EFEITO DO ÓXIDO NÍTRICO NA VIABILIDADE, PROLIFERAÇÃO E
ESTEROIDOGÊNESE DAS CÉLULAS DA GRANULOSA ANTRAIS
DE BOVINOS EM MEIO DE CULTURA QUIMICAMENTE DEFINIDO
MÁRCIA REZENDE FAES
UNIVERSIDADE ESTADUAL DO NORTE FLUMINENSE DARCY
RIBEIRO
CAMPOS DOS GOYTACAZES – RJ
SETEMBRO – 2005
EFEITO DO ÓXIDO NÍTRICO NA VIABILIDADE, PROLIFERAÇÃO E
ESTEROIDOGÊNESE DAS CÉLULAS DA GRANULOSA ANTRAIS
DE BOVINOS EM MEIO DE CULTURA QUIMICAMENTE DEFINIDO
MÁRCIA REZENDE FAES
“Tese apresentada ao Centro de
Ciências e Tecnologias Agropecuárias
da Universidade Estadual do Norte
Fluminense Darcy Ribeiro, como parte
das exigências para obtenção do título
de Doutor em Produção Animal.”
Oritentadora: Profª. Drª Maria Clara Caldas Bussiere
CAMPOS DOS GOYTACAZES – RJ
SETEMBRO – 2005
EFEITO DO ÓXIDO NÍTRICO NA VIABILIDADE, PROLIFERAÇÃO E
ESTEROIDOGÊNESE DAS CÉLULAS DA GRANULOSA ANTRAIS
DE BOVINOS EM MEIO DE CULTURA QUIMICAMENTE DEFINIDO
MÁRCIA REZENDE FAES
Tese apresentada ao Centro de
Ciências e Tecnologias Agropecuárias
da Universidade Estadual do Norte
Fluminense Darcy Ribeiro, como parte
das exigências para obtenção do título
de Doutor em Produção Animal.
Aprovada em 2 de setembro de 2005
Comissão Examinadora:
Profª. Cláudia Lima Verde Leal (Doutora, Reprodução Animal) – FZEA - USP
Prof. Reginaldo da Silva Fontes (Doutor, Reprodução Animal) – UENF
Prof. Francisco Aloísio Fonseca (Doutor, Fisiologia Animal) – UENF
Profª. Maria Clara Caldas Bussiere (Doutora, Fisiologia Animal) – UENF
(Orientador)
“Não procures o que excede a tua capacidade, nem
procures penetrar o que está acima de ti. Aplicate àquilo que te for ordenado, e não te ocupes
em coisas impenetráveis. Não te obstines em busca
daquilo que te ultrapassa, pois já te foi mostrado
mais do que o espírito humano pode
compreender. Muitas são as opiniões dos
homens, e as más imaginações conduzem ao
engano. Sem pupila falta a luz e sem
conhecimento, a sabedoria”
Eclesiástico 3:21-25
Aos meus grandes amigos e queridos pai (in memoriam) e mãe, por sempre me
apoiarem e acreditarem em mim.
Aos meus queridos esposo Gustavo e filhos, Mariana e Pedro,
pelo amor e compreensão.
DEDICO
AGRADECIMENTOS
A Deus por estar sempre comigo
À minha orientadora, pela orientação, pelo constante incentivo, pelas palavras
amigas, pelo carinho, por tudo...Meu crescimento profissional e minhas conquistas
são seus também...
Ao professor Reginaldo da Silva Fontes, por toda a contribuição...
Ao professor Ângelo Burla Dias, por estar sempre disposto a nos escutar e
ajudar...
Aos professores Francisco Aloísio Fonseca e Cláudia Verde Leal, pelas sugestões
para o aperfeiçoamento desta tese
À professora Telma Pereira, pela grande contribuição ao deixar seu laboratório à
disposição (Citogenética Vegetal)
Ao professor Alexandre Viana, pela ajuda na análise estatística
Ao professor Eulógio e Antônio (LSA) pelo auxílio na obtenção de resultados
À professora Rosemery Bastos pela grande amizade e sugestões...
À professora Célia Quirino da pós-graduação, pela compreensão e seu esforço em
melhorar cada vez mais o curso de pós-graduação
À professora Isabel Cândia Nunes e ao professor Frederico Straggiotti, pela
compreensão
À amiga e técnica de nível superior Carla Sobrinho Paes de Carvalho, obrigada
por tudo que me ensinou...
À técnica e amiga Bruna Dias (Radioimunoensaio), pelas análises hormonais
Aos técnicos Wânia e Tiago e todos os bolsistas do laboratório e funcionários da
imunogenética (LMGA)
Às alunas de pós-graduação Fabiane Costa (Laboratório Citogenética Vegetal,
CCTA) e Rita Escorcard (Laboratório de Biologia do Reconhecer, CBB), pela
grade ajuda técnica
Às amigas Kellen Sararoli, Sílvia Matta e Lio Moreira, pela ajuda técnica, pelo
carinho e conforto que vocês sempre me deram...
À querida Mariane, pela boa vontade, carinho, amizade...
Aos amigos pós-graduandos Elga, Carol, Janaína, Guilherme e Victor, pela
amizade e carinho.
Aos profissionais da pós-graduação, em especial Etiene e Giovana, sempre com
boa vontade...
Às funcionárias da biblioteca do CCTA pelo auxílio e boa vontade
À Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro (UENF)
À Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro, pelo apoio
financeiro.
BIOGRAFIA
Márcia Rezende Faes nasceu em 21 de outubro de 1970, na cidade de Rio do
Janeiro. Concluiu o segundo grau no colégio José Bonifácio (Rede MV1).
Ingressou no curso de Medicina Veterinária da Universidade Federal Rural do Rio
de Janeiro. Foi monitora durante o período 03/1994-08/1995 da disciplina de
Fisiopatologia da Reprodução e Inseminação Artificial, diplomada em outubro de
1995. Trabalhou como veterinária autônoma, dando assistência a criadores de
gado de leite em Duas Barras-RJ. Em 03/1998, ingressou no curso de pósgraduação em Produção Animal, mestrado em Reprodução Animal, na
Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro, e submeteu-se à
defesa de tese para conclusão do curso 09/2000. Em seguida, ingressou no curso
de Doutorado da mesma instituição, submetendo-se, em 02/09/2005, aos exames
finais de defesa de tese. Atualmente, trabalha como Médica Veterinária na
Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro na área de Clínica
Reprodutiva de Pequenos Animais.
CONTEÚDO
LISTA DE ABREVIATURAS ....................................................................................ix
RESUMO .................................................................................................................xi
ABSTRACT ............................................................................................................xiii
1. INTRODUÇÃO .....................................................................................................1
2. REVISÃO DE LITERATURA.................................................................................4
2.1. Foliculogênese...................................................................................................4
2.2. Células da granulosa.........................................................................................5
2.2.1. Controle hormonal do ciclo celular das células da granulosa.................7
2.3. Esteroidogênese folicular...................................................................................8
2.3.1. Papel do FSH e LH na esteroidogênese das células da granulosa.....12
2.4. Atresia folicular ovariana..................................................................................13
2.4.1.Regulação hormonal da apoptose das células da granulosa................14
2.4.2. Mecanismo da apoptose nas células da granulosa..............................15
2.5. Òxido nítrico (NO)............................................................................................17
2.5.1. Mediador do efeito citotóxico ou citoprotetor........................................19
2.5.2. Na função ovariana...............................................................................21
2.5.3. Doadores de óxido nítrico.....................................................................22
2.5.4. Sistema óxido nítrico/guanosina monofosfato cíclica (NO/GMPc).......22
2.5.5. Inibidor da guanilato ciclase..................................................................23
2.6. Cultivo in vitro de células da granulosa...........................................................23
3. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS...................................................................26
4. TRABALHOS......................................................................................................43
4.1. EFEITO DO FSH NA SÍNTESE DE HORMÔNIOS ESTERÓIDES E ÓXIDO
NÍTRICO NA CULTURA DE CÉLULAS DA GRANULOSA ANTRAIS DE
BOVINOS EM MEIO DE CULTURA QUIMICAMENTE DEFINIDO................44
4.2. EFEITO
DO
ÓXIDO
NÍTRICO
NA VIABILIDADE, PROLIFERAÇÃO E ESTEROIDOGÊNESE DURANTE O
CULTIVO DAS CÉLULAS DA GRANULOSA ANTRAIS DE FOLÍCULOS
PEQUENOS EM MEIO DE CULTURA QUIMICAMENTE DEFINIDO............71
4.3. ÓXIDO NÍTRICO MODULA A SÍNTESE DE 17β- ESTRADIOL VIA GMPC,
MAS NÃO A SÍNTESE DE PROGESTERONA PELAS CÉLULAS DA
GRANULOSA
ANTRAIS
EM
MEIO
DE
CULTURA
QUIMICAMENTE
DEFINIDO ......................................................................................................99
5. CONCLUSÕES GERAIS..................................................................................128
LISTA DE ABREVIATURAS
AMPc – adenosina monofosfato cíclica
BSA – albumina sérica bovina
cdks – cinases dependentes de ciclinas
E2 – 17 β-Estradiol
FSH – hormônio folículo estimulante
CG (s) – célula (s) da granulosa (s)
GMPc – guanosina 3’ 5’ - monofosfato cíclica
LH – hormônio luteinizante
NO – óxido nítrico
NO2- – nitrito
NO3- – nitrato
NOS – óxido nítrico sintase
cNOS - óxido nítrico sintase constitutiva
nNOS - óxido nítrico sintase neuronal
eNOS – óxido nítrico sintase endotelial
iNOS – óxido nítrico sintase induzível
O2- – superóxido
ONOO- – peroxinitrito
PDE – fosfodiesterase
SFB – soro fetal bovino
ix
SNAP – S-nitroso-N-acetilpenicilamina
SNP – nitroprussiato de sódio
STAR -proteína da regulação aguda da esteroidogênese
TNFα – fator necrose tumoral
-G0 - subdiploide
G0/G1 - fase diplóide
S - fase de síntese
G2/M- fase tetraplóide e mitose
DNAse - endonuclease
x
RESUMO
FAES, Márcia Rezende, D, Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy
Ribeiro; Setembro de 2005; Efeito óxido nítrico na viabilidade, proliferação,
esteroidogênese das células da granulosa antrais em meio de cultura
quimicamente definido; Professor(a) orientador (a): Maria Clara Caldas Bussiere.
Professor conselheiro: Cláudia Lima Verde Leal.
O presente experimento objetivou padronizar um sistema de cultivo quimicamente
definido contendo álcool polivinílico para verificar o efeito óxido nítrico (NO) e a via
utilizada para exercer seus efeitos na proliferação, viabilidade e esteroidogênese
das CGs antrais de folículos de 3 -5 mm de diâmetro. O experimento I objetivou
padronizar um modelo de cultivo que mantivesse a síntese de esteróides ao longo
do tempo. CGs foram cultivadas com ou sem FSH (1 ng/ml) por 24, 48, 72, 96 e
120 h. Foram avaliadas a viabilidade e a proliferação celular pelo método MTT e
citometria de fluxo, respectivamente, concentração de progesterona (P4) e 17βestradiol (E2) por quimioluminescência e nitrato/ nitrito (NO3-/NO2-) pelo método de
Griess. O FSH aumentou a proliferação celular com 48 h e diminuiu com 72 h
(P<0,05), além disso, diminuiu (P<0,05) a P4 (P<0,05) às 72 e 96 h, aumentou
(P<0,05) o E2 até 24 h e não variou NO3- / NO2- (P>0,05). Os experimentos II e III
utilizaram a mesma metodologia do experimento I. No experimento II, o
nitroprussíato de sódio (SNP), doador de NO, foi adicionado nas concentrações 0
(controle), 10-9, 10-7 e 10-5 M à cultura de CGs. Todos os tratamentos com SNP
xi
aumentaram (P<0,05) a viabilidade e a proliferação celular no final de 120 h e
inibiram a P4 (P<0,05), enquanto o E2 foi estimulado até as 24 h (P<0,05) e inibido
(P<0,05) após 48h. O E2 foi correlacionado negativamente com a proliferação
celular (P<0,001), enquanto NO3- / NO2- foi correlacionada positivamente com a
proliferação (P<0,0001) e viabilidade celular (P<0,01). NO experimento III, as CGs
foram cultivadas por 24 h com 0, 10-5, 10-3 e 10-1M de SNP com ou sem o inibidor
da guanilato ciclase [1H]-[1,2,3] oxadiaziolo [4,3a] quinoxaline-1-one (ODQ). CGs
cultivadas com 0, 10-5 M de SNP com ou sem ODQ formaram grumos celulares e
não apresentaram variação (P>0,05) na viabilidade celular, enquanto que 10-3 e
10-1 M de SNP com ou sem ODQ levaram a desorganização e ausência de
grumos celulares, respectivamente e diminuição da viabilidade celular e de
esteróides (P<0,05), além disso, 100% das CGs cultivadas com 10-1 M de SNP
apresentaram níveis subdiplóides de DNA. 10-5 M de SNP inibiu (P<0,05) a P4, por
mecanismo independente do GMPc e aumentou (P<0,05) o E2 via GMPc. Os
resultados sugerem que: 1) o sistema de cultivo das CGs com PVA pode ser
utilizado para avaliar os efeitos do NO nas CGs, entretanto, a adição de FSH não
deve ser utilizada, tendo em vista que a sua adição de forma crônica induz a
diminuição de E2, o que demonstra seu papel na diferenciação das CGs; 2) O NO
pode estar envolvido na progressão das CGs antrais no ciclo celular, e desta
forma, regular a esteroidogênese das CGs; e 3) a via GMPc é um dos
mecanismos utilizados pelo NO em concentrações baixas para regular
positivamente a síntese de E2, mas não a de P4, enquanto concentrações elevadas
de NO inibem os esteróides por via independente de GMPc, além de
apresentarem efeito citotóxico.
Palavras-chave: bovino, óxido nítrico, células da granulosa, GMPc, cultivo
xii
ABSTRACT
FAES, Márcia Rezende, D, Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy
Ribeiro; Setembro de 2005; Nitric oxide effect on antral granulosa cells viability,
proliferation and steroidogenesis in chemically defined culture medium; Professor
advisor Maria Clara Caldas Bussiere. Commitee members: Cláudia Lima Verde
Leal
The present experiment aimed to standardize a chemically defined culture system
containing polyvinyl alcohol to verify the effect of nitric oxide (NO) and the pathway
to exert its effects on antral granulosa cells (GCs) proliferation, viability and
steriodogenesis of follicles 3-5 mm. Experiment I aimed to develop a culture model
to maintain steroid synthesis throughout the culture period. GCs were cultured with
or without FSH (1 ng/ml) for 24, 48, 72, 96 and 120 h. The cell viability and
proliferation were evaluated by MTT method and flow cytometry, respectively,
progesterone (P4) and oestradiol 17β (E2) concentration by chemiluminescence
and nitrite/nitrate (NO3-/NO2-) by Greiss method. FSH increased cell proliferation at
48 h and decreased at 72 h (p<0.05), moreover, decreased (p<0.05) P4 at 72 and
96 h, increased (p<0.05) E2 at 24 h and did not affect NO3- / NO2- (p>0.05).
Experiment II and III used the same methodology of experiment I. In experiment II,
sodium nitroprusside (SNP), NO donor, was added at 0 (control), 10-9, 10-7 and 105
M concentrations to CGs culture. All the treatments with SNP increased (p<0.05)
xiii
cell viability and proliferation at 120 h and inhibited P4 (p<0.05), while E2 was
stimulated at 24 h (p<0,05) and inhibited (p<0.05) after 48h. E2 was negatively
correlated with cell proliferation (P<0.001), while NO3- / NO2- was positively
correlated with cell proliferation (p<0.0001) and viability (p<0.01). In Experiment III,
GCs were cultured for 24h with 0, 10-5, 10-3 and 10-1M SNP with or without the
guanylate cyclase inhibitor [1H] - [1,2,3] oxadiaziolo [4,3a] quinoxaline-1-one
(ODQ). GCs cultured with 0, 10-5 M SNP with or without ODQ formed cell groups
and showed no variation (p>0.05) in cell viability, whereas 10-3 and 10-1 M SNP
with or without ODQ lead to disorganization or non formation of cell groups,
respectively, and decreased cell viability and steroids (p<0.05). Moreover, 100% of
the CGs cultured with 10-1 M SNP presented subdiploid DNA levels. 10-5 M SNP
inhibited (p<0.05) P4, by a mechanism independent of cGMP and increased
(p<0.05) the E2 pathway cGMP. The results suggest that: 1) the culture system for
CGs with PVA can be used to evaluate the effect of NO on CGs, however, FSH
addition is not necessary since its chronic addition induces E2 reduction,
demonstrating its role in CGs differentiation, 2) NO can be involved in cellular cycle
progression of antral CGs and in such a way may regulate steroidogenesis in these
cells, and 3) the cGMP pathway is one of the mechanisms used by NO in low
concentrations to positively regulate E2 synthesis, but not P4, while high NO
concentrations inhibit steroids by a cGMP independent pathway, besides
presenting cytotoxic effect.
Key-words: bovine, nitric oxide, granulosa cells, cGMP, culture.
xiv
1
1. INTRODUÇÃO E JUSTIFICATIVA
O folículo é a unidade funcional do ovário dos mamíferos, consistindo de
uma célula germinativa (oócito) e células somáticas (células da granulosa e teca).
Durante o desenvolvimento e formação do antro folicular, são formadas três
subpopulações de células da granulosa: murais alinhadas à parede folicular; antrais,
em contato com o fluido folicular e do cumulus, que se encontram em torno do oócito,
formando o complexo cumulus oócito (COC) (EPPIG, 1991). As células somáticas
são responsáveis pela síntese de hormônios, fatores de crescimento, mensageiros
intercelulares e, portanto, seus produtos de secreção são responsáveis pela
formação do antro folicular.
A célula da granulosa (CG) é o principal tipo celular responsável pela
formação do antro folicular e, portanto, contribui para fornecer um micro-ambiente
para o desenvolvimento do folículo-oócito (HENDRIKSEN et al., 2000). A principal
atividade das CGs é a síntese de hormônios esteróides em resposta às
gonadotrofinas (GORE-LANGTON e ARMSTRONG, 1994). Os estudos realizados
com sistema de cultura in vitro de CGs vêm demonstrando que às CGs antrais
possuem maior atividade esteroidogênica, em resposta às gonadotrofinas, quando
comparadas as CGs murais (ROUILLER et al., 1996; ROUILLER et al 1998).
A perda da atividade esteroidogênica das células da granulosa é um dos
primeiros sinais indicativos de degeneração folicular e, conseqüentemente, a do
2
oócito também. A diminuição do aporte sanguíneo e de receptores para
gonadotrofinas e diminuição da atividade das enzimas esteroidogênicas (IRELAND e
ROCHE, 1983; GRIMES et al., 1987; JOLLY et al., 1994) vêm sendo considerados
como um dos principais fatores envolvidos na perda da atividade esteroidogênica.
Contudo, estudos realizados em ratas (SNYDER et al., 1996; DAVE et al., 1997;
MATSUMI et al., 1998a, MATSUMI et al., 2000), mulheres (KAGABU et al. 1999) e
codornas (VAN NASSAUW et al., 1999) vêm demonstrando que, além destes
fatores, o óxido nítrico (NO), um radical livre, pode estar envolvido na regulação da
esteroidogênese e apoptose ovariana.
A baixa taxa de desenvolvimento de embriões in vitro (15-20%) vem sendo
relacionada à qualidade dos folículos (JEWGENOW et al., 1998). Portanto, o folículo é
que determina o futuro do oócito. Assim, é de considerável interesse o estudo sobre
os fatores fisiológicos envolvidos no desencadeamento da atresia folicular para o
entendimento dos eventuais problemas que ocorrem durante o uso das biotecnologias
que utilizam a superovulação para obtenção de oócitos para a produção in vitro e in
vivo de embriões.
Em bovinos, os estudos sobre o efeito do NO nas CGs vêm sendo
realizados em meio de cultura contendo soro fetal bovino (SFB) (BASINI et al., 1998)
ou albumina sérica bovino (BSA) (BASINI et al., 2000). O SFB facilita a adesão das
CGs na placa de cultura e aumenta a viabilidade celular (GONG et al., 1994), porém
não impede a luteinização destas, mesmo quando tratadas com gonadotrofinas
(LUCK et al., 1990; GUTIERREZ et al., 1997).
O BSA comumente utilizado nos sistemas de cultivo é contaminado com
várias moléculas definidas e não definidas, assim como colesterol, peptídeos,
progesterona, andrógenos e outros (WANG et al., 1997; MINGOTI et al., 2002).e sua
composição varia com o seu preparo, o que pode variar os seus efeitos durante o
cultivo (KANE, 1983; MCKIERNAN e BAVISTER, 1992). PICCINATO et al. (2000)
substituíram o BSA por álcool polivinílico (PVA) e observaram a manutenção das
mesmas características morfológicas de CGs esteroidogenicamente ativas descritas
por GUTIERREZ et al. (1997). Assim, o presente estudo utilizou o modelo de cultivo
quimicamente definido, com algumas modificações, tais como: redução de células
3
sanguíneas como hemácias e macrófagos, que podem mascarar a esteroidogênese
e síntese de NO (BECKMANN et al., 1991) para verificar o efeito do NO na
viabilidade, proliferação e esteroidogênese das CGs, e se este utiliza a via GMPc
para mediar seus possíveis efeitos.
4
2. REVISÃO DE LITERATURA
2.1. Foliculogênese
No ovário fetal bovino, são encontradas, aproximadamente, 2.739.000
células germinativas e, ao nascer, é observada a presença de 120.000 a 150.000
folículos primordiais ou primários, 200 a 500 folículos em crescimento e 20 a 50
folículos antrais. Obviamente, os folículos pré-antrais, que incluem primordial,
primário e em crescimento, representam 99% da reserva de germoplasma
(ERICKSON, 1966; FIGUEIREDO et al., 1997). Contudo, menos de 1% dos folículos
são ovulados durante a vida reprodutiva da vaca. Assim, mais de 99 % dos folículos
sofrem mudanças degenerativas nos vários estádios de desenvolvimento folicular,
que fazem parte da função ovariana normal (BYSCOV, 1978; MARIANA et al., 1991).
Este processo degenerativo pelo qual os folículos são eliminados antes de atingirem
a ovulação é designado atresia folicular (HSUEH et al., 1994).
A foliculogênese é caracterizada por uma marcante proliferação e
diferenciação das células somáticas do folículo. O desenvolvimento folicular produz
um ambiente ótimo para a maturação do oócito e sua subseqüente fertilização após
a ovulação. Os principais reguladores da foliculogênese são as gonadotrofinas que
regulam o desenvolvimento folicular ovariano via o clássico mecanismo endócrino de
retroalimentação positiva ou negativa (ADASHI e ROBAN, 1992; MANSON e
5
FRANKS, 1997; TERRANOVA e RICE, 1997). Os folículos ovarianos são conhecidos
por produzirem uma série de peptídeos, fatores de crescimento e sinalizadores que
agem localmente. Estes podem interagir com o mesmo tipo celular, do qual foi
produzido (ação autócrina) ou com outro tipo celular (ação parácrina) para estimular
ou atenuar a resposta celular às gonadotrofinas. Portanto, o crescimento e
desenvolvimento folicular são processos integrados em compasso com sinais extraovarianos, como as gonadotrofinas e hormônios metabólicos (ARMSTRONG e
WEBB, 1997) e intra-ovarianos, como os fatores de crescimento (TELFER, 1997) e
mensageiros inter e intracelulares, como o óxido nítrico (BASINI et al., 1998; BASINI
et al., 2000, ISHIMARU et al., 2001; LAPOLT et al., 2002). A foliculogênese está
associada com o desenvolvimento de um grupo de folículos de vários estádios de
desenvolvimento, do qual um número espécie-específico é selecionado para crescer
(WEBB et al., 1992; FORTUNE, 1994; CAMPBELL et al., 1995; CONG e WEBB,
1996).
A foliculogênese pode ser dividida em três estádios de desenvolvimento
folicular: 1) recrutamento, estádio durante o qual um grupo de folículos em
crescimento é selecionado para crescer rapidamente; 2) seleção, processo pelo qual
os folículos são selecionados para continuar o seu crescimento; e 3) dominância,
processo pelo qual o folículo selecionado cresce rapidamente, enquanto que os
demais regridem (folículos subordinados). Este padrão de desenvolvimento folicular
está associado a várias mudanças na expressão de RNAm, que codificam receptores
para gonadotrofinas e enzimas esteroidogênicas que permitem que os folículos
selecionados, quando expostos ao ambiente adequado, ovulem em resposta à onda
de gonadotrofina ovulatória
2.2. Células da granulosa
O crescimento e o desenvolvimento do compartimento de células somáticas
e germinativas do folículo ovariano ocorrem de uma maneira mutuamente
dependente e coordenada. Os folículos ovarianos de mamíferos consistem de
6
camadas de células da teca e granulosa que cercam a célula germinativa ou oócito.
Durante o crescimento folicular, ocorre formação do antro e separação anatômica e
funcional das células da granulosa em três subtipos celulares: granulosas murais
alinhadas à parede folicular formando um epitélio estratificado com a lamina basal;
granulosas antrais, em contato com o fluido folicular e do cumulus, que se encontram
em torno do oócito, formando o complexo cumulus oócito (COC) (EPPIG, 1991;
ALBERTINI et al., 2001).
O contato físico e a comunicação intercelular entre as células somáticas e o
oócito são necessários para a sobrevivência, desenvolvimento e maturação do oócito
(EPPIG, 1991; GORDON, 1994). Esta cooperação metabólica entre o oócito e as
células do cumulus, que tem importante função nutritiva para o oócito durante a
maturação, ocorre por meio das junções comunicantes. Assim, a perda destas
junções implica na degeneração do oócito e folículo (SUTOVSKY et al., 1993).
Adicional a este controle parácrino do metabolismo do COC, via junções
comunicantes, há também um controle via substâncias secretadas pelas células
foliculares no fluido folicular (RABAHI et al., 1993).
Do crescimento folicular até a ovulação, as células da granulosa mostram
extensivas mudanças na atividade mitótica e secreção de esteróides. Além disso,
dentro de um mesmo folículo, verifica-se uma heterogeneidade bioquímica e
morfológica entre as células de um mesmo folículo ovariano, caracterizando um
gradiente de diferenciação (AMSTERDAN et al., 1989). Em ratas, relatam-se
diferenças entre o número de junções comunicantes, receptores para FSH e índice
mitótico. ROUILLIER et al. (1996) verificaram, em cultura de células da granulosa de
bovinos livre de soro fetal, uma resposta mais acentuada ao FSH na síntese de
esteróides pelas células da granulosa antrais quando comparadas às células da
granulosa murais.
7
2.2.1. Controle hormonal do ciclo celular das células da granulosa
O crescimento dos folículos ovarianos, ovulação e formação do corpo lúteo
são processos complexos que envolvem mudanças na função das células da
granulosa. Estas mudanças são seqüenciais e ordenadas em resposta às
gonadotrofinas, esteróides, fatores de crescimento, citocinas (HIRSHIFIELD et al.,
1991; RICHARDS, 1978). No período peri-ovulatório, as células da granulosa
passam de estádio proliferativo para não - proliferativo, período no qual as células da
granulosa encontram-se diferenciadas, característica de células da fase luteal.
Nos folículos primordiais, o oócito é cercado por uma única camada de
células que se encontram detidas na fase G0/G1 do ciclo celular, ou seja, na fase
diplóide, na qual as células não estão se dividindo.
Os folículos saem do estádio quiescente e iniciam a fase de crescimento
lento (fase S/G2), no qual as células entram no ciclo celular, mas a proliferação é
muito lenta (HIRSHIFIELD et al., 1991). Durante esta lenta proliferação, as células da
granulosa vão adquirindo e aumentando a sua responsividade ao FSH e LH,
aumentando a síntese de estradiol (RICHARDS, 1980). A exposição das células
foliculares a estes hormônios induz um aumento na fase proliferativa, que resulta na
formação de um folículo pré-ovulatório (RAO, 1978).
As células da granulosa de folículos pré-ovulatórios são muito proliferativas e
mais diferenciadas e adquirem receptores para LH (UILENBROEK et al., 1979). Com
o pico de LH, o crescimento folicular é interrompido juntamente com a mudança na
função e estrutura folicular, resultando na saída das células da granulosa de folículos
pré-ovulatório do ciclo celular (HIRSHIFIELD et al., 1991). Esta saída do ciclo celular
coincide com a diferenciação das células da granulosa em células luteinizadas,
caracterizada por finalização da divisão celular.
A progressão pelo ciclo celular e a proliferação são controladas por um
complexo de quinases dependentes de ciclinas (cdk) (MURAY e HUNT, 1993).
Algumas ciclinas dirigem a fase G1 (células diplóides), enquanto outras, a fase de
transição G2 a M (células poliplóides – mitose). A ciclina D2 (INABA et al., 1992,
8
XIONG et al., 1992a) age como regulador positivo da progressão pelo ciclo celular,
devido à sua habilidade em se ligar às cdks 4 ou 6, que, por sua vez, ativam a
cascata de eventos que permitem a progressão através da fase G1 do ciclo celular
(XIONG et al., 1992b).
A ciclina E age, também, como um regulador positivo da progressão do ciclo
celular ao se ligar à cdk 2. A cdk2 ativada regula a transição da fase G1 para S (fase
de síntese de DNA) (LEW et al., 1991; POLYAK et al., 1994).
A progressão pela fase S é regulada pelo complexo ciclina A e a mitose é
iniciada pelo complexo ciclina b-cdc2 (REBECCA et al., 1998), enquanto a ciclina
p27
kip1
inativa a cascata de quinases dependentes de ciclinas e impede a
progressão pelo ciclo celular, que fica detido em fase G1 (POLYAK et al., 1994).
Assim, tem sido demonstrado que a proliferação estimulada pelo FSH e o estradiol
ocorrem por meio da ciclina D2 (SICINSKI et al., 1996), enquanto, o LH diminui a
ciclina D2 e E e aumenta a concentração de ciclina p27 kip1, finalizando a proliferação
celular e resultando em luteinização das células da granulosa (NAKAYAMA et al.,
1996; FERO et al., 1996).
O FSH e o LH, ao se ligarem aos seus receptores, aumentam a síntese de
AMPc intracelular. O AMPc gerado em baixa concentração, quando estimulado pelo
FSH, aumenta a concentração de ciclina D2 e E. Ao contrário, a concentração de
AMPc estimulado pelo LH é mais elevada e diminui a ciclina D2 e E e aumenta a
ciclina p27
kip1
, que cessa a divisão celular e finaliza a diferenciação celular
(ROBKER e RICHARDS, 1998)
2.3. Esteroidogênese folicular
Os hormônios esteróides são classificados com base na sua estrutura
química ou ações fisiológicas. Os principais hormônios sexuais esteróides pertencem
a três classes maiores: progestágenos, andrógenos e estrógenos, cujas estruturas
químicas são derivadas dos seguintes compostos: pregnane (C21), androstane (C19)
e estrane (C18), respectivamente (GORE-LANTON e ARMSTRONG, 1994).
9
A pregnenolona (P5) é o progestágeno mais importante produzido no folículo
devido ao seu papel chave como precursor dos esteróides. No folículo ovariano, a
progesterona é a forma mais abundante da P5 (GORDON, 1994).
A P5 se origina do colesterol, e este, por sua vez, pode originar-se a partir de
três possíveis fontes: (a) colesterol pré-formado, que se encontra ligado a
lipoproteínas circulantes de baixa (LDL) e alta (HDL) densidade na corrente
sangüínea; (b) colesterol pré-formado armazenado dentro da célula ovariana, ou livre
(constituinte da membrana celular), ou liberado de ésteres de colesterol armazenado
dentro das gotas lipídicas citoplasmáticas e (c) colesterol, sintetizado de novo nas
células ovarianas, derivado do metabolismo de carboidratos, gorduras ou proteínas
dentro da célula (STRAUSS et al., 1981).
A utilização de cada fonte de colesterol está sujeita à regulação de acordo
com a importância quantitativa de uma fonte ou outra, que varia com o estado
fisiológico. Além disso, a fonte de colesterol utilizada pode, ainda, variar com a
espécie animal e com o tipo celular envolvido (STRAUSS et al., 1981).
Em tecido ovariano, a principal fonte de colesterol utilizado para a
esteroidogênese
é do
colesterol ligado
às lipoproteínas.
As
lipoproteínas
extracelulares se ligam à membrana celular via seu componente apoproteico,
seguindo-se a internalização do complexo lipoproteína-receptor, captação do
complexo pelo lisossomo, degradação das lipoproteínas pelas esterases lisossomais
e liberação do colesterol, que está apto para ser utilizado na esteroidogênese
(GWYNNE e STRAUSS, 1982).
A identificação dos andrógenos (testosterona e androstenediona) no fluido
folicular demonstrou que as células foliculares, especificamente as células da teca,
são uma significante fonte de andrógenos ovarianos, os quais constituem o principal
substrato para a biossíntese de estrógenos pelas células da granulosa (SHORT,
1960).
Os estrógenos possuem a mais ampla extensão de funções de todos os
esteróides (17β-estradiol e estrona), sendo necessários para o desenvolvimento e a
10
atresia folicular, manifestações psíquicas comportamentais do cio ou estro, além de
atuar em vários sistemas fisiológicos (GORE-LANGTON e AMSTRONG, 1994).
A esteroidogênese (Figura 1) tem início com a clivagem do colesterol nas
ligações C20, C22, cuja reação é catalisada pela enzima P450scc (clivagem da cadeia
lateral do colesterol), localizada sobre a matriz da membrana interna mitocondrial,
resultando nos compostos P5 (C21) e um fragmento de 6 carbonos (aldeído
isocapróico) (FARKASH et al., 1986). A P450scc tem sido considerada taxa limitante
na síntese de hormônios esteróides (MILLER, 1988).
A produção de hormônios esteróides pode seguir duas vias, a partir da P5,
dependendo da sua biodisponibilidade e das atividades específicas das enzimas
esteroidogênicas. A via ∆5 é a via utilizada em ovários bovinos (FORTUNE, 1986). Os
esteróides da via ∆5 podem passar para via ∆4 e vice-versa. Isto se deve à ação da
enzima ∆5-3 3β-hidroxiesteróide desidrogenase ou ∆5-4 isomerase (3β-HSD)
(LACROIX et al., 1974; FORTUNE, 1986).
Na via ∆5, o complexo enzimático 17α-hidroxilase/C17,20 liase, presente na
membrana do retículo endoplasmático liso, é taxa limitante na biossíntese dos
andrógenos no folículo. Este complexo catalisa a conversão da P5 em 17α-OHpregnenolona e em deidroepiandrostenediona (DHEA). Mediante a ação da 3β-HSD,
o DHEA é convertido em androstenediona (A4), que, posteriormente, será convertido
pela enzima 17 β-hidroxiesteróide desidrogenase (17β-HSD) em testosterona (Figura
1) (BAO et al., 1997).
Pela via ∆4, a enzima 3β-HSD converterá a P5 em P4, que, por sua vez, será
convertida em 17α-OH-progesterona, pela ação da enzima 17α-hidroxilase, e em
seguida, será transformada em A4 pela C17,20 liase. (GORE-LANGTON e
AMSTRONG, 1994).
Nos folículos ovarianos, precisamente nas células da granulosa, os
esteróides (C19) androstenediona e testosterona serão convertidos à estrona (E1) e
17β-estradiol (E2), respectivamente, pela ação do complexo enzimático P450arom
(Figura 1), localizado no retículo endoplasmático liso de diferentes tipos celulares
11
ovarianos. Em adição, a E1 pode ser convertida em E2 por meio da ação da enzima
17β-HSD (GOWER, 1984).
Figura 1: Esquema mostrando a biossíntese dos hormônios esteróides pela via ∆5 e
∆4 . O colesterol é clivado pela P450scc em pregnenolona (P5). Pela via ∆5,
P5 é convertida em deidroepiandrostenediona (DHEA) pelo complexo
enzimático 17α-hidroxilase/C17,20 liase. A 3βHSD converte DHEA em
androstenediona (A4), que será convertida em testosterona pela enzima
17β-HSD. Pela via ∆4, a 3βHSD converte P5 em P4, e o complexo
enzimático 17α-hidroxilase/C17,20 liase converte P4 em A4, que será
convertida
em
testosterona
pela
17β-HSD.
A
androstenediona e
testosterona são convertidas a estrona (E1) e 17β-estradiol (E2),
respectivamente, pela ação do complexo enzimático P450arom (GORELANGTON e AMSTRONG, 1994; GOWER et al., 1994).
12
2.3.1. Papel do FSH e LH na esteroidogênese
A síntese de hormônios esteróides necessita da cooperação das células
foliculares (células da granulosa e teca) e da participação das gonadotrofinas FSH e
LH, que define o modelo proposto como “duas células/dois hormônios”. Neste
modelo, as células da granulosa possuem receptores para FSH e as da teca para
LH. Assim, em resposta ao LH as células da teca sintetizam os andrógenos, que por
sua vez, serão convertidos em E2 pelas células da granulosa estimuladas pelo FSH
(FORTUNE et al., 1994; FORTUNE et al., 1996).
As ações do LH e FSH são mediadas por receptores trans – membrana,
acoplados à proteína G estimuladora (SIMONI et al., 1997). Com a ligação destas
gonadotrofinas ao seu receptor, o ligando induz a uma mudança na conformação dos
receptores, resultando na liberação da subunidade Gsα e ativação da adenilato
ciclase, aumentando a produção de AMPc que ativa a proteína quinase A
(EDELMAN et al., 1987). A proteína quinase A, por sua vez, promove a fosforilação
de proteínas nos resíduos de cisteína e serina, que pode diretamente influenciar a
expressão e/ou atividade da via esteroidogênica, promovendo o aumento da
atividade da P450 aromatase, pelo fenômeno de transcrição ou tradução
(YOSHIURA et al., 2003). O aumento da atividade da P450 aromatase é o principal
requisito para síntese de estradiol pelas células da granulosa e conseqüente
maturação folicular.
A estimulação da via AMPc leva ao aumento da transcrição da proteína
regulatória aguda da esteroidogênese (StAR) (STRAUS et al., 1999), que possui
como função transportar o colesterol para membrana interna da membrana
mitocondrial, onde será utilizado para síntese de esteróides (STOCCO et al., 1996;
CHRISTENSON et al., 2001). Embora a expressão de StAR seja aumentada pelo
FSH e dependente de LH, o aumento de AMPc e exposição tônica das células da
granulosa (macacas) ao FSH in vivo não resultou em aumento da transcrição de
StAR (CHRISTENSON et al., 2001). O autor sugere que a expressão de StAR pode
ser dose-dependente do AMPc, ou que o LH ativa uma única via de sinalização que
orienta a expressão de StAR ou ainda que o FSH ativa uma via de sinalização que
13
inibe a ação estimuladora do AMPc na expressão de StAR e esteroidogênese das
CGs.
2.4. Atresia folicular ovariana
Durante o desenvolvimento folicular ovariano em bovinos, mais de 99,9%
dos folículos não atingem a ovulação, devido ao mecanismo de deleção celular
presente no ovário, que impede que vários folículos alcancem a ovulação. Assim, um
limitado número de folículos é selecionado para a ovulação, enquanto que os
remanescentes sofrem degeneração pelo processo de atresia folicular (MARIANA et
al., 1991).
A atresia folicular é mediada por um organizado mecanismo de morte celular
designado de apoptose ou morte celular programada (HUGHES e GOROSPE, 1991;
TILLY et al., 1991). O principal tipo celular acometido pela apoptose é a célula da
granulosa (CG). A CG possui a enzima endonuclease Ca2+/Mg2+, que, quando
ativada, cliva o DNA em fragmentos múltiplos de 180-200 pb. Este padrão de
clivagem é utilizado como um marcador bioquímico de apoptose nas CGs (TILLY et
al., 1991).
O início do crescimento dos folículos primordiais, designado de recrutamento
inicial, é seguido por crescimento, diferenciação e atresia. Quando os folículos
adquirem a cavidade antral tornam-se dependentes do FSH. Durante cada ciclo
reprodutivo, o aumento do FSH recruta os folículos antrais em crescimento. Portanto,
o FSH vem sendo considerado como um fator de sobrevivência para os folículos
antrais. Estes achados são confirmados por evidências bioquímicas, que mostram
que a atividade da enzima endonuclease Ca2+/Mg2+ dependente é modulada por
mudanças nas concentrações de FSH (ZELEZNIK et al., 1989).
14
2.4.1. Regulação hormonal da apoptose das células da granulosa
Uma das características iniciais da atresia folicular é a perda da atividade da
enzima aromatase e C17,20-liase. A conseqüência deste evento é: 1) a diminuição
da conversão de progestágenos a andrógenos, que pode ser evidenciada pelo
aumento das concentrações de P4 no fluido folicular e 2) a falha das células da
granulosa metabolizar andrógenos a estrógenos, que resulta em concentrações
reduzidas de E2 no fluido folicular (MCNATTY et al., 1984a; MCNATTY et al., 1984b).
A perda da atividade das enzimas aromatase e 17α-hidroxilase:C17,20-liase tem sido
associada com a diminuição de receptores para FSH e LH nas células foliculares
(BOGOVICH et al., 1982; JOLLY et al., 1994).
Os folículos estrógenos-ativos têm mais células da granulosa e maior
capacidade para se ligarem à gonadotrofinas comparados aos folículos estrógenos
inativos. Assim, a concentração de esteróides no fluido folicular ou a presença de
receptores para gonadotrofinas nas células da granulosa, índices de qualidade
folicular, podem também ser utilizados como índices de atresia folicular ovariana
(BOMSEL-HELMREICH et al., 1979; IRELAND e ROCHE, 1982).
Os sistema de cultivo de células da granulosa vêm demonstrando vários
fatores estimuladores e inibidores da apoptose. Sabendo-se que o folículo estrógeno
ativo é indicador de viabilidade folicular, os fatores que regulam negativamente a
esteroidogênse das células da granulosa podem estar implicados na indução da
apoptose. Os principais fatores já estudados como reguladores de sobrevivência do
folículo ovariano são: as gonadotrofinas, fator de crescimento semelhante à insulina,
fator de crescimento epidermal, fator de crescimento fibroblástico, estradiol e óxido
nítrico (CHUN et al., 1995; GUTHIE et al., 1998; PETROFF et al., 2001;
MANCHANDA et al., 2001). Ao contrário destes, o TNFα (fator necrose tumoral),
concentrações elevadas de AMPc e GnRH (hormônio liberador de gonadotrofina)
podem induzir a apoptose das CGs (KEREN-TAL et al., 1995; AMSTERDAN et al.,
1999; SASSON et al., 2002)
15
Em sistema de cultivo livre de soro, o FSH e substâncias que elevam o
AMPc intracelular induzem a diferenciação das células da granulosa de folículos préantrais (AMSTERDAN et al., 1981). Ao contrário, CGs de folículos pré-ovulatórios
são mais sensíveis à retirada do soro, e o FSH não é capaz de inibir a apoptose.
Além disso, os análogos do AMPc podem, ainda, aumentar a apoptose. Isto sugere
que a amplitude e a duração da sinalização via AMPc podem determinar se as
células da granulosa irão se luteinizar e sobreviver ou sofrer apoptose (AHARONI et
al., 1995).
A progesterona produzida nos sistemas de cultura pode agir sinergicamente
com o AMPc e reduzir a incidência de apoptose induzida pela remoção do soro ou
estimulação prolongada ao AMPc (TILLY et al., 1992). Assim, conclui-se que: a) as
CGs adquirem sensibilidade ao AMPc dependendo do seu grau de maturação e da
amplitude e duração de exposição ao AMPc, e b) a relação cruzada entre vias
sinalizadoras pode controlar se a CGs esteroidogenicamente ativas irão se luteinizar
e sofrer morte celular programada ou sobreviver na sua forma diferenciada.
2.4.2. Mecanismo da apoptose nas células da granulosa
A apoptose é coordenada pela ativação de vários reguladores denominados
caspases executoras da via apoptótica (HENGARTENER et al., 2000). As caspases
são proteases que clivam proteínas nos resíduos de ácido aspártico.
O mecanismo de ativação das caspases inclui: a ligação do ligando ao
receptor de morte celular; associação com cofatores; ativação de caspases; clivagem
de
proteínas
induzidas
pelo
aumento
da
concentração
de
caspases.
(HENGARTENER et al., 2000).
Existem mais de 100 proteínas que são utilizadas pelas caspases como
substratos. A clivagem destas proteínas intracelulares ou de membrana leva a varias
alterações morfológicas características de morte celular por apoptose, como por
exemplo: a clivagem da lamina, presente na membrana celular, induz a retração e
formação de botões nucleares; clivagem de fodrin e geosolina presentes na
16
membrana celular levam à perda da estrutura celular (CORSI et al., 1995;
KOTHAKOTA et al., 1997).
Na célula esteroidogênica, ocorre uma compartimentalização das organelas
devido à clivagem de proteínas de membrana o que provoca alteração do
citoesqueleto e separação dos botões apoptóticos da porção celular principal, que
contém gotas lipídicas, mitocôndrias e retículo endoplasmático liso. Assim, diferente
de outros tipos celulares, esta mudança na conformação das CGs permite a
preservação das mitocôndrias, que são as últimas a serem atingidas durante a
apoptose e, portanto, permite a continuidade da síntese de progesterona durante o
processo de apoptose (AMSTERDAN et al., 1998).
A granzima B é uma protease liberada por linfócitos T citotóxicos. Nas
células da granulosa, esta protease pode ser estimulada pelas gonadotrofinas. A
granzima B ao ser clivada se torna ativada e direciona a ativação das caspases, de
forma que a mitocôndria seja preservada da destruição pelo mecanismo da
apoptose. Assim, tem sido sugerido que esta proteína está envolvida no mecanismo
de proteção das mitocôndrias durante o processo de apoptose nas células da
granulosa. (AMSTERDAN et al., 2003).
As caspases também ativam a enzima endonuclease Ca2+/Mg2+ dependente
endógena (MATIKAINEN et al., 2001). Esta enzima cliva o DNA genômico nuclear
(WYLLIE, 1980; ALFANAS`ev et al., 1986) nas regiões internucleossomais gerando
fragmentos de DNA múltiplos 180-200 pb. Este evento regulado por nucleases é o
ponto irreversível na cascata na morte celular (TILLY, 1996). Tem sido demonstrado
que a endonuclease Ca+2/Mg+2 dependente, responsável pela degradação do DNA
apoptótico no ovário, é a DNAse I (BOONE et al., 1995; BOONE e TSANG, 1997),
encontrada no núcleo das células da granulosa e luteais de folículos antrais
saudáveis. Isto sugere que a DNAse I está presente nas células da granulosa de
folículos antrais, na sua forma inativa, sendo somente necessário um sinal para
ativá-la.
.
17
2.5. Óxido nítrico (NO)
O oxigênio reativo e espécies de nitrogênio possuem importância na
transdução de sinais (TORRES e FROMAN, 2000). Assim, o entendimento de como
estas espécies são geradas nas células, algumas de suas propriedades químicas e
reações não enzimáticas que produzem danos celulares se faz necessário para a
compreensão do envolvimento destes na fisiologia celular.
Mais de 95% do oxigênio consumido pelos tecidos é resultante da redução
deste em H2O pela citocromo oxidase na mitocôndria. O consumo remanescente de
oxigênio envolve sua redução univalente e divalente com formação de espécies
reativas de oxigênio como o radical ânion superóxido (O2-) e peróxido de hidrogênio
(H2O2), respectivamente (TORRES e FROMAN, 2000).
A redução univalente do O2 resulta na formação do ânion superóxido e
ocorre sob várias condições: oxidase respiratória em fagócitos, perda de elétrons da
cadeia transportadora de elétrons (maior fonte geradora de superóxidos), reações de
algumas mono-oxigenases, reações catalisadas por desidrogenases, e autooxidação de pequenas moléculas e da oxihemoglobina catalisada por metais
(TORRES e FROMAN, 2000).
O radical superóxido possui propriedades redutoras e oxidantes. Em pH
ácido, o superóxido é protonado para formar o hidroperoxila (HO2.) e reage com a
membrana lipídica, por ser muito reativo e lipofílico (TORRES e FROMAN, 2000).
A redução divalente do oxigênio por mono-oxigenases gera espécies não
radicais de peróxido de hidrogênio. Outra fonte de peróxido de hidrogênio ocorre pela
desmutação do superóxido. Esta reação ocorre em pH fisiológico, sendo acelerada
pela superóxido desmutase. Nesta reação, o peróxido de hidrogênio completamente
protonado, possui meia vida longa, é permeável à membrana, causando danos a
sítios distantes de sua origem. Proteínas que possuem o íon ferro podem ser
reduzidas pelo superóxido (TORRES e FROMAN, 2000).
O peróxido de hidrogênio, na presença de metais reduzidos como ferro e
cobre, é reduzido ao radical hidroxila (OH) e ao íon OH-. O radical hidroxila é
18
extremamente reativo, principalmente com moléculas orgânicas, e modifica
moléculas imediatamente adjacentes ao seu sítio de geração. Isto pode resultar em
uma reação em cadeia, assim como a peroxidação de lipídios. Muitas das toxidades
dos superóxidos (O.2-) podem ser mediadas por meio de sua reação com o óxido
nítrico, para formar o peróxinitrito (TORRES e FROMAN, 2000).
O
óxido
nítrico
(NO)
é
a
menor
molécula
bioativa,
sintetizado
endogenamente pela enzima óxido nítrico sintase (NOS) que converte a L–arginina
em L-citrulina e NO, na presença de oxigênio molecular e vários cofatores: Ca++,
tetrahidrobiopterin,
flavina
adenina
dinucleotídeo,
flavina
mononucleotídea
(McDONALD e MURAD, 1996).
A óxido nítrico sintase é encontrada em duas isoformas: iNOS (óxido nítrico
sintase induzível) e cNOS (óxido nítrico sintase constitutiva) (MONCADA et al., 1991;
SESSA, 1994). Estas isoformas possuem regulação diferente, a cNOS é cálcio
calmodulina dependente e libera pequena quantidade de NO (<1 µM) em curtos
períodos, em resposta à estimulação de receptor. Assim, a isoforma cNOS é ativada
pelo influxo de cálcio, que se liga ao receptor calmodulina, enquanto a iNOS libera
NO em grande quantidade (>10µM) e por longo período de tempo, após ativação de
macrófagos e células endoteliais por citocinas (MONCADA et al., 1991; NATHAN,
1992). O NO liberado pela iNOS está envolvido na vasodilatação patológica e danos
aos tecidos (KILBOURN et al., 1990; MONCADA et al., 1991).
A forma constitutiva da óxido nítrico sintase possui duas isoformas: a
neuronal (nNOS), que ocorre no cérebro, e a endotelial (eNOS), verificada em
diferentes tipos celulares (BREDT et al., 1991; SNYDER, 1995). Estas duas
isoformas liberam pequenas quantidades de NO, que participam de vários eventos
fisiológicos como: neurotransmissão, inibição de agregação e prevenção de adesão
plaquetária no endotélio vascular e regulação da morte celular programada
(apoptose) (MCDONALD e MURAD, 1996; MONCADA et al., 1991; DAWSON e
DAWSON, 1996; ROSSELLI, et al., 1998).
O NO é altamente reativo e possui meia vida curta (5’’), sendo rapidamente
oxidado ao nitrito (NO2-) e nitrato (NO3-), que representam os dois produtos estáveis
de oxidação do metabolismo do NO (MONCADA et al., 1991).
19
Durante as últimas décadas, os efeitos do NO eram anteriormente estudados
somente nos eventos fisiológicos relacionados ao sistema nervoso, circulatório e
imunológico. (MONCADA et al., 1991; NATHAN, 1992; KERWIN e HELLER, 1994;
MURARD, 1999). A partir da década de 90, o NO vem ganhando grande destaque
também na função ovariana, como regulador do desenvolvimento folicular
(MATSUMI et al., 1998b; MASUDA et al., 2001; KIM et al., 2005); esteroidogênese
(VAN VOORHIS et al., 1994; BASINI et al., 1998; BASINI e TAMINI, 2000; MASUDA
et al., 2001; PINTO et al., 2002; JAROSZEWSKI et al., 2003; ESTÉVEZ et al., 2004);
ovulação (SHUKOVSKI e TSAFRIRI, 1994; BONELLO et al., 1996; YAMAUCHI et al.,
1997); regressão luteal (OLSON et al., 1996); maturação oocitária (JABLONKASHARIFF, 2000; HATTORI et al., 2000; HATTORI et al., 2001) e processo de
apoptose nas células da granulosa (HURWITZ et al., 1992; ELLMAN et al., 1993;
CHUN et al., 1995; BASINI et al., 1998; VAN-NASSAUW et al., 1999).
2.5.1. Mediador do efeito citotóxico ou citoprotetor
As propriedades mediadoras do NO dependem de sua química. O NO pode
sofrer várias reações que podem resultar na formação de espécies reativas, dentre
estas, a geração de espécies reativas de óxido de nitrogênio (RNOS) (ESPEY et al.,
2000).
A maioria dos efeitos fisiológicos do NO in vivo está relacionada a reações
diretas entre NO e proteínas contendo o radical heme. Os efeitos indiretos do NO
envolvem RNOS (peróxinitrito), freqüentemente derivados de reações entre NO com
o O2 ou superóxido (O2-). Estas reações estão associadas aos efeitos patofisiológicos
e resposta imune a patógenos. Para que ocorra esta reação, é necessário que o NO
esteja em alta concentração. Portanto, o NO em baixa concentração e liberado por
curto período de tempo medeia efeitos diretos, enquanto que os efeitos indiretos do
NO ocorrem na presença de concentrações elevadas do NO, sustentadas por um
longo período de tempo (ESPEY et al., 2000).
20
Os efeitos diretos e indiretos estão correlacionados com as diferentes
isoformas de óxido nítrico sintase. As formas constitutivas (eNOS e nNOS) e
induzível
(iNOS)
estão
relacionadas
com
os
efeitos
diretos
e
indiretos,
respectivamente.
Os intermediários reativos são responsáveis (RNOS) pelos efeitos indiretos
do NO e podem também sofrer uma variedade de reações. Assim, os efeitos
indiretos podem ser subdivididos em categorias de estresse nitrosativo e oxidativo
(WINK e MITCHELL, 1998).
A oxidação é conseqüência da formação do peroxinitrito (ONOO-) ou íon
nitroxil (WINK et al., 1999). A oxidação química inclui a remoção de um ou dois
elétrons e reações de hidroxilação do substrato. A nitrosação mediada pelo RNOS
parece ocorrer in vivo por meio da reação primária com N2O3 (óxido de nitrogênio),
sendo caracterizada pela adição de um equivalente de NO a uma amina, tiol ou
grupo aromático. Por exemplo: os intermediários da reação NO/O2 (peroxinitrito)
converte peptídeos tiol a peptídeos S-nitrosotiol. Por último, a nitração do grupo
aromático envolve a adição de um equivalente de NO2+. Como exemplo desta
reação, tem-se a formação da nitrotirosina, índice de espécies reativas (BECKMANN
et al., 1992).
Os tipos celulares contendo cNOS (eNOS e nNOS) geram baixo fluxo de NO
por curtos períodos de tempo, portanto, os efeitos diretos são predominantes e os
indiretos limitados, enquanto que na presença da iNOS, a produção de NO é muito
maior, ocorrendo os efeitos indiretos como nitrosação, nitração e reações de
oxidação. Além da fonte geradora do NO, deve-se considerar também que os tipos
celulares ou tecidos próximos a uma fonte de NO podem experimentar os efeitos
diretos e indiretos do NO. Fatores temporal e espacial são, portanto, importantes
quando se considerada a química responsável pelos efeitos biológicos específicos do
NO (LEWIS et al., 1995).
21
2.5.2. Na função ovariana
O NO vem sendo considerado como um dos reguladores envolvidos nas
diversas mudanças estruturais e funcionais que ocorrem no ovário durante o ciclo
estral. Está envolvido na liberação de hormônios hipofisários, regulação do
desenvolvimento folicular e função do corpo lúteo. Além disso, o NO afeta
diretamente ou indiretamente de forma autócrina e/ou parácrina as células
esteroidogênicas, sistema imune, vasos sanguíneos e neurônios no ovário (DAVE et
al., 1997; MASUDA et al., 2001; MASUDA et al., 2001; JAROSZEWSKI et al., 2003;
KIM et al., 2005)
Acreditava-se que a fonte de NO folicular fosse oriunda só das células da
granulosa, pois os estudos (VAN VOORHIS et al., 1994) revelaram a presença da
enzima NOS induzível nas mesmas. Entretanto, estudos posteriores vieram
comprovar a presença da NOS também nas células da teca, células do estroma e
corpo lúteo (JABLONKA – SHARIFF e OLSON, 1997; JAROZENSKY et al. 2000).
Em bovinos, o NO foi verificado em concentrações mais elevadas no fluido
folicular de folículos pequenos (<5 mm) comparado aos folículos grandes (>8 mm)
(BASINI et al., 1998; FAES et al., 2000). BASINE et al. (1998) demonstraram in vitro
a síntese de NO pelas células da granulosa luteais. Recentemente, KIM et al. (2005)
verificaram um padrão de expressão diferenciado das três isoformas iNOS, eNOS e
nNOS no ovário durante o desenvolvimento folicular em suínos. Todos estes
resultados sugerem um papel do NO na fisiologia ovariana.
O NO exerce seus efeitos biológicos por meio de uma variedade de
mecanismos, e muitas de suas ações são atribuídas à sua ligação a enzimas
contendo o grupo heme e metal ferro. Assim, o NO é conhecido por ativar a guanilato
ciclase ao se ligar ao grupo prostético heme, causando um aumento do GMPc
(IGNARRO, 1990). Pode, ainda, combinar-se com o grupo heme da enzima ciclooxigenase, levando à produção de prostaglandinas (SALVEMINI et al., 1993).
As enzimas esteroidogênicas (citocromo P450) possuem um centro heme, o
que poderia sugerir um papel modulador do NO sobre a esteroidogênese, inibindo
22
diretamente a atividade da aromatase (GUENGERICH, 1989; VAN VOORHIS et al.,
1994). Entretanto, SNYDER et al. (1996) demonstraram a ação direta do NO sobre o
complexo enzimático P450arom (SNYDER et al., 1996), ao se ligar ao grupo sulfidrila
da cisteína (sítio ativo da enzima), formando o grupo nitrosotiol, inibidor da atividade
catalítica da aromatase ou, indiretamente, por inibição do gene de transcrição para
aromatase (KAGABU et al., 1999).
2.5.3. Doadores de óxido nítrico
Uma variedade de doadores de NO vem sendo utilizados como:
nitroprussiato de sódio, nitrato e nitrito orgânicos, nitrosaminas, etc. O NO em baixa
concentração
é
quase
que
estável com
baixa
reatividade.
Contudo, em
concentrações elevadas, o NO interage com muitos metais de transição, proteínas
contendo heme e grupos tiols e pode oxidar os polinucleotídeos (RNA e DNA) e
proteinas e pode causar quebras nos polinucleotídeos (IGNARRO e MURRARD,
1995)
2.5.4. Sistema óxido nítrico/guanosina monofosfato cíclica (NO/GMPc)
O nucleotídeo GMPc é um segundo mensageiro potencial, formado a partir
do do nucleotídeo GTP (guanosina tri-fosfato). A enzima catalisadora desta reação é
a guanilato ciclase (Gc) descrita no final da década de 60 e metade da de 70
(GOLDBERG et al., 1969; HARDMAN e SUTHERLAND, 1969; CHRISMAN et al.,
1975). Existem dois tipos de guanilato ciclase que diferem um do outro em função da
localização celular, estrutura e regulação (WALDMAN et al., 1987). Assim, a Gc pode
ser distinguida entre as formas solúvel ou citosólica e ligada à membrana. Entretanto,
uma das isoformas da Gc solúvel foi encontrada associada à membrana celular,
sendo esta sensível ao NO.
A isoforma sensível ao NO é um heterodímero com duas subunidades
diferentes designadas de α e β. Além disso, Gc sensível ao NO contém um grupo
23
prostético heme, no qual o NO se liga e efetua a ativação desta. As subunidades α e
β.são requeridas para a propriedade ligante e orientação do grupo prostético heme.
A estimulação da Gc sensível ao NO pelo seu ativador leva a um aumento de GMPc.
A ativação da enzima requer o ion Mg
++
e promove a conversão de GTP em GDP
(guanosina difosfato) e finalmente em GMPc (GERSER et al., 1981).
No meio intracelular, o sinal induzido pelo NO, via GMPc, desencadeia a
ativação de várias moléculas efetoras: fosfodiesterase-reguladas pelo GMPc,
proteínas quinases dependentes de GMPc, canais iônicos dependentes de GMPc
(LINCOLN, 1989; HOFMAN et al., 2000; FRIEBE e KOESLING, 2003).
A estimulação da fosfodiesterase pelo GMPc ocorre por meio da ligação
deste com o domínio regulatório da enzima, denominado GAF-A. Este processo é
acompanhado pela fosforilação da proteína quinase 1 dependente de GMPc, que
aumenta a afinidade do GMPc pelo dominio GAF-A (FRANCIS et al., 2002)
2.5.5. Inibidor da Guanilato ciclase
Existem algumas substâncias que são inibidoras da GC sensível ao NO.
Uma delas é a quinoxalina derivada do 1H-[1,2,4] oxadiazolo[4,3-a]-quinoxalin-1-one
(ODQ). O ODQ é considerado um forte inibidor da GC sensível ao NO, por se ligar
de forma competitiva e irreversível com a GC sensível ao NO, por meio da oxidação
do Fe++ do grupo heme (SCHRAMMEL et al., 1996; ZHAO et al., 2000).
2.6. Cultivo in vitro de células da granulosa
A atividade aromatase é uma das principais funções do folículo ovariano. A
ocorrência de luteinização espontânea e falha em estimular a atividade da aromatase
nas células da granulosa vem comprometendo os sistemas de cultivo que objetivam
estudar a síntese de estradiol pelas células da granulosa e avaliar a contribuição de
fatores autócrinos e parácrinos envolvidos na esteroidogênese e no desenvolvimento
folicular. Doses fisiológicas de FSH (1-2 ng/ml) utilizadas nos sistemas de cultivo
24
vêm demonstrando um aumento da síntese de estradiol no primeiro dia de cultivo,
ocorrendo uma queda na sua síntese, principalmente ao se utilizarem doses mais
elevadas de FSH (10ng/ml) (GUTIERREZ et al., 1997).
Os sistemas de cultivo de CGS vêm se desenvolvendo cada vez mais com o
objetivo de assemelhar-se às condições esteroidogênicas encontradas in vivo no
folículo ovariano.
O soro fetal bovino utilizado como suplemento em muitos sistemas de cultivo
in vitro de CGs não é capaz de manter a esteroidogênese ativa, pois as células se
luteinizam e perdem a sua capacidade para sintetizar estradiol em resposta ao FSH
(SIRARD., et al 1991; GONG et al., 1994).
A prática de usar soro fetal durante as primeiras horas de cultivo ou placas
pré-tratadas com soro fetal bovino também foram muito utilizadas, por facilitar a
adesão das células na superfície da placa, aumentando a viabilidade celular (GONG
et al., 1994). Entretanto, a breve exposição ao soro fetal induz a luteinização das
CGs, com rápida perda da atividade aromatase (GONG et al., 1994). Assim,
GUTIERREZ et al. (1997) desenvolveram um sistema de cultivo completamente livre
de soro fetal bovino. Neste sistema, as células da granulosa expressam e mantêm a
atividade aromatase e permanecem responsivas a concentrações fisiológicas do
hormônio folículo estimulante (FSH) e fatores de crescimento. Alem disso, as células
mantêm a forma esférica, característica das CGs na parede do folículo e se
organizam em grumos ligados à placa por um pedúnculo, semelhante a um célula
fibroblástica. Entretanto, concentrações elevadas de FSH diminuem a síntese de
estradiol e levam a mudanças na forma da célula, que passa de cubóide para a
forma achatada (GUTIERREZ et al., 1997).
Atualmente, os sistemas de cultura de CGs que visam a conservar a
atividade esteroidogênica das CGs utilizam a albumina de soro bovino 0,1% (BSA)
como um substituto do SFB, o que mantém a atividade da P450 aromatase.
Entretanto, tem sido demonstrado que o BSA comercial é contaminado com várias
moléculas definidas e não definidas, assim como colesterol, peptídeos, esteróides e
outros (WANG et al., 1997; MINGOTI et al., 2002), o que torna este sistema de
25
cultivo semidefinido. PICCINATO et al. (2000) substituíram BSA por álcool polivinílico
0,1% (PVA) e observaram que as CGs mantiveram as mesmas características
esteroidogênicas quando cultivadas com BSA.
O BSA possui uma macromolécula fixadora de nitrogênio com funções
nutricionais, pois é uma grande fonte de proteínas, e sua hidrólise fornece
aminoácidos no meio de cultivo que suporta o desenvolvimento das células. Além
disso, alguns aminoácidos funcionam como agentes quelantes de metais divalentes
tóxicos, reguladores do potencial de oxi-redução. Entretanto, esta macromolécula
possui a composição muito variável em função do grau de ligação das pequenas
moléculas e destas permanecerem ligadas durante o seu preparo. Assim, existem
variação dos efeitos produzidos durante o uso de BSA nos meios de cultura (KANE,
1983; MCKIERNAM, 1992).
A substituição do BSA pelo PVA já é bem aceita no cultivo de embriões
(BAVISTER, 1981; BIGGERS et al., 1997, WRENZYCKI et al., 1999) e recentemente
foi utilizada como um dos constituintes do meio de criopreservação de oócitos (DIEZ
et al., 2005). O PVA é uma molécula inerte e sintética que mantém a osmolaridade
dos sistemas in vitro sem toxidade para as células (BIGGERS et al., 1997;
WRENZYCKI et al., 1999).
26
3. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
ADASHI, E.Y., ROBAN, R.M. (1992) Intraovarian regulation. Peptidergic signaling
systems. Trends in Endocrinol. Metab. 3:243-248.
AHARONI, D., DANTES, A., OREN, M., AMSTERDAN, A. (1995) c – AMP mediated
signals as determinants for apoptosis in primary granulosa cells. Exp Cell Res.,
218:271-282.
ALBERTINI, D. F., COMBELLES, C. M., BENECCHIO, E., CARABATSOS, M. J.
(2001) Cellular basis for paracrine regulation of ovarian follicle development.
Reproduction, 121: 647-653.
ALFANAS`ev,
V.N.,
KOROL`B,A.,
MANTSYGIN,
Y.A.,
NELIPOVICH,
P.A.,
PECAHATNIKOV, V.A., UMANSKY, S.R. (1986) Flow cytometry and bioquimical
analysis DNA degradation characteristics of two types of cell death. FEBS Lett.
194:357-350.
AMSTERDAN, A., DANTES, A., HOSOKAWA, K., SCHERE-LEVY, C. P., KOTSUJI,
F., AHARONI, D. (1998) Steroid regulation during apoptosis of ovarian follicular
cells. Steroids, 63:314-318
AMSTERDAN, A., GOLD, R. S., HOSOKAWA, K., YOSHIDA, Y., SASSON, R.,
JUNG, Y. (1999) Crosstalk among multiple signaling pathways controling ovarian
cell death. Trends Endocrinol Metabol. 10:255-262.
27
AMSTERDAN, A., KNECHT, M., CATT, K. J. (1981) Hormonal regulation of cytodifferention and intercellular communication in cultured granulose cells. Proc.
Natl. Acad. Sci. USA. 78:3000-3004.
AMSTERDAN, A., ROTMENSCH, S., BEN-ZEÈV, A. (1989) Coordinated regulation
of morphological and bioquemical differentiation in steroidogenic cell: the
granulosa cell model. Trends Biochem. Sci. 14:377-382.
AMSTERDAN, A., TAL, I., AHARONI, D., DANTES, A., LAND-BRACHA, A., RIMON,
E., SASSON, R., HIRSH, L. (2003) Steroidogenesis and apoptosis in the
mammalian ovary. Steroids, 68:861-867.
ARMSTRONG, D.G., WEBB, R. (1997) Ovarian follicular dominance: the role
intraovarian growth factors and novel proteins. Rev. Reprod. 2:139-146.
BAO, B., CALDER, M. D., XIE, S., SMITH, F. M., YOUNGQUIST, R. S.,
GARVERICK, H. A. (1997) Steroidogenic acute regulatory protein messenger
ribonucleic acid (mRNA) expression is limited to theca of healthy bovine follicles.
Biol. Reprod. 56:143 (abst.)
BASINI, G., BARATTA, M., PONDERATO, N., BUSSOLATI, S., TAMANINI, C. (1998)
Is nitric oxide an autocrine modulator of bovine granulosa cell function? J.
Reprod. Fertil. 10:471-478.
BASINI, G., GRASSELLI, F., PONDERATO, N., BUSSOLATI, S., TAMANINI, C.
(2000) Lipid hydroperoxide and cGMP are not involved in nitric oxide inhibition of
steroidogenesis in bovine granulosa cells. Reprod. Fertil., 12:289-295.
BASINI, G., TAMANINI, C. (2000) Selenium stimulates estradiol production in bovine
granulose cells: possible involvement of nitric oxide. Domestic. An. Endocrinol.
18:1-17.
BECKMANN, M., POLACEK, D., SEUNG, L., SCHREIBER, J. (1991) Human ovarian
granulosa cell culture: determination of blood cell contamination and evaluation of
possible culture purification steps. Fertil. Steril, 56:881-887.
28
BIGGERS, J. D., SUMMERS, M. C., MCGINNIS, L. K. (1997) Polyvinil alcohol and
amino acids as substitutes for bovine serum albumin in culture media for mouse
preimplantation embryos. Hum. Reprod., 3:125-135.
BOGOVICH, K., RICHARDS, J.S. (1982) Androgen biosynthesis in developing
ovarian follicles: evidence that luteinizing hormone regulates thecal 17αhydroxylase and C 17,20 -lyase activities. Endocrinology, 11:1201-1208.
BOMSEL-HELMREICH, O., GOUGEON, A., THEBAULT, A., SALTARELLI, D.,
MILGROM, E., FRYDMAN, R., PAPIERNIK, E. (1979) Healthy and atretic human
follicles in the preovulatory phase: differences in evolution of follicular morphology
and steroid content of follicular fluid. J. Clin. Endocrinol. Metab. 48:686-694.
BONELLO, N., MCKIE, K., JASPER, M., ANDREW, L., ROSS, N., BREYBON, E.,
BRANNSTROM, M., NORMAN, R.J. (1996) Inhibition of nitric oxide: effects of
interleukin-1β-enhanced ovulation rate, steroid hormones, and ovarian leukocyte
distribution at ovulation in the rat. Biol. Reprod. 54:436-445.
BOONE, D.L., TSANG, B.K. (1997) Identification and localization of DNAse I in the rat
ovary. Biol. Reprod. 57:813-821.
BOONE, D.L., YAN, W., TSANG, B.K. (1995) Identification of deoxyribonuclease Ilike endonuclease in rat granulosa and luteal cell nuclei. Biol. Reprod. 53:10571065.
BRAW, R.H., TSAFRIRI, A. (1981) Effect of hypophysectomy on atresia of rat
preovulatory follicles. Biol. Reprod. 25:989-996.
BRAW-TAL, R., YOSSEFI, S. (1997) Studies in vivo and in vitro on the initiation of
follicle growth in the bovine ovary. J. Reprod. Fertil. 109:165-171.
BREDT, D.S., SNYDER, S.H. (1994) Nitric oxide: a physiologic messenger molecule.
Annu Rev. Biochem. 63:175-195.
BYSCOV, A.G. Follicular atresia. (1978) In: JONES, R.E (ed.) The vertebrate Ovary.
New York: Plenum Press, p. 533-562.
29
CAMPBELL, B.K., SCARAMUZZI, R.J., WEBB, R. (1995) Control of follicle
development and selection in sheep and cattle. J. Reprod. Fertil. 49:335-350.
(Suppl.)
CHRISMAN, T. D., GARBERS, D. L., PARKS, M. A., HARDMAN, J. G. (1975)
Characterization of particulate and soluble guanylate cyclaes from rat lung. J.
Biol. Chem. 250:374-381.
CHRISTENSON, L. K., STOUFFER, R. L., STRAUSS, J. F. III. (2001) Quantitative
analysis of the hormone-induced hyperacetylation of histone H3 associated with
the steroidogenic acute regulatory protein gene promoter. J. Biol. Chem.
276:27392-27399.
CHUN, S.Y., EISENHAUER, K.M., KUBO, M., HSUEH, A.J.W. (1995). Interleukin-1β
suppresses apoptosis in rat ovarian follicles by increasing nitric oxide production.
Endocrinology, 136:3120-3127.
CONG, J.G., WEBB, R. (1996) Control of ovarian follicle development in domestic
ruminants: Its manipulation to increase ovulation rate and improve reproductive
performance. An. Breed. 64:195-204. (abstr.)
CORSI, D., GALLUZZI, L., GRINLLI, R., MAGNANI, M. (1995). Ubiquitin is
conjugated to the cytoskeletal protein alpha-spectrin in mature erythocytes. J.
Biol. Chem. 270:8928-8935.
DAVE, S., FARRANCE, D.P., WHITEHEAD, S.A. (1997) Evidence that nitric oxide
inhibts steroidogenesis in cultured rat granulose cells. Clin. Sci. 92:277-284.
DAWSON, V. L., DAWSON, T. M. (1996) Nitric oxide in neuronal degeneration. Proc.
Soc. Exp. Biol. Med. 211:33-40.
EDELMAN, A. M., BLUMENTHAL, D. K., KRBS, E. G. (1987) Protein serine/threonine
kinases. Annu. Rev. Biochem. 56:567-613.
ELLMAN, C., CORBETT, J.A., MISKO, T.P., MCDANIEL, M., BECKERMAN, K.P.
(1993) Nitric oxide mediates interleukin-1- induced cellular cytotoxicity in rat
ovary: potential role for nitric oxide in the ovulatory process. J. Clin. Invest.
92:3053-3056.
30
EPPIG, J.J. (1991) Intercommunication between mammalian oocytes and companion
somatic cells. Bio-Essays, 13:569-574.
ERICKSON, B.H. (1966) Developmental and senescence of the postnatal bovine
ovary. J. Reprod. Fertil. 10:97-105.
ESPEY, M. G., MIRANDA, K. M., FEELISCH, M., FUKUTO, J., GRISHAM, M. B.,
VITEK, M. P., WINK, D. A. 2000 Mechanisms of cell death governed by the
balance between nitrosative and oxidative stress. NY Acad. Sci. 899:209-221.
ESTÉVEZ, A., FARINA, M., FRANCHI, A., JOHNSON, C., VEJA, M., MOTTA, A. B.
(2004) Interleukin-1β up-regulates nitrite production: effects on ovarian function.
Nitric Oxide. 10:92-100.
FAES, M. R.; CALDAS-BUSSIERE, M. C.; RODRIGUES, J.A ; FONTES, R. S. ;
ROSA E SILVA, A. A. M. . Interrelationship between nitric oxide, progesterone
and oestradiol-17beta concentrations in follicular fluid of ovarian follicles with
follicle-oocyte quality during follicular development in zebu cows (Bos indicus). In:
XXVIII Conferência Annual da Sociedade Internacional de Transferência de
embriões. Theriogenology, EUA, v. 57, n. 1, p. 605-605, 2002
FARKASH, Y., TIMBERG, R., ORLY, J. (1986) Preparation of antiserum to rat
cytochrome P450 cholesterol side chain cleavage, and its use for ultrastructural
localization
of
immunoreactive
enzyme
by
protein
A-gold
technique.
Endocrinology, 118:1353-1365.
FERO, M. L., RIVKIN, M., TASCH, M., PORTER, P., CAROW, C. E., FIRPO, E.,
POLYAK, K., TSAI, L. H., BROUNDY, V., PERMUTTER, R. M., KAUSHANSKY,
K., ROBERTS, J. M. (1996) A syndrome of multiorgan hyperplasia with features
of gigantism tumorigenesis, and female sterility in p27kip1-deficient mice. Cell.
85:733-744.
FIGUEIREDO, J.R., GONÇALVES, P.B.D., RODRIGUES, A.P.R., DE BEM, A.R.
(1997) In vitro development of isolated bovine preantral follicles. Anais de
Congresso da XII Reunião Anual da Sociedade Brasileira de Transferência de
Embriões, Porto Alegre: Arc. Fac. Vet. UFFGS, v. 25, p. 93-107.
31
FORTUNE, J.E. (1986) Bovine theca and granulosa cells interact to promote
androgen production. Biol. Reprod. 35:292-299.
FORTUNE, J.E. (1994) Ovarian follicular growth and development in mammals.
Biol. Reprod. 50:225-232.
FRANCIS, S. H., BESSAY, E. P., KOTERA, J., GRIMES, K. A., LIU, L., THOMPSON,
W.
J.,
CORBIN,
J.
D.
(2002)
Phsphorylation
of
isolated
human
phosphodiesterase-5regulatory domain induces an apparent conformational
change and increases cGMP binding affinity. J. Biol. Chem. 277:47581-47587.
FRIEBE, A., KOESLING, D. (2003) Regulation of nitric oxide-sensitive guanylyl
cyclase. American Heart Assoc. 96-107.
GERSER, R., BÖHME, E., HOFMANN, F., SCHLTZ, G. (1981) Soluble guanylate
cyclase purified from bovine lung contains heme and copper. FEBS Lett. 132:7174.
GOLDBERG, N. D., DIETZ, S. B., O`TOOLE, A. G. (1969) Cyclic guanosine3`5`monophosphate in mammalian tissues and urine. J. Biol. Chem. 244:4458-4466.
GONG, J. G., MCBRIDE, D., BRAMLEY, T. A., WEBB, R. (1994) Effects of
recombinant bovine somatotrophin, insulin-like growth factor-I and insulin on
bovine granulosa cell steroidogenesis in vitro. J. Endocrinol. 143:157-164
GORDON, I. (1994) Oocyte recovery and maturation. In: Gabrielle, J.P. (ed.)
Laboratory Production of Cattle Embryons. Wallingford: Cab International, p. 30142.
GORE-LANGTON, R.E., ARMSTRONG, D.T. (1994) Follicular steroidogenesis and
its control In: Knobil, E., Neill, J.D (eds.). The Physiology of Reproduction. New
York: Raven Press, p. 331-385.
GOWER, D.B. (1984) The role of cytochrome P-450 in steroidogenesis and
properties of some the steroid-trasforming enzymes. In: Markin, H.L.J. (ed.)
Biochemistry of Steroid Hormones.Oxford. UK: Balckwell Scientific, p. 230-292.
32
GRIMES, R.W., MATTON, P., IRELAND, J.J. (1987). A comparison of histological
and non-histological indices of atresia and follicular function. Biol. Reprod. 37:8288.
GUENGERICH, F.P. (1989) Characterization of human microssomal cytochrome P450 enzymes. Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 29:241-264.
GUTHIE, H. D., GARRET, W. M., COOPER, B. S. (1998) Follicle-stimulating
hormone and insulin-like growth factor-I attenuate apoptosis in cultured porcine
granulosa cells. Biol. Reprod. 58:390-396.
GUTIERREZ, C. G., CAMPBELL, B. K., WEBB, R., (1997) Development of a longterm bovine granulosa cell culture system: Induction and maintenance of estradiol
production,
response
to
follicle-stimulating
hormone,
and
morphological
characterisics. Biol. Reprod. 56:608-616.
GWYNNE, J.T., STRAUSS III, J.F. (1982) The role of lipoproteins in steroidogenesis
and cholesterol metabolism in steroidogenic glands. Endocr. Rev. 3:299-329.
HARDMAN, J. G., SUTHERLAND, E. W. (1969) Guanyl cyclase, an enzyme
catalyzing the formation of guanosine 3`, 5`- monophosphate from guanosine
triphosphate. J. Biol. Chem. 244:6363-6370.
HATTORI, M-A., NISHIDA, N., TAKESUE, K., KATO, Y., FUJIHARA, N. (2000) FSH
suppression of nitric oxide synthesis in porcines oocytes. J. Mol. Endocrinol.
21:65-73.
HATTORI, M-A., TAKESUE, K., KATO, Y., FUJIHARA, N. (2001) Expression of
endothelial nitric oxide synthase in the porcine oocyte and its possible function.
Mol. Cell. Bioquem. 219:121-126.
HENDRIKSEN, P. J. M., VOS, P. L. A. M., STEENWEG, W. N. M., BEVERS, M. M.,
DIELEMAN, S. J. (2000) Bovine follicular development and its effect on the in
vitro competence of oocytes. Theriogenology, 53:11-20.
HIRSHIFIELD, A. N. Development of follicles in the mammalian ovary. (1991) Int.
Rev. Cytol. 124:42-101.
33
HOFMANN, F., AMMENDOLA, A., SCHLOSSMANN, J. (2000) Rising behind NO:
cGMP-dependent protein kinases. J. Cell Sci. 113:1671-1676.
HSUEH, A.J.W., BILLIG, H., TSAFRIRI, A. (1994) Ovarian follicle atresia: A
hormonally controlled apoptotic process. Endocrinology, 5:707-724.
HUGHES, F.M. Jr., GOROSPE, W.C. (1991) Bioquimical identification of apoptosis
(programmed cell death) in granulosa cells: evidence for a potential mechanism
underlying follicular atresia. Endocrinology, 129:2799-2801.
HURWITZ, A., HERNANDEZ, E.R., PAYNE, D.W., DHARMARAJAN, A.M., ADASHI,
E.Y. (1992) Interleukin-1 is both morphogenic and cytotoxic to cultured rat ovarian
cells: obligatory role for heterologous, contact-independent cell-cell interaction.
Endocrinology, 131:1643-1649.
IGNARRO, L.J. (1990) Biosynthesis and metabolism of endothelium-derived nitric
oxide. Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 30:535.
IGNARRO., l., MURRARD, F. (ed) (1995) Nitric oxide: biochemistry, molecular
biology, and therapeutic implications. In: Advances in Pharmacology. Academic
Press, New York. v. 34.
INABA, T., MATSUSHINE, H., VALENTINE, M., ROUSSEL, M. F., SHERR, C. J.,
LOOK, A. T. (1992) Genomic organization, chromosomal localization, and
independent expression of human cyclin D genes. Genomics 13:565-574.
IRELAND, J.J., ROCHE, J.F. (1982) Development of antral follicles in cattle following
prostaglandin-induced luteolysis: change in serum hormones, steroids in follicular
fluid and gonadotropin receptors. Endocrinology, 111:2077-2086.
IRELAND, J.J., ROCHE, J.F. (1983) Development of nonovulatory antral follicles in
heifers: changes in steroids in follicular fluid and receptors for gonadotropins.
Endocrinology, 112:150-156.
ISHIMARU, R. S., LEUNG, K., HONG, L-S., LaPOLT, P. S. (2001) Inhibitory effects of
nitric oxide on estrogen production and cAMP levels in rat granulosa cells
cultures. J Endocrinol.168:249-255.
34
JANBLONKA-SHARIFF, A., OLSON, L.M (2000) Nitric oxide is essential for optimal
meiotic maturation of murine cumulus-oocyte complexes in vitro. Mol. Reprod.
Dev. 55:412-421.
JANBLONKA-SHARIFF, A., OLSON, L.M. (1997) Hormonal regulation of nitric oxide
synthases and their cell-specific expression during follicular development in the
rat ovary. Endocrinology, 138:460-468.
JAROSZEWSKI, J. J., BOGACKI, M., SKARZYNSKI, D. J. (2003) Progesterone
production in bovine luteal cells treated with drugs that modulate nitric oxide
production. Reproduction, 125:389:395.
JEWGENOW, K., WOOD, T.C., WILDT, D.E. (1997) DNA-degradation in mural
granulosa cells of non- and slightly atretic follicles of fresh and cold-stored
domestic cat ovaries. Mol. Reprod. Dev. 48:350-355.
JOLLY, P.D., TISDALL, D.J., HEATH, D.A., LUN, S., McNATTY, K.P. (1994)
Apoptosis in bovine granulosa cells in relation to steroid synthesis, cyclic
adenosine 3’, 5’- monophosphate response to follicle-stimulating hormone and
luteinizing hormone, and follicular atresia. Biol. Reprod., 51:934-944.
KAGABU, S., KODAMA, H., FUKUDA, J., KARUBE, A, MURATA, M., TANAKA, T.
(1999) Inhibitory effects of nitric oxide on the expression and of aromatase in
human granulosa cells. Mol. Hum. Reprod., 5:396-401.
KANE, M. T. (1983) Variability in different lots of commercial bovine serum albumin
affects cell multiplication and hatching of rabbit blastocysts in culture. J. Reprod.
Fertil. 88:361-368.
KEREN-TAL, I., SUH, B. S., DANTES, A., LINDNER, S., OREN, M., AMSTERDAN,
A. (1995) Involvement of p53 expression in cAMP mediated apoptosis in
immortalized granulose cells. Exp Cell Res. 218:283-295.
KERWIN, Jr, J.F., HELLER, M. (1994) The arginine-nitric oxide pathway: a target for
new drugs. Med. Res. Rev., 14:23-74.
KILBOURN, R. G., GROSS, S. S., JUBRAN, A., ADAMS, J., GRIFFITH, O. W., LEVI,
R., LODATO, R. F. (1990) Ng-methyl-L-arginine inhibits tumor necrosis factor-
35
induced hypotension: implications for the involvement of nitric oxide. Proc. Natl
Acad. Sci. USA. 87:3629-3632.
KIM, H., MOON, C., AHN, M., LEE, Y., KIM, H., KIM, S. (2005) Expression of nitric
oxide synthase isoforms in the porcine ovary during follicular development. J. Vet.
Sci. 6: 97-101.
KOTHAKOTA, S., AZUMA, T., REINHARD, C., KLIPPEL, A., TANG, J., CHUN, K.,
MCGARRY, T. J. (1997) Caspase-3 generated fragment in gelsolin: effector of
morphological change in apoptosis. Science (Washington DC) 278:294-298.
LACROIX, E., EECHAUTE, W., LEUSEN, I. (1974) The biosynthesis of estrogens by
cow follicles. Steroids, 23:337-356.
LAPOLT, P. S., LUNG, K., ISHIMARU, R., TAFOYA, M. A., CHEN, J. Y. H. Roles of
cyclic GMP in modulating ovarian functions. Symposium: Genetic aspects of
follicular
and
oocyte
growth;
Reproductive
Biomedice
Online.
6:15-23
http://www.rbmonline.com/Article/ 711 em 09/08/2002.
LEW, D. J., VJEKOSLAV, D., REED, S. I. (1991) Isolation of three novel human
cyclins by rescue of G1 cyclin (Cln) function in yeast. Cell. 66:1197-1206.
LEWIS, T. S., TAMIR, S., TANNENBAUM, S. R., DEEN, W. H.M. (1995) Kinetic
analysis of the fate of nitric oxide synthesised by macrophage in vitro. J. Biol.
Chem. 270: 350-355.
LINCOLN, T. M. (1989) Cyclic GMP and mechanism of vasodilation. Pharmacol Ther.
41:479-502.
LUCK, M. R., RODGERS, R. J., FINDLAY, J. K., (1990) Secretion and gene
expression of inhibin, oxytocin and steroid hormones during the in vitro
differentiation of bovine granulosa cells. Reprod. Fertil. Dev. 2:11-25.
MANCHANDA, R., KIM, J-M., TSANG, B. K. (2001) Role of prostaglandins in the
suprpression of apoptosis in hen granulosa cells by transforming growth factor α.
Reproduction 122:91-101.
MANSON, H., FRANKS, S. (1997) Local control of steroidogenesis. Clin. Obst.
Gynecol. 11:261-79.
36
MARIANA, J.C., MONNIAUX, D., DRIANCOURT, M.A., MAULEON, P. (1991)
Folliculogenesis In: Cupps, P.T. (ed.) Reproduction in Domestics Animals, 4. ed.
San Diego: Academic Press, p. 119:171.
MASUDA, M., KUBOTA,T., ASO, T. (2001) Effects of nitric oxide on steroidogenesis
in porcine granulosa cells during different stages of follicular development.
European J Endocrinol. 144:303:308.
MATIKIANEN, T., PEREZ, G. I., ZHENG, T. S., KLUZAK, T. S., RUEDA, B. R.,
FLAVELL, R. A., TILLY, J.; L (2001) Caspase -3 gene knockout defines cell
lineage
specificity for programmed
cell death
signaling in
the
ovary.
Endocrinology, 142:2468-2467.
MATSUMI, H., KOJI, T., YANO, T., YANO, N., TSUTSUMI, O, MOMOEDA, M.,
OSUGA, Y., TAKETANI, Y. (1998a) Evidence for na inverse relationship between
apoptosis and inducible nitric oxide synthase expression in rat granulosa cells: A
possible role of nitric oxide in ovarian follicle atresia. Endocr. J. 45:745-751.
MATSUMI, H., YANO, T., KOJI, T., OGURA, T., TSUTSUMI, O., TAKETANI, Y.,
ESUMI, H. (1998b) Expression and localization of inducible nitric oxide synthase
in the rat ovary: A possible involvement of nitric oxide in the follicular
development. Biochem Biophys. Res. Communic. 243:67-72.
MATSUMI, H., YANO, T., YUTAKA, O., KUGU, K., TANG, X., XU, P. J., YANO, N.,
KURASHIMA, Y., OGURA, T., TSUTSUMI, O, KOJI, T., ESUMI, HIROYASU.,
TAKETANI,Y. (2000) Regulation of nitric oxide synthase to promote cytostasis in
ovarian follicular development. Biol. Reprod. 63:141-146.
MCDONALD, L. J., MURARD, F. (1996) Nitric oxide and cyclic GMP signalling. Proc
Soc Exp Biol Med., 211:1-6.
MCKIERNAN, S. H., BAVISTER, B. D. (1992) Different lots of bovine serum albumin
inhibit or stimulate in vitro development of hamster embryons. In vitro Cell. Dev.
Biol. 284:154-156.
MCNATTY, K.P., HEATH, D.A., HENDERSON, K.M., LUN, S., HUST, P.R., ELLIS,
L.M., MONTGOMERY, G.W., MORRISON, L., THURLEY, D.C. (1984a) Some
37
aspects of thecal and granulosa cell function during follicular development in
bovine ovary. J. Reprod. Fertil. 72:39-53.
MCNATTY, K.P., HEATH, D.A., LUN, S., FANNIN, J,M., McDIARMID, J.H.,
HANDERSON, K.M. (1984b) Esteroidogenesis by bovine theca in an in vitro
perfusion system. Biol. Reprod. 30:159-170.
MILLER, W.L. Molecular biology of steroid hormone biosynthesis. (1988) Endocr.
Rev. 9:295-318.
MINGOTI, G. Z., GARCIA, J. M., ROSA -e-SILVA, A., A., M. (2002) Steroidogenesis
in cumulus cells of bovine cumulus-oocyte-complexes matured in vitro with BSA
and different concentrations of steroids. Anim. Reprod. Sci. 69:175-186.
MONCADA, S., PALMER, R.M.J., HIGGS, E.A. (1991). Nitric oxide: physiology,
patho-physiology. Pharmacol. Rev. 43:109-142.
MURARD, F. (1999) Cellular signaling with nitric oxide and cyclic GMP. Brazilian J.
Med. Biol. Res. 32:1317-1327.
NAKAYAMA, K., ISHIDA, N., SHIRANE, M., INOMATA, A., INOUE, T., SHISHIDO,
N., HORII, I., LOH, D. Y., NAKAYAMA, K. (1996) Mice lacking p27kip1 display
increased body size, multiple organ hyperplasia, retinal dysplasia, and pituitary
tumors. Cell. 85:707-720.
NATHAN, C. (1992) Nitric oxide as secretory product of mammalian cells. FASED J.
6:3051-3064.
OLSON, L.M., JONES-BURTON, C.M., JABLONKA-SHARIFF, A. (1996) Nitric oxide
decreases estradiol synthesis of rat luteinized ovarian cells: Possible role for nitric
oxide in functional luteal regression. Endocrinology, 137:3531-3539
PETROFF, M. G., PETROFF, B. K., PATE, J. L. (2001) Mechanism of cytocineinduced death of cutlured bovine luteal cells. Reproduction, 121:753-760
PICCINATO, C. A., MONTREZOR,L. H., ROSA e SILVA, A. A. M. Produção de óxido
nítrico: Padronização do modelo de cultura das células da granulosa de folículos
ovarianos bovinos. Anais de Congresso da XV Reunião Anual da Sociedade de
38
Transferência de Embriões. (2000) Caldas Novas Arq. Fac. Vet. UFRGS, Porto
Alegre, v. 28, p. 308
PINTO, C. R. F., PACCAMONTI, D. L., ELITS, B. E., SHORT, C. R., GENTRY, L.,
THOMPSON Jr, D. L., GODKE, R. A (2002) Evidence for nitric oxide – mediated
modulation of equine granulosa cell steriodogenesis. Theriogengy, 58:579-583.
POLYAK, K., LEE, M. ERDJUMENT-BROMAGE, H., KOFF, A., ROBERTS, J. M.,
TEMPST, P., MASSAGUE, J. (1994) Cloning of p27kip1, a cyclin-dependent
kinase ihibitor and a potential mediatetor of extracellular antimitotic signals. Cell,
78:59-66.
RABAHI, F., MONNIAUX, D., PISSELET, C., DURAND, P. (1993) Control of in vitro
maturation of bovine cumulus-oocyte complex by preovulatory granulosa cells.
Mol. Reprod. Dev., 34:431:442.
RAO, M. C., MIDGLEY, A. R. Jr., RICHARDS, J. S. (1978) Hormonal regulation of
ovarian cellular proliferation. Cell. 14:71-78
REBECCA, L., ROBKER and JOANNE, S., RICHARDS, S. (1998) Hormonal control
of the cell cycle in ovarian cells: Proliferation versus differentiation. Biol. Reprod.
59:476-482.
RICHARDS, J. S. (1978) Hormonal control of follicular growth and maturation in
mammals. In: Jones RE (ed) The Vertebrate Ovary: Comparative Biology and
Evolution. New York: Plenum Press: 1978: 331-360.
RICHARDS, J. S. (1980) Maturation of ovarian follicles actions and interactions of
pituitary and ovarian hormones on follicular cell differentiation. Physiol.
Rev.60:51-89.
ROBKER, R. L., RICHARDS, J. S. (1998) Hormone-induced proliferation e
differentiation of granulose cells: a coordinated balance of the cell cycle
regulators cyclin D2 and p27kip1. Mol. Endocrinol, 12:924-940.
ROSSELLI, M., KELLER, P. J., DUBEY, R. K. (1998) Role of nitric oxide in the
biology, physiology and pathophysiology of reproduction. Hum. Reprod. Update,
4:3-24.
39
ROUILLIER, P., MATTON, P., SIRARD, M. A., GUILBAULT, L. A. (1996) Folliclestimulating hormone-induced estradiol and progesterone production by bovine
antral and mural granulosa cells cultured in vitro in a completely defined medium.
J. Anim. Sci., 74:3012-3019.
ROUILLIER, P., MATTON,P., DUFOUR, M., SIRARD, M. A., GUILBAULT, L. A.
(1998) Steroid production, cell proliferation, and apoptosis in cultured bovine
antral and mural granulosa cells: development of na in vitro model to study
estradiol production. Mol. Reprod. Dev. 50:170-177.
SALVEMINI, D., MISKO, T.P., MASFERRER, J.L., SIEBERT, K., CURIE, M.G.,
NEEDLEMAN, P. (1993). Nitric oxide activates cyclooxygenase enzymes.
Proc. Natl Acad Sci USA, 90:7240-7244.
SASSON, R., WINDER, N., KEES, S., AMSTERDAN, A. (2002) Induction of
apoptosis in granulose cells by TNF alpha and its attenuation by glucocorticoids
involve modulation of Bcl2. Biochem Biophys Res Commun. 294:51-59.
SCHRAMMEL, A., BEHRENDS, S., SCHMIDT, K., KOESLING, D., MAYER, B.
(1996) Characterisation of 1H-[1,2,4]oxadiazolo[4,3-a]quinoxalin-1-one (ODQ) as
a heme site inhibitor of nitric oxide-sensitive guanylyl cyclase. Mol. Pharmacol.
50:1-5.
SESSA, W. C. (1994) The nitric oxide synthase family of proteins. J. Vasc. Res.
31:131-143.
SHORT, R. V. (1960). Steroids present in follicular fluid of the mare. J. Endocrinol.
20: 147-156.
SHUKOVSKI, L., TSAFRIRI, A. (1994) The involvement of nitric oxide in the ovulatory
process in the rat. Endocrinology, 135:2287-2290.
SICINSKI, P., DONAHER, J. L., GENG, Y., PARKER, S. B., GARDNER, H., PARK,
M. Y., ROBKER, R. L., RICHARDS, JU. S., McGINNIS, L. K., BIGGERS, J. D.,
EPPIG, J. J., BRONSON, R. T., ELLEDE, S. J., WEINBERG, R. A. (1996) Cyclin
D2 is an FSH-responsive gene involved in gonadal cell proliferation and
oncogenesis. Nature. 384:470-474.
40
SIMONI, M., GROMOLL, J., NIESHLAG, E. (1997) The follicular-stimulating hormone
receptor: Biochemistry, molecular biology, physiology, and pathophysiology.
Endocr. Rev.18:739-773.
SIRARD, M. A. Bovine granulosa cells steroidogenesis in vitro (1991). II Response to
FSH, folskolin, and IBMX. In G Gibori (ed.): Sinaling Mechanisms and gene
expression in the ovary. p. 435-440.
SNYDER, G.D., HOLMES, R.W., BATES, J.N., VAN VOORHIS, B.J. (1996) Nitric
oxide inhibits aromatase activity: mechanisms of action. J. Steroid Biochem
Molec. Biol. 58:63-69.
SNYDER, S. H (1995) Nitric oxide. No endothelial NO [news;comment]. Nature,
196:197.
STOCCO, D. M., CLARK, B. J. (1996) Role of steroidogenic acute regulatory protein
(Star) in steroidogenesis. Biochem. Pharmacol. 51:197-205.
STRAUSS, III.J.F., SCHULER, L.A., ROSENBLUM, M.F., TANAKA, T. (1981)
Cholesterol metabolism by ovarian tissue. Adv. Lipid Res. 18:99-157.
SUTOVSKY, P., FLECHON, J.E., FLECHON, B., MOTILIK, J., PEYNOT, N.,
CHESNE, P., HEYMAN, Y. (1993) Dynamic changes of “gap” junctions and
cytoskeleton during in vitro culture of cattle oocyte cumulus complexes. Biol.
Reprod. 49:1277-1287.
TELFER, E.E. (1997) In vitro models for oocyte development. Theriogenology,
49:451-469.
TERRANOVA, P.F., RICE, V.M. (1997) Cytokine involvement in ovarian processes.
Am. J. Reprod. Immunol. 37:50-63.
TILLY, J.L. (1996) Apoptosis and ovarian function. Rev. Reprod. 1:162-172.
TILLY, J.L., KOWALSKI, K.8I., JOHNSON, A.L.I., HSUEH, A.J.W. (1991) Involvement
of
apoptosis
ovarian
follicular
atresia
and
postovulatory
regression.
Endocrinology, 129:2799-2801.
TILLY, J.L., KOWALSKI, K.I., SCHOMBERG, D.W., HSUEH, A.J. (1992) Apoptosis in
atretic ovarian follicles is associated with selective decreases in messenger
41
ribonucleic acid transcripts for gonadotropin receptors and cytochome P450
aromatase. Endocrinology, 131:1670-1676.
TORRES, M., FORMAN, J. H. (2000) Nitric oxide, oxidative stress, and signal
transduction In: Nitric Oxide, Academics Press, p. 330
UILENBROEK, J. Th. J., RICHARDS, J. S. (1979) Ovarian follicular development
during
the
rat
estrous
cycle:
gonadotropin
receptors
and
follicular
responsiveness. Biol. Reprod. 20:1159-1165.
VAN NASSAUW, L., TAO, L.L., HARRISSON, F. (1999) Localization of nitric oxiderelated substances in quail ovary during folliculogenesis. Hitochem J. 31:443-454.
VAN VOORHIS, B.J., DUNN, M.S., SNYDER, GARY. D., WEINER, C.P. (1994) Nitric
oxide: An autocrine regulator of human granulose-luteal cell steroidogenesis.
Endocrinology, 135:1779-1806.
WALDMAN, S. A., MURARD, F. (1987) Cyclic GMP synthesis and function.
Pharmacol Rev. 39:163-196.
WANG, S., LIU, Y., HOLYOAK, G. R., BUNCH, T. D. (1997) The effects of bovine
serum albumin and fetal bovine serum on the development of pre-and postcleavage-stage bovine embryos cultured in modified CR2 and M199 media. Anim.
Reprod. Sci., 48:37-45.
WEEB, R. GONG, J. G., LAW, A. S., RUSBRIDGE, S. M. (1992) Control of ovarian
function in cattle. J. Reprod. Fertil. 45:141-156 (suppl)
WINK, D. A., FEELISCH, M., VODOVOTZ, Y., FUKUTO, J., GRISHAM, M. B. (1999)
The chemical biology of nitric oxide. Gilbert , D. L., Colton, C. A. (eds) Reactive
Oxygen species in Biological System. New York: Kluwer Academic /Plenum
Publishes, p. 245-291.
WINK, D. A., MITCHELL, J. B. (1998) Chemical biology of nitric oxide: Insights into
regulatory, cytotoxic and cytoprotective mechanisms of nitric oxide. Free radicals
Biol. Med. 25:434-456.
42
WRENZYCKI, C. (1999). Alterations in the relative abundance of gene transcripts in
preimplantation bovine embryos cultured in medium supplemented with either
serum or PVA. Mol. Reprod. Dev. 53:8-18
WYLLIE, A.H. (1980) Glucocorticoid-induced thymocyte apoptosis is associated with
endogenous endonuclease activation. Nature, 284:555-556.
XIONG, Y., MENNINGER, J., BEACH, D., WARD, D. C. (1992a). Molecular cloning
and chromosomal mapping of CCND genes encoding human D-type cyclins.
Genomics, 13:575-584.
XIONG, Y., ZHANG, H., BEACH, D. (1992b) Dtype cyclins associate with multiple
protein kinases and the DNA replication and repair factor PCNA. Cell, 72:505514.
YAMAUCHI, J., MIYAZAKI, T., IAWASAKI, S., KISHI, I., KUROSHIMA, M.TEI.C.,
YOSHIMURA, Y. (1997) Effects of nitric oxide on ovulation and ovarian
steroidogenesis and prostaglandin production in the rabbit. Endocrinology,
138:3630-3637.
ZELEZNIK, A.J., IHRIG, L.L., BASSETT, S.G. (1989) Developmental expression of
Ca++/Mg++- dependent endonuclease activity in rat granulose and luteal cells.
Endocrinology, 125:2218-2220.
ZHAO, Y., BRANDISH, P. E., DIVALENTIN, M., SCHELVIS, J. P., BABCOK, G. T.,
MARLETTA, M. A. (2000) Inhibition of doluble guanylate cyclase by ODQ.
Biochemistry 39:10848-10854.
43
4. TRABALHOS
Os trabalhos a seguir serão submetidos à Revista Animal Reproduction
Science.
44
4.1. EFEITO DO FSH NA SÍNTESE DE HORMÔNIOS ESTERÓIDES E ÓXIDO
NÍTRICO NA CULTURA DE CÉLULAS DA GRANULOSA ANTRAIS DE BOVINOS EM
MEIO DE CULTURA QUIMICAMENTE DEFINIDO
RESUMO
Os sistemas de cultivo in vitro de células da granulosa (CGs) vêm se desenvolvendo
com o intuito de se assemelharem, cada vez mais, às condições in vivo. Sabendo-se
que o FSH está envolvido na diferenciação das CGs de bovinos e que o óxido nítrico
(NO) também modula a diferenciação das CGs, o presente estudo objetivou verificar o
efeito do FSH na viabilidade e proliferação celular, síntese de esteróides e de NO,
utilizando meio de cultura quimicamente definido. As CGs antrais (5,0 x 105/ml) de
folículos de 3-5 mm foram cultivadas com ou sem FSH (1ng/ml) por 24, 48, 72, 96 e 120
h em meio de cultura contendo polivinilálcool (PVA). No final cada período de cultivo,
foram avaliadas a viabilidade e proliferação celular pelo método do MTT e citometria de
fluxo, respectivamente, concentração de progesterona (P4) e 17β-estradiol (E2) por
quimioluminescência e nitrato/nitrito (NO3- / NO2-) pelo método de Griess. O sistema de
cultivo manteve a síntese de esteróides e viabilidade celular ao longo do cultivo. O FSH
aumentou (P<0,05) a proliferação e diminuiu a (P<0,05) viabilidade celular às 48 h.
Entretanto, às 72 h a viabilidade celular aumentou (P<0,05) e foi mantida até 120 h de
cultivo, não diferindo (P>0,05) do controle. A síntese de P4 não variou (P>0,05) com a
adição de FSH ao longo da cultura, mas foi menor (P<0,05) às 72 e 96 h em relação ao
controle. O FSH aumentou (P<0,05) a síntese E2 às 24 h e inibiu (P<0,05) nos demais
tempos em relação ao controle. O NO3- / NO2-não variou ao longo do tempo com ou
sem FSH e não houve diferença entre os dois grupos. Os resultados sugerem que: 1) o
sistema de cultivo utilizado foi representativo das condições in vivo, pois aumentou a
síntese de esteróides ao longo do tempo, 2) o FSH induziu a uma rápida diferenciação
das CGs e não alterou síntese de NO pelas CGs, pelo menos na concentração
utilizada.
Palavras - chave: FSH, bovino, células da granulosa, cultura, esteroidogênese
45
ABSTRACT
Studies to improve the in vitro culture systems of granulosa cells (GCs) have been
developing with intention of likely to the in vivo conditions. Knowing that FSH is involved
in bovine GCs differentiation and that nitric oxide (NO) also modulates GCs
differentiation, the this work aimed to verify the effect of the FSH on GCs viability and
proliferation, steroids and NO synthesis using chemically defined culture system. GCs
(5,0 x 105/ml) of follicles measuring 3-5 mm were cultured with or without FSH (1ng/ml)
for 120 h in a culture medium containing polyvinyl alcohol (PVA). In the end of 24, 48,
72, 96 and 120h of culture were evaluated cellular viability and proliferation by MTT
method and flow cytometry, respectively, progesterone (P4) and oestradiol- 17β (E2)
concentration by chemiluminescence and nitrite/nitrate (NO3-/NO2-) by Greiss method.
The culture system maintained steroids synthesis and cellular viability along the culture.
FSH has increased (p<p.05) cell proliferation and has decreased cell viability at the end
of 48 h (p<0.05). However, at 72 h the viability has increased (p<0.05) and was
maintained until 120 h of culture, not differing (p<0.05) from the control. The P4
synthesis haven`t changed with FSH addition, but it is smaller at 72 and 96h (p<0.05) in
relation to control. FSH increased E2 at 24 h and after this period inhibited when it
compared by the control. NO3- / NO2- haven’t changed along the time with or without
FSH (p>0.05). These results suggest that: the 1) the culture system was similar to that
observed in vivo conditions, since it has increased steroids synthesis along the time, 2)
FSH has induced to a faster GCs differentiation and didn’t change the NO synthesis.
Key words: FSH, bovine, granulosa cells, culture, steroidogenesis
46
INTRODUÇÃO
O
sucesso
para
o
desenvolvimento
dos
folículos
ovarianos
é
caracterizado como a capacidade de sintetizar estrógenos (HSUEH et al., 1984).
As células da granulosa (CGs) contribuem para formar o folículo, cuja função é
prover um ambiente adequado para que o oócito se desenvolva. A principal
atividade das CGs é a biossíntese de E2 e P4, regulada pelas gonadotrofinas.
Entretanto, o processo de crescimento e diferenciação dos folículos ovarianos
também é regulado por outros fatores extra e intrafoliculares com ação endócrina,
parácrina e autócrina. O NO vem sendo descrito como regulador da função
ovariana (MASON e FRANKS, 1997; TERRANOVA E RICE, 1997). Este radical
livre é sintetizado via oxidação da L-arginina em L-citrulina pela enzima óxido
nítrico sintase (NOS). Existem três formas da NOS: a forma endotelial (eNOS), a
neural (nNOS), reguladas pelo cálcio-calmodolina (BREDT et al., 1991; LAMAS et
al., 1992) e a induzível (iNOS), regulada por citocinas (LOWENSTEIN et al., 1992).
No ovário, já foi verificada a presença das três isoformas (VAN VOORHIS et al.,
1995; TAKESUE, et al., 2001; TAO et al., 2004; KIM et al., 2005), estando o NO
envolvido na foliculogênese, esteroidogênese, maturação oocitária, ovulação e
atresia folicular (ELLMAN et al., 1994; BEN-SHLOMO et al., 1994; CHUN et al.,
1995, BASINI et al., 1998; JABLONKA –SHARIFF e OLSON, 1997, JABLONKASHARIFF e OLSON, 2000). O NO já foi demonstrado por ser estimulado pelo FSH
em cultura de células da granulosa de suínos (TAKESUE et al., 2001), enquanto
em bovinos ainda não existe nenhum estudo que comprove a ação do FSH na
síntese de NO.
Estudos vêm focando no estabelecimento de um modelo de sistema in
vitro que possa refletir a ação de fatores de crescimento, hormônios e
sinalizadores intra e extracelulares no desenvolvimento das células da granulosa
(GC) in vivo. GUTIERREZ et al. (1997) substituíram o soro fetal bovino,
comumente utilizado no cultivo in vitro, pela albumina sérica bovina (BSA). Neste
sistema de cultura, as CGs expressam e mantêm a atividade da aromatase que
47
permanece responsiva a concentrações fisiológicas de hormônio folículo
estimulante (FSH) e fatores de crescimento. Além disso, as CGs mantêm a forma
esférica, como no folículo, e formam agregados celulares ancorados ao fundo da
placa por células, que se assemelham ao fibroblasto.
A albumina sérica bovina (BSA) mantém a atividade esteroidogênica das
CGs, mas é contaminado por testosterona, progesterona (P4) (MINGOTI et al.,
2000), colesterol, peptídeos e outros fatores (BRACKETT, 1996; WANG et al.,
1997). PICCINATO et al. (2000) substituíram o BSA pelo álcool polivinílico (PVA)
na cultura de CGs e obtiveram resultados semelhantes aos de GUTIERREZ et al.
(1997). O PVA é uma molécula inerte e foi utilizado em sistemas de cultura de
embriões por manter a osmolaridade do meio sem efeito tóxico (BIGGERS et al.,
1997, THOMPSON et al., 1998; WRENYCKI, 1999).
A manutenção da atividade esteroidogênica é o principal objetivo dos
estudos que visam a melhorar o cultivo in vitro das CGs, porém pouco enfoque é
dado à contaminação por células sanguíneas provenientes da punção folicular. As
CGs são cultivadas juntamente com grande quantidade de hemácias e,
possivelmente, macrófagos e outros tipos celulares presentes no sangue. Em
humanos (BECKMANN et al., 1991), a contaminação por células sanguíneas
diminui a esteroidogênese. Além disso, a hemoglobina se liga ao NO e os
macrófagos
podem
também
sintetizar
NO
quando
na
presença
de
lipopolissacarídeos (QUI et al., 2006). Assim, o presente estudo utilizou um
sistema de cultivo quimicamente definido (PICCINATO et al., 2002) com algumas
modificações, sem a presença de hemácias e macrófagos, para verificar o efeito
do FSH na síntese de P4, E2 e NO, viabilidade e proliferação das CGs
48
MATERIAL E MÉTODOS
Reagentes
A maioria dos reagentes, exceto aqueles especificados, foram obtidos
da Sigma Sta Louis, MO, EUA.
Obtenção das células da granulosa
Ovários de vacas cíclicas foram obtidos semanalmente em abatedouros
locais. Após a colheita, foram imediatamente colocados em frascos contendo
solução salina e transportados à temperatura ambiente para o laboratório, onde
tiveram os restos de tecidos eliminados. Em seguida, os ovários foram lavados
com solução salina acrescida de antibiótico e enxaguados brevemente com etanol
70%, sendo novamente lavados (3 vezes) com solução salina. Os folículos
pequenos (3 - 5 mm) apresentando 70 % da sua superfície exposta clara e
vascularizados (GRIMES et al., 1987) foram puncionados e as CGs antrais
aspiradas (ROUILLER et al., 1998) e depositadas em tubos de polietilenoglicol de
15 ml contendo 2 ml de meio base [(Meio Dulbeccos Eagles modificado – Ham´s
F12 com Hepes 15 mM; (Gibco, São Paulo - BRL), adicionado de bicarbonato de
sódio 10 mM, ; penicilina G 100 UI/ml, e sulfato de estreptomicina 100ug/ml,
(Merck, Rio de Janeiro- BRL) acrescido de heparina (50UI) para evitar a formação
de grumos.
A suspensão de CGs foi filtrada em uma malha para retirar os oócitos e
debris celulares. Em seguida, o filtrado foi centrifugado (300 x g/ 10 minutos) à
temperatura ambiente e o sobrenadante eliminado.
As células foram lavadas (2 vezes) com 1 ml de meio base.
Posteriormente, para retirar as hemácias, o precipitado de CGs foi tratado com
300 µl de uma solução de cloreto de amônio 0,9% pré-aquecida (37º C) e
49
incubado por 1 minuto. Em seguida, foi adicionado meio base ao tubo com as
CGs até completar o volume de 12 ml, restaurando, assim, a isotonicidade das
CGs. As CGs foram centrifugadas (300 x g/ 10 minutos) e o precipitado lavado
com meio base. O precipitado de CGs foi ressuspendido em 1 ml de meio base e
semeado em discos de cultura de 32 mm de diâmetro contendo 2 ml do mesmo
meio. As CGs foram incubadas por 2 h, a 37,5oC em ambiente com atmosfera
contendo 5% de CO2 para retirada dos macrófagos (BECKMANN et al., 1991).
As CGs não aderidas foram coletadas da placa de cultura, centrifugadas
(300 x g/ 10 minutos) e ressuspendidas em 2 ml de meio de cultivo [Meio
Dulbeccos Eagles modificado - Hams F12 contendo Hepes 15mM, adicionado de
bicarbonato de sódio 10 mM, penicilina G 100U/ml, e sulfato de estreptomicina
100ug/ml; androstenediona, 10-7 M; PVA 0,1%; 1% de MEM aminoácidos não
essenciais 100 vezes concentrado e 1% de solução ITS 100 vezes concentrado
(selenito de sódio -1,4 ng/ml; transferrina - 5,0 µg /ml; insulina-10ng/ml). A
viabilidade e o número de células foram estimados utilizando-se o microscópio
invertido (Telaval 31, Zeiss), aumento de 400x, hemocitômetro e o método de
exclusão com azul de trypan 0,4%. A viabilidade celular média foi de 70 %.
Foram realizados esfregaços da suspensão celular antes e após o
tratamento para retirada de hemácias e macrófagos. Após terem sido corados com
hematoxilina, foram contadas 100 células com 10 repetições (1000 células totais).
Para cada 100 células contadas antes do tratamento para retirada de hemácias e
macrófagos foram encontrados, em média, 39,8% (± 7,7) de hemácias, 8,5% (±3)
de macrófagos. Após o tratamento, foram encontrados 9% (± 4) de hemácias e 0,4
% de (± 0,5) de macrófagos.
Cultura das CGs
As células da granulosa antrais (5,0 x 105 células/ml) foram cultivadas
em placas de 24 poços contendo meio de cultivo com ou sem FSH (1 ng/ml).
Em seguida, as CGs foram incubadas a 37,5oC em ambiente com atmosfera
50
contendo 5% de CO2 A cada 24 h de cultivo, 70% do meio foi substituído por
meio fresco contendo os tratamentos. O efeito do FSH foi verificado na
viabilidade, proliferação celular e síntese de progesterona (P4), 17β-estradiol
(E2) e nitrato/nitrito (NO3-/NO2-) pelas células da granulosa no final de 24, 48,
72, 96 e 120 h de cultivo.
Determinação da viabilidade celular
No final de cada período de cultura, foi estimada a viabilidade celular
usando-se o método MTT. Este ensaio é baseado na habilidade das células vivas
com mitocôndrias ativas reduzirem o sal brometo de difeniltetrazolium 3-[4,5dimetiltrazol-2yl]-2,5 - ao produto final azul de formazan (metiltriazole).
(MOSMANN, 1983). No final do cultivo 700µl de meio de cultivo foram retirados
para realizar as dosagens necessárias, restando apenas 300 µl de meio. Assim,
30 µl de MTT (5mg/ml) foram adicionados em cada poço, e, em seguida, as CGs
foram incubadas por 3 h a 37º C. Posteriormente, foram adicionados 300 µl de
isopropanol acidificado com HCl (0,04 N) contendo 10 % de Triton X 100 para
solubilizar os cristais formados, durante 14-16 h em temperatura ambiente. Após
este período, 200 µl da mistura de cor azul foram transferidos para placas de 96
poços. A leitura foi realizada em um espectrofotômetro (Multiskan EX Primary EIA
V 2.1-0) com comprimento de onda de 570 nm, com subtração do background
(620 nm). A relação entre a absorbância e o número de células foi determinada
pela incubação prévia de quantidades conhecidas de células com MTT, criando,
assim, uma curva padrão. A relação entre a absorbância e o número de células foi
linear (R2=0,99; P<0,05).
Proliferação celular
Para determinar o efeito do FSH na proliferação das CGs antrais (fase S +
G2/M do ciclo celular), foi realizada citometria de fluxo (BLONDIN et al., 1996). As
51
CGs foram coletadas após a incubação com 1 ml de PBS Ca++ Mg++ e EDTA (125
mg/l) por 10 minutos e centrifugadas a 400g a 4º C por 5 minutos. O
sobrenadante foi removido e o precipitado foi ressuspendido em 500 ul de PBS
Ca++ Mg++. As CGs foram fixadas por no mínimo, 1 hora a 4º C com 1 ml de etanol
absoluto gota a gota durante agitação em vortex. Posteriormente, as CGs foram
centrifugadas e o precipitado ressuspendido com 500 µl de etanol 70% e
estocadas a – 20º C até o dia da análise por citometria de fluxo. Antes das
análises, as CGs foram centrifugadas e o sobrenadante descartado. O precipitado
foi lavado duas vezes com PBS (400g a 4º C por 5 minutos). As CGs foram
ressuspendidas com 1ml de PBS contendo 50 µg/ml de ribonuclease (RNAse,
Merck, Rio de Janeiro-BRL) e incubadas por 30 minutos a 37 oC. Posteriormente,
as CGs foram centrifugadas a 400g a 4º C por 5 minutos e o precipitado
ressuspendido com PBS acrescido de iodeto de propídio (50 µg/ml) e incubadas
por 30 minutos a 0o C. As amostras foram filtradas em filtro de 40µm de diâmetro
e lidas no comprimento de 540 nm (Analisador PARTEC PA). Os dados foram
derivados de histogramas do DNA analisados pela citometria de fluxo. A
percentagem de células em estádio G0/G1(diplóides), S (síntese de DNA) e G2/M
(tetraplóide) do ciclo celular e percentagens de células contendo níveis subdiplóides de DNA (DNA fragmentado) foram calculados utilizando – se um
software DPAC.
Dosagens hormonais
No final de cada período de tempo, o meio de cultura foi coletado e
armazenado a -20oC para dosagem de E2 e P4 pelo sistema automatizado de
quimioluminescência ACS:180®. O teste é um imunoensaio competitivo que usa
tecnologia quimioluminescente direta. O anticorpo anti-P4 e anti-E2 monoclonal é
marcado com éster de acridina. A curva de P4 variou de 0,86 a 29,80 ng/ml e a de
E2 de 88 a 785 pg/ml. Amostras de meio de cultivo das CGs foram utilizadas sem
diluição e com diluições (1/40 e 1/400) e o hormônio mensurado. A média do
52
coeficiente de variação foi de 1,6 % e 3 % para e progesterona e 17β-estradiol
respectivamente.
Dosagem de nitrato/nitrito (NO3- / NO2-)
A concentração de NO3- / NO2- (µM) foi mensurada utilizando-se o método
colorimétrico de Griess (RICART-JANÉ et al., 2002). O reagente de Griess é
composto de uma mistura de sulfanilamida 2% e N-(1-naphthyl) ethylene-diamine
0,2% em água Milii Q. A primeira reação na amostra ocorre com o nitrito para
formar o sal diazonium que reage com o segundo reagente para formar a cor
púrpura com um pico de absorbância a 540 nm. Para reduzir o nitrato a nitrito, as
amostras (40 µl) foram incubadas com 40 µl de uma mistura contendo 1000 µl da
enzima nitrato redutase oriunda de bactéria [100 µl da enzima (10 UI diluída em
500 µl de água Milli Q) diluída em 900 µl de água Milli Q], 1000 µl do cofator
NADPH (5mg/ml diluído em água Milli Q) e 1000 µl de tampão fosfato de potássio
(0,5 M). As amostras foram incubadas a 37 oC por 14-16 horas. Posteriormente,
80 µl do reagente de Griess foram adicionados às amostras.
O método foi desempenhado em placa de 96 poços. Todas as soluções
foram protegidas da luz. Uma curva padrão de nitrito de sódio diluída em
DMEM/Ham`s-F12 contendo valores conhecidos de nitrito foi realizada, onde o
valor mínimo de nitrito foi de 0,5 µM e o máximo de 100µM. Com os valores da
absorbância foi montado um gráfico de dispersão. A relação entre a absorbância e
a concentração de NO3- / NO2- foi linear (R2=0,98; P<0,05).
Análise estatística
O experimento foi repetido duas vezes e cada tratamento constou de
duas repetições por experimento. Foi aplicada uma análise de regressão
polinomial para verificar a viabilidade celular, proliferação celular e concentração
de P4, E2, NO3-/NO2- ao longo do tempo, com respectivo teste de significância de
53
5% e coeficiente de determinação (R2). Foi realizada uma ANOVA com um fator.
As médias foram comparadas por teste de Tukey (<0,05). O programa utilizado foi
SAS (Statistical Analysis System). Além disso, a correlação de Pearson (P<0,05)
foi utilizada para verificar correlação entre as variáveis P4, E2, NO2- / NO-3,
viabilidade celular e proliferação celular. Os dados estão representados como
médias ± desvio padrão.
RESULTADOS
Características morfológicas das células da granulosa cultivadas com ou sem FSH
ao longo de 120 h de cultivo
As CGs mantiveram a característica arredondada como in vivo (Figura 1),
formaram vários e pequenos grumos celulares no final de 24 h nos dois grupos.
Estes grumos celulares aumentaram de tamanho ao longo do tempo, formando
grumos maiores e ancorados ao fundo da placa de cultura por células de
aparência semelhante a de um fibroblasto. No final de 48 h, as CGs cultivadas
com FSH pareciam ter seu tamanho aumentado em relação ao controle. Após 96
e 120 h de cultivo, as CGs cultivadas com FSH ficaram mais achatadas e havia
formação de gotas de aspecto gorduroso no fundo da placa.
Viabilidade celular
A viabilidade das CGs cultivadas sem FSH (controle) aumentou (P<0,05)
no final de 48 h (9,8 x 105 ± 0,7 células) e 120 h (8,9 x 105 ± 0,6 células) de cultivo
em relação aos demais períodos de cultivo (Tabela 1), enquanto a viabilidade das
CGs cultivadas com FSH (Tabela 1) diminuiu (P<0,05) às 96 h (7,0 x 105 ± 0,7
células) e aumentou (P<0,05) às 120 h (8,7 x 105 ± 0,6 células). A regressão foi
54
linear significativa (R2= 0,94, P<0,0001 e R2= 0,67, P<0,001 para CGs cultivadas
sem FSH ou com FSH, respectivamente).
A viabilidade das CGs cultivadas sem FSH (9,8 x 105 ± 0,7 células) foi
maior (P<0,05) comparada à das CGs cultivadas com FSH (7,1 x 105 ± 0,6 células)
no final de 48h, enquanto nos demais períodos de cultivo não houve diferença
(P>0,05) na viabilidade celular entre os dois grupos (Tabela 1 ).
Proliferação celular
A maioria das CGs encontrou-se na fase G0/G1 (estádio diplóide de DNA)
do ciclo celular nos dois grupos. A percentagem de CGs na fase S+G2/M (mitose)
foi maior (R2= 0,55, P<0,05) no final de 48 h (27, 0 ± 2,0 %) e 72 h (25,4 ± 1,0 %)
do que nos demais períodos, quando as CGs foram cultivadas sem FSH (Figura
2). O FSH aumentou (R2= 0,13, P>0,05) a percentagem de CGs na fase S+G2/M
somente no final de 48 h (41,1 % ± 1,5) comparada aos demais períodos de
cultivo e também com as CGs cultivadas sem FSH (27, 0 ± 2,0 %) (Figura 2).
Porém, após 72h, a percentagem de CGs na fase S+G2/M cultivadas sem FSH
(25,4 ± 1,0 %) foi maior (P<0,05) comparada às CGs cultivadas com FSH (14,75
± 0,8 %). Nos demais períodos de cultivo, não houve diferença (P>0,05) entre os
dois grupos de tratamento (Figura 2).
A percentagem de CGs com níveis sub-diplóides de DNA foi inferior a 5 %
para CGs cultivadas para os dois grupos ao longo de todo o cultivo.
Síntese de P4.
A síntese de P4 pelas CGs cultivadas sem FSH aumentou (P<0,05) às 72
h (529,9 ± 109 ng/ml), mantendo-se elevada até 96 h (673,9 ± 6,5 ng/ml) e
diminuiu (P<0,05) às 120h (380,8±89,1ng/ml). Não houve variação (P>0,05) na
síntese de P4 quando as CGs foram cultivadas com FSH ao longo de 120 h. A
regressão foi linear significativa (R2= 0,83; P<0,0001 e R2= 0,50; P<0,01) para
55
CGs cultivadas com ou sem FSH, respectivamente. A síntese de P4 pelas CGs
cultivadas com ou sem FSH (controle) não diferiu até 48 h (407,0 ± 104 ng/ml;
316,4 ± 60ng/ml, respectivamente). Ao final de 72 h e 96 h, a síntese de P4 pelas
CGs cultivadas com FSH (347,4 ± 24 ng/ml; 324, 1 ± 118 ng/ml, respectivamente)
foi menor (P<0,05) do que a síntese de P4 pelas CGs cultivadas sem FSH (529,9 ±
109 ng/ml; 673,3 ± 6,5 ng/ml, respectivamente) (Tabela 2).
Síntese de E2
A síntese de E2 pelas CGs cultivadas sem FSH (controle) aumentou
(P<0,05) até 72 h (24,5 ± 0,3 ng/ml) e se manteve até 120 h (23,9 ± 2,1 ng/ml) de
cultivo, enquanto que, com FSH, a síntese de E2 diminuiu (P<0,05) no final de 48 h
(0,72 ± 0,1 ng/ml) e manteve – se baixa até o final do cultivo. A regressão foi linear
significativa (R2= 0,94, P<0,0001 e R2= 0,63, P<0,005) para CGs cultivadas sem
ou com FSH, respectivamente. O FSH aumentou (P<0,05) a síntese de E2 às 24 h
(3,2 ± 0,003 ng/ml) e depois diminuiu nos demais períodos de tempo em relação
ao controle (Tabela 3).
Síntese de NO3- / NO2A síntese de NO2- / NO3- sem ou com FSH não variou ao longo do tempo
(R2= 0,40, P>0,05 e R2= 0,22, P>0,01, respectivamente) e nem diferiu (P>0,05)
entre os grupos (Tabela 4).
Relação entre a síntese de P4 e E2, NO3- / NO2-, viabilidade e proliferação celular
A síntese de P4 foi correlacionada positivamente com a síntese de E2
pelas CGs (0,32, P<0,05). A síntese de P4 foi correlacionada positivamente com a
proliferação celular (0,45, P<0,005). Embora não tenha sido significativo, a síntese
56
de E2 foi correlacionada negativamente com a proliferação celular (- 0,07, P>0,6).
As demais correlações não foram significativas (P>0,05).
Tabela 1 Número de células da granulosa viáveis (x 105 ) de folículos de 3-5mm de
diâmetro cultivadas sem (controle) ou com FSH ao longo de 120 h.
Tratamento
24h
48h
72h
96h
120h
Controle
7,3 ±0,7 aA
9,8 ±0,7bA
7,31 ±0,3aA
7,0 ±0,8aA
8,9 ±0,6aA
FSH
8,2 ±0,4abA
7,1 ±0,3bcB
7,6 ±0,6bcA
7,0 ±0,7cA
8,7 ±0,6aA
ab
Médias acompanhadas de letras diferentes na mesma linha diferem
significativamente (P<0,05) pelo teste de Tukey.
AB
Médias acompanhadas de letras diferentes na mesma coluna diferem
significativamente (P<0,05) pelo teste de Tukey.
Cada
valor
representa
média
± desvio
padrão
independentes com duas repetições por tratamento.
de
dois
experimentos
57
Tabela 2 Concentração de progesterona (ng/ml) sintetizada pelas CGs antrais
cultivadas sem (controle) ou com FSH (1ng/ml) no final de cada período
de tempo.
Tratamento
24 h
48 h
72 h
96 h
120 h
Controle
174,8±22aA
316,3±60abA
529,9±109cdA
673,3±6,5dA
380,8±89cdA
FSH
249,8±44aA
407,0±104aA
347,4±24aB
324,1±118aB
437,4±86aA
abcd
Médias acompanhadas de letras diferentes na mesma linha diferem
significativamente (P<0,05) pelo teste de Tukey.
AB
Médias acompanhadas de letras diferentes na mesma coluna diferem
significativamente (P<0,05) pelo teste de Tukey.
Cada valor representa média ± desvio padrão de experimentos independentes
com duas repetições por tratamento
58
Sem FSH
Com FSH
a
b
c
d
e
f
96h
g
h
120h
i
j
24h
48 h
72h
Figura 1 Células da granulosa antrais de folículos de 3-5 mm de diâmetro
cultivadas sem FSH (a, c, e, g, i) ou com FSH (b, d, f, h, j), aumento de
400 x no final de 24, 48, 72, 98 e 120 h de cultura.
% de células proliferativas (S+G2/M)
59
c
45
40
b
35
b
30
25
20
a
a
a
a
a
a
a
Seqüência1
Sem FSH
Com FSH
Seqüência2
15
10
5
0
24
48
72
96
120
Período de cultivo (horas)
Figura 2:
Percentagem (%) de células da granulosa antrais de folículos de
3-5 mm de diâmetro em estádio proliferativo (S+G2/M) sem ou com
FSH (1ng/ml) no final de cada período de cultivo analisado por
citometria de fluxo. Médias com letras diferentes indicam diferença
estatística de um mesmo tratamento ao longo cultivo e de tratamentos
diferentes no final de cada período cultivo (P<0,05). Cada valor
representa
média
±
desvio
padrão
de
independentes com 2 repetições por tratamento.
.
dois
experimentos
60
Tabela 3 Concentração de 17 β-estradiol (ng/ml) sintetizada pelas CGs antrais de
folículos de 3-5 mm de diâmetro cultivadas sem (controle) ou com FSH
(1ng/ml) no final de cada período de tempo.
Tratamento
abc
24 h
48 h
aA
Controle
2,0 ± 0,3
FSH
3,2 ± 0,003
aB
72 h
bA
8,6 ± 0,9
bB
0,72 ± 0,1
96 h
cA
26,46 ± 3,7
cA
23,85 ± 2,1
cA
bB
0,52 ± 0,06
bB
0,38 ± 0,07
bB
24,49 ± 2,2
0,42 ± 0,07
120 h
Médias acompanhadas de letras diferentes na mesma linha diferem
significativamente (P<0,05) pelo teste de Tukey.
AB
Médias acompanhadas de letras diferentes na mesma coluna diferem
significativamente (P<0,05) pelo teste de Tukey.
Cada valor representa média ± desvio padrão de experimentos independentes
com duas repetições por tratamento
61
Tabela 4 Concentração de NO3- / NO2- (µM) sintetizada células da granulosa
antrais (n x 105) cultivadas sem (controle) ou com FSH (1ng/ml) ao longo
do tempo e no final de cada período de tempo
Tratamento
24 h
48 h
72 h
96 h
120 h
Controle
1,89 ±0,56ªA
2,40 ±1ªA
2,74 ±0,5ªA
2,98 ± 0,91ªA
1,83 ±0,37ªA
FSH
1,74 ±0,7ªA
2,19 ±0,6ªA
1,59 ±0,9ªA
2,70 ±0,4ªA
2,46 ±0,7ªA
a
Médias acompanhadas de letras diferentes na mesma linha diferem
significativamente (P<0,05) pelo teste de Tukey.
A
Médias acompanhadas de letras diferentes na mesma coluna diferem
significativamente (P<0,05) pelo teste de Tukey.
Cada
valor
representa
média
± desvio
padrão
de
dois
experimentos
independentes com duas repetições por tratamento
DISCUSSÃO
O sistema de cultivo utilizado no presente estudo, no qual o BSA foi
substituído pelo PVA, aumentou a síntese de esteróides (P4 e E2) ao longo do
cultivo pelas células da granulosa como descrito por GUTIERREZ et al. (1997) em
sistema de cultivo com BSA e confirmam os resultados de PICCINATO et al.
(2000), que, ao substituírem BSA pelo PVA no cultivo de CGs de bovinos,
verificaram também o aumento da síntese de esteróides ao longo do cultivo. As
CGs conservaram a forma arredondada, formando agregados celulares, mantendo
as características de células da granulosa de um folículo saudável e funcional.
Portanto, este sistema de cultivo pode ser utilizado para estudos que visam a
melhor compreender os fatores reguladores da esteroidogênese ovariana, visto
62
que a síntese de esteróides é a principal atividade das células da granulosa,
sendo utilizada como uma forma de predizer o destino do folículo, se este irá
sofrer atresia ou luteinização (HSUEH et al., 1994; JOLLY et al., 1994).
O PVA é uma macromolécula sintética não protéica que pode substituir o
BSA (BIGGERS et al., 1997; PICCINATO et al., 2000). O BSA também é uma
macromolécula utilizada nos sistemas de cultura como fonte de aminoácidos,
entretanto é um produto quimicamente muito variável, pois a sua composição
depende do grau de como as pequenas moléculas permanecem ligadas à
macromolécula durante o seu preparo. Assim, o seu efeito no cultivo também é
muito variável (MCKIERNAN e BAVINSTER, 1992). Além disso, o BSA também é
contaminado com testosterona e progesterona e a suplementação do meio de
cultura contendo BSA com um destes hormônios poderia inibir a síntese de E2
pelas CGs (MINGOTI et al., 2002). A substituição do BSA pelo PVA, com adição
de aminoácidos e fatores de crescimento, mantém a atividade esteroidogênica e
as características morfológicas das células da granulosa de um folículo estrógeno
ativo (PICCINATO et al., 2000). PICCINATO et al. (2000) demonstraram, por meio
de microscopia eletrônica, que as CGs cultivadas em meio de cultivo livre de soro
fetal contendo PVA e insulina mantêm a forma poliédrica, presença de gotas
lipídicas, alta relação núcleo/citoplasma, abundantes ribossomos e mitocôndrias
com cristas trabeculares. Estas características são as mesmas descritas por
GUTIERREZ et al (1997), em sistema de cultivo contendo BSA e insulina
Os resultados demonstraram que a adição de FSH na concentração de
1ng/ml a cada 24 h, manteve a síntese de P4 sem variações ao longo do cultivo,
entretanto a síntese de E2 só foi estimulada até 24 h de cultivo com uma
diminuição considerável na sua síntese após 48 h de cultivo comparada às CGs
cultivadas sem FSH. GUTIERREZ et al. (1997) demonstraram que a adição de
FSH, na concentração de 1 ng/ml, a um sistema de cultivo contendo 10ng/ml de
insulina, semelhante ao presente experimento, aumenta a síntese de E2 pelas CGs
obtidas de folículos < 4mm, entretanto este mesmo tratamento possui pouco efeito
positivo sobre a síntese de E2 de folículos médios (4-8 mm) e grandes (>8mm).
ROULLIER et al. (1998) demonstraram que a produção de E2 pode ser aumentada
63
pelo FSH no final do cultivo da CGs, quando estas são cultivadas inicialmente sob
condições mínimas de FSH (0,5ng/ml) e depois expostas à concentrações maiores
de FSH, enquanto que sob estas condições ocorre uma diminuição da síntese de
P4. Entretanto, a exposição das CGS ao FSH em doses crônicas aumenta a
síntese de P4, e diminui a síntese de E2 pelas CGs de folículos > 8mm, sugerindo
uma luteinização das CGs. Adicional a estes resultados, GONG et al. (1994)
verificaram que a combinação do FSH com insulina estimula o aumento da síntese
de E2,de uma maneira dose-dependente, em cultivo de CGs de folículos
pequenos, médios e grandes.
O FSH, quando utilizado sob condições de estimulação crônica ou em altas
concentrações, diminui a produção de E2, tendo em vista que a constante
exposição das CGs ao FSH regula negativamente os receptores para FSH
(BERNDTSON et al., 1995; MINEGISHI et al., 1995; ROUILLER et al., 1996).
Embora, no presente estudo, não tenha sido utilizado FSH em concentração
elevada (10 ng/ml), a adição deste desde o início do cultivo pode ter favorecido
uma rápida diminuição do E2. Esta diminuição não parece ser uma conseqüência
da diminuição da viabilidade celular, embora esta tenha sido menor no final de 48
h de cultivo em relação às CGs cultivadas sem FSH. De uma forma geral, a
viabilidade das CGs cultivadas com FSH se manteve semelhante à das CGs
cultivadas sem FSH ao longo de 120 h. Contudo, o aumento da proliferação das
CGs no final de 48h de cultivo quando estas foram estimuladas pelo FSH pode ter
sido o causador da diminuição de E2, embora não tenha sido significativo, a
síntese de E2 foi correlacionada negativamente com a proliferação celular. Como
em ratas imaturas, ORLY et al. (1980) demonstraram, em sistema de livre de soro,
que as CGs perdem a capacidade esteroidogênica induzida pelo FSH durante o
aumento da proliferação celular.
Como verificado no presente estudo, a síntese de P4 estimulada pelo FSH
não mudou ao longo do tempo, entretanto, no final de 72 h e 96 h ela foi menor
que a síntese de P4 pelas CGs cultivadas sem FSH e foi correlacionada
positivamente com a proliferação celular. As CGs se diferenciam durante o cultivo
in vitro mudando de estrógeno ativa para células produtoras de P4 (SKINNER e
64
OSTEEN, 1988). Entretanto, o aumento de P4 observado pelas CGs ao longo da
cultura não significa que as CGs tenham se luteinizado, visto que as mesmas não
mudaram sua forma esférica, encontrada em folículo estrógeno ativo. No modelo 2
células/2 hormônios (FORTUNE et al., 1994), as CGs sintetizam a P4 que irá servir
como precursora da síntese de andrógenos pelas células da teca. No final do
crescimento folicular, a atividade da P450 aromatase é modulada pela
disponibilidade de andrógenos que aumenta de forma crescente até ocorrer o pico
pré-ovulatório. Neste sistema de cultivo, o acúmulo de P4 se deve à não-utilização
desta como substrato, tendo em vista a ausência das células da teca.
O FSH pode estimular diferentes vias de transdução de sinais por meio da
ligação com seu receptor. A via clássica de estimulação da síntese de esteróides
pelo FSH é a via AMPc pela ativação da adenilato ciclase e aumento da proteína
quinase A (LEUNG et al., 1992). Uma outra via independente do AMPc envolve a
ativação da fosfolipase C (PLC) pelo FSH, que aumenta a síntese do 1,4,5 inositol
tri-fosfato, que, por sua vez, aumenta a concentração de Ca++ intracelular
(QUINTANA et al., 1994). Em camundongos (LEUNG et al., 1992), esse aumento
do Ca++ intracelular inibe a produção de AMPc estimulada pela adenilato ciclase e
portanto esta via tem impacto negativo sobre a síntese se esteróides. Assim, é
possível que o FSH tenha atuado via fosfolipase C/proteína quinase C para inibir a
síntese de E2, e portanto, esta via merece ser investigada em outros estudos.
A síntese de NO ao longo do tempo tanto nas CGs cultivadas sem ou com
FSH, na concentração de 1ng/ml não variou. Estes resultados sugerem que
embora a enzima NOS esteja presente nas CGs antrais de bovinos, visto que as
mesmas sintetizam NO, o FSH não foi capaz de aumentar a síntese de NO, pelo
menos na concentração conhecida por ser fisiológica (GUTIERREZ et al.,1997). O
envolvimento do NO na diferenciação celular e a estimulação da sua síntese por
gonadotrofinas já foi descrito em suínos (HATTORI et al., 1996; NISHIDA et al.,
2000; TAKESUE et al., 2001). O FSH em concentrações mais elevadas (10 ng/ml)
estimula a síntese do NO e seu 2º mensageiro, GMPc, após 48 h de cultivo, que
coincidi com o aumento da expressão do receptor para LH (TAKESUE et al.,
2001). Deve ser ressaltado que o FSH na concentração de 10 ng/ml, considerada
65
elevada, vem sendo relacionada com a luteinização das CGs. Como verificado no
presente estudo, as características morfológicas de CGs esteroidogenicamente
ativas foram preservadas quando estas foram cultivadas com 1 ng/ml de FSH,
sugerindo que elas não se luteinizaram. Mais estudos devem ser realizados para
avaliar o possível envolvimento do NO no processo de diferenciação das CGs
induzido pelo FSH.
CONCLUSÕES
Estes resultados permitem concluir que a substituição do BSA pelo PVA
não altera a viabilidade e proliferação das CGs e nem as características
morfológicas e esteroidogênicas das CGs demonstradas por GUTIERREZ et al.
(1998), podendo ser utilizada como meio de cultivo quimicamente definido para
verificar
os
efeitos
de
diversos
fatores
envolvidos
na
regulação
da
eteroiodogênese das CGs, como foi verificado no presente estudo, no qual foi
demonstrado um efeito negativo da adição do FSH, de forma crônica, sobre a
síntese de E2, confirmando seu papel na diferenciação das CGs.
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
BASINI, G., BARATTA, M., PONDERATO, N., BUSSOLATI, S., TAMANINI, C.
(1998) Is nitric oxide an autocrine modulator of bovine granulosa cell function?
J. Reprod. Fertil., 10:471-478.
66
BECKMANN, M., POLACEK, D., SEUNG, L., SCHREIBER, J. (1991) Human
ovarian granulosa cell culture: determination of blood cell contamination and
evaluation of possible culture purification steps. Fertil. Steril., 56:881-887.
BEN-SHLOMO,
I.,
ADASHI,
E.
Y.,
PAYNE,
D.
W.
(1994)
The
morphogenic/cytotoxic and prostaglandin-stimulating activities of interleukin-1β
in the rat ovary are nitric oxide independent. J Clin Invest., 94:1463-1469.
BERNDTSON, A. K., VICENT, S. E., FORTUNE, J. E. (1995) Low and high
concentrations gonadotropins differentially regulate hormone production by
theca interna and granulose cells from bovine preovulatory follicles. Biol.
Reprod., 52:1334-1342.
BIGGERS, J. D., SUMMERS, M. C., MCGINNIS, L. K. (1997) Polyvinil alcohol and
amino acids as substitutes for bovine serum albumin in culture media for
mouse preimplantation embryos. Hum. Reprod., 3:125-135.
BLONDIN, P., DUFOUR, M., SIRARD, M. (1996) Analysis of atresia in bovine
follicles
using
different
methods:
Flow
cytometry,
enzyme-linked
immunosorbent assay, and classic histology. Biol. Reprod., 54:631-637.
BRACKETT, B. G., YOUNIS, A. I., FAYRER-HOSKEN, R. (1989). Enhance
viability after in vitro fertilization of bovine oocytes matured in vitro with
concentrations of luteinizing hormone. Fertil. Steril., 52:319-324.
BREDT, D. S., HWANG, P. M., GLATT, C. E., LOWENSTEIN, C., REED, R. R.,
SNYDER, H. (1991) Cloned and expressed nitric oxide synthase structurally
resembles cytochome P450 reductase. Nature, 351:714-718.
BREDT, D.S., SNYDER, S.H. (1994) Nitric oxide: a physiologic messenger
molecule. Annu Rev. Biochem., 63:175-195.
CHUN, S.Y., EISENHAUER, K.M., KUBO, M., HSUEH, A.J.W. (1995) Interleukin1β suppresses apoptosis in rat ovarian follicles by increasing nitric oxide
production. Endocrinology, 136:3120-3127.
67
CONG, J. G., MCBRIDE, T. A., BRAMLEY, T. A., WEBB, R. (1994) effects of
recombinant bovine somatotrophin, insulin-like growth factor –I and insulin on
bovine granulose cell steroidogenesis in vitro. Endocrinology, 143:157-164
ELLMAN, C., CORBETT, J.A., MISKO, T.P., MCDANIEL, M., BECKERMAN, K.P.
(1993) Nitric oxide mediates interleukin-1- induced cellular cytotoxicity in rat
ovary: potential role for nitric oxide in the ovulatory process. J. Clin. Invest.,
92:3053-3056.
FORTUNE, J. E. (1994). Ovarian follicular growth and development in mammals.
Biol. Reprod., 50:225-232.
GRIMES, R.W., MATTON, P., IRELAND, J.J. (1987). A comparison of histological
and non-histological indices of atresia and follicular function. Biol. Reprod.,
37:82-88.
GUTIERREZ, C. G., CAMPBELL, B. K., WEBB, R. (1997) Development of a longterm bovine granulosa cell culture system: Induction and maintenance of
estradiol
production,
response
to
follicle-stimulating
hormone,
and
morphological characterisics. Biol. Reprod., 56:608-616.
HATTORI, M-A., SAKAMATO, K., FUJIHARA, N., KOJIMA, I. (1996) Nitric oxide: A
modulator for the epidermal growth factor receptor expression in developing
ovarian granulosa cells. Am J Physiol., 270:C812-C818.
HSUEH, A.J.W., BILLIG, H., TSAFRIRI, A. (1994) Ovarian follicle atresia: A
hormonally controlled apoptotic process. Endocrinology, 5:707-724.
JABLONKA-SHARIFF, A; OLSON, L. M (1997) Hormonal regulation of nitric oxide
synthases and their cell-specific expression during follicular development in the
ovary. Endocrinology, 460-468.
JANBLONKA-SHARIFF, A., OLSON, L.M. (2000) Nitric oxide is essential for
optimal meiotic maturation of murine cumulus-oocyte complexes in vitro. Mol.
Reprod. Dev., 55:412-421.
JOLLY, P.D., TISDALL, D.J., HEATH, D.A., LUN, S., MCNATTY, K.P. (1994)
Apoptosis in bovine granulose cells in relation to steroid synthesis, cyclic
68
adenosine 3’, 5’- monophosphate response to follicle-stimulating hormone and
luteinizing hormone, and follicular atresia. Biol. Reprod., 51:934-944.
KIM, H., MOOM, C., AHN, M., LEE, Y., KIM, H., KIM, S., HA, T., JEE, Y., SHIN, T.
(2005) Expression of nitric oxide syntahse isoforms in the porcine ovary during
follicular development. J. Vet. Sci., 6:97-101.
LAMAS, S. MARSDEN, P. A., LI, G. K; TEMPST, P., MICHEL, T. 1992. Endothelial
nitric oxide synthase: molecular cloning and characterization of a distinct
constitutive enzyme isoform. Proceed. Nat. Acad. Sci. USA. 89:6348-6352.
LEUNG, P. C., STEELE, G. L. (1992). Intracellular signaling in the gonadas.
Endocr Rev., 13:476-498.
LOWENSTEIN, C. J., GLATT, C. S., BREDT, D. S., SNYDER, S. H. (1992) Cloned
and expressed macrophages nitric oxide synthase contrasts with the brain
enzyme. Proceed. Nat. Acad. Sci. USA. 89:6711-6715.
MANSON, H., FRANKS, S. (1997) Local control of steroidogenesis. Clin. Obst.
Gynecol., 11:261-79.
MCKIERNAN, S. H., BAVINSTER, B. D. (1992) Different lots of bovine serum
albumin inhibit or stimulate in vitro development of hamster embryos. In vitro
Cell. Dev. Biol., 28:154-156.
MINEGISHI, T., TANO, M., NAKAMURA, K., KARINO, S., MIYAMOTO, K., IBUKI,
Y (1995) Regulation of follicle-stimulation hormone receptor messenger
ribonluic acid levels in cultured rat granulosa cells. Mol. Cell. Endocrinol.,
108:67-73.
MINGOTI, G. Z., GARCIA, J. M., ROSA -E-SILVA, A., A., M. (2002)
Steroidogenesis in cumulus cells of bovine cumulus-oocyte-complexes
matured in vitro with BSA and different concentrations of steroids. Anim.
Reprod. Sci., 69:175-186.
MOSMANN, T. (1983) Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival:
application to proliferation and cytotoxicity assays. J. Immunol., 65, 55-63.
69
NISHIDA, N., TAKESUE, K., HATTORI, M-A., KATO, Y., WAKABAYASHI, K.,
FUJIHARA, N. (2000) Modulatory action of nitric oxide on the expression of
transcription factor genes, c-fos and c-jun, in developing porcine granulosa
cells in vitro. J. Reprod. Dev., 46:167-175.
ORLY, J., SATO, G., ERICKSON, G. F. (1980) Serum suppresses the expression
of hormonally induced functions in cultured cells. Cell, 20, 817-827.
PICCINATO, C. A., MONTREZOR, L. H., ROSA E SILVA, A. A. M. (2000) Produção
de óxido nítrico: Padronização do modelo de cultura das células da granulosa
de folículos ovarianos bovinos. Anais de Congresso da XV Reunião Anual da
Sociedade de Transferência de Embriões. Caldas Novas Arq. Fac. Vet.
UFRGS, Porto Alegre, v. 28, P. 308 (supl)
QUI, M., PARAMOV, V. M., SMITH, M., STONE, W. L. (2006) Inhibition of
inducible nitric oxide synthase by a mustard gas analog in murine
macrophages. BMC Cell Biol., 7: 39 (epud ahead of print)
QUINTANA, J., HIPKIN, R. W., SANCHEZ-YAGUE, J., ASCOLI, M. (1994)
Follitropin (FSH) and a phorbol Ester stimulate the phosphorylation of the
receptor in intact cells. J. Biol. Chem., 269:8772-8779
RICART-JANÉ, D., LLOBERA, M., LÓPEZ-TEJERO, D. (2002) Anticoagulants and
others preanalytical factors interfer in plasma nitrate/nitrite quantification by
Griess method. Nitric. Oxide, 6:178-185.
ROUILLIER, P., MATTON, P., SIRARD, M. A., GUILBAULT, L. A. (1996) Folliclestimulating hormone-induced estradiol and progesterone production by bovine
antral and mural granulosa cells cultured in vitro in a completely defined
medium. J. Anim. Sci., 74:3012-3019.
ROUILLIER, P., MATTON,P., DUFOUR, M., SIRARD, M. A., GUILBAULT, L. A.
(1998) Steroid production, cell proliferation, and apoptosis in cultured bovine
antral and mural granulosa cells: development of na in vitro model to study
estradiol production. Mol. Reprod. Dev., 50:170-177.
SAS (1996) Statistical Analysis
70
SKINNER, M, K., OSTEEN, K. G. (1988) Developmental and hormonal regulation
of bovine granulose cell function in preovulatory follicle. Endocrinology.
123:1668-1675.
TAKESUE, K., HATTORI, M-A., NISHIDA, N., KATO, Y., FUJIHARA, J. (2001)
Expression of endothelial nitric oxide synthase gene in culture porcine
granulosa cells after FSH stimulation. Mol. Endocrinol., 26:259-265.
TAO, Y., FU, Z., ZHANG, M. J., XIA, G. NO L., YANG, J., XIE, H. R. (2004)
Immunohistochimical localization of inducible and endothelial nitric oxide
synthase in porcine ovaries and effect on antrum formation and oocyte meiotic
maturation. Mol. Cell. Endocrinol., 222:93-103.
TERRANOVA, P.F., RICE, V.M. (1997) Cytokine involvement in ovarian processes.
Am. J. Reprod. Immunol., 37:50-63.
THOMPSON, J. G., SHERMAN, A. N. M., ALLEN, N. W., MCGOWAN, L. T.,
TERVIT, H. R. (1998) Total protein content and protein synthesis with preelogation stage bovine embryos. Mol. Reprod. Dev., 50:139-145.
VAN VOORHIS, B. J., MOORE, K., STRIJBOS, P. J. L, M., NELSON, S., BAYLIS,
S. A., GRZYBICKI, D., WEINER, C. P. 1995 Expression and localization of
inducible and endothelial nitric oxide synthase in rat ovary. J. Clin. Invest.,
96:2719-2726.
WANG, S., LIU, Y., HOLYOAK, G. R., BUNCH, T. D. (1997) The effects of bovine
serum albumin and fetal bovine serum on the development of pre-and post –
cleavage – stage bovine embryons cultured in modified CR2 and M199 media.
An. Reprod. Sci., 48:37-45.
WRENZYCKI, C. (1999) Alterations in the relative abundance of gene transcripts in
preimplantation bovine embryos cultured in medium supplemented with either
serum or PVA. Mol. Reprod. Dev., 53:8-18.
71
4.2. EFEITO DO ÓXIDO NÍTRICO NA VIABILIDADE, PROLIFERAÇÃO E
ESTEROIDOGÊNESE DURANTE O CULTIVO DAS CÉLULAS DA GRANULOSA
ANTRAIS DE FOLÍCULOS PEQUENOS EM MEIO DE CULTURA
QUIMICAMENTE DEFINIDO
RESUMO
O presente experimento objetivou verificar o efeito do óxido nítrico (NO) na viabilidade,
proliferação e esteroidogênese das CGs antrais não diferenciadas em meio de cultivo
quimicamente definido mantenedor da atividade aromatase. As CGs de folículos de 3-5
mm de diâmetro foram cultivadas por 24, 48, 72, 96 e 120h com 0, 10-9, 10-7 e 10-5 M
de SNP (nitroprussiato de sódio), um doador de NO. No final de cada período de tempo
de cultivo, foram avaliadas a viabilidade e ciclo celular pelo método do MTT e
citometria de fluxo, respectivamente, concentração de progesterona (P4) e 17βestradiol (E2) por quimioluminescência e nitrato/nitrito (NO3- / NO2-) pelo método de
Griess. A concentração mais elevada de SNP (10-5M) liberou mais (P<0,05) NO3- / NO2no meio de cultivo (P<0,05), entretanto, todos os tratamentos com SNP foram efetivos
em aumentar a viabilidade celular. Todos os tratamentos com SNP inibiram a síntese
de P4 (P<0,05) ao longo de 120 h de cultivo, enquanto a síntese de síntese de E2 foi
estimulada até as 24 h (P<0,05) e inibida (P<0,05) após 48h de cultivo. A concentração
de E2 apresentou uma correlação negativa com a proliferação celular (P<0,001),
enquanto que a concentração de NO apresentou uma correlação positiva com a
proliferação (P<0,0001) e viabilidade celular (P<0,01). Estes resultados sugerem que o
NO pode estar envolvido na progressão das CGs antrais no ciclo celular e regulação da
esteroidogênese, estando envolvido no processo de diferenciação das CGs antrais de
folículos pequenos em bovinos.
Palavras - chave: óxido nítrico, células da granulosa, bovino, esteroidogênese,
proliferação celular
72
ABSTRACT
The work aimed to verify the effect of nitric oxide (NO) on undifferentiated antral
granulosa cells viability, proliferation and steroidogenesis using chemically defined
culture medium to maintain aromatase activity. The antral GCs of folicles 3-5 mm were
cultured for 24, 48, 72, 96 and 120h with 0, 10-9, 10-7 and 10-5 M SNP (sodium
nitroprusside), a NO donor. In the end of each period of culture, were evaluated cell
viability and proliferation by MTT method and flow cytometry, respectively, progesterone
(P4) and oestradiol 17β (E2) concentration by chemiluminescence and nitrate / nitrite
(NO3-/NO2-) by Greiss method. 10-5M SNP released more (p<0.05) NO in the medium of
culture (p<0.05). All the treatments with SNP increased (p<0.05) cell viability and
proliferation at 120 h and inhibited P4 (p<0.05), while E2 was stimulated at 24 h (p<0.05)
and inhibited (p<0.05) after 48h. E2 was negatively correlated with cell proliferation
(p<0.001), while NO3- / NO2- was positively correlated with cell proliferation (p<0.0001)
and viability (p<0.01). These results suggest that NO can be involved on cellular cycle
progression of antral GCs and steroidogenesis, being involved in the process of antral
granulosa cells differentiation of bovine small follicles.
Key words: nitric oxide, granulosa cells, bovine, steroidogenesis, cell proliferation
INTRODUÇÃO
O óxido nítrico (NO) é um radical livre na forma de gás altamente reativo e
lipossolúvel e seu efeito vem sendo demonstrado em muitas funções celulares,
principalmente na transdução de sinais intra e extracelulares. Assim, a ausência ou
inadequada produção/liberação de NO pode levar a várias condições patológicas (LIU
et al., 1998).
73
A síntese do NO é catalisada pela enzima óxido nítrico sintase (NOS) e
envolve a oxidação da L-arginina, formando L-citrulina e NO (MCDONALD e MURAD,
1996). Existem duas isoformas da enzima óxido nítrico sintase: a constitutiva (cNOS),
encontrada no endotélio vascular (eNOS) e no cérebro (nNOS) (BREDT et al., 1991;
LAMAS et al., 1992) e a induzível (iNOS), presente nos macrófagos (MONCADA et al.,
1991; SESSA, 1994). Mais recentemente, foi identificada a isoforma mitocondrial
(mtNOS) (GIULIVI et al., 1998; GHAFOURIFAR et al., 1999).
As isoformas cNOS sintetizam NO em pequena quantidade por curto período
de tempo requerendo cálcio e calmodulina para sua atividade, enquanto citocinas e
endotoxinas estimulam a iNOS a sintetizar NO em grande quantidade e por longo
período de tempo (HEVEL et al.,1992).
O NO também é sintetizado pelo ovário e vem sendo demonstrado como um
importante modulador da fisiologia reprodutiva, incluindo: esteroidogênese (VAN
VOORHIS et al., 1994; BASINI et al., 1998), apoptose das células da granulosa (CHUN
et al., 1995; PONDERATO et al. 2000), ovulação (HEFLER et al., 2002), maturação
oocitária (JABLONKA–SHERIFF, 2000; MATTA et al., 2001, MATTA et al., 2002; TAO
et al., 2005; VIANA et al., 2005) e desenvolvimento embrionário (NISHIKIMI et al.,
2001; ORSI et al., 2006)
Estudos vêm demonstrando que o sistema NO/NOS está localizado nas CGs e
que o NO inibe a esteroidogênese (BASINI et al., 1998, BASINI et al., 2000a, BASINI et
al., 2000b) por inibição da P450 aromatase nas células da granulosa de ratas (VAN
VOORHIS et al., 1995).
Em bovinos, estudos sobre o efeito do NO nas CGs oriundas de folículos
pequenos (<5mm) e grandes (>8mm) foram, inicialmente, realizados em sistemas de
cultura contendo soro fetal bovino (SFB) (BASINI et al., 1998), que induz a luteinização
das CGs (GUTIERREZ et al., 1997). Posteriormente, BASINI et al. (2000a), para
avaliar a via utilizada para o NO exercer seus efeitos inibitórios sobre a síntese de E2,
substituiram o SFB pelo BSA, confirmando seus achados iniciais.
O BSA, comumente utilizado nos sistemas de cultivo, é contaminado com
várias moléculas definidas e não definidas, assim como colesterol, peptídeos,
74
hormônios esteróides e outros (WANG et al., 1997; MINGOTI et al., 2002). PICCINATO
et al. (2000) substituíram BSA 0,1% por álcool polivinílico 0,1% (PVA) e observaram
que as CGs mantiveram as mesmas características esteroidogênicas, quando
cultivadas com BSA. Assim, o presente estudo utilizou o modelo de cultivo
quimicamente definido por PICCINATO et al. (2000) com algumas modificações, para
investigar o papel do NO na viabilidade, proliferação celular (fase S+G2/M do ciclo
celular) e esteroidogênese das CGs de folículos de 3-5 mm de bovinos.
MATERIAL E MÉTODOS
Reagentes
A maioria dos reagentes, exceto aqueles especificados, foram obtidos da
Sigma (Sta Louis, MO, EUA).
Obtenção das células da granulosa
Ovários de vacas cíclicas foram obtidos em abatedouros locais e transportados
imediatamente em solução salina estéril (NaCl 0,9%) acrescida de antibióticos [(100
IU/ml de penicilamina e 100 µg/ml de sulfato de estreptomicina (Merck, Rio de JaneiroBRL)] e transportados para o laboratório, onde tiveram os restos de tecidos eliminados.
Os ovários foram lavados com solução salina acrescida de antibióticos e enxaguados
brevemente com etanol 70% e, posteriormente, lavados (3 vezes) com solução salina
acrescida de antibióticos.
Os folículos pequenos (3 - 5 mm) apresentando 70 % da sua superfície exposta
clara e vascularizados (GRIMES et al., 1987) foram puncionados e as CGs antrais
aspiradas (ROUILLER et al., 1998) e depositadas em tubos de polietilenoglicol de 15 ml
contendo 2 ml de meio base[(Meio Dulbeccos Eagles modificado – Ham´s F12 com
Hepes 15 mM; (Gibco, São Paulo-BRL), adicionado de bicarbonato de sódio 10 mM, ;
75
100 UI/ml penicilina G, e sulfato de 100ug/ml estreptomicina)] e acrescido de heparina
50UI para evitar a formação de grumos.
A suspensão de CGs foi filtrada em uma malha para retirar os oócitos e debris
celulares. Em seguida, o filtrado foi centrifugado (300 x g/ 10 min) à temperatura
ambiente, o sobrenadante descartado e as células lavadas (2 vezes) com 1 ml de meio
base. Tendo em vista que as hemácias se ligam ao NO (MCMAHON, 2002) e que os
macrófagos podem sintetizar NO, e que ao puncionar as CGs, estas vêm com células
sanguíneas devido à ruptura de pequenos vasos sanguíneos, foram realizados dois
procedimentos com o objetivo de remover estas células. Para retirada das hemácias, o
precipitado de CGs foi tratado com 300 µl de uma solução de cloreto de amônio 0,9%
pré-aquecida (37º C) e incubado por 1 minuto. Em seguida, foi adicionado meio base
ao tubo com as CGs até completar o volume de 12 ml, restaurando, assim, a
isotonicidade das CGs. As CGs foram centrifugadas (300 x g/ 10 min) e o precipitado
lavado com meio base. O precipitado de CGs foi ressuspendido em 1 ml de meio base
e semeado em discos de cultura de 32 mm de diâmetro contendo 2 ml do mesmo meio.
As CGs foram incubadas por 2 h a 37,5oC em ambiente com atmosfera contendo 5%
de CO2 para retirada dos macrófagos, uma vez que estes aderem facilmente ao fundo
da placa de cultivo (BECKMANN et al., 1991).
As CGs não aderidas foram coletadas da placa de cultura, centrifugadas (300 x
g/ 10 min) e ressuspendidas em 2 ml de meio de cultivo [Meio Dulbeccos Eagles
modificado - Hams F12 contendo Hepes 15mM, adicionado de bicarbonato de sódio 10
mM, penicilina G 100U/ml, e sulfato de estreptomicina 100µg/ml; androstenediona, 10-7
M; PVA 0,1%; 1% de MEM aminoácidos não essenciais 100 % e 1% de solução ITS 100
% (selenito de sódio -1,4 ng/ml; transferrina - 5,0 µg /ml; insulina-10ng/ml)].
A viabilidade e o número de células foram estimados utilizando-se o
microscópio invertido (400 x, Telaval 31, Zeiss), hemocitômetro e o método de exclusão
com azul de trypan 0,4%. A viabilidade celular média foi de 67,4 %.
Foram realizados esfregaços da suspensão celular antes e após o tratamento
para retirada de hemácias e macrófagos. Após terem sido corados com hematoxilina,
foram contadas 100 células com 10 repetições (1000 células totais). Para cada 100
76
células contadas antes do tratamento para retirada de hemácias e macrófagos foram
encontradas, em média, 39,8 ± 7,7% de hemácias e 8,5 ±3 % de macrófagos. Após o
tratamento foram encontrados 9 ± 4 % de hemácias e 0,4 ± 0,5 % de macrófagos.
Delineamento experimental
As CGs foram cultivadas com 0 (controle), 10-9, 10-7 e 10-5 M de SNP, em
meio de cultura quimicamente definido, por 24, 48, 72, 96 e 120 h. No final de cada
período, foi avaliado a concentração de (NO3-/NO2-) e o efeito dose resposta do SNP
sobre a viabilidade, proliferação celular e síntese de progesterona (P4) e 17βestradiol (E2)
Cultura das CGs
Foram adicionadas 5,0 x 105 CGs antrais de folículos de 3-5mm em placas de
24 poços e o volume completado para 1000 µl de meio de cultura contendo os
tratamentos com SNP. Em seguida, as CGs foram incubadas a 37,5oC em ambiente
com atmosfera contendo 5% de CO2. A cada 24 h de cultivo, 70% do meio foi
substituído por meio fresco contendo os tratamentos.
Determinação da viabilidade celular
O efeito do NO na viabilidade celular foi verificado no final de cada período de
cultura por meio do método MTT. Este ensaio é baseado na habilidade das células
vivas com mitocôndrias ativas reduzirem o sal brometo de difeniltetrazolium 3-[4,5dimetiltrazol-2yl]-2,5 - ao produto final azul de formazan (metiltriazole). (MOSMANN,
1993). No final do cultivo, 700µl de meio de cultivo foram retirados para realizar as
dosagens necessárias, restando apenas 300 µl de meio. Assim, 30 µl de MTT
(5mg/ml) foram adicionados em cada poço e, em seguida, as CGs foram incubadas
por 3 h a 37º C. Posteriormente, foram adicionados 300 µl de isopropanol acidificado
77
com HCl (0,04 N) contendo 10 % de Triton X 100 para solubilizar os cristais formados
por 14-16 h em temperatura ambiente. Após este período, 200 µl da mistura de cor
azul foram transferidos para placas de 96 poços. A leitura foi realizada em um
espectrofotômetro (Multiskan EX Primary EIA V 2.1-0) com comprimento de onda de
570 nm, com subtração do background (620 nm). A relação entre a absorbância e o
número de células foi determinada pela incubação prévia de quantidades conhecidas
de células com MTT, criando assim, uma curva padrão. A relação entre a absorbância
e número de células foi linear (R2=0,99; P<0,05).
Proliferação celular
Para determinar o efeito do NO na proliferação das CGs antrais (fase S +
G2/M do ciclo celular), foi realizada citometria de fluxo (BLONDIN et al., 1996). As CGs
foram coletadas após a incubação com 1 ml de PBS Ca++ Mg++ e EDTA (125 mg/l) por
10 min e centrifugadas a 400 g a 4 ºC por 5 min. O sobrenadante foi removido e o
precipitado foi ressuspendido em 500µl de PBS Ca++ Mg++. As CGs foram fixadas por,
no mínimo, 1 h a 4ºC com 1 ml de etanol absoluto gota a gota durante agitação em
vortex. Posteriormente, as CGs foram centrifugadas e o precipitado ressuspendido
com 500µl de etanol 70% e estocadas a -20 ºC até o dia da análise por citometria de
fluxo. Antes das análises, as CGs foram centrifugadas e o sobrenadante descartado. O
precipitado foi lavado duas vezes com PBS (400 g a 4 ºC por 5 min). As CGs foram
ressuspendidas com 1ml de PBS contendo 50 µg/ml de ribonuclease (RNAse, Merck
Rio de Janeiro-BRL) e incubadas por 30 min a 37 oC. Posteriormente, as CGs foram
centrifugadas a 400 g a 4 ºC por 5 min e o precipitado ressuspendido com PBS
acrescido de iodeto de propídio (50 µg/ml) e incubadas por 30 min a 0o C. As amostras
foram filtradas em filtro de 40µm e lidas no comprimento de 540nm (Analisador
PARTEC PA). Os dados foram derivados de histogramas do DNA analisados pela
citometria de fluxo. A percentagem de células em estádio G0/G1 (diplóides), S (síntese
de DNA) e G2/M (tetraplóide) do ciclo celular e percentagens de células contendo
níveis sub-diplóides de DNA (DNA fragmentado) foram calculados utilizando-se um
software DPAC.
78
Dosagens hormonais
No final de cada período de tempo, o meio de cultura foi coletado e
armazenado a -20oC para dosagem de E2 e P4 pelo sistema automatizado de
quimioluminescência ACS:180®. O teste é um imunoensaio competitivo que usa
tecnologia quimioluminescente direta. O anticorpo anti-P4 e anti-E2 monoclonal é
marcado com éster de acridina. A curva de P4 variou de 0,86 a 29,80 ng/ml e a de E2
de 88 a 785 pg/ml. As amostras foram utilizadas sem diluir e com diluição de 1/400 em
meio de cultivo e o hormônio mensurado. A média do coeficiente de variação foi de 3
% e 1,6 % para 17β-estradiol e progesterona, respectivamente.
Dosagem de nitrito/nitrato (NO3- / NO2-)
A concentração de NO3- / NO2- foi mensurada utilizando-se o método
colorimétrico de Griess (RICART-JANÉ et al., 2002). O reagente de Griess é composto
de uma mistura de sulfanilamida 2% e N-(1-naphthyl) ethylene-diamine 0,2% em água
Milii Q. A primeira reação na amostra ocorre com o nitrito para formar o sal diazonium
que reage com o segundo reagente para formar a cor púrpura com um pico de
absorbância a 540 nm. Para reduzir o nitrato a nitrito, as amostras (40 µl) foram
incubadas com 40 µl de uma mistura contendo 1000 µl da enzima nitrato redutase
oriunda de bactéria [100 µl da enzima (10 UI diluída em 500 µl de água Milli Q) diluída
em 900 µl de água Milli Q], 1000 µl do cofator NADPH (5mg/ml diluído em água Milli Q)
e 1000 µl de tampão fosfato de potássio (0,5 M). As amostras foram incubadas a 37 oC
por 14-16 horas. Posteriormente, 80 µl do reagente de Griess foram adicionados às
amostras.
O método foi desempenhado em placa de 96 poços. Todas as soluções foram
protegidas da luz. Uma curva padrão de nitrito de sódio diluída em DMEM/Ham`s-F12
contendo valores conhecidos de nitrito foi realizada, onde o valor mínimo de nitrito foi
de 0,5 µM e o máximo de 100µM. Com os valores da absorbância foi montado um
gráfico de dispersão. A relação entre a absorbância e concentração de nitrato/nitrito foi
linear (R2=0,98; P<0,05).
79
Análise estatística
Os resultados foram obtidos de dois experimentos independentes e cada
tratamento constou de duas repetições, totalizando 4 repetições por tratamento. Uma
análise de regressão polinomial foi utilizada para verificar as variáveis: viabilidade
celular, proliferação celular e concentração de E2, P4, NO3-/NO2- ao longo do tempo de
cultivo, com respectivo teste de significância de 5% e coeficiente de determinação (R2).
Foi realizada uma ANOVA e aplicado o teste de Tukey (P<0,05) para comparação das
médias. Além disso, a correlação de Pearson (P<0,05) foi utilizada para verificar
correlação entre as variáveis P4, E2, NO-3/NO2-, viabilidade celular e proliferação
celular. O programa utilizado foi SAS (Statistical Analysis System). Os dados são
representados como médias ± desvio padrão.
RESULTADOS
Características morfológicas das CGs
Em todos os tratamentos, as CGs mantiveram as mesmas características
morfológicas descritas por GUTIERREZ et al. (1997). Encontraram-se arredondadas e
organizadas em grupos celulares, que aumentaram de tamanho ao longo do tempo,
formando grupos maiores e ancorados ao fundo da placa de cultura por células de
aparência semelhante a um fibroblasto. No final de 120 h de cultura, as CGs cultivadas
com SNP apresentavam-se com sua superfície mais brilhante em relação às CGs
cultivadas sem SNP (controle) (Figura 1).
Efeito do SNP na concentração de NO3-/NO2- no meio de cultivo
A concentração de NO3-/NO2- ficou estável em todos os tratamentos com ou
sem SNP ao longo do tempo. O tratamento com 10-5 M de SNP manteve a
80
concentração de NO3-/NO2- mais elevada no meio de cultivo em todos os períodos de
cultivo quando comparada ao controle e às demais concentrações de SNP (Tabela 1).
Efeito do SNP na viabilidade celular
A viabilidade celular aumentou ao longo do tempo de cultivo (Tabela 2) tanto
para CGs cultivadas com SNP (10-9, 10-7, 10-5M; R2= 0,95, R2 = 0,91, R2 = 0,85,
respectivamente, P<0,0001) ou sem SNP (controle) (R2= 0,66, P<0,001), entretanto
todos os tratamentos com SNP (10-9, 10-7, 10-5M) no final de 72h (7,7 x 105 ± 0,16; 7,3 x
105 ± 0,21; 8,0 x 105 ± 0,33 células, respectivamente) e 120 h (8,6 x 105 ± 0,25; 8,9 x
105 ± 0,12; 8,9 x 105 ± 0,13 células, respectivamente) de cultivo aumentaram a
viabilidade celular comparado ao controle (6,5 x 105 ± 0,3; 7,2 x 105 ± 0,58 células,
respectivamente) (Tabela 2).
Efeito do SNP na proliferação celular
A maioria das CGs encontraram-se na fase G1 do ciclo celular ao longo do
tempo de cultivo. Todos os tratamentos com SNP (10-9, 10-7, 10-5 M) aumentaram a %
de CGs na fase S + G2/M ao longo do cultivo (R2=0,56; 0,39; 0,40; respectivamente,
P<0,05), enquanto que o tratamento sem SNP (controle) manteve o aumento da % de
CGs na fase S+G2/M até 72h (R2 =0,55, P<0,05) (Tabela 3). Após 96 h de cultivo,
todos os tratamentos com SNP (10-9; 10-7; 10-5 M) (39,2 ±2 %; 24,5 ±3,5 %; 24,3 ±
0,4%) foram mais eficazes (P<0,05) em manter as CGs na fase S+G2/M do ciclo
celular em relação ao controle (13,0 ± 0,4%) (Tabela 3)
81
Efeito do SNP na esteroidogênese
Síntese de P4
A síntese de P4 pelas CGs cultivadas sem SNP (controle) aumentou até 96 h
de cultura e obteve uma diminuição no final de 120 h (R2=0,89, P<0,001). Durante o
tratamento com SNP (10-9, 10-7e 10-5 M) ocorreu um aumento da síntese de P4 no final
de 48h (R2=0,61, P<005; R2=0,70, P<0,0005; R2=0,57, P<0,005, respectivamente) e
depois esta síntese foi mantida sem alterações (P<0,05) ao longo do cultivo (Tabela 4)
O SNP (10-9, 10-7e 10-5 M) manteve a síntese de P4 até 96h de cultivo (239,92
± 17 ng/ml; 260,03 ± 1,7 ng/ml; 360,34 ± 81 ng/ml, respectivamente) menor (P<0,05)
do que o controle (673,29 ± 6,5ng/ml). No final de 120 h de cultura não houve
diferença (P>0,05) na síntese de P4 pelas CGs cultivadas com SNP (10-9, 10-7 e 10-5 M;
270,14 ± 36 ng/ml; 300,61 ± 45 ng/ml; 388,35 ± 81 ng/ml, respectivamente) e controle
(380,35 ± 89 ng/ml) (Tabela 4).
Síntese de E2
A síntese de E2 (Tabela 5) pelas CGs cultivadas sem SNP (controle) (R2=0,96,
P<0,0001) ou com SNP em todas as concentrações (10-9, 10-7 e 10-5 M) aumentou ao
longo do tempo (R2=0,60, P<0,005; R2= 0,72, P<0,0005, R2=0,83, P<0,0001,
respectivamente).
No final de 24h, a síntese de E2 pelas CGs foi maior quando as CGs foram
cultivadas com SNP em todas as concentrações (10-9, 10-7, 10-5M; 6,31 ±1,0 ng/ml;
7,19 ±1,0 ng/ml; 7,01±0,5 ng/ml, respectivamente) comparada ao controle (2,01 ±0,3
ng/ml). Com 48 h de cultura não houve diferença (P>0,05) na síntese de E2. pelas CGs
cultivadas com SNP (10-9, 10-7, 10-5M; 9,64 ± 0,8 ng/ml, 9,17 ± 1,0ng/ml, 10,34 ± 0,8
ng/ml, respectivamente) e sem SNP (8,60 ± 0,9 ng/ml). A partir de 72 h de cultivo,
todas as concentrações de SNP (10-9, 10-7, 10-5M) inibiram a síntese de E2 (11,55 ± 0,9
82
ng/ml, 11,2 ± 1,9 ng/ml, 12,10 ±1,2 ng/ml, respectivamente) comparada ao controle
(24,49 ±2,2 ng/ml), que foi mantida até o final do cultivo (Tabela 5).
Relação entre a síntese de E2, P4, NO3- / NO2- viabilidade e proliferação celular
A síntese de P4 foi correlacionada positivamente com a síntese de E2 (0,79;
P<0,0001) e não apresentou correlação (P>0,05) com a concentração de NO3-/NO2-,
viabilidade e proliferação celular. A concentração de E2 apresentou correlação
negativamente (-0,35, P<0,001) com a proliferação celular, não sendo verificada
correlação significativa (P>0,05) com a concentração de NO3- / NO2- e viabilidade
celular. A concentração de NO3- / NO2- foi correlacionada positivamente com a
viabilidade (0,26; P<0,01) e proliferação celular (0,52; P<0,0001). A viabilidade celular
foi correlacionada positivamente com a proliferação celular (0,36; P<0,0001).
83
Tabela 1: Concentrações médias de NO3- / NO2- (µM) no meio de cultivo com o uso do
SNP nas concentrações 10-9, 10-7e 10-5 M durante diferentes períodos de
incubação.
[ SNP] (M)
24 h
48 h
72 h
96 h
120 h
0 (controle)
1,8 ± 0,6a A
2,4 ± 1,0 a A
2,7 ± 0,6 a A
2,2 ± 0,7 a A
1,8 ± 0,4 ª A
10-9
1,6 ± 0,9 a A
1,7 ± 1,7 a A
2,2 ± 0,4 a A
2,0 ± 0,6 a A
1,5 ± 0,7 ª A
10-7
1,9 ± 0,5 a A
3,4 ± 1,4 a A
2,7 ± 0,4 a A
2,8 ± 0,6 a A
1,9± 0,5 ª A
10-5
6,7 ± 0,6 a B
6,3 ± 0,4 a B
4,9 ± 0,2 a B
4,8 ± 0,5 a B
4,6 ± 0,3 a B
a
Médias acompanhadas por letras diferentes na mesma linha são estatisticamente
diferentes (P<0,05) pelo teste de Tukey.
AB
Médias acompanhadas por letras diferentes na mesma coluna são estatisticamente
diferentes (P<0,05) pelo teste de Tukey
Dados são representativos de dois experimentos independentes com duas repetições
por tratamento.
84
Tabela 2: Efeito do SNP nas concentrações 0 (controle), 10-9, 10-7e 10-5 M na
viabilidade das CGs antrais de folículos de 3-5 mm de diâmetro (no de
células x 105), mensurada pela habilidade das CGs reduzirem o MTT.
[ SNP] (M)
24h
48h
72h
96h
120h
0 (controle)
6,2 ± 0,7 a A
8,0 ± 0,7 b A
6,5 ± 0,3 a A
6,4 ± 0,8 a AB
7,2 ± 0,6 ab A
10-9
6,1 ± 0,5 a A
6,0 ± 0,2 a B
7,7 ± 0,2 b B
6,3 ± 0,2 a B
8,6 ± 0,3 b B
10-7
6,6 ± 0,4 ab A
6,3 ± 0,3 a B
7,3 ± 0,2 b AB
6,9 ± 0,2 ab AC
8,9 ± 0,1 c B
10-5
7,1 ± 0,5 a A
8,1 ± 0,1 b A
8,0 ± 0,3 b B
7,3 ± 0,2 a C
8,9 ± 0,1 c B
abc
Médias acompanhadas por letras diferentes na mesma linha são estatisticamente
diferentes (P<0,05) pelo teste de Tukey.
ABC
Médias
acompanhadas
por
letras
diferentes
na
mesma
coluna
são
estatisticamente diferentes (P<0,05) pelo teste de Tukey.
Dados são representativos de dois experimentos independentes com duas repetições
por tratamento.
85
Controle
SNP 10-5 M
24 h
48 h
72 h
96 h
120 h
Figura 1: Características morfológicas das CGs antrais de folículos de 3-5 mm de
diâmetro cultivadas com 0 (controle) e 10-5M de SNP no final de 24, 48, 72,
98 e 120h. (400x).
86
Tabela 3: Efeito do SNP nas concentrações 0 (controle), 10-9, 10-7e 10-5 M na
proliferação das CGs antrais de folículos de 3 – 5 de diâmetro (% de CGs
na fase S+G2/M).
[ SNP] (M)
24h
48h
72h
96h
120h
0 (controle)
19,0 ±1,4 a A
27,0 ±3,0 b A
24,0 ±2,1 b A
12,0 ±1,9 a A
13,0 ±0,4 a A
10-9
25,4 ±0,6 a B
38,4 ±0,7 b B
35,0 ±0,2 b B
36,0±2,0 b B
39,2 ±2,0 b B
10-7
27,9 ±2,9 a B
31,0 ±1,4 ab A
35,0 ±3,0 b B
22,7 ±0,5 c C
24,5 ±3,5 ac C
10-5
20,01±1,4 a A
31,5 ±4,0 b A
26,5 ±2,1 bc A
25,4±1,9 c C
24,4 ±0,4 c C
abc
Médias na mesma linha acompanhadas por letras diferentes são estatisticamente
diferentes (P<0,05) pelo teste de Tukey.
ABC
Médias
na
mesma
coluna
acompanhadas
por
letras
diferentes
são
estatisticamente diferentes (P<0,05) pelo teste de Tukey.
Dados são representativos de dois experimentos independentes com duas repetições
por tratamento.
87
Tabela 4. Efeito do SNP nas concentrações 10-9, 10-7e 10-5 M na síntese de
progesterona (ng/ml) pelas CGs antrais de folículos de 3- 5 mm de
diâmetro no final de diferentes períodos de incubação.
[ SNP] (M)
0 (controle)
-9
10
72 h
96 h
529,96 ±109
aA
316,34 ±60
ab A
123,25 ±15
aB
243,58 ±40
bB
257,62 ±91
a AB
231,16 ±47
bB
246,52 ±25
aB
268,26 ±84
ab B
349,33 ±150
161,83 ±25
-5
129,12 ±6
10
48 h
174,77 ±22
-7
10
abcd
24 h
cd
120 h
673,29 ±6,5
dA
bB
239,92 ±17
bB
270,14 ±36
bA
bB
260,03 ±1,7
bB
300,61 ±45
bA
360,34 ±81
bC
388,35 ±81
bA
A
bC
380,35 ±89
bc A
Médias acompanhadas por letras diferentes na mesma linha são estatisticamente
diferentes (P<0,05) pelo teste de Tukey.
ABC
Médias
acompanhadas
por
letras
diferentes
na
mesma
coluna
são
estatisticamente diferentes (P<0,05) pelo teste de Tukey.
Dados são representativos de dois experimentos independentes com duas repetições
por tratamento.
88
Tabela 5. Efeito do SNP nas concentrações 10-9, 10-7e 10-5 M na síntese de 17-β
estradiol (ng/ml) pelas CGs antrais de folículos de 3 - 5 mm diâmetro no final
de diferentes períodos de incubação.
[ SNP] (M)
24 h
48h
72h
96h
120h
0 (controle)
2,01 ±0,3 a A
8,60 ±0,9 b A
24,49 ±2,2 c A 26,46 ±3,7 cA
10-9
6,31 ±1,0 a B
9,64 ±0,8 ab A
11,55 ±0,9 b B 10,70 ±0,3 b B 9,50 ±3,3 ab B
10-7
7,19 ±1,0 a B
9,17 ±1,0 ab A
11,20 ±1,9 b B 11,44 ±0,5 b B 10,73 ±0,1 b B
10-5
7,01 ±0,5 aB
10,34 ±0,8 b A 12,10 ±1,2 b B 11,82 ±1,2 b B 10,90 ±0,8 b B
abc
23,85 ±2,1 c A
Médias acompanhadas por letras diferentes na mesma linha são estatisticamente
diferentes (P<0,05) pelo teste de Tukey.
AB
Médias acompanhadas por letras diferentes na mesma coluna são estatisticamente
diferentes (P<0,05) pelo teste de Tukey.
Dados são representativos de dois experimentos independentes com duas repetições
por tratamento.
DISCUSSÃO
O presente experimento demonstrou que, embora a concentração de NO3/NO2- no meio de cultivo tenha sido maior ao se utilizar 10-5 M de SNP em relação ao
tratamento 10-9 e 10-7 M de SNP e controle, todos os tratamentos com SNP melhoram a
viabilidade e aumentaram a proliferação celular, que, por sua vez, foram
correlacionadas entre si, sugerindo que o aumento da fase proliferativa contribuiu para
o aumento da viabilidade celular no final do cultivo.
89
Recentemente, foi demonstrado em CGs de ratas (LI et al., 2005) que a via
NO-GMPc estimula a expressão de um fator de transcrição (Fox01) que regula genes
implicados na progressão do ciclo celular (MEDEMA et al., 2000), sobrevivência das
células e apoptose (BRUNET et al., 1999), proteção contra estresse oxidativo
(FURUKAWA-HIBI et al., 2002) e diferenciação (NAKAE et al., 2003). Em suínos, as
CGs, quando cultivadas com 10-5 e 10-4 M de SNAP (S-Nitroso-N-acetil penicilamina,),
doador de NO, apresentaram um aumento da atividade proliferativa verificado por
incorporação de timidina de forma semelhante às células cultivadas sem o doador
(GRASSELLI et al., 2001). Os resultados do presente experimento demonstraram que
o NO nas concentrações utilizadas foi correlacionado positivamente com a proliferação
celular, sugerindo que o NO pode regular a progressão das CGs antrais de folículos de
3-5mm no ciclo celular estando envolvido na diferenciação e sobrevivência das CGs.
Assim, estudos futuros se fazem necessários para verificar qual ou quais os
mecanismos utilizados pelo NO para regular o ciclo celular em CGs de bovinos.
Um outro mecanismo que o NO também pode utilizar para aumentar a
viabilidade celular é via formação de antioxidantes. O NO participa na formação da
glutationa,
um
tripeptídeo
que
é
considerado
o
maior
antioxidante
celular
(MOELLERING et al., 1998). A glutationa participa da detoxicação de espécies de
nitrogênio e oxigênio reativos oriundas do metabolismo do oxigênio, que provoca
inevitável formação de peróxidos orgânicos (peroxinitrito e H2O2), peróxidos lipídicos e
seus produtos de decomposição, como os aldeídos (MOELLERING et al., 1998).
Durante a esteroidogênese ocorre a formação de radicais livres e, portanto, as células
ficam expostas aos danos oxidativos. Estes dados sugerem que o NO pode, também,
ter funcionado como um antioxidante, exercendo um efeito citoprotetor, contribuindo,
também, para a viabilidade celular.
O papel inibitório do NO na esteroidogênese ovariana já é bem documentado
em alguns trabalhos com cultura de CGs de bovinos (BASINI et al., 1998; 2000a).
Apesar dos resultados do presente estudo apresentarem algumas semelhanças com
os resultados dos estudos relacionados acima, existem algumas diferenças que
merecem atenção. Assim, ao contrário dos estudos que utilizaram doadores de NO em
cultura de CGs de bovinos (BASINI et al., 1998; BASINI et al., 2000), nos quais foi
90
verificado um efeito inibidor do NO tanto na síntese de P4 e E2, os resultados do
presente experimento, apesar de também terem demonstrado uma inibição da síntese
de P4 pelo NO, não mostrou o mesmo com a síntese de E2, que foi estimulada nas
primeiras 24h de cultivo e somente após 48 h de cultivo ocorreu sua inibição.
O aumento inicial de E2, no presente experimento, não foi uma conseqüência
do aumento da viabilidade celular, pois não houve correlação significativa entre síntese
de E2 e viabilidade das CGs cultivadas com ou sem SNP, como foi verificada entre
concentração de (NO3-/NO2-) com proliferação e viabilidade celular. Assim, o possível
mecanismo utilizado pelo NO para aumentar a síntese de E2 merece ser investigado.
Apesar de estes achados contrariarem os resultados de BASINI et al. (1998) em cultura
de CGs em bovinos, existem relatos na literatura que correlacionam o aumento da
concentração de nitrito, metabólito do NO, com o volume folicular e concentração de
E2, mas não com a concentração de P4 no fluido folicular de mulheres durante a fase
folicular (ANTEBY et al., 1996). Além disso, BONELLO et al., 1996, objetivando avaliar
a regulação do NO na taxa de ovulação em ratas, demonstraram por meio da perfusão
ovariana com o inibidor da enzima NOS (L-NAME, ester metil l-arginina -nitro-n-omega)
uma diminuição da síntese de E2, sugerindo que o NO pode regular positivamente a
síntese de E2 e ovulação. Assim, estes dados sugerem que o NO pode, em um dado
momento durante o desenvolvimento folicular, regular positivamente a síntese de E2 e,
posteriormente exercer um efeito inibitório.
Deve ser ressaltado que o sistema de cultivo quimicamente definido utilizado
neste experimento foi livre de soro fetal, BSA, hemácias e macrófagos, qu,e
comprovadamente interferem na esteroidogênese das CGs (BECKMANN et al., 1991;
PICCINATO et al., 2000; MCMAHON et al., 2002). Assim, as diferenças de alguns
resultados encontradas no presente estudo quando comparados com outros relatos na
literatura (BASINI et al., 1998; BASINI et al., 2000a) podem ser devido ao modelo de
cultura utilizado no presente experimento.
Os resultados do presente estudo demonstraram que as CGs em seu estado
proliferativo é apresenta uma relação inversa com a síntese de E2, verificada pela sua
diminuição após 48 h de cultivo. O aumento da fase proliferativa induzido pelo NO
91
diminuiu o número de células da granulosa com capacidade de síntese (células
diplóides) e, conseqüentemente reduziu a esteroidogênese. Baseado nos achados de
ORLY et al. (1980), que demonstraram que o aumento da fase proliferativa é
inversamente correlacionado com a síntese de P4 estimulada pelo FSH em meio de
cultivo contendo soro fetal bovino. Os resultados do presente estudo sugerem que o
controle do ciclo celular pelo NO pode ser um mecanismo adicional para o NO controlar
a esteroidogênese.
As controvérsias com relação aos efeitos do NO vêm sendo relacionadas com
a sua via de ação. CHUN et al. (1995) demonstraram que uma das vias utilizadas pelo
NO para inibir a apoptose de células da granulosa de ratas é a via GMPc, que também
vem sendo uma das vias preconizadas por ISHIMARU et al. (2001), como inibidora da
esteroidogênese pelo NO. Em bovinos, BASINI et al. (2000a) demonstraram que a via
NO/GMPc e intermediários da peroxidação lipídica (hidroperóxidos lipídicos) não estão
envolvidos na inibição da esteroidogênese das CGs. Outros estudos (STAMLER et al.,
1994; HANKE et al., 1998) indicaram que o NO pode ligar-se à enzima contendo o
grupo heme e, assim, inibir sua atividade. Desta forma o NO pode ligar-se à enzima
P450scc (clivagem da cadeia lateral do colesterol) e a enzima aromatase e/ou à
guanilato ciclase e regular a síntese de estradiol. Assim, este radical livre pode exercer
seus efeitos de várias formas e em função das circunstâncias, sensibilidade e tipo
celular.
As CGs de folículos de 3- 5 mm possuem uma atividade proliferativa maior do
que aquelas obtidas de folículos pré-ovulatórios e, por não serem diferenciadas, a sua
capacidade de síntese de esteróides aumenta com o período de cultivo (GUTIERREZ
et al., 1997). Além disso, a concentração de nitrito e nitrato no fluido folicular de
folículos < 5 mm é maior comparada a folículos maiores (BASINI et al., 1998; FAES et
al., 2000).
92
CONCLUSÕES
Os resultados do presente estudo permitem concluir que o NO nas
concentrações estudadas pode regular a progressão das CGs no ciclo celular,
podendo, também, regular a síntese de P4 e E2, e, portanto, está envolvido no processo
de diferenciação das CGs. Provavelmente em condições de exposição crônica ao NO,
esta redução do E2 poderá levar a célula a um estado deletério. Portanto, este pode ser
um mecanismo regulador da maturação e/ou atresia folicular em bovinos.
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
ANTEBY, E. Y., HURWITZ, A., KORACH, O., REVEL, A., SIMON, A., FINCIYEHESKEL, Z., MAYER, M., LAUFER, N. (1996) Human follicular nitric oxide
pathway: relationship to follicular size, oestradiol concentrations and ovarian blood
flow. Hum Reprod., 11: 1947-1951.
BASINI, G., BARATTA, M., PONDERATO, N., BUSSOLATI, S., TAMANINI, C., (1998).
Is nitric oxide an autocrine modulator of bovine granulosa cell function? J. Reprod.
Fertil., 10:471-478.
BASINI, G., GRASSELLI, F., PONDERATO, N., BUSSOLATI, S., TAMANINI, C. (2000a)
Lipid hydroperoxide and cGMP are not involved in nitric oxide inhibition of
steroidogenesis in bovine granulosa cells. Reprod. Fertil., 12, 289-295.
BASINI, G., TAMANINI, C. (2000b) Selenium stimulates estradiol
production in bovine granulose cells: possible involvement of nitric
oxide. Domest. Anim. Endocrinol., 18, 1-17.
93
BECKMANN, M., POLACEK, D., SEUNG, L., SCHREIBER, J. (1991) Human ovarian
granulosa cell culture: determination of blood cell contamination and evaluation of
possible culture purification steps. Fertile Steril., 56:881-887.
BLONDIN, P., DUFOUR, M., SIRARD, M. (1996) Analysis of atresia in bovine follicles
using different methods: Flow cytometry, enzyme-linked immunosorbent assay, and
classic histology. Biol. Reprod., 54:631-637.
BONELLO, N., MCKIE, K., JASPER, M., ANDREW, L., ROSS, N., BRAYBON, E.,
BRÄNNSTROM, M., NORMAN, R. J. (1996) Inhibition of nitric oxide: Effects on
interleukin-1β-enhanced ovulation rate, steroid hormones, and ovarian leukocyte
distribution at ovulation in rat. Biol. Reprod., 54:436-445.
BREDT, D. S. HWANG, P. M., GLATT, C. E., LOWENSTEIN, C., REED, R. R.,
SNYDER, S. H. (1991) Cloned and expressed nitric oxide sinthase structurally
resembles cytochome P450 reductase. Nature, 351:714-718.
BRUNET, D. S., BONNI, A., ZIGMOND, M. J., LIN, M. Z., JUO, P., HU, L. S.
ANDERSON, M. J., ARDE, K. C., BLENIS, J., GREENBERG, M. E. (1999) Akt
promotes cell survival by phosphorylating and inhibiting a Forhead transcription
factor. Cell., 96:857-868.
BRYAN, S. N., RASSAF, T., RODRIGUEZ, J., FEELISEH, M. (2004) Bound NO in
human red blood cells: Fac. Or artefact? Nitric Oxide, 10:221-228.
CHUN, S.Y., EISENHAUER, K. M., KUBO, M., HSUEH, A. J. W. (1995)
Interleukin-1β suppresses apoptosis in rat ovarian follicles by increasing
nitric oxide production. Endocrinology, 136, 3120-3127.
FAES, M. R.; CALDAS-BUSSIERE, M. C.; RODRIGUES, J. A.; FONTES, R. S.; ROSA
E SILVA, A. A. M. (2002) Interrelationship between nitric oxide, progesterone and
oestradiol-17beta concentrations in follicular fluid of ovarian follicles with follicleoocyte quality during follicular development in zebu cows (Bos indicus).
Theriogenology, 57: 605.
94
FURUKAWA-HIBI, Y., YOSHIDA-ARAKI, K., OHTA, T., IKEDA, K., MOTOYAMA, N.
(2002) FOXO forhead transcription factors induce G(2) –M checkpoint in response
to oxidative stress. J. Biol. Chem. 277: 26729-26732.
GHAFOURIFAR, P., SCHENK., U., KLEIN, S. D., RICHTER, C. (1999) Mitocondrial
nitric oxide synthase stimulation causes cytochome c release from isolated
mitochondria. Evidence for intramitocondrial peroxynitrite on mitochondrial electron
transport. (1999) Arch. Biophys. Acta. 1411:250-262.
GIULIVI, C., PONDEOSO, J. J., BOVERIS, A. (1998) Production of NO by mitocôndria.
J. Biol. Chem. 273:11038-11043.
GRASSELLI, F., PONDERATO, N., BASINI, G., TAMANINI. (2001) Nitric oxide
synthase expression and nitric oxide/cyclic GMP pathway in swine granulosa cells.
Dom Anim Endocr, 20: 241-252.
GRIMES, R.W., MATTON, P., IRELAND, J.J. (1987) A comparison of histological and
non-histological indices of atresia and follicular function. Biol. Reprod., 37:82-88.
GUTIERREZ, C. G., CAMPBELL, B. K., WEBB, R. (1997) Development of a long-term
bovine granulosa cell culture system: Induction and maintenance of estradiol
production,
response
to
follicle-stimulating
hormone,
and
morphological
characterisics. Biol. Reprod. 56:608-616.
HANKE, C. J., DREWTT, J. G., MYERS, C. R., CAMPBELL, W. B. (1998).
Nitric oxide inhibits aldosterone synthesis by a guanylyl cyclaseindependent effect. Endocrinology 139, 4053-4060.
HEFLER, L. A., GREGG, A. R. 2002, Inducible and endothelial nitric oxide synthase:
genetic background affects ovulation in mice. Fertile Steril, 77:147-151.
HEVEL, J. M., MARLETTA, M. A. (1992) Macrophage nitric oxide synthase:
Relationship between enzyme-bound tetrahydrobiopterin and synthase activity.
Biochemistry. 31:7170-7165
IÑIGUEZ, G., VILLAVICENCIO, A., GABLER, F., PALOMINO, A., VEGA, M. (2001)
Effect of nitric oxide on the expresión of insulin-like growth factors and insulin-like
95
growth factor binding proteins throughout the lifespan of the human corpus luteum.
Reproduction 122: 865-873.
ISHIMARU, R. S., LEUNG, K., HONG, L-S., LAPOLT, P. S., (2001) Inhibitory effects of
nitric oxide on estrogen production and cAMP levels in rat granulosa cells cultures.
J. Endocrinol. 168, 249-255.
JANBLONKA-SHARIFF, A., OLSON, L. M. (2000) Nitric oxide is essential for optimal
meiotic maturation of murine cumulus-oocyte complexes in vitro. Mol. Reprod. Dev.
55:412-421.
LAMAS, S. MARSDEN, P. A., LI, G. K; TEMPST, P., MICHEL, T. (1992) Endothelial
nitric oxide synthase: molecular cloning and characterization of a distinct
constitutive enzyme isoform. Proceedings of the National Academy of Sciences of
USA. 89:6348-6352.
LI, X., JIANG, Y., WANG, Z., LIU, G., HUTZ, R. J., LIU, W., XIE, Z., SHI, F. (2005)
Regulation of Fox O1 transcription factor by nitric oxide and cyclic GMP in cultured
rat granulose cells. Zoological Sci. 22: 1339-1346.
LIU, X., MILLER, M. J., THOMAS, D. D., LANCASTER, J. R (1998) Accelerated reaction
of nitric oxide with oxygen within th hydrophobic interior of biological membranes.
Proc. Natl. Acad. USA. 95:2175-2179.
MATTA, S. G. C., CALDAS-BUSSIERE, M. C., FAES, M. R., VIANA, K. S.; ADONA, P.
R., RODRIGUES, J.A. (2002) Concentração de óxido nítrico no meio de cultivo
durante a cinética de maturação in vitro de oócitos bovinos. Anais da XVII Reunião
Anual da Federação de Sociedades de Biologia Experimental. Ribeirão Preto, SP :
Brazilian Journal of Medical and Biological Research. v. 1. p. 54-54.
MATTA, S. G.C., CALDAS-BUSSIERE, M. C., FAES, M. R., ADONA, P. R.,
CARVALHO, C. S. P., DOMINGUES, S. F. S., DOMINGUES, S. J. S., VIANA, K. S.,
ANTUNES-RODRIGUES, J. (2001) Efeito de diferentes concentrações de óxido
nítrico na maturação in vitro de oócitos bovinos In: II Simpósio de Integração em
Biologia da Reprodução, 126. Ribeirão Preto. USP- Faculdade de Medicina de
Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo (Ementa)
96
MCDONALD, L. J., MURARD, F. (1996) Nitric oxide and cyclic gmp signalling. Proc Soc
Exp Biol Med., 211:1-6.
MCMAHON, T. J. (2002) Nitric oxide in the human respiratory cycle Nat. Med. 8:711717.
MEDEMA, R. H., KOPS, G. J., BOS, J. L., BURGERING, B. M. (2000) AFX-like Forkhead transcription factors mediate cell-cycle regulation by Rãs and PKB through
p27kip1. Nature, 404:782-787.
MINGOTI, G. Z, GARCIA, J. M., ROSA E SILVA, A. A. M. (2002) Steroidogenesis in
culus cells of bovine cumulus-oocyte complexes matured in vitro with BSA and
different concentratios of steroids. Anim. Reprod. Sci., 69, 175-186.
MOELLERING, D., MCANDREWW, J., PATEL, R. P., CORWELL, T., LINCOLN, CAO,
X., MESSINA, J. L., FORMAN, H. J., JO, H., DARLEY-USMAR, V. M. (1998) Nitric
oxide-dependent induction of glutathione synthesis though increased expression of
glutamycysteine synthase. Arch. Biochem. Biophysys., 358, 74-82.
MONCADA, S., PALMER, R. M. J., HIGGS, E. A. (1991) Nitric oxide: physiology,
pathology, and pharmacology. Pharmacol Rev., 43: 109-142.
MONCADA, S., PALMER, R. M. J., HIGGS, E.A. (1991). Nitric oxide: physiology, pathophysiology. Pharmacol. Rev., 43, 109-142.
MOSMANN, T., (1983) Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival:
application to proliferation and cytotoxicity assays. J. Immunol., 65, 55-63.
NAKAE, J., KITAMURA, T., KITAMURA, Y., BIGGS, W. H. ARDEN, K. C., ACCILI, D.
(2003). The forhead transcription factor FoxO1 regulates adipocyte differentiation.
Dev. Cell, 4:119-129.
NISHIKIMI, A., MATSUKAWA, T., HOSHINO, K., IKEDA, S., KIRA, Y., SATO, E. F.,
INOUE, M., YAMADA, M. (2001). Localization of nitric oxide synthase activity in
unfertilized oocytes and fertilized embryos during preimplantation development in
mice. Reproduction, 122, 957-963.
97
ORLY, J., SATO, G., ERICKSON, G. F. (1980). Serum suppresses the expression of
hormonally induced functions in cultured cells. Cell, 20, 817-827.
ORSI, N. M. (2006) Embryotoxicity of the nitric oxide donor sodium nitroprusside in
preimplantation bovine embryons in vitro. Anim. Reprod. Sci., 91:225-236.
PICCINATO, C.A., MONTREZOR, L.H., ROSA E SILVA, A. A .M. (2000) Produção de
óxido nítrico: Padronização do modelo de cultura das células da granulosa de
folículos ovarianos bovinos. Arquivos da Faculdade de Veterinária UFRGS. Anais da
XV Reunião Anual da Sociedade Brasileira de de Transferência de Embriões.
Caldas Novas, v. 28, p. 308 (supl),
PONDERATO, N., GRASSELLI, F., SALERI, E., TAMANINI, C. (2000) Factors
modulating apoptosis: na in vitro study in swine granulosa cells. Reprod. Domesti
Anim., 35:213-219.
RICART-JANÉ, D., LLOBERA, M., LÓPEZ-TEJERO, D. (2002) Anticoagulants and
others preanalytical factors interfer in plasma nitrate/nitrite quantification by Griess
method. Nitric Oxide, 6:178-185.
ROUILLIER, P., MATTON, P., DUFOUR, M., SIRARD, M. A., GUILBAULT, L. A. (1998)
Steroid production, cell proliferation, and apoptosis in cultured bovine antral and
mural granulosa cells: development of na in vitro model to study estradiol production.
Mol. Reprod. Dev., 50:170-177.
SAS (1996) Statistical Analysis
SESSA, W. C. (1994) The nitric oxide synthase family of proteins. J. Vasc. Res.,
31:131-143.
STAMLER, J. S. (1994) Redox signaling: Nitrosylation and related target interactions of
nitric oxide. Cell, 78:931-936.
TAO, Y., XIE, H., HONG, H., CHEN, X., JANG, J., XIA, G. (2005) Effect of nitric oxide
synthase inhibitors on porcine oocyte meiotic maturation. Zygoto, 13,1-9.
98
VAN VOORHIS, B. J., DUNN, M. S., SNYDER, G. D., WEINER, C. P. (1994) Nitric
oxide: An autocrine regulator of human granulose-luteal cell steroidogenesis.
Endocrinology, 135:1779-1806.
VAN VOORHIS, B. J., MOORE, K, STRIJBOS, P. J. L., NELSON, S., BAYLIS, A. S.,
GRZYBICKI, D., WEINER, C. P. (1998) Expression and localization of inducible snd
endothelial nitric oxide synthase: a possible involvement of nitric oxide in the
follicular development. Biochem Biophys Res Commun.; 243:67-72.
VIANA, K. S., CALDAS-BUSSIERE, M. C., MATTA, S. G. C., PAES DE CARVALHO, C.
S., FAES, M. R., QUIRINO, C. R. (2005) Efeito da adição de óxido nítrico na
maturação in vitro de oócitos bovinos; In: XIX Reunião Anual da Sociedade
Brasileira de tecnologia de Embriões Angra dos Reis,. Acta Scientiae Veterinariae
v. 33 p. 169, supl 1.
WANG, S., LIU, Y., HOLYOAK, G. R., BUNCH, T. D. (1997) The effects of bovine
serum albumin and fetal bovine serum on the development of pre-and postcleavage-stage bovine embryons cultured in modified CR2 and M199 media. Anim.
Reprod. Sci., 48:37-45.
99
4.3. ÓXIDO NÍTRICO MODULA A SÍNTESE DE 17β
β- ESTRADIOL VIA GMPC, MAS
NÃO A SÍNTESE DE PROGESTERONA PELAS CÉLULAS DA GRANULOSA
ANTRAIS EM MEIO DE CULTURA QUIMICAMENTE DEFINIDO
RESUMO
No ovário bovino, o NO vem sendo caracterizado como um dos reguladores da
esteroidogênese e apoptose das células da granulosa (CGs). Uma das vias utilizadas
pelo NO para exercer seus efeitos é a via GMPc. O presente estudo teve como
objetivo verificar o efeito do nitroprussiato de sódio (SNP), doador de NO, na
esteroidogênese, viabilidade e ciclo celular das CGs, e se este efeito ocorre via GMPc
por meio da combinação do SNP com ODQ [([1H]-[1,2,3] oxadiaziolo[4,3a]quinoxaline1-one)], inibidor da guanilato ciclase. As CGs antrais de folículos com 3-5mm de
diâmetro foram cultivadas com 0, 10-5, 10-3 e 10-1 M de SNP com ou sem ODQ por 24
h. No final deste período, foram avaliadas a concentração de nitrato/nitrito (NO3-/N02-)
pelo método de Griess, a síntese de progesterona (P4) e 17β-estradiol (E2) pelas CGs
por
quimioluminescência,
viabilidade
e
ciclo
celular
pelo
método
MTT
(difeniltetrazolium 3-[4,5-dimetiltrazol-2yl]-2,5) e citometria de fluxo, respectivamente. A
concentração de NO3-/N02- aumentou (P<0,05) de uma maneira dose-dependente no
meio de cultivo de acordo com a concentração de SNP adicionada ao meio de cultura.
As CGs cultivadas com 0, 10-5 M de SNP com ou sem ODQ formaram grumos
celulares, e não apresentaram variação (P>0,05) na viabilidade celular, enquanto que
as CGs cultivadas com 10-3 e 10-1 M de SNP com ou sem ODQ apresentaram
desorganização e não formaram grumos celulares, respectivamente, diminuição da
viabilidade celular e síntese de esteróides (P<0,05). A maioria das CGs cultivadas com
0, 10-5 e 10-3 M de SNP com ou sem ODQ encontram-se na fase G0/G1 (80 - 70 %) e
em menor proporção (20 - 30 %) na fase S+G2/M do ciclo celular, enquanto todas CGs
(100%) cultivadas com 10-1 M de SNP apresentaram níveis subdiplóides de DNA. O
tratamento com 10-5 M de SNP inibiu (P<0,05) a síntese de P4 por mecanismo
independente do GMPc e estimulou a síntese de E2 via GMPc. Estes resultados
100
sugerem que a síntese de E2 pelas CGs antrais de folículos pequenos é modulada pelo
NO em concentrações mais baixas via GMPc, mas não a de P4, e que o NO em
concentrações elevadas exerce efeito citotóxico, sugerindo o seu envolvimento na
necrose celular e/ou apoptose das CGs.
Palavras- chave: bovino; oxido nítrico; progesterona; 17β-estradiol-, GMPc
ABSTRACT
In the bovine ovary, NO it being characterized as one of the regulators of
steroidogenesis and apoptosis of the granulosa cells (GCs). One of the ways used for
NO to exert its effect is the cGMP pathway. This work aimed to verify the effect of the
sodium nitroprusside (SNP), a NO donor, on antral CGs viability, cell cycle and
steroidogenesis, and if this effect occurs way cGMP, by means of the combination of
the SNP with 1H-[1,2,3 ] oxadiaziolo [ 4,3a]quinoxaline-1-one (ODQ), a selective
guanilate cyclase inhibitor. The antral GCs from bovine follicles (3-5mm) were cultured
with SNP (0, 10-5, 10-3 and 10-1 M) with and without ODQ for 24 h. In the end of time
were been evaluated viability and cellular cycle by MTT (3- [4,5-dimethylthiazol-2yl] 2,3 dipheniltetrazolium bromide) and flow cytometry, respectively, the nitrato/nitrite
(NO3-/N02-) concentration by Griess method, 17 β -estradiol (E2) and progesterone (P4)
synthesis by chemiluminescence. NO3-/NO2- concentration has increased (p< 0.05) in a
way dose-dependent according to SNP concentration. CGs cultured with 0, 10-5 M SNP
with or without ODQ formed cell groups and showed no variation (p>0.05) in cell
viability, whereas 10-3 and 10-1 M SNP with or without ODQ lead to disorganization or
non formation of cell groups, respectively, and decreased cell viability and steroids
(p<0.05). The majority of the GCs cultured with 0, 10-5 and 10-3 M of SNP with or
without ODQ had met in the phase G0/G1 (80 - 70 %) and 20 - 30 % in phase S/G2 of
the cellular cycle, Moreover, 100% of the CGs cultured with 10-1 M SNP presented
subdiploid DNA levels. 10-5 M SNP inhibited (p<0.05) P4, by a mechanism independent
101
of GMPc and increased (P<0.05) the E2 pathway GMPc. These results suggest that the
GMPc pathway is one of the mechanisms used by NO in low concentrations to
positively regulate E2 synthesis, but not P4, while high NO concentrations inhibit
steroids by a GMPc independent pathway, besides presenting cytotoxic effect
suggesting its role on necrosis and /or apoptosis
Key words: bovine, nitric oxide, progesterone, 17β-oestradiol, cGMPc
INTRODUÇÃO
O 17β-estradiol (E2) tem um papel essencial no estabelecimento e manutenção
do sistema reprodutivo. A síntese de E2 pelas células da granulosa (CG) é dependente
da enzima P450 aromatase, que converte andrógenos em estrógenos. O aumento da
expressão desta enzima é induzido pelo hormônio folículo estimulante (FSH), que ao
se ligar ao receptor acoplado à proteína G, ativa a adenilato ciclase e estimula a
produção de AMPc, seu segundo mensageiro (HSUEH, 1988). Além do FSH, existem
outros hormônios, fatores de crescimento, peptídeos e sinalizadores extra e
intracelulares moduladores da função das CGs (LAPOLT e HONG, 1995, CHUN et al.,
1995).
O óxido nítrico (NO) é um gás transparente, cuja solubilidade máxima em
pressão e temperatura ambiente é levemente maior do que a solubilidade do oxigênio
em água. Assim, como O2, o NO é lipofílico e é 6 a 8 vezes mais solúvel em solventes
não-polares e lipídeos de membrana comparada à água. Portanto, as taxas de reações
do NO em ambiente hidrofóbico é maior do que em ambiente aquoso (LIU et al., 1998).
Assim, possui alta solubilidade pelas membranas biológicas.
O NO é formado a partir da L-arginina, cuja reação é catalisada pela enzima
óxido nítrico sintase (NOS), que existe nas isoformas endotelial (eNOS) e neuronal
(nNOS), reguladas pelo cálcio-calmodolina e a isoforma induzível (iNOS), regulada por
citocinas (Snyder, 1995). A presença da eNOS e iNOS, como fonte geradora de NO em
102
compartimentos ovarianos e seu papel na regulação da esteroidogênse das CGs já foi
demonstrado em camundongos (JABLONKA – SHARIFF e OLSON, 1997; MATSUMI
et al., 1998; HURWITZ et al., 2002) e bovinos (BASINIi et al., 1998). Entretanto, ainda
existem controvérsias com relação aos mecanismos utilizados para o NO exercer seus
efeitos nas CGs.
O NO vem sendo demonstrado como um regulador negativo da síntese de
esteróides, e um dos mecanismos utilizados para o NO exercer seus efeitos é por meio
da sua ligação a enzimas que contêm o grupo prostético heme. Assim, o NO pode se
ligar diretamente à enzima P450 aromatase e inibir a esteroidogênese estimulada pelas
gonadotrofinas (VAN VOORHIS et al., 1994; HANKE et al., 1998).
Outro mecanismo de ação mediado pelo NO é via ativação da enzima
guanilato ciclase por meio da ligação do NO ao grupo heme, presente também na
enzima. A ativação da guanilato ciclase aumenta a concentração intracelular de GMPc
(guanosina monofosfato cíclica) (MURARD, 1999; HANAFY et al., 2001). Tem sido
sugerido que o GMPc aumenta a atividade da fosfodiesterase 2 (PDE2), que aumenta
a hidrólise do AMPc, 2º mensageiro intracelular do FSH.
Em cultura de células da granulosa de ratas (ISHIMARU et al., 2001) e suínos
(GRASSELLI et al., 2001), a via NO/GMPc vem sendo sugerida como um dos
mecanismos utilizados pelo NO para inibir a esteroidogênese. Ao contrário, em
bovinos, o uso de análogos de GMPc não foi eficaz em inibir a esteroidogênese
(BASINI et al., 2000).
Os resultados acima são conflitantes, provavelmente devido a variações entre
os modelos de cultivo utilizados, presença de células sanguíneas, diferença entre
espécies e grau de diferenciação das CGs utilizadas nos estudos. O BSA, comumente
utilizado na maioria dos sistemas de cultivo e também naqueles relatados acima, é
contaminado com esteróides, colesterol, peptídeos e outras moléculas não definidas
(WANG et al., 1997; MINGOTTI et al., 2002). Isto torna o meio de cultivo semi-definido,
podendo interferir com os resultados. Além disso, a presença de células sanguíneas
podem também alterar a esteroidogênese das CGs e síntese e concentração de NO
(BECKMANN et al., 1991; SHAKIL et al., 1994) no meio de cultura. Assim, o presente
103
experimento utilizou um sistema de cultivo comprovadamente eficaz em manter a
esteroidogênese das CGs (PICCINATO et al., 2000), no qual o BSA foi substituído pelo
álcool polivinílico (PVA). Foram utilizados métodos para retirada de hemácias e
macrófagos que vêm junto quando as CGs são aspiradas dos folículos. Com este
modelo de cultivo, o presente experimento objetivou: 1) verificar o efeito do NO na
viabilidade, ciclo celular e na síntese de esteróides das CGs antrais, visto que estas
possuem maior atividade esteroidogênica (ROUILLER et al., 1996; ROUILLER et al.,
1998), de folículos pequenos (3-5 mm) de bovinos, pois estes ainda não estão
diferenciados e possuem maior atividade proliferativa (GUTIERREZ et al., 1997), e 2)
verificar se os efeitos do NO são modulados pelo GMPc, utilizando-se o ODQ ([1H][1,2,3] oxadiaziolo[4,3a]quinoxaline-1-one), inibidor da enzima guanilato ciclase solúvel.
MATERIAL E MÉTODOS
Reagentes
A maioria dos reagentes foram obtidos da Sigma Sta Louis, MO. Os
reagentes de outros laboratórios foram especificados.
Obtenção das células da granulosa
Ovários de vacas cíclicas foram obtidos em abatedouros locais e transportados
imediatamente em solução salina estéril (NaCl 0,9%) acrescida de antibióticos (100
IU/ml de penicilamina e 100 µg/ml de sulfato de estreptomicina) para o laboratório, onde
tiveram os restos de tecidos eliminados. Os ovários foram lavados com solução salina
acrescida de antibióticos e enxaguados brevemente com etanol 70% e posteriormente
lavados (3 vezes) com solução salina acrescida de antibióticos.
104
Os folículos pequenos (3-5 mm), apresentando 70 % da sua superfície exposta
clara e vascularizados (GRIMES et al., 1987), foram puncionados e as CGs antrais
aspiradas (ROUILLER et al., 1998) e depositadas em tubos de polietilenoglicol de 15 ml
contendo 2 ml de meio base [Meio Dulbeccos Eagles modificado – Ham´s F12 com
Hepes 15 mM (Gibco, São Paulo - BRL), adicionado de 10 mM de bicarbonato de sódio;
100 UI/ml de penicilina G, e 100 µg/ml de sulfato de estreptomicina (Merck, Rio de
Janeiro, BRL)] acrescido de 50 UI de heparina para evitar a formação de grumos.
A suspensão de CGs foi filtrada em uma malha para retirar os oócitos e debris
celulares. Em seguida, o filtrado foi centrifugado (300 x g/ 10 minutos) à temperatura
ambiente, o sobrenadante descartado e as células lavadas (2 vezes) com 1 ml de meio
base. Tendo em vista que as hemácias se ligam ao NO (MCMAHON et al., 2002) e que
os macrófagos podem sintetizar NO (WHITEHEAD et al., 1996), e as CGs, ao serem
puncionadas vêm junto com sangue, foram realizados dois procedimentos. Para
retirada das hemácias, o precipitado de CGs foi tratado com 300 µl de uma solução de
cloreto de amônio 0,9% pré-aquecida (37º C) e incubado por 1 minuto. Em seguida, foi
adicionado meio base ao tubo com as CGs até completar o volume de 12 ml,
restaurando, assim, a isotonicidade das CGs. As CGs foram centrifugadas (300 x g/ 10
minutos) e o precipitado lavado com meio base. O precipitado de CGs foi
ressuspendido em 1 ml de meio base e semeado em discos de cultura de 32 mm de
diâmetro contendo 2 ml do mesmo meio. As CGs foram incubadas por 2 h a 37,5o C em
ambiente com atmosfera contendo 5% de CO2 para retirada dos macrófagos, uma vez
que estes aderem facilmente ao fundo da placa de cultivo (BECKMANN et al., 1991).
As CGs não-aderidas foram coletadas da placa de cultura, centrifugadas (300 x
g/ 10 minutos) e ressuspendidas em 2 ml de meio de cultivo [Meio Dulbeccos Eagles
modificado - Hams F12 contendo Hepes 15mM, adicionado de bicarbonato de sódio 10
mM, penicilina G 100 U/ml, e sulfato de estreptomicina 100µg/ml (Merck, Rio de JaneiroBRL); androstenediona, 10-7 M; PVA 0,1%; 1% de MEM aminoácidos não essenciais
100 % e 1% de solução ITS 100 % (selenito de sódio -1,4 ng/ml; transferrina - 5,0 µg
/ml; insulina-10 ng/ml).
105
A viabilidade e o número de células foram estimados utilizando-se o
microscópio invertido (Telaval 31, Zeiss), aumento de 400x, hemocitômetro e o método
de exclusão com azul de trypan 0,4%. A viabilidade celular média foi de 70 %.
Foram realizados esfregaços da suspensão celular antes e após o tratamento
para retirada de hemácias e macrófagos. Após terem sido corados com hematoxilina,
foram contadas 100 células com 10 repetições (1000 células totais). Para cada 100
células contadas antes do tratamento para retirada de hemácias e macrófagos foram
encontrados, em média, 39,8 ± 7,7 % de hemácias, 8,5 ± 3 % de macrófagos. Após o
tratamento, foram encontrados 9 ± 4 % de hemácias e 0,4 ± 0,5 % de macrófagos.
Delineamento experimental
As CGs foram cultivadas com 0, 10-5, 10-3, 10-1 M de nitroprussiato de sódio
(SNP), doador de óxido nítrico, sem ou com 10-
4
M ODQ. A concentração de
nitrato/nitrito (NO3-/NO2-), viabilidade e proliferação celular, síntese de progesterona
(P4) e E2 pelas CGs foram avaliados no final de 24 h de cultura.
Cultura das CGs
Foram adicionadas 5,0 x 105 CGs antrais de folículos de 3 -5mm em placas de
24 poços e o volume completado para 1000 µl de meio de cultura contendo os
tratamentos. Em seguida, as CGs foram incubadas a 37,5 oC em ambiente com
atmosfera contendo 5% de CO2.
Determinação da viabilidade celular
A viabilidade celular foi verificada no final de 24h cultura por meio do método
MTT. Este ensaio é baseado na habilidade das células vivas com mitocôndrias ativas
reduzirem o sal brometo de difeniltetrazolium 3-[4,5-dimetiltrazol-2yl]-2,5 - ao produto
106
final azul de formazan (metiltriazole) (MOSMANN, 1993). No final do cultivo, 700µl de
meio de cultivo foram retirados para realizar as dosagens necessárias, restando
apenas 300 µl de meio. Assim, 30 µl de MTT (5mg/ml) foram adicionados em cada
poço e, em seguida, as CGs foram incubadas por 3 h a 37º C. Posteriormente, foram
adicionados 300 µl de isopropanol acidificado com HCl (0,04 N) contendo 10 % de
Triton X 100 para solubilizar os cristais formados por 14-16 h em temperatura
ambiente. Após este período, 200 µl da mistura de cor azul foram transferidos para
placas de 96 poços. A leitura foi realizada em um espectrofotômetro (Multiskan EX
Primary EIA V 2.1-0) com comprimento de onda de 570 nm, com subtração do
background (620 nm). A relação entre a absorbância e o número de células foi
determinado pela incubação prévia de quantidades conhecidas de células com MTT,
criando, assim, uma curva padrão. A relação entre a absorbância e número de células
foi linear (R2=0,99; P<0,05).
Ciclo celular
Para determinar o efeito dos tratamentos no ciclo celular das CGs antrais foi
realizada citometria de fluxo (BLONDIN et al., 1996). As CGs foram coletadas após a
incubação com 1 ml de PBS Ca++ Mg++ e EDTA (125 mg/l) por 10 minutos e
centrifugadas a 400g a 4º C por 5 minutos. O sobrenadante foi removido e o
precipitado foi ressuspendido em 500 µl de PBS Ca++ Mg++. As CGs foram fixadas por,
no mínimo, 1 hora a 4º C com 1 ml de etanol absoluto gota a gota durante agitação em
vortex. Posteriormente, as CGs foram centrifugadas e o precipitado ressuspendido
com 500 µl de etanol 70% e estocadas a - 20º C até o dia da análise por citometria de
fluxo. Antes das análises, as CGs foram centrifugadas e o sobrenadante descartado. O
precipitado foi lavado duas vezes com PBS (400g a 4º C por 5 minutos). As CGs foram
ressuspendidas com 1ml de PBS contendo 50 µg/ml de ribonuclease (RNAse, Merck,
Rio de Janeiro-BRL) e incubadas por 30 minutos a 37 oC. Posteriormente, as CGs
foram centrifugadas a 400g a 4º C por 5 minutos e o precipitado ressuspendido com
PBS acrescido de iodeto de propídio (50 µg/ml) e incubadas por 30 minutos a 0o C. As
amostras foram filtradas em filtro de 40µM e lidas no comprimento de onda de 540 nm
107
(Analisador PARTEC PA). Os dados foram derivados de histogramas do DNA
analisados pela citometria de fluxo. A percentagem de células em estádio
G0/G1(diplóides), S (síntese de DNA) e G2/M (tetraplóide) do ciclo celular e
percentagens de células contendo níveis sub-diplóides de DNA (DNA fragmentado)
foram calculados utilizando -se um software DPAC.
Dosagens de nitrato/nitrito (NO3-/NO2-) e de esteróides
No final de 24h de cultivo, o meio de cultura foi coletado e armazenado a o
20 C para dosagem de NO3-/NO2-, P4 e E2.
NO3-/NO2A concentração de NO3-/NO2- foi mensurada utilizando-se o método
colorimétrico de Griess (RICART-JANÉ et al., 2002). O reagente de Griess é composto
de uma mistura de sulfanilamida 2% e N-(1-naphthyl) ethylene-diamine 0,2% em água
Milii Q. A primeira reação na amostra ocorre com o nitrito para formar o sal diazonium
que reage com o segundo reagente para formar a cor púrpura com um pico de
absorbância de 540 nm. Para reduzir o nitrato a nitrito, as amostras (40 µl) foram
incubadas com 40 µl de uma mistura contendo 1000 µl da enzima nitrato redutase
oriunda de bactéria [100 µl da enzima (10 UI) diluída em água Milli Q + 900 µl de água
Milli Q), 1000 µl do cofator NADPH (5mg/ml diluído em água Milli Q) e 1000 µl de
tampão fosfato de potássio (0,5 M). As amostras foram incubadas a 37 oC por 14-16 h.
Posteriormente, 80 µl do reagente de Griess foram adicionados às amostras.
O método foi desempenhado em placa de 96 poços. Todas as soluções foram
protegidas da luz. Uma curva padrão de nitrito de sódio diluída em DMEM/Ham`s-F12
contendo valores conhecidos de nitrito foi realizada, onde o valor mínimo de nitrito foi
de 0,5 µM e o máximo de 100µM. Com os valores da absorbância, foi montada um
gráfico de dispersão. A relação entre a absorbância e concentração de NO3-/NO2- foi
linear (R2=0,98; P<0,05).
108
Esteroidogênese
A concentração de P4 e E2 foi determinada pelo sistema automatizado de
quimioluminescência ACS:180®. O teste é um imunoensaio competitivo que usa
tecnologia quimioluminescente direta. O anticorpo anti-P4 e anti-E2 monoclonal é
marcado com éster de acridina. A curva de P4 variou de 0,86 a 29,80 ng/ml e a de E2
de 88 a 785 pg/ml. As amostras com 0, 10-5 M de SNP com ou sem ODQ foram
diluídas (1/400), enquanto que as amostras de meio de cultivo obtidas dos tratamentos
com 10-3 e 10-1 M de SNP com ou sem ODQ não foram diluídas. Após as devidas
diluições, os hormônios foram mensurados. A média do coeficiente de variação foi de
1,6 % e 3 % para progesterona e 17β-estradiol, respectivamente.
Análise estatística
O experimento foi repetido duas vezes e cada tratamento constou de duas
repetições. Foi realizada uma ANOVA com um fator e as médias foram comparadas
pelo teste de Tukey (P<0,05). O programa utilizado foi SAS (Statistical Analysis
System).
Resultados
Características morfológicas das CGs
No final de 24 h, as CGs cultivadas com 0 (controle), 10-5 M de SNP com ou
sem ODQ (Figura 1. painéis a, b, c, d) mantiveram as características arredondadas de
CGs esteroidogenicamente ativas e formaram grupos celulares, enquanto as CGs
cultivadas com 10-3 M de SNP com ou sem ODQ (Figura 1. painéis e, f) formaram
grupos desorganizados, apresentaram-se escurecidas e com pouca aderência na
109
placa de cultura. As CGs cultivadas com 10
-1
M de SNP com ou sem ODQ (Figura 1.
painéis g e h) não formaram grupos celulares e apresentaram- se escurecidas e
achatadas na placa de cultura.
Concentração de NO3-/NO2-
A concentração de NO no meio de cultura aumentou (P<0,05) de maneira
dose dependente de acordo com a concentração de SNP adicionada ao meio de cultivo
(Figura 2, painel a). Controle (1,9 ±0,6 µM); ODQ (1,5 ±0,18 µM); 10-5 M de SNP
(6,7±0,9 µM); 10-5 M de SNP +ODQ (6,6 ±2,3 µM); 10-3 M de SNP (48,6 ±11 µM); 10-1
M de SNP + ODQ (67,2± 2,9 µM); 10-1M de SNP +ODQ (67,4 ±1,7 µM).
Viabilidade celular
A viabilidade celular não variou (P>0,05) entre o grupo controle (6,8 x 105 ±
0,27 células), e o grupo de CGs cultivadas com ODQ (6,6 x 105 ± 0,75 células) e 10-5 M
de SNP com ODQ (7,0 x 105 ± 0,5 células) ou sem ODQ (7,6 x 105 ± 0,8 células).
Entretanto, após a adição de 10-3 e 10-1 M de SNP com ou sem ODQ, 100% das CGs
(P<0,05) tornaram-se inviáveis (Figura2, painel b).
Ciclo celular
As maioria das CGs cultivadas com 0 (controle), 10-5 e 10-3 M de SNP com ou
sem ODQ no final de 24 h de cultura encontraram-se na fase G0/G1 (80 - 70 %),
enquanto, 20 - 30 % na fase S + G2/M do ciclo celular. Já as CGs cultivadas com 10-1
M de SNP apresentaram redução do conteúdo do DNA e desvio para esquerda do pico
G0/G1 (G0/G1 - 0% S e G2- 0%) (Figura 3).
110
Esteroidogênese
A síntese de P4 (Figura 4, painel a) pelas CGs foi inibida (P<0,05) pela adição
tanto de 10-4M de ODQ (91,3 ± 0,02 ng/ml) quanto de 10-5 de SNP com ou sem ODQ
(126,68 ± 0,044 ng/ml e 129,1 ± 0,006 ng/ml, respectivamente) ao meio de cultura em
relação ao controle (174,7 ± 0,02 ng/ml), entretanto, esta inbição foi maior quando as
CGs foram cultivadas com ODQ. Não houve diferença (P>0,05) na síntese de P4 pelas
CGs os tratamentos 10-5 M de SNP e 10-5M com ODQ. O efeito inibitório da adição de
10-3 M de SNP com ou sem ODQ (16,35 ± 0,0007 ng/ml; 14,39 ± 0,003 ng/ml,
respectivamente) foi maior do que o observado pelos demais tratamentos quando
comparado ao controle (P<0,05).
Tanto a adição de 10-4 M de ODQ quanto de 10-5 M de SNP no meio de cultura
de CGs estimularam (P<0,05) a síntese de E2 (3,4 ng/ml, 6,8 ± 0,5 ng/ml,
respectivamente) quando comparada ao controle (2,0 ng/ml, P<0,05), entretanto, o
aumento da síntese de E2 foi maior (P<),05) quando as CGs foram cultivadas com 10-5
M de SNP do que o aumento observado com a adição de ODQ. A adição de ODQ
inibiu (P<0,05) o aumento da síntese de E2 (3,3 ±0,3 ng/ml) estimulada pela adição de
10-5 M de SNP, não sendo observada diferença entre a síntese de E2 quando as CG
foram cultivadas na presença de ODQ e ODQ com 10-5 M de SNP (P>0,05). A adição
de 10-3 M de SNP inibiu (P<0,05) a síntese de E2 (0,02 ± 0,001 ng/ml) e este efeito não
foi revertido pelo ODQ (0,02 ± 0,1 ng/ml) (Figura 4, painel b).
A síntese de P4 e E2 pelas CGs cultivadas com 10-1 M de SNP foi menor que a
concentração mínima detectada (> 0,86 ng/ml e > 88,0 pg/ml, respectivamente) pelo
método de mensuração de esteróides utilizado. Por este motivo, não consta nos
gráficos.
111
Figura 1 Células da granulosa cultivadas sem tratamento (a), com ODQ (b); 10-5 M de
SNP (c); 10-5 M de SNP + ODQ (d); 10-3 M de SNP (e); 10-3 M de SNP + ODQ
(f); 10-1 M de SNP (g); 10-1 M de SNP + ODQ (h) (aumento de 400 x).
112
(a)
NO3- / NO2- (uM)
100
d
80
60
d
c
c
10-3
+
10-3
10-1
+
10-1
d
d
d
d
10-3
+
10-3
40
20
0
a
ODQ (10-4M) SNP (M)
0
a
+
0
b
b
10-5
+
10-5
(b)
CGs viáveis (n x 10 5)
9
8
a
7
6
5
4
3
2
1
0
ODQ (10-4M) SNP (M)
0
b
ab
+
0
ab
10-5
+
10-5
+
10-1 10-1
Figura 2: Efeito do SNP (0, 10-5 , 10-3 e 10-1 M) com ou sem ODQ (10-4 M) na (a)
concentração de NO3-/NO2- no meio de cultura e na (b) viabilidade celular (no
de CGs antrais viáveis x 105) no final de 24 h de cultura. Médias com letras
diferentes são (P<0,05) diferentes pelo teste de Tukey. Cada valor no gráfico
representa média ± desvio padrão de dois experimentos independentes
113
ODQ
Controle
SNP10 -5 M
Número de células
G O /G 1
-Go
S
G2
Conteúdo de DNA
SNP10 -3 M
SNP10 -3 M + ODQ
Número de células
SNP 10 -5 M+ ODQ
Conteúdo de DNA
SNP 10 -1M +ODQ
Número de células
SNP 10 -1M
Conteúdo de DNA
Figura 3: Efeito do SNP no ciclo celular das CGs antrais de folículos de 3-5mm de
diâmetro cultivadas com 0 de SNP (controle); 10-4 M de ODQ; 10-5 M de SNP,
10-5 M de SNP + 10-4 M de ODQ; 10-3 M de SNP; 10-3 M de SNP + 10-4 M de
ODQ; 10-1 M de SNP; 10-1 M de SNP + 10-4 M de ODQ. – G0 – níveis subdiplóides de DNA; G0/G1- células diplóides; S - síntese de DNA; G2 – células
tetraplóides (mitose).
114
P4 (ng/ml)
(a)
200
180
160
140
120
100
80
60
40
20
0
a
c
c
b
d
1
ODQ (10-4M) SNP (M)
0
d
2
3
4
5
6
+
0
10-5
+
10-5
10-3
+
10-3
(b)
8
c
7
E2 (ng/ml)
6
5
b
b
4
3
a
2
1
d
0
1
2
3
ODQ (10 M) SNP (M)
0
+
0
10-5
-1
-4
4
5
6
+
10-5
10-3
+
10-3
Figura 4: Efeito do SNP (0, 10-5, 10-3 M) com ou sem ODQ (10-4M) na síntese de P4 e
E2 pelas CGs antrais de folículos de 3-5mm de diâmetro no final de 24 h de
cultura. Cada valor no gráfico representa média ± desvio padrão de dois
experimentos independentes com 2 repetições por tratamento.
115
DISCUSSÃO
O
presente
experimento
demonstrou
que
o
NO
pode
regular
a
esteroidogênese das CGs de folículos pequenos de bovinos confirmando a hipótese do
papel parácrino e autócrino do NO na fisiologia ovariana (BASINI et al., 1998).
No presente estudo, foi verificado que, apesar da concentração 10-5M de SNP
inibir a síntese de P4, esta estimulou a síntese de E2 nas primeiras 24 h de cultura,
enquanto concentrações mais elevadas (10-3 e 10-1M) de NO inibiram a síntese tanto
de E2 quanto de P4. Estes resultados contrariam em parte os resultados encontrados
por Basine et al. (1998) que demonstraram com o uso do S-nitroso-N-acetylpenicillamine (SNAP), doador de NO, em concentrações semelhantes às utilizadas no
presente estudo, uma inibição da síntese de esteróides logo nas primeiras 24 h de
cultivo das CGs de bovinos. Entretanto, existem relatos na literatura que correlacionam
o aumento da concentração de nitrito, metabólito do NO, com o volume folicular e
concentração de E2, mas não com a concentração de P4 no fluido folicular de mulheres
durante a fase folicular (ANTEBY et al., 1996). Além disso, BONELLO et al. (1996),
objetivando avaliar a regulação do NO na taxa de ovulação em ratas, demonstraram
por meio da perfusão ovariana com o inibidor da enzima NOS (Nω-nitro-L-arginine
methyl ester, L-NAME) uma diminuição da síntese de E2, sugerindo que o NO pode
regular positivamente a síntese de E2 e a ovulação. Assim, os resultados do presente
estudo corroboram com estes achados, sugerindo que o NO pode participar na
regulação positiva da síntese de E2 pelas CGs de bovinos.
Os resultados deste estudo também demonstraram que a inibição da síntese
de P4 pela adição 10-5 M de SNP e a inibição tanto de E2 quanto de P4 pela adição de
concentrações mais elevadas de SNP (10-3 e 10-1M) ocorre por um mecanismo
independente da via GMPc, semelhante aos resultados encontrados por BASINI et al.
(2000), ao utilizarem doador de NO (SNAP, N-acetilpenicilamina s-nitroso) em cultura
de CGs de bovinos. O NO pode agir por um mecanismo independente de GMPc, tendo
em vista que este pode se ligar a enzimas contendo o grupamento heme, assim como
116
as ciclo-oxigenases (RETTORI et al., 1992) e enzimas do citocromo P450 (WINK et al.,
1993). SNYDER et al. (1996) sugerem que NO regula a esteroidogênese por inibição
direta das enzimas do citocromo P450. Adicional a estes resultados, o presente estudo
mostrou que, embora a concentração mais baixa de SNP tenha reduzido a síntese de
P4 nas primeiras 24h, esta manteve as características morfológicas de CGs
esteroidogenicamente ativas (GUTIERREZ et al., 1997) e não alterou viabilidade e ciclo
celular, enquanto que concentrações mais elevadas de SNP no meio de cultivo, além
de inibirem a síntese de esteróides, alteraram as características morfológicas de CGs
descritas por GUTIERREZ et al. (1997), induzindo a desagregação do grumos
celulares e bloquearam a atividade das enzimas mitocondriais, evidenciado pela
redução drástica da viabilidade celular. Entretanto, a concentração 10-3M não alterou o
ciclo celular como verificado pela adição da concentração 10-1M, que induziu uma
fragmentação do DNA das CGs. CHU et al. (1995) e BASINI et al. (1998)
demonstraram que o NO inibe a apoptose das CGs em ratas e bovinos,
respectivamente, e de fato concentrações reduzidas de NO (nmoles) podem reduzir a
ativação de caspases, induzindo a expressão do gene Bcl2, que inibe a permeabilidade
mitocondrial e previne a liberação do citocromo c e clivagem da polimerase poli (ADPribose) (GENARO et al., 1995; ROSSSIG et al., 1999). Entretanto, sabe-se que o NO
em concentrações elevadas possui efeito citotóxico e vem sendo demonstrado por
induzir a apotose e/ou necrose em outros estudos ligados à fisiologia da reprodução,
como: ovário de ratas (ELLMAN et al., 1993), células epitélio- endometriais de
mulheres (LI et al., 2001) e embriões bovinos (ORSI et al., 2005).
As mitocôndrias possuem várias enzimas contendo o grupo heme, como as
enzimas responsáveis pela respiração celular (citocromo oxidase) e síntese de
esteróides nas CGs (citocromo P450scc e aromatase) (GORE-LANGTON et al., 1994 ).
Como demonstrado no presente estudo pelo método do MTT, a inibição da atividade
mitocrondrial pelo NO em concentrações elevadas se deve provavelmente à ligação do
NO à enzima citocromo oxidade, prejudicando a respiração mitocondrial das CGs,
levando à morte celular, provavelmente por depleção de ATP (LEIST et al., 1999) e
clivagem do DNA (ZHANG et al., 1994). Em função dessa ação do NO nas
mitocôndrias, estes resultados sugerem, também, uma provável ligação do NO ou de
117
seus derivados ao grupamento heme da P450 aromatase como um mecanismo de
inibição da síntese de esteróides demonstrado por VAN VOORHIS et al. (1994) em
cultura de CGs luteais de humanos.
O NO em concentrações elevadas se liga ao grupamento heme das enzimas
da cadeia respiratória, como a citocromo oxidade e inibe a atividade mitocondrial
levando a morte das células por hipóxia (CLEMENTI et al., 1999; SARTI et al., 1999).
Após várias horas de exposição ao NO, pode ocorrer uma inibição irreversível da
enzima citocromo oxidase, devido à conversão do NO em espécies reativas de
nitrogênio (peroxinitrito), que inibem vários sítios da respiração celular. A formação do
peroxinitrito, que é um forte oxidante, pode causar peroxidação lipídica, aumentando a
permeabilidade mitocondrial a prótons ou outros íons e, assim, causar danos ao DNA.
Assim, os resultados do presente estudo mostram uma inibição da atividade
mitocondrial pelo tratamento das CGs com 10-3M de SNP sem dano ao DNA pelo
menos com 24 h de cultivo, enquanto a concentração 10-1M de SNP mostra dano
mitocondrial e fragmentação do DNA, sugerindo que concentrações elevadas de NO
parecem inicialmente inativar a função mitocondrial e, depois, induzirem a
fragmentação do DNA, levando à morte das CGs por apoptose ou injúria.
Os resultados demonstraram que, embora não tenha sido verificada a inibição
de P4 pelo NO via GMPc, existe algum fator, que não é o NO, capaz de estimular a
síntese de P4 via GMPc , visto que, a inibição da via GMPc diminuiu a síntese de P4,
contudo, um resultado não esperado e inexplicável foi a ausência de um efeito negativo
adicional sobre a síntese de P4, quando o ODQ foi adicionado ao tratamento com 10-5
M de SNP. Embora o maior ativador fisiológico da guanilato ciclase, enzima
responsável pela síntese de GMPc, seja o óxido nítrico (IGNARRO et al., 1991),
existem outros reguladores fisiológicos envolvidos na sua ativação, como: o cálcio
(SITARAMAYYA, 2002) e a protoportfirin IX (MINGONE et al., 2006). No ovário, pouco
se sabe sobre os ativadores e reguladores da guanilato ciclase (LAPOLT et al., 2002).
Assim, estudos nesta área devem ser realizados com intuito de verificar outros
possíveis reguladores da via GMPc para assim melhor compreender os eventos que
controlam a função ovariana.
118
Ao contrário do efeito do NO sobre a síntese de P4, o presente estudo mostrou
que a adição de 10-5 M de SNP aumentou síntese de E2 por um mecanismo
dependente de GMPc, porém, como observado na síntese de P4, os resultados deste
estudo também mostraram que existem outros mecanismos reguladores da via GMPc,
entretanto, estes possíveis reguladores estão envolvidos na inibição da síntese de E2,
pois a inibição da via GMPc estimulou um aumento de cerca de 20 % da síntese de E2
em relação ao controle, enquanto, aproximadamente, 50% do aumento da síntese de
E2 em relação ao controle se deve ao efeito positivo do NO mediado pelo GMPc,
observado após a adição de 10-5 M de SNP. Estes resultados sugerem que a via
NO/GMPc não está envolvida na regulação da síntese de E2, mas pode existir um outro
mecanismo que regula negativamente a síntese de E2 via GMPc indepentente do NO,
ainda não elucidado.
Apesar dos resultados serem conflitantes, já foi demonstrado que existe uma
regulação por parte dos esteróides sobre a síntese do GMPc. Foi demonstrado que a
P4 e o E2 estimulam a síntese de GMPc em células pancreáticas (ROPERO et al.,1999)
e em CGs de mulheres (SIROTKIN et al., 1995), respectivamente. Assim, verifica-se
que existe uma relação positiva e negativa entre estes hormônios e o GMPc. Mais
estudos são necessários para se avaliar a regulação autócrina/parácrina da
esteroidogênese nas CG de bovinos pela P4 e E2 via GMPc.
Tem sido sugerido que o GMPc diminuí a concentração de AMPc pela ativação
da fosfodiesterase-AMPc (PDE-AMPc), que cliva o AMPc (MACFARLAND et al., 1991).
Entretanto, os sistemas celulares possuem duas classes de PDE, uma classe
designada PDE 2, que é estimulada pelo GMPc, e outra classe PDE 3 que é inibida
pelo GMPc (CONTI et al., 1995). Nas células, onde os sistemas AMPc e GMPc agem
sinergicamente, a PDE 3, é inibida pelo NO e GMPc, resultando no aumento do AMPc
e ativação da via dependente de AMPc (DRAIJER et al., 1995; KURTZ et al., 1998). Ao
contrário, a ativação da PDE 2 pelo NO leva à hidrólise do AMPc (MACFARLAND et
al., 1991). Assim, as interações entre GMPc e AMPc, induzidas pelo NO, podem ser
sinérgicas ou antagônicas.
119
No ovário, observou-se que os oócitos expressam a PDE 3, e as CGs, a PDE
4 (TSAFRIRI et al., 1996). A regulação da PDE 2 no ovário não está relatada. Assim,
fica claro que outros componentes da via de sinalização GMPc devem ser elucidados
para o entendimento das ações do NO via GMPc e AMPc. Em adição, o efeito do
análogo do GMPc (bromo GMPc) e doador de NO (SNP) na inibição da apoptose das
CGs já foi verificado em folículos em estádio inicial antral (CHUN et al., 1995) e antrais
em todos os estádios de desenvolvimento em ratas (MCGEE et al. (1997).
O E2 (HSUEH et al., 1994) e o GMPc (CHUN et al., 1995; MCGEE et al., 1997)
vêm sendo considerados como um dos fatores anti-apoptóticos das CGs, enquanto a
P4 vem sendo relacionado à apoptose das CGs. Além disso, durante o
desenvolvimento folicular em mulheres submetidas à superovulação, ocorre um
aumento da concentração de nitrito/nitrato paralelo ao desenvolvimento folicular
(ANTEBY et al., 1996). Já é bem estabelecido que o desenvolvimento folicular é
correlacionado com a síntese de E2. Assim, concentrações menores de NO parecem
estar envolvidas na regulação negativa da P4, por mecanismos não elucidados no
presente experimento, e positiva da síntese de E2 via GMPc, provavelmente, este
mecanismo pode estar envolvido na maturação folicular e proteção das CGs via GMPc.
A discrepância entre os resultados do presente estudo com alguns dados
encontrados na literatura pode ser devido a algumas diferenças relevantes existentes
entre o sistema de cultivo utilizado e os sistemas utilizados em outros experimentos.
BASINI et al. (1998), visando a verificar o efeito do NO nas CGs, utilizaram sistema de
cultivo com soro fetal bovino (SFB) e, posteriormente, utilizaram um sistema de cultivo
livre de SFB, contendo BSA, porém sem adição de insulina (BASINI et al., 2000).
O soro fetal bovino induz a luteinização das CGs (GUTIERREZ et al., 1997) e
o BSA contém colesterol, testosterona, progesterona, vários fatores de crescimento e
outros componentes não determinados, além da variação da concentração destes
componentes por ser um material biológico (WANG et al., 1977; MAURER, 1992,
KESKINTEPE e BRACKETT, 1996, MINGOTI et al., 2002). MINGOTI et al. (2002)
demonstraram uma diminuição da síntese de E2 pelas células do cumulus quando o
complexo cumulus-oócito (COC) de bovinos foi maturado em meio de cultivo
120
suplementado
com
testosterona,
sugerindo
que
concentrações
elevadas
de
testosterona podem inibir a síntese de E2. Portanto, o meio de cultivo suplementado
com BSA aumenta a concentração de andrógenos além da adicionada no meio de
cultivo, que pode exercer um efeito negativo sobre a síntese de E2 e, assim, interferir
nos resultados. A insulina possui grande importância nos sistemas de cultivo, pois
mantém a atividade esteroidogênica das CGs (GUTIERREZ et al., 1997).
O sistema de cultivo utilizado no presente estudo substituiu o SFB e BSA por
PVA. Além disso, foram retirados as hemácias e macrófagos que, sabidamente,
interferem na esteroidogênese e síntese de NO (BECKMANN et al., 1991; Shakil et al.,
1994). Como demonstrado, o modelo de cultivo foi eficaz em manter as mesmas
características morfológicas de células da granulosa esteroidogenicamente ativas,
descritas por GUTIERREZ et al. (1997), como: forma arredondada e formação de
grupos celulares ancorados ao fundo da placa por células semelhantes a um
fibroblasto.
CONCLUSÕES
Diante disto, os resultados do presente estudo, utilizando este sistema de
cultivo, sugerem que concentrações mais baixas de NO podem regular negativamente
a síntese de P4 por via independente de GMPc, entretanto, os resultados também
demonstraram que esta via está envolvida na regulação positiva da síntese de P4 por
fatores não elucidados. Ao contrário destes achados, este experimento mostrou que a
via NO/GMPc encontra-se envolvida na síntese E2, porém, esta via também parece ser
utilizada para inibir a síntese de E2 por mecanismos independentes do NO.
Concentrações de NO mais elevadas neste experimento tiveram efeito citóxico, e
parecem, inicialmente, induzir uma inativação da função mitocondrial e depois
fragmentação do DNA, levando à morte celular das CGs por injúria celular ou
apoptose, além de inibirem a síntese de P4 e E2. Assim, o NO pode estar envolvido na
regulação
da
esteroidogênese
e
diferenciação
das
GCs
por
mecanismos
121
independentes ou não do GMPc, mas também no processo de apoptose e /ou necrose
celular.
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
ANTEBY, E. Y, HURWITZ, A., KORACH, O., REVEL, A., SIMON, A., FINCI-YEHESKEL,
Z., MAYER M., LAUFER, N. (1996) Human follicular nitric oxide pathway: relationship
to follicular size, oestradiol concentrations and ovarian blood flow. Hum Reprod., 11:
1947-1951.
BASINI G., BARATTA, M., PONDERATO, N., BUSSOLATI, S., TAMANINI, C. (1998) Is
nitric oxide an autocrine modulator of bovine granulosa cell function? Reprod Fertil
Dev., 10: 471-478.
BASINI, G., GRASSELLI, F., PONDERATO, N., BUSSOLATI, S., TAMANINI, C. (2000)
Lipid hydroperoxide and cGMP are not involved in nitric oxide inhibition of
steroidogenesis in bovine granulosa cells. Reprod Fertil., 12:289-295.
BECKMANN, M. W., POLACEK, D., SEUNG, L., SCHREIBER, J.R. (1991) Human
ovarian granulosa cell culture: determination of blood cell contamination and
evaluation of possible culture purification steps. Fertil Steril., 56: 881-887.
BLONDIN, P., DUFOUR., M, SIRARD, M. (1996) Analysis of atresia in bovine follicles
using different methods: Flow cytometry, enzyme-linked immunosorbent assay, and
classic histology. Biol Reprod., 54:631-637.
BONELLO, N., MCKIE, K., JASPER, M., ANDREW, L., ROSS, N., BRAYBON, E.,
BRÄNNSTROM, M., NORMAN, R. J. (1996) Inhibition of nitric oxide: Effects on
interleukin-1β-enhanced ovulation rate, steroid hormones, and ovarian leukocyte
distribution at ovulation in rat. Biol. Reprod., 54:436-445.
122
CHUN, S.Y., EISENHAUER, K. M., KUBO, M., HSUEH, A. J. W. (1995) Interleukin-1β
suppresses apoptosis in rat ovarian follicles by increasing nitric oxide production.
Endocrinology, 136:3120-3127.
CLEMENTI, E., BROWN, G. C., FOXWELL, N., MONCADA, S. (1999). On mechanism
by which vascular endothelial cells regulate their oxygen consuption. Proc Natl
Acad. USA. 96:1559-1562.
CONTI, M., NEMOZ, G., SETTE, C., VICINI, E. (1995) Recent progress in
understanding the hormonal regulation of phosphodiesterases. Endocr Rev.,
16:370-389.
DONG, Y-L., GANGULA, P. R. R., FANG, L., YALLAMPALLI, C. (1999) Nitric oxide
reverses prostaglandin-induced inhibition in ovarian progesterone secretion in rats.
Hum Reprod., 14: 27-32.
DRAIJER, R. J., ATSMA, D. E., VAN DER LAARSE, A., VAN HINSBERG, V. W. (1995)
cGMP and nitric oxide modulate thrombin-induced endothelial permeability.
Regulation via different pathways in human aortic and umbilical vein endothelial
cells. Circulation Res., 76:199-208.
GENARO, A. M., HORTELANO, S., ALVAREZ, A., MARTINEZ, C., BOSCA, L. (1995)
Splenic B lymphocytes programmed cell death is prevented by nitric oxide release
thoug mechanisms involving sustained Bcl-2 levels. J. Clin. Invest., 95:1884-1890.
GORE-LANGTON, R.E., ARMSTRONG, D.T. (1994) Follicular steroidogenesis and its
control In: Knobil, E., Neill, J.D (eds.). The Physiology of Reproduction. New York:
Raven Press, p. 331-385.
GRASSELLI, F,, PONDERATO, N., BASINI, G., TAMANINI. (2001). Nitric oxide
synthase expression and nitric oxide/cyclic GMP pathway in swine granulosa cells.
Dom Anim Endocr,, 20: 241-252.
GRIMES, R. W., MATTON, P., IRELAND, J. J. (1987). A comparison of histological and
non-histological and non-histological indices of atresia and follicular function. Biol
Reprod 37: 82-88.
123
GUTIERREZ, C. G, CAMPBELL, B. K, WEBB, R. (1997) Development of a long-term
bovine granulosa cell culture system: Induction and maintenance of estradiol
production,
response
to
follicle-stimulating
hormone,
and
morphological
characterisics. Biol Reprod., 56:608-616.
HANAFY, K. A, KRUMENACKER, J. S, MURAD, F. (2001) NO, nitrotyrosine, and cyclic
GMP in signal transduction. Med Sci Monitor, 7:801-819.
HANKE, C. J., DREWTT, J. G., MYERS, C. R., CAMPBELL, W. B. (1998). Nitric oxide
inhibits
aldosterone
synthesis
by
a
guanylyl
cyclase-independent
effect.
Endocrinology, 139:4053-4060.
HSUEH, A. J. W., BILLIG, H., TSAFRIRI, A. (1994). Ovarian follicle atresia: A
hormonally controlled apoptotic process. Endocr Rev., 15: 707-724.
HURWITZ, A., HERNANDEZ, E.R., PAYNE, D.W., DHARMARAJAN, A.M., ADASHI,
E.Y. (1992) Interleukin-1 is both morphogenic and cytotoxic to cultured rat ovarian
cells: obligatory role for heterologous, contact-independent cell-cell interaction.
Endocrinology, 131:1643-1649.
IGNARRO, L. J. (1991) Signal transduction mechanism involving nitric oxide. Biochem.
Pharm., 41:485-490.
ISHIMARU, R. S., LEUNG, K. HONG, L. S., LAPOLT, P. S. (2001). Inhibitory effects of
nitric oxide on estrogen production and cAMP levels in rat granulosa cells cultures. J
Endocrinol, 168:249-255.
JANBLONKA-SHARIFF, A., OLSON, L.M (2000) Nitric oxide is essential for optimal
meiotic maturation of murine cumulus-oocyte complexes in vitro. Mol. Reprod. Dev.,
55:412-421.
JANBLONKA-SHARIFF, A., OLSON, L.M. (1997) Hormonal regulation of nitric oxide
synthases and their cell-specific expression during follicular development in the rat
ovary. Endocrinology, 138:460-468.
KESKINTEPE, L., BRACKETT, B. G. (1996) In vitro developmental competence of in
vitro-matured bovine oocytes fertilized and cultured in completely defined media.
Biol Reprod., 55: 33-339.
124
KURTZ, A., GOTZ, K. H, HAMANN, M., WAGNER, C. (1998) A stimulation of rennin
secretion by nitric oxide is mediated by phosphodiesterase3. Proc Natl Acad Sci
USA, 95: 4743-4747
LA POLT, P. S., HONG, L. S. (1995) Inibitory effects of superoxide dismutase and cyclic
guanosina 3’, 5’-monophosphate on estrogen production in cultured rat granulosa
cells. Endocrinology, 136: 5533-5539.
LEIST, M., SINGLE, B., NAUMANN, H., FAVA, E., SIMON, B., KUHNLE, S.,
NICOTERA, P. (1999) Inhibition of mitochondrial ATP generation by nitric oxide
switches apoptosis to necrosis. Exp. Cell. Res., 249: 396-403.
LI, H. Y., CHANG, S. P., YUAN, C. C., CHAO, H. T. (2001) Nitric oxide induces
apoptosis in endometrial epithelial cells in the presence of progesterone:
involvement of mitogen-activated protein kinase pathway. Mol. Hum. Reprod.,
7:755-763.
LIU, X., MILLER, M. J., THOMAS, D. D., LANCASTER, J. R (1998) Accelerated reaction
of nitric oxide with oxygen within th hydrophobic interior of biological membranes.
Proc. Natl. Acad. USA. 95:2175-2179.
MACFARLAND, R. T., ZELUS, B. D., BEAVO, J. A. (1991) High concentrations of a
cGMP-stimulated phosphodisterase mediate ANP-induced decreases in cAMP and
steroidogenesis in adrenal glomerulosa cells. J. Biol. Chem., 266:136-142.
MATSUMI, H., YANO, T., KOJI, T., OGURA, T., TSUTSUMI, O., TAKETANI, Y.,
ESUMI, H. (1998) Expression and localization of inducible nitric oxide synthase in
the rat ovary: A possible involvement of nitric oxide in the follicular development.
Biochem Biophys. Res. Communic., 243:67-72.
MAURER, H. R. (1992). Towards serum-free, chemical defined media for mammalian cell
culture. In: Freshney RI. (ed.) Animal Cell Culture: A Pratical Approach, 2 nd Edition,
Oxford University Press, Oxford, pp 15-46.
MCGEE, E., SPEARS, N., MINAMI, S., HSU, S., CHUN, S., BILLING, H., HSUEH, A. J.
W. (1997) Preantral ovarian follicles in serum-free cultue: suppression of apoptosis
after activation of the cyclic guanosine 3’,5’-monophosphate pathway and stimulation
125
of growth and differentiation by follicle-stimulating hormone. Endocrinology, 138:
2417-2424.
MCMAHON, T. J. (2002) Nitric oxide in the human respiratory cycle Nat. Med., 8:711717.
MINGONE, C. J., GUPTE, S. A., CHOW, J. L., AHMAD, M., ABRAHAM, N. G., WOLIN,
M. S. (2006) Am. J. Physiol. Lung. Cell. Mol. Physiol., 29:334-336.
MINGOTI GZ, GARCIA JM, ROSA E SILVA, A. A. M. (2002). Steroidogenesis in cumulus
cells of bovine cumulus-oocyte-complexus matured in vitro with BSA and diffetent
concentrations of steroids. Anim. Reprod. Sic., 69: 175-186, 2002.
MOSMANN, T. (1983) Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival:
application to proliferation and cytotoxicity assays. J. Immunol., 65, 55-63.
MURARD, F. (1999). Cellular signaling with nitric oxide and cyclic GMP. Braz J Med
Biol Res., 32: 1317-1327.
PICCINATO, C. A, MONTREZOR L. H, ROSA E SILVA A. A. M. Produção de óxido
nítrico: Padronização do modelo de cultura das células da granulosa de folículos
ovarianos bovinos. Anais da XV Reunião Anual da Sociedade de Transferência de
Embriões. (2000) Caldas Novas, Arq Fac Vet UFRGS, Porto Alegre, v. 28, P. 308
(supl)
RETTORI, V., GIMERO, M., LYSON, K., MCCANN, S. M (1992) Nitric oxide mediates
norepinephrine-induced prostaglandin E2 release from the hypothalamus. Proc.
Natl. Acad. Sci., 89:543-546.
RICART-JANÉ, D. L., LOBERA, M., LÓPEZ-TEJERO, D. (2002) Anticoagulants and
others preanalytical factors interfer in plasma nitrate/nitrite quantification by Griess
method. Nitric Oxide, 6:178-185.
ROPERO, A. B., FUENTES, E., ROVIRA, J. M. (1999) Non-genomic actions of 17beta
ostradiol in mouse pancreatic beta cells are mediated by a cGMP dependent protein
kinas. J. Physiol., 521:397-407.
126
ROSSELLI, M., KELLER, P. J., DUBEY, R. K. (1998) Role of nitric oxide in the biology,
physiology and pathophysiology of reproduction. Hum Reprod UP., 4:3-24
ROSSIG, L., FICHTLSHERER, B., BREITSCHOPF, K., HAENDELER, J., ZEIHER, A.
M. MULSCH, A., DIMMELER, S. (1999) Nitric oxide inhibits caspases-3 by Snitrosation in vivo. J. Biol. Chem., 274:6823-6826.
ROUILLIER, P., MATTON, P., DUFOUR, M, SIRARD, M. A., GUILBAULT, L. A. (1998)
Steroid production, cell proliferation, and apoptosis in cultured bovine antral and
mural granulose cells: Developmental of an in vitro model to study estradiol
production. Mol Reprod Dev., 50: 170-177.
ROUILLIER, P., MATTON, P., SIRARD, M. A., GUILBAULT, L. A. (1996) Folliclestimulating hormone-induced estradiol and progesterone production by bovine antral
and mural granulose cells cultured in vitro in a completely defined medium. J Anim
Sci., 74: 3012-3019.
SARTI, P., LENDARO, E., IPPOLITI, R., BELLELLI, A., BENEDETTI, P. A., BRUNORI,
M. (1999) Modulation of mitochondrial respiration by NO: investigation by single cell
fluorescence microscopy. FASED J., 13:191-197.
SAS (1996) Statistical Analysis.
SHAKIL, T., WHITEHEAD, S. S. (1994) Inhibitory action of peritoneal macrophages on
progesterone secretion from co-cultured rat granulose cells. Biol. Reprod., 50: 11831189.
SIROTKIN, A. V., MLYNCEK, J., LAVRINCIK, J. (1995) The ability of steroid hormones
to control cAMP and cGMP production by human granulose cells in culture. Cell.
Signal., 7:61-65.
SITARAMAYYA, A. (2002) Calcium-dependent activation of guanylate cyclase by
S100b. Adv. Exp. Med. Biol., 514:389-398.
SNYDER, G. D., BRENDT, D. S. (1992). Biological role of nitric oxide. Sci Am., 5: 2835.
127
SNYDER, G. D., HOLMES, R. W., BATES, J. N., VAN VOORHIS, B. J. (1996) Nitric
oxide inhibits aromatase activity: mechanisms of action. J. Steroid. Biochm. Mol.
Biol., 58:63-69.
VAN VOORHIS, B. J., DUNN, M. S, SNYDER, G. D, WEINER, C. P. 1994. Nitric oxide:
An
autocrine
regulator
of
human
granulosa-luteal
cell
steroidogenesis.
Endocrinology, 135: 1779-1806.
WANG, S., LIU, Y., HOLYOAK, G. R., BUNCH, T. D. (1997). The effects of bovine
serum albumin and fetal bovine serum on the development of pre- and postcleavage-stage bovine embryos cultured in modified CR2 and M199 media. Anim
Reprod Sci., 48: 37-45.
WHITEHEAD, S., LACEY, M. (1996) Inhibitory effect of peritoneal macrophages on
progesterone
release
from
co-cultured
ratgranulosa
cells
is
reversed
by
dexamethasone: evidence for an action independent of nitric oxide and distal to
cyclic adenosine 3`, 5`-monophosphate generation. Biol. Reprod., 54:1317-1325.
WINK, D. A., OSAWA, Y., DARBYSBIRE, J. F., JONES, C. R., ESHENAUR, S. C.,
NIMS, R. W. (1993) Inhibition of cytochomes P450 by nitric oxide and a nitric oxide –
releasing agent. Arch. Biochrm. Biophys., 300:115-123.
ZHANG, J., DAWSON, V., DAWSON, T., SNYDER, S. (1994) Nitric oxide activation of
poly(ADP-ribose) synthetase in neurotoxicity. Science 263:687-689.
128
5. CONCLUSÕES GERAIS
Trabalho I
1.
O FSH adicionado em doses fisiológicas a cada 24 h induz a diferenciação
das CGs em menos de 48 h, sem afetar a síntese de P4 e as características
morfológicas das CGs;
2.
O FSH não utiliza a via NO para induzir a diferenciação das CGs, pelo
menos
em
concentrações
fisiológicas
descritas
por
estimular
a
esteroidogênese das CGs de folículos pequenos em bovinos.
Trabalho II
1. O NO em baixa concentração possui efeito citoprotetor
2. O NO inibe a síntese de E2 e P4 e induz a proliferação das células da
granulosa, estando ligado à diferenciação das CG.
129
Trabalho III
1. O NO pode regular positivamente a síntese de E2 via GMPc e desta forma,
modular a diferenciação das CGs;
2. A síntese de P4 é modulada pelo NO, mas não pela via GMPc
3. O NO em concentração elevada possui efeito citotóxico e induz a
fragmentação do DNA.