PROGRAMA E CONTEÚDO TEÓRICO E PRÁTICO DAS MATÉRIAS DA
DISCIPLINA DE
BIOTECNOLOGIA DE CÉLULAS ANIMAIS
José António Henriques de Conde Belo
Faculdade de Engenharia de Recursos Naturais
Faro, Setembro de 2006
Biotecnologia de Células Animais 2006/07
BIOTECNOLOGIA DE CÉLULAS ANIMAIS
Engenharia Biotecnológica – FERN/UALG
2005/2006
DOCENTE: Prof. Doutor José António Belo
Gabinete 3.10; Telefone: #7040
EMAIL: [email protected] ;
1. AVALIAÇÃO DE CONHECIMENTOS
A avaliação dos conhecimentos da disciplina de Biotecnologia de Células Animais
poderá ser feita por exame final ou por frequência. O exame ou testes contabilizam 70%
da nota final, sendo os restantes 30% o resultado da avaliação do relatório final das
aulas práticas (20%) e da avaliação do seminário (10%).
2. PROGRAMA TEÓRICO
CAPÍTULO 1)
O desenvolvimento da tecnologia de células animais.
Vantagens da Cultura de Células
Desvantagens. Principais diferenças in vitro.
Definição de tipos de cultura de tecidos.
Biologia da célula em cultura.
CAPÍTULO 2)
Desenho e distribuição do laboratório.
Equipamento necessário.
Tecnicas assépticas.
Normas de segurança e perigos biológicos.
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Biotecnologia de Células Animais 2006/07
CAPÍTULO 3)
O ambiente de cultura: Substrato, Fase de Gás, Meio e Temperatura.
CAPÍTULO 4)
Preparação e esterilização.
Desagregação do tecido e cultura primária.
Manutenção da cultura: linhas celulares.
Clonagem e selecção de linhas celulares específicas.
CAPÍTULO 5)
Caracterização de linhas celulares.
Disponibilidade e obtenção de linhas celulares.
Estabelecimento de linhas celulares: imortalização por transfecção.
CAPÍTULO 6)
Contaminação.
Quantificação e desenho experimental.
CAPÍTULO 7)
Hibridação celular e Hibridomas.
Produção de anticorpos monoclonais.
Tissue Engineering (Culturas tridimensionais).
CAPÍTULO 8)
Embryonic Stem (ES) Cell Technology – alteração dirigida e estável do património
genetico do ratinho.
Isolamento de Células Estaminais Embrionárias de ratinho.
Inactivação dirigida de genes usando estas células.
CAPÍTULO 9)
Isolamento de Células Estaminais Embrionárias humanas.
Utilização em engenharia de tecidos humanos.
Considerações científicas, biomédicas e éticas.
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Biotecnologia de Células Animais 2006/07
3. PROGRAMA PRÁTICO
PROTOCOLO 1. Apresentação do curso prático
Duração: 1 aula (três horas)
Considerações gerais sobre o laboratório de cultura de tecidos e procedimentos gerais de
laboratório.
PROTOCOLO 2. Técnicas básicas para o manuseamento e cultura de células de
mamífero (ratinho).
Duração: 5 aulas (15 horas)
Aprendizagem de técnicas básicas em cultura de células de mamífero com o intuito do
crescimento e manutenção em cultura deste tipo de células e comparação de diferentes
métodos de contagem utilizados nestas células.
PROTOCOLO 3. Isolomento e manutenção de uma cultura primária de fibroblastos
de ratinho.
Duração: 2 aulas (seis horas)
Aprendizagem de técnicas básicas utilizadas no estabelecimento de culturas primárias.
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Biotecnologia de Células Animais 2006/07
4. BIBLIOGRAFIA
4.1. Livros gerais para apoio às aulas teóricas
General Techniques of Cell Culture (Handbooks in Practical Animal Cell Biology),
November 1997.
Maureen A. Harrison, Ian F. Rae, Ann Harris (Preface)
Cambridge Univ Pr (Pap Txt); ISBN: 052157496X
Engenharia genética – Princípios e aplicações, 2001
Arnaldo Videira (ed.)
Lidel. Lisboa; ISBN: 972-757-163-8
Animal Cell Culture Methods (Methods in Cell Biology, Vol 57), June 1998.
David Barnes (Editor), Jennie P. Mather (Editor)
Academic Pr; ISBN: 0124800408
Culture of Animal Cells – A Manual of Basic Technique, 1994
R. Ian Freshney
Third Edition
Wiley-Liss, Inc.
Animal Cell Culture (A Practical Approach), 2000.
John R. W. Masters (Editor)
Third Edition
Oxford University Press
Gene Targeting (A Practical Approach), 2000
Alexandra L. Joyner (Editor)
Second Edition
Oxford University Press
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Biotecnologia de Células Animais 2006/07
4.2. Livros gerais para apoio às Aulas Práticas
Cells – A Laboratory Manual, 1998
Vol.1: Culture and Biochemical Analysis of Cells.
David L. Spector, Robert D. Goldman and Leslie A. Leinwand
Cold Spring Harbor Laboratory Press.
Essential Developmental Biology (A Practical Approach), 1993.
Claudio D. Stern and Peter W. H. Holland (Editors)
Oxford University Press
Mammalian Cell Biotechnology (A Practical Approach), 1991.
M. Butler (Editor)
Oxford University Press
4.3. Endereços de Internet de revistas internacionais com interesse para a disciplina
Motor de busca bibliográfica PubMed OnLine http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed
American Journal of Human Genetics http://genetics.faseb.org/genetics/ashg/ashgmenu.htm
Annual Review of Cell and Developmental Biology http://www.annualreviews.org/catalog/2005/cb21.asp
Annual Review of Biomedical Engineering http://www.annualreviews.org/catalog/2005/be07.asp
BioEssays - http://www3.interscience.wiley.com/cgi-bin/jhome/34201
Biotechnology Advances - http://www.sciencedirect.com/science/journal/07349750
Biotechnology and Bioengineering –
http://www3.interscience.wiley.com/cgi-bin/jhome/71002188
Cell - http://www.cell.com/
Current Opinion Cell Biology http://www.sciencedirect.com/science/journal/09550674
EMBO Journal - http://embojournal.npgjournals.com/
Experimental Cell Research - http://www.sciencedirect.com/science/journal/00144827
Journal of Biotechnology - http://www.sciencedirect.com/science/journal/01681656
Journal of Cell Biology - http://www.jcb.org/
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Journal of Cell Science - http://jcs.biologists.org/current.shtml
Molecular Biology of the Cell - http://www.molbiolcell.org/current.shtml
Nature - http://www.nature.com/
Reviews in Molecular Biotechnology http://www.sciencedirect.com/science/journal/13890352
Science - http://www.sciencemag.org/
Tissue and Cell - http://www.sciencedirect.com/science/journal/00408166
Transgenic Research - http://www.kluweronline.com/issn/0962-8819
Trends in Biotechnology - http://www.sciencedirect.com/science/journal/01677799
Trends in Cell Biology - http://www.sciencedirect.com/science/journal/09628924
4.4. Hiper-ligações para páginas Internet dedicadas à Biotecnologia Células Animais
American Society for Bone and Mineral Research - http://www.asbmr.org/
American Society for Cell Biology - http://www.ascb.org/
American Society for Microbiology - http://www.asmusa.org/
BioEngineering Research Group, IST, Lisboa - http://193.136.165.110/cebq/berg/
Biotech terms http://biotechterms.org/sourcebook/index_kc.phtml
Biotechnology and Biological Sciences Research Council (BBSRC) http://www.bbsrc.ac.uk/
Biotechnology Research Institute - http://www.bri.nrc.gc.ca
British Medical Research Council (MRC) Stem Cell Bank http://www.nibsc.ac.uk/divisions/cbi/stemcell.html
Departamento de Engenharia Biológica, UMinho - http://www.deb.uminho.pt/
European Federation of Biotechnology - http://www.efbweb.org/efb.htm
European Molecular Biology Laboratory - http://www.embl.de/
Harvard Stem Cell Institute - http://stemcell.harvard.edu/
Human Stem Cell Training Courses - http://www.isscr.org/science/courses.htm
Instituto Biologia Experimental e Tecnológica - http://www.ibet.pt/rnd.htm
Instituto Tecnologia Quimica e Biológica http://www.itqb.unl.pt/Research/Technology/Animal_Cell_Technology/
International Society for Stem Cell Research - http://www.isscr.org/index.htm
Medical Research Council (UK) - http://www.mrc.ac.uk/
National Center for Biotechnology Information - http://www.ncbi.nlm.nih.gov/
Riken Center for Development Biology - http://www.cdb.riken.jp/en/
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Sigma-Aldrich http://www.sigmaaldrich.com/Area_of_interest/Life_Science/Cell_Culture
Society for Developmental Biology - http://www.sdbonline.org
Stem Cell Research Foundation - http://www.stemcellresearchfoundation.org/
The Jackson Laboratory - http://www.jax.org/index.html
Tissue Engineering Society International - http://www.tesinternational.org/
Wellcome Trust - http://www.wellcome.ac.uk/
4.5. Bibliografia para apoio à elaboração do seminário
Os artigos para apresentação em seminário são préviamente escolhidos pelo pelo
professor. Grupos de dois alunos debruçam-se sobre cada um artigo específico, recente,
de acordo com o respectivo interesse, sob orientação e aconselhamento do professor.
Este artigo será depois apresentado em formato PowerPoint perante os restantes colegas
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Biotecnologia de Células Animais 2006/07
5. PROTOCOLOS DAS AULAS PRÁTICAS
AULA TEÓRICO-PRÁTICA 2
ARTIGOS PARA APRESENTAÇÃO E DISCUSSÃO
Jun Cheng, Amalia Dutra, Aya Takesono, Lisa Garrett-Beal and Pamela L.
Schwartzberg (2004). Improved Generation of C57BL/6J Mouse Embryonic Stem
Cells in a Defined Serum-Free Media. genesis 39:100–104
H.J. RIPPON, N.N. ALI, J.M. POLAK, and A.E. BISHOP (2004). Initial Observations
on the Effect of Medium Composition on the Differentiation of Murine Embryonic
Stem Cells to Alveolar Type II Cells. Cloning and Stem Cells 6 (2): 49-56.
A. VON DRYGALSKI, G. ALESPEITI, L. REN and J.W. ADAMSON (2004). Murine
Bone Marrow Cells Cultured Ex Vivo in the Presence of Multiple Cytokine
Combinations Lose Radioprotective and Long-Term Engraftment Potential. STEM
CELLS AND DEVELOPMENT 13:101–111.
Jason S. Meyera, Martin L. Katzb, Joel A. Maruniaka, Mark D. Kirk (2004). Neural
differentiation of mouse embryonic stem cells in vitro and after transplantation into
eyes of mutant mice with rapid retinal degeneration. Brain Research 1014: 131–
144.
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Biotecnologia de Células Animais 2006/07
AULA TEÓRICO-PRÁTICA 3.
ARTIGOS PARA APRESENTAÇÃO E DISCUSSÃO
Anton Novak, Caiying Guo, Wenyi Yang, Andras Nagy and Corrinne G. Lobe (2000).
Z/EG, a Double Reporter Mouse Line That Expresses Enhanced Green Fluorescent
Protein Upon Cre-Mediated Excision. genesis 28:147–155.
Petra Pennekamp,1 Christina Karcher,Anja Fischer, Axel Schweickert, Boris Skryabin,
Jurgen Horst,Martin Blum and Bernd Dworniczak (2002). The Ion Channel
Polycystin-2 Is Required for Left-Right Axis Determination in Mice. Current
Biology, Vol. 12, 938–943, June 4
Tel/Etv6 is an essential and selective regulator of adult hematopoietic stem cell survival
(2004). Hanno Hock, Eliza Meade, Sarah Medeiros, Jeffrey W. Schindler, Peter
J.M. Valk, Yuko Fujiwara and Stuart H. Orkin. GENES & DEVELOPMENT
18:000–000.
Christopher B. Brown, Jennifer M. Wenning, Min Min Lu, Douglas J. Epstein, Erik N.
Meyers, and Jonathan A. Epstein (2004). Cre-mediated excision of Fgf8 in the Tbx1
expression domain reveals a critical role for Fgf8 in cardiovascular development in
the mouse. Developmental Biology 267: 190–202.
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Biotecnologia de Células Animais 2006/07
PROTOCOLO 2. Técnicas básicas para o manuseamento e cultura de células de
mamífero (Humanas).
Duração: 5 aulas (15 horas)
Aprendizagem de técnicas básicas em cultura de células de mamífero e comparação de
diferentes métodos de contagem utilizados nestas células.
Prática 1+2
Objectivo:
Esta aula prática tem como objectivo a aprendizagem de técnicas básicas de
manuseamento de culturas de células animais dependentes de ligação para o
crescimento e a comparação de diferentes métodos de contagem utilizados com este tipo
de células.
Material, células e meios:
Lista de reagentes
Glutamina
Gibco/BRL# 043-05030 D
Penicilin/Streptomycin (10,000 U cada)
Gibco/BRL# 15140-114
Trypsin/EDTA (10X)
Gibco/BRL# 35400-027
PBS (sem cálcio e magnésio)
Gibco/BRL# 14190-094
Calf Serum (Heat Inactivated)
Gibco/BRL# 26170-043
DMEM
Gibco/BRL# 41965-039
Material
Hemocitómetros para células animais
Banho de água a 37ºC
Tubos Eppendorf esterilizados
Pipetas de vidro esterilizadas com algodão (1, 5 e 10 ml)
Pipetas de Pasteur esterilizadas com algodão
Pontas para micropipetas de 1000 µl e 200 µl esterilizadas
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Células
T-flasks pequenos com monocamada confluente de células HELA, células humanas
epiteliais provenientes de uma linha celular imortalizada, no final da fase exponencial
de crescimento
Meios de Cultura, aditivos, tampões, enzimas e corantes
Meio DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium)
Solução de Glutamina 200 mM
Soro
Solução de Tripsina
Solução salina (NaCl 9g/l)
Azul de triptano
Violeta de cristal
ATENÇÃO: todos os meios, aditivos e soluções estão esterilizadas. Todo o trabalho
com células e soluções que vão estar em contacto com células deve ser feito na câmara
de fluxo laminar em condições de assépsia. Deve-se passar à chama e deixar arrefecer
todo o material de vidro que vai estar em contacto com células e soluções. As
colorações e contagens podem ser feitas fora do fluxo laminar.
Preparação de meios
Fazer as adições necessárias de modo a obter um volume final de 20 ml de meio
DMEM com 10% (V/V) de soro, 4 mM de glutamina. Se o meio já estiver preparado
apresentar no relatórios os cálculos dos volumes de meio base, soro e do stock de
glutamina que tinham que adicionar para obtenção do meio de cultura pretendido.
Todos os meios e soluções que vão estar em contacto com as células devem estar a
37ºC.
“Passagem” ou “manutenção” de uma linha celular dependente de
ligação para o crescimento
1. Abrir o T-flask na câmara de fluxo. Colocar o T-flask em pé;
2. Retirar o meio de cultura que cobre as células com uma pipeta e deitar fora;
3. “Lavar” as células com 4 ml de PBS em alternativa adicionando o tampão muito
suavemente na parede do T-flask oposta á monocamada de células. Lavar a
monocamada e retirar o tampão. Repetir esta operação mais uma vez;
4. Adicionar 1 ml da solução de Tripsina. Fechar o T-flask e esperar de 3 a 5 minutos
se possível na cmara de incubação a 37ºC. Agitar suavemente e verificar se as
células se estão a soltar.
5. Quando as células se soltarem da superfície adicionar 9 ml de meio DMEM com
aditivos e homogeneizar utilizando uma pipeta de 5 ml;
6. “Passar” para 2X T-flask pequenos 1 ml da suspensão celular e adicionar a cada um
deles 4 ml de meio. Colocar na incubadora a 37ºC após saturar a atmosfera do T-
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Biotecnologia de Células Animais 2006/07
flask com uma mistura de 5% CO2 em ar utilizando uma pipeta de Pasteur com
algodão.
7. Identificar 2 tubos eppendorf com A e V. Retirar para cada um dos tubos 500 µl da
suspensão celular.
8. Observar o T-flask durante 5-7 dias em nicroscópio invertido.
Contagens Celulares:
•
Número de núcleos (células totais)
Centrifugar o tubo V a 200 x g durante 10 minutos. Desprezar o sobrenadante e
resuspender o pellet em 200 µl de Nacl. Adicionar 200 µl de violeta de cristal e agitar.
Incubar a 37ºC durante 1 h - 2 h. Encher as células do hemocitometro e contar os
núcleos.
•
Número de células viáveis
Retirar 100 µl do tubo A para outro eppendorf e adicionar 100 µl de azul de triptano.
Esperar 5 minutos e contar as células viáveis (transparentes) e não viáveis (azuis) no
hemocitometro utilizando microscopia de contraste de fase.
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Biotecnologia de Células Animais 2006/07
Prática 3
OBJECTIVOS: Expansão em cultura de células HeLa, células humanas epiteliais
provenientes de um alinha celular imortalizada.
1- Observar as Células HeLa em cultura desde a aula anterior. Anotar características das
células, grau de confluência, cor do meio, etc.
2- Preparar 4 frascos TC 6cm.
3- Tratar com 2 mL tripsina/EDTA os dois frascos com as culturas da aula anterior.
Incubar 10 min.
4- Pegar nas placas TC 6cm no qual células HeLa tenham estado em, abrir a tampa e
aspirar por vacuo o meio de cultura (evitando tocar na superfície de crescimento).
5- Adicionar a cada frasco 5 mL de PBS. Lavar cuidadosamento por oscilação a
superfície onde as células estao aderentes.
6- Aspirar o PBS. Adicionar a cada frasco 2 mL de 1X tripsina/EDTA.
7- Fechar os frascos TC 6cm e colocar-los em posição de incubação permitindo a
distribuição uniforme da tripsina por toda a área de crescimento das HeLa.
8- Incubar 10 min a temperatura ambiente
9- Adicionar 2 mL de meio DMEM a cada frasco TC. Lavar cuidadosamente a
superfície de crescimento por pipetamento e recolher a totalidade do liquido+Células
para um tubo esteril de 50 mL.
10- Adicionar meio DMEM ate perfazer um total de 20 mL.
11 Adicionar 5 mL a cada uma dos frascos cultura 6cm préviamente identificados.
12- Tapar os frascos e colocar a incubar na estufa a 37º C, 5% CO2
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Biotecnologia de Células Animais 2006/07
Prática 4
OBJECTIVOS: Teste do efeito de utilização de diversas drogas no crescimento e
viabilidade das Células Hela em cultura.
Nota: Geneticina (G418) e Mitomicina C sao substancias tóxicas por contacto e por isso
a utilização de luvas e obrigatória bem como extremo cuidado no manuseamento
durante todo o procedimento.
1- Observar as Células HeLA em cultura desde a aula anterior. Anotar características
das células, grau de confluência, cor do meio, etc.
2- Marcar os 4 frascos de A a D.
3- Mudar o meio dos frascos A e B com novo DMEM. Suplementar o meio no frasco B
com Geneticina (G418). Incubar na estufa a 25º C.
4- Ás placas C e D suplementar o meio de cultura com 25% e 100% de Mitomicina C
respectivamente. Incubar por 2 horas.
5- Aspirar o meio dos frascos C e D. Lavar 2X com PBS. Adicionar a cada placa 5 mL
de DMEM. Incubar na estufa a 37º C, 5% CO2.
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Prática 5
OBJECTIVOS: Observação do efeito de utilização de diversas drogas no crescimento e
viabilidade das Células HeLa em cultura.
Nota: Geneticina (G418) e Mitomicina C são substancias tóxicas por contacto e por isso
a utilização de luvas e obrigatória bem como extremo cuidado no manuseamento
durante todo o procedimento.
1- Observar as Células HeLa em cultura desde a aula anterior. Anotar
características das células, grau de confluência, cor do meio, etc.
2- Tratar com 2 mL tripsina/EDTA os 4 frascos com as culturas da aula anterior.
Incubar 10 min.
3- Adicionar 1 mL de meio DMEM a cada um dos frascos TC. Lavar
cuidadosamente a superfície de crescimento por pipetamento e recolher a
totalidade do liquido+Células de cada frasco TC para um tubo estéril de 15 mL.
4- Contar o numero de células por tubo utilizando um Hematocitometro.
5- Comparar as diversas contagens relacionando com o efeito esperado das drogas
utilizadas no crescimento e viabilidade celular.
CONTAGENS
1.
Abrir o T-flask na câmara de fluxo. Colocar o T-flask em pé;
2.
Retirar o meio de cultura que cobre as células com uma pipeta e deitar fora;
3.
“Lavar” as células com 4 ml de PBS em alternativa adicionando o tampão muito
suavemente na parede do T-flask oposta á monocamada de células. Lavar a
monocamada e retirar o tampão. Repetir esta operação mais uma vez;
4.
Adicionar 1 ml da solução de Tripsina. Fechar o T-flask e esperar de 3 a 5
minutos se possível na cmara de incubação a 37ºC. Agitar suavemente e verificar se as
células se estão a soltar.
5.
Quando as células se soltarem da superfície adicionar 9 ml de meio DMEM com
aditivos e homogeneizar utilizando uma pipeta de 5 ml;
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Biotecnologia de Células Animais 2006/07
6.
“Passar” para um T-flask pequeno 1 ml da suspensão celular e adicionar 9 ml de
meio. Colocar na incubadora a 37ºC após saturar a atmosfera do T-flask com uma
mistura de 5% CO2 em ar utilizando uma pipeta de Pasteur com algodão.
7.
Identificar 2 tubos eppendorf com A e V. Retirar para um dos tubos 500 µl da
suspensão celular.
8.
Contar de novo o numero de núcleos e o número de células viáveis utilizando as
técnicas de violeta de cristal e de azul de triptano respectivamente, como indicado no
protocolo da aula anterior.
Apresentação de Resultados:
Comparar os diferentes métodos de contagem celular.
Cálculos:
CALCULAR QUANTAS CÉLULAS VIÁVEIS FORAM INOCULADAS NO T-FLASK.
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Biotecnologia de Células Animais 2006/07
PROTOCOLO 3. Isolomento e manutenção de uma cultura primária de fibroblastos
de ratinho.
Duração: 2 aulas (seis horas)
Aprendizagem de técnicas básicas utilizadas no estabelecimento de culturas primárias.
Prática 6
Este protocolo pode ser utilizado com embriões de ratinho, rato, hamster e galinha.
Neste caso específico a espécie utilizada será o ratinho. È recomendável obter embriões
entre 11-13 dias de gestação, pois a este estadio os embriões contém um número óptimo
de células indiferenciadas de mesenquima, de onde as células com características de
fibroblastos são derivadas.
1. Sacrificar a ratinha grávida utilizando métodos apropriados.
2. Imediatamente esfregar o animal com 70% etanol numa camara estéril.
3. Utilizando tesouras e pinças estéreis, abrir o abdomen e remover o útero
contendo os embriões. Transferir para uma placa de petri esterilizada.
4. Remover as membranas, a cabeça e as visceras. Lavar os embriões em PBS,
mudando o líquido até a solução se apresentar límpida.
5. Transferir 6-8 embriões para uma nova placa e cortar em pedaços bastante
pequenos. Lavar com PBS.
6. Transferir os pedaços de embrião para um frasco de 500 mL com uma barra de
agitação. Adicionar 200 ml de 0.25% tripsina em HBSS GIBCO/BRL). Agitar
num incubador a 37ºC durante 15 minutos.
7. Parar a agitação e permitir que os blocos maiores de tecido assentem no fundo
do frasco por gravidade. Remover a solução contendo as células em suspensão
para um tubo estéril de centrifuga contendo 1 mL de soro de vitelo por cada 1o
mL de suspensão (para inactivar a tripsina).
8. Centrifugar durante 5 minutos a 1200 rpm, e remover o sobrenadante.
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Biotecnologia de Células Animais 2006/07
9. Ressuspender o pellet em PBS e centrifugar de novo como em 8.
10. Ressuspender o pellet em 10 mL de DMEM contendo 10% de soro de vitelo e
antibióticos, a´te um volume final de 100 mL.
11. Para determinar a concentração de células presentes, adicionar 0.2 mL da
suspensão a 1.8 mL de 1% ácido acético (para lisar eventuais glóbulos
vermelhos presentes) e contar no hematócitometro.
12. Plaquear as células a uma densidade de 1-4X107 por placa de 100mm contendo
10 mL de meio de cultura. Incubar a 37ºC em 5% de CO2.
Prática 7
1.
Abrir a placa na câmara de fluxo.
2.
Retirar o meio de cultura que cobre as células com uma pipeta e deitar fora;
3.
“Lavar” as células com 4 ml de NaCl 9g/l (pode ser PBS em alternativa)
adicionando o tampão muito suavemente na parede da placa. Lavar a monocamada e
retirar o tampão. Repetir esta operação mais uma vez;
4.
Adicionar 1 ml da solução de Tripsina. Fechar a placa e esperar de 3 a 5 minutos
se possível na cmara de incubação a 37ºC. Agitar suavemente e verificar se as
células se estão a soltar.
5.
Quando as células se soltarem da superfície adicionar 9 ml de meio DMEM com
aditivos e homogeneizar utilizando uma pipeta de 5 ml.
6.
Identificar 2 tubos eppendorf com A e V. Retirar para um dos tubos 500 µl da
suspensão celular.
Contagens Celulares:
•
Número de núcleos (células totais)
Centrifugar o tubo V a 200 x g durante 10 minutos. Desprezar o sobrenadante e
resuspender o pellet em 200 µl de Nacl. Adicionar 200 µl de violeta de cristal e agitar.
Incubar a 37ºC durante 1 h - 2 h. Encher as células do hemocitometro e contar os
núcleos.
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•
Número de células viáveis
Retirar 100 µl do tubo A para outro eppendorf e adicionar 100 µl de azul de triptano.
Esperar 5 minutos e contar as células viáveis (transparentes) e não viáveis (azuis) no
hemocitometro utilizando microscopia de contraste de fase.
Apresentação de Resultados:
Comparar os diferentes métodos de contagem celular.
Cálculos:
CALCULAR QUANTAS
CÉLULAS VIÁVEIS FORAM INOCULADAS EM CADA PLACA DE
100
MM.
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