positivo
Diminui
Positivo
Diminui
Pos/ Neg
Diminui
Pos/ Neg
Diminui
Positivo
Aumenta
Pos/ Neg
Aumenta
Pos/ Neg
Aumenta
Pos/ Neg
Aumenta
Pos/ Neg
Variável
Positivo
Variável
Positivo
Aumenta
Positivo
Diminui
Positivo
Aumenta
= Reatividade aumenta com o aquecimento
= Reatividade diminui com o aquecimento
O fluxograma abaixo fornece diretrizes para a interpretacao de paineis de hemacias
PESQUISA DE ANTICORPOS IRREGULARES POSITIVA + AUTO-CONTROLE NEGATIVO
TODAS REAÇÕES POSITIVAS
COM MESMA
INTENSIDADE E FASE
ANTICORPO CONTRA
ANTÍGENO PÚBLICO
SOMENTE UMA CÉLULA DO
PAINEL POSITIVA OU
SOMENTE A PROVA CRUZADA
INCOMPATÍVEL
REATIVIDADE COM
ALGUMAS CÉLULAS
PARECENDO ELIMINAR
TODAS ESPECIFICIDADES
BAIXA REATIVIDADE
DO ANTICORPO OU
EFEITO DE DOSE
ANTICORPO CONTRA ANTÍGENO PRIVADO
SOMENTE UMA CÉLULA DO PAINEL POSITIVA
BOLSA COM COOMBS DIRETO POSITIVO
SOMENTE A PROVA CRUZADA INCOMPATÍVEL
-PAINÉIS ESPECIAIS
-FENOTIPAR O PACIENTE
-PAINÉIS ESPECIAIS
-TÉCNICAS QUE AUMENTAM A
ATIVIDADE DOS ANTICORPOS
-TITULAÇÃO DE ANTICORPOS
-PAINÉIS ESPECIAIS
-COOMBS DIRETO DA BOLSA
Ao definirmos as especificidades envolvidas na interpretação de painéis de hemácias,
é importante termos conhecimento da IMPORTÂNCIA CLINICA DESTES ALOANTICORPOS:
ANTICORPOS CLINICAMENTE SIGNIFICANTES
Os anticorpos dos Sistemas ABO , RH , KELL , KIDD , DUFFY e contra os
antígenos SsU devem ser respeitados no caso de necessidade transfusional.
ANTICORPOS QUE PODEM SER SIGNIFICANTES
Os anticorpos dirigidos contra os antígenos Lea , M , N , P1, Lua , Lub podem
ocasionalmente determinar reação transfusional
ANTICORPOS QUE RARAMENTE SÃO SIGNIFICANTES
Os anticorpos dirigidos contra os antígenos Leb , Cha , Rga , Xga e os dirigidos
contra antígenos de alto titulo e baixa afinidade ( HTLA ) dificilmente estão
envolvidos em problemas transfusionais