INSTITUTO OSWALDO CRUZ
Doutorado em Biologia Celular e Molecular
Influência da variabilidade genética humana dos genes
NAT2, CYP2E1, GSTM1 e GSTT1 na ocorrência de reações
adversas hepáticas induzidas pela isoniazida em pacientes
com tuberculose ativa
RAQUEL LIMA DE FIGUEIREDO TEIXEIRA
Rio de Janeiro
2009
Ministério da Saúde
Fundação Oswaldo Cruz
Instituto Oswaldo Cruz
Curso de Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular
RAQUEL LIMA DE FIGUEIREDO TEIXEIRA
Influência da variabilidade genética humana dos genes NAT2, CYP2E1, GSTM1
e GSTT1 na ocorrência de reações adversas hepáticas induzidas pela isoniazida
em pacientes com tuberculose ativa
Tese apresentada ao Instituto Oswaldo Cruz como
parte dos requisitos para obtenção do título de
Doutor em Biologia Celular e Molecular, na área
de Genética Molecular Humana.
Orientadores: Dr. Adalberto Rezende Santos
Dr. Antonio Basílio de Miranda
Este trabalho foi realizado no Laboratório de Biologia Molecular aplicada a Micobactérias e
no Laboratório de Genética Humana, ambos do Instituto Oswaldo Cruz - FIOCRUZ
RIO DE JANEIRO
2009
ii
Ministério da Saúde
Fundação Oswaldo Cruz
Instituto Oswaldo Cruz
Curso de Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular
Influência da variabilidade genética humana dos genes NAT2, CYP2E1,
GSTM1 e GSTT1 na ocorrência de reações adversas hepáticas induzidas
pela isoniazida em pacientes com tuberculose ativa
RAQUEL LIMA DE FIGUEIREDO TEIXEIRA
Orientadores: Dr. Adalberto Rezende Santos
Dr. Antonio Basílio de Miranda
Data da aprovação: 29 de abril de 2009
BANCA EXAMINADORA:
TITULARES:
Dra. Márcia Mattos Gonçalves Pimentel - UERJ
Dr. Marcus Barreto Conde- UFRJ
Dr. Marcelo Alves Ferreira - FIOCRUZ
SUPLENTES:
Dr. Harrison Magdinier Gomes - FIOCRUZ
Dr. Pedro Hernan Cabello - FIOCRUZ (revisor)
RIO DE JANEIRO, 29 DE ABRIL DE 2009
iii
INSTITUTO OSWALDO CRUZ
“Influência da variabilidade genética humana dos genes NAT2, CYP2E1, GSTM1 e GSTT1 na
ocorrência de reações adversas hepáticas induzidas pela isoniazida em pacientes com tuberculose
ativa”
RESUMO
Tese de doutorado
Raquel Lima de F. Teixeira
A isoniazida (INH), uma das principais drogas usadas no esquema de
tratamento de primeira linha anti-tuberculose (anti-TB), tem sido associada à intensificação de
efeitos adversos principalmente hepáticos. Sabe-se hoje, que variações polimórficas em genes
humanos codificando enzimas envolvidas na biotransformação de diferentes fármacos podem
contribuir para diferenças interindividuais na resposta farmacológica ou toxicológica de várias
drogas estando diretamente relacionadas aos desfechos de falha terapêutica e reações adversas
a drogas (ADRs). A INH é geralmente administrada de forma oral sendo metabolizada por
enzimas hepáticas. O mecanismo de lesão hepatocelular induzido pela isoniazida envolve as
enzimas de biotransformação N-acetiltransferase 2 e a mono-oxigenase CYP450 2E1.
Mutações pontuais na região codificante de NAT2 são capazes de alterar a atividade de
acetilação da enzima gerando três possíveis fenótipos: acetiladores lentos, intermediários e
rápidos. Os indivíduos que apresentam uma acetilação lenta acumulam intermediários
hepatotóxicos levando a ocorrência de ADRs. Outra classe de enzimas cuja participação na
biotransformação da isoniazida vem sendo especulada é a glutationa S-transferase (GST).
Considerando a importância das variantes alélicas dos genes envolvidos na metabolização da
isoniazida e que suas frequências variam entre as diferentes etnias este trabalho teve como
objetivos principais: (i) análise descritiva da distribuição dos alelos de NAT2 em duas regiões
diferentes do Brasil; (ii) identificação de novas mutações e caracterização haplotípica de
novos alelos de NAT2 bem como análise estrutural da influência dessas alterações na estrutura
protéica de NAT2 e (iii) estudo de associação, caso-controle, entre as variáveis genéticas
presentes nos genes que codificam para NAT2, CYP2E1 e GSTs humanas, com a ocorrência
de reações adversas em pacientes com TB em tratamento com esquemas contendo isoniazida.
Dezessete SNPs previamente descritos foram identificados na população estudada, dos quais,
sete: 191G>A; 282C>T; 341T>C; 481C>T; 590G>A; 803A>G e 857G>A são os mais
frequentes na população mundial. Adicionalmente, seis mutações novas foram identificadas e
sete novos alelos de NAT2 circulantes no Rio de Janeiro e/ou Goiás foram caracterizados
através de clonagem e resequenciamento e experimentos de modelagem molecular. Nossos
resultados mostraram a predominância de alelos de NAT2 associados com o fenótipo de
acetilação lenta em indivíduos brasileiros e que a distribuição desses alelos varia
significativamente de acordo com a região brasileira estudada. Além disso, fomos capazes de
constatar que os acetiladores lentos apresentaram um risco significativamente maior em
desenvolver hepatotoxicidade (OR: 2,62; IC 95%: 1,75-3.49; p = 0.03) ou hepatite
medicamentosa (OR: 3,59; IC 95%: 2,53-4.64; p = 0,02) quando comparados aos acetiladores
intermediários/rápidos. Por outro lado, não observamos qualquer relação entre polimorfismos
nos genes CYP2E1, GSTM1 e GSTT1 com a ocorrência de ADRs durante tratamento anti-TB.
Sendo assim, nossos resultados sugerem a influência de variantes gênicas de NAT2 na
ocorrência de hepatotoxicidade durante o tratamento da tuberculose em indivíduos brasileiros
e que esses polimorfismos podem ser utilizados como ferramentas para predição desses
efeitos colaterais.
iv
INSTITUTO OSWALDO CRUZ
“Influência da variabilidade genética humana dos genes NAT2, CYP2E1, GSTM1 e GSTT1 na
ocorrência de reações adversas hepáticas induzidas pela isoniazida em pacientes com tuberculose
ativa”
ABSTRACT
Tese de doutorado
Raquel Lima de F. Teixeira
Isoniazid (INH), one of the most important drugs used in anti-TB treatment, is also the
major drug involved in hepatotoxicity. Genetic variability in several loci coding for drugmetabolizing enzymes can contribute to individual differences in drug response or toxicity
and have been attributed to therapeutic failure and adverse drug reactions (ADRs). INH is oral
administered and is metabolized by hepatic enzymes. The N-acetyltransferase 2 (NAT2) and
the monoxigenase CYP450 2E1 (CYP2E1) are involved in the mechanism of hepatic injury
induced by INH. NAT2 is a polymorphic gene and mutations in its coding region can alter its
enzymatic activity classifying individuals as slow, intermediate and fast acetylators. The slow
acetylators can accumulate hepatotoxic intermediates developing liver disorders. Glutathione
S-transferase (GST) is another enzyme supposed to play a protective role in INH
biotransformation. Considering the differences found in the NAT2, CYP2E1, GSTM1 and
GSTT1 alleles’ distribution among interethnic populations and their clinical importance in
INH biotransformation, our goal was (i) to describe the genetic profile of the NAT2 gene in
individuals from two different regions of Brazil: Rio de Janeiro and Goiás States; (ii) to
identify new NAT2 variants in Brazilian individuals resident of two different regions by direct
sequencing, and to characterize new haplotypes after cloning and re-sequencing as well as by
molecular modeling; and (iii) to evaluate the contribution of genetic variants of NAT2,
CYP2E1, GSTM1 and GSTT1 in the susceptibility to anti-TB drug-induced hepatotoxicity in
Brazilian individuals. Seventeen Single Nucleotide Polymorphisms (SNPs) already described
were identified in Brazilian individuals in which seven (191G>A; 282C>T; 341T>C;
481C>T; 590G>A; 803A>G and 857G>A) were the most common SNPs in world population
Moreover, six new mutations were identified and seven new haplotypes were characterized in
individuals resident in Rio de Janeiro and Goiás by cloning and re-sequencing and molecular
modeling experimental. Our results showed the high incidence of NAT2 alleles with low
activity in Brazilian individuals and the variability of their frequencies between the two
regions analyzed. Therefore, we could also observe that slow acetylation status was a risk
factor for both anti-TB drug-induced hepatotoxicity (OR, 2.62; 95% IC, 1.75-3.49; p = 0.03)
and hepatitis (OR, 3.59; 95% IC, 2.53-4.64; p = 0.02) when compared with intermediate/fast
acetylation. No significant association between CYP2E1, GSTM1 and GSTT1 genotypes and
liver side effects occurrence was observed. Even so, the results presented here support the
influence of the genetic factors in the occurrence of antituberculosis drug-induced liver
adverse reactions among Brazilians and can be used to predict these side effects.
v
À minha avó Margarida, que não se encontra mais entre nós, mas que sempre curtiu e
admirou meu sucesso profissional, e aos seus cinco irmãos que morreram de tuberculose, em
uma época em que a cura ainda era um desafio – a eles dedico esta obra.
vi
AGRADECIMENTOS
A Deus, por tudo que representa na minha vida, guiando-me e dando forças, iluminando
minhas mãos para que eu pudesse concluir esse trabalho. Obrigada Senhor por tudo que me
foi proporcionado nessa etapa da minha vida, vindo a contribuir para meu amadurecimento e
aumentando ainda mais minha fé em Ti.
À minha mãe Cristina e meus irmãos Alexandre e Gabriel, que amo tanto, pela paciência,
carinho e incentivo, durante todos esses anos dedicados à pesquisa, e a mais nova e querida
integrante da família, minha cunhada Adriana. Dri, obrigada pela força. Você é MARA!
Aos meus orientadores “Adalba” e “Antony de Mira”, pela oportunidade da realização desse
trabalho, pelas risadas, pelos chopps e, acima de tudo, por contribuírem de forma essencial
para minha formação profissional. Obrigada pelos ensinamentos científicos e de vida! Hoje,
eu perco dois orientadores, mas ganho dois grandes amigos!
Ao Dr. Pedro Cabello, meu chefe e amigo! Obrigada Pedro, por permitir que eu continuasse
no doutorado e concluísse esse trabalho após ter assumido o cargo de Pesquisadora Assistente
em seu laboratório. Obrigada pelas trocas diárias no convívio do laboratório e por sempre
acreditar no meu potencial. A você toda a minha gratidão;
Ao meu grande Amor, José Carlos Xavier, por ser meu companheiro, parceiro, cúmplice;
amante e amigo. Que essa felicidade que estamos vivendo agora permaneça em nossos
corações pelo resto de nossas vidas! TE AMO!
À minha nova família: aos meus sogros, Fátima e José Carlos, aos meus novos “vós” Alda e
José e aos meus cunhados queridos, Roberta e Carlos Henrique. Fátima, obrigada pelo carinho
e pela correção da tese, de acordo com as novas regras da língua portuguesa;
À minha “filha-aluna” Renata Morato, por estar ao meu lado, sempre se esforçando para a
conclusão dessa tese. Obrigada pela paciência e pelas incansáveis padronizações de PCRs,
seqüenciamento, purificação, etc. O sucesso é nosso! Te adoro!
À Marcinha, minha mãe-amiga que, mesmo de longe, sempre esteve disponível quando
precisei. Obrigada pelos ensinamentos, pelo carinho e pela amizade!
Às “amigas-da-carona” - Lizânia, Carol, Mary, Paulinha, Renata e Larissa - pelas conversas e
desabafos nas nossas idas e vindas, Niterói/FIOCRUZ/Niterói, e principalmente pelas nossas
saídas semanais de quinta que são sempre tão animadas! Carol, valeu pela formatação das
referências!!! Sua ajuda foi essencial!
Às amigas do “Chopp das Amigas” - Irene, Marcinha, Elisa, Juliana e Júlia - que sempre me
apoiaram e acreditaram no meu potencial; vocês são mais que amigas....são irmãs!!!
vii
À minha psicóloga, Dra. Joana, que me ajudou nesses últimos cinco anos a ser uma pessoa
melhor, me ensinando a ver a vida com um olhar diferenciado!!! E não é que funcionou?!
A todos do Laboratório de Genética Humana pelas risadas, pelas festinhas, pelas discussões
científicas e pelas horas agradáveis durante o trabalho;
À Dra Fernanda Mello, por sempre estar disposta a ajudar e esclarecer questões da clínica
médica que pertencem a um mundo bem diferente do meu. Obrigada por ter sido mais que
colaboradora e por vibrar junto comigo as conquistas alcançadas durante a realização desse
projeto;
Às enfermeiras Adriana Rezende e Lígia Mayumi: sem elas, a realização deste trabalho seria
impossível! Meninas, obrigada pelo carinho, dedicação e paciência!
Ao Marcelo, ao Érico, à Aline e à Andreza – o dream team da Plataforma de Sequeciamento por estarem sempre dispostos a ajudar no sequenciamento realizado durante toda a tese;
Ao Floriano e à Aline, do Laboratório de Bioquímica de Proteínas e Peptídeos, que realizaram
a parte de modelagem molecular e análise estrutural de NAT2, de forma a enriquecer ainda
mais o trabalho. Muito obrigada pela disponibilidade e por “vestirem a camisa” do projeto!
À Débora Goulart, minha professora de inglês e amiga pessoal. Obrigada pelas correções dos
artigos e, acima de tudo, por transformar uma aula de inglês em algo tão prazeroso!
A todos do Laboratório de Biologia Molecular Aplicada a Micobactérias, por me acolherem
sempre que precisei, principalmente durante o primeiro ano de doutorado, em especial ao
querido amigo Harrison e ao meu ex-chefe Dr. Philip Noel Sulffys;
À Dra. Leila de Mendonça Lima, por ceder o laboratório para realização dos experimentos de
clonagem;
Aos pacientes, contatos domiciliares e profissionais de saúde envolvidos neste estudo e que
contribuíram para um melhor entendimento da farmacogenética na tuberculose;
Ao Instituto Oswaldo Cruz que me concedeu a bolsa nos primeiros meses de doutorado;
À Faperj, ao CNP-q e ao programa POM da Fiocruz pelo apoio financeiro.
viii
"É
melhor tentar e falhar, que preocupar-se e ver a vida passar; é melhor tentar, ainda que
em vão, que sentar-se fazendo nada até o final. Eu prefiro na chuva caminhar, que em dias
tristes em casa me esconder. Prefiro ser feliz, embora louco, que em conformidade viver ..."
Martin Luther King
“Na atividade da vida, o que importa não são o valor e a perfeição material das obras, mas a
grandeza do amor com que as realizamos”
Frei Anselmo
ix
ABREVIATURAS
Acetil-CoA
Acetil Coenzima A
ACP
Acyl Carrier Protein – Proteína carreadora de grupamento acil
ADR
Adverse Drug Reaction – Reação adversa a droga
Asp
Aspartato ou Ácido aspártico
ATG
Códon de iniciação (adenosina, timina e guanina)
CD4+
Receptor de superfície de células T4
CD8+
Receptor de superfície de células T8
CYP 450
Citocromo P450
CYP2E1
Monooxigenase P450 da família 2, subfamília E, isoenzima 1
Cys
Cisteína
EUA
Estados Unidos da América
GSH
Glutationa
GST
Glutationa S transferase
GSTM1
Glutationa S transferase da família mu, isoenzima 1
GSTP1
Glutationa S transferase da família pi, isoenzima 1
GSTT1
Glutationa S transferase da família theta, isoenzima 1
His
Histidina
IC 95%
Intervalo de Confiança 95%
IFN-γ
Interferon gama
INH
Isoniazida
InhA
Enoil-ACP redutase
INPI
Instituto Nacional de Propriedade Industrial
KasA
-cetoacil-ACP sitetase
KatG
catalase-peroxidase micobacteriana
Kb
Kilo base
KDa
Kilo Dalton
MDR
Multi-droga resistente
Mn
Manganês
NAD+
Nicotinamida adenina dinucleotídeo oxidado
NADH
Nicotinamida adenina dinucleotídeo reduzido
NAT
N-acetiltransferase
NAT1
N-acetiltransferase 1
NAT2
N-acetiltransferase 2
x
OMS
Organização Mundial da Saúde
OR
Odds Ratio – Razão de Chance
P
Propabilidade
pb
Par de base
PCR
Polymerase Chain Reaction – Reação em cadeia da polimerase
PCT
Patent Cooperation Treaty – Tratado de Cooperação de Patente
pNAT
Pseudogene que constitui a família de genes NATs
PPD
Purified Protein Derivative - Derivado purificado da proteína
RFLP
Restriction Fragment Lengh Polymorphism – Polimorfismo de tamanho de fragmento
por restrição
RIF
Rifampicina
RNI
Reactive nitrogen intermediate - Intermediários reativos de nitrogênio
ROI
Reactive oxygen intermediate - Intermediários reativos de oxigênio
SNP
Single Nucleotide Polymorphism – Polimorfismo de base única
TBMR
Tuberculose multi-resistente
TNF-α
Fator de Necrose Tumoral alfa
xi
SUMÁRIO
Página
Resumo........................................................................................................................
iv
Abstract.......................................................................................................................
v
Abreviaturas...............................................................................................................
x
Lista de Figuras...........................................................................................................
xiii
Lista de Tabelas..........................................................................................................
xv
1) INTRODUÇÃO......................................................................................................
1
1.1. Tuberculose: a doença..............................................................................
2
1.2. Tratamento da TB....................................................................................
5
1.3. Mecanismos de ação da isoniazida..........................................................
7
1.4. Reações Adversas a Drogas: mecanismos da lesão hepatocelular
mediada por drogas e o papel da isoniazida nesse contexto..........................
10
1.5. A ciência da Farmacogenética.................................................................
16
1.6. Genética molecular da N-acetiltransferase 2............................................
20
1.7. Genética molecular da monoxigenase CYP2E1......................................
28
1.8. Genética molecular das glutationas S-transferases..................................
32
2) OBJETIVOS...........................................................................................................
36
3) RESULTADOS......................................................................................................
39
3.1. Capítulo 1.................................................................................................
40
3.2. Capítulo 2.................................................................................................
51
3.3. Capítulo 3.................................................................................................
90
3.4. Capítulo 4.................................................................................................
137
4) DISCUSSÃO..........................................................................................................
165
5) CONCLUSÕES......................................................................................................
175
6) REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS...................................................................
177
7) ANEXOS................................................................................................................
193
xii
LISTA DE FIGURAS
Página
1) Estimativa do número de novos casos de tuberculose no mundo em 2006..............
3
2) Incidência da tuberculose nos diferentes estados do Brasil em 2006........................
3
3) Eventos cronológicos após contato com M. tuberculosis..........................................
5
4) Estrutura da isoniazida...............................................................................................
7
5) Mecanismo de ação da isoniazida em M. tuberculosis..............................................
9
6) Seis mecanismos de lesão no fígado causada por drogas..........................................
11
7) Reações de biotransformação de fármacos...............................................................
13
8) Metabolismo da isoniazida no fígado.......................................................................
15
9) Áreas de conhecimento da farmacologia..................................................................
17
10) Esquema mostrando as três possibilidades resultantes do metabolismo de
fármacos administrados como droga ativa ou pró-droga..............................................
11) Esquema mostrando o benefício do ajuste de dose de uma droga baseado no
genótipo do indivíduo...................................................................................................
19
19
12) A prática da farmacogenética.................................................................................
20
13) Localização cromossômica dos loci das N-acetiltransferases humanas..................
21
14) Estrutura geral das N-acetiltransferases 1 e 2 humanas e de S. typhimurium..........
24
15) Nomenclatura das isoenzimas da super família CYP450........................................
29
16) Abundância relativa das isoformas de CYP450 no fígado e alguns exemplos de
substratos, inibidores e indutores...................................................................................
17) Localização dos polimorfismos no locus de CYP2E1 e as respectivas enzimas de
restrição utilizadas para detectar dos diferentes genótipos............................................
18) Localização estrutural do cluster gênico de 100 kb que codifica para a
subfamília GST mu........................................................................................................
19) Localização estrutural do cluster gênico que codifica para a subfamília GST
teta..................................................................................................................................
20) Figura 1 do Capítulo 2: Sequência nucleotídica da região codificante de NAT2
indicando as mutações novas protegidas pela patente BRPI0704093-8........................
21) Figura 1 do Capítulo 3: Caracterização dos haplótipos/alelos de NAT2 contendo
mutações novas ou raras em indivíduos brasileiros.......................................................
22) Figura 2 do Capítulo 3: Mapeamento das mutações encontradas na região
codificante de NAT2 na estrutura tridimensional da proteína........................................
23) Figura 3 do Capítulo 3: Alterações nas pontes de hidrogênio e no potencial
xiii
30
31
33
34
86
126
127
129
eletrostático frente à troca de aminoácido Tyr208His na estrutura da proteína NAT2
humana...........................................................................................................................
24) Figura 4 do Capítulo 3: Modelo estrutural da variante Gly51Val em NAT2
humana...........................................................................................................................
25) Figura 5 do Capítulo 3: Modelo estrutural da variante Cys68Tyr em NAT2
humana...........................................................................................................................
26) Figura do Material Suplementar do Capítulo 3: Alinhamento múltiplo de várias
sequências de NAT.........................................................................................................
27) Estratégia de amplificação e seqüenciamento de NAT2 (Anexo 2).........................
28) Eletroforese em gel de agarose 1% contendo os produtos de PCR NAT2
purificados (Anexo 2)....................................................................................................
29) Ilustração da utilização do software SeqScape v. 2.5. (Anexo 2)...........................
30) Identificação de SNP através da visualização do cromatograma dentro do
programa SeqScape v. 2.5. (Anexo 2)...........................................................................
31) Seqüência nucleotídica da região de clonagem do vetor pCR-BluntII-TOPO
(Anexo 4).......................................................................................................................
32) Gel de agarose 1,5% com PCR NAT2 a partir de colônia para identificação de
bactérias portadoras de pCRBlunt-II/NAT2 (Anexo 4).................................................
33) Análise de restrição para confirmação da presença do inserto dos clones
pCRBlunt-II/NAT2 (Anexo 4).......................................................................................
130
131
132
197
197
198
198
202
202
202
34) Gel de agarose 2% com o perfil de digestão (Rsa I) dos três genótipos de
CYP2E1 para o SNP -1053 CT (Anexo 6)…...……………………………………..
35) Gel de agarose 2,5% com PCR padrão para detectar a presença do gene GSTM1
tipo-selvagem (Anexo 6)………………………………………………………………
36) Gel de agarose 1,5% com PCR Multiplex para identificação dos genótipos de
GSTT1 (Anexo 6)...........................................................................................................
xiv
207
207
207
LISTA DE TABELAS
Página
1) Esquemas de tratamento padronizados para tuberculose no Brasil...........................
2) Características moleculares das N-acetiltransferases humanas e relação entre
fenótipo e genótipo apresentados por essas enzimas.....................................................
3) Alelos de NAT2 já descritos na literatura..................................................................
4) Comparação interétnica da distribuição dos alelos de NAT2 e a frequência do
fenótipo de acetilação lenta encontrada nas diferentes populações...............................
5) Tabela 1 do Capítulo 1: Frequência das mutações no gene da N-acetiltransferase 2
em indivíduos brasileiros provenientes do Rio de Janeiro e Goiás................................
6) Tabela 2 do Capítulo 1: Frequência das variantes alélicas de NAT2 entre os
indivíduos do Rio de Janeiro e Goiás.............................................................................
6
22
25
27
44
45
7) Tabela 3 do Capítulo 1: caracterização genotípica do gene NAT2 a determinação
preliminar do status de acetilação em 202 indivíduos de duas regiões diferentes do
46
Brasil..............................................................................................................................
8) Tabela 4 do Capítulo 1: Frequência alélica das sete mutações mais comuns do
gene NAT2 em diferentes populações...........................................................................
9) Tabela 1 do Capítulo 2: Sequências dos oligonucleotídeos utilizados para a
amplificação e/ou sequenciamento da região codificante do gene NAT2……………..
10) Tabela 2 do Capítulo 2: Lista dos polimorfismos de base única (SNPs)
descobertos no gene NAT2…………………………………………………………….
11) Tabela 3 do Capítulo 2: Frequência alélica dos SNPs da presente invenção no
gene NAT2 em duas diferentes regiões do Brasil..........................................................
12) Tabela 4 do Capítulo 2: Frequência dos SNPs identificados no gene NAT2 em
duas diferentes regiões do Brasil...................................................................................
47
79
81
84
84
13) Tabela 1 do Capítulo 3: Todas as mutações já identificadas na região codificante
de NAT2 e suas frequências em 404 indivíduos brasileiros residentes no Rio de
136
Janeiro e em Goiás.........................................................................................................
14) Tabela 1 do Capítulo 4: Características clínicas dos pacientes com TB com e
sem hepatotoxicidade. Frequências alélicas e genotípicas dos polimorfismos nos
158
genes CYP2E1, GSTT1 e GSTM1 nos dois grupos......................................................
15) Tabela 2 do Capítulo 4: Características clínicas dos pacientes com TB com e
sem hepatite medicamentosa. Frequências alélicas e genotípicas dos polimorfismos
nos genes CYP2E1, GSTT1 e GSTM1 nos dois grupos..................................................
xv
159
16) Tabela 3 do Capítulo 4: Frequência dos alelos de NAT2 nos indivíduos
brasileiros arrolados no estudo.......................................................................................
17) Tabela 4 do Capítulo 4: Genótipo/fenótipo de NAT2 e suscetibilidade a
hepatotoxicidade induzida por isoniazida......................................................................
18) Tabela 5 do Capítulo 4: Genótipo/fenótipo de NAT2 e suscetibilidade a hepatite
medicamentosa induzida por isoniazida........................................................................
xvi
160
161
163
INTRODUÇÃO
Raquel Lima de F. Teixeira
1- INTRODUÇÃO
1
INTRODUÇÃO
Raquel Lima de F. Teixeira
1.1) Tuberculose: a doença
A tuberculose (TB) é uma doença infectocontagiosa causada por uma bactéria aeróbia
patogênica, que estabelece a sua infecção preferencialmente nos pulmões, sendo considerada
uma das mais importantes doenças infecciosas no mundo. É estimado que um terço da
população mundial esteja infectado e apresente tuberculose latente (WHO, 2000). Segundo
estimativas da Organização Mundial de Saúde (OMS), apesar de existir um tratamento com
elevada eficácia, entre 2000 e 2020, um bilhão de pessoas estarão infectadas pelo bacilo da
tuberculose, cerca de duzentos milhões desenvolverão a doença e trinta e cinco milhões irão a
óbito caso não sejam identificados novos métodos diagnósticos, novas vacinas, novos
medicamentos e que políticas mais apropriadas para controle dos pacientes com tuberculose
ativa e seus contatos sejam desenvolvidas (WHO, 2000).
De acordo com a OMS, foram notificados nove milhões e duzentos mil novos casos de
TB no mundo em 2006 (Figura 1) com um milhão e setecentos mil óbitos, principal fator que
torna a TB um problema de saúde pública mundial. O continente africano contém as maiores
taxas da doença, apresentando trezentos e sessenta e três casos por cem mil habitantes. No
total, 83% dos casos novos de tuberculose são atribuídos às regiões da África e Ásia, onde a
Índia, China, Indonésia, Nigéria e África do Sul ocupam os cinco primeiros lugares em termos
de casos absolutos de tuberculose (WHO, 2008). A tuberculose pode ser prevenida e a
maioria dos casos tem cura; entretanto, fatores demográficos e sócio-econômicos dificultam
sua prevenção e tratamento. Além disso, a disseminação da epidemia do vírus HIV e a
emergência de cepas multidroga-resistentes (MDRs) em várias partes do mundo têm
contribuído para o aumento do número de casos de tuberculose (Schluger, 2001; van Crevel,
et al., 2002; Tufariello, Chan & Flynn, 2003).
O Brasil ocupa hoje o décimo-sexto lugar na lista dos vinte e dois países com a mais
elevada taxa de incidência de tuberculose. Estima-se uma prevalência de cinquenta milhões de
infectados, com cerca de cento e dez mil casos novos e seis mil óbitos ocorrendo anualmente
(Santos-Filho, 2006; WHO, 2008). Os estados mais afetados incluem Amazonas (73,5
casos/100.000 habitantes) o Rio de Janeiro (73,2 casos/100.000 habitantes) e o Ceará (50,8
casos/100.000 habitantes), e aqueles que apresentam as menores taxas de incidência de
tuberculose são Tocantins (18,1 casos/100.000 habitantes), Distrito Federal (16,7
casos/100.000 habitantes e Goiás (15,3 casos/100.000 habitantes) (SINAN - Sistema de
Informação de Agravos de Notificação - Figura 2).
2
INTRODUÇÃO
Raquel Lima de F. Teixeira
Número estimado de casos novos de TB, em 2006
Nº estimado de
casos novos
1.000.000 ou mais
Não estimado
Figura 1: Estimativa do número de novos casos de tuberculose no mundo, em 2006
(Controle Global da TB, WHO report 2008)
Incidência de TB no Brasil em 2006
Figura 2: Incidência de tuberculose nos diferentes estados do Brasil em 2006. Os
números representam os casos de TB por 100.000 habitantes. Fonte: SINAN (Sistema de
Informação de Agravos de Notificação).
3
INTRODUÇÃO
Raquel Lima de F. Teixeira
A tuberculose é causada pelo Mycobacterium tuberculosis, um bacilo álcool-ácido
resistente, de crescimento lento, que é transmitido principalmente através das vias
respiratórias superiores. A infecção acontece inicialmente nos macrófagos alveolares, após
inalação da bactéria contida em perdigotos liberados por pacientes com tuberculose ativa não
tratada. Contudo, o micro-organismo pode atingir qualquer órgão através da disseminação
hematogênica e quando a TB é estabelecida, a localização, a gravidade e a evolução da
doença são altamente variáveis.
O M. tuberculosis se replica no interior dos macrófagos, induzindo a produção de
citocinas e quimiocinas que iniciam uma resposta inflamatória nos pulmões. Macrófagos,
linfócitos, monócitos, bem como outras células inflamatórias, migram para o local da infecção
e formam o granuloma, cuja principal função é segregar a infecção e prevenir a disseminação
do bacilo para outros órgãos, assim como concentrar a resposta imune diretamente no sítio da
infecção. Neste contexto, a principal citocina envolvida na manutenção da estrutura do
granuloma e na ativação de macrófagos é o Fator de Necrose Tumoral alfa (TNF-), liberado
por fagócitos ativados pelo M. tuberculosis (van Crevel, et al., 2002).
As células T são fundamentais na resposta imune contra o M. tuberculosis. Os
linfócitos T CD4+ exercem seu efeito protetor através da produção de citocinas,
principalmente Interferon gama (IFN-), após a estimulação com antígenos micobacterianos.
Já os linfócitos T CD8+, além de secretarem citocinas como IFN- e TNF-, desempenham
uma atividade citotóxica, levando à lise de células infectadas ou à morte intracelular do
patógeno, diretamente (Schluger, 2001).
A citocina proinflamatória IFN- desempenha um papel chave na proteção contra a
tuberculose. Secretado por diversas células imunológicas, o IFN- estimula a produção de
intermediários reativos de oxigênio (ROI) e nitrogênio (RNI), através da indução da expressão
da óxido nítrico sintase (NOS2) por macrófagos. Esses reativos são importantes para a
realização das funções efetoras de inibição do crescimento intracelular e morte da
micobactéria pelo macrófago. Adicionalmente, o IFN- induz um aumento da expressão de
moléculas do complexo MHC de classe II pelos macrófagos e também regula positivamente a
expressão e secreção de TNF- (Schluger, 2001; Flynn & Chan, 2001; Tufariello et al.,
2003).
Existem basicamente três possíveis desfechos após o contato da pessoa com o M.
tuberculosis (Figura 3): (i) o micro-organismo pode ser imediatamente destruído pela resposta
imune inata do hospedeiro; (ii) uma parcela das pessoas infectadas (cerca de 10%) desenvolve
a tuberculose ativa (TB primária) no intervalo de um a três anos (esse grupo, aparentemente,
4
INTRODUÇÃO
Raquel Lima de F. Teixeira
não é capaz de controlar a infecção inicial nem de desenvolver uma imunidade protetora a
tempo de prevenir a doença ativa); e finalmente (iii) a maioria das pessoas infectadas com M.
tuberculosis apresentam uma infecção latente. Aproximadamente de 5 a 10 % dessas pessoas
irão sofrer uma reativação da infecção e apresentar tuberculose ativa (TB pós-primária) que
normalmente acontece em resposta a perturbações do sistema imune (Flynn & Chan, 2001a;
Flynn & Chan, 2001b; van Crevel et al., 2002).
O PPD (Purified Protein Derivative - Derivado Purificado da Proteína) ou Prova
Tuberculínica Cutânea é um método auxiliar para diagnóstico de TB. Baseia-se na reação
celular desenvolvida após a inoculação intradérmica de um derivado protéico de M.
tuberculosis. Essa reação cutânea é registrada em milímetros, para a posterior interpretação
clínica. O resultado positivo caracteriza apenas infecção pelo bacilo (Dalcomo et al., 2004).
Complexo primário –
granuloma
(PPD+)
Inalação de M.
tuberculosis
Morte imediata
do bacilo
(PPD-)
Disseminação de
M. tuberculosis
Doença
localizada
(TB primária)
Estabilização
(latência)
Doença aguda
(meningite, TB miliar, etc)
Estabilização
(latência)
Reativação
(TB pós-primária)
Figura 3: Eventos cronológicos após contato com M. tuberculosis. Figura adaptada de van Crevel, Ottenhoff e van der Meer,
2002.
PPD
– Prova tuberculínica cutânea
1.2) Tratamento da TB
Desde 1979, os esquemas de tratamento da TB preconizados pelo Ministério da Saúde
no Brasil são: um, de primeira linha, para os casos virgens de tratamento, que compreende a
administração de rifampicina (R), isoniazida (H) e pirazinamida (Z) por dois meses, seguidos
de rifampicina e isoniazida por mais quatro meses (Esquema I – 2RHZ/4RH); e outro, de
segunda linha, com administração de estreptomicina (S), pirazinamida, etambutol (E) e
etionamina (Et) por três meses e etambutol e etionamida mais nove meses (Esquema III –
3SZEEt/EEt), indicado para pacientes com falência ao Esquema I. Para os casos de
meningoencefalite isolada ou associada a outras formas, é proposto um esquema especial
(Esquema II) que compreende a administração de R, H e Z por dois meses, seguidos da
administração de R e H por mais sete meses. Para os pacientes que não obtêm cura com os
esquemas tradicionais descritos acima, chamados de portadores de TBMR (TB multi5
INTRODUÇÃO
Raquel Lima de F. Teixeira
resistente), foi proposto, após ter sido validado pelo Ministério da Saúde, em 2000, um
esquema alternativo com associação de amicacina (AM), ofloxacina (OFX), terizidon (TRZ),
etambutol (E) e clofazimina (CLZ), com duração de 18 meses (Tabela 1 - Dalcomo et al.,
2004).
Tabela 1: Esquemas de tratamento para a tuberculose no Brasil (Dalcomo et al., 2004).
Esquemas
Finalidade
Esquema 1
Diário, por seis meses para todas as formas pulmonares e
RHZ (2RHZ/4RH)
extrapulmonares, todas as idades, e na coinfecção com
HIV/AIDS
Esquema 2
Diário, por nove meses para meningoencefalite
RHZ (2RHZ/7RH)
tuberculosa
Esquema 1R
Diário, por seis meses para retratamento por recidiva após
RHZE (2RHZE/4RHE)
a cura ou o reinício do tratamento por abandono
Esquema 3
Doze meses de tratamento, para falência bacteriológica
SEEtZ (3EEtZ/9EEt)
aos esquemas anteriores
SEO (3SEOFX/9EOFX)
Doze meses de tratamento, para hepatopatias ou
intolerância severa
SHE (3SHE/9HE)
Doze meses de tratamento, para hepatopatias
SRE (2SRE/4RE)
Seis meses de tratamento, para hepatopatias
12AM / 18OFX / 18 TRZ /
18 meses de tratamento, para TBMR
18 E / 18 CLZ
R
– Rifampicina
– Isoniazida
Z
– Pirazinamida
E
– Etambutol
H
S
– Estreptomicina
– Ofloxacina
AM
– Amicacina
TRZ
– Terizidon
CLZ
– Clofazimina
O, OFX
A quimioprofilaxia da tuberculose é uma medida terapêutica que consiste no uso de
medicamentos para a prevenção da infecção pelo M. tuberculosis ou para evitar o
desenvolvimento da doença naqueles infectados. Baseia-se na administração de isoniazida
(INH), durante seis meses, em pessoas não infectadas para prevenir a infecção (quimioterapia
primária) ou em pessoas já infectadas (que apresentarem viragem do PPD), mas sem sinais de
doença, para prevenir a evolução da infecção à mesma (quimioprofilaxia secundária)
(Dalcomo et al., 2004).
6
INTRODUÇÃO
Raquel Lima de F. Teixeira
Os grupos de risco onde a quimioprofilaxia apresenta algum benefício incluem:
pessoas infectadas com HIV com PPD positivo (enduramento ≥ 5mm); contatos de pessoas
com TB ativa, sem sinais da doença ativa e fortes reatores à prova tuberculínica (≥10 mm);
crianças com menos de 15 anos não vacinadas; crianças vacinadas com BCG nos últimos 3
anos e com resposta tuberculínica igual ou superior a 15 mm de enduramento; pessoas com
viragem tuberculínica recente e que apresentam aumento na resposta à prova tuberculínica de
no mínimo 10 mm em relação à enduração inicial. No Brasil, em particular, com a
recomendação de não se vacinar os profissionais de saúde não reatores, torna-se necessário
realizar inquéritos tuberculínicos em unidades de saúde e indicar a quimioprofilaxia aos
profissionais de saúde que apresentarem viragem tuberculínica (Frieden et al., 2003; Dalcomo
et al., 2004).
1.3) Mecanismos de ação da isoniazida
Em 1952, a isoniazida foi introduzida ao esquema quimioterápico de controle da
tuberculose e até hoje apresenta uma excelente eficácia contra M. tuberculosis, tanto no
tratamento da infecção ativa, quanto na profilaxia.
A isoniazida (hidrazida do ácido isonicotínico – Figura 4) possui ação bacteriostática
para o bacilo em repouso e ação bactericida para o bacilo em multiplicação. A INH penetra
com facilidade nas células e se mostra eficaz contra bacilos que crescem no interior de
macrófagos, ou in vitro (meio de cultura). Além disso, esse fármaco é seletivo para
micobactérias, sendo necessárias altas concentrações para que algum efeito seja observado em
outros micro-organismos (Hardman et al., 1996).
O
- oxigênio
- carbono
N
- nitrogênio
H
– hidrogênio
C
O
NH
NH2
C
N
Figura 4: Estrutura da isoniazida.
Em 1970, foi demonstrado que a INH inibe a síntese dos ácidos micólicos em M.
tuberculosis levando então à correlação entre a biossíntese de ácidos micólicos e à viabilidade
celular (Winder & Collins, 1970; Winder et al., 1970; Takayama et al., 1972).
7
INTRODUÇÃO
Raquel Lima de F. Teixeira
Os ácidos micólicos são componentes estruturais importantes para a manutenção da
integridade da parede celular micobacteriana e consistem em cadeias longas de ácidos graxos
(-pregueadas e -hidroxiladas) que ligam o esqueleto rígido da parede celular
(arabinogalactana) à membrana celular externa. Sendo assim, a inibição da síntese de ácidos
micólicos leva a deformidades celulares em M. tuberculosis, causando a perda da integridade
celular (Middlebrook, 1952). Consequentemente, a inibição da síntese do ácido micólico pode
explicar a perda da álcool-ácido resistência pelas micobactérias expostas à isoniazida
(Blanchard, 1996).
Outros mecanismos de ação da isoniazida, ainda não muito bem esclarecidos, incluem:
depleção do cofator NAD+, efeito na biossíntese de ácidos nucléicos, inibição da atividade de
catalase-peroxidase micobacteriana, suscetibilidade aos efeitos tóxicos dos reativos de
oxigênio (principalmente H2O2) no fagolisossomo do macrófago (Zhang & Young, 1993;
Rastogi & David, 1993; Blanchard, 1996 Hardman et al., 1996).
A isoniazida é considerada uma pró-droga porque requer a ativação celular antes de
exercer seus efeitos tóxicos no bacilo. A enzima micobacteriana catalase-peroxidase KatG
(80KDa) transforma a INH na sua forma ativada através de uma reação de oxidação (Slayden
& Barry, 2000). Essa enzima desempenha diversas funções dentro da micobactéria, como:
atividades de catalase-peroxidase, de peroxidase dependente de Mn2+, de peroxinitrilase e de
mono-oxigenase (P450-“like”), sendo importante no estresse oxidativo e na virulência.
Segundo dados da literatura, a forma ativa proposta da INH (radical isonicotinil ou
acilisonicotínico) é um metabólito intermediário da formação do ácido isonicotínico, da
isonicotinamida e piridina-4-carboxialdeído, produtos da oxidação de INH por KatG
(Rozwarski et al., 1998; Slayden & Barry, 2000). Uma vez formado no interior da célula
micobacteriana, o radical isonicotinil se liga ao cofator NAD+ (nicotinamida adenina
dinucleotídeo oxidado) localizado no sítio ativo da proteína InhA, uma enoil-ACP (acyl
carrier protein) redutase. Além disso, a forma ativada de INH se liga covalentemente a outra
proteína chamada KasA, uma -cetoacil-ACP sintetase. Ambas as proteínas estão envolvidas
na elongação de ácidos graxos e biossíntese de ácidos micólicos. A ligação do complexo
NADH-isonicotinil a InhA e KasA reduz as atividades de redutase e sintetase das enzimas,
interferindo com a biossíntese de ácidos graxos e micólicos (Figura 5), provocando então o
acúmulo de ácidos graxos saturados de cadeias não muito longas (Rozwarski et al., 1998). A
interrupção da síntese de ácidos micólicos na micobactéria em crescimento leva à formação
de poros na parede celular, com a consequente lise da célula (Figura 5).
8
INTRODUÇÃO
Raquel Lima de F. Teixeira
Poros na parede celular
(ação da INH)
isoniazida
proteínas
1
5
Lipoarabinomanana
INH ativada
KatG
InhA
ácidos micólicos
2
3
peptidoglicana
KasA
4
membrana
citoplasmática
arabinogalactana
M. tuberculosis
Figura 5: Mecanismo de ação da isoniazida em M. tuberculosis.
9
1) A INH é capaz de atravessar
a parede celular micobacteriana;
2) se liga a KatG, enzima
micobacteriana capaz de ativar a
droga;
3) o metabólito ativo de INH se
liga às proteínas InhA e KasA,
enzimas envolvidas na síntese de
ácidos graxos e micólicos;
4) a síntese de ácidos micólicos
é interrompida e ocorre um
acúmulo de ácidos graxos de
cadeias pequenas;
5) a falta de ácidos micólicos
gera o aparecimento de poros na
parede celular micobacteriana
levando à perda da integridade e
rompimento da célula.
INTRODUÇÃO
Raquel Lima de F. Teixeira
1.4) Reações Adversas a Drogas: mecanismos da lesão hepatocelular mediada por
drogas, e o papel da isoniazida nesse contexto
As reações adversas à isoniazida incluem febre, erupções cutâneas, hepatite e
exantemas morbiliformes, macupapulares, purpúricos e urticariformes. Além disso, podem
ocorrer reações hematológicas. Somente no início da década de setenta ficou evidente a
possível ocorrência de lesão hepática grave, resultando na morte de alguns pacientes que
estavam tomando INH (Garibaldi et al., 1972). Estudos adicionais em adultos e crianças
confirmaram esta observação, mostrando que o processo patológico característico consiste em
necrose em ponte e multilobular. Os pacientes que recebem isoniazida devem ser
cuidadosamente avaliados a intervalos mensais para sintomas de hepatite (como anorexia,
mal-estar, fadiga, náusea e icterícia) e alertados sobre a necessidade de interromper o fármaco
se esses sintomas ocorrerem (Hardman et al., 1996).
As Reações Adversas a Drogas (adverse drug reactions - ADRs) podem levar a
hospitalização e apresentam um alto custo financeiro para a sociedade. Esses custos incluem
despesas para o tratamento das ADRs e despesas para evitar esses efeitos colaterais durante a
administração do fármaco (Lundkvist & Jonsson, 2004). A ocorrência de ADRs graves e
fatais tem sido extensivamente analisada em pacientes hospitalizados. Uma meta-análise de
aproximadamente quarenta estudos prospectivos em hospitais dos Estados Unidos da América
(EUA) sugere que de 6-7% dos pacientes internados sofrem de ADRs graves e que 0,32% dos
pacientes apresentam ADRs fatais (Hug et al., 2003). Isso resulta em aproximadamente
100.000 mortes por ano nos EUA, e um custo anual de mais de cem bilhões de dólares para a
sociedade norte-americana, devido a um tempo maior de hospitalização e redução na
produtividade (Ingelman-Sundberg, 2001; Hug et al., 2003). Além disso, foi estimado que as
ADRs são responsáveis por mais de 7% das internações nos hospitais do Reino Unido e 13%
das admissões em clínicas médicas na Suécia (Ingelman-Sundberg, 2001), mostrando que as
reações adversas constituem um problema ainda maior do que se pensava, no contexto de
quimioterapia e desenvolvimento de novas drogas.
Na França, um estudo realizado durante dez anos, na Unidade Hepática do Hôpital
Beaujon (Paris), mostrou que dentre todos os pacientes internados com hepatite aguda, 10%
eram casos de reação adversa a drogas. A prevalência de hepatotoxicidade medicamentosa em
pacientes com mais de cinquenta anos foi superior a 40%. No Japão, e em outros países
orientais, os fármacos são responsáveis por cerca de 10-20% dos casos de hepatites
fulminantes (Larrey, 2002).
10
INTRODUÇÃO
Raquel Lima de F. Teixeira
A lesão hepática é o tipo mais frequente de ADRs e pode levar a retirada de um
fármaco do mercado. A doença hepática induzida por drogas é uma das principais
complicações durante a quimioterapia, uma vez que o fígado é o órgão central na
biotransformação e excreção da maioria das drogas e substâncias xenobióticas (Bagheri et al.,
2000; Bissell et al., 2001; Larrey, 2002; Lee, 2003). Existem basicamente seis mecanismos
que envolvem primariamente a lesão do hepatócito (Figura 6). As reações da mono-oxigenase
citocromo P450 (CYP450) com determinados fármacos geram metabólitos tóxicos que podem
se ligar a proteínas intracelulares, levando a uma disfunção da homeostase da bomba de cálcio
com consequente desestruturação das fibras de actina na superfície do hepatócito e lise celular
(Figura 6A). Algumas drogas podem afetar proteínas transportadoras na membrana canicular
interrompendo o fluxo da bile e então causando a colestase. (Figura 6B).
Figura 6: Seis mecanismos de lesão no fígado causada por drogas. Esquema retirado a partir de Lee,
2003.
DD – death domain
11
INTRODUÇÃO
Raquel Lima de F. Teixeira
Várias reações envolvendo CYP P450 podem promover a ligação da droga à enzima, com
consequente exposição desse complexo na superfície celular, reconhecimento por células T e
produção de anticorpos (lesão por resposta autoimune) (Figura 6C/D). Por fim, determinadas
drogas podem promover lesão hepática mediada por morte celular programada (apoptose)
(Figura 6E) ou ainda serem capazes de inibir a respiração e/ou betaoxidação mitocondrial
(Figura 6F).
As substâncias xenobióticas são, em sua maioria, lipofílicas. Essa propriedade facilita
o seu transporte na corrente sanguínea por lipoproteínas e sua penetração nos órgãos, através
das membranas lipídicas. Entretanto, as propriedades físico-químicas das moléculas dos
fármacos dificultam sua posterior excreção do organismo. Sendo assim, essas substâncias são
metabolizadas a compostos hidrossolúveis, apropriados à excreção renal ou biliar (Cotran et
al., 1996; Hardman et al., 1996). As substâncias químicas são frequentemente metabolizadas,
quase sempre através de múltiplas vias, a produtos que podem ser mais ou menos tóxicos do
que o produto original. Um ou mais desses metabólitos podem, portanto interagir com
macromoléculas-alvo (DNA, RNA, proteínas, receptores), resultando em efeito tóxico. O
local da toxicidade é geralmente aquele onde ocorre a metabolização ou excreção dos
metabólitos (Cotran et al., 1996).
Os sistemas enzimáticos responsáveis pela biotransformação de muitos fármacos estão
localizados no retículo endoplasmático liso do fígado (fração microssômica). Tais enzimas
também são encontradas em outros órgãos como rins, pulmões e epitélio gastrintestinal,
embora em menor concentração (Hardman et al., 1996).
As reações químicas da biotransformação enzimática são classificadas como reações
de Fase I ou reações de Fase II (Figura 7). As reações de Fase I convertem o fármaco original
em um metabólito mais polar, através de oxidação, redução ou hidrólise. O metabólito
resultante seria farmacologicamente inativo, menos ativo ou, às vezes, mais ativo que a
molécula original (no caso de pró-droga). Esse metabólito pode ser eliminado ou participar
das reações de Fase II. As reações de Fase II, denominadas reações de conjugação ou síntese,
envolvem a ligação do fármaco ou metabólito primário a um substrato endógeno, como
glicuronato, sulfato, acetato, aminoácidos ou glutadiona (tripeptídeo). Essas reações incluem
reações de glicuronidação, metilação, sulfatação, acetilação, conjugação com glutadiona,
conjugação com glicina (Hardman et al., 1996).
12
INTRODUÇÃO
Raquel Lima de F. Teixeira
Drogas lipofílicas
Reações de Fase I
(adição de grupamento polar)
Produto da oxidação, redução ou hidrólise
Reações de Fase II
(glicuronidação, metilação, sulfatação,
acetilação, conjugação com glutadiona,
conjugação com glicina)
Produto hidrofílico
urina
bile
Figura 7: Reações de biotransformação de fármacos.
A lesão hepática pode ocorrer após a inalação, ingestão ou administração parenteral da
droga. Em geral, dois tipos principais de hepatotoxicidade química são reconhecidos: o tóxico
direto e o idiossincrásico (Harrison, 2002). A hepatotoxicidade direta ocorre com frequência
de forma previsível em indivíduos expostos ao agente agressor, sendo dependente da dose. O
período latente entre a exposição e a lesão hepática geralmente é curto (desde algumas horas
até 48 horas). Os agentes que produzem hepatite tóxica são venenos sistêmicos ou são
convertidos no fígado em metabólitos tóxicos. A hepatotoxicidade idiossincrásica é
caracterizada por ser uma reação imprevisível, anormal e geneticamente determinada. A
resposta observada é qualitativamente similar em todos os indivíduos e não é dose
dependente. Considera-se que a maioria das reações idiossincrásicas resulta de diferenças na
reatividade metabólica a agentes específicos. A suscetibilidade do hospedeiro é mediada pelas
cinéticas de geração do metabólito tóxico, que difere entre os indivíduos. A formação de
metabólitos reativos derivados de reações de biotransformação está frequentemente
relacionada à hepatotoxicidade idiossincrásica, como é o caso da isoniazida. Além disso,
nessas reações pode acontecer hipersensibilidade derivada da produção de auto-anticorpos;
sendo assim, as reações idiossincrásicas podem ainda ser divididas em alérgicas e metabólicas
(Harrison, 2002; Lee, 2003; Hug et al., 2003).
O risco de hepatotoxicidade é influenciado por diferentes fatores adquiridos e
genéticos. Dentre os fatores adquiridos podemos citar: idade, sexo, qualidade nutricional do
indivíduo, interações medicamentosas, gravidez, doenças extra-hepáticas. Variações genéticas
em isoenzimas que geram os bioprodutos tóxicos podem resultar em diferenças na reatividade
metabólica a agentes específicos que variam de indivíduo para indivíduo (Larrey, 2000;
Larrey, 2002; Lee, 2003). No caso da isoniazida, a idade é um fator de risco para a geração de
hepatotoxicidade, principalmente em pessoas acima de 50 anos, enquanto que deficiências na
13
INTRODUÇÃO
Raquel Lima de F. Teixeira
capacidade de acetilação da enzima N-acetiltransferase 2 (devido a alterações genéticas) se
apresentam como um fator de risco genético para o aparecimento da lesão hepática.
A isoniazida é geralmente administrada de forma oral sendo rapidamente absorvida
através do trato gastrintestinal. Primeiramente, através do sistema porta-hepático, o fármaco
passa pelo fígado antes que possa atingir a circulação e antes que seja distribuído ao seu local
de ação. Sendo assim, como a isoniazida é metabolizada por enzimas hepáticas, parte dela é
inativada inicialmente, e sua biodisponibilidade diminui (efeito de primeira passagem). Cerca
de 75% a 95% de uma dose de isoniazida são excretados na urina em 24 horas, principalmente
na forma de metabólitos, sendo os principais produtos de excreção aqueles resultantes de
acetilação enzimática (acetil-isoniazida) e hidrólise enzimática (ácido isonicotínico)
(Hardman et al., 1996).
A principal enzima responsável pela inativação e metabolização da INH é a Nacetiltransferase 2 (NAT2), codificada pelo gene NAT2. NAT2 é uma enzima de conjugação
de Fase II que catalisa a transferência do grupo acetil, a partir do cofator Acetil-coenzima A
(Acetil-CoA), ao terminal nitrogenado da droga (Figura 8). Após acetilação, a acetilisoniazida é hidrolizada por uma amidase à acetil-hidrazina. Esta, por sua vez, é oxidada em
intermediários hepatotóxicos pela mono-oxigenase CYP450 2E1. Paralelamente, a acetilhidrazina é novamente acetilada por NAT2 formando diacetil-hidrazina, composto não tóxico.
A acetil-hidrazina é considerada uma hepatotoxina, pois sua ativação metabólica por monooxigenases hepáticas (CYP2E1) gera metabólitos acilantes e alquilantes altamente reativos. A
ligação covalente desses agentes (considerados reativos eletrofílicos ou radicais livres) a
macromoléculas no fígado é capaz de causar lesão hepática (Figura 8) (Mitchell, et al., 1976;
Nelson, et al., 1976; Woodward & Timbrell, 1984; Kita et al., 2001; Huang et al., 2002;
Huang et al., 2003; Huang, 2007.).
14
INTRODUÇÃO
Raquel Lima de F. Teixeira
Isoniazida
NAT2
Acetil-isoniazida
acetilação
hidrólise
Hidrazina
(hepatotóxica)
Ligação covalente a
macromoléculas
(NECROSE HEPÁTICA)
hidrólise
NAT2
Acetil-hidrazina
acetilação
CYP2E1
Hepatotoxinas
oxidação
NAT2
(agentes acilantes e alquilantes)
acetilação
GST
conjugação
Diacetil-hidrazina
Excreção
(não-tóxico)
Figura 8: Metabolismo da isoniazida no fígado. Adaptado a partir de Mitchell, et al., 1976 e Huang, 2007.
Mutações pontuais na região codificante de NAT2 são capazes de alterar a atividade de
acetilação da enzima e essas alterações podem gerar três fenótipos diferentes: acetiladores
lentos, intermediários e rápidos. Os indivíduos que apresentam uma capacidade de acetilação
lenta acumulam mais acetil-hidrazina, uma vez que a isoniazida compete com esse metabólito
tóxico pela acetilação. A reação da acetil-hidrazina (em altos níveis) com CYP2E1 leva a
ligação covalente de metabólitos secundários altamente reativos com proteínas intracelulares.
A partir daí, ocorrem alterações intracelulares que resultam na perda de gradientes iônicos,
queda dos níveis de ATP e ruptura da actina com consequente lise celular (Figura 6). Em
1986, Sarma e colaboradores propuseram que a interação medicamentosa de INH com
rifampicina (RIF) pode também levar à lesão hepática. Segundo os autores, a RIF aumenta a
conversão direta da isoniazida a ácido isonicotínico e hidrazina (hepatotóxica, carcinogênica e
neurotóxica) em acetiladores lentos, provocando o acúmulo desse metabólito hepatotóxico
(Sarma et al., 1986).
Outra classe de enzimas cuja participação na biotransformação da isoniazida que vem
sendo estudada é a glutationa S-transferase (GST) (Roy, et al., 2001; Huang, 2007) que
realiza uma reação de conjugação da glutationa (GSH) a compostos eletrofílicos, levando à
formação de produtos menos reativos e prontos para excreção pelo organismo (Figura 8).
15
INTRODUÇÃO
Raquel Lima de F. Teixeira
1.5) A ciência da Farmacogenética
A variabilidade interindividual no metabolismo de xenobióticos e na resposta a uma
determinada droga é extensa. Fatores que influenciam essa variação incluem: herança
genética, sexo, idade, co-administração de medicamentos, fisiologia do indivíduo, presença de
outra fisiopatologia e alguns fatores ambientais (consumo de álcool, cigarro, hábitos
alimentares, etc).
Para produzir seus efeitos terapêuticos, um fármaco precisa estar presente em
concentrações adequadas em seus locais de ação. Embora as concentrações obtidas sejam
dependentes da dose administrada, elas também irão depender da magnitude e velocidade de
sua absorção, distribuição, ligação ou localização nos tecidos, biotransformação e excreção. É
a farmacocinética a ciência que estuda o caminho e distribuição da droga e seus metabólitos
nos diferentes tecidos, englobando os mecanismos de absorção, transporte, metabolização e
eliminação. O estudo dos efeitos bioquímicos e fisiológicos dos fármacos e seus mecanismos
de ação é denominado farmacodinâmica. Proteínas envolvidas na mediação dos efeitos da
droga são definidas como moléculas-alvo, e incluem não somente receptores diretos da
mesma e, sim, qualquer proteína envolvida no seu mecanismo de ação (proteínas transdutoras
de sinal, por exemplo). (Hardman et al., 1996).
Após sua administração, a droga deve ser absorvida pelo organismo e distribuída por
todo o corpo para que possa atingir seu sítio de ação. Isso requer a participação em conjunto
de várias proteínas, incluindo enzimas metabolizadoras, proteínas transportadoras, receptores
e outros. A droga, por sua vez, pode ser administrada na sua forma ativa ou inativa (pródroga). Ambas as formas sofrem o processo de biotransformação para serem eliminadas do
organismo e/ou liberarem seus componentes ativos, processo onde outras proteínas
enzimáticas estão envolvidas (Prows & Prows, 2004). A variabilidade genética já é conhecida
nos contextos de absorção e metabolismo de fármacos, além de suas interações com
receptores farmacológicos (moléculas-alvo), levando então ao aparecimento de diferentes
fenótipos de absorção (lenta ou rápida), metabolização (ineficiente, eficiente ou ultrarrápida) e
ainda de interação droga-receptor (fraca ou ineficiente) (Ingelman-Sundbug, 2001). Uma das
consequências dessas variações é o surgimento de reações adversas ou falência terapêutica
(Figura 9).
16
INTRODUÇÃO
Raquel Lima de F. Teixeira
Áreas de conhecimento da Farmacologia
droga
Figura 9: Componentes importantes da farmacologia. Variantes gênicas envolvidas com a
farmacodinâmica ou farmacocinética da droga são alvos dos estudos farmacogenéticos.
A farmacogenética é o estudo das variações genéticas que causam respostas variáveis
aos medicamentos incluindo diferenças na eficácia, interações droga-droga e o risco relativo
de reações adversas. Isso envolve, então, estudos de mutações e polimorfismos que podem
afetar a expressão ou atividade de receptores farmacológicos, proteínas transportadoras,
sinalizadoras e de enzimas metabolizadoras (Ingelman-Sundberg, 2001; Roses, 2002, Prows
& Prows, 2004).
Um dos principais objetos de estudo da farmacogenética são as enzimas envolvidas na
biotransformação de fármacos. Variações genéticas nos genes que codificam essas enzimas
podem resultar em alterações na atividade biotransformadora. Isso favoreceria o aparecimento
de reações adversas por toxicidade devido a uma baixa metabolização e o consequente
acúmulo do princípio ativo ou de metabólitos intermediários tóxicos (metabolizadores lentos).
A presença de variantes que não afetam a atividade enzimática (metabolizadores rápidos), ou
com múltiplas cópias (metabolizadores ultrarrápidos), podem estar associadas a concentrações
séricas subterapêuticas da droga (Ingelman-Sundberg, 2001). Na maioria dos casos, a
17
INTRODUÇÃO
Raquel Lima de F. Teixeira
presença de heterozigose origina metabolizadores intermediários (Kalow, 1997) (Figuras 10 e
11).
Cerca de 99,9% do genoma humano é idêntico em todos os indivíduos. Entretanto, ao
longo da sequência deste genoma existem locais específicos onde ocorrem variações no DNA.
Uma dessas alterações é conhecida como SNP (Single Nucleotide Polymorphism) e envolve a
troca de uma base nucleotídica por outra qualquer (mutação de ponto).
Os dois tipos principais de mutação de ponto no DNA são as substituições de bases e
adições ou deleções de bases (indel). As substituições de base podem ser de dois tipos:
transições, quando ocorre substituição de uma base por outra da mesma categoria química –
purina por purina (A/G) ou pirimidina por pirimidina (T/C); e transversões, quando ocorre
substituição de uma base por outra de categoria química diferente – purina por pirimidina ou
pirimidina por purina. As mutações de ponto podem ainda ser classificadas como: mutações
sinônimas ou silenciosas (mutações que alteram um determinado códon para outro códon que
codifica o mesmo aminoácido); mutações não sinônimas ou de sentido trocado (o códon para
um determinado aminoácido é trocado por outro que determina aminoácido diferente);
mutações sem sentido (o códon que codifica para um determinado aminoácido é trocado para
um códon de terminação da tradução) e mutações de troca de matriz de leitura ou frame-shift
(mutações indel mudam a matriz de leitura para o restante do processo de tradução)
(Guttmacher & Collins, 2002).
Os SNPs são comuns e ocorrem a uma taxa de aproximadamente um, a cada trezentos
a mil bases. Um conjunto de SNPs em um dado indivíduo é chamado de perfil de SNPs. Esses
perfis estão sendo citados como alternativa para investigar as bases genéticas de várias
doenças e ajudar a predizer que tipo de resposta um determinado paciente pode apresentar em
relação a uma determinada droga (variantes associadas com eficácia terapêutica e efeitos
adversos) (Roses, 2002; Prows & Prows, 2004).
A identificação de marcadores genéticos que possam predizer se o indivíduo responde
mal, ou não, a uma determinada droga auxiliaria na indicação correta do medicamento e do
seu esquema posológico, maximizando a eficácia e prevenindo ou reduzindo as possíveis
reações adversas tóxicas (Figura 12).
18
INTRODUÇÃO
Raquel Lima de F. Teixeira
Drogas ativas
Variações na
atividade de
enzimas
metabolizadoras
de drogas
normal
Aumentada
(metabolismo
rápido ou
ultrarrápido)
Pró-drogas
Variações na
atividade de
enzimas
metabolizadoras
de drogas
Ausente ou
deficiente
(metabolismo
lento)
normal
Aumentada
(metabolismo
rápido ou ultrarápido)
Ausente ou
deficiente
(metabolismo
lento)
Droga
ativa
Restante da
pro-droga
Circulação
metabólito
Circulação
Metabólito
inativado
excretados pelos
rins e intestino
A droga é rapidamente
metabolizada antes de
atingir efeitos
terapêuticos
Metabólito ativo entra
na circulação, atinge
seu alvo e depois é
excretado pelos rins e
intestino
A droga ou metabólitos
intermediários tóxicos se
acumulam em níveis altos
antes de serem eliminados
pelos rins e intestino
A
Rápida conversão a
metabólito ativo com
possível overdose antes
de eliminação
Ineficiência ou
ausência de ativação;
pouco ou nenhum
efeito terapêutico
B
Figura 10: Esquema mostrando as três possibilidades resultantes do metabolismo de fármacos administrados como
droga ativa (A) ou pró-droga (B) (Prows & Prows, 2004). Essas diferenças na biotransformação das drogas são
definidas pelo genótipo do paciente. Os desfechos encontrados no quadro B são referentes ao metabolismo de pródrogas que são ativadas por enzimas do indivíduo; a isoniazida, apesar de ser considerada uma pró-droga, se
encaixa no esquema do quadro A, uma vez que sua ativação acontece dentro da micobactéria.
% Dose padrão
% Dose baseada no genótipo
Variantes
gênicas
Faixa terapêutica
Efeitos colaterais
Falência terapêutica
19
Figura 11: Esquema mostrando o
benefício do ajuste de dose de uma droga,
baseado no genótipo do indivíduo.
Indivíduos com variantes gênicas que
codificam enzimas metabolizadoras de
drogas com baixa atividade têm maior
propensão a desenvolver efeitos colaterais.
Sendo assim, a dosagem do fármaco para
esses indivíduos deve ser diminuída. Por
outro lado, aqueles indivíduos que
possuam genótipos de metabolizadores
rápidos, ou ultrarrápidos, correm o risco
de apresentar falha terapêutica devendo,
então, receber doses aumentadas do
fármaco. Adaptado de Kirchheiner et al.,
2005. c = concentração da droga; t =
tempo.
INTRODUÇÃO
Raquel Lima de F. Teixeira
Variação fenotípica de resposta a drogas entre indivíduos que
apresentam o mesmo diagnóstico – Identificação através do genótipo
Indivíduos que respondem mal à droga
Gene com
sequência alterada
Tratamento com
outra droga ou
com dosagem
diferente
Indivíduos que respondem de forma normal à droga
Gene com
sequência normal
Tratamento
com a droga
convencional
e mesma
dosagem
Figura 12: Pacientes que apresentam o mesmo esquema terapêutico podem responder de
forma diferenciada, devido à presença de alelos diferentes. A prática da farmacogenética
envolve a genotipagem de pacientes e o tratamento daqueles que respondem mal à
quimioterapia de primeira escolha com outra droga, ou com uma posologia diferente (Prows &
Prows, 2004).
1.6) Genética molecular da N-acetiltransferase 2
Variações na atividade da enzima N-acetiltransferase 2 foram descobertas há mais de
40 anos, através da observação de diferenças interindividuais no metabolismo da isoniazida,
em pacientes com tuberculose, bem como da presença ou não de toxicidade induzida por essa
droga (Evans, 1989). Alguns estudos de genética de família puderam então comprovar que a
variabilidade genética de NAT2 estava diretamente relacionada ao aparecimento de diferentes
fenótipos de acetilação (Knight et al., 1959).
O estudo molecular das N-acetiltransferases em humanos revelou a presença de três
loci, dois que codificam para duas enzimas similares (NAT1 e NAT2) e um terceiro que
constitui um pseudogene (pNAT) (Figura 13). Os três loci estão localizados no cromossomo 8
entre 170-360Kb da região 8p22, uma região instável e frequentemente deletada em células
tumorais, sugerindo a presença de genes supressores de tumor nesse local (Sim et al., 2000).
O pNAT é um pseudogene que contém um códon de parada prematuro, e não é transcrito.
20
INTRODUÇÃO
Raquel Lima de F. Teixeira
NAT1 e NAT2 consistem em dois genes de 873 pb, que não apresentam íntrons, e codificam
proteínas de 34 KDa. Enquanto a proteína NAT1 é derivada de um mRNA sintetizado a partir
de um único éxon, o mRNA de NAT2 é constituído do éxon codificador da proteína e um
segundo éxon, não codificador, de 100 pb localizado a aproximadamente 8Kb antes do sítio
de iniciação da tradução. NAT1 e NAT2 apresentam 81% de homologia e seus respectivos
genes apresentam 87% de homologia na sequência nucleotídica. Ambas as enzimas são
capazes de realizar a N-acetilação, O-acetilação e N-O-transferência em diferentes
xenobióticos e carcinógenos; entretanto, diferem na distribuição tecidual no organismo, na
especificidade a substratos e em níveis de expressão durante o desenvolvimento embrionário
(Tabela 2). (Hein, et al., 2000; Sim et al., 2000; Hein, 2002; Pompeo et al., 2002).
8
8p22
PNAT
telômero
NAT1
103 pb
D8S21
NAT2
8652 pb 6 pb
centrômero
299 bp
873 pb
Éxon 1
Éxon 2
polyA-1 polyA-2
NAT2
-8763
-8660
-6 +1
+873
+1071 +1193
5`UTR
3`UTR
191G>A
282C>T
341T>C
481C>T
590G>A
803A>G
857G>A
Figura13:
12:Localização
Localizaçãocromossômica
cromossômicados
dosloci
locidas
das N-acetiltransferases
N-acetiltransferases humanas. Esquema
Figura
Esquema mostrando
mostrandoos
os
SNPsmais
maisfreqüentes
freqüentesencontrados
encontradosno
nogene
geneNAT2
NAT2 humano.
humano. D8S21
D8S21 representa um
SNPs
um marcador
marcador polimórfico
polimórfico
encontrado
encontradodentro
dentrononolocus
locusdedeNAT2
NAT2(Adaptado
(Adaptadoaapartir
partirde
deSim
Simetetal.,
al.,2000
2000 ee Boukouvala
Boukouvala & Sim, 2005).
Tanto NAT1 como NAT2 são genes polimórficos com mais de 20 alelos descritos para
cada locus. Uma vez que o polimorfismo genético influencia na velocidade de acetilação de
NAT1 e NAT2, os indivíduos são então classificados em acetiladores rápidos (e/ou
intermediários) e lentos. Apesar de alguns estudos mostrarem que o fenótipo de acetilação
lenta obedece a uma herança autossômica recessiva (Knight et al., 1959; Jorge-Nebert et al.,
21
INTRODUÇÃO
Raquel Lima de F. Teixeira
2002; Moussa et al., 2002; Agúndez et al., 2002; Dandara et al., 2003; Mittal et al., 2004),
outros estudos mostram a presença de três genótipos codominantes: homozigotos rápidos,
heterozigotos intermediários e homozigotos lentos (Sanahara et al., 1961; Mashimo et al.,
1992; Doll et al., 1995; Deitz et al., 2000; Ohno et al., 2000; Hein et al., 2000; Kita et al.,
2001; Pompeo et al., 2002). As variações entre esses estudos possivelmente se devem à
utilização
de
diferentes
substratos
(INH,
dapsona,
cafeína,
procainamida,
ácido
aminossalicílico, sulfapiridina, etc) nos ensaios enzimáticos de fenotipagem, uma vez que
algumas dessas substâncias não são capazes de discriminar os acetiladores rápidos dos
intermediários (Mashimo et al., 1992; Yokogawa et al., 2001). De fato, alguns trabalhos onde
foram realizados experimentos de genotipagem e avaliação do fenótipo concomitantemente
mostraram que o comportamento dos heterozigotos (ditos por alguns autores heterozigotos
rápidos) difere de ambos os homozigotos, apresentando uma atividade enzimática
intermediária (Deguchi, et al., 1990; Hickman & Sim, 1991; Kita et al., 2001; Jorge-Nebert et
al., 2002). Adicionalmente, quando os três genótipos foram avaliados quanto aos níveis
séricos atingidos pela INH horas depois da sua administração, novamente o heterozigoto se
manteve numa faixa intermediária em relação aos homozigotos rápidos e lentos (Donald, et
al., 2004). Entretanto, essas discrepâncias ainda não foram resolvidas de forma satisfatória.
Tabela 2: Características moleculares das N-acetiltransferases humanas e a relação entre o
fenótipo e genótipo apresentados por essas enzimas (Hein, et al., 2000; Sim et al., 2000; Hein,
2002; Pompeo et al., 2002).
CARACTERÍSTICA
Localização
cromossômica
Gene
Proteína
Atividade enzimática
Homologia
Locais de expressão
Substratos
N-ACETILTRANSFERASE 1
N-ACETILTRANSFERASE 2
8p22 (170-360 Kb)
Região instável em tumores (presença de gene supressor de tumor)
NAT1 (873 pb), sem íntrons;
NAT2 (873 pb), sem íntrons (mRNA composto pelo éxon codificador da proteína e
éxon de 100pb não codificante localizado a 8 Kb a cima do códon de iniciação)
NAT1 (290 a.a. - 34 KDa)
NAT2 (290 a.a. - 34 KDa)
N-acetilação (desintoxicação de xenobióticos)
O-acetilação (ativação de carcinógenos)
N-O-acetiltranferência(ativação de carcinógenos)
gene= 87%
proteína = 81%
Diferentes tecidos
Epitélio intestinal e fígado
Fases iniciais do desenvolvimento
(mRNA encontrado em diferentes
embrionário e fase adulta
tecidos)
Aminas heterocíclicas, ácido
p-aminossalicílico, ácido p-aminobenzóico,
p-aminobenzoil glutamato (p-AB Glu) 
substrato endógeno
22
Isoniazida, sulfonamidas (sulfametazina),
dapsona, aminas heterocíclicas (PhIP, GluP1) derivadas de alimentos
INTRODUÇÃO
Raquel Lima de F. Teixeira
Tabela 2: Características moleculares das N-acetiltransferases humanas e a relação entre o
fenótipo e genótipo apresentados por essas enzimas (Hein, et al., 2000; Sim et al., 2000; Hein,
2002; Pompeo et al., 2002). (Continuação)
CARACTERÍSTICA
Polimorfismo
genético
Genótipo/fenótipo
N-ACETILTRANSFERASE 1
N-ACETILTRANSFERASE 2
NAT1 = mais de 20 alelos / NAT2 = 53 alelos
Frequência dos alelos varia de acordo com grupos étnicos
Alelo = combinação de mutações pontuais no promotor e/ou no CDS / SNPs,
encontrados nos diferentes alelos, resultam em redução de afinidade pelo substrato,
atividade enzimática, níveis da proteína e/ou estabilidade da mesma.
TRIMODAL: acetiladores lentos, intermediários e rápidos.
Relação com predisposição ao câncer e/ou eficácia ou efeitos colaterais no
tratamento com antibióticos
Análises funcionais e estudos de mutação sitiodirigida permitiram a identificação de
um resíduo de cisteína no sítio ativo (na posição 68 em humanos – Cys68) como a única
cisteína conservada em todas as NATs cujas sequências já estavam disponíveis até o
momento. Esses estudos demonstraram que Cys68 desempenha um papel crucial no sítio
catalítico da enzima NAT2 humana (Watanabe et al., 1992, Dupret & Grant, 1992).
Posteriormente, estudos de modelagem molecular por homologia da NAT2 humana, baseados
na estrutura protéica de NAT Salmonella typhimurium, revelaram a presença de uma tríade
catalítica similar à encontrada em cisteína-proteases (Cys68-His107-Asp122) (Sinclair et al.,
2000, Rodrigues-Lima & Dupret, 2002).
Os estudos baseados na estrutura cristalográfica de NATs de diferentes bactérias
foram de grande importância para o melhor entendimento das características estruturais dessas
proteínas, incluindo a localização de SNPs ao longo da estrutura tridimensional e
experimentos de docking molecular com diversos substratos (Sinclair et al., 2000; Sandy et
al., 2002; Holton et al., 2005; Westwood et al., 2005; Westwood et al., 2006). Entretanto, a
similaridade entre as sequências protéicas de NATs de mamíferos e NATs bacterianas é muito
baixa (30%), e as diferenças estruturais entre essas proteínas representam um fator importante
e limitante para o estudo de modelagem molecular das N-acetiltransferases de seres humanos
(Walraven et al., 2007).
Recentemente, as estruturas cristalográficas de NAT1 e NAT2 humanas foram
resolvidas, corroborando vários achados prévios de estudos de modelagem molecular e
fornecendo evidências da existência de novas características estruturais na porção C-terminal
das NATs humanas ausentes em bactérias (Wu et al., 2007). Adicionalmente, foi verificado
que o arranjo tridimensional de NAT1 e NAT2 humanas é muito similar aos seus ortólogos
bacterianos, com três domínios principais: um domínio N-terminal de oitenta e três resíduos
23
INTRODUÇÃO
Raquel Lima de F. Teixeira
contendo cinco α-hélices e uma folha-β pequena; um segundo domínio com nove folhas-β e
duas pequenas hélices formando um barril-β; e um terceiro domínio α/β com quatro folhas-β e
uma α-hélice (Figura 14). Os dois primeiros domínios, envolvidos na atividade catalítica e
ligação do Acetil-CoA, estão conectados ao terceiro domínio através de um interdomínio αhelicoidal. O terceiro domínio está relacionado com a afinidade ao substrato (Westwood et
al., 2006; Wu et al., 2007).
A N-acetilação envolve uma reação clássica do tipo “ping-pong”, em duas etapas, e
utiliza o cofator Acetil-CoA como doador do grupamento acetil. O resíduo sulfidril da cisteína
no sítio catalítico de NAT recebe o grupamento acetil, num primeiro momento da reação,
resultando na formação da estrutura intermediária acetilcisteinil. Posteriormente, o
grupamento acetil é transferido para o terminal amino da molécula aceptora. (Dupret & Grant,
1992, Wang et al., 2004).
NAT1 humana
NAT2 humana
NAT S. typhimurium
Figura 14: Estrutura geral das N-acetiltransferases 1 e 2 humanas e de S. typhimurium. A NAT1 humana está
ligada ao substrato acetamina e a NAT2 humana está ligada a Acetil-CoA. Os terminais amino e
carboxil estão indicados como NT e CT, respectivamente. A inserção de uma cauda na região carboxiterminal das NATs humanas, inexistente na NAT bacteriana, está destacada em roxo. Os três domínios
estão representados por cores na NAT de S. typhimurium: domínio I = azul; domínio 2 = amarelo;
domínio III = verde. O interdomínio está destacado em cinza. Figura retirada de Wu et al., 2007.
Até o presente momento, já foram identificados cinqüenta e três alelos diferentes para
o gene NAT2 (www.louisville.edu/medschool/pharmacology/NAT.html), os quais consistem
na combinação de até quatro mutações pontuais na região codificante (Tabela 3). Existem
trinta e dois SNPs identificados na região codificante de NAT2: vinte e cinco cadastrados no
site oficial de nomenclatura e sete no banco de dados SNPEntrez e/ou em artigos publicados.
Estudos funcionais de expressão gênica, em células de levedura e de mamífero, mostraram
claramente a existência de diferentes mecanismos que podem resultar no fenótipo de
24
INTRODUÇÃO
Raquel Lima de F. Teixeira
acetilação lenta de NAT2 (Fretland et al., 2001; Walraven et al., 2008). Nesses estudos, foi
observado que as mutações no gene NAT2 podem interferir na quantidade de proteína
sintetizada (190C>T, 191G>A, 341T>C, 364G>A, 411A>T, 434A>C, 499G>A, 590G>A e
857G>A), na atividade enzimática (190C>T, 191G>A, 341T>C, 364G>A, 411A>T, 434A>C,
499G>A, 590G>A, 845A>C e 857G>A) e estabilidade de NAT2 (191G>A, 590G>A,
845A>C e 857G>A), conferindo a todos um fenótipo de acetilação lenta. Entretanto, outras
mutações (111T>C, 282C>T, 481C>T, 759C>T e 803A>G) não exerceram nenhum efeito na
proteína, resultando em um fenótipo normal, semelhante a proteína codificada pelo alelo tiposelvagem (Fretland et al., 2001; Walraven et al., 2008).
Tabela 3: Alelos de NAT2 já descritos na literatura. As mutações se referem à posição dentro
da região codificante de NAT2, considerando o nucleotídeo de número um (1) a adenina (A)
do códon de iniciação da tradução (ATG). A mutação que caracteriza cada grupo está
destacada em vermelho.
ALELOS
SNPs
ALELOS
SNPs
ALELOS
SNPs
NAT2*4
tipo-selvagem
NAT2*6E
NAT2*12F
NAT2*5A
341T>C
481C>T
341T>C
481C>T
803A>G
NAT2*6F
481C>T
590G>A
590G>A
803A>G
282C>T
518A>G
590G>A
282C>T
590G>A
766A>G
282C>T
590G>A
838G>A
857G>A
282C>T
590G>A
857G>A
622T>C
803A>G
609G>T
803A>G
NAT2*5B
NAT2*6G
NAT2*5C
341T>C
803A>G
NAT2*6H
NAT2*5D
341T>C
NAT2*6I
NAT2*5E
341T>C
590G>A
NAT2*6J
*
NAT2 5F
NAT2*5G
NAT2*5H
NAT2*5I
NAT2*5J
NAT2*5K
341T>C
481C>T
759C>T
803A>G
282C>T
341T>C
481C>T
803A>G
341T>C
481C>T
803A>G
859T>C
341T>C
411A>T
481C>T
803A>G
282C>T
341T>C
590G>A
282C>T
341T>C
NAT2*12G
NAT2*12H
403C>G
803A>G
NAT2*13A
282C>T
NAT2*13B
282C>T
578C>T
NAT2*14A
191G>A
NAT2*6K
282C>T
590G>A
638C>T
NAT2*14B
191G>A
282C>T
NAT2*6L
282C>T
345C>T
590G>A
NAT2*14C
191G>A
341T>C
481C>T
803A>G
NAT2*7A
857G>A
NAT2*14D
191G>A
282C>T
590G>A
NAT2*7B
282C>T
857G>A
NAT2*14E
191G>A
803A>G
NAT2*10
499G>A
NAT2*14F
NAT2*11A
481C>T
NAT2*14G
25
191G>A
341T>C
803A>G
191G>A
282C>T
803A>G
INTRODUÇÃO
Raquel Lima de F. Teixeira
Tabela 3: Alelos de NAT2 já descritos na literatura. As mutações se referem à posição dentro
da região codificante de NAT2, considerando o nucleotídeo de número um (1) a adenina (A)
do códon de iniciação da tradução (ATG). A mutação que caracteriza cada grupo está
destacada em vermelho. (Continuação)
ALELOS
*
NAT2 5L
NAT2*5M
NAT2*6A
NAT2*6B
NAT2*6C
NAT2*6D
SNPs
70T>A
341T>C
481C>T
803A>G
341T>C
481C>T
803A>G
838G>A
282C>T
590G>A
590G>A
282C>T
590G>A
803A>G
111T>C
282C>T
590G>A
ALELOS
SNPs
ALELOS
SNPs
NAT2*11B
481C>T
859Del
NAT2*14H
191G>A
282C>T
683C>T
NAT2*12A
803A>G
NAT2*14I
191G>A
481C>T
803A>G
NAT2*12B
282C>T
803A>G
481C>T
803A>G
NAT2*17
434A>C
NAT2*12D
364G>A
803A>G
NAT2*19
NAT2*12E
282C>T
578C>T
803A>G
NAT2*12C
NAT2*18
845A>C
190C>T
Sabe-se hoje que, para os genes que contém vários SNPs, o haplótipo - combinação
destes SNPs no mesmo lócus - é o que determina o fenótipo, e não o SNP individual. Sendo
assim, vários estudos de expressão e atividade enzimática foram realizados com os alelos
mais frequentes de NAT2, possibilitando então a caracterização dos mesmos quanto ao perfil
de acetilação: os alelos dos grupos NAT2*5, *6, *7, e *14 resultam em um fenótipo de
acetilação lenta e os alelos NAT2*4, do grupo *12 (com exceção do alelo *12D) e *13A
conferem um fenótipo de acetilação rápida (Hein et al., 2000; Hein, 2002).
Estudos realizados em populações distintas mostraram que a distribuição dos alelos
que codificam para NAT2 apresenta diferenças de acordo com a etnia da população estudada.
Por exemplo, a mutação 191G>A, que caracteriza o cluster *14, está presente nas populações
americanas de origem africana, e em populações africanas nativas, mas nunca foi identificada
em populações eurodescendentes. Os alelos NAT2*5A, NAT2*5B, NAT2*5C, NAT2*6A e
NAT2*7B representam 99% dos alelos mutantes em acetiladores lentos da população
eurodescendente, onde esse fenótipo apresenta uma freqüência acima dos 50%. Já nas
populações asiáticas, o fenótipo de acetilação rápida predomina, sendo representado pelo alelo
NAT2*4 (Tabela 4).
26
INTRODUÇÃO
Raquel Lima de F. Teixeira
Tabela 4: Comparação interétnica da distribuição dos alelos de NAT2 e a frequência do
fenótipo de acetilação lenta encontrada nas diferentes populações. A soma dos alelos não
representa necessariamente 100% porque na maioria dos estudos os alelos raros não foram
considerados. (Tabela construída a partir das informações obtidas de Meyer & Zanger, 1997;
Jorge-Nebert et al., 2002; Moussa et al., 2002; Dandara et al., 2003).
Acetiladores
População
NAT2*4
NAT2*5
NAT2*6
NAT2*7
NAT2*14
40-70%
-
-
-
-
-
-
24%
43%
31%
2%
0
-
26%
46%
26%
2%
0
-
22%
44%
26%
1%
1%
59%
-
-
-
-
-
Americanos-africanos
-
35%
30%
23%
5%
8%
Africanos nativos
-
-
-
-
-
-
lentos
Eurodescendente

Americanos
brancos

Europeus
brancos

Espanhóis
brancos

Franceses

Gabonese
-
27%
40%
22%
2%
9%

Tanzânia
49%
30,8%
33,8%
20,5%
3,4%
11,5%

Venda
38%
23,4%
38,5%
21,9%
5,2%
10,9%

Zimbabwea
52%
28,8%
30,7%
20,9%
5,8%
13,8%
Marroquinos
61,8%
-
-
-
-
-
Gregos
66,3%
-
-
-
-
-
Orientais
10-30%
-
-
-
-
-

Japoneses
11,4%
67%
1%
22%
10%
0

Chineses
-
53%
5%
30%
12%
0

Coreanos
-
68%
2%
18%
11%
1%
-
-
-
-
-
-
Ameríndios

Ngawbe
27,6%
72%
2,4%
0
23,3%
-

Embera
39%
61%
9,9%
3,7%
22,8%
-
Devido ao fato de NAT1 e NAT2 catalisarem a ativação metabólica de aminas
aromáticas
e
heterocíclicas
carcinogênicas
assim
como
estarem
envolvidas
na
biotransformação de xenobióticos, polimorfismos genéticos em NAT1 e NAT2 podem
modificar o risco de câncer relacionado à exposição a esses carcinógenos, bem como resultar
também na ocorrência de reações adversas a drogas e eficácia terapêutica. Na tentativa de se
estabelecer uma associação entre o perfil de acetilação e o desenvolvimento de uma
determinada doença, estudos de coorte ou do tipo caso-controle têm sido realizados através da
27
INTRODUÇÃO
Raquel Lima de F. Teixeira
utilização de ferramentas de fenotipagem e genotipagem. No caso do gene NAT2, já é clara a
correlação entre o fenótipo de acetilação lenta e o desenvolvimento de câncer de bexiga, bem
como a correlação entre o fenótipo de acetilação rápida com o desenvolvimento de câncer de
cólon (Hein et al., 2000).
Durante muitos anos, a isoniazida vem sendo apontada como uma droga hepatotóxica
e estudos de associação entre o fenótipo de acetilação e a suscetibilidade a essas reações
adversas vêm sendo realizados. Dois estudos iniciais feitos na população oriental verificaram
a associação do fenótipo de acetilação lenta com a hepatotoxicidade induzida pela INH (Ohno
et al., 2000; Huang et al., 2002). Através da genotipagem pela técnica de PCR-RFLP esses
autores comprovaram que, dentre os pacientes submetidos ao tratamento quimioterápico antiTB, aqueles que continham alelos para acetilação lenta apresentavam risco aumentado de
desenvolvimento de hepatotoxicidade pela isoniazida. Recentemente, novos estudos em
diferentes populações observaram que, de fato, indivíduos portadores de um genótipo
associado à acetilação lenta estariam predispostos a desenvolverem hepatite medicamentosa
causada por drogas anti-TB (Hiratsuka et al., 2002; Kinzig-Schippers et al., 2005; Shimizu et
al., 2006; Cho et al., 2007; Higuchi et al., 2007). Em contrapartida, outros autores observaram
associação entre acetiladores rápidos e suscetibilidade à ocorrência de efeitos colaterais
durante o tratamento anti-TB (Mitchell et al., 1975) ou nenhuma relação entre o perfil de
acetilação e a hepatotoxicidade induzida por essas drogas (Singh et al., 1995a; Singh et al.,
1995b; Roy et al., 2006; Vuilleumier et al., 2006), mostrando que esses resultados
discrepantes precisam ser elucidados.
1.7) Genética molecular da mono-oxigenase CYP2E1
O citocromo P450 é uma hemoproteína e constitui o complexo enzimático mais
importante das reações de biotransformação de Fase I. As isoenzimas que compõem o
complexo CYP450 participam do sistema de oxidação da célula e estão localizadas na
membrana do retículo endoplasmático liso, preferencialmente das células do fígado.
Entretanto, essas mono-oxigenases já foram identificadas em diversos tecidos como no
intestino, pâncreas, cérebro, pulmão, rim, medula óssea, pele, ovários e testículos (Wijnen et
al., 2007).
As proteínas CYP450 estão agrupadas em famílias e subfamílias de acordo com a
similaridade entre as sequências de aminoácidos; membros da mesma família possuem ≥ 40%
28
INTRODUÇÃO
Raquel Lima de F. Teixeira
de identidade na sequência aminoacídica e membros da mesma subfamília compartilham ≥
55% de identidade (Figura 15).
CYP 2 E 1*1A
família
isoforma
subfamília
variante alélica
Figura 15: Nomenclatura das isoenzimas da super família CYP450.
As mono-oxigenases P450 atuam no metabolismo de vários substratos endógenos e na
síntese de lipídios hidrofóbicos como o colesterol, hormônios esteróides, ácidos biliares e
ácidos graxos. Além disto, algumas enzimas do complexo P450 metabolizam várias
substâncias exógenas incluindo drogas, substâncias químicas ambientais e poluentes, bem
como produtos derivados de plantas. O metabolismo de substâncias exógenas por CYP450
geralmente resulta na desintoxicação da substância; entretanto, as reações desencadeadas por
essas enzimas podem levar a geração de metabólitos tóxicos que contribuem para o aumento
do risco de desenvolvimento de cânceres e outros efeitos tóxicos (Nebert & Russel, 2002).
O sequenciamento do genoma humano permitiu a identificação de cento e quinze
genes humanos de CYP450: cinquenta e sete genes ativos e cinquenta e oito pseudogenes
(http://drnelson.utmem.edu/cytochromeP450.html). As isoenzimas CYP450 pertencentes às
famílias 1-3 são responsáveis por 70-80% de todas as reações de Fase I dos fármacos
utilizados atualmente, enquanto CYPs das outras famílias participam da metabolização de
componentes endógenos (Wijnen et al., 2007). A CYP2 constitui a maior família de
isoenzimas e compreende um terço de todas as CYPs humanas (Figura 16). Os genes que
codificam para essas enzimas são polimórficos e a frequência da distribuição das variantes
alélicas nos diferentes grupos étnicos varia. Em geral, quatro fenótipos podem ser
identificados: metabolizadores lentos, que não possuem uma boa atividade enzimática;
metabolizadores intermediários, geralmente heterozigotos para um alelo deficiente;
metabolizadores rápidos, que possuem dois alelos normais e, por último, os metabolizadores
ultrarrápidos, que possuem várias cópias do gene (Ilgelman-Sundberg, 2004).
29
INTRODUÇÃO
Raquel Lima de F. Teixeira
Bupropion
Efavirenz
Sparteína
Bufuralol
Paclitaxel
Repaglinida
Substratos
Tolbutamida
S-Warfarina
Fenitoína
Nicotina
Coumarin
2C8
 5%
2D6
< 5%
2C9
 15%
2A6
 10%
Omeprazol
S-Mefenitoína
Clorzoxazona
Acetaminofeno
Etanol
Cafeína
Fenacetina
Midazolam
Eritromicina
Ciclosporina
Testosterona
Simvastatina
2E1
 15%
3A4/5/7
 35%
1A2
 10%
2C19
 5%
2B6
< 5%
Quinidina
Inibidores
Montelukast
Metoxsaleno
Tranilcipromina
Sulfafenazol
Fluconazol
Indutores
Rifampicina
Fenobarbial
ThioTEPA
Cetoconazol
Itraconazol
Fluconazol
Furafilina
Fluvoxamina
Piridina
Disulfiram
Fenobarbial
Rifampicina
Carbamazepine
Dexametazone
Fenobarbial
Rifampicina
Etanol
Isoniazida
Fumo
omeprazol
Fenobarbial Fenobarbial
Rifampicina Rifampicina
Figura 16: Abundância relativa das isoformas de CYP450 no fígado e alguns exemplos de substratos,
inibidores e indutores (Pelkonen et al., 2008).
A enzima CYP2E1, membro da superfamília do citocromo P450, é expressa
principalmente no fígado, mas pode ser encontrada em outros órgãos como rins, trato
gastrintestinal e cérebro. Suas funções abrangem desde a oxidação do etanol, gerando
produtos reativos como acetaldeído e o radical 1-hidroxietil, até a metabolização de várias
drogas e procarcinógenos. Além do etanol, CYP2E1 pode ser induzido por diversas drogas
como, por exemplo, a isoniazida, e também por hidrocarbonetos, benzeno, clorofórmio e
diversos solventes orgânicos (Caro & Cederbaum, 2004) (Figura 16).
A atividade de CYP2E1 é modulada pela presença de polimorfismos em vários sítios
ao longo do gene. Dois polimorfismos se localizam na região promotora e são detectáveis
através de digestão com as enzimas de restrição Pst I e Rsa I (Figura 17). Esses SNPs estão
em completo desequilíbrio de ligação e podem estar relacionados com a expressão gênica de
CYP2E1, uma vez que estão localizados no sítio de ligação do fator de transcrição HNF-1
(Watanabe et al., 1994). Três genótipos de CYP2E1 podem ser classificados pela técnica de
PCR-RFLP utilizando a enzima Rsa I (c1/c1, c1/c2 e c2/c2), onde o alelo tipo-selvagem é
denominado c1 (presença do sítio de restrição) e o alelo mutante é denominado c2 (ausência
do sítio de restrição). De acordo com as recomendações recentes para a nomenclatura de
CYP2E1,
o
alelo
*1A
equivale
ao
c1
(http://www.cypalleles.ki.se/cyp2e1.htm).
30
e
o
alelo
*5
equivale
ao
c2
INTRODUÇÃO
Raquel Lima de F. Teixeira
O polimorfismo detectável pela enzima Dra I (7632T>A) está localizado no íntron 6 e
gera a variante alélica CYP2E1*6 (ausência do sítio de restrição - Figura 17). Outro
polimorfismo localizado na região promotora de CYP2E1 é uma inserção/deleção de 96 pb
(alelos CYP2E1*1D e *1C) que pode regular a expressão desse gene. Alguns estudos têm
demonstrado que as variantes alélicas CYP2E1*5, *6 e *1D estariam associadas com um
aumento da atividade enzimática (Watanabe et al., 1994; Carriere et al., 1996). Entretanto,
outros autores não confirmaram qualquer relação desses polimorfismos com a atividade de
CYP2E1 (Powell et al., 1998).
locus CYP2E1 (cromossomo 10q24.3)
promotor
Intron 6
Íntron
96 pb/indel
SNP -G1293C
Pst I
SNP T7632A
Dra I
SNP -C1053T
Rsa I
Figura 17: Localização dos polimorfismos no locus de CYP2E1 e as respectivas enzimas de restrição
utilizadas para detectar os diferentes genótipos (adaptado a partir de Das-Roy et al., 2008).
Vários estudos têm descrito a influência dos polimorfismos em CYP2E1 no
desenvolvimento de vários tipos de câncer. Entretanto, os resultados são contraditórios. A
maioria dos trabalhos destaca a mutação –1053C>T na região promotora do gene, a qual varia
significativamente em termos de freqüência, dependendo do grupo étnico estudado. O alelo
mutante está presente com uma frequência de 2-8% em eurodescendentes enquanto que em
asiáticos varia entre 25-36% (Neuhaus et al., 2004). Em 2003, Huang e colaboradores
mostraram a associação do genótipo *1A/*1A com o risco de desenvolvimento de lesão
hepática induzida pela isoniazida, em pacientes adultos com tuberculose, independentemente
do perfil de acetilação (OR 2,52; IC 95% 1,26-5,05 - Huang et al., 2003). Posteriormente,
Vuilleumier e colaboradores observaram a mesma associação entre o genótipo tipo-selvagem
e a hepatotoxicidade induzida pela isoniazida, durante a quimioprofilaxia para a tuberculose
(Vuilleumier et al., 2006). Entretanto, um estudo com crianças indianas e outro com a
população coreana não observaram nenhuma relação entre os efeitos adversos hepáticos com
o genótipo *1A/*1A de CYP2E1, durante o tratamento anti-TB (Roy et al., 2006; Cho et al.,
2007). Assim, novos estudos em diferentes populações e com um número amostral maior são
necessários para verificar a real influência dos polimorfismos no gene CYP2E1 com a
ocorrência de lesão hepática durante o tratamento contra a tuberculose.
31
INTRODUÇÃO
Raquel Lima de F. Teixeira
1.8) Genética molecular das glutationas S-transferases
As GSTs constituem uma superfamília de enzimas multifuncionais e ubíquas que
desempenham um papel importante na desintoxicação celular, protegendo macromoléculas de
ataques de reativos eletrofílicos. São enzimas de Fase II que catalisam o ataque nucleofílico
da glutationa (GSH), em componentes que contêm um átomo eletrofílico de carbono,
nitrogênio ou enxofre. A conjugação da GSH com esses compostos quase sempre leva a
formação de produtos menos reativos e mais solúveis em água, prontos para a excreção pelo
organismo (Hayes, et al., 2005; Parl, 2005).
As glutationas transferases são de grande interesse para farmacologistas e
toxicologistas, uma vez que são alvos de drogas no tratamento de asma e câncer além de
metabolizarem drogas, inseticidas, herbicidas, carcinógenos e produtos de estresse oxidativo.
Polimorfismos nos genes que codificam para as diferentes GSTs são frequentemente
correlacionados com a suscetibilidade a diversos tipos de câncer, bem como à doença hepática
alcoólica (Strange et al., 2000; Strange et al., 2001; Coughlin & Hall, 2002; Hayes, et al.,
2005; Parl, 2005).
Em humanos, oito famílias gênicas de GSTs solúveis (ou citossólicas) já foram
descritas: alfa () localizada no cromossomo 6, mu () no cromossomo 1; teta () no
cromossomo 22, pi () no cromossomo 11; zeta () no cromossomo 14, sigma () no
cromossomo 4; kappa () (localização cromossômica não determinada) e omega () no
cromossomo 10 (Strange et al., 2001). Essa classificação é baseada na identidade entre
sequências de aminoácidos, especificidade de substratos, afinidade química, estrutura protéica
e comportamento cinético da enzima. Essas enzimas são altamente expressas no fígado
constituindo até 4% do total de proteínas solúveis, mas podem ser observadas em diversos
outros tecidos (Landi, 2000). As GSTs apresentam uma sobreposição de substratos
específicos e a deficiência em uma isoforma pode ser compensada por outras isoformas. A
glutationa S-transferase mu (GSTM1), glutationa S-transferase teta (GSTT1) e glutationa Stransferase pi (GSTP1) têm sido as isoformas mais estudadas (Pemble, et al., 1994; Geisler &
Olshan, 2001; Henrion-Caude, et al., 2002; Vineis et al., 2004; Raimondi et al., 2006; Holley
et al., 2007).
A subfamília GST mu é codificada por cinco genes arranjados em tandem (5_GSTM4-GSTM2-GSTM1-GSTM5-GSTM3-_3), formando um cluster gênico de 100 kb no
cromossomo 1p13.3 (Figura 18). Já foram identificados polimorfismos em GSTM1 e as
32
INTRODUÇÃO
Raquel Lima de F. Teixeira
consequências clínicas dos genótipos resultantes das combinações dos alelos GSTM1*0,
GSTM1*A e GSTM1*B têm sido amplamente investigadas (Brockmöller et al., 1994; Cotton
et al., 2000; Coughlin & Hall, 2002; Parl, 2005). Os indivíduos que possuem o genótipo
homozigoto nulo para GSTM1 (GSTM1*0/ GSTM1*0) não expressam essa proteína. Desta
maneira, a ausência deste gene pode causar um maior acúmulo de metabólitos reativos no
organismo, aumentando a probabilidade de interação com as macromoléculas celulares e a
iniciação do processo tumoral. GSTM1*A e GSTM1*B diferem apenas em uma base no éxon
7 e codificam monômeros que formam dímeros ativos. A atividade catalítica das enzimas
codificadas por ambos os alelos são similares (Widersten et al., 1991). Em 1997, McLellan e
colaboradores descreveram uma variante alélica em dois indivíduos da Arábia Saudita que
demonstraram uma atividade enzimática ultrarrápida devido à presença de duas cópias de
GSTM1 entre os genes GSTM2 e GSTM5 (McLellan et al., 1997).
O gene GSTM1 é flanqueado por duas regiões quase idênticas de 4,2 Kb. A deleção
GSTM1*0, causada por uma recombinação homóloga entre essas duas regiões repetidas,
resulta na perda de um fragmento de 16 Kb contendo o gene GSTM1 inteiro (Figura 18).
GSTM1 é excisado de forma precisa deixando os genes adjacentes, GSTM2 e GSTM5, intactos
(Parl, 2005). Em estudo de espécimes de fígado de cento e sessenta e oito indivíduos
japoneses autopsiados, Harada e colaboradores (1987) observaram que o alelo nulo GSTM1*0
era mais frequente nos fígados portadores de hepatite e hepatocarcinoma em relação a fígados
controles (Harada et al., 1987).
GSTM4
GSTM2
GSTM1
GSTM5
GSTM3
Alelo wild-type
Alelo nulo
Figura 18: Localização estrutural do cluster gênico de 100 kb que codifica para a subfamília
GST mu (cromossomo 1p13.3). A figura indica o evento de recombinação homóloga que
pode acontecer nesse locus e originar o alelo nulo (GSTM1*0 – ausência de GSTM1). Figura
adaptada de Parl, 2005.
A subfamília GST teta consiste de dois genes, GSTT1 e GSTT2, localizados no
cromossomo 22q11.2 e separados por aproximadamente 50 Kb (Figura 19). Uma análise da
porção de 119 Kb contendo os dois genes revelou duas regiões flanqueando GSTT1, HA3 e
33
INTRODUÇÃO
Raquel Lima de F. Teixeira
HA5, com mais de 90% de homologia. HA3 e HA5 contêm duas regiões de 403 pb idênticas
e, de forma semelhante a GSTM1*0, a deleção de GSTT1*0 é causada provavelmente por
recombinação homóloga entre essas duas regiões repetidas (Figura 19) (Parl, 2005).
Diferentemente de GSTM1, GSTT1 apresenta as atividades de desintoxicação e
ativação. Por exemplo, GSTT1 é capaz de ativar di-halometanos a diclorometanos,
aparentemente envolvidos no desenvolvimento de câncer de fígado e pulmão em
camundongos (Pemble et al., 1994). Em humanos, GSTT1 é expressa também nos eritrócitos
e possivelmente desempenha um papel mais global na desintoxicação inicial de xenobióticos
e carcinógenos.
HA3
HA5
GSTT1
50 Kb
GSTT2P
GSTT2
DDCT
DDCT
Alelo wild-type
Alelo nulo
Figura 19: Localização estrutural do cluster gênico que codifica para a subfamília GST teta (cromossomo
22q11.2). A figura mostra duas regiões repetitivas que flanqueiam o gene GSTT1 e que, através de
recombinação homóloga, permitem a sua excisão do cromossomo (alelo GSTT1*0). Figura adaptada de Parl,
2005.
Deficiências na atividade de GST, devidas aos genótipos nulos de GSTM1 e GSTT1,
podem modular a suscetibilidade ao desenvolvimento de hepatotoxicidade induzida por
drogas e xenobióticos. Além disso, foi observado que as frequências dos alelos GSTM1*0 e
GSTT1*0 variam de acordo com os diferentes grupos étnicos (Landi, 2000; Parl, 2005). A
lesão hepática induzida pela isoniazida tem sido associada à depleção do conteúdo de
glutationa, com uma redução da atividade de GST, em modelo animal com hepatotoxicidade
por drogas anti-TB (Sodhi et al., 1996).
Em 2001, Roy e colaboradores demonstraram que indivíduos homozigotos nulos para
GSTM1 apresentavam um risco relativo de 2,12 para desenvolver hepatotoxicidade induzida
por drogas anti-TB. Entretanto, esses autores não verificaram a associação do genótipo nulo
de GSTT1 com o desenvolvimento de reação adversa a isoniazida (Roy et al., 2001). De
forma similar, em outro estudo realizado na população tailandesa, também foi verificado que
somente o genótipo nulo de GSTM1 aumenta o risco de desenvolvimento de lesão hepática
(OR 2,23; IC 95% 1,07-4,67 - Huang et al., 2007). Por sua vez, Leiro e colaboradores
observaram o contrário: indivíduos o com genótipo nulo de GSTT1 apresentaram um risco
34
INTRODUÇÃO
Raquel Lima de F. Teixeira
aumentado em desenvolver hepatotoxicidade induzida por drogas anti-TB e nenhuma
associação significativa foi observada entre o genótipo GSTM1*0/*0 e a lesão hepática em
pacientes sob tratamento anti-TB (Leiro et al., 2008). Esses estudos sugerem um efeito
protetor das glutationas S-transferases em relação aos efeitos hepatotóxicos da isoniazida;
entretanto, novas populações devem ser avaliadas para verificar quais desses polimorfismos
podem ser utilizados como marcadores genéticos para o risco de ocorrência de efeitos
colaterais durante tratamento anti-TB.
Os brasileiros formam uma das populações mais heterogêneas do mundo, resultado de
mais de cinco séculos de cruzamento interétnico: europeus, representados principalmente por
portugueses, escravos africanos e ameríndios. Quando os portugueses chegaram ao Brasil, em
22 de abril de 1500, havia aproximadamente 2,5 milhões de indígenas vivendo nesta área
(IBGE, 2000). A primeira colonização neste país envolveu principalmente integrantes do sexo
masculino, o que acabou ocasionando o casamento entre homens europeus com mulheres
indígenas. Posteriormente, com a chegada dos escravos durante o ciclo econômico da canade-açúcar, começaram a ocorrer relacionamentos entre europeus e africanas. Após a abertura
dos portos para outras nações, o Brasil recebeu ainda um grande número de imigrantes de
várias partes da Europa, incluindo Itália, Espanha e Alemanha e, no século 20, foi a vez da
imigração asiática principalmente por parte dos japoneses, libaneses e sírios contribuindo
ainda mais para a miscigenação brasileira (IBGE, 2000).
O alto nível de diversidade genômica e a extensa miscigenação da população brasileira
têm implicações importantes nos estudos de farmacogenética, uma vez que não é possível a
extrapolação dos dados encontrados em grupos étnicos fechados para a maioria das pesquisas
realizadas no país. Além disso, a contribuição genética de cada etnia parental aconteceu de
forma diferenciada ao longo das regiões do país fazendo com que cada estado brasileiro
apresente a sua particularidade no perfil de variantes gênicas. Sendo assim, um estudo de
associação entre os polimorfismos de genes metabolizadores de drogas e a ocorrência de
hepatotoxicidade seria de grande relevância na população brasileira já que a tuberculose é
uma doença com alta incidência no Brasil, onde a quimioprofilaxia com INH é preconizada, e
levando-se em conta que a distribuição dos alelos de NAT2, CYP2E1, GSTM1 e GSTT1 varia
de acordo com a etnia.
35
OBJETIVOS
Raquel Lima de F. Teixeira
2- OBJETIVOS
36
OBJETIVOS
Raquel Lima de F. Teixeira
Geral: Avaliar a possível associação entre as variantes alélicas dos genes NAT2, CYP2E1,
GSTM1 e GSTT1 e a ocorrência de efeitos adversos hepáticos em pacientes sob tratamento
anti-tuberculose, com esquema contendo isoniazida, atendidos em um hospital geral do Rio de
Janeiro, referência para AIDS.
Objetivos específicos:

Determinar a freqüência de SNPs no gene NAT2 em amostras de duas regiões
brasileiras (Rio de Janeiro e Goiás);

Identificar novos SNPs na região codificante de NAT2 e caracterizar novos
alelos/haplótipos na população estudada;

Determinar os haplótipos de NAT2 mais freqüentes e os perfis de acetilação presentes
nas populações de estudo, comparando as freqüências alélicas encontradas no Rio de
Janeiro e em Goiás;

Avaliar os efeitos de polimorfismos importantes na estrutura molecular tridimensional
da proteína NAT2;

Identificar a freqüência dos alelos c1 (–1053C) e c2 (–1053T) de CYP2E1 no grupo de
estudo proveniente do RJ;

Identificar a freqüência dos genótipos nulos para os genes GSTM1 e GSTT1 no grupo
de estudo proveniente do RJ.

Avaliar a associação entre o fenótipo de acetilação lenta (presença de dois alelos de
NAT2 que caracterizam baixa atividade) com a hepatotoxicidade e/ou hepatite
medicamentosa em pacientes sob tratamento anti-TB, com esquema contendo
isoniazida, residentes no Rio de Janeiro;

Avaliar a possível associação entre a ocorrência de hepatotoxicidade e/ou hepatite
medicamentosa e a presença de polimorfismos no gene que codifica para CYP2E1 em
pacientes sob tratamento anti-TB, com esquema contendo isoniazida, residentes no
Rio de Janeiro;

Avaliar a possível associação entre a ocorrência de hepatotoxicidade e/ou hepatite
medicamentosa e a presença de um ou dois alelos nulos das glutationas S transferases
M1 e T1 em pacientes sob tratamento anti-TB, com esquema contendo isoniazida,
residentes no Rio de Janeiro.
37
OBJETIVOS
Raquel Lima de F. Teixeira
Metas:

Obter informações a respeito da variabilidade dos genes em estudo tendo em vista sua
grande relevância na farmacologia e a existência de poucos dados disponíveis na
população brasileira;

Descrever as frequências dos diferentes polimorfismos nos genes que codificam para
NAT2, CYP2E1 e GSTs na população estudada;

Fornecer dados que serão úteis para a avaliação futura de novas drogas, modificação da
conduta terapêutica ou correção da dosagem individual com base nos perfis genômicos
envolvidos, tendo em vista que a concentração de isoniazida recomendada em nosso país
(400mg/dia) difere da preconizada pela OMS (300mg/dia).
Hipótese nula:

Pacientes com tuberculose em tratamento específico, contendo isoniazida, e que
apresentam polimorfismos genéticos no gene que codifica para NAT2, resultando num
fenótipo de acetiladores lentos, bem como nos genes CYP2E1, GSTM1 e GSTT1
apresentam um risco de desenvolverem hepatotoxicidade similar aos acetiladores
rápidos e aqueles não possuem os polimorfismos nos outros genes em questão.
Hipótese alternativa:

Pacientes com tuberculose em tratamento específico, contendo isoniazida, e que
apresentam polimorfismos genéticos no gene que codifica para NAT2, resultando num
fenótipo de acetiladores lentos, bem como nos genes CYP2E1, GSTM1 e GSTT1
apresentam
risco
maior
de
desenvolverem
medicamentosa.
38
hepatotoxicidade
e/ou
hepatite
RESULTADOS
Raquel Lima de F. Teixeira
3- RESULTADOS
39
RESULTADOS
Raquel Lima de F. Teixeira
CAPÍTULO I
Essa etapa incluiu a padronização da amplificação e seqüenciamento da região codificante de
NAT2, a análise da distribuição dos alelos de NAT2 e o perfil de acetilação de indivíduos
residentes do Rio de Janeiro e de Goiás. Esses resultados encontram-se publicados no
manuscrito:
“Genetic profile of the Arylamine N-Acetyltransferase 2 coding gene among individuals from
two different regions of Brazil”.
Revista de publicação: Mutation Research: Fundamental and Molecular Mechanisms of
Mutagenenesis 2007; 624(1-2):31-40.
40
Available online at www.sciencedirect.com
Mutation Research 624 (2007) 31–40
Genetic profile of the arylamine N-acetyltransferase 2 coding gene
among individuals from two different regions of Brazil
Raquel L.F. Teixeira a , Antonio B. Miranda b , Antonio G. Pacheco c ,
Márcia Q.P. Lopes a , Joseane Fonseca-Costa d , Marcelo F. Rabahi e ,
Hedi M. Melo f , Afrânio L. Kritski d , Fernanda C.Q. Mello d ,
Philip N. Suffys a , Adalberto R. Santos a,∗
a
b
Laboratory of Molecular Biology Applied to Mycobacteria, Department of Mycobacteriosis, IOC/Fiocruz,
Avenida Brasil 4365, Manguinhos, Rio de Janeiro, CEP 21040-900, Brazil
Laboratory for Functional Genomic and Bioinformatics, Department of Biochemistry and Molecular Biology, Fiocruz,
Avenida Brasil 4365, Rio de Janeiro, CEP 21040-900, Brazil
c Department of Epidemiology and Quantitative Methods in Health, National School of Public Health/Fiocruz,
Rua Leopoldo Bulhões 1.480, Manguinhos, Rio de Janeiro, CEP 21040-900, Brazil
d Hospital Complex - HUCFF-IDT, Federal University of Rio de Janeiro, Rua Professor Rodolpho Paulo Rocco 255,
Ilha do Fundão, Rio de Janeiro, CEP 21941-913, Brazil
e Anuar Auad Infectious Disease Reference Hospital, Av.do Contorno, s/n, Goiânia, CEP 74853-400, Brazil
f Santa Maria State Hospital, Estrada do Rio Pequeno 656, Rio de Janeiro, CEP 22723-195, Brazil
Received 11 July 2006; received in revised form 11 January 2007; accepted 1 March 2007
Available online 19 April 2007
Abstract
Arylamine N-acetyltranferase 2 is the main enzyme responsible for the isoniazid metabolization into hepatotoxic intermediates
and the degree of hepatotoxicity severity has been attributed to genetic variability in the NAT2 gene. The main goal of this study
was to describe the genetic profile of the NAT2 gene in individuals from two different regions of Brazil: Rio de Janeiro and Goiás
States. Therefore, after preparation of DNA samples from 404 individuals, genotyping of the coding region of NAT2 was performed
by direct PCR sequencing. Thirteen previously described SNPs were detected in these Brazilian populations, from which seven:
191 G > A; 282 C > T; 341 T > C; 481 C > T; 590 G > A; 803 A > G and 857 G > A are the most frequent in other populations. The
presence of so-called ethnic-specific SNPs in our population is in accordance with the Brazilians’ multiple ancestry. Upon allele
and genotype analysis, the most frequent NAT2 alleles were respectively NAT2*5B (33%), NAT2*6A (26%) and NAT2*4 (20%)
being NAT2*5/*5 the more prevalent genotype (31.7%). These results clearly demonstrate the predominance in the studied Brazilian
groups of NAT2 alleles associated with slow over the fast and intermediate acetylator genotypes. Additionally, in Rio de Janeiro, a
significantly higher frequency of intermediate acetylation status was found when compared to Goiás (42.5% versus 25%) (p = 0.05),
demonstrating that different regions of a country with a population characterized by a multi-ethnic ancestry may present a large
degree of variability in NAT2 allelic frequencies. This finding has implications in the determination of nationwide policies for use
of appropriate anti-TB drugs.
© 2007 Elsevier B.V. All rights reserved.
Keywords: NAT2; Polymorphism; Genotyping; Sequencing; Admixed population; Brazilian subjects
∗
Corresponding author. Tel.: +55 21 2598 4289; fax: +55 21 2270 9997.
E-mail address: [email protected] (A.R. Santos).
0027-5107/$ – see front matter © 2007 Elsevier B.V. All rights reserved.
doi:10.1016/j.mrfmmm.2007.03.015
41
32
R.L.F. Teixeira et al. / Mutation Research 624 (2007) 31–40
determination they are not taken into account. Considering only the seven most common SNPs, four result in
an amino acid change leading to a significant decrease
in acetylation capacity (SNPs 191 G > A, 341 T > C,
590 G > A and 857 G > A). The other three (282 C > T,
481 C > T and 803 A > G) are silent mutations or do not
alter the phenotype [19].
It has been demonstrated that the frequencies of
genotypes and phenotypes in different ethnic closed
populations are variable [20]. Ethnic-specific SNPs like
191 G > A, which is commonly found in the NAT2*14
haplotype cluster and is associated with low INH acetylation, is present in African Americans and Sub-Saharan
Africans, but it is absent or rarely found in European
descents [6,21,22] where the most frequent SNPs are
the 341 T > C, and the frequently associated 481 C > T
and 282 C > T. In this population the frequency of defective alleles lacking these SNPs is less than 3% [23,24].
Another variant, 857 G > A, although relatively uncommon in most of ethnic closed populations, is present in a
high frequency in Asians and Amerindians [25–28]. In
mixed Hispanic population, a high impact of the genetic
admixture of Asian origin (Central American Indians)
and European descents (Spaniards) was reflected by
the high heterogeneity of genotypes and phenotypes
observed [29].
Brazilians are members of one of the most heterogeneous population in the world, result of five centuries
of ethnic admixture of people from three continents:
the European colonizers mainly represented by the
Portuguese, the African slaves and the autochthonous
Amerindians [30]. Thus, the admixture of ethnicities is
spread all over the country with predominance of certain groups depending on the region. Having in mind the
diversity of NAT2 allele distribution related to this factor
it is reasonable to expect different N-acetylation statuses
in these different regions. However, INH-containing
schemes for TB-treatment in Brazil use a standardized dosage for INH administration irrespectively of the
region.
Recently, the genetic diversity of NAT2 has been
clearly demonstrated among thirteen different native
Americans populations including three from Brazil
(Karitiana, Surui and Xavante) [31]. We described here
the first genetic profile of the NAT2 gene of individuals from two distinct urban regions of Brazil: Rio de
Janeiro and Goiás, respectively in the Southeast and
Center West region. These two States reflect a distinct
population behavior which results in different ethnic
characteristics. Rio de Janeiro is one of the most important economic and touristic poles of the country and
its cosmopolite characteristic results in high national
1. Introduction
The increasing incidence of tuberculosis (TB) worldwide together with the spreading of multidrug resistant
strains (MDR) of Mycobacterium tuberculosis are the
main reasons why this disease is considered an important public health problem. In addition, control of this
endemic disease is also hampered by liver adverse
reactions (ADRs) induced by anti-TB drugs that are
important causes of morbidity/mortality [1,2] and represent an annual cost of approximately 100 billion US$
in the US [3].
Isoniazid (INH), one of the most important drugs used
in anti-TB treatment and in TB chemoprophylaxis, is
also the major drug involved in hepatotoxicity [4,5].
Arylamine N-acetyltransferase 2 (NAT2), a cytosolic
phase II conjugation enzyme, is responsible for the
N-acetylation of arylamine and hydrazine xenobiotics,
including drugs and carcinogens being consequently
associated with drug effects or toxicity levels. In
humans, two different genes (NAT1 and NAT2) located
in the chromosome 8 p22 encode N-acetyltransferases
with partly overlapping substrate specificities [6–8].
N-Acetyltransferase 2 is mainly responsible for INH
metabolization intermediating the generation of hepatotoxins. Both loci are highly polymorphic and differences
in INH-induced toxicity, discovered over 40 years ago,
have been attributed to genetic variability in the NAT2
gene [9–11].
Polymorphism at the N-acetylation level is an
example of a pharmacogenetic trait that implies on
interindividual and interethnic differences in response
to xenobiotics. From the clinical point of view, Nacetylation polymorphism has been implicated with
therapeutic effects and adverse reactions of various
amine-containing drugs and in the susceptibility to cancers and others disorders. In fact, epidemiological studies
have suggested that several NAT1 and NAT2 alleles are
linked to increased susceptibility to drug toxicity and
cancer risk caused by arylamine exposure [5,7,12–16].
Variations within the NAT2 gene were initially studied
because of their association with INH metabolism and
drug-induced side effects in TB patients [17,18]. The
wild type NAT2*4 allele and 35 other variants of NAT2
gene were identified and classified in human populations
depending on the haplotype determined by the combination of up to four out of the 17 different single nucleotide
polymorphisms (SNPs) present throughout the
NAT2 coding region (www.louisville.edu/medschool/
pharmacology/NAT.html). Several other rare SNPs
were described in other populations and reported
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/GenBank), but for allele
42
R.L.F. Teixeira et al. / Mutation Research 624 (2007) 31–40
and international migration rates. On the other side, in
Goiás, this migratory flux is not observed with favors
a more homogeneous population with predominance of
Amerindians and Amerindians/European descents.
33
primer3/primer3 www.cgi). Genotyping of the NAT2 coding
region was performed by generation of the intronless 1093 bp
PCR fragment and direct sequencing. For PCR amplification
100 ng of genomic DNA were added to a reaction mixture
containing 200 ng of each primer (NAT2EF and NAT2ER),
0.2 mM of each dNTP, 4.0 mM MgCl2 , 10% glycerol, 10 mM
Tris–HCl pH 9.0, 50 mM KCl, 0.1% Triton X-100, and 1.1 U
of DNA polymerases (mixture of 1 U of Taq DNA polymerase
and 0.1 U of Tli DNA polymerase - Promega Corporation,
USA). Samples were incubated at 94 ◦ C for 5 min, followed
by 35 cycles 94 ◦ C for 1 min. 57.5 ◦ C for 1 min and 72 ◦ C for
1 min; final extension took place at 72 ◦ C for 5 min. Evaluation of the PCR product was achieved by electrophoresis on
a 1% agarose gel followed by ethidium bromide (0.5 ␮g/ml)
staining. The PCR products were purified with ammonium
acetate 2.5 M and used for direct sequencing. Four different
sequencing reactions, using the described primers, were performed separately for each sample. Sequencing was performed
using ABI PRISM Big Dye Terminator v. 3.1 Kit (PE Applied
BioSystems), according to the manufacturer’s recommendations, on an ABI PRISM 3730 DNA Analyser (PE Applied
BioSystems).
2. Methods
2.1. Selection of subjects and sample collection
Four hundred and four consanguineously unrelated individuals from two different geographic regions of Brazil were
enrolled in this study. They comprised 248 active TB patients
and 50 close healthy contacts of smear positive pulmonary
TB cases from the University Hospital Complex: Thoracic
Institute/Clementino Fraga University Hospital from Federal
University of Rio de Janeiro (UFRJ) and Reference Santa
Maria State Hospital, both situated in Rio de Janeiro State and
106 asymptomatic Health Care Workers (HCWs) from Anuar
Auad Infectious Disease Reference Hospital of the State Health
Secretariat of Goiás State, Brazil. This study was approved
by the Institutional Review Boards of the University Hospital
Clementino Fraga Filho (UFRJ), of the State Health Secretariat
of Goiás State, the Oswaldo Cruz Foundation and the Brazilian
Ministry of Health. All participants were informed about the
objectives of the project and a written informed consent was
obtained.
Because of the complete lack of information regarding this
issue in Brazil, sample size was estimated after a number of
assumptions. We worked with a 3:1 ratio. Power for twosample Binomial tests was calculated for different sample sizes
in order to establish a convenient one that would give us at least
80% of power. A review of the literature revealed that for these
SNPs, varying frequencies in one of the alleles is present, so we
also tested frequencies ranging from 0.01 to 0.4. Given these
conditions and a type I error of 0.05 we agreed that a sample of
around 400 individuals would give us enough power to detect
as low as an odds ratio of 1.9 for the 0.4 frequency group (i.e.
a frequency of 0.56 in the other group) up to as high as 7 for
the 0.01 frequency group (0.066 in the other). These figures
seemed reasonable for us, given that for small frequencies in
one group, larger differences should be reached in order to
provide a clinical/biological significant difference.
A volume of 3 ml of venous blood was collected from
each volunteer and stored at −20 ◦ C. Genomic DNA was isolated from 100 ␮l of frozen whole blood using the FlexiGene
DNA Kit (Qiagen Inc., USA), according to the manufacturer’s
specifications. After extraction, DNA samples were stored at
−20 ◦ C.
2.3. Computational analysis
Sequence data of each sample were analyzed for
SNPs identification after alignment with the reference
sequence AY331807 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/GenBank)
through SeqScape v.2.5 software (Applied BioSystemshttp://www.appliedbiosystems.com).
2.4. Statistical analysis
Expected genotype frequencies were calculated from
respective single allele frequencies and were consistent with
Hardy Weinberg equilibrium. Pair-wise linkage disequilibrium
was also tested for the loci studied using conventional methods
as implemented in the R package “genetics” [32].
Overall linkage disequilibrium, estimation of haplotypes
with unknown phase via the EM algorithm and association of
haplotype distributions with geographical region, either using
a score statistic or generalized linear models were performed
as implemented by the R package “haplo.stats” [33], originally
proposed by Schaid et al. [34]. For genotype comparisons, loglinear models were employed and comparisons of frequencies
with published data were performed by Fisher’s exact test, with
Bonferroni correction. All the analyses were carried out with
the statistical package R [35].
2.2. NAT2 genotyping
3. Results
Two sets of primers for PCR amplification and/or sequencing (NAT2 EF 5 TTA GTC ACA CGA GGA AAT CAA A 3
and NAT2 ER 5 AAA TGC TGA CAT TTT TAT GGA TGA 3 .
NAT2 IF 5 ACC ATT GAC GGC AGG AAT TA 3 and NAT2
IR 5 TGG TCC AGG TAC CAG ATT CC 3 ) were designed
using the Primer3 software (http://frodo.wi.mit.edu/cgi-bin/
3.1. SNPs profile of the human NAT2 gene among
Brazilians subjects
Using the direct PCR sequencing approach, analysis
of the 404 DNA samples enrolled in this study revealed
43
34
R.L.F. Teixeira et al. / Mutation Research 624 (2007) 31–40
the presence of 13 previously described SNPs of
which 7 represent the most frequently found in different populations and are registered in the official site
of NAT2 nomenclature (www.louisville.edu/medschool/
pharmacology/NAT.html). Five of the remaining SNPs
have been recently reported in sub-Saharan African populations [36,37] and one (345 C > T) is deposited in
genetic databases (GenBank-Entrez SNP). The allele frequencies of the 13 SNPs found in the present study and
their presumed influence on the protein sequence are
shown in Table 1. No significant differences were found
between the frequencies of any SNP when Rio de Janeiro
and Goiás were compared (Table 1).
among the defective alleles (those associated with slow
acetylation). Comparison of the frequencies between Rio
de Janeiro and Goiás by the use of Generalized Linear
Model (GLM) revealed significant differences in the distribution of the NAT2*4. (p-value 0.02), which were 1.6
times higher in Goiás. Additionally, Table 2 shows the
lower allele diversity found in Goiás compared to Rio de
Janeiro. Out of the 16 allele variants characterized, 15
were identified in Rio de Janeiro and only 11 in Goiás.
3.2. Determination of the NAT2 allele variants
present in Rio de Janeiro and Goiás
For genotype characterization, a total of six SNPs
were excluded (two synonymous and four that were not
in LD with any other) since they were not informative for
phenotype prediction. From the remaining samples only
those homozygous for all SNPs found or heterozygous
for only one SNP were considered. In this way, genotype
determination was achieved for 50% of the samples (202
out of 404).
The distribution of the genotype frequencies and the
predicted phenotypes in Rio de Janeiro and Goiás is
shown in Table 3. A total of 14 different genotypes
was observed with an overall predominance of the low
acetylation status (49%) being the *5/*5 genotype the
most frequent (31.7%). The characterization of the fast
and intermediate phenotypes was predominantly determined respectively by the wild type *4/*4 and *4/*6
genotypes while the slow acetylation phenotype was
determined by both *5/*5 and *6/*6 genotypes. Out
3.3. Genotype characterization of the NAT2 gene
and preliminary determination of the acetylation
status
A linkage disequilibrium test (LDT) was carried out
with the identified SNPs and it was observed that four
SNPs (345 C > T; 403 C > G; 683 C > T and 838 G > A)
were not in LD with any other being consequently
excluded for allele characterization.
Sixteen different haplotypes were identified in the
study population by the use of the Score Test (R for
Windows Version 2.2.1) [35] allowing the characterization of the corresponding NAT2 alleles. Table 2 shows
the frequency of each allele variant found in the overall studied population and after stratification in the two
different studied regions. Among the functional alleles,
the NAT2*4 (wild type) was the most frequent with an
overall frequency of 20% whereas the alleles *5B and
*6A were the more frequent (33% and 26% respectively)
Table 1
Frequency of point mutations in the N-acetyltransferase (NAT2) gene among Brazilian subjects from Rio de Janeiro and Goiás
SNPs
70A
191Ad
282Td
341Cd
345T
403G
481Td
590Aa
609T
683T
803Gd
838A
857Ad
a
b
c
d
Total
Rio de Janeiro
Goiás
na
%
nb
%
nc
%
01
33
298
306
02
05
284
215
03
02
322
04
36
0.1
4.1
37
38
0.3
0.6
35
27
0.4
0.2
40
0.5
4.4
1
28
226
236
0
4
217
155
2
2
245
3
27
0.2
5
38
40
0
1
36
26
0.3
0.3
41
0.5
4.5
0
5
72
70
2
1
67
60
1
0
77
1
9
0
2
34
33
1
0.5
32
28
0.5
0
36
0.5
4.2
Frequency refers to 808 alleles.
Frequency refers to 596 alleles.
Frequency refers to 212 alleles.
Seven most common SNPs in the world.
44
p-value
Effect
aa change
0.8416
0.3055
0.4686
0.2312
0.7991
0.823
0.3739
0.6462
0.8439
0.8337
0.3877
0.9682
0.9028
Missense
Missense
Silent
Missense
Silent
Missense
Silent
Missense
Missense
Missense
Missense
Missense
Missense
L24I
R64Q
None
I114T
None
L135V
None
R197Q
E203D
P228L
K268R
V280M
G286E
Table 2
Frequency of the NAT2 allele variants among individuals from Rio de Janeiro and Goiás
T70A
G191A
C282T
T341C
C481T
G590A
G609T
A803G
G857A
Total
RJa
GOb
ORc
95% CI
p-value
4
12A
13
5A
5B
5C
6A
6Bd
7B
14Ad
14B
NCd
NCd
NCd
NCd
NCd
T
T
T
T
T
T
T
T
T
T
T
T
T
A
T
T
G
G
G
G
G
G
G
G
G
A
A
G
G
A
A
G
C
C
T
C
C
C
T
C
T
C
T
C
C
C
T
T
T
T
T
C
C
C
T
T
T
T
T
T
T
T
T
T
C
C
C
T
T
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
G
G
G
G
G
G
A
A
G
G
G
G
G
G
G
G
G
G
G
G
G
G
G
G
G
G
G
T
T
G
G
T
A
G
A
A
G
G
A
A
A
A
A
A
G
A
A
G
G
G
G
G
G
G
G
G
A
G
G
G
G
G
A
A
0.20
0.04
0.03
0.02
0.33
0.03
0.26
<0.01
0.04
<0.01
0.03
<0.01
<0.01
<0.01
<0.01
<0.01
0.17
0.04
0.03
0.03
0.34
0.03
0.26
<0.01
0.04
<0.01
0.04
<0.01
<0.01
<0.01
<0.01
0
0.28
0.03
<0.01
<0.01
0.31
0.01
0.28
0
0.04
0.01
<0.01
0
0
0
0
<0.01
1.71
0.91
0.16
0.17
–
0.54
1.14
–
0.89
–
0.24
–
–
–
–
–
1.11–2.64
0.39–2.11
0.02–1.21
0.02–1.36
–
0.15–1.86
0.76–1.71
–
0.38–2.11
–
0.05–1.06
–
–
–
–
–
0.02
0.83
0.08
0.10
–
0.33
0.53
–
0.80
–
0.06
–
–
–
–
–
NC: not classified according to the official NAT2 nomenclature. All estimatives and comparison were carried out according to Schaid et al. [34] and Sinnwell and Schaid [33].
a Rio de Janeiro (596 alleles).
b Goiás (212 alleles).
c Odds ratio.
d Rare alleles.
R.L.F. Teixeira et al. / Mutation Research 624 (2007) 31–40
NAT2 alleles
35
45
36
R.L.F. Teixeira et al. / Mutation Research 624 (2007) 31–40
Table 3
Genotype characterization of NAT2 gene and preliminary determination of acetylation status in 202 Brazilians subjects from two different regions
Cluster designation
Total
n
Rio de Janeiro
%
n
Goiás
%
n
p-value
%
*4/*4
*4/*12a
*4/*13a
*12/*12a
*13/*13a
Fast acetylation
16
5
2
3
1
27
7.9
2.5
1
1.5
0.5
13.4
7
4
2
2
1
16
4.8
2.7
1.4
1.4
0.7
10.9
9
1
0
1
0
11
16.1
1.8
0
1.8
0
19.6
0.002
–
–
–
–
–
*4/*5a
*4/*6
*4/*7a
*4/*14a
*12/*5a
*13/*6a
Intermediate acetylation
3
46
6
4
9
8
76
1.5
22.8
3
2
4.5
4
37.6
3
36
4
4
7
8
62
2.1
24.7
2.7
2.7
4.9
5.5
42.5
0
10
2
0
2
0
14
0
17.9
3.6
0
3.6
0
25
–
0.37
–
–
–
–
–
*5/*5
*6/*6
*14/*14a
Slow acetylation
64
34
1
99
31.7
16.8
0.5
49
49
18
1
68
33.6
12.3
0.7
46.6
15
16
0
31
26.8
28.6
0
55.4
0.25
0.003
–
–
Total
a
202
100
146
100
56
100
Genotype frequencies lower than 5%.
that of European descents, Germans and Polish and significantly lower (p < 0.01) than Sub-Saharan Africans
(Guinea Bissau). The frequency of 857 G > A polymorphism, was significantly higher in Brazil than in
European descents, Germans and Spanish (p < 0.05) and
significantly lower than Thai, Chinese and Amerindians
(p < 0.01). Aditionally, the SNPs 341 T > C, 481 C > T
and 803 A > G, all highly prevalent in European and
African populations, were also frequently observed in
Brazil (Table 4). The frequency of the SNP 341 T > C in
Brazilians was significantly higher than in Japanese, Chinese and Amerindians populations (p < 0.01). The SNP
481 C > T was also more frequent in our studied population than in Asian populations like Japanese and Chinese
(p < 0.001) as well as in Amerindians (p < 0.001) but less
frequent than in European descents (p < 0.05), while SNP
803 A > G was observed at a higher frequency than in
Japanese and Amerindians (p < 0.001). Finally, the frequency of SNP 282 C > T was significantly higher than
in Spanish and European descents (p < 0.05) while that
of SNP 590 G > A was significantly higher only when
compared with Amerindians (p < 0.001).
of the 14 genotypes identified, 6 were not found in
Goiás. A comparison of the predicted phenotypes of
Rio de Janeiro and Goiás showed an statistically significant higher frequency of the intermediate acetylation
phenotype in Rio de Janeiro (p = 0.05). The same comparison for fast and slow acetylation phenotypes showed
no statistic differences (Table 3). After clustering the
genotypes with frequencies lower than 5% in a group
designated as rare, a statisticaly significant difference
was observed in the frequencies of the *4/*4 and *6/*6
genotypes upon comparison of Rio de Janeiro and Goiás
(p-values 0.002 and 0.003, respectively). Furthermore,
Table 3 shows that *4/*4 and *6/*6 genotypes were 3.4
and 2.3 times more frequent in Goiás than in Rio de
Janeiro.
3.4. Interethnic distribution of SNPs of NAT2 gene
The sequencing-based determination of SNPs in the
NAT2 gene of Brazilians allowed, for the seven most
prevalent SNPs worldwide, the comparison of the allele
frequencies observed in our study with the frequencies observed in different ethnic populations around the
world (Table 4). The SNP 191 G > A, mainly identified
in African populations, and 857 G > A, of Asian origin but also prevalent in Amerindian populations, were
found in our population. The frequency of 191 G > A
was significantly higher (p < 0.01) in our population than
4. Discussion
In the present study, by sequencing the entire NAT2
coding region in clinical samples collected from Brazilians resident in two different regions of the country, we
46
R.L.F. Teixeira et al. / Mutation Research 624 (2007) 31–40
37
Table 4
Allelic frequency of the most common SNPs of NAT2 human gene in different populations
Population
SNP (%)
191A
282T
341C
481T
590A
803G
857A
Brazil (808 alleles)
European descentsa (2068 alleles)
Germanb (1688 alleles)
Polishc (496 alleles)
Spanishd (1008 alleles)
Thaie (470 alleles)
Japanesef (96 alleles)
Chineseg (882 alleles)
4.1R
1**
0.1*
0*
1.6
ND
0
ND
36.8 R
25.8**
30.8
33.5
27.3φ
47.4
37.3
30.5
37.7R
45.9
46.5ϕ
44.4
45
ND
1.6*
6*
35.4R
45.6φ
42.5
38.3
44.8ϕ
3.8*
1.6*
6*
26.4R
26.4
27.8
30
26
32.5
28.3
30.5
40.3R
47
42.4
39.3
47.2
ND
7.4*
ND
4.5R
1.2**
1.3φ
3.4
1.2φ
20.4*
11.3
11.2**
Amerindians
Ngawbeh (210 alleles)
Emberah (272 alleles)
ND
ND
25.2
29
2.4*
9.9*
2.4*
9.2*
0*
3.7*
1.9*
9.9*
23.3*
22.8*
Africani (234 alleles)
Sub-Saharan Africanj (250 alleles)
Effect on enzymatic activity
6.8
19.2*
Decrease
32.5
ND
No effect
35.9
ND
Decrease
29.5
ND
No effect
27.4
ND
Decrease
46.5
ND
No effect
2.2
ND
Decrease
ND: not determined. Bonferroni correct p-value: R: reference. ϕ p-value 0.1–0.05. φ p-value 0.05–0.01. ** p-value 0.01–0.001. * p-value < 0.001.
a [24].
b [21].
c [39].
d [23].
e [27].
f [26].
g [25].
h [28].
i [39] pooled data of Gabonese and Dogon populations.
j [40] Guinea Bissau population.
these silent SNPs belong to the group of the most frequently distributed around the world is not well known.
In our population, SNP 282 C > T was found in frequencies significantly higher than in European descents and
Spanish (p < 0.01 and <0.05, respectively). This may be
interpreted as one of the consequences of the influence
of Amerindians and Africans in the constitution of the
Brazilian population.
Several SNPs with recognized role in the determination of the acetylation phenotype have been observed
with significant high frequencies within certain ethnic
groups. The variation 191 G > A (which characterizes
the cluster NAT2*14), is more prevalent in African populations whereas the SNP 857 G > A is predominant in
Asians and Amerindians. The SNPs 341 T > C (cluster
NAT2*5), 481 C > T and 803 A > G are usually present in
high frequencies among Europeans and Africans while
SNP 590 G > A (cluster NAT2*6) is more prevalent in
Asians [21–28,38–43]. The finding of SNPs (191 G > A,
341 T > C and 857 G > A of different ethnic-origin in
two different regions of Brazil corroborates with the
multiple ancestry of Brazilian population and clearly
shows the influence of different ethnicities in the gene
described the frequency of 13 SNPs, seven of which
are those commonly found in high frequencies in ethnic closed populations in the world. Four of them (191
G > A, 341 T > C, 590 G > A, 857 G > A) are associated with the slow acetylation phenotype and three (282
C > T, 481 C > T and 803 A > G) have been demonstrated
not to interfere with the acetylation status. Six SNPs (70
T > A; 345 C > T; 403 C > G; 609 G > T; 683 C > T and
838 G > A), that do not take part of the official NAT2
nomenclature, were found in frequencies lower than 1%
in the studied groups and their influence on the acetylation phenotype has not been established yet. However,
except for the 345 C > T the remaining five are Africanspecific SNPs corroborating with the natural history of
the African admixture in the constitution of the Brazilian population [36,37]. Analysis of our samples showed
that although some SNPs (70 T > A, 345 C > T and 683
C > T) are not detected in Goiás, no statistically significant difference was observed when the frequencies
of any the SNP identified were compared between the
two regions. Additionally, two SNPs (282 C > T and 481
C > T, both silent mutations) were observed in high frequencies of 37% and 35%, respectively. The reasons why
47
38
R.L.F. Teixeira et al. / Mutation Research 624 (2007) 31–40
pool of Brazilians, a trihybrid population with European,
African and Amerindian roots.
Upon submitting the 13 SNPs identified in the present
study to a linkage disequilibrium test (LDT), and after the
exclusion of 4 SNPs that were not in LD with any other,
16 different alleles were characterized. Five of which
have not been described yet, in consequence, no information is available on their functional activity. Among
the remaining 11 alleles, the majority (n = 8) were defective (associated with slow acetylation phenotype), from
which NAT2*5B and *6A were the most frequent. The
NAT2*4 was the most frequent one among the functional
alleles and upon comparing frequencies of all alleles in
individuals from Rio de Janeiro and Goiás, only the wild
type allele showed a statistically significant difference
being higher in Goiás. Additionally, samples from Goiás
presented lower allele diversity than those from Rio de
Janeiro. Despite of this and taking into account the overall allele distribution, there was a general predominance
of defective alleles in both regions.
It was observed that the slow acetylation phenotype
is mainly characterized by the NAT2*5B allele (33%),
followed by NAT2*6A (26%), whereas the NAT2*4 was
the most frequent among the functional alleles (20%).
These findings once more suggest the influence of Europeans and Africans in the composition of the Brazilian’s
genetic background, considering the high incidence of
NAT2*5 and NAT2*6 alleles among these two populations [22,42]. In Asians, both NAT2*6 and NAT2*7
alleles are the main responsible for the low acetylation
phenotypes while the NAT2*5 cluster is rare [26,27].
Finally, in Amerindians, NAT2*7B is the main allele
responsible for the low acetylation status, with low incidence or absence of other low activity alleles [28]. The
NAT2*7 was observed at low frequency (4%) among
Brazilian individuals of both regions.
A total of 120 DNA samples were either homozygous
for all SNPs or heterozygous for only one SNP, allowing the definition of the haplotype pairs. However, after
the exclusion of six SNPs that were not informative for
phenotype prediction, we were able to characterize 202
individuals’ genotypes and predict their acetylation status. We obtained a total of 14 different genotypes with
a predominance of the slow acetylation status (49%)
represented mainly by NAT2*5/*5 and NAT2*6/*6. Furthermore, the two regions studied here showed a different
distribution of genotypes and acetylation status with a
statistically significant higher frequency of the intermediate acetylation phenotype in Rio de Janeiro.
Further analysis of these two regions showed a lower
diversity of allele and genotype variants in Goiás, probably as a consequence of the high influence of Amerindian
population (already characterized by a decreased genetic
diversity and reduced genotype variability) in this region,
according with the history of Brazil’s colonization. The
high migratory movement of different population groups
along the Brazilian territory results in a considerable
phylogeographical heterogeneity, probably influencing
the distribution of allelic variants of NAT2 among the
different geographical regions of the country. Therefore, characterization of NAT2 alleles profile in different
regions of Brazil would be of high importance.
The high frequency of genotypes with slow acetylation activity alleles observed in the two studied regions
of Brazil indicates a significant prevalence of the slow
acetylation phenotypes, suggesting a higher probability
of hepatic injury in TB patients upon INH treatment. The
data we present on the genetic diversity among people
from two different regions of Brazil also demonstrate
the importance of genotyping NAT2 in other regions
since anti-TB medications in Brazil are standardized for
the whole country. Prediction of hepatotoxicity phenotypes based on genotypes in different regions of Brazil
may help the application of more appropriate therapeutic
schemes to avoid adverse effects and to reduce treatment
cost.
In conclusion, this first evaluation of NAT2 gene in
Brazilians subjects demonstrated a considerable prevalence of slow acetylators over rapid acetylators and
established a basis for further detailed clinical and
epidemiological investigations of NAT2 and other conditions associated with the acetylation polymorphism in
the different ethnic groups of the country.
Acknowledgments
This work was supported by MCT/DECIT/MS and
Faperj/Pronex Proc: E-26/171.207/2003. Raquel L.F.
Teixeira was fellow awarded by FAPERJ/FIOCRUZ
program. Adalberto R. Santos is supported by CNPq
Grant number 308786/2005-0. We thank the nursing service of the Anuar Auad Infectious Disease Reference
Hospital, Santa Maria Hospital from the State of Rio
de Janeiro and from the Hospital Tuberculosis Control
Program/Thoracic Diseases Institute/Clementino Fraga
Filho University Hospital, for sample collection. Additionally we also thank the PDTIS-FIOCRUZ Sequencing
and Bioinformatics Platforms support.
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50
RESULTADOS
Raquel Lima de F. Teixeira
CAPÍTULO II
Essa etapa incluiu a redação de um pedido de patente nacional, relacionada ao
campo da Biologia Molecular e Genômica, especialmente a Farmacogenômica, que inclui
metodologia passível de aplicação para orientação de condutas terapêuticas utilizando os
novos polimorfismos descritos.
A referida patente intitula-se “Método para a predição do desfecho do tratamento de
doenças humanas utilizando fármacos metabolizados pela N-acetiltransferase 2 humana
(NAT2) com base em polimorfismos genéticos” sendo depositada no INPI (Instituto Nacional
de Propriedade Industrial) na data de 04-10-07 onde recebeu seu número de depósito
BRPI0704093-8. Os inventores são: Raquel Lima de F. Teixeira, Adalberto Rezende Santos,
Antonio Basílio de Miranda e Philip Noel Suffys da FIOCRUZ e Fernanda C. Q. Mello e
Afrânio Lineu Kritski da UFRJ.
Em outubro de 2008, segundo informação da GESTEC, a Fiocruz estendeu o pedido
de patente nacional para patente internacional, a ser protegida em alguns mercados ainda por
serem definidos. O número do pedido de patente depositado no exterior via sistema PCT
(Patent Cooperation Treaty), é PCT/BR2008/000304, depositado em 06-10-2008.
51
RESUMO
“Método para a predição do desfecho do tratamento de doenças
humanas
utilizando
fármacos
metabolizados
pela
N-
acetiltransferase 2 humana (NAT2) com base em polimorfismos
5
genéticos”
A presente invenção está relacionada ao campo da Biologia
Molecular
e
Genômica,
especialmente
a
Farmacogenômica.
A
invenção descreve a presença de novos polimorfismos no gene
que
10
codifica
humana
para
(NAT2),
fármacos
a
a
qual
importantes
etiologias
enzima
diversas,
é
na
Arilamina
responsável
terapêutica
bem
como
de
N-acetiltransferase
pela
de
metabolização
2
de
várias
doenças
de
inúmeras
toxinas
e
carcinógenos presentes em alimentos, cigarro e no ambiente. A
presente invenção inclui metodologia passível de utilização na
15
terapêutica utilizando os polimorfismos descritos.
52
“Método para a predição do desfecho do tratamento de doenças
humanas
utilizando
fármacos
metabolizados
pela
N-
acetiltransferase 2 humana (NAT2) com base em polimorfismos
genéticos”
5
Campo da Invenção
A presente invenção está relacionada ao campo da Biologia
Molecular
Descreve
e
a
Genômica,
presença
especialmente
de
novos
a
Farmacogenômica.
polimorfismos
no
gene
que
codifica para a enzima Arilamina N-acetiltransferase 2 humana
10
(NAT2), a qual é responsável pela metabolização de fármacos
importantes
diversas,
15
na
terapêutica
bem
como
presentes
em
invenção
inclui
de
alimentos,
de
várias
inúmeras
cigarro
metodologia
doenças
toxinas
e
no
passível
de
e
carcinógenos
ambiente.
de
etiologias
A
presente
utilização
na
terapêutica utilizando os polimorfismos descritos.
Fundamentos e Estado da Arte
A
análise
de
variações
na
seqüência
de
DNA
para
a
compreensão dos diferentes fenótipos observados no ser humano
tem
20
sido
o
principal
foco
da
pesquisa
genética
durante
décadas. Diferentes testes têm sido extensivamente explorados
através da análise de ligações, segundo os quais, mutações em
um único gene podem ser suficientes não somente para explicar
variações na suscetibilidade de diferentes indivíduos a uma ou
mais
25
doenças
como
também
para
explicar
variações
inter-
individuais de resposta a um determinado fármaco. O tipo mais
comum de variação encontrada no genoma humano é o polimorfismo
de base única (Single Nucleotide Polymorphism - SNP). Tais
variações
têm
sido
identificadas
53
como
marcadores
genéticos
para doenças de etiologias diversas sendo também relacionados
com diferentes fenótipos de metabolização de xenobióticos.
Ingelman-Sundberg, J Int Med 250: 186-200 2001; Roses, A.D
Life
5
Sciences
Journal
of
70:1471-1480
Nursing
farmacogenéticos,
2002
104:60-70
nos
quais
e
Prows
2004,
foram
&
Prows,
através
American
de
estudos
avaliadas
variações
genéticas que causam diferentes respostas aos medicamentos, ao
incluírem dados acerca das diferenças na eficácia, interações
fármaco-fármaco
10
e
o
risco
relativo
de
reações
adversas,
identificaram uma associação de vários SNPs com a expressão ou
atividade
de
receptores
farmacológicos,
proteínas
transportadoras, sinalizadoras e enzimas do metabolismo.
Um dos principais objetos de estudo da farmacogenética
refere-se a análise de enzimas envolvidas na biotransformação
15
de
fármacos.
Variações
nos
genes
que
codificam
para
essas
enzimas podem resultar em uma diminuição de atividade destes
fármacos, e favorecer o aparecimento de reações adversas por
toxicidade
devido
a
uma
baixa
metabolização
e
conseqüente
acúmulo do princípio ativo ou de metabólitos intermediários
20
tóxicos
(metabolizadores
lentos).
Por
outro
lado,
segundo
Ingelman-Sundberg, J Int Med 250: 186-200 2001, a presença de
variantes alélicas que não afetam a atividade enzimática, isto
é,
25
alelos
funcionais
(que
caracterizam
metabolizadores
rápidos)
ou
com
(metabolizadores
ultra-rápidos)
pode
concentrações
séricas
um
fenótipo
múltiplas
estar
subterapêuticas
cópias
associada
do
de
a
fármaco.
Adicionalmente, de acordo com Kalow, Pharmacological Reviews
49:369-379 1997, nos casos de heterozigose onde os indivíduos
sejam portadores de um alelo que caracterize baixa atividade
54
enzimática e um alelo funcional, um fenótipo de acetilação
intermediária é originado.
A enzima N-acetiltransferase 2 humana (NAT2), codificada
pelo
5
gene
NAT2
fármacos
está
utilizados
tuberculose
envolvida
na
metabolização
correntemente
(isoniazida),
para
hipertensão
o
de
vários
tratamento
arterial
de:
(hidrazinas
anti-hipertensivas), hanseníase (dapsona) e arritmia cardíaca
(procainamida anti-arritmica) além de sulfametazina e outras
sulfonamidas usadas para a terapia de outras desordens (Weber,
10
The
Acetylator
Press,
N.Y.
Genes
1987).
and
Drug
Várias
Response,
mutações
Oxford
pontuais
University
na
região
codificante do gene NAT2 são capazes de alterar a atividade de
15
acetilação
da
fenótipos:
acetiladores
(Hein,
al.,
et
Prevention,
enzima
2000.
9:29-42).
podendo
resultar
lentos,
Cancer
O
em
três
intermediários
Epidemiology,
fenótipo
de
diferentes
e
rápidos
Biomarkers
acetilação
and
lenta,
caracterizado por determinados perfis genotípicos leva a um
acúmulo do fármaco e consequentemente ao desenvolvimento de
reações adversas, as quais são principalmente caracterizadas
20
por
neuropatias
periféricas
e
hepatite.
Já
o
fenótipo
de
acetilação rápida leva a uma diminuição dos níveis séricos do
fármaco,
as
quais
podem
baixar
até
alcançar
níveis
sub-
terapêuticos levando conseqüente à uma falência terapêutica
(Ingelman-Sundberg, J Int Med 250: 186-200 2001).
25
A enzima NAT2 participa também de vias de ativação de
poluentes ambientais com potencial carcinogênico, tais como,
2-aminofluoreno, 4-aminobifenil, benzidina, beta-nafitilamina
e
algumas
aminas
heterocíclicas
presentes
em
pirolisados
protéicos (Kato, CRC Crit Ver.Toxicol. 16:307-348 1986; Weber,
55
The
Acetylator
Genes
and
Drug
Response,
Oxford
University
Press, N.Y. 1987; Hein Biochim Biophys Acta, 948:37-66, 1988).
Adicionalmente, a participação de NAT2 na detoxificação também
tem sido associada à suscetibilidade a doenças induzidas por
5
substâncias
químicas,
Pharmacogenetics,
5:
tais
1-17
como
1995)
neoplasia
(Vatsis
quando
combinação
da
et
al,
da
ingestão de carne vermelha com o fumo (Potter et al Câncer
Epidem. Biomarkers & Prev., 8: 69-75 1999; Liu et al., Canc
Letters, 133: 115-123 1988).
10
Até o presente momento, já foram identificados 36 alelos
diferentes
para
o
gene
NAT2
(http//www.louisville.edu/medschool/pharmacology/NAT.html),
os
quais consistem na combinação de até 4 mutações pontuais na
região codificante do gene. Estudos funcionais realizados no
15
início desta década demonstraram a existência de diferentes
mecanismos que podem resultar no fenótipo de acetilação lenta
dependendo dos polimorfismos presentes no gene NAT2. Dentre
estes
mecanismos
estão:
(i)
diminuição
da
quantidade
de
proteína sintetizada, (SNPs C190T, T341C, A434C, G590A); (ii)
20
diminuição da atividade enzimática (SNPs C190T, G191A, T341C,
A434C e G59A) e (iii) diminuição da estabilidade da enzima
NAT2
(SNPs
G191A,
A845C
e
G857A),
(Fretland
et
al,.
Pharmacogenetics, 11:207-215 2001; Zhu & Hein, Biol. Chem.,
383: 983-987 2002).
25
Por outro lado, outras mutações descritas
na literatura como por exemplo T111C, C282T, C481T, C759T e
A803G, não exercem nenhum efeito na atividade biológica da
proteína, caracterizando um alelo funcional (Fretland et al,.
Pharmacogenetics,
11:207-215
2001).
Estudos
adicionais
que
avaliaram a relação entre diferentes haplótipos e o desfecho
56
de metabolização, baseados na expressão e atividade enzimática
realizados
com
os
alelos
mais
freqüentes
de
NAT2,
possibilitaram a caracterização dos mesmos quanto ao perfil de
acetilação. Os alelos dos clusters NAT2 *5, *6, *7, *14 e *19
5
conferem um fenótipo de acetilação lenta enquanto os alelos
NAT2 *4 e dos clusters *12 e *13, conferem um fenótipo de
acetilação rápida (Hein et al, Cancer Epidemiology, biomarkers
and Prevention, 9:29-42 2000; Hein, Mutation Research, 506507:65-77. 2002).
10
As Reações Adversas a Drogas (ADRs) são causas comuns de
hospitalização em todo o mundo e passíveis de promover o óbito
de
pacientes
acometidos
por
tais
situações.
Recentemente,
Bagheri et al, J. Clin. Pharmacol. 50: 479-484 2000; Bissell
et al, Hepatology 33:1009-1013 2001; Larrey, Seminars in Liver
15
Disease
22:145155
2002,
descreveram
que,
entre
as
reações
adversas, a lesão hepática é o tipo mais freqüente. Segundo os
autores, a doença hepática induzida por fármacos é uma das
principais complicações durante o uso de antimicrobianos, uma
vez
20
que
o
fígado
é
o
órgão
central
na
biotransformação
e
excreção da maioria dos fármacos e substâncias xenobióticas.
Variações genéticas em enzimas que participam na geração
destes
bioprodutos
tóxicos
podem
resultar
em
diferenças
na
reatividade metabólica a agentes específicos com variações de
indivíduo
25
para
indivíduo.
Assim,
a
determinação
dos
perfis
genotípicos individuais e seus fenótipos resultantes podem ser
de grande valia para os médicos tanto na escolha do fármaco a
ser indicado quanto na determinação da posologia e do esquema
terapêutico a ser adotado, o qual deve encontrar um balanço
adequado
entre
a
eficácia
e
a
57
toxicidade.
Adicionalmente,
estas variações genéticas podem ser utilizadas como marcadores
para identificar pré-disposição a cânceres.
Prince & Brookes, Expert Rev. Mol. Diagn. 1(3) 89-95,2001.
”Towards high-throughput genotyping of SNPs by dynamic allele5
specific hybridization”, descreveram a análise de SNPs como
uma
estratégia
simples
para
o
descobrimento
de
genes
envolvidos em doenças complexas tais como Alzheimer, obesidade
e diabetes melito e anteciparam que os SNPs teriam um papel
muito importante na farmacogenômica, onde a identificação de
10
variações
em
genes
específicos,
determinada
droga,
estabelecer
estratégias
individuais.
toxicidade
relevantes
e
metabolismo
terapêuticas
Refletindo
estas
na
ótimas
eficácia
ajudariam
para
expectativas,
de
a
pacientes
várias
novas
tecnologias têm aparecido ao longo dos últimos anos, cada uma
15
com vantagens particulares, mas todas com o objetivo único de
simplificar
a
análise
dos
SNPs.
Os
autores
descrevem
uma
técnica chamada “Hibridação dinâmica alelo-específica” (DASH),
segundo eles, um método conveniente para a genotipagem de SNPs
e mutações do tipo
20
indel,
(inserção ou deleção), as quais
possuem potencial de aplicação tanto na pesquisa básica como
no diagnóstico clínico. Informam ainda que o DASH comercial
está disponível, tornando a tecnologia acessível para todos os
laboratórios.
Garte, Cancer Epidemology Biomarkers & Prevention Vol.10,
25
1233-1237, December 2001. ”Metabolic Susceptibility Genes As
Cancer Risk Factors” descrevem que polimorfismos em genes da
via
metabólica
conferem
relacionada
suscetibilidade
à
ativação
ao
câncer
de
não
carcinógenos
mostraram
que
uma
associação consistente com o desenvolvimento de câncer quando
58
somente os efeitos principais foram examinados. Isto realmente
era esperado tendo em vista o limitado e específico papel
bioquímico de tais genes no processo carcinogênico. Contudo,
quando
5
grupos
separadamente,
a
particulares
de
importância
destes
casos
são
polimorfismos
examinados
genéticos
torna-se clara. Exemplos da literatura e um modelo hipotético
são
apresentados
como
suporte
de
que
alelos
de
risco
pertencentes à via metabólica devem ser estudados em subgrupos
de estudos do tipo caso controle com maior casuística tendo
10
como hipótese questões relacionadas à ação do produto gênico
em
função
de
variáveis
demográficas,
ambientais
ou
outras
variáveis genéticas.
O pedido de patente US 20030096235 “Methods and products
related to genotyping and DNA analysis”, descreve métodos e
15
produtos relacionados a genotipagem. Este método é baseado no
uso de polimorfismos de base única (SNPs) para uma varredura
ampla e de alta performance do genoma. O método é realizado
através da hibridização de oligonucleotídeos alelo específicos
em um genoma de complexidade reduzida (RCG). A invenção também
20
se relaciona com métodos de: preparo de oligonucleotídeos SNPespecíficos e RCGs, métodos de fingerprinting, determinação da
freqüência alélica para um determinado SNP, caracterização de
tumores, geração de um código de classificação genômico para a
identificação de SNPs desconhecidas, composições relacionadas
25
e kits.
O pedido de patente US 20030049628 “Complexity Management
of
Genomic
DNA”,
descreve
métodos
e
kits
para
reduzir
a
complexidade de uma amostra de DNA através da disponibilização
de métodos (não baseados em gel) para a amplificação de um
59
subgrupo de seqüências em uma amostra com sítios de restrição
para duas ou mais enzimas, através da ligação de adaptadores
aos fragmentos, de forma que somente um subgrupo de fragmentos
possa ser amplificado. Esta invenção descreve adicionalmente
5
procede a análise do produto amplificado acima por hibridação
com um arranjo que pode ser especificamente desenhado para
características
particulares
dos
fragmentos
desejados,
tais
como, a presença ou ausência de um polimorfismo.
O pedido de patente US 20040053232 “Quantitative trait
10
loci and somatostatin”, relaciona-se ao uso de características
genéticas em gado para a determinação das características da
progênie e para otimizar a manipulação do gado visando um
aumento na performance de amamentação e qualidade da carne. O
alvo especialmente estudado é o locus da somatostatina, o qual
15
está
associado
com
certos
loci
de
características
quantitativas (QTLs). Os SNPs e haplótipos são preditivos do
aumento ou decréscimo da quantidade de tecido no animal.
O pedido de patente US 20040081996 “Methods of validating
SNPs and compiling libraries of assays”, descreve bibliotecas
20
de
ensaios
bibliotecas.
base
única
e
métodos
Os
para
ensaios
(SNPs).
podem
a
compilação
identificar
Adicionalmente,
métodos
de
dados
em
polimorfismos
de
de
de
validação
SNPs e construção de mapas de desequilíbrio de ligação usando
conjuntos ou sub-conjuntos de SNPs são disponibilizados.
25
O pedido de patente US 20050042654 “Genotyping Methods”
descreve
métodos
para
genotipagem
das
genotipagem
utilizam
específicos
para
a
amostras
amplificação
do
amplificadas.
arranjos
polimorfismos
60
DNA
Os
genômico
métodos
de
oligonucleotídeos
de
base
única
e
de
alelo
(SNPs).
Os
métodos
também
relacionam
técnicas
para
a
amplificação
de
múltiplas amostras de DNA de vários indivíduos de maneira a
minimizar
a
possibilidade
de
contaminação
das
amostras
por
produtos amplificados previamente (amplicons).
5
O pedido de patente US 20050153328 “Method and markers for
determining the genotype of horned/polled cattle”, descreve
métodos para a descoberta e utilização de polimorfismos de
base única (SNPs) na determinação do genótipo
Adicionalmente,
10
a
presente
invenção
de ruminantes.
fornece
seqüências
específicas de ácidos nucléicos, SNPs e perfis de SNPs que
podem ser usados com esta finalidade.
Chang-Claude
et
al.,
Cancer
Prevention,11 698-704, 2002.
Epidemiology,
Biomarkers
&
“Differencial Effect of NAT2 on
the Association between Active and Passive Smoke Exposure and
15
Breast Cancer Risk”, em estudo caso–controle realizado para
avaliar o possível efeito diferencial do genótipo de NAT2 na
relação entre fumantes ativos e passivos e o câncer de mama,
descreveram que polimorfismos presentes no gene que codifica
para a enzima N-acetyltransferase 2 (NAT2) influenciam na taxa
20
de metabolização de aminas aromáticas heterocíclicas presentes
no tabaco.
Anitha & Banerjee,
Arylamine
Int J Mol Med Vol.11 125-131, 2003. ”
N-acetyltransferase
2
polymorphism
in
the
ethnic
populations of South India “, mostraram que o polimorfismo da
25
N-acetilação
é
um
trato
genético
refletido
fenotipicamente
pelas diferenças na atividade da N-acetyltransferase 2 (NAT2)
em agentes terapêuticos (acetiladores rápidos e lentos). Os
autores
relatam
os
resultados
da
genotipagem
de
comunidades etnicamente diferentes do sul da Índia.
61
NAT2
de
Após a
genotipagem de 8 diferentes comunidades étnicas, o fenótipo de
acetilação lenta teve predominância de 74% nestas populações
corroborando
asiáticas
5
resultados
onde
esta
encontrados
predominância
é
em
outras
de
cerca
populações
de
60%.
Os
autores não encontraram associação entre o sexo e o fenótipo
de acetilação.
Musbah et al, Squ Journal For Scientific Research: Medical
Sciences 2003 Vol 5, No. 1–2, 9–14. “Distribution of arylamine
N-acetyltransferase 2 (NAT2) genotypes among Omanis”.descreve
10
sistemas
para
a
identificação
da
maioria
dos
polimorfismos
conhecidos de NAT2, tais como: G191A, C282T, C341T, C481T,
G590A, A803G e G857A usando a técnica de
PCR-RFLP (Polymerase
Chain Reaction-Restriction Fragment Length.Polymorphism).
Cavaco et al, Clin Chemical Lab Med ol.41(4) 606-609 2003
15
”CYP3A4*1B
and
NAT2
*14
Allelle
in
a
Native
African
Population”, relatam polimorfismos de base única nos genes que
codificam
para
o
acetiltransferase
metabolismo
20
de
citocromo
2
uma
P450
(NAT2),
grande
3A4
(CYP3A4)
principais
variedade
de
e
para
a
mediadores
drogas
de
Ndo
uso
terapêutico, bem como de xenobióticos.
Lash et al, Breast Cancer Research Vol: 7 Nº3 R.385-393
2005.
“A case-only analysis of the interaction between N-
acetyltransferase
haplotypes
and
tobacco
smoke
in
breast
cancer etiology“ descreve haplótipos de N-acetyltransferase 2
25
envolvidos com câncer de mama. Mulheres que possuem alelos
mutantes
com
um
genótipo
homozigoto
possuem
uma
taxa
de
ativação metabólica mais baixa das arilaminas aromáticas, um
dos constituintes do tabaco, identificado como carcinógeno. Os
autores levantam a hipótese de que mulheres com câncer de mama
62
com o fenótipo de acetilação lenta possuem um risco aumentado
para o desenvolvimento deste tipo de carcinoma associado com o
fumo ativo ou exposição passiva.
O
5
pedido
de
patente
US
20020128215.
“Novel
sequence
variants of the human N-acetyltransferase 2 (NAT2) gene and
use thereof”, descreve novos polimorfismos no gene NAT2, os
quais
podem
utilizadas
estar
para
envolvidos
o
tratamento
no
de
metabolismo
várias
de
desordens
drogas
bem
como
podem ser utilizados para a determinação de pré-disposição ao
10
desenvolvimento de vários cânceres.
Em resumo, nenhum dos estudos já realizados e documentos
de patentes encontrados revelaram métodos similares, baseados
nos
SNPs
aqui
hepatotóxicos
15
descritos,
provenientes
para
da
predizer
metabolização
os
de
efeitos
drogas
no
organismo de um ser humano, através de variações na seqüência
do
gene
codificador
para
a
enzima
Arilamina
N-
acetiltransferase 2 (NAT2). Estes e outros aspectos vantajosos
formam
coletivamente
os
objetos
da
presente
invenção,
que
serão descritos em mais detalhes a seguir.
20
Sumário da Invenção
A presente invenção inclui seqüências de ácidos nucléicos
mostradas nas FIGS. 1A-1B e Tabela 2, com destaque aos sítios
polimórficos
no
gene
que
codifica
para
NAT2.
A
presente
invenção relaciona-se ainda com oligonucleotídeos, mostrados
25
na
tabela
1,
que
hibridam
especificamente
com
diferentes
regiões da seqüência mostrada nas FIGS. 1A-1B. Adicionalmente,
a
presente
invenção
representados
na
descreve
população
como
de
distintas do Brasil.
63
os
duas
polimorfismos
regiões
estão
geográficas
Métodos
diagnósticos
que
utilizem
toda
ou
parte
das
seqüências contendo os SNPs identificados nesta invenção. Por
exemplo,
podem
5
tais
ser
ácidos
nucléicos
utilizados
polimorfismos
no
como
gene
ou
métodos
de
NAT2
especificamente
para
que
a
os
SNPs,
identificação
estejam
associados
de
à
predisposição a várias doenças, incluindo, mais não limitadas
a câncer de bexiga e câncer de colo e câncer de próstata.
Uma outra aplicação desta invenção inclui a possibilidade
de
10
criação
recebendo
tais
de
um
protocolo
composições
como:
de
prognóstico
terapêuticas
isoniazida,
para
metabolizadas
fenilzina,
pacientes
por
hidrazina,
NAT2,
dapsona,
procainamida, sulfametazina e outras sulfonamidas. O método
inclui:
a)
identificação
de
pacientes
recebendo
uma
destas
drogas; b) determinação do fenótipo de acetilação (rápidos ou
15
lentos) com base no genótipo; e c) conversão dos dados obtidos
no passo (b) em um protocolo de prognóstico. O protocolo de
prognóstico pode incluir a predição da eficácia da droga, a
predição do prognóstico do paciente, a predição de interações
entre drogas, e a predição de efeitos adversos.
20
A invenção também está relacionada com a identificação de
diferenças
entre
exógenos,
incluindo,
agentes
mutagênicos,
aminobifenil,
25
indivíduos
arilaminas
mas
na
não
metabolização
limitados
incluindo
benzidina,
heterocíclicas
a
de
carcinógenos
2-aminofluoreno,
beta-nafitilamina,
presentes
compostos
em
e
ou
4-
certas
pirolisados
de
proteínas.
Em outro contexto, a invenção descreve ainda a freqüência
dos
polimorfismos
de
NAT2
em
duas
populações
de
regiões
geográficas distintas do Brasil, permitindo, com base nestas
64
informações,
suscetíveis
subsidiar
tanto
a
os
a
identificação
doenças
ou
de
desordens
profissionais
de
grupos
étnicos
diversas,
saúde
na
como
mais
também
elaboração
e/ou
redefinição de condutas terapêuticas em especial na escolha do
5
fármaco e sua dosagem a serem
utilizados por um determinado
grupo étnico.
Uma outra aplicabilidade desta invenção é a criação de um
método
para
assistir
no
desenvolvimento
de
novos
compostos
terapêuticos através de ensaios clínicos. O método inclui: a)
10
administração
avaliação
de
de
um
sua
composto
terapêutico
eficácia;
b)
a
um
determinação,
indivíduo
através
e
do
genótipo incluindo os SNPs aqui descritos, se o indivíduo é um
acetilador
rápido
ou
lento;
e
c)
determinar
a
partir
dos
passos (a) e (b), qual composição terapêutica será a mais
15
efetiva para aquele genótipo em particular e qual
estará mais
associada aos efeitos adversos.
Descrição das Figuras
As Figuras 1A-1B mostram a seqüência do gene NAT2 (alelo
selvagem), (SEQ ID NO:1). Estas figuras contém a sequência
20
nucleotídica do tipo selvagem e a sequência de aminoácidos
(SEQ ID NO:2) O nucleotídeo de número 1 refere-se a adenosina
do códon de iniciação “ATG”, o qual encontra-se sublinhado. A
posição das bases referente aos seis novos SNPs descobertos na
região
25
codificante
do
gene
encontram-se
sublinhadas
e
em
negrito e correspondem as substituições de bases listadas na
Tabela 2. O códon de terminação está indicado por um asterisco
(*).
Adicionalmente,
as
trocas
sublinhadas e em negrito.
65
de
aminoácidos
encontram-se
A seguir são apresentadas definições importantes para a
perfeita compreensão do escopo da presente invenção.
“Amplificação
de
ácidos
nucléicos”
refere-se
a
métodos
tais como a reação da polimerase em cadeia (PCR) e reação em
5
cadeia
da
ligase
(LCR).
amplamente
disseminados
reagentes
para
comercialmente
a
Estes
e
métodos
tanto
execução
disponíveis.
os
da
Os
são
bem
conhecidos,
equipamentos
técnica
de
como
PCR
oligonucleotídeos
os
estão
utilizados
para a amplificação de uma região específica do cromossomo são
10
preferencialmente complementares e hibridam especificamente a
seqüências na região cromossômica ou em regiões que flanqueiam
a região alvo. As seqüências geradas por amplificação podem
ser seqüenciadas diretamente ou ainda serem clonadas.
“Sequenciamento de DNA” refere-se a uma técnica utilizada
15
para
determinação
exata
da
sequêcia
nucleotídica
de
um
fragmento particular de DNA ou de um genoma inteiro. A ordem
dos pares de bases na molécula de DNA fornece uma informação
específica da sequência de aminoácidos de uma proteína a ser
produzida por um determinado gene.
20
“Condições de estringência“ para hibridações referem-se as
condições de temperatura e concentração de tampão que permite
a hibridação de um ácido nucléico particular a outro ácido
nucléico
sendo
perfeitamente
25
compartilhar
que
o
primeiro
complementar
algum
grau
de
ao
ácido
segundo,
nucléico
ou
complementariedade,
pode
pode
menor
ser
somente
que
o
perfeito. Por exemplo, algumas condições de alta estringência
podem ser utilizadas, as quais distinguem perfeitamente ácidos
nucléicos
complementares
daqueles
menor.
66
com
complementariedade
“Clonagem” refere-se ao uso de técnicas de recombinação in
vitro a fim de inserir um gene particular ou outra seqüência
de DNA numa molécula que servirá como vetor. Para se obter
sucesso na clonagem de um determinado gene, é necessário o uso
5
de métodos para a geração de fragmentos de DNA, que sejam
capazes
de
se
ligar
a
moléculas
vetores,
com
conseqüente
introdução da molécula híbrida em uma célula hospedeira na
qual poderá se replicar, para então proceder-se a seleção dos
clones contendo o gene alvo.
10
“Veículo de clonagem” refere-se a um DNA de plasmídeo ou
bacteriófago, ou outra seqüência de DNA, a qual seja capaz de
se replicar numa célula hospedeira. O veículo (ou vetor de
clonagem), é caracterizado pela presença de um ou mais sítios
de restrição no qual cada seqüência de DNA pode ser cortada
15
sem a perda da função biológica do DNA o qual pode conter um
marcador
útil
para
a
identificação
e
seleção
das
células
transformadas.
“Gene”
refere-se
a
uma
seqüência
de
DNA
portando
informação genética. Esta pode ser expressa através do RNA
20
mensageiro,
característica
formando
de
um
uma
seqüência
peptídeo
de
específico.
O
aminoácidos
termo
“gene”
inclui regiões não codificantes (regulatórias), as quais não
são transcritas, bem como regiões codificantes para RNAs que
não serão posteriormente traduzidas na forma de proteínas.
25
A seqüência da presente invenção foi obtida a partir do
DNA extraído de células humanas.
“Oligonucleotídeos” refere-se a um ácido nucléico de fita
simples
com
tamanho
oligonucleotídeos
variando
freqüentemente
67
entre
são
2
e
60
sintéticos,
bases.
mas
Os
podem
também ser produzidos a partir de polinucleotídeos que ocorrem
naturalmente.
ligar
a
um
Uma
sonda
ácido
é
um
nucléico
oligonucleotídeo
alvo
com
seqüência
capaz
de
se
complementar
através de um ou mais tipos de ligações químicas, usualmente
5
através
do
pareamento
hidrogênio.
As
complementar
sondas
freqüentemente
de
5
freqüentemente
entre
de
bases
via
pontes
oligonucleotídicas
a
60
15
e
nucleotídeos,
30
bases
possuem
variando
de
de
mais
tamanho.
Um
oligonucleotídeo pode incluir bases naturais (A, T, G, C) ou
10
modificadas (7-deazaguanosina, iosina, etc). Além disto, as
bases podem ser unidas por ligações outras que não a ligação
fosfodiester,
tais
como
uma
ligação
fosfodiéster
ou
uma
ligação fosforotioato.
“Farmacogenômica e Farmacogenética”, Farmacogenômica é a
15
aplicação de abordagens e tecnologias empregadas na Genômica e
identificação
de
alvos
para
drogas.
Em
outras
palavras,
a
farmacogenômica utiliza informação genética para predizer se
uma
droga
irá
contribuir
de
um
tratamento
20
variação
da
ação
positivamente
paciente.
Farmacogenética
e
à
reação
drogas
conteúdo genético do paciente.
diferentemente
ou
aos
e
negativamente
é
sua
o
estudo
relação
com
no
da
o
Os indivíduos respondem
tratamentos
com
drogas;
alguns
positivamente, outros sem modificações óbvias em sua condição
e ainda outros com efeitos colaterais e/ou reações alérgicas.
25
A
Farmacogenética
é
um
subconjunto
da
farmacogenômica,
empregando métodos e técnicas da Genômica e da Bioinformática
para
a
identificação
genômicas
como,
por
de
correlações
exemplo,
característicos.
68
SNPs
entre
e
características
perfis
de
resposta
“Polimorfismos”, em termos gerais, refere-se à habilidade
de
algo
aparecer
em
várias
formas.
Especificamente,
a
existência de duas ou mais formas alternativas (alelos) de um
loco cromossomal diferindo na seqüência nucleotídica.
5
“Seqüência referência” é a seqüência nucleotídica do gene
que codifica para a enzima NAT2 (SEQ ID NO:1) e a seqüência do
aminoácido correspondente da proteína NAT2 (SEQ ID NO:2), como
descrito por Rieder et al 2003 (submissão direta) número de
acesso no geneBank (AY331807).
10
“Polimorfismo
de
base
única
ou
SNP”
refere-se
à
substituição de um único nucleotídeo por outro com os dois ou
mais estados sendo encontrados na população.
“Hospedeiro” inclui procariotos e eucariotos, tais como,
bactérias, leveduras e fungos filamentosos, bem como células
15
vegetais e animais. O termo inclui um organismo ou célula que
recebe um veículo de expressão ou de clonagem replicável.
“Promotor” refere-se à seqüência de DNA reconhecida por
uma RNA polimerase. A presença de tal seqüência permite que a
RNA
20
polimerase
se
ligue
ao
DNA
e
inicie
a
transcrição
de
seqüências gênicas operacionalmente ligadas.
“Região
promotora
promotora”
ou
é
regulatória,
a
região
bem
que
como
inclui
outras
a
seqüência
seqüências,
as
quais, podem ser necessárias para a iniciação da transcrição.
A
25
presença
expressão
da
de
região
outras
promotora
seqüências
é
necessária
gênicas
para
levar
a
operacionalmente
ligadas.
“Fenótipo
de
acetilação
rápida”
refere-se
as
características de metabolização de compostos aminados, que em
69
alguns
indivíduos
é
rápida
em
comparação
com
outros
indivíduos.
“Fenótipo de acetilação lenta” é a característica de um
indivíduo, no qual, a acetilação de compostos aminados é lenta
5
em comparação com outros indivíduos.
“Reações adversas”, referem-se a efeitos não esperados ou
negativos
induzidos
quimioterápico.
As
por
uma
droga
reações
durante
adversas
um
podem
tratamento
ser
locais,
sistêmicas ou alergênicas.
10
Descrição Detalhada da Invenção
Esta invenção relata a identificação de seis novos SNPs na
região codificante do gene que codifica para a proteína Nacetiltransferase 2 (NAT2) humana em indivíduos residentes em
duas diferentes regiões geográficas do Brasil. Os SNPs aqui
15
descritos foram identificados através das técnicas de Reação
em Cadeia da Polimerase (PCR) e seqüenciamento dos produtos
amplificados.
específicas
20
A
de
detecção
DNA
métodos
incluindo,
tamanho
de
pode
mas
fragmentos
de
ser
não
de
polimorfismos
obtida
limitada
restrição
por
a
em
uma
i)
seqüências
variedade
de
polimorfismo
de
(PCR-RFLP)
baseado
na
clivagem específica por uma enzima de restrição de um sitio
alelo específico, (kan e Dozy, Lancet ii:910-912, 1978); ii)
hibridação
com
sondas
oligonucleotídicas
alelo
específicas
(Wallace e cols. Nucl Acids Res. 6:3543-3557 1978), incluindo
25
oligonucleotídeos
Acad.
Sd.
USA
oligonucleotídeos
imobilizados
86:6230-6234
(Maskos
na
(Saiki
e
1969)
Southern
cols,
ou
Nucl.
Proc.
arranjos
Acids
Natl.
de
Res.
17:2503-2516 1993); iii) PCR alelo específico (Newton e cols.,
Nucl Acids Res 17:2503-2516 1989); iv) detecção e reparo de
70
pareamento errôneo “mismatch-repair detection” (MRD) (Faham &
Cox,
Genome
Res.
desnaturante
5:474-482,
de
1995);
gradiente
v)
gel
de
eletroforese
“Denaturing-gradient
gel
electrophoresis” (DGGE) (Fisher e cols, Proc. Natl. Acad. Sci.
5
USA
80:1579-1583
conformação
de
1983);
fita
vi)
detecção
simples
de
“Single
polimorfismo
strand
por
conformation
polimorphism” (SSCP) (Orita e cols, Genomics 5:874-879 1983);
vii) clivagem de pareamento errôneo por
RNAse (Meyers e cols,
Science 230:1242 1985); viii) método químico (Cotton e cols,
10
Proc. Natl. Acad. Sci. USA
8Z4397-440 1988) ou enzimático
(Youil e cols, Proc. Natl. Acad. Sci. USA
92:87-91 1995); ix)
clivagem de DNA heteroduplex; x) métodos baseados na extensão
de primers alelo específicos (Syvanen e cols, Genomics 8:684692
15
1990);
xi)
“Oligonucleotide
ensaio
ligation
de
ligação
Assay”
de
(OLA)
oligonucleotídeo
(Landegren
e
cols,
Science 241:1077 1988); xii) reação em cadeia de ligação alelo
específica
„allele-specific
ligation
chain
reaction
(LCR)
(Barrany, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 88:189-193 1991); xiii)
sequenciamento
20
radioativo
ou
fluorescente
(Sambrook,
J.
&
Russell, D. W. 2001; Molecular cloning: a laboratory manual.
Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New
York).
Os 6 polimorfismos descritos nas FIGs. 1A-1B e Tabela 2
estão localizados na região codificante do gene NAT2 e incluem
25
as seguintes substituições (T  C na base 29, G  T na base
152, G  A na base 203, C  T na base 228, C  T na base 458,
e A  G na base 600). Com exceção dos SNPs C228T e A600G que
são silenciosos, todos os outros 4 SNPs modificam o aminoácido
transcrito nas seguintes posições (SNP T 29 C troca de I  T
71
no aminoácido 10, SNP G 152 T, troca de G  V no aminoácido
51, SNP G 203 A, troca de C  Y no aminoácido 68, SNP C 458 T,
troca de T  I no aminoácido153).
Como descrito acima, a presente invenção está relacionada
5
a uma seqüência de DNA compreendida na região codificante do
gene NAT2, na qual foram identificados 6 novos SNPs. Variantes
muito
próximas
invenção,
também
bem
como
estão
ácidos
incluídas
como
parte
desta
nucléicos
recombinantes
que
contenham qualquer dos SNPs aqui descritos ou as regiões acima
10
ou abaixo dos mesmos na seqüência descrita nas FIGs. 1A-1B e
reivindicações.
Esta
invenção
também
está
relacionada
à
utilização
de
métodos que utilizem ácidos nucléicos (DNA ou RNA) isolados
e/ou
15
recombinantes
que
sejam
caracterizados
pela
sua
capacidade de hibridarem a um ácido nucléico que codifique uma
proteína
ou
polipeptídeo,
tal
como
um
ácido
nucléico
que
contenha a seqüência descrita nas FIGs. 1A-1B ou parte de um
DNA estranho que contenha o mínimo de nucleotídeos suficientes
para codificar um polipeptídeo que contenha parte da seqüência
20
de aminoácidos descrita nas FIGs. 1A-1B e Tabela 2 ou que
codifiquem
para
equivalentes
funcionais,
ou
seja,
um
polipeptídeo que quando incorporado a uma célula hospedeira
tenha
toda
ou
parte
da
atividade
da
proteína
NAT2.
Um
equivalente funcional da proteína NAT2 deve ter uma seqüência
25
de
aminoácido
similar
(no
mínimo
65%
de
identidade)
e
características similares a proteína NAT2. Um ácido nucléico
que
hibrida
com
outro
ácido
nucléico
que
codifica
para
a
proteína NAT2 ou polipeptídeo, tais como descrito nas FIGs.
1A-1B e Tabela 2 podem ser de fita dupla ou de fita simples.
72
Hibridação com um DNA contendo toda ou parte da seqüência
descrita nas FIGs. 1A-1B inclui hibridação tanto com a fita
mostrada como com a sua fita complementar.
Ácidos nucléicos incluindo DNA ou RNA podem ser detectados
5
e isolados por hibridação sob condições de estringência alta
ou moderada, as quais são escolhidas de forma a não permitir a
hibridação
de
seqüências
nucleotídicas
não
complementares.
“Condições de alta estringência” e “condições de estringência
moderada”
10
para
a
exemplificadas
Molecular
em
hibridação
Sambrook,
cloning:
a
de
J.
&
laboratory
ácidos
nucléicos
Russell,
manual.
Cold
D.
são
W.
2001;
Spring
Harbor
Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York. As condições
exatas que determinam a estringência da hibridação dependem
não somente da força iônica, temperatura e concentração de
15
agentes desestabilizadores, tais como formamida, mais também
de fatores tais como o tamanho da seqüência de ácido nucléico,
a composição das bases, percentual de pareamento errôneo entre
as duas seqüências e a freqüência de ocorrência. Assim, as
condições
20
de
alta
ou
moderada
estringência
podem
ser
calculadas empiricamente.
A
presente
invenção
também
diz
respeito
ao
uso
da
seqüência nucleotídica aqui descrita, ou parte da mesma, para
a identificação de sondas de DNA específicas para o gene NAT2
ou oligonucleotídeos para a amplificação (através de PCR) do
25
gene NAT2.
A
presente
invenção
também
descreve,
na
Tabela
1,
oligonucleotideos para a amplificação de dois fragmentos, do
gene
de
NAT2,
codificante
do
que,
juntos,
respectivo
gene
73
compreendem
contendo
toda
os
a
região
polimorfismos
descritos. Os seis novos SNPs presentes na região codificante
do gene NAT2 foram identificados a partir do seqüenciamento
automático dos fragmentos gerados após a amplificação do DNA
por PCR com os dois pares de oligonucleotídeos descritos na
5
Tabela 1. Assim, estes oligonucleotídeos podem ser utilizados
para detecção dos mesmos SNPs em quaisquer amostras de DNA
provenientes de material biológico humano através do PCR e
seqüenciamento.
Os seis novos SNPs descritos nas FIGs. 1A-1B e tabela 2 da
10
presente invenção podem ser utilizados para a determinação de
haplótipos, os quais, quando estendidos e associados aos SNPs
já descritos, podem ser utilizados para a predição do fenótipo
de acetilação (acetilador lento ou rápido) de um determinado
indivíduo. Como descrito no exemplo 1, o DNA pode ser isolado
15
de
diferentes
seqüênciamento
indivíduo
indivíduos
de
pode
polimorfismos,
DNA,
a
ser
o
e,
através
sequência
obtida.
genótipo
é
do
Após
de
gene
a
técnicas
de
NAT2
de
identificação
determinado
permitindo
de
um
dos
assim
a
predição do fenótipo.
20
A invenção também está relacionada a um método de criação
de um protocolo prognóstico para um paciente recebendo algum
agente terapêutico metabolizado por NAT2 tais como, amonafida,
isoniazida,
25
fenilzina,
hidrazina,
sulfametazina
e
outras
identificação
de
pacientes
dapsona,
sulfonamidas.
recebendo
O
procainamida,
método
uma
destas
inclui:
a)
drogas;
b)
determinação do fenótipo de acetilação (rápidos ou lentos) com
base no genótipo; e c) conversão dos dados obtidos no passo
(b) em um protocolo prognóstico. O protocolo prognóstico pode
incluir
a
prevenção
da
eficácia
74
da
droga,
predição
do
prognóstico do paciente, predição de interações entre drogas,
e predição de efeitos adversos. A combinação das seqüências de
DNA geradas com o fenótipo de acetilação fornece um protocolo
prognóstico
5
estudos
específico
têm
mostrado
para
que
àquele
a
indivíduo.
isoniazida
é
Por
mais
exemplo,
tóxica
em
pacientes com fenótipo de acetiladores lentos que em pacientes
com
10
fenótipo
de
acetiladores
identificação
destes
nucleotídicas
fornecidas
rápidos.
pacientes
aqui
pode
Portanto,
usando
as
auxiliar
a
seqüências
no
desenho
de
esquemas terapêuticos balanceando eficácia e toxicidade.
Em outro exemplo, relacionado a um protocolo prognóstico,
pacientes
risco
identificados
de
como
acetiladores
hipersensibilidade
cutânea
lentos
quando
estão
sob
tratados
com
trimetoprin-sulfametoxazole (TMP-SMZ). Desta forma, antes de
15
prescrever
uma
droga
particular,
tal
como
trimetoprin-
sulfametoxazole (TMP-SMZ), o médico pode solicitar um teste
para a identificação do fenótipo de acetilação do paciente
baseado no perfil genotípico e, uma vez o paciente sendo um
acetilador
20
lento
o
médico
então
pode
prescrever
uma
terapêutica alternativa.
Ensaios Clínicos
Esta
invenção
também
relaciona-se
a
um
método
para
auxiliar na avaliação de novos fármacos através de ensaios
clínicos (Clinical Trials). O método inclui: a) administração
25
de
um
agente
terapêutico
(metabolizado
por
NAT2)
a
um
indivíduo e mensuração de sua eficácia; b) determinação do
status de acetilação do indivíduo (rápido ou lento) baseado no
genótipo
ou
haplótipo
do
gene
de
NAT2
incluindo
os
SNPs
descritos na presente invenção e c) determinação a partir dos
75
itens (a) e (b) do agente terapêutico seria mais eficaz para
aquele genótipo em particular. Os ensaios clínicos geralmente
baseiam-se em informações fornecidas pelo paciente, incluindo
idade,
5
sexo
e
histórico
familiar.
A
invenção
fornece
uma
seqüência de DNA do gene de NAT2 contendo novos SNPs os quais
podem
ser
adicionados
ao
banco
de
SNPs
fatores genéticos do paciente em um
e
utilizados
como
ensaio clínico. Como
descrito aqui, um genótipo individual pode ser determinado por
métodos de seqüênciamento de DNA descritos no exemplo 1 desde
10
que seus haplótipos sejam de fase conhecida.
Após a administração da droga o genótipo do paciente pode
então ser comparado com a eficácia da mesma e ocorrência de
quaisquer efeitos adversos. Baseado nesta informação, fármacos
podem
15
ser
desenvolvidos
individuais
os
quais
especificamente
estejam
para
relacionados
com
genótipos
uma
maior
eficácia e/ou menor toxicidade. Genótipos de pacientes que não
respondem
ao
fármaco
utilizem
vias
podem
ser
alternativas
agrupados
de
e
fármacos
que
podem
ser
acetilação
desenvolvidos.
20
Freqüência dos dados
A presente invenção também relata a freqüência dos novos
SNPs em duas diferentes populações do Brasil, como descrito na
Tabela 3.
em
25
Os dados mostram que os SNPs identificados aparecem
diferentes
populações
tratarem
freqüências
estudadas,
de
duas
o
e
que
são
específicos
corrobora
populações
a
nas
hipótese
geneticamente
duas
de
se
distintas
e
consequentemente com fenótipos de acetilação também distintos.
Os SNPs T29C, G152T, G203A e C458T ocorrem exclusivamente na
76
amostra populacional do Rio de Janeiro e os SNPs C228T e A600G
ocorrem exclusivamente na amostra populacional de Goiás.
Como
descrito
anteriormente,
a
enzima
NAT2
tem
sido
associada a uma variedade de doenças e desordens incluindo
5
câncer
de
bexiga,
carcinoma
celular
particularmente,
10
suscetíveis
a
mutagênico
e/ou
câncer
de
urotelial
a
colo,
e
doença
identificação
metabolização
de
carcinogênico
câncer
de
de
próstata,
Gilbert‟s.
Mais
indivíduos
compostos
incluindo
de
com
mais
potencial
2-aminofluoreno,
4-
aminobifenil, benzidina, beta-naftilamina e certas arilaminas
heteroclíclicas presentes em pirolisados de proteínas, pode
ser muito benéfica na prevenção, por parte do indivíduo, da
utilização de tais compostos.
Os inventores disponibilizam
uma seqüência de DNA contendo novos SNPs, os quais podem ser
15
úteis para a identificação de indivíduos, com polimorfismos no
gene de NAT2 que estão associados com estas doenças e afetam o
metabolismo dos compostos descritos acima.
Ácidos nucléicos associados a doenças e úteis para métodos
diagnósticos incluem oligonucleotídeos com um tamanho mínimo
20
de 15 nucleotideos, preferencialmente um tamanho mínimo de 20
nucleotideos e mais preferencialmente um tamanho mínimo de 25
nucleotideos que hibride especificamente com um ácido nucléico
associado a doenças.
A amostra a ser analisada deve ser submetida a um processo
25
de extração de DNA. Entende-se que o método de extração de DNA
dependerá
da
natureza
da
amostra
a
ser
analisada.
O
DNA
resultante deverá ser submetido a PCR para amplificação da
região contendo os SNPs e em seguida seqüenciados.
77
A seqüência polinucleotídica descrita na presente invenção
(ou
parte
da
mesma),
principalmente
aquela
relacionada
a
identificação dos SNPs aqui descritos, representa uma valiosa
fonte de informação
5
termos de haplótipos e outros subgrupos, como por exemplo
investigação
10
para a caracterização de indivíduos em
de
suscetibilidade
ao
tratamento
com
na
alguns
fármacos particulares.
Esta abordagem é ainda facilitada pelo
armazenamento
destas
informações
informatizada
e
posterior
sua
bioinformática.
Assim,
a
em
uma
análise
seqüência
base
por
de
dados
programas
de
polinucleotídica
da
presente invenção é particularmente útil como componente de
banco de dados utilizado para a identificação de seqüências e
outras
buscas.
qualquer
15
O
mídia
seqüências
com
estoque
e
sua
da
informações
utilização
relação
polinucleotídeos
das
a
em
da
bancos
“polinucleotídeo
invenção”
cobre
ou
qualquer
seqüência
em
de
dados
de
seqüência
de
característica
química ou física do polinucleotídeo da presente invenção que
pode ser reduzido a, convertido em, ou estocado em alguma
mídia, tais como, um disquete ou um CD, preferencialmente numa
20
forma legível em um computador.
Exemplo 1
Amostras
brasileiros
genotipagem
25
de
sangue
foram
consanguineamente
de
NAT2.
As
coletadas
não
amostras
de
404
indivíduos
relacionados
utilizadas
para
a
compreenderam
indivíduos de duas regiões geograficamente distintas do Brasil
(Rio
de
Janeiro
e
Goiás)
e
foram
coletadas
no
Hospital
Universitário Clementino Fraga Filho da Universidade Federal
do Rio de Janeiro (UFRJ) e no Hospital de Referência Anuar
Auad do Estado de Goiás. O DNA genômico foi isolado deste
78
material utilizando o kit comercial FlexiGene DNA Kit (Qiagen
Inc., USA)
Os fragmentos de DNA cobrindo toda a região codificante do
gene NAT2 para posterior seqüenciamento foram gerados a partir
5
da
amplificação
cadeia”
pela
(PCR),
técnica
através
de
da
“reação
de
utilização
polimerase
de
um
par
em
de
oligonuclçeotídeos (NAT2ED e NAT2ER, Tabela 1). As condições
para
a
reação
de
PCR
foram
as
seguintes:
100
ng
de
DNA
genômico, 200 ng de cada oligonucleotídeo, 0,2 mM de dNTPs,
10
4.0
mM
MgCl2,
10%
glicerol
(Invitrogen
Life
Technologies,
Gaithersburg, MD, USA), 10 mM Tris-HCl pH 9.0, 50 mM KCl, 0.1%
Triton X-100, and 1.1 U da mistura de duas DNA polymerases (1
U of Taq DNA polymerase and 0.1 U de Tli DNA polymerase Promega Corporation, USA). Foram usados em um volume final de
15
50
l para cada
amostra. A amplificação foi realizada nas
seguintes condições de ciclagem: uma desnaturação inicial a
94°C for 5 min, seguida de 35 ciclos de 94°C por 1 min. 57.5°C
for 1 min e 72°C por 1 minuto. O passo de extensão final foi
realizado
20
a
72°C
por
5
min.
Após
a
amplificação,
aproximadamente 20 % do produto amplificado foi examinado em
gel de agarose.
Antes da etapa de sequenciamento do DNA, os
produtos de PCR foram purificados com acetato de amônio 2.5 M.
Tabela 1
Seqüência dos oligonucleotideos utilizados para a
amplificação e/ou sequenciamento da região codificante do gene NAT2
ED
NAT2 ED
5` - TTA GTC ACA CGA GGA AAT CAA A - 3`
NAT2 ER
5` - AAA TGC TGA CAT TTT TAT GGA TGA - 3`
NAT2 ID
5` - ACC ATT GAC GGC AGG AAT TA - 3`
NAT2 IR
5` - TGG TCC AGG TAC CAG ATT CC - 3`
- Externo direto;
ER
- Externo Reverso;
ID
- Interno direto;
79
IR
- Interno Reverso
Quatro
reações
de
seqüenciamento
foram
realizadas
para
cada amostra utilizando o Kit ABI PRISM Big Dye Terminator v.
3.1 (PE Applied BioSystems), de acordo com as recomendações do
fabricante em um seqüenciador de capilar “ABI PRISM 3730 DNA
5
Analyzer” (PE Applied BioSystems). Em cada reação (10 l de
volume
final),
foram
utilizados
aproximadamente
20
ng
de
produto amplificado, 3,2 pmol do iniciador, 0,5 l de Big Dye e
1,5 l de tampão 5X (fornecido no kit).
A
10
análise
das
seqüências
e
identificação
das
SNPs
presentes na região codificante de NAT2 foi feita através do
software
SeqScape
v.
2.5
(Applied
Biosystems).(http://www.appliedbiosystems.com/catalog/myab/Sto
reCatalog/products/CategoryDetails.jsp?hierarchyID=101&categor
y3rd=111917&trail=no).
15
A
seqüência
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/GenBank)
foi
AY331807
usada
como
referência. As seqüências obtidas, referentes a cada amostra
clínica individual, foram agrupadas sob forma de projeto de
acordo
com
a
utilização
do
SeqScape.
As
seqüências
foram
comparadas por alinhamento com a seqüência referência e os
20
sítios polimórficos (SNPs), foram identificados.
As
figuras
1A-1B
mostram
as
seqüências
nucleotídica
e
aminoacídica do tipo selvagem do gene NAT2 descrita por Blum
et al. (DNA and Cell Bio., 9:192-203, 1990), incluindo o sítio
de iniciação da tradução “ATG”.
25
A posição dos seis novos SNPs
descobertos estão sublinhadas e em negrito. Adicionalmente, as
trocas aminoacídicas também estão sublinhadas e em negrito.
A Tabela 2 contém a lista dos polimorfismos de base única
(SNPs) descobertos no gene NAT2. A posição do nucleotídeo de
acordo com as FIGs. 1A-1B é listada na primeira coluna. A
80
segunda coluna descreve as trocas de bases a partir do gene
tipo selvagem. A posição do aminoácido afetado pela troca da
base nucleotídica é listada na terceira coluna. As trocas de
aminoácidos decorrentes de 4 dos 6 SNPs adicionais (base 29,
5
152, 203, 228, 458 e 600) são listadas na quarta coluna.
Tabela 2
Posição
dos SNPs
Troca de
nucleotídeo
posição do
aminoácido
Troca de
aminoácido
29
152
203
228
458
600
T para C
G para T
G para A
C para T
C para T
A para G
10
51
68
76
153
158
I para T
G para V
C para Y
Não ocorre
T para I
Não ocorre
Significância dos novos SNPs
Nenhuma troca de aminoácido ocorre quando da presença do
SNP na base 228 e 600 da seqüência descrita nas FIGs. 1A-1B.
Trata-se
10
de
SNPs
localizados
no
terceiro
nucleotídeo
dos
códons 76 e 158 respectivamente.
Esta invenção fornece ainda quatro SNPs adicionais, não
sinônimos, presentes na região codificante do gene de NAT2, os
quais alteram a seqüência de aminoácidos da proteína.
A
15
substituição
no
nucleotídeo
29
(TC)
na
região
codificante do gene de NAT2, resulta numa troca de aminoácido
No códon 10 (IT: isoleucina para treonina). Neste caso temos
a troca de um aminoácido cadeia lateral apolar, hidrofóbico
por um polar. Tendo em vista a diferença entre as cadeias
laterais
20
destes
substituição
pode
aminoácidos,
afetar
a
muito
provavelmente
estrutura,
estabilidade e enovelamento da proteína NAT2.
81
esta
flexibilidade,
A
substituição
no
nucleotídeo
152
(GT)
na
região
codificante do gene de NAT2, resulta numa troca de aminoácido
no códon 51 (GV: glicina para valina). Aparentemente uma
troca
5
conservativa
(aminoácidos
com
cadeias
laterais
similares). Contudo, se localizada em alguma região crítica
(sítios de ligação do substrato ou co-fatores), esta troca
pode afetar a estrutura ou atividade da proteína.
A
substituição
no
nucleotídeo
203
(GA)
na
região
codificante do gene de NAT2 resulta numa troca de aminoácido
10
na posição 68 (CY: cisteína para tirosina).
Neste caso temos
a troca de um aminoácido apolar por um polar não carregado.
Tendo em vista a diferença entre as cadeias laterais destes
aminoácidos,
estrutura,
15
é
provavel
que
flexibilidade,
esta
substituição
estabilidade
e
afete
enovelamento
a
da
proteína NAT2.
A
substituição
no
nucleotídeo
458
(CT)
na
região
codificante do gene de NAT2, resulta numa troca de aminoácido
na posição 153 (TI: treonina para isoleucina). Neste caso
temos a troca de um aminoácido polar não carregado por um
20
apolar. Tendo em vista a diferença entre as cadeias laterais
destes aminoácidos, muito provavelmente esta substituição pode
afetar a estrutura, flexibilidade, estabilidade e enovelamento
da proteína NAT2.
A combinação de um ou todos os SNPs aqui descobertos com
25
aqueles já descritos na literatura pode ter efeitos adicionais
na
estrutura,
atividade,
dobramento
e
estabilidade
da
proteína. Evidências sugerem que o fenótipo metabólico seja
gerado a partir da combinação de todos os SNPs presentes no
indivíduo. Utilizando análises de regressão linear múltipla,
82
pesquisadores foram capazes de formular expressões matemáticas
capazes de predizer a capacidade metabólica da enzima NAT2
baseados no genótipo (Maisel et al., Pharmacogenomics, 1997).
De
5
acordo
com
nucleotídeos,
estas
mesmo
análises,
aquelas
todas
que
não
as
substituições
causam
a
aminoácidos, afetam o fenótipo de alguma forma.
troca
de
de
Embora eles
possam predizer com razoável segurança o fenótipo da maioria
dos indivíduos, se todos os SNPs conhecidos forem levados em
consideração a precisão do modelo é consideravelmente maior.
10
Uma vez que neste modelo os autores tiveram um indivíduo para
o
qual
o
fenótipo
não
pode
ser
predito,
existe
uma
alta
probabilidade da existência de SNPs adicionais no gene cujas
análises realizadas não foram capazes de detectar.
Dados de Freqüência
15
A Tabela 3 mostra a freqüência alélica dos seis novos SNPs
descritos na presente invenção, em duas regiões distintas do
Brasil.
A
primeira
identificados
nessa
coluna
lista
amostragem.
os
A
diferentes
segunda,
SNPs
quinta
e
novos
oitava
colunas indicam as frequências dos SNPs na amostra total, no
20
Rio de Janeiro e em Goiás, respectivamente. As colunas 3, 4,
6,
7,
9
e
homozigotos
10
ou
detalham
se
heterozigotos
e
quantos
para
o
indivíduos
polimorfismo
foram
listado
A
freqüência na segunda coluna refere-se ao número de alelos com
polimorfismo
25
amostragem
dividido
a
troca
pelo
de
número
bases
e
total
de
posição
alelos
na
referem-se
as
coordenadas das FIGS. 1A-1B.
A
Tabela
invenção
com
4
lista
os
a
sítios
frequência
dos
polimórficos
SNPs
descritos
adicionais,
na
suas
respectivas frequências nas diferentes regiões estudadas e,
83
para
cada
SNP,
se
a
variante
mutante
foi
encontrada
em
homozigose ou heterozigose. A frequência é o número de alelos
contendo o polimorfismo dividido pelo número total de alelos
na
5
amostragem.
A
troca
de
bases
e
a
posição
das
bases,
referem-se as coordenadas das FIGS. 1A-1B.
Tabela 3
Freqüência alélica dos SNPs da presente invenção no gene NAT2
em duas diferentes regiões do Brasil
SNPs
TOTAL
%
RIO DE JANEIRO
Heterozigotos Homozigotos
%
GOIÁS
Heterozigotos Homozigotos
%
Heterozigotos Homozigotos
29C
0,12
01/404
0
0,17
01/298
0
0
0
0
152T
0,12
01/404
0
0,17
01/298
0
0
0
0
203 A
0,12
01/404
0
0,17
01/298
0
0
0
0
228 T
0,12
01/404
0
0
0
0
0,47
01/106
0
458 T
0,12
01/404
0
0,17
01/298
0
0
0
0
600G
0,12
01/404
0
0
0
0
0,47
01/106
0
Tabela 4
Freqüência dos SNPs identificados no gene NAT2 em duas
diferentes regiões do Brasil
SNPs
TOTAL
RIO DE JANEIRO
GOIÁS
% Heterozigotos Homozigotos % Heterozigotos Homozigotos % Heterozigotos Homozigotos
29C
0.1
01/404
0
0.1
01/298
0
0
0
0
70A
0.1
01/404
0
0.2
01/298
0
0
0
0
152T
0.1
01/404
0
0.2
01/298
0
0
0
0
191A*
4.1
31/404
01/404
5
26/298
01/298
2
05/106
0
203A
0.1
01/404
0
0.2
01/298
0
0
0
0
228T
0.1
01/404
0
0
0
0
0.5
01/106
0
84
282T*
37
184/404
57/404
38
144/298
41/298
34
40/106
16/106
341C*
38
176/404
65/404
40
136/298
50/298
33
40/106
15/106
345T
0.3
02/404
0
0
0
0
1
02/106
0
403G
0.6
04/404
0
1
04/298
0
0.5
0
0
458T
0.1
01/404
0
0.2
01/298
0
0
0
0
472C
0.6
05/404
0
0.5
03/298
0
1
02/106
0
481T*
35
176/404
54/404
36
137/298
40/298
32
39/106
14/106
590A*
27
157/404
29/404
26
119/298
18/298
28
38/106
11/106
600G
0.1
01/404
0
0
0
0
0.5
01/106
0
609T
0.4
03/404
0
0.3
02/298
0
0.5
01/106
0
683T
0.2
02/404
0
0.3
02/298
0
0
0
0
766G
0.7
06/404
0
0.7
04/298
0
1
02/106
0
803G*
40
184/404
69/404
41
143/298
51/298
36
41/106
18/106
838A
0.5
04/404
0
0.5
03/298
0
0.5
01/106
0
G857A* 4.4
36/404
0
4.5
27/298
0
4.2
09/106
0
descrita
aqui
Apesar
de
ilustrada
e
com
referência
a
determinadas representações específicas, a presente invenção
não tem, no entanto, a intenção de estar limitada aos detalhes
mostrados. Várias modificações podem ser feitas nos detalhes
5
dentro do âmbito e alcance de equivalentes sem se afastar do
espírito da invenção.
85
-50
TGCTAAAGTATGATATGTTTTTATGTTTTGTTTTTCTTGCTTAGGGGATCATGGACATTG
M D I
11
T29C
AAGCATATTTTGAAAGAATTGGCTATAAGAACTCTAGGAACAAATTGGACTTGGAAACAT
E A Y F E R I G Y K N S R N K L D L E T
71
TAACTGACATTCTTGAGCACCAGATCCGGGCTGTTCCCTTTGAGAACCTTAACATGCATT
L T D I L E H Q I R A V P F E N L N M H
131
G152T
GTGGGCAAGCCATGGAGTTGGGCTTAGAGGCTATTTTTGATCACATTGTAAGAAGAAACC
C G Q A M E L G L E A I F D H I V R R N
191
G203A
C228T
GGGGTGGGTGGTGTCTCCAGGTCAATCAACTTCTGTACTGGGCTCTGACCACAATCGGTT
R G G W C L Q V N Q L L Y W A L T T I G
251
TTCAGACCACAATGTTAGGAGGGTATTTTTACATCCCTCCAGTTAACAAATACAGCACTG
F Q T T M L G G Y F Y I P P V N K Y S T
311
GCATGGTTCACCTTCTCCTGCAGGTGACCATTGACGGCAGGAATTACATTGTCGATGCTG
G M V H L L L Q V T I D G R N Y I V D A
371
GGTCTGGAAGCTCCTCCCAGATGTGGCAGCCTCTAGAATTAATTTCTGGGAAGGATCAGC
G S G S S S Q M W Q P L E L I S G K D Q
431
C458T
CTCAGGTGCCTTGCATTTTCTGCTTGACAGAAGAGAGAGGAATCTGGTACCTGGACCAAA
P Q V P C I F C L T E E R G I W Y L D Q
491
TCAGGAGAGAGCAGTATATTACAAACAAAGAATTTCTTAATTCTCATCTCCTGCCAAAGA
I R R E Q Y I T N K E F L N S H L L P K
551
A600G
AGAAACACCAAAAAATATACTTATTTACGCTTGAACCTCGAACAATTGAAGATTTTGAGT
K K H Q K I Y L F T L E P R T I E D F E
FIGURA 1A
86
611
CTATGAATACATACCTGCAGACGTCTCCAACATCTTCATTTATAACCACATCATTTTGTT
S M N T Y L Q T S P T S S F I T T S F C
671
CCTTGCAGACCCCAGAAGGGGTTTACTGTTTGGTGGGCTTCATCCTCACCTATAGAAAAT
S L Q T P E G V Y C L V G F I L T Y R K
731
TCAATTATAAAGACAATACAGATCTGGTCGAGTTTAAAACTCTCACTGAGGAAGAGGTTG
F N Y K D N T D L V E F K T L T E E E V
791
AAGAAGTGCTGAAAAATATATTTAAGATTTCCTTGGGGAGAAATCTCGTGCCCAAACCTG
E E V L K N I F K I S L G R N L V P K P
851
GTGATGGATCCCTTACTATTTAG
G D G S L T I *
FIGURA 1B
87
REIVINDICAÇÕES
1.
bases
Ácido
nucléico
isolado
nucleotídicas
compreendendo
incluindo
o
pelo
sítio
menos
15
polimórfico
caracterizado por ser selecionado de um grupo consistindo de:
5
(a) uma substituição T  C no nucleotídeo 29 da SEQ ID NO:1
(b) uma substituição G  T no nucleotídeo 152 da SEQ ID NO:1
(c) uma substituição G  A no nucleotídeo 203 da SEQ ID NO:1
(d) uma substituição C  T no nucleotídeo 228 da SEQ ID NO:1
(e) uma substituição C  T no nucleotídeo 458 da SEQ ID NO:1
10
(f) uma substituição A  G no nucleotídeo 600 da SEQ ID NO:1.
2. Ácido nucleico isolado de acordo com a reivindicação 1
caracterizado por compreender um DNA.
3. Sonda específica para um alelo isolado caracterizado
por ser capaz de detectar um sítio polimórfico da SEQ ID NO:1
15
da reivindicação 1.
4.
Oligonucleotídeo
específico
para
um
alelo
isolado
caracterizado por ser capaz de detectar um sítio polimórfico
da SEQ ID NO:1 da reivindicação 1.
5.
20
alelo
Kit
diagnóstico
específica
caracterizado
conforme
por
utilizar
reivindicação
3
a
sonda
ou
um
oligonucleotídeo alelo específico conforme a reivindicação 4.
6. Método de identificação de qualquer polimorfismo da SEQ
ID
NO:1
em
mamíferos
caracterizado
por
compreender
as
ou
de
seguintes etapas:
25
(a)
preparo
de
amostras
de
células
tecidos
mamíferos;
(b) identificação de tecidos ou células contendo todos ou
parte dos polimorfismos da SEQ ID NO:1 da reivindicação 1, em
condições onde o DNA hibridado possa ser produzido;
88
(c) identificação do DNA hibridado;
(d) clonagem e seqüenciamento do DNA hibridado para a
identificação do gene NAT2 em mamíferos.
7. Método de identificação individual em um ensaio clínico
5
caracterizado por compreender:
(a) produção de uma biblioteca de SNPs incluindo os sítios
polimórficos da SEQ ID NO:1 conforme a reivindicação 1 e seu
respectivo fenótipo;
(b) seqüenciamento individual do gene NAT2;
10
(c)
conjugação
do
genótipo
obtido
no
Ítem
(b)
com
o
fenótipo obtido em (a).
8. Método de identificação de composições terapêuticas as
quais
são
eficazes
em
indivíduos
caracterizado
por
compreender:
15
(a)
administração
de
composição
terapêutica
para
um
indivíduo e mensuração de sua eficácia;
(b) determinação de genótipos individuais e de sítios
polimórficos
da
SEQ
ID
NO:1
da
reivindicação
1
indiquem se o indivíduo é um acetilador rápido ou lento;
20
(c) determinação a partir das etapas (a) e (b) de quais
composições terapêuticas serão as mais efetivas para um
genótipo particular e quais terão efeitos adversos.
89
que
RESULTADOS
Raquel Lima de F. Teixeira
CAPÍTULO III
Essa etapa incluiu descrição de novos polimorfismos no gene NAT2 bem como a
caracterização de novos alelos por clonagem e re-sequenciamento e experimentos de
modelagem molecular onde verificamos a influência de diferentes SNPs na estrutura protéica
de NAT2. Esses resultados encontram-se reunidos no manuscrito “Sequence analysis of NAT2
gene of Brazilians: identification of undescribed Single Nucleotide Polymorphisms and
molecular modeling of the N-acetyltransferase 2 protein structure” submetido para a revista
internacional Mutation Research: Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis
em abril de 2009.
90
Elsevier Editorial System(tm) for Mutation Research/Fundamental and Molecular
Mechanisms of Mutagenesis
Manuscript Draft
Manuscript Number: MUT-D-09-00087
Title: Sequence analysis of NAT2 gene of Brazilians: identification of undescribed Single
Nucleotide Polymorphisms and molecular modeling of the N-acetyltransferase 2 protein structure
Article Type: Research Paper
Keywords: human NAT2, polymorphism, molecular modeling, N-acetylation, structure/function,
Brazilian population
Corresponding Author: Doctor Adalberto Rezende Santos, Ph.D
Corresponding Author's Institution: Oswaldo Cruz Foundation
First Author: Raquel F Teixeira, MSc
Order of Authors: Raquel F Teixeira, MSc; Floriano P Silva Junior, Ph.D; Aline R Silveira, MSc;
Pedro H Cabello, Ph.D; Leila Mendonça-Lima, Ph.D; Marcelo F Rabahi, Ph.D; Afrânio L Kritski,
Ph.D; Fernanda Q Mello, Ph.D; Philip N Suffys, Ph.D; Antonio B Miranda, Ph.D; Adalberto
Rezende Santos, Ph.D
Abstract: N-acetyltransferase 2 (NAT2) metabolizes a variety of xenobiotics that include many
therapeutic drugs, chemicals and carcinogens. This enzyme is genetically variable in human
populations and polymorphisms in the NAT2 gene have been associated with drug toxicity and
efficacy as well as cancer susceptibility. Here we have focused on the identification of NAT2
variants in Brazilian individuals resident in two different regions by direct sequencing and in the
characterization of new haplotypes after cloning and re-sequencing. Upon analysis of DNA
samples from 404 individuals, six new mutations (c.29T>C, c.152G>T, c.203G>A, c.228C>T,
c.458C>T and c.600A>G) and seven new NAT2 alleles were identified with different frequencies in
91
Rio de Janeiro and Goiás. Molecular modeling and structural analysis suggested that
polymorphism p.Gly51Val may have an important effect on substrate recognition by NAT2. We also
observed that mutation p.Cys68Tyr would impair acetylating activity due to the resulting geometric
restrictions and incompatibility of the functional group in the Tyr side chain with the admitted
chemical mechanism for catalysis by NATs. Moreover, other variants may lead to the presence of
hydrophobic residues involved in protein aggregation and/or targeted degradation. From the new
alleles, NAT2*5N, *5O, *6H, *6M, and *12E may code for a slow activity and NAT2*20 and *12I, are
functional alleles. Finally, it is possible that NAT2*12F and NAT2*12J do not interfere with the
acetylation activity because they contain other mutations (c.622T>C and c.29T>C, in addition to
c.803A>G) which do not affect the enzyme structure. Functional studies are needed to clarify the
mechanisms by which new SNPs interfere with acetylation.
Suggested Reviewers: Tom Ottenhoff Ph.D
Leiden University
[email protected]
Brigitte Gicquel
Institute Pasteur
[email protected]
Tom Huizinga
Leiden University
[email protected]
Susan Dorman
Johns Hopkins University
[email protected]
92
* Cover Letter
Rio de Janeiro, April, 15 2009
Dear Editor Chief
Please find enclosed the manuscript entitled “Sequence analysis of NAT2 gene of
Brazilians: identification of undescribed Single Nucleotide Polymorphisms and molecular
modeling of the N-acetyltransferase 2 protein structure” from Raquel Lima de Figueiredo
Teixeira et al. to be considered for publication as a research paper in the Mutation
Research: Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis.
In this manuscript we report the discovery of six new mutations within the NAT2 coding
region in Brazilians subjects and characterization of new NAT2 alleles by cloning and resequencing followed by molecular modeling. According our in silico data, some of these
SNPs and alleles are involved with the NAT2 low activity, contributing to the slow
acetylation profile in these populations.
The authors declare that there are no conflicts of interest.
Yours sincerely,
________________________
Adalberto Rezende Santos, Ph.D.
Laboratory of Molecular Biology Applied to Mycobacteria
Oswaldo Cruz Institute – Fiocruz, Av. Brasil 4365, CEP: 21040-900
Manguinhos, Rio de Janeiro, RJ, Brazil
Phone:55(21) 2598-4289 Fax: 55(21)2270-9997; E-mail: [email protected]
93
* Conflict of Interest Statement
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94
* Conflict of Interest Statement
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95
* Manuscript
Click here to view linked References
1
Sequence analysis of NAT2 gene of Brazilians: identification of undescribed Single
Nucleotide Polymorphisms and molecular modeling of the N-acetyltransferase 2 protein
structure
Raquel L. F. Teixeira1, Floriano P. Silva Junior2, Aline R. Silveira2, Pedro H. Cabello1, Leila
Mendonça-Lima3, Marcelo F Rabahi4, Afrânio L. Kritski5, Fernanda C. Q. Mello5, Philip N.
Suffys6, Antonio B. Miranda3 & Adalberto R. Santos6*.
1
Laboratory of Human Genetics, Oswaldo Cruz Institute, Fiocruz, Rio de Janeiro, Brazil
2
Laboratory of Proteins and Peptides Biochemistry, Oswaldo Cruz Institute, Fiocruz, Rio de
Janeiro, Brazil
3
Laboratory for Functional Genomics and Bioinformatics, Oswaldo Cruz Institute, Fiocruz,
Rio de Janeiro, Brazil
4
Anuar Auad Infectious Disease Reference Hospital of the State Health Secretariat of Goiás
State, Goiânia, Brazil
5
Academic Tuberculosis Program / Medical School, Hospital Complex HUCFF-IDT, Federal
University of Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, Brazil
6
Laboratory of Molecular Biology Applied to Mycobacteria, Oswaldo Cruz Institute, Fiocruz
Rio de Janeiro, Brazil
*Corresponding author: Laboratory of Molecular Biology Applied to Mycobacteria –
Oswaldo Cruz Institute – Fiocruz, Av. Brasil 4365, CEP: 21040-900, Manguinhos, Rio de
Janeiro, RJ, Brazil
Phone:55(21) 2598-4289 Fax: 55(21)2270-9997; E-mail: [email protected]
96
2
Abstract
N-acetyltransferase 2 (NAT2) metabolizes a variety of xenobiotics that include many
therapeutic drugs, chemicals and carcinogens. This enzyme is genetically variable in human
populations and polymorphisms in the NAT2 gene have been associated with drug toxicity
and efficacy as well as cancer susceptibility. Here we have focused on the identification of
NAT2 variants in Brazilian individuals resident in two different regions by direct sequencing
and in the characterization of new haplotypes after cloning and re-sequencing. Upon analysis
of DNA samples from 404 individuals, six new mutations (c.29T>C, c.152G>T, c.203G>A,
c.228C>T, c.458C>T and c.600A>G) and seven new NAT2 alleles were identified with
different frequencies in Rio de Janeiro and Goiás. Molecular modeling and structural analysis
suggested that polymorphism p.Gly51Val may have an important effect on substrate
recognition by NAT2. We also observed that mutation p.Cys68Tyr would impair acetylating
activity due to the resulting geometric restrictions and incompatibility of the functional group
in the Tyr side chain with the admitted chemical mechanism for catalysis by NATs.
Moreover, other variants may lead to the presence of hydrophobic residues involved in
protein aggregation and/or targeted degradation. From the new alleles, NAT2*5N, *5O, *6H,
*6M, and *12E may code for a slow activity and NAT2*20 and *12I, are functional alleles.
Finally, it is possible that NAT2*12F and NAT2*12J do not interfere with the acetylation
activity because they contain other mutations (c.622T>C and c.29T>C, in addition to
c.803A>G) which do not affect the enzyme structure. Functional studies are needed to clarify
the mechanisms by which new SNPs interfere with acetylation.
Key
words:
human
NAT2,
polymorphism,
structure/function, Brazilian population.
97
molecular
modeling,
N-acetylation,
3
1. Introduction
Arylamine N-acetyltransferases (NATs) constitute a ubiquitous enzyme class, which
has been isolated from many organisms like bacteria, birds and mammals, and plays an
important role for drug metabolism and in the bioactivation of carcinogenic arylamines.
Humans express two functional NAT isozymes, NAT1 and NAT2, which share 81% amino
acid sequence identity, but exhibit considerable differences in substrate specificity and tissue
distribution [1].
Arylamine N-acetyltransferase II (NAT2) is a cytosolic phase II conjugation enzyme
which catalyzes the transfer of an acetyl group from acetyl-CoA to the nitrogen or oxygen
atom of different arylhidrazine and arylamine drugs [1, 2, 3, 4]. In addition, NAT2 catalyzes
the metabolic activation of aromatic and heterocyclic amine carcinogens [1, 5].
Literature data have described the association of NAT2 genetic variations and the
acetylation status to the presence or absence of side effects during tuberculosis treatment [6,
7, 8; for a review see 9, 10] and also to susceptibility to bladder, colorectal and breast cancers
[11, 12; for a review see 13]. In fact, three major genetically determined phenotypes are
observed: fast, intermediate and slow acetylators, which are inherited as a codominant trait.
Interindividual genetic variations in NAT2 gene that cause differences in the activity of allelic
isoenzymes or in the protein levels result in altered activation/deactivation of many
compounds generating carcinogenic or toxic effects.
Most mutations reported to date are found within the 873 bp (including the stop
codon) intronless coding region of NAT2 gene, which is located in chromosome 8p22. Among
the seven most common SNPs (single nucleotide polymorphisms), four result in amino acid
changes leading to a significant decrease in acetylation capacity (SNPs c.191G>A, c.341T>C,
c.590G>A and c.857G>A). The other three (c.282C>T, c.481C>T and c.803A>G) are silent
98
4
mutations and/or do not alter the phenotype [14, 15]. According to the consensus gene
nomenclature of human NAT2 (www.louisville.edu/medschool/pharmacology/NAT.html), the
NAT2 alleles are characterized by the combination of up to four SNPs present in the coding
region. Currently, there is a total of 32 SNPs identified in the NAT2 coding region (25 in the
nomenclature official site and the other seven in the Entrez SNP database) with 53
combinations (alleles) described.
A variation in the frequency of NAT2 genotypes and phenotypes in different ethnic
closed populations has been well described in different geographic regions around the world
and include populations with high frequencies of slow-acetylator allele(s), such as European
descendents and sub-Saharan Africans [16, 17, 18], and other populations that are
characterized by higher frequencies of fast acetylator allele(s), including Japanese, Chinese
and Amerindians [19, 20, 21]. According to Luca and co-workers, differences in eating habits
and lifestyles may explain inter-population differences in NAT2 variation [22].
Functional analysis and site directed mutagenesis studies have allowed the
identification of the active site cysteine residue (corresponding to Cys68 in human NATs) as
the only cysteine which was conserved in all of the other NATs of which sequence
information was available. These studies have also shown that the same cysteine plays an
essential role at the active site of human NAT2 [23, 24]. Moreover, three-dimensional
homology modeling studies of human NAT2, based on the Salmonella typhimurium NAT
structure, have revealed a cysteine protease-like catalytic triad (Cys68-His107-Asp122) [25,
26].
Studies based on the homology of N-acetyltransferase enzyme crystal structures from
different bacteria provided some understanding of its structural characteristics, including SNP
locations and computational docking of substrates [25, 27, 28, 29, 30]. However, the
alignment scores between bacterial and mammalian N-acetyltransferase protein sequences are
99
5
low (~30%) and important differences between the bacterial and mammalian Nacetyltransferase protein structures limited the utility of the mammalian N-acetyltransferase
homology models [31].
Recently, the crystal structures of human NAT1 and NAT2 were finally resolved
corroborating a number of predictions from previous modeling and experimental studies. The
fold of human NAT1 and NAT2 closely resembles the overall structure of their prokaryotic
orthologues, with three generally described domains: an 83 residues long N-terminal domain
containing five α-helices and a short β-strand; a second domain consisting of nine β-strands
and two short helices forming a β-barrel; and a third α/β lid domain with four β-strands and an
α-helix. The first two domains, which have been recognized to be involved in active-site
pocket formation and AcCoA binding, are connected to the third domain through the α-helical
interdomain. The third domain has been implicated in acetyl-acceptor specificity [30, 32].
However, the crystal structures of human NATs also provided evidence for novel structural
characteristics at the carboxyl terminus that could not be anticipated from the homology with
the bacterial enzymes [32].
The crystal structures of human NAT1 and NAT2 have also shown that, although the
point mutations are distributed throughout the entire primary structure, the majority of the
SNPs are located on the protein surface and thus exposed to the cellular environment. These
findings would be consistent with the hypothesis that the structural alterations induced by
most amino acid substitutions basically lead to the ubiquitylation and proteasomal
degradation of these proteins [33]. However, molecular modeling based on the recently solved
human NATs structures aiming to give new insights about the role of SNPs on the acetylation
phenotype has the potential to further expand these initial findings from structural analysis.
Genetic variations can alter the expression levels and/or function of a gene product
and the haplotype structure is the main genetic determinant of phenotypic consequences.
100
6
Hence, we have been engaged on the identification of NAT2 variants in Brazilian subjects by
direct sequencing. We report here the discovery of six new mutations and seven new NAT2
alleles by employing cloning and re-sequencing. Furthermore, molecular modeling and
structural analysis were employed to identify polymorphisms with the potential to alter NAT2
function. Such genetic variations should be useful markers for studying the correlation
between genotypes and phenotypes of N-acetyltransferase 2.
101
7
2. Material and Methods
Selection of subjects and sample collection
Four hundred and four consanguineously unrelated individuals from two different
geographic regions of Brazil, Rio de Janeiro (RJ) and Goiás (GO), were enrolled in this study.
They comprised 248 active TB patients and 50 asymptomatic close contacts of pulmonary TB
cases from the Thoracic Institute/University Hospital Clementino Fraga Filho from the
Federal University of Rio de Janeiro and 106 asymptomatic Health Care Workers from Anuar
Auad Infectious Disease Reference Hospital of Goiás State, Brazil. This study was approved
by the ethics committee of each enrolled institution.
After written consent, a volume of 3 mL of venous blood was collected from each of
the volunteers and stored at –20°C. Genomic DNA was isolated from 100 µL of frozen whole
blood using the FlexiGene DNA Kit (Qiagen Inc., USA), according to the manufacturer’s
specifications. After extraction, DNA samples were stored at –20°C.
NAT2 genotyping and computational analysis
Genotyping of the NAT2 coding region and computational analysis were performed as
described previously [34]. In brief, a 1093 bp fragment, which contains the entire coding
region of NAT2, was amplified by PCR and subsequently sequenced on both DNA strands
using a set of primers for amplification (NAT2 EF 5` TTA GTC ACA CGA GGA AAT CAA
A 3` and NAT2 ER 5` AAA TGC TGA CAT TTT TAT GGA TGA 3`) and a second set of
internal primers (NAT2 IF 5` ACC ATT GAC GGC AGG AAT TA 3` and NAT2 IR 5` TGG
TCC AGG TAC CAG ATT CC 3`) [34]. Sequencing was performed using ABI PRISM Big
Dye Terminator v. 3.1 Kit (PE Applied BioSystems), according to the manufacturer’s
recommendations, on an ABI PRISM 3730 DNA Analyser (PE Applied BioSystems). The
sequence analysis and SNPs identification were performed using SeqScape v.2.5 software
102
8
(Applied BioSystems http://www.appliedbiosystems.com) using GenBank Accession Number
AY331807 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ GenBank) as the reference sequence. HardyWeinberg equilibrium for each mutation was tested. All singletons and even new/rare
mutation identified were confirmed by PCR re-amplification (three times) and re-sequencing.
Molecular determination of haplotypes by NAT2 cloning and re-sequencing
To resolve ambiguous haplotypes containing new or rare mutations, with 2 or more
heterozygous SNPs, we used cloning methodology. Therefore, the 1093 bp PCR fragment of
NAT2 gene was cloned into pCR-BluntII-TOPO vector, to keep alleles separate, by using
Zero Blunt TOPO PCR Cloning kit (Invitrogen) according to the manufacturer`s
recommendations. For these experiments, the final extension step of PCR cycle was abolished
generating blunt ends in PCR fragments. Fifteen to twenty clones from each individual were
isolated and plasmids were purified with Ilustra plasmidPrep Mini Spin kit (GE Healthcare)
and checked for the presence of insert by restriction analysis. Plasmids containing human
NAT2 insert were sequenced and the sequence data were analyzed with SeqScape software as
described above.
Sequences and alignment
The amino acid sequence of human NAT2 (UniprotKB/Swiss-Prot accession number
P11245) was employed as the query sequence to search the UniprotKB/Swiss-Prot databank
[35] using the BLASTP program, as implemented in the WWW ExPASy server
(http://ca.expasy.org/). Representative sequences from eukaryotic and prokaryotic organisms
were selected and then aligned with the multiple sequence alignment tool T-COFFEE v.7.44
[36], using the program default parameters. The resulting alignment was manually corrected
according to a structural aligment built by superposing in the Swiss-PdbViewer program v.3.7
[37] the crystal structures of NATs found in the Protein Data Bank (PDB) [38], including
103
9
human NAT2 chain A (PDB code 2FPR; [32]), human NAT1 (PDB code 2PQT; [32]) and M.
smegmatis NAT chain A (PDB code 1W6F; [39]).
Molecular modeling and structural analysis of mutations
For each SNP identified from the analysis of the human NAT2 gene in Brazilian
individuals, which resulted in amino acid substitution in the NAT2 enzyme, we have
constructed a structural model of the mutated protein to evaluate the putative effects of each
individual mutation. For this purpose, we have chosen chain A from the NAT2 crystal
structure (PDB code 2FPR), since this protein was crystallized as a dimer [32]. The point
mutations were introduced within the Swiss-Pdbviewer program by replacing the side chain
of the mutated amino acid by browsing a rotamer library, which provides the most commonly
observed orientations for the new side chain [37]. The most reasonable rotamers were chosen
with the aid of a simple score based on the minimization of clashes and maximization of the
number of hydrogen bonds between the mutated side chain atoms and other nearby atoms of
the protein. We also favored rotamers that most preserved the space occupied by the original
residue. The resulting models were submitted to an energy minimization protocol (to remove
bad contacts and optimize favorable interactions) that consisted of 10 steps of the steepestdescent algorithm followed by up to 1000 steps of the conjugated gradient algorithm or until
the energy gradient was inferior to 0.05 KJ/mol. In order to prevent over deviation from the
crystal structure, harmonic constraints of 50/5000 for selected/non selected residues were
employed, where the selected set was composed of any residue 6Å away from the mutated
amino acid. The resulting optimized structures were inspected for any structural changes.
Calculations of the electrostatic potentials on the molecular surfaces and the manual
evaluation of interatomic contacts were done with built-in Swiss-Pdbviewer tools while an
automated analysis of interatomic contacts was carried out within the LPC/CSU server [40].
104
10
3. Results and discussion
Identification of new mutations in NAT2 coding region and new NAT2 haplotypes
The sequencing of the 1093 bp amplicon containing the NAT2 coding region obtained
from 404 Brazilian individuals from two different regions, Rio de Janeiro and Goiás, allowed
us to identify 17 polymorphisms already described in literature or data bases (Table 1) [34]
and 6 new mutations (c.29T>C, c.152G>T, c.203G>A, c.228C>T, c.458C>T and c.600A>G).
Among the SNPs already described in previous studies, we found four mutations (c.766A>G,
c.622T>C, c.578C>T and c.472A>C) recently identified only in African populations [41, 42].
All beforementioned polymorphisms were observed at a frequency in both regions at HardyWeinberg equilibrium and their allele frequencies, found in the present study, as well as their
presumed influence on the protein sequence are shown in Table 1. No significant differences
were found in the frequencies of any SNP between individuals from Rio de Janeiro and Goiás
(data not shown).
The new mutations in the NAT2 coding region included transversion and transition
events and only c.228C>T and c.600A>G are silent mutations. All new variants were
singletons and some of them are present only in Rio de Janeiro (c. 29 T>C, c.152 G>T,
c.203G>A, c.458C>T) and others only in Goiás (c.228C>T and c.600A>G) (Table 1). Upon
comparison of the SNP profile in both regions we could observe that Goiás is more
homogeneous than Rio de Janeiro showing a lower diversity of variants, probably as a
consequence of the high influence of Amerindian population in this region, according with the
history of Brazil’s colonization (www.ibge.gov.br/brasil500/index.html).
To determine SNP combinations and then characterize new NAT2 alleles at the DNA
level, haplotypes ambiguity was resolved by isolating each NAT2 allele through a cloning
process and re-sequencing each chromosomal allele from recombinant plasmid DNA. We
105
11
were able to identify NAT2*6H, NAT2*12E and NAT2*12F alleles, firstly identified in
African populations [42], and seven new haplotypes with different profiles in the studied
regions, as demonstrated in Figure 1.
Structural analysis of the SNPs identified in Brazilian individuals
In order to have a global perspective of all known mutations affecting the coding
region of the NAT2 gene on the protein level, we have mapped the SNPs onto the 3D structure
of the protein (Figure 2). Figure 2A shows the location of each SNP colored according to the
occurrence in the Brazilian populations examined in this work. It is possible to see that all the
mutations are well spread across the whole structure without showing a clear trend to cluster
at a specific domain. From Figure 2B it is possible to appreciate the spatial relationship
between mutations known to affect NAT2 structure and/or activity, the new SNPs found in
this work and the residues close to the 2-bromoacetanilide adduct with the catalytic Cys68
residue [modeled from the NAT1 crystal structure (PDB code 2PQT)] [32]. Noteworthy,
excluding p.Asp122Asn and possibly p.Gly286Glu and p.Arg64Gln/Trp, at least one half of
the mutations with a documented phenotype (i.e. p.Leu137Phe, p.Ile114Thr and
p.Arg197Gln) are found far away from the substrate binding site, indicating that they must
produce their known unfavorable effects [10, 15, 43] through destabilization of the NAT2
structure instead of having a direct effect over the interaction with the substrate. This trend is
maintained among the new mutations identified in this work. The p.Cys68Tyr was the only
mutation affecting a residue in direct contact with the substrate (Figure 2B).
Molecular modeling analysis of individual mutations
We have employed a combination of sequence conservation analysis, inspection of
molecular graphics and molecular modeling techniques to evaluate the possible effects of
each SNP occurring in the coding region of the sequenced NAT2 genes. The multiple
sequence alignment used for this analysis can be found as a Supplementary Material on line.
106
12
Our analysis suggested that some of the new non-synonimous SNPs (c.458C>T,
c.578C>T, c.683C>T, and c.838G>A) (p.Thr153Ile, p.Thr193Met, p.Pro228Leu and
p.Val280Met, respectively) may lead to protein modifications by leaving hydrophobic
residues highly exposed on the protein surface, thus facilitating protein aggregation and/or
targeted degradation. Although the p.Thr193Met modification may lead to some
destabilization of the -barrel strands 7 and 8 in domain II, our analysis indicated that most
of the identified SNPs should be innocuous to the function of the NAT2 enzyme, including
c.29T>C, c.70T>A, c.403C>G, c.472A>C, c.609G>T, c.622T>C and c.766A>G (protein
modifications p.Ile10Thr, p.Leu24Ile, p.Leu135Val, Ile158Leu, p.Glu203Asp, p.Tyr208His
and p.Lys256Glu, respectively).
The p.Tyr208His mutation merits further attention as this mutation causes the bulkier
Tyr side chain to be changed to the smaller His that can be well accommodated in the NAT2
structure (Figure 3). Our analysis showed that the imidazoyl group in His208 side chain could
keep the hydrogen bond with one of the phosphate groups in CoA, although the hydrogen
bonds with Ser12 and Thr214 were lost. Noteworthy, if protonation is assumed, the positively
charged His208 would better accommodate the phosphate groups in CoA due to the Coulomb
attraction of their negative charges. This view was supported by our model where it was
predicted a shorter (stronger) hydrogen bond with the phosphate group in CoA (His208:NE2CoA:O4A 2.6Å). Hence, we concluded that it is unlikely for the p.Tyr208His mutation to
impair CoA binding by human NAT2. This conclusion is supported by the fact that His is also
naturally found in the homologous position of chicken NAT2 sequence [44].
Next, we describe in detail the structural analysis of the individual mutations most
likely affecting NAT2 function.
107
13
c.152G>T (p.Gly51Val)
Gly51 is conserved in many mammalian NATs but not in mycobacterial NAT
sequences, where it is replaced by Ile in M. smegmatis or by Val in M. tuberculosis and M.
bovis. It is positioned at the beginning of the 4 helix in the human NAT2 structure and has
12.7% RSAS [solvent accessible surface area (SAS) of the residue in the folded protein
relative to the SAS of the residue in vacuum]. Gly51 mainly contacts Ala54 and Ile55 in 4
with 5.7% and 13% RCSA [contact surface area (CSA) with a particular partner relative to the
total CSA of the residue with all contacting partners} respectively. During the modeling
exercise, the introduction of the Val mutation had a difficult spatial accommodation (with
only 3 possible rotamers) probably due the differences in side chain volumes (60.1Å3 for Gly
and 140Å3 for Val). The resulting model has doubled the contact surface with Glu49 (from
3.0% RCSA for Gly to 6.6% RCSA for Val). As this is a destabilizing contact (Val51:CG2Glu49:OE1), the region between 2 and  can be dislocated, modifying the position of
Phe37 side chain, which participates in substrate binding (Figure 4). Hence, this mutation may
have an impact in substrate recognition by NAT2.
c.203G>A (p.Cys68Tyr)
NAT active site has been extensively studied and Cys68 was found to be essential for
enzyme activity by site-directed mutagenesis and chemical modification [23, 24, 25, 45, 46].
Due to its importance to NAT function, Cys68 is conserved among prokaryotic and
eukaryotic NATs. In human NAT2, this residue is located at the N-terminal end of the 5
helix and is completely buried (0% RSAS) in a network of polar interactions (Figure 5A).
Cys68 makes hydrogen bonds with Asn72 through the backbone (Cys68:O-Asn72:N 3.0Å)
and with His107 side chain through its sulfydryl group (Cys68:SG-His107:ND1 3.4Å).
Hydrophobic residues make an extensive set of Van der Waals contacts: Phe37, Val71,
Val106, Leu108 and Gly124 (0.9%, 2.4%, 5.3%, 4.8% and 3.1% RCSA, respectively). The
108
14
most important contacting partners are Asn72 (12.2% RCSA) and His107 (12.1% RCSA) side
chains. Upon mutation to Tyr, two clashes were detected with residues Leu69 and Val106, but
these could be readily eliminated after our energy minimization protocol. Regarding the
impact of this SNP to the biochemical phenotype, although modeling of the p.Cys68Tyr
mutation evidenced the availability of space to accommodate the larger Tyr side chain (Figure
5B), the phenol hydroxyl in Tyr would not fulfill the same role as the thiol group in Cys as a
nucleophile. Hence, it’s very unlikely that a NAT2 enzyme carrying the p.Cys68Tyr mutation
can preserve its acetylation activity, at least not by the same catalytic mechanism, as we shall
discuss further below.
There are two basic enzymatic mechanisms that are known to be used by
acetyltransferases modifying a diverse set of substrates [47]. The first is through a direct
transfer mechanism, as exemplified by the Gcn5 N-acetyl transferases (GNATs) superfamily,
where a general base withdraws a proton from the substrate leaving a substrate atom more
nucleophilic for the attack to the carboxyl moiety in AcetylCoA (more often, a His residue is
activated by spatially close Glu or Asp to play the role of this base). The second is through a
so-called ping-pong mechanism, as employed by the p300 and NAT families of
acetyltransferases. Although structurally distinct, both families catalyze reactions that produce
an intermediate, the acetyl-enzyme. In the ping-pong mechanism, acetyl-CoA binds and is
attacked by a catalytic residue, resulting in the formation of an acetyl-enzyme covalent
intermediate, with concomitant release of CoA. The second substrate binds to coordinate a
nucleophilic attack on the acetyl-enzyme covalent intermediate. The acetyl group is then
transferred and the modified substrate is released. Differently, for the direct transfer
mechanism, the modified substrate is released followed by release of CoA.
The NAT family contains a motif, Cys-His-Asp, that is similar to the catalytic triad
found in the cysteine proteases [48]. NATs and cysteine proteases use a similar mechanism
109
15
for their acetyltransferase and hydrolase activity, respectively, even though they use different
substrates: NATs use acetyl-CoA and the amino group on arylamine, whereas cysteine
proteases use a peptide and water. It was recently shown that acetylation of the hamster NAT2
is dependent on a thiolate-imidazolium ion pair, Cys-S-His-ImH+, and not a general acid-base
catalysis [49], further highlighting the distinction from the direct transfer mechanism.
All of the knowledge briefly revised above strongly suggests that the p.Cys68Tyr
mutation found in our study would prevent NAT2 from accelerating an acetylation reaction
by nucleophilic catalysis in the known ping-pong mechanism. One hypothetical means by
which the p.Cys68Tyr NAT2 mutant could retain its activity is the reaction mechanism
changing to a direct transfer mechanism where His107 becomes a general base (still activated
by Asp122) and Tyr68 plays a role as a general acid, facilitating CoASH departure. Such role
for Tyr was described for the active site of Serotonin N-acetyltransferase [arylalkylamine Nacetyltransferase (AANAT)], a member of the GNAT superfamily [50, 51]. Nevertheless, a
major obstacle for this hypothesis would remain - the lack of space in the NAT2 active site to
bind both substrates simultaneously.
Molecular modeling analysis of selected alleles
NAT2*6H
NAT2*6H was the most frequently observed new allele among the studied population and was
also the most prevalent allele in the group from Rio de Janeiro (Figure 1). The SNPs found in
the coding region of this allele encode amino acid residues that are more than 40Å apart in the
human NAT2 structure: p.Arg197Gln and p.Lys256Glu; thus it is very unlikely that one
mutation could have direct influence over the other. The unfavorable effects to human NAT2
function produced by the p.Arg197Gln mutation are well known [10, 15]. Using a molecular
modeling approach similar to ours, Walraven et al. [52] proposed that the slightly reduced
thermostability frequently observed for the p.Arg197Gln variant, which leads to reduced
110
16
NAT2 activity and protein levels, are consistent with the loss of the relatively weak
electrostatic interactions of Arg197 with Glu195 and Met105. There is no such effect nor any
other phenotype change documented for the p.Lys256Glu mutation. Moreover, from our
analysis we suggest that while the Lys256 variant reverses the charge in residue 256, its
surface localization most likely prevents it from causing major alterations in the domain III
stability or folding.
NAT2*5N
NAT2*5N was the second most frequent new allele for the totality of individuals
examined as well as for the RJ group. For the group from Goiás, NAT2*5N showed the same
frequency of the NAT2*6H allele. The NAT2*5N allele codes for a triple mutant NAT2
variant: p.Ile114Leu, p.Ile158Thr and p.Lys268Arg. The p.Ile114Leu is a SNP frequently
observed found in human populations and is associated with a slow acetylator phenotype [10,
15, 34]. Structural evaluations made by Walraven et al. [52] could offer no other reasoning for
that functional observation other than an increase in protein aggregation and/or degradation
due to the exposure of a hydrophobic residue on the protein surface. Although they are
separated in space for more than 21Å, SNPs Ile114Thr and Ile158Leu are both located within
the -barrel domain and could sum up to have a synergic effect over human NAT2 structure
and function. Nevertheless, residue 158 is found after a variable loop in NATs, at the Nterminal tip of the 8 strand, and accordingly, our modeling for the mutation Ile158Leu
suggested it would have little chance of affecting human NAT2 activity or stability. The third
mutation found in the NAT2*5N allele, p.Lys268Arg, was also analyzed by Walraven et al.
[52] and these authors proposed that it could not affect the enzyme structure due to the
complete lack of contacts with other protein residues, consistent with the functional data
available so far [43]. Being at least 35Å away from either one of the sites of the other SNPs in
the structure of this human NAT2 variant, we consider it is safe to presume that the
111
17
p.Lys268Arg mutation would have no direct influence on the phenotypes of the p.Ile114Thr
and p.Ile158Leu SNPs.
NAT2*5O
The other human NAT2 variant containing the p.Lys268Arg mutation is encoded by
allele NAT2*5O. The other two mutations found in this variant, p.Cys68Tyr and p.Ile114Thr,
are both predicted to have a deleterious effect on NAT2 structure and function. While
p.Ile114Thr was already characterized [10, 15], p.Cys68Tyr is described for the first time in
this study. Due to its participation in the NAT2 catalytic triad and the different physicalchemical properties of Cys and Tyr, it is intuitive to assume that the p.Cys68Tyr mutation
would have a major impact on NAT2 activity. The modeling studies reported above by us
fully support this view. Because of the large distances separating one site of mutation from
the other, it is unlikely that any of them would have a direct effect over the other. On the other
hand, the concomitant expression of the p.Cys68Tyr and p.Ile114Thr mutations would most
likely completely shut down the NAT2 variant encoded by this allele.
NAT2*12J, NAT2*6M, NAT2*12E and NAT2*12F
These four alleles were found exclusively in the Rio de Janeiro group, but in lower
frequencies. All of them have in common the p.Arg197Gln SNP plus an additional mutation.
From our molecular modeling analysis of the individual mutations, we propose that the alleles
NAT2*6M and NAT2*12E may code for proteins with further reduced activity and/or stability.
In the later allele, the side chains of residues 193 and 197, which are only 3.9Å apart, may
produce a negative synergic effect on NAT2 activity upon mutation of both residues. As
observed by Walraven et al. [52] the stabilization provided by the electrostatic interaction
“sandwich” formed by the positively charged Arg197 positioned between the negatively
charged Glu195 and the methionine sulfur’s electron pairs would be lost in the mutation for
the neutral Gln. Our analysis suggests that the concomitant mutation of the polar Thr193 side
112
18
chain to the hydrophobic Met would further destabilize the Gln197 side chain, thus
emphasizing the loss of thermostability produced by this mutation alone.
In conclusion, differential effects among several SNPs on the structure of NAT2
enzyme were observed suggesting that some SNPs, such as c.152G>T (p.Gly51Val) and
c.203G>A (p.Cys68Tyr), may alter protein structure and/or binding to the catalytic site in the
NAT2 protein. Molecular dynamics simulations are in progress in our group to further
characterize such effects. However, functional studies are needed to clarify the dimension of
the mechanisms by which these new identified SNPs interfere with acetylation. Improvements
in our understanding of the relationships between polymorphic substitution at the NAT2
coding gene and the activity of the variant enzymes would be of great interest for design of
new drugs. Moreover, associating SNPs with unfavorable therapeutic outcomes during
treatment of human diseases has great potential for direct clinical application by providing
new and more accurate genetic markers for diagnostic and prognostic purposes as well as
novel therapeutic targets.
113
19
Acknowledgments
This work was supported by MCT/DECIT/MS and Faperj/Pronex Proc: E-26/170.0003/2008.
Adalberto Rezende Santos, Afrânio Lineu Kritski, Fernanda C. Q. Mello, and Philip Noel
Suffys are supported by CNPq Grant numbers 308786/2005-0, 35 04 77/1995-7,
306702/2007-0 and 312165/2006-4 respectively.
We thank the nursing service of the Anuar Auad Infectious Diseases Reference Hospital from
the State of Goiás, and from the Hospital Tuberculosis Control Program, Thoracic Diseases
Institute/Clementino Fraga Filho University Hospital for sample collection. We also thank the
support from the PDTIS - FIOCRUZ Sequencing and Bioinformatics Platforms.
Conflict of Interest statement
The authors declare that there are no conflicts of interest.
114
20
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122
28
Figure Legends
Figure 1: NAT2 Haplotypes/alleles characterization containing new or rare mutations in
Brazilian subjects. A- Human NAT2 representative coding region. Figure was adapted from
[61]. B- Haplotypes/alleles new or rare identified in this study. NAT2*6H, NAT2*12E and
NAT2*12F were first identified in African population [42]. The new haplotypes names are
suggestions for the official site of NAT2 nomenclature.
Figure 2: Mapping of the mutations on the coding region of the human NAT2 gene on the
three-dimensional structure of the protein. A- Spatial localizations of the residues undergoing
mutations in the NAT2 enzyme are represented by spheres centered at the -carbon
coordinates in the human NAT2 crystal structure (PDB code 2FPR). The protein folding is
represented in light gray ribbons. The residues are labeled and colored according to their
occurrence in the two different Brazilian populations (RJ population - yellow and cooccurrence in the RJ/GO populations - red). Mutations not identified in either one of the
Brazilian populations are colored in gray. As a reference, the bound conformation of CoA, as
observed in the human NAT2 structure is shown as sticks colored according to the CPK
scheme. B- All residues plotted in A are colored in red while the positions of residues
possibly interacting with the arylamine substrate are marked by spheres colored in magenta
(some of which are labeled in magenta for reference). The protein folding is represented by
ribbons colored according to the domain structure of human NAT2: domain I (-helix bundle)
– blue, domain II (-barrel) - yellow, interdomain - gray and domain III (/) - green.
Residues associated with SNPs that have a documented impact on NAT2 stability and/or
function are labeled in red. Residues associated with the new SNPs found within the Brazilian
populations analyzed are detached in yellow boxes. Molecular graphics were prepared in the
Swiss-Pdbviewer program [37].
123
29
Figure 3: Changes in the network of hydrogen bonds and in the electrostatic potential upon
introduction of the Tyr208His mutation in human NAT2 structure. Molecular surfaces were
colored according to the electrostatic potential (EP) calculated in the Swiss-Pdbviewer
program [37]. The surface was rendered transparent to allow the visualization of the
underlying residues (CPK colored sticks). Hydrogen bonds are represented as dashed green
lines. The bound conformation of CoA as determined in the crystal structure of human NAT2
(PDB 2FPR) is also shown. Note that upon mutation of Tyr208 (A) to His (B), the imidazoyl
group in the His208 side chain could keep the hydrogen bond with one of the phosphate
groups in CoA, although the hydrogen bonds with Ser12 and Thr214 were lost. Observe also
that in the His208 mutant the EP near the phosphate groups in CoA was slightly less negative.
Figure 4: Model for the Gly51Val mutation in human NAT2. In sticks (CPK colored) are
shown Phe37, the acetanilide adduct with Cys68 (TYX) and all the residues 6A away from
Val51. The protein folding is represented by ribbons colored according to the domain
structure of human NAT2: domain I (-helix bundle) – blue, domain II (-barrel) - yellow,
interdomain - gray and domain III (/) - green. The Cys68 adduct was modeled based on the
crystal structure of the homologous human NAT1 (PDB 2PQT). The mutated Val51 is found
in the N-terminal of the 4 helix. Note that Phe37, which interacts with TYX is located at the
tip of the loop connecting 4 to 2 and therefore may have its position affected by the
p.Gly51Val mutation. Molecular graphics were prepared in the Swiss-Pdbviewer program
[37].
Figure 5: Model for the Cys68Tyr mutation in human NAT2. The protein folding is
represented by ribbons colored according to the domain structure of human NAT2: domain I
(-helix bundle) – blue, domain II (-barrel) - yellow, interdomain - gray and domain III
(/) - green. In sticks are shown part of the bound CoA proximal to the catalytic site. AImportant residues contacting the Cys68 side chain are shown as sticks colored according to
124
30
the CPK scheme. The hydrogen bond between Cys68 and N72 backbones is represented as a
dashed green line. B- The modeled Tyr68 side chain is shown along with the new
conformation assumed by the Leu69 side chain (orange) needed to accommodate the bulkier
phenol group in Tyr. Molecular graphics were prepared in the Swiss-Pdbviewer program [37].
125
Figure 1
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126
Figure 2A
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127
Figure 2B
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128
Figure 3
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129
Figure 4
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130
Figure 5
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131
132
Supplemental Figure S1: Multiple sequence analysis of NAT sequences. Sequences
are identified by their UniProtKB/Swiss-Prot entry names (UniProt Knowledgebase
Release 14.7): ARY1_HUMAN = Human NAT1 (UniProtKB accession number
P18440; [62]); ARY2_HUMAN = Human NAT2 (UniProtKB accession number
P11245; [62]); ARY1_CHICK = Gallus gallus (chicken) NAT1 (UniProtKB accession
number P13913; [44]); ARY2_CHICK = G. gallus (chicken) NAT2 (UniProtKB
accession number P13914; [44]); ARY1_MOUSE = Mus musculus (mouse) NAT1
(UniProtKB accession number P50294; [63]); ARY2_MOUSE = M. musculus (mouse)
NAT2 (UniProtKB accession number P50295; [63]); ARY1_RABIT = Oryctolagus
cuniculus (Rabbit) NAT1 (UniProtKB accession number P18605; [64]); ARY2_RABIT
= O. cuniculus (Rabbit) NAT2 (UniProtKB accession number P11246; [65]);
ARY1_MESAU = Mesocricetus auratus (Golden hamster) NAT1 (UniProtKB
accession number P50292; [66]); ARY2_MESAU = M. auratus (Golden hamster)
NAT2 (UniProtKB accession number P50293; [67]); ARY1_BOVIN = Bos taurus
(Bovine) NAT1 (UniProtKB accession number Q1JPA6; [68]); ARY2_MACMU =
Macaca mulatta (Rhesus macaque) NAT2 (UniProtKB accession number Q7YRG5);
NAT_MYCSM = Mycobacterium smegmatis NAT (UniProtKB accession number
O86309; [69]); NAT_MYCTU = M. tuberculosis NAT (UniProtKB accession number
P0A5L8; [69]); NAT_MYCBO = M. bovis NAT (UniProtKB accession number
P0A5L9; [70]). The alignment was shaded at the 70% conservation level according to
the BLOSUM62 matrix [71] within the BioEdit software version 7.0.5.3 [72].
References Supplementary Material:
133
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134
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135
Table
Table 1: All mutations identified in NAT2 coding region and their frequencies among 404 Brazilian subjects from Rio de Janeiro and Goiás.
Frequency (%)
Effect
aa change
Mutation
References
rs or ss identifiers**
Totala
RJb
c. 29T>C *
This study
ss102664284
missense
p.Ile10Thr
0.12
0.17
c.34T>C
22
missense
p.Tyr12His
c.70T>A
34, 41, 53
rs45477599
missense
p.Leu24Ile
0.12
0.17
c.111T>C
54, 55
silent
c.152G>T *
This study
ss102664285
missense
p.Gly51Val
0.12
0.17
c.190C>T
52, 56
rs1805158
missense
p.Arg64Trp
c.191G>A
34, 43, 52
rs1801279
missense
p.Arg64Gln
4.08
4.7
c.203G>A *
This study
ss102664286
missense
p.Cys68Tyr
0.12
0.17
c.228C>T *
This study
ss102664287
silent
0.12
0.0
c. 282C>T
14, 15, 34
rs1041983
silent
36.88
37.92
c. 341T>C
15, 34, 52
rs1801280
missense
p.Ile114Thr
37.87
39.6
c.345C>T
34, 57
rs45532639
silent
0.25
0.0
c.364G>A
15, 43, 52
rs4986996
missense
p.Asp122Asn
c.403C>G
34, 42, 57
rs12720065
missense
p.Leu135Val
0.62
0.67
c.411A>T
15, 43, 52
rs4986997
missense
p.Leu137Phe
c.434A>C
14, 52, 55
missense
p.Gln145Pro
*
c.458C>T
This study
ss102664288
missense
p.Thr153Ile
0.12
0.17
c.472A>C
42 and this study
missense
p.Ile158Leu
0.62
0.50
c.481C>T
14, 15, 34
rs1799929
silent
35.15
36.41
c.499G>A
15, 52, 55
missense
p.Glu167Lys
c.518A>G
42
missense
p.Lys173Arg
c.578C>T
41; 53 and this study
missense
p.Thr193Met
0.12
0.17
c.590G>A
14, 34, 52
rs1799930
missense
p.Arg197Gln
26.61
26.01
*
ss102664289
c.600A>G
This study
silent
0.12
0.0
c.607G>C
53
missense
p.Glu203Gln
c.609G>T
42, 57
rs45618543
missense
p.Glu203Asp
0.37
0.33
c.613A>T
58
rs45607939
missense
p.Met205Leu
c.622T>C
41, 53 and this study
rs56387565
missense
p.Tyr208His
0.12
0.17
c.638C>T
57
missense
p.Pro213Leu
c.683C>T
34, 42
rs45518335
missense
p.Pro228Leu
0.25
0.33
c.759C>T
55, 59
rs56011192
silent
c.766A>G
42 and this study
rs55700793
missense
p.Lys256Glu
0.74
0.67
c.803A>G
15, 34, 52
rs1208
missense
p.Lys268Arg
39.85
41.11
c.838G>A
34, 42, 57
rs56393504
missense
p.Val280Met
0.49
0.50
c.845A>C
14, 55; 52
rs56054745
missense
p.Lys282Thr
c.857G>A
15, 34, 52
rs1799931
missense
p.Gly286Glu
4.45
4.53
c.859T>C
13
missense
p.Ser287Pro
c.859delT
60
Frameshift
p.Ser287fs
*
New mutations identified in NAT2 coding region. ** Reference cluster ID numbers (rs) or NCBI Assay ID numbers (ss) in dbSNP Entrez.
a
Frequency refers to 808 alleles. b Frequency refers to 596 alleles. c Frequency refers to 212 alleles.
136
GOc
0.0
0.0
0.0
2.36
0.0
0.47
33.96
33.02
0.94
0.47
0.0
0.94
31.60
0.0
28.30
0.47
0.47
0.0
0.0
0.94
36.32
0.47
4.24
-
RESULTADOS
Raquel Lima de F. Teixeira
CAPÍTULO IV
Essa etapa incluiu o estudo de associação, do tipo caso-controle, entre os
polimorfismos genéticos presentes nos genes que codificam para as enzimas metabolizadoras
de drogas NAT2, CYP2E1, GSTM1 e GSTT1, com a ocorrência de reações adversas em
pacientes com TB em tratamento com esquemas contendo isoniazida. Esses resultados
encontram-se reunidos no manuscrito “Genetic polymorphisms of NAT2, CYP2E1, GSTM1
and GSTT1 enzymes and the occurrence of antituberculosis drug-induced hepatotoxicity in
Brazilian TB patients” submetido à revista internacional European Journal of Human
Genetics em abril de 2009.
137
1
Genetic polymorphisms of NAT2, CYP2E1, GSTs enzymes and the occurrence of
antituberculosis drug-induced hepatotoxicity in Brazilian TB patients
Running title: Drug-metabolizing enzymes and hepatotoxicity
Raquel L. F. Teixeira1, Renata G. Morato1, Pedro H. Cabello1, Ligia M. K. Muniz2, Adriana S.
R. Moreira2, Afrânio L. Kritski2, Fernanda C. Q. Mello2, Philip N. Suffys3, Antonio B. Miranda4
& Adalberto R. Santos3*.
1
Laboratory of Human Genetics, Oswaldo Cruz Institute, Fiocruz, Rio de Janeiro, Brazil
2
Medical School -Hospital Complex HUCFF-IDT, Federal University of Rio de Janeiro (UFRJ),
Rio de Janeiro, Brazil
3
Laboratory of Molecular Biology Applied to Mycobacteria, Oswaldo Cruz Institute, Fiocruz,
Rio de Janeiro, Brazil
4
Laboratory of Functional Genomic and Bioinformatics, Oswaldo Cruz Institute, Fiocruz, Rio
de Janeiro, Brazil
*Corresponding author: Laboratory of Molecular Biology Applied to Mycobacteria –
Oswaldo Cruz Institute – Fiocruz, Av. Brasil 4365, CEP: 21040-900, Manguinhos, Rio de
Janeiro, RJ, Brazil. Phone:55 (21) 2598-4289 Fax: 55 (21)2270-9997
E-mail: [email protected]
138
2
Abstract
The problem of liver adverse reactions induced by antituberculosis drugs is a relevant subject of
investigation. Isoniazid (INH), one of the most important drugs used in antituberculosis
treatment, is also the major drug involved in hepatotoxicity. Differences in isoniazid-induced
toxicity have been attributed to genetic variability in several loci such as NAT2, CYP2E1,
GSTM1 and GSTT1, coding for drug-metabolizing enzymes. Considering the differences in the
NAT2, CYP2E1, GSTM1 and GSTT1 alleles and distribution among interethnic populations, our
goal was to evaluate the contribution of their polymorphisms in the susceptibility to
antituberculosis drug-induced hepatotoxicity in Brazilian individuals. A total of 167 TB patients
treated with isoniazid-containing antituberculosis schemes were genotyped for NAT2, CYP2E1,
GSTM1 and GSTM1 polymorphisms. Genotype and allele frequencies were compared between
TB patients with (cases) or without liver adverse events using multivariate logistic regression
analyses. Among cases, 37 patients presented hepatotoxicity and 27 had drug-induced hepatitis.
Statistical analyses revealed no significant association between CYP2E1, GSTM1 and GSTT1
genotypes and liver side effects occurrence. However, slow acetylators had a higher incidence
of hepatitis than intermediate/fast acetylators [22% (18/82) versus 9.8% (6/61); OR, 2.86; CI
95%, 1.06-7.68; p = 0.04)]. Logistic regression showed that slow acetylation status was the only
independent risk factor for both antituberculosis drug-induced hepatotoxicity (OR, 2.62; 95%
IC, 1.75-3.49; p = 0.03) and hepatitis (OR, 3.59; 95% IC, 2.53-4.64; p=0.02). Therefore, slow
acetylation status is a significant risk factor for hepatotoxicity and/or hepatitis occurrence during
antituberculosis treatment with isoniazid-containing schemes in Brazilian individuals.
Keywords:
Drug-metabolizing
enzymes,
pharmacogenetics, Brazilian subjects
139
hepatotoxicity,
tuberculosis,
isoniazid,
3
Introduction
Tuberculosis (TB) is one of the major causes of illness and death worldwide, especially
in Asia and Africa. Globally, 9.2 million new cases and 1.7 million deaths from TB occurred in
2006, of which 0.7 million cases and 0.2 million deaths were in HIV-positive individuals.1
Brazil is the 16th among the 22 countries with the higher burden of tuberculosis, with 50 million
infected subjects, 110 000 new cases and 6 000 annual deaths.2, 3
According to the guidelines for TB control, treating patients with anti-TB drugs is one
of the most effective intervention and schemes containing isoniazid (INH), rifampicin (RMP),
ethambutol (EMB) and pyrazinamide (PZA) are used as first line therapy for tuberculosis1,
2
Despite the availability of effective chemotherapeutic agents to treat TB, side effects such as
hepatic disorder and peripheral neuritis are frequent, limiting the clinical use of the drugs and
contributing to treatment relapse and appearance of multidrug-resistant Mycobacterium
tuberculosis strains.4, 5
The most frequent and serious side effect of these drugs is hepatotoxicity.4, 6 The liver
has a central role in drug metabolism and detoxification, and is consequently vulnerable to
injury. Among the first line anti-TB drugs, INH is the main responsible for the occurrence of
drug-induced hepatic adverse effects and the metabolic intermediates of INH seem to be the
cause of hepatotoxicity.7-9 In liver, INH is metabolized to acetylisoniazid via N-acetyltransferase
2 (NAT2), followed by hydrolysis to acetylhydrazine. Acetylhydrazine is oxidized by
cytochrome P4502E1 (CYP2E1) to form hepatotoxic intermediates.8,
10
These reactive
metabolites can destroy hepatocytes either by interfering with cell homeostasis or by triggering
immunologic reactions in which reactive metabolites, bound to hepatocyte plasma proteins, may
act as haptens.11 The other metabolic pathway to generate toxic metabolites is the direct
hydrolysis of INH to hydrazine, a potent hepatotoxin. N-acetyltransferase 2 is also responsible
to convert acetylhydrazine to diacetylhydrazine, a nontoxic component.7-9 Glutathione Stransferase (GST), an important phase II detoxification enzyme, is supposed to play a protective
role as an intracellular free radical scavenger conjugating glutathione with toxic metabolites that
140
4
are generated from CYP2E1.12 Sulphydryl (SH) conjugation facilitates the elimination of
metabolites from the body and reduces the toxic effect.13
The common risk factors for hepatotoxicity include advanced age, sex, malnutrition,
complications of diseases, alcohol abuse, HIV infection, viral hepatitis B and C infections.6, 14, 15
Recent studies have demonstrated that genetic polymorphisms in drug-metabolizing enzymes,
which influence their activation capacity and the generation of metabolites in the liver, might
predispose an individual to hepatic adverse reactions.16-24
NAT2 is a polymorphic gene and mutations in its coding region can alter its enzymatic
activity.25,
26
In fact, three major genetically determined phenotypes are observed: fast,
intermediate and slow acetylators, which are inherited as a codominant trait.27-29 However, some
groups consider the intermediate and fast acetylators as one and classify genotypes as: slow and
fast acetylators.30-32 The wild-type NAT2*4 allele and 52 other variants of NAT2 gene were
identified and classified in human populations depending on the haplotype determined by the
combination of up to four out of the 25 different single nucleotide polymorphisms (SNPs)
present
throughout
the
NAT2
coding
region
(www.louisville.edu/medschool/pharmacology/NAT.html). Several other rare SNPs were
described in other populations and reported (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ GenBank), but they
have not been taken into account for allele determination. Many studies have demonstrated that
people with low NAT2 activity have a higher risk of developing hepatic disorders than those
with high NAT2 activity.16, 17, 19, 20 However, other authors observed that fast acetylation would
be a factor risk for antituberculosis drug-induced hepatotoxicity and the controversy still
remains.33-36
The activity of CYP2E1 is also modulated by polymorphisms at several sites on its gene
and the higher activity of this enzyme may increase the synthesis of hepatotoxins leading to
hepatotoxicity. Two polymorphisms upstream of the CYP2E1 transcriptional start site are
detectable by Pst I and Rsa I restriction enzymes and appear to be in complete linkage
disequilibrium. Three genotypes of CYP2E1 are classified as c1/c1, c1/c2 and c2/c2 by
141
5
Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP) using RsaI as the restriction enzyme. The
wild-type allele is c1 and the mutant allele is c2. According to the recent recommended
nomenclature for CYP2E1, *1A is equivalent to c1, and *5 is equivalent to c2
(www.cypalleles.ki.se/cyp2e1.htm). The presence of CYP2E1 *1A/*1A as a genetic marker of
isoniazid-induced liver injury has been evaluated in few studies with discordant results.21, 36, 37
The absence of GST activity due to homozygous null mutations at GSTM1 and GSTT1
loci may also modulate susceptibility to drug-induced hepatotoxicity, but the results reported in
the literature are not homogenous.18, 23, 24
Due to differences in NAT2, CYP2E1, GSTM1 and GSTT1 genotype frequencies among
ethnic groups, evaluation of these genetic markers in the predisposition to drug-induced
hepatotoxicity during TB treatment is needed, mainly in admixed populations. Brazilians are
members of one of the most heterogeneous population in the world, result of five centuries of
ethnic admixture of people from three continents: the European colonizers mainly represented
by the Portuguese, the African slaves and the autochthonous Amerindians. Having in mind the
diversity of those genes distribution and the high incidence of tuberculosis in Brazil, we have
reported here the contribution of NAT2, CYP2E1, GSTM1 and GSTT1 genetic variants in
susceptibility to anti-TB drug-induced hepatotoxicity in Brazilians.
Materials and Methods
Study design and Patients
In a case-control design, a total of 167 unrelated active tuberculosis patients who had
been treated between 1998 and 2008 at the University Hospital Complex: Thoracic
Institute/Clementino Fraga University Hospital from Federal University of Rio de Janeiro
(UFRJ) (Brazil) was enrolled in this study. We retrospectively identified all the patients that
developed antituberculosis drug-induced hepatotoxicity and/or acute hepatitis (cases) and the
ones that showed no evidence of antituberculosis hepatic side effects (controls).
142
6
This study was approved by the ethics committee of the Oswaldo Cruz Foundation
(FIOCRUZ) of Rio de Janeiro, where the samples were processed and analyzed, and written
informed consent was obtained from all the enrolled patients.
All participants fulfilled the following inclusion criteria: (i) age above 18 years; (ii)
diagnosis of active tuberculosis; (iii) treatment with anti-TB drugs regimens that include
isoniazid at the usual dosage (400mg/day); (iv) normal baseline serum transaminases [alanine
aminotransferase (ALT) and aspartate aminotransferase (AST)] before treatment. The exclusion
criteria were: (i) positive serological testing for the human immunodeficiency virus (HIV),
hepatitis B virus or hepatitis C virus; (ii) alcohol abuse intake; (iii) history of chronic liver
disease; (iv) pregnancy and (v) refusal of signing informed written consent.
A volume of 3 mL of venous blood was collected from each volunteers and stored at –
20°C. Genomic DNA was isolated from 100 µL of frozen whole blood using the FlexiGene
DNA Kit (Qiagen Inc., USA), according to the manufacturer’s specifications. After extraction,
DNA samples were stored at –20°C.
Liver function monitoring and diagnosis of drug-induced adverse effects
Liver function tests, consisting of serum transaminases, total bilirubin and alkaline
phosphatase measurements, were done once a month, during the patient’s visit, by using
commercial kits according to the manufacturer’s instructions. The normal values of different
tests were: ALT 30-65 IU/L; AST 15-37 IU/L; total bilirubin up to 1mg/dL and alkaline
phosphatase 50-136 IU/L. Clinical and laboratory checkups were performed more frequently
when hepatitis symptoms or abnormal serum transaminases levels were observed.
According to the American Thoracic Society criteria6 and Brazilian Health Ministry,
cases were divided in two subgroups: (1) drug induced hepatoxicity: individuals who showed
antituberculosis drug-induced hepatotoxicity, with an increase in serum transaminases (either
AST or ALT) values higher than two times the upper limit of normal values (> 2xULN) during
treatment; and (2) drug induced hepatitis: individuals who showed antituberculosis drug-
143
7
induced hepatitis, with an increase in serum transaminases values higher than three times the
upper limit of normal values (> 3xULN) when the recommendation is to interrupt the treatment.
NAT2 genotyping and haplotype reconstruction
Genotyping of the NAT2 coding region and computational analysis were performed as
described previously.38 In brief, a 1093 bp fragment, which contains the entire coding region of
NAT2, was amplified by PCR and subsequently sequenced on both DNA strands using the
primers for amplification and two other internal primers38 Sequencing was performed using ABI
PRISM Big Dye Terminator v. 3.1 Kit (PE Applied BioSystems), according to the
manufacturer’s recommendations, on an ABI PRISM 3730 DNA Analyser (PE Applied
BioSystems). The sequence analysis and SNPs identification were performed using SeqScape
v.2.5 software (Applied BioSystems http://www.appliedbiosystems.com) with the sequence
GenBank AY331807 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/,) as the reference. To solve the haplotype
pair of each patient and to define the acetylation status, haplotype reconstruction using the
program PHASE v2.1.1 was carried out39,
40
with the default model for recombination rate
variation.41 Five independent runs with 1000 interactions, 500 burn-in interactions and a
thinning interval of 1 were performed. The best run that showed the maximum consistency
across five runs was chosen. Additionally, the consistency of the results applying the PHASE
algorithm repeatedly with default and varying values of number of interactions, burn-in
interactions and the thinning interval was pursued.
CYP2E1 genotypes identification
To genotype the SNP -1053C>T in the CYP2E1 gene promoter region and to determine
the three genotypes (*1A/*1A; *1A/*5 and *5/*5), a polymerase chain reaction (PCR) with the
amplification primers CYP2E1F 5´CCA GTC GAG TCT ACA TTG TCA 3’ and CYP2E1R 5`
TTC ATT CTG TCT TCT AAC TGG 3´ were performed followed by RFLP as previously
described.42 Briefly, after the amplification of a 413 bp DNA fragment flanking the -1053C>T
SNP the PCR product was digested with Rsa I restriction enzyme. Evaluation of the fragment
digestions was achieved by electrophoresis on 2% agarose gel followed by ethidium bromide
144
8
staining (0.5μg/mL).
GSTT1 and GSTM1 genotypes identification
In order to determine the presence or absence of the GSTM1 and GSTT1 genes, two
separate multiplex PCR reactions were used as reported previously, with minor modifications.43,
44
The GSTM1 wild-type allele was identified by PCR method using primers M1 5` CTG CCC
TAC TTG ATT GAT GGG 3` and M2 5` CTG GAT TGT AGC AGA TCA TGC 3` to obtain a
273-bp PCR product.43 Co-amplification of a 536 bp fragment of β-globin gene using the
primers: Beta1 5´ GGT TGG CCA ATC TAC TCC CAG G 3` and Beta2 5` GCT CAC TCA
GTG TGG CAA AG 3` was performed as an internal control. The PCR reaction mixture was
carried out in a total volume of 50 µL containing 100ng of genomic DNA, 240 ng of each
GSTM1 primers and 10 pmoles for each β-globin primer, PCR Gold buffer (1x), 3 mM MgCl2,
0.1% Triton X-l00, 0.2 mM of each dNTP and 2U Ampli Taq Gold DNA polymerase (PE
Applied Biosystems). Amplification conditions consisted of an initial denaturing step of 95°C
for 10 min. followed by 30 cycles of 95°C for 30 s, 64°C for 1 min., and 72°C for 6 min. The
homozygous GSTM1 null genotypes were detected by the absence of the 273 bp fragment.
For GSTT1 genotyping and identification of the three genotypes (GSTT1*A/GSTT1*A,
GSTT1*A/GSTT1*0 and GSTT1*0/GSTT1*0) a 1460 bp GSTT1*0 specific fragment was coamplified with a 460 bp fragment corresponding to GSTT1*A allele in a single reaction tube
using primers T1 5´ CCA GCT CAC CGG ATC ATG GCC AG 3`, T2 5` GAG ATG TGA
GGA CCA GTA AGG AAG G 3`, T3 5` CAG TTG TGA GCC ACC GTA CCC 3` and T4 5`
GAG GGG GCC AGC AAC TAT CG 3`.44 PCR was carried out in 50 µL reaction mix
containing 150 ng genomic DNA, PCR buffer (1x), 100 ng of each primer, 1.5 mM MgCl2, 100
µg/mL BSA, 0.2 mM of dNTPs and 2U DNA polymerase (Biotools, Madrid/Spain).
Amplification conditions consisted of a touchdown PCR with an initial denaturing step (94°C
for 5 min.) followed by 20 cycles of 94ºC for 1 min., 68°C for 1 min. (with a decrease of 0,5°C
per cycle at the annealing temperature), and 72°C for 1 min. and 30 s. Additional 15 cycles of
145
9
94°C for 1 min., 58°C for 1 min. and 72°C for 1.5 min. were performed. Evaluation of the PCR
amplicons was achieved by electrophoresis on 2% agarose gel followed by ethidium bromide
staining.
Statistical analysis
Data were expressed as the mean ± standard deviation (SD) (for normal distribution) or
as median with range (for non normal distribution). Expected genotype frequencies were
calculated from respective single allele frequencies according to the Hardy-Weinberg equation.
The observed and expected gene frequencies were compared using a χ2 test to the HardyWeinberg equilibrium.
Qualitative variables were compared using the χ2 test with Yates correction, or the
Fisher exact test when appropriate. Quantitative variables were analyzed using the Student´s t
test, for normal distribution, or Mann-Whitney U-test (2 groups) and Kruskal-Wallis test (up to
2 groups) for non normal distribution. Odds ratios (OR) and confidence intervals (CI) were
calculated to evaluate the susceptibility of NAT2 haplotypes, genotypes and acetylation status to
antituberculosis drug-induced hepatic adverse effects. Multivariate analysis was performed to
evaluate the adjusted risk of antituberculosis drug-induced hepatic adverse effects in the
different genotypes using a stepwise logistic regression analysis. All the analyses were carried
out with the statistical software SPSS 12.0 for Windows (SPSS Inc., Chicago, IL). All statistical
test were evaluated at 0.05 significance level.
Results
Among 167 individuals enrolled in this study, 37 presented antituberculosis druginduced hepatotoxicity where 26 were diagnosed with antituberculosis drug-induced hepatitis.
No statistical differences in age, sex and basal liver function tests between cases and controls
were observed (Tables 1 and 2). The median of ALT, AST and total bilirubin during treatment
146
10
were statistically different between cases (hepatotoxicity or hepatitis) and controls, showing a
clinically significant liver injury among cases (Tables 1 and 2).
The CYP2E1, GSTM1 and GSTT1 genotypes under investigation were in HardyWeinberg equilibrium (p>0.05). There were no significant differences in the frequencies of
CYP2E1, GSTM1 and GSTT1 genotypes between cases and controls neither for hepatotoxicity
nor for hepatitis analyses (Tables 1 and 2).
After NAT2 sequencing and haplotype pair reconstruction, 14 NAT2 alleles were
identified, of which, 3 were new, firstly described here (Table 3). Although the distribution of
NAT2 alleles between cases and controls was not statistically different, the alleles with low
activity were more frequent in cases, while the functional alleles were more frequent in the
control group (Table 3). Genotypes of eight individuals (4.8%) could not be solved after the
reconstruction by PHASE v2.1.1. Additionally, we identified other 10 individuals whom the
acetylation status has not yet been characterized (Tables 4 and 5). Therefore, a total of 18
(10.8%) individuals were excluded for NAT2 analysis.
Among 149 individuals whose acetylation status could be determined, 82 (55.03%)
were slow acetylators, 60 (40.27%) were intermediate acetylators and only 7 (4.7%) individuals
showed fast acetylation genotypes. The slow acetylators had higher median serum ALT and
AST levels than fast/intermediate acetylators during the treatment (ALT: p=0.03; AST: p=0.01).
None specific NAT2 genotype was found to be associated to susceptibility of anti-TB druginduced hepatotoxicity or hepatitis occurrence (Tables 4 and 5).
The risk of antituberculosis drug-induced hepatitis occurrence was significantly higher
in slow acetylators than in fast/intermediate acetylators (22% versus 9%; OR, 2.86; CI 95%,
1.06-7.68; p = 0.04). The same result was not observed when the group with antituberculosis
drug-induced hepatotoxicity was compared to controls (Tables 4 and 5).
Variables such as age, sex, acetylation status, and CYP2E1, GSTM1 and GSTT1
genotypes were further analyzed in a multivariate logistic regression model. After adjustment,
the slow acetylation was the only risk factor for both antituberculosis drug-induced
147
11
hepatotoxicity (OR, 2.62; 95% IC, 1.75-3.49; p = 0.03) and hepatitis (OR, 3.59; 95% IC, 2.534.64; p = 0.02). We have also performed similar analyses classifying individuals in three
acetylation phenotypes (slow, intermediate and fast acetylators) and observed the same results
for hepatotoxicity (OR, 2.63; IC 95%, 1.81-3.45; p=0.02) or for hepatitis (OR, 3.47; IC 95%,
2.43-4.47; p=0.02).
Discussion
Among the first line therapeutic anti-TB drugs, isoniazid is the main drug associated
with hepatotoxicity,45-47 the other drugs related with this adverse reaction are reported in
combination with isoniazid.48 NAT2 is the main enzyme in the isoniazid metabolism and it is
expressed in the liver. Like most studies conducted in different countries,16, 17, 19, 20 our findings
suggest that NAT2 is one of the genetic factors responsible for predisposition to anti-TB druginduced hepatotoxicity in Brazilian individuals. Additionally, the incidence of elevated levels of
serum transaminases was significantly higher in slow acetylators than in fast/intermediate
acetylators. These results are in agreement with the current hypothesis about the risk factor of
hepatic side effects based on acetylation status. Indeed, slow acetylators acetylate not only
isoniazid more slowly but also acetylhydrazine, the immediate precursor of toxic intermediates,
to the harmless diacetylhydrazine.49,
50
This protective acetylation is further suppressed by
isoniazid competition. Therefore, slow acetylators may critically and indirectly increase the
accumulation of toxic metabolites. In addition, another important route to generate toxic
intermediates from isoniazid is by direct hydrolysis of isoniazid without acetylation.51 This
reaction produces hydrazine, which can induce hepatic injury.10,
51
Pharmacokinetics studies
showed that the serum concentration of hydrazine was significantly higher in slow acetylators
than in fast acetylators, probably due to the high concentration of isoniazid. The high amount of
isoniazid disposed by this pathway lead to enhanced hydrolysis to hydrazine, since the rate of
metabolic conversion of isoniazid to acetylisoniazid is lower in slow than in fast acetylators.52, 53
148
12
All of these drug-disposal processes may support the finding that slow acetylators are prone to
isoniazid-induced hepatitis.
Although few studies had been reported the absence of relationship between acetylation
status and hepatotoxicity during TB treatment34-36 or observed that fast acetylators could be
susceptible to this kind of side effects,33 some considerations must be done. In those studies,
phenotyping methods to access the acetylation status of TB patients were used,34-36 which may
have less efficacy being influenced by several confounding factors, such as age, sex, diet, drug
interactions, environmental factors, and co morbid illnesses. Here, genotyping of the NAT2 gene
were performed by sequencing, overcoming these problems in the classification of the
acetylation status. Other aspect that should be taken into account is that in our study, patients
were treated with 400 mg of isoniazid whereas 300 mg were prescribed in the study conducted
by Vuilleumier et al.36 Finally, here we were very rigorous with selection criteria of individuals
to avoid confounding variables.
In our study, no association was found with specific NAT2 haplotype and/or genotype
related to susceptibility of anti-TB drug-induced hepatotoxicity occurrence. These findings may
be due to a high diversity in the NAT2 locus of Brazilian individuals, meaning that a group of
defective NAT2 alleles are involved with hepatic side effects instead of a specific one.
CYP2E1, one of the CYP enzymes, may convert acetylhydrazine into hepatotoxins
affecting anti-TB drug-induced hepatotoxicity. Some studies have shown the relationship
between CYP2E1*5/*5 genotype and the risk of anti-TB drug-induced hepatotoxicity.21,
36
However, a recent study in a Korean population did not confirm those results.37 In Brazilians, it
has been shown that the homozygous mutant CYP2E1*5/*5 is rare (0.5%),54 which differs from
Taiwanese population (12%).21 Indeed, we found only one individual with that genotype among
167 patients enrolled in this study (0.6%) with no association between CYP2E1 genotypes and
hepatic side effects occurrence. The discrepancy of our results may be due to differences in the
frequencies of wild-type CYP2E1*1A and mutant CYP2E1*5 alleles among Brazilian
individuals. Therefore, further studies, with larger sample size, should be carried out in
149
13
Brazilian population to better evaluate the relationship between CYP2E1 genotypes and adverse
reactions during TB treatment.
Finally, the frequencies of homozygous GSTM1 and GSTT1 null genotypes in this study
were in accordance to other studies in a Brazilian population55 showing the consistence of our
data. Few studies observed the relationship between GSTs genotypes and antituberculosis druginduced hepatotoxicity.18,
23, 24
Indeed, Roy et al. have observed a significant association
between the homozygous GSTM1 null polymorphism and the antituberculosis drug-induced
hepatotoxicity in Indian TB patients.18 Recently, Huang et al. have found similar results in a
Chinese population.23 On the other hand, the presence of homozygous GSTT1 null
polymorphism was similar between cases and controls in both studies. The same analysis in
Spanish TB patients however, showed an opposite effect: the homozygous GSTT1 null
polymorphism was highly associated with anti-TB drug-induced hepatotoxicity and no
significant associations were found between homozygous GSTM1 null and hepatotoxicity.24 So,
further studies should be carried out to evaluate these genetic factors in the susceptibility to
hepatotoxicity occurrence.
Although in a previous study, the association of slow acetylation profile with higher risk
of developing hepatotoxicity to anti-tuberculosis drugs has already been reported in Brazilians
from the Southern region,57 to our knowledge, this is the first study with Brazilian individuals
where four genetic markers were analyzed to evaluate their relationship with side effects
occurrence during antituberculosis therapy. The high diversity of NAT2 gene and the presence
of rare alleles in Brazilian individuals, identified after sequencing that could not be solved by
PHASE program, lead to a reduced number of patients enrolled for NAT2 analysis. Even so,
critically considering and excluding the confounding factors, the results presented here are the
first experimental proof to support the influence of the genetic factors in the occurrence of
antituberculosis drug-induced liver adverse reactions among Brazilians and may be used to
predict these side effects.
150
14
Therefore, the prediction of antituberculosis drug-induced hepatotoxicity would not
only assist in determining the most suitable drug doses for individual patients, but should also
reduce the number of outpatient visits, laboratory tests and hospitalizations due to liver
dysfunction.
Acknowledgements
We thank the nursing service of the Hospital Tuberculosis Control Program/Thoracic Diseases
Institute/Clementino Fraga Filho University Hospital, for sample collection and the support
from the PDTIS- FIOCRUZ sequencing and Bioinformatics Platforms.
This work was supported by Faperj/Pronex: Proc: E-26/170.0003/2008 and FAPERJ Pensa Rio:
E-26/110.288/2007. Adalberto Rezende Santos, Afrânio Lineu Kritski, Fernanda C. Q. Mello,
and Philip Noel Suffys are supported by CNPq Grant numbers 308786/2005-0, 35 04 77/19957, 306702/2007-0 and 312165/2006-4 respectively.
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157
Table 1: Demographic, clinical and laboratory data of enrolled subjects. Influence of the
genotype and allele frequencies of CYP2E1, GSTT1 and GSTM1 in drug-induced hepatotoxicity.
Hepatotoxicity
(>2xULN AST or ALT)
p
Presence
Absence
(n=37)
(n=130)
Age (year)*
46.7±18.91
42.85±14.85
0.258a
Sex (M/F)
22/15
68/62
0.441b
Baseline
AST**
27 (14-73)
24 (10-58)
0.495c
**
ALT
30 (14-95)
28 (10-73)
0.145c
**
Total bilirubin
0.5 (0.1-1.0)
0.5 (0.2-1.0)
0.264c
**
Alkaline phosfatase
81 (43-174)
84.5 (10-210)
0.804c
During antituberculosis treatment
Peak AST**
263 (57-2,600)
27 (13-74)
< 0.001c
**
Peak ALT
180 (53-1,331)
32 (13-73)
< 0.001c
**
Peak total bilirubin
2.5 (0.2-22.6)
0.65 (0.4-1.8)
0.003c
**
Peak alkaline phosfatase
152 (54-591)
175 (60-450)
0.922c
CYP2E1
*1A/*1ª
33 (89.2%)
118 (90.8%)
0.168b
(8.1%)
*1A/*5
3
12 (9.2%)
*5/*5
1 (2.7%)
0 (0%)
(93.2%)
248 (95.4%)
*1ª
69
(6.8%)
*5
5
12 (4.6%)
GSTT1
+/+
12 (32.4%)
34 (26.1%)
0.720b
(48.7%)
+/18
72 (55.4%)
-/7 (18.9%)
24 (18.5%)
(56.8%)
140 (53.8%)
Functional allele (wild-type)
42
(43.2%)
null allele
32
120 (46.2%)
GSTM1
0.251b
+/_
18 (48.6%)
77 (59.2%)
(51.4%)
(40.8%)
-/19
53
Normal Interval of AST: 15-37 U/L; ALT: 30-65 U/L; Total bilirrubin: <1mg/dL; Alkaline
phosfatase: 50-136 U/L;
*
Mean e standard deviation; ** Median (range).
a
p-value of Student t test; b p-value of χ2; c p-value of Mann Whitney test
158
Table 2: Demographic, clinical and laboratory data of enrolled subjects. Influence of the
genotype and allele frequencies of CYP2E1, GSTT1 and GSTM1 in drug-induced hepatitis
Hepatitis
(>3xULN AST or ALT)
P
Presence
Absence
(n=26)
(n=141)
Age (year)*
47.58±20.07
42.99±14.94
0.275a
Sex (M/F)
16/10
74/67
0.395b
Baseline
AST**
27 (14-54)
24 (10-73)
0.577c
**
ALT
31 (14-95)
28 (10-73)
0.441c
**
Total bilirubin
0.5 (0.2-1.0)
0.5 (0.1-1.0)
0.211c
**
Alkaline phosfatase
80.5 (43-174)
84.5 (10-210)
0.787c
During antituberculosis treatment
Peak AST**
351.5 (74-2,600)
28.5 (13-118)
< 0.001c
**
Peak ALT
254 (60-1,331)
34 (13-155)
< 0.001c
**
Peak total bilirubin
3.9 (0.6-22.6)
0.6 (0.2-7.5)
< 0.001c
**
Peak alkaline phosfatase
154 (54-591)
163 (60-450)
0.884c
CYP2E1
*1A/*1A
23 (88.5%)
128 (90.8%)
(7.7%)
0.064b
*1A/*5
2
13 (9.2%)
(3.8%)
(0%)
0
*5/*5
1
*1A
48 (92.3%)
269 (95.4%)
13 (4.6%)
*5
4 (7.7%)
GSTT1
+/+
9 (34.6%)
37 (26.2%)
(50%)
+/13
77 (54.6%)
0.666b
(15.4%)
(19.2%)
-/4
27
151 (53.5%)
Functional allele (wild-type)
31 (59.6%)
null allele
21 (40.4%)
131 (46.5%)
GSTM1
+/_
15 (41.7%)
80 (56.7%)
0.928b
(42.3%)
-/11
61 (43.3%)
Normal Interval of AST: 15-37 U/L; ALT: 30-65 U/L; Total bilirubin: <1mg/dL; Alkaline
phosfatase: 50-136 U/L;
*
Mean e standard deviation; ** Median (range).
a
p-value of Student t test; b p-value of χ2; c p-value of Mann Whitney test
159
Table 3: NAT2 alleles frequencies among Brazilians TB patients enrolled in this study.
Allele
Phenotype
Total
HepTox1 HepMed2
Haplotype•
GTTACAGAAGG
NAT2*6A
slow
242
284
288
GCCATGGAGGG
NAT2*5B
slow
23
28.4
26.9
GCTACGGAAGG
NAT2*4
fast
18.9
13.5
13.5
GCCATGGAAGG
NAT2*5A
slow
12
9.5
9.6
GTTACGGAAGA
NAT2*7B
slow
4.5
6.8
7.7
ATTACGGAAGG
NAT2*14B
slow
3
2.7
3.8
GCTACGGAGGG
NAT2*12A
fast
2.4
0
0
GCCACGGAGGG
NAT2*5C
slow
2.7
2.7
3.8
GTTACGGAAGG
NAT2*13A
fast
1.5
1.3
0
GTTACAGGAGG
NAT2*6H
ND
0.9
2.7
1.9
GCTACGTAGGG
NAT2*12G
ND
0.6
1.3
0
GTTACAGAAAG
NAT2* new1
ND
0.9
0
0
GTTATGGAAGA
NAT2* new2
ND
0.3
0
0
GCCCTGGAGGG
NAT2* new3
ND
0.3
0
0
ND
ND
4.8
2.7
3.8
Alleles with low activity
-
69.5
78.4
80.8
Functional alleles
-
22.7
14.9
13.4
Function not determined
-
7.8
6.7
5.8
100
100
100
Total
•
Nucleotide positions within NAT2 coding region: 191; 282; 341; 472; 481; 590; 609; 766; 803;
838; 857;
1
Allele frequency among individuals with hepatotoxicity (n° of individuals=37);
2
Allele frequency among individuals with hepatitis (n° of individuals=26);
ND
not determined.
160
Table 4: NAT2 genotype/phenotype and susceptibility of isoniazid-induced hepatotoxicity.
Hepatotoxicity
Genotype/Phenotype
Total
OR*
95% CI *
Presence
Absence
Slow acetylator
23 (62.2%)
59 (45.4%)
82 (49.1%)
2.22
0.97-5.08
5B/5B
7 (18.9%)
15 (11.5%)
22 (13.1%)
1.79
6A/6A
5
(13.5%)
(7.7%)
(9.9%)
1.88
0.67-4.78
0.60-5.88
6A/5A
2 (5.4%)
13 (7.8%)
6A/5B
3
(8.1%)
7B/5A
1
(2.7%)
5C/5B
0 (0%)
6A/7B
(0%)
0
(2.7%)
10
11 (8.5%)
15
0.62
0.13-2.92
8
(4.8%)
2.21
0.50-9.68
4
(2.4%)
-
-
4 (3.1%)
4 (2.4%)
-
-
3
(2.3%)
3
(1.8%)
-
-
2
(1.5%)
3
(1.8%)
-
-
5
(3.8%)
3
(2.3%)
7B/5B
1
5C/5C
1 (2.7%)
1 (0.8%)
2 (1.2%)
-
-
5A/5B
(2.7%)
1
(0.8%)
2
(1.2%)
-
-
2
(1.5%)
2
(1.2%)
-
-
2 (1.2%)
-
-
1
(0.6%)
-
-
1
(0.6%)
-
-
-
-
20
(12%)
0.86
0.27-2.76
15
(9.9%)
0.51
0.11-2.39
1
(0%)
5A/14B
0
6A/14B
2 (5.4%)
7B/14B
5B/14B
0
(0%)
0
(0%)
0 (0%)
1
(0.8%)
1
(0.8%)
10 (27%)
50 (38.4%)
4
(10.8%)
(12.3%)
4/5A
2
(5.4%)
4/5B
1 (2.7%)
Intermediate acetylator
6A/4
0
(0%)
4/14B
0
(0%)
7B/4
2 (5.4%)
12A/5B
0
(0%)
6A/12A
0
(0%)
13A/5B
1 (2.7%)
6A/13A
13A/5A
Fast acetylator
4/4
12A/12A
Acetylation not determined
6H/4
12G/5C
0
(0%)
16
13
(10%)
60 (35.9%)
7 (5.4%)
8 (4.8%)
-
-
4
(3.1%)
4
(2.4%)
-
3
(2.3%)
3
(1.8%)
-
-
1 (0.8%)
3 (1.8%)
-
-
2
(1.5%)
2
(1.2%)
-
-
2
(1.5%)
2
(1.2%)
-
-
1 (0.8%)
2 (1.2%)
-
-
(0.8%)
(0.6%)
-
-
-
-
-
-
1
1
0 (0%)
7 (5.4%)
7 (4.2%)
0
(0%)
6
(4.6%)
6
(4.6%)
0
(0%)
1
(0.8%)
1
(0.6%)
4 (10.8%)
1
0
(2.7%)
(0%)
14 (10.8%)
0
1
(0%)
(0.8%)
161
-
-
1
(0.6%)
-
-
1
(0.6%)
-
-
18 (10.8%)
6H/5A
6A/6H
7B/12G
NEW1/14B
NEW2/5A
NEW1/4
NEW1/5A
5B/NEW3
Genotype not determined
Total
1 (2.7%)
0
(0%)
1 (2.7%)
0
(0%)
0
(0%)
0 (0%)
1
(0.8%)
0 (0%)
1
(0.8%)
1
(0.8%)
1 (0.6%)
-
-
(0.6%)
-
-
1 (0.6%)
-
-
1
(0.6%)
-
-
1
(0.6%)
-
-
1
0 (0%)
1 (0.8%)
1 (0.6%)
-
-
0
(0%)
1
(0.8%)
1
(0.6%)
-
-
0
(0%)
1
(0.8%)
1
(0.6%)
-
-
1 (2.7%)
7 (5.4%)
8 (4.8%)
-
-
37 (100%)
130 (100%)
167 (100%)
-
-
Intermediate and fast acetylators were grouped into the same class and individuals with
acetylation status not determined were excluded of phenotype analysis. Other genotypes were
used as reference for OR.
*
162
Table 5: NAT2 genotype/phenotype and susceptibility of isoniazid-induced hepatitis.
Hepatitis
Genotype/Phenotype
Total
OR*
95% CI*
Presence
Absence
Slow acetylator
18 (69.2%)
5
(19.2%)
3
(11.5%)
2
(7.7%)
6A/5B
3
(11.5%)
7B/5A
1 (3.8%)
5B/5B
6A/6A
6A/5A
64 (45.4%)
17
(12.1%)
12
(8.5%)
11
(7.8%)
(3.6%)
5
2.86
1.06-7.68
22
(13.1%)
1.74
15
(8.9%)
1.40
0.58-5.21
0.37-5.36
13
(7.8%)
0.98
0,21-4.73
3.55
0.79-15.87
82 (49%)
8
(4.8%)
3 (2.1%)
4 (2.4%)
-
-
4
(2.8%)
4
(2.4%)
-
-
3
(2.1%)
3
(1.8%)
-
-
0
(0%)
6A/7B
0
(0%)
7B/5B
1 (3.8%)
2 (1.4%)
3 (1.8%)
-
-
5C/5C
(3.8%)
1
(0.7%)
2
(1.2%)
-
-
2
(1.4%)
2
(1.2%)
-
-
2 (1.2%)
-
-
2
(1.2%)
-
-
1
(0.6%)
-
-
5C/5B
1
(0%)
5A/5B
0
5A/14B
0 (0%)
6A/14B
2
(7.7%)
(0%)
2 (1.4%)
0
(0%)
(0.7%)
7B/14B
0
5B/14B
0 (0%)
1 (0.7%)
1 (0.6%)
-
-
Intermediate acetylator
6 (23.1%)
54 (38.3%)
60 (36%)
-
-
18
(12.8%)
20
(12%)
0.57
0.12-2.62
13
(9.2%)
15
(9%)
0.82
0.17-3.87
-
-
-
6A/4
4/5A
4/5B
12A/5B
4/14B
7B/4
2
(7.7%)
2
(7.7%)
0
(0%)
0
(0%)
0
(0%)
2
(7.7%)
(0%)
1
8
(5.7%)
4
(2.8%)
3
(2.1%)
1
(0.7%)
2
(1.4%)
8
(4.8%)
4
(2.4%)
3
(1.8%)
-
-
3
(1.8%)
-
-
2
(1.2%)
-
-
6A/13A
0
6A/12A
0 (0%)
2 (1.4%)
2 (1.2%)
-
-
13A/5B
0 (0%)
2 (1.4%)
2 (1.2%)
-
-
13A/5A
(0%)
(0.7%)
(0.6%)
-
-
0
1
1
Fast acetylator
0 (0%)
7 (5%)
7 (4.2%)
-
-
4/4
0 (0%)
6 (4.3%)
6 (3.6%)
-
(0%)
(0.7%)
(0.6%)
-
-
12A/12A
0
1
1
Acetylation not determined
2 (7.7%)
16 (11.3%)
18 (10.8%)
-
-
6H/4
1 (3.85%)
0 (0%)
1 (0.6%)
-
-
12G/5C
0 (0%)
1 (0.7%)
1 (0.6%)
-
-
163
6H/5A
0 (0%)
1 (0.7%)
1 (0.6%)
6A/6H
0 (0%)
1 (0.7%)
1 (0.6%)
7B/12G
0 (0%)
1 (0.7%)
1 (0.6%)
NEW1/14B
0 (0%)
1 (0.7%)
1 (0.6%)
NEW2/5A
0 (0%)
1 (0.7%)
1 (0.6%)
NEW1/4
0 (0%)
1 (0.7%)
1 (0.6%)
NEW1/5A
0 (0%)
1 (0.7%)
1 (0.6%)
5B/NEW3
0 (0%)
1 (0.7%)
1 (0.6%)
Genotype not determined
Total
1 (3.85%)
26 (100%)
7 (5%)
141 (100%)
8 (4.8%)
167 (100%)
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
Intermediate and fast acetylators were grouped into the same class and individuals with
acetylation status not determined were excluded of phenotype analysis. Other genotypes were
used as reference for OR.
*
164
DISCUSSÃO
Raquel Lima de F. Teixeira
4- DISCUSSÃO
165
DISCUSSÃO
Raquel Lima de F. Teixeira
Variações genéticas em enzimas metabolizadoras de drogas são responsáveis por
diferenças interindividuais na resposta terapêutica, na suscetibilidade a doenças, na ocorrência
de efeitos colaterais e interações medicamentosas. Assim, a identificação de marcadores
genéticos que possam predizer desfechos terapêuticos desfavoráveis com uma determinada
droga pode direcionar não somente a indicação do medicamento correto como também do
esquema posológico mais adequado, maximizando a eficácia e prevenindo ou reduzindo as
possíveis reações adversas tóxicas.
Durante muitos anos a isoniazida vem sendo apontada como uma droga hepatotóxica e
alguns estudos têm demonstrado uma associação entre o fenótipo/genótipo de acetilação de
NAT2 e a suscetibilidade à ocorrência dessas reações adversas. Alguns polimorfismos no
gene de NAT2 estão relacionados a uma baixa atividade enzimática, o que leva a geração de
metabólitos hepatotóxicos a partir da biotransformação da isoniazida. Em contrapartida, a
presença de dois alelos funcionais caracteriza um fenótipo de acetilação rápida, podendo
interferir na eficácia da droga, o que torna a análise do perfil de acetilação um ponto crucial
para a prevenção de desfechos terapêuticos desfavoráveis no tratamento anti-TB. Hoje, a
genotipagem de NAT2 tem sido considerada um método rápido e simples para inferir o
fenótipo de acetilação num curto espaço de tempo. Através desse acompanhamento genético,
terapias individualizadas para drogas que são metabolizadas por NAT2 poderiam ser
introduzidas na prática clínica, através do ajuste da dosagem do medicamento ou da
administração de uma droga alternativa, de forma a maximizar o efeito terapêutico e reduzir
as reações adversas no indivíduo sob tratamento.
Polimorfismos no gene que codifica para N-acetiltransferase 2 tem sido
extensivamente investigados; hoje, a variabilidade do gene NAT2 em diferentes populações é
um consenso geral. Uma vez que, ao iniciarmos esse estudo, não encontramos dados na
literatura sobre o perfil de acetilação da população brasileira, bem como quais alelos
circulavam aqui no país, iniciamos um mapeamento da região codificante de NAT2 de
indivíduos residentes nos Estados do Rio de Janeiro e Goiás, utilizando como estratégia de
genotipagem o sequenciamento direto de produto de PCR (Aprovação Comitê de Ética em
Pesquisa n° 216/03 – Anexo 1).
Para tal, desenhamos quatro iniciadores, baseados na sequência referência de NAT2
(AY331807) contida no GenBank. Esses iniciadores foram utilizados tanto para a
amplificação da região de interesse, como para as reações de sequenciamento (Anexo 2). Uma
DNA polimerase com atividade revisora (Tli DNA polimerase) foi adicionada à reação de
PCR para evitar a introdução de nucleotídeos de forma errônea pela Taq DNA polimerase, e
166
DISCUSSÃO
Raquel Lima de F. Teixeira
assim nos certificarmos da fidelidade da sequência amplificada. Dessa forma, conseguimos
obter quatro sequências para cada amostra, a partir do produto amplificado de 1093 pb que,
depois de editadas através de programa computacional apropriado, foram capazes de nos
fornecer a sequência nucleotídica completa da região que codifica para NAT2. De modo a
aperfeiçoar as análises das sequências obtidas a partir de quatrocentos e quatro indivíduos, o
software SeqScape foi utilizado nesse estudo e se mostrou apropriado como ferramenta para
a identificação de SNPs já descritos, bem como para a validação de novos SNPs (Anexo 2).
Através da genotipagem por sequenciamento, conseguimos não somente determinar as
frequências dos SNPs já descritos, como também identificar novas mutações em NAT2 e
sugerir qual seria o perfil de acetilação das populações estudadas através da identificação dos
genótipos encontrados na nossa amostragem. Um total de vinte e três SNPs foram
identificados, sendo treze SNPs já descritos em outras populações e dez mutações, até o
momento, ainda não descritas na literatura.
Com o objetivo de utilizarmos as novas variantes gênicas de NAT2 como ferramenta
tecnológica para a predição de efeitos colaterais, falência terapêutica ou suscetibilidade a
doenças onde este gene possa estar envolvido, redigimos um pedido de patente (Capítulo 2 Resultados) solicitando a proteção de um método diagnóstico contendo as novas mutações
encontradas em indivíduos brasileiros. Entretanto, durante a fase de redação, Patin e
colaboradores (2006) publicaram dois artigos revelando a presença de quatro (472A>C,
578C>T, 622T>C, e 766A>G) das dez novas mutações na população africana (Patin et al.,
2006a; Patin et al., 2006b). Sendo assim, a referida patente, depositada no âmbito nacional no
dia 12 de outubro de 2007, e posteriormente internacionalizada em outubro de 2008 (Anexo
3), inclui apenas seis mutações (29T>C, 152G>T, 203G>A, 228C>T, 458C>T e 600A>G)
descritas somente na fração da população brasileira estudada (Capítulo 2; Tabela 1 do
Capítulo 3).
Dentre os SNPs já descritos, os sete mais comumente encontrados em diferentes
regiões do mundo puderam ser observados numa frequência relevante em nossa população
(Tabela 1 do Capítulo 1). Dentre esses polimorfismos, foi possível identificar mutações
consideradas étnicoespecíficas, como os SNPs 191G>A, 341T>C e 857G>A. Com relação a
influência dos SNPs no fenótipo de acetilação, observamos que quatro desses polimorfismos
(191GA, 341TC, 590GA e 857GA) eram associados com um fenótipo de acetilação
lenta e os outros três (282C>T, 481C>T e 803A>G) aparentemente não interferiam na
atividade enzimática (Fretland et al., 2001; Zang et al., 2007). Seis mutações (70T>A;
345C>T; 403C>G; 609G>T; 683C>T e 838G>A), que não fazem parte do site oficial de
167
DISCUSSÃO
Raquel Lima de F. Teixeira
nomenclatura de NAT2, foram encontradas em frequências abaixo de 1%, e sua influência no
fenótipo de acetilação ainda não foi determinada.
Em relação à origem étnicoespecífica dos SNPs, a mutação 191GA foi inicialmente
identificada em americanos-africanos através de um estudo realizado por Bell e colaboradores
(1993). Esses autores sugeriram que o referido SNP teria uma origem africana, uma vez que
era completamente ausente em populações eurodescendentes. (Bell et al., 1993).
Posteriormente, em 1996, outro estudo com populações africanas confirmou a origem do
mesmo SNP (Delomenie et al., 1996). Adicionalmente, diversos estudos mostram que a
frequência de 191G>A pode variar nas diferentes regiões da África, com um decréscimo de
sua incidência a partir do oeste para o leste africano, ao longo da África Subssaariana (Cavaco
et al., 2003). Nossos resultados mostram que a população de estudo apresenta uma frequência
significativa (4,1%) de 191G>A, ficando atrás apenas das populações onde essa mutação se
originou (Tabela 4 do Capítulo 1). O fato de populações do oeste da África terem participado
do povoamento do Brasil na época da colonização talvez seja a melhor explicação para a
presença deste SNP em nossa população (Parra et al., 2003).
Por outro lado, o SNP 857G>A foi originalmente identificado em indivíduos japoneses
(Ohsako e Deguchi, 1990), sendo raramente observado em populações européias (Blum et al.,
1991). Em 1993, Lin e colaboradores observaram que o SNP 857G>A caracterizava de 3033% dos alelos lentos dentre os coreanos e chineses; entretanto, o mesmo caracteriza apenas
1-5% dos alelos lentos em populações eurodescendentes, corroborando a hipótese de que esta
mutação originou-se na Ásia (Lin et al., 1993). Estudos posteriores em populações ameríndias
mostraram que esse SNP compreende a mutação mais frequente, dentre aqueles responsáveis
pela diminuição na atividade de NAT2 (Jorge-Nebert et al., 2002) contribuindo assim para a
hipótese da proximidade filogenética entre as populações asiática e ameríndia. Em nosso
trabalho, o SNP 857G>A foi observado numa frequência de 4,4%, mostrando mais uma vez a
participação de diferentes etnias na constituição da população brasileira (Tabela 4 do Capítulo
1).
Finalmente, quando analisamos a mutação 341T>C (considerada como de origem
européia), pudemos verificar que a mesma se apresenta numa frequência similar às
encontradas em populações eurodescendentes (Tabela 4 do Capítulo 1), mostrando, assim, a
influência européia no perfil genético de NAT2 da fração estudada da população brasileira.
No que diz respeito à diversidade alélica de NAT2, neste estudo inicial, fomos capazes
de identificar dezesseis alelos diferentes de NAT2 dos quais cinco deles ainda não foram
caracterizados quanto ao fenótipo de acetilação (Tabela 2 do Capítulo 1). Dentre os onze
168
DISCUSSÃO
Raquel Lima de F. Teixeira
alelos com função conhecida, oito deles caracterizam um fenótipo de acetilação lenta, sendo
os alelos NAT2*5B (33%) e NAT2*6A (26%) os mais frequentes. O alelo tipo-selvagem
NAT2*4 foi o alelo funcional mais frequente em nossa amostragem (20%) e, quando
comparamos a distribuição dos diferentes alelos nas duas regiões estudadas apenas este
apresentou uma frequência significativamente diferente, sendo mais observado no Estado de
Goiás (Tabela 2 do Capítulo1). Essa distribuição alélica de NAT2 mostra mais uma vez a forte
influência de eurodescendentes e africanos na formação do background genético do povo
brasileiro. De fato, em eurodescendentes e africanos a incidência de alelos do cluster NAT2*5
é alta, enquanto que a frequência dos alelos NAT2*7A e NAT2*7B é baixa (Mrozikiewicz et
al., 1996; Dandara et al., 2003); já em populações asiáticas acontece o contrário, sendo os
alelos dos clusters *6 e 7* os responsáveis pelo fenótipo de acetilação lenta (Sekine et al.,
2001; Kukongviriyapan et al., 2003). Em populações ameríndias, o alelo NAT2*7B é o
principal responsável pelo fenótipo de acetilação lenta, apresentando pouca ou nenhuma
incidência de outros alelos que conferem uma baixa atividade de N-acetilação (Jorge-Nebert
et al., 2002).
Após a análise da combinação dos diferentes SNPs encontrados através do
sequenciamento direto, conseguimos identificar o haplótipo de cento e vinte indivíduos
homozigotos para todas as mutações ou heterozigotos para somente um SNP. Entretanto, após
a exclusão de seis SNPs que não influenciavam no fenótipo de acetilação, pudemos
caracterizar o genótipo de um total de duzentos e dois indivíduos e assim predizer seu perfil
de acetilação. Sendo assim, foi possível identificar quatorze genótipos e sugerir que o perfil
de acetilação da população estudada é lento (49%), representado principalmente pelos
genótipos NAT2*5/*5 e NAT2*6/*6 (Tabela 3 do Capítulo 1). Por outro lado, com base nas
análises realizadas, o genótipo de acetilação rápida, nessas duas regiões do Brasil, é
constituído pelos alelos NAT2*4, *12 e *13, semelhante ao observado em populações
africanas, enquanto que em eurodescendentes a acetilação rápida é dependente principalmente
da presença do alelo tipo-selvagem NAT2*4 (Cascorbi et al., 1995; Delomenie et al., 1996;
Agundez, 2003).
Quando observamos separadamente os resultados obtidos nos dois Estados do Brasil,
pudemos verificar que a população de Goiás apresenta uma maior prevalência de alelos
funcionais quando comparado à população do Rio de Janeiro, além de conter uma diversidade
alélica menor (Tabela 2 do Capítulo 1). Esse quadro pode ser explicado pela influência de
populações ameríndias naquela região, uma vez que são populações mais homogêneas e com
alto índice de alelos funcionais, representados pelo alelo NAT2*4 (Jorge-Nebert et al., 2002).
169
DISCUSSÃO
Raquel Lima de F. Teixeira
Além disso, as duas populações estudadas apresentaram diferenças na distribuição dos
genótipos de NAT2 e perfil de acetilação, com uma frequência significativamente maior de
acetiladores intermediários no Rio de Janeiro (Tabela 3 do Capítulo 1), mostrando a grande
diversidade existente entre essas duas regiões do país.
A presença isolada de SNPs responsáveis por uma diminuição da atividade enzimática
no gene que codifica para NAT2 é um evento raro. Assim, quando duas ou mais destas
mutações estão presentes numa determinada amostra, é de extrema importância averiguar se
as mesmas estão localizadas num único alelo (sendo, o outro um alelo funcional), ou ainda se
os SNPs estão presentes em alelos diferentes (caracterizando dois alelos não funcionais). Para
se aferir o perfil de acetilação de um determinado indivíduo, é necessária a identificação do
haplótipo de cada alelo de NAT2, uma vez que a atividade enzimática é influenciada pela
combinação dos SNPs presentes em ambos os alelos.
A fim de caracterizar os alelos/haplótipos de NAT2 portadores de mutações novas e/ou
raras circulantes em indivíduos residentes no Rio de Janeiro e Goiás, partimos para a
utilização da tecnologia de clonagem e ressequenciamento gênico (Anexo 4). Através dessa
metodologia, conseguimos isolar os alelos de cada indivíduo analisado e identificar as
combinações de mutações que geram os haplótipos, pelo sequenciamento dos DNAs
recombinantes. Sete novos alelos foram identificados na fração da população brasileira
estudada, apresentando diferentes frequências (Figura 1 do Capítulo 3).
Vários estudos de predição por modelagem molecular têm caracterizado a
funcionalidade dos alelos de NAT2 e obtido resultados semelhantes aos estudos experimentais
(Rodrigues-Lima & Dupret, 2002; Zang et al., 2007; Walraven et al., 2008). Sendo assim,
através de modelagem e análise estrutural da proteína NAT2, fomos capazes de sugerir o
papel estrutural e/ou funcional de diferentes polimorfismos: encontramos uma mutação
possivelmente envolvida no reconhecimento do substrato pela enzima (152G>T ou
Gly51Val), uma mutação que altera o sítio catalítico pela perda de um grupamento funcional
(203G>A ou Cys68Tyr) e mutações que podem levar à presença de resíduos hidrofóbicos
expostos na superfície da proteína (458C>T, 578C>T, 683C>T, e 838G>A), facilitando a
ubiquitilação e a degradação proteossômica da proteína (Grant, 2008). Todos esses
polimorfismos parecem interferir na atividade de acetilação contribuindo ainda mais para o
fenótipo de acetilação lenta predominante na fração estudada da população brasileira.
Adicionalmente, dentre os sete novos alelos caracterizados pelo exame do DNA, cinco deles
apresentaram potencial para codificar uma enzima com atividade reduzida (NAT2*5N, *5O,
*6H, *6M, *12E), outros dois (NAT2*20 e *12I) parecem ser alelos funcionais por conterem
170
DISCUSSÃO
Raquel Lima de F. Teixeira
mutações silenciosas e/ou mutação que não altera a atividade enzimática (803A>G).
Finalmente, os alelos NAT2*12F e NAT2*12J possivelmente codificam enzimas com
atividade normal, uma vez que apresentam polimorfismos (622T>C ou 29T>C, em adição a
803A>G, respectivamente) que não afetam a estrutura ou a função enzimática.
Até o presente momento, este parece ser o primeiro trabalho de mapeamento da região
codificante de NAT2 por sequenciamento numa população miscigenada onde a tuberculose se
apresenta de forma endêmica, servindo de base para estudos clínicos e epidemiológicos de
NAT2 no Brasil. Os diferentes SNPs encontrados, novos e já descritos, assim como a
diversidade alélica para o gene NAT2 mostram a heterogeneidade brasileira e isto se deve ao
fato de diferentes grupos étnicos terem participado na construção de nossa população na
época da colonização. Entretanto, a frequência esperada desses SNPs depende da região a ser
estudada, devido a uma maior ou menor influência de determinado grupo étnico. Portanto, se
faz necessário um estudo da prevalência dessas mutações e de padrões genotípicos em
diferentes regiões do Brasil, para podermos avaliar com precisão as condutas terapêuticas do
tratamento da tuberculose aplicadas em nosso país. Além disso, um estudo funcional da
influência desses novos SNPs na atividade de NAT2 seria importante para um completo
entendimento e caracterização do fenótipo de acetilação no Brasil.
A fim de verificar a influência de variantes gênicas dos loci NAT2, CYP2E1, GSTM1 e
GSTT1 na ocorrência de efeitos colaterais hepáticos induzidos por drogas anti-TB, realizamos
um estudo retrospectivo do tipo caso-controle com pacientes atendidos no Hospital
Universitário Clementino Fraga Filho, da Universidade Federal do Rio de Janeiro (Aprovação
Comitê de Ética em Pesquisa n° 421/07 – Anexo 5). Para isso, os quatro genes foram
genotipados por sequenciamento direto ou PCR, aliada, ou não, à técnica de RFLP (Anexos 2
e 6), e as frequências das variantes gênicas foram comparadas entre pacientes que
desenvolveram ou não hepatotoxicidade durante o tratamento anti-TB com um esquema
contendo INH.
Nossos resultados sugerem que os polimorfismos no gene NAT2 constituem um fator
de risco genético importante para a ocorrência de hepatotoxicidade induzida por drogas antiTB. Através da regressão logística multivariada, fomos capazes de constatar que os
acetiladores lentos apresentaram um risco significativamente maior em desenvolver
hepatotoxicidade (OR, 2.62; IC 95%, 1.75-3.49; p = 0.03) ou hepatite medicamentosa (OR,
3.59;
IC
95%,
2.53-4.64;
p
=
0.02)
quando
comparados
aos
acetiladores
intermediários/rápidos (Capítulo 4). Além disso, observamos que aqueles indivíduos
portadores de um genótipo/fenótipo de acetilação lenta apresentaram picos de transaminases
171
DISCUSSÃO
Raquel Lima de F. Teixeira
hepáticas
significativamente
mais
altos
quando
comparados
aos
acetiladores
intermediários/rápidos reforçando a hipótese de que indivíduos com uma deficiência na
atividade de acetilação estariam mais predispostos a desenvolverem efeitos colaterais
hepáticos durante o tratamento anti-TB.
De fato, vários estudos realizados em diferentes populações já constataram a
existência de associação entre o fenótipo de acetilação lenta com a hepatotoxidade induzida
pela INH (Ohno et al., 2000; Huang et al., 2002; Hiratsuka et al., 2002; Kinzig-Schippers et
al., 2005; Shimizu et al., 2006; Cho et al., 2007; Higuchi et al., 2007). Através da
genotipagem pela técnica de PCR-RFLP, esses autores comprovaram que, dentre os pacientes
submetidos ao tratamento quimioterápico anti-TB contendo isoniazida, aqueles que
continham dois alelos para acetilação lenta apresentavam um maior risco de desenvolvimento
de hepatotoxicidade.
Alguns estudos não observaram uma relação entre o perfil de acetilação e a ocorrência
de hepatotoxicidade (Singh et al., 1995a; Singh et al., 1995b; Roy et al., 2006; Vuilleumier et
al., 2006), ou verificaram que os indivíduos com um fenótipo de acetilação rápida é que
seriam mais suscetíveis à lesão hepática induzida por drogas anti-TB (Mitchell et al., 1975).
Várias possibilidades poderiam explicar as diferenças encontradas nesses trabalhos.
Inicialmente, em alguns desses estudos a fenotipagem foi utilizada como ferramenta de
associação entre o perfil de acetilação e o desenvolvimento de doença hepática. Entretanto, o
fenótipo é influenciado por vários fatores, incluindo idade, sexo, hábitos alimentares, doenças,
quimioterapia, consumo de álcool, contaminantes ambientais, etc. Além disso, dependendo do
substrato utilizado como droga-sonda e do método analítico empregado, os fenótipos de
acetilação muitas vezes não são distinguíveis, exibindo sobreposições. Sendo assim, os
métodos de genotipagem passaram a ser mais utilizados, e a técnica mais comum para a
identificação dos alelos de NAT2 é o PCR-RFLP. Além de tratar-se de uma técnica simples, a
utilização de genotipagem por PCR-RFLP para a determinação do perfil de acetilação
apresenta outras vantagens quando comparada aos métodos de fenotipagem: é menos invasiva
(não requer a administração de drogas evitando toxicidade para o indivíduo), é mais barata,
mais rápida e reprodutível em larga escala, e não requer a supervisão do indivíduo, bastando
apenas a coleta de alíquotas de sangue de onde o DNA genômico será extraído.
Outro elemento que pode causar erros de interpretação nesse tipo de estudo é a
distribuição dos diferentes perfis de acetilação na população a ser estudada. Segundo Ohno e
colaboradores (2000), a existência de poucos acetiladores rápidos com uma predominância de
acetiladores intermediários impossibilita a identificação de diferenças na hepatotoxicidade
172
DISCUSSÃO
Raquel Lima de F. Teixeira
entre indivíduos lentos e rápidos. Outras duas hipóteses levantadas por esses autores seria
que: (i) a frequência da administração do fármaco (diariamente ou com intervalos) poderia
influenciar o acúmulo de substâncias tóxicas a partir da metabolização da INH e, (ii) a não
exclusão de pacientes com fatores que os predispõe a hepatotoxicidade, como doenças no
fígado, o consumo de álcool e a coadministração de outras drogas hepatotóxicas (Ohno et al.,
2000).
Outro fato importante que deve ser considerado é a diferença na posologia para a
administração de INH utilizada na terapia da tuberculose nas diferentes populações de estudo.
Por exemplo, no Japão a indicação é de 8mg/Kg/dia (até 400mg/dia) de INH, semelhante à
utilizada na população aqui estudada, por outro lado, em populações eurodescendentes, a
quimioterapia com essa droga consiste na administração de 5mg/Kg/dia (até 300mg/dia).
Nesse caso, se os acetiladores lentos não apresentam um risco maior de desenvolvimento de
lesão hepática na população eurodescendente, os resultados obtidos por Ohno e colaboradores
indicam que a dosagem padrão administrada na população japonesa é alta para pessoas com
um fenótipo de acetilação lenta (Ohno et al., 2000).
Os métodos de genotipagem oferecem hoje uma alternativa simples e segura para a
predição do fenótipo de acetilação de um determinado indivíduo. Entretanto, o grande número
de variantes alélicas de NAT2 dificulta a genotipagem por PCR-RFLP devido à grande
quantidade de reações a serem realizadas para a caracterização completa de todos os alelos em
uma única amostra, além de impossibilitar a identificação de novos polimorfismos. O
sequenciamento direto do produto amplificado contendo a região codificante de NAT2
permitiu uma maior discriminação dos alelos, possibilitando a correta classificação do perfil
de acetilação dos indivíduos arrolados nesse estudo. Além disso, a seleção dos pacientes no
presente estudo foi realizada de forma a excluir ao máximo variáveis que pudessem interferir
em nossos resultados e assim contribuir para um melhor entendimento dos mesmos.
Nenhuma associação foi observada para os demais loci estudados (CYP2E1, GSTM1 e
GSTT1). Apesar das variantes gênicas apresentarem frequências similares àquelas encontradas
por outros autores em nossa população (Sigimura et al., 1995; Suarez-Kurtz et al., 2007), não
verificamos uma relação das mesmas com hepatotoxicidade ou hepatite medicamentosa
induzida por drogas anti-TB (Tabelas 1 e 2 do Capítulo 4). Poucos são os estudos avaliando a
influência desses genes na ocorrência de efeitos colaterais em pacientes com TB, e ainda
assim apresentam resultados contraditórios (Roy et al., 2001; Huang et al., 2003; Cho et al.,
2007; Huang et al., 2007; Leiro et al., 2008). Estudos com um maior tamanho amostral
envolvendo outras populações devem, pois ser realizados, para melhor elucidar o possível
173
DISCUSSÃO
Raquel Lima de F. Teixeira
envolvimento dos polimorfismos nos genes CYP2E1, GSTM1 e GSTT1, na ocorrência de
efeitos adversos induzidos por drogas anti-TB.
A possibilidade de avaliação da influência da variabilidade genética do hospedeiro, em
relação a desfechos comuns em resposta ao tratamento anti-TB com esquemas contendo INH,
é sem dúvida inovadora, e certamente contribuirá com informações importantes para a
reavaliação da conduta terapêutica individualizada e um melhor manejo do tratamento antiTB. Isso permitirá, a nível profilático, a substituição da INH por outra droga, para a prevenção
do desenvolvimento de ADRs, em pacientes cujo perfil de acetilação seja predominantemente
lento, ou ainda a correção da dosagem de INH nos pacientes com um predomínio de alelos
funcionais de NAT2.
174
CONCLUSÕES
Raquel Lima de F. Teixeira
5- CONCLUSÕES
175
CONCLUSÕES
Raquel Lima de F. Teixeira
 A fração da população brasileira, aqui representada por indivíduos residentes no Rio
de Janeiro e em Goiás, apresenta uma grande diversidade de alelos de NAT2, resultado
da miscigenação das populações parentais (europeus, africanos e ameríndios);
 O sete SNPs de NAT2 mais frequentes no mundo foram identificados na população
estudada assim como outros SNPs ainda não descritos na literatura, contribuindo para
a diversidade alélica de NAT2;
 A fração da população brasileira aqui estudada apresentou uma quantidade maior de
alelos de NAT2 com baixa atividade e consequentemente um maior número de
indivíduos com perfil de acetilação lenta em relação aos acetiladores intermediários e
rápidos;
 Os pacientes com tuberculose, sob tratamento anti-TB, que tinham perfil de acetilação
lenta apresentaram picos de transaminases significativamente maiores quando
comparados àqueles indivíduos portadores de genótipos/fenótipos de acetilação rápida
ou intermediária;
 Os pacientes com tuberculose, sob tratamento anti-TB com esquema contendo
isoniazida, portadores de um genótipo/fenótipo de acetilação lenta apresentaram um
risco aumentado em desenvolver hepatotoxicidade ou hepatite medicamentosa em
relação aos acetiladores rápidos/intermediários;
 Nenhuma associação foi observada entre polimorfismos nos genes de CYP2E1,
GSTM1 e GSTT1 com a ocorrência de efeitos adversos induzidos por drogas anti-TB,
na população estudada do Rio de Janeiro.
176
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Raquel Lima de F. Teixeira
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192
ANEXOS
Raquel Lima de F. Teixeira
7- ANEXOS
193
ANEXOS
Raquel Lima de F. Teixeira
ANEXO 1
194
195
ANEXOS
Raquel Lima de F. Teixeira
ANEXO 2
196
ANEXOS
Raquel Lima de F. Teixeira
ESTRATÉGIA DE GENOTIPAGEM DE NAT2 HUMANO
aagggattcatgcagtagaaatactaacaaaagaattactatgacagatacttataacca
ttgtgtttttacgtatttaaaatacgttatacctataattagtcacacgaggaaatcaaa
tgctaaagtatgatatgtttttatgttttgtttttcttgcttaggggatcatggacattg
aagcatattttgaaagaattggctataagaactctaggaacaaattggacttggaaacat
taactgacattcttgagcaccagatccgggctgttccctttgagaaccttaacatgcatt
gtgggcaagccatggagttgggcttagaggctatttttgatcacattgtaagaagaaacc
ggggtgggtggtgtctccaggtcaatcaacttctgtactgggctctgaccacaatcggtt
ttcagaccacaatgttaggagggtatttttacatccctccagttaacaaatacagcactg
gcatggttcaccttctcctgcaggtgaccattgacggcaggaattacattgtcgatgctg
ggtctggaagctcctcccagatgtggcagcctctagaattaatttctgggaaggatcagc
ctcaggtgccttgcattttctgcttgacagaagagagaggaatctggtacctggaccaaa
tcaggagagagcagtatattacaaacaaagaatttcttaattctcatctcctgccaaaga
agaaacaccaaaaaatatacttatttacgcttgaacctcgaacaattgaagattttgagt
ctatgaatacatacctgcagacgtctccaacatcttcatttataaccacatcattttgtt
ccttgcagaccccagaaggggtttactgtttggtgggcttcatcctcacctatagaaaat
tcaattataaagacaatacagatctggtcgagtttaaaactctcactgaggaagaggttg
aagaagtgctgaaaaatatatttaagatttccttggggagaaatctcgtgcccaaacctg
gtgatggatcccttactatttagaataaggaacaaaataaacccttgtgtatgtatcacc
caactcactaattatcaacttatgtgctatcagatatcctctctaccctcacgttatttt
gaagaaaatcctaaacatcaaatactttcatccataaaaatgtcagcatttattaaaaaa
caataactttt
Produto de
PCR NAT2
(1093 pb)
Iniciadores externos usados para amplificação e seqüenciamento
Iniciadores internos usados somente para seqüenciamento
Figura 27: Estratégia de amplificação e sequenciamento de NAT2 (Sequência parcial do gene de
NAT2 retirada da sequência referência AY331807). O esquema mostra a região de anelamento dos
iniciadores utilizados para amplificação e/ou sequenciamento bem como a região de interesse
(negrito) mostrando os códons de iniciação (ATG) e terminação (TAG) em vermelho.
1093 pb
Figura 28: Eletroforese em gel de agarose 1% contendo os produtos de PCR NAT2, obtidos a
partir de diferentes amostras de DNA genômico, após purificação com acetato de amônia 2,5M
(ver Capítulo 1) (1) Marcador de peso molecular de 100 pb; (2 a 19) produtos de PCR NAT2 de
diferentes amostras de DNA genômico.
197
ANEXOS
Raquel Lima de F. Teixeira
Seq. ref. mostrando em
azul as 23 SNPs
encontradas nesse estudo
Sequência consenso
Sequência referência
Sequência de a.a.
Alinhamento das
sequências de diferentes
amostras
(A)
SNP
s
NAT2 IR
NAT2 EF
NAT2 ER
NAT2 IF
(B)
(C)
Figura 29: Ilustração da utilização do software SeqScape v. 2.5. (a) Nessa janela pode ser observado o
alinhamento das amostras bem como a sequência referência, sequência consenso e a sequência de
aminoácidos de NAT2. (b e c) Nessas janelas podem ser observadas as sequências obtidas a partir de cada
iniciador bem como a região de aproveitamento de cada uma delas (azul claro). Nesse indivíduo foram
detectados 3 SNPs, ou seja, três bases se apresentaram distintas da sequência referência (c).
(A)
(B)
Um pico azul
referente a citosina
(CC)
(C)
Dois picos (azul e
vermelho) referentes a
citosina e timina (CT)
Um pico vermelho
referente a timina
(TT)
Figura 30: Identificação de SNP através da visualização do cromatograma dentro do programa SeqScape. A figura mostra três amostras
diferentes e os possíveis genótipos para o SNP T341C. (A) Amostra mutante homozigota, (B) amostra mutante heterozigota e (C) amostra
tipo-selvagem para o SNP T341C.
198
ANEXOS
Raquel Lima de F. Teixeira
ANEXO 3
199
200
ANEXOS
Raquel Lima de F. Teixeira
ANEXO 4
201
ANEXOS
Raquel Lima de F. Teixeira
ESTRATÉGIA DE CLONAGEM PARA RE-SEQUENCIAMENTO DE NAT2 HUMANO
Sítio de clonagem mostrando as enzimas de restrição utilizadas para análise
dos transformantes
Vetor de clonagem
(a)
(b)
Figura 31: (a) Sequência nucleotídica da região de clonagem do vetor pCR-BluntIITOPO indicando os sítios de restrição de Hind III (apenas um sítio no vetor) e Eco RI
(dois sítios que flanqueam o inserto). (b) Esquema do vetor de clonagem indicando a
localização da entrada do inserto dentro da região codificante do gene “suicida” (ccdB).
1 2 3 4
5 6 7
8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23
1 2
4
5 6
7
8
9 10 11 12
4611 pb
4072 pb
3054 pb
1.353 pb
1.078 pb
872 pb
603 pb
3
3501 pb
1636 pb
1018 pb
Figura 32: Gel de agarose 1,5% com PCR NAT2 a partir de
colônia para identificação de bactérias portadoras de
pCRBlunt-II/NAT2. (1) DNA X174 digerido com Hae III (2)
produto de PCR (1093 pb) gerado a partir de uma amostra de
DNA humano (controle positivo) (3 a 22) produtos de PCR
derivados de 20 diferentes transformantes; (23) controle
negativo.
202
1110 pb
Figura 33: Análise de restrição para confirmação da
presença do inserto dos clones pCRBlunt-II/NAT2.
(1 e 12) 1Kb DNA Extension Ladder; (2, 4, 6, 8
e10) digestão dos clones com Hind III; (3, 5, 7, 9 e
11) digestão dos clones com Eco RI.
ANEXOS
Raquel Lima de F. Teixeira
ANEXO 5
203
Parecer Consubstanciado de Projeto de Pesquisa
Título do Projeto: Influência da variabilidade genética humana dos genes NAT2, CYP2E1 e
GST na ocorrência de reações adversas hepáticas induzidas pela isoniazida em pacientes com
tuberculose ativa
Pesquisador Responsável Adalberto Rezende Soares
Data da Versão 24/09/2007
Grupo e Área Temática
Cadastro 421/07
Data do Parecer 12/11/2007
I.1 Genética Humana
Objetivos do Projeto
Avaliar a possivel associação entre variantes alélicas dos genes NAT2, CYP2E1 e GST na
ocorrência de reações adversas hepáticas induzidas pela isoniazida em pacientes com
tuberculose ativa e, HUCFF-UFRJ, RJ, referência para AIDS
- det haplotipos de NAT2, frequência dos alelos c1 e c2 de CYP2E1, e de GSTM1*0 e GSTT1*0,
correlacionar com hepatotoxicidade
Sumário do Projeto
Tratamento atual da TB = isoniazida (INH) (e rifampicina (RIF) e pirazinamida (PZA)). Reações
adversas a nível hepático ocorrem, envolvendo as enzimas N-acetultransferase 2 (NAT 2) e a
monooxigenase (CYP 450 2E1) e, possivelmente, glutationa S transferase (GST). O estudo
pretende avaliar a associação entre variabilidade genética dessas enzimas e hepatoxicidade
da droga.
Itens Metodológicos e Éticos
Título
Autores
Local de Origem na Instituição
Projeto elaborado por patrocinador
Aprovação no país de origem
Local de Realização
Outras instituições envolvidas
Condições para realização
Situação
Adequado
Adequados
Adequado
Não
Não necessita
Outro (citar no comentário)
Sim
Adequadas
Comentários sobre os itens de Identificação
HUCFF-UFRJ + IOC-FIOCRUZ
Introdução
Adequada
Comentários sobre a Introdução
Objetivos
Adequados
Comentários sobre os Objetivos
Pacientes e Métodos
Delineamento
Tamanho de amostra
Cálculo do tamanho da amostra
Participantes pertencentes a grupos especiais
Seleção eqüitativa dos indivíduos participantes
Critérios de inclusão e exclusão
Relação risco- benefício
Uso de placebo
Período de suspensão de uso de drogas (wash out)
Monitoramento da segurança e dados
Avaliação dos dados
Privacidade e confidencialidade
Termo de Consentimento
Adequação às Normas e Diretrizes
Adequado
Total 245 Local RJ
Não necessário (pesquisa qualitativa)
Não
Adequada
Adequados
Adequada
Não utiliza
Nâo utiliza
Comentário
Adequada - qualitativa
Adequada
Comentário
Sim
Página 1-2
204
Comentários sobre os itens de Pacientes e Métodos
Como usa material de pacientes em tratamento, o tratamento será
acompanhado pelo Hospital normalmente
Cronograma
Data de início prevista
Data de término prevista
Orçamento
Fonte de financiamento externa
Adequado
novembro 2007
nov 09
Comentário
Não
Comentários sobre o Cronograma e o Orçamento
POM - IOCe orçamento regular HUCFF-UFRJ
Referências Bibliográficas
Adequadas
Comentários sobre as Referências Bibliográficas
Recomendação
Aprovar
Comentários Gerais sobre o Projeto
Um projeto simples, com objetivos bem escritos, que irá fazer parte de uma rotina
bem estabelecida (HUCFF) e de tecnologias usadas rotineiramente nos laboratórios
da FIOCRUZ, com bastante chance de trazer informações de grande utilidade para o
tratamento de indivíduos infectados com M. tuberculosis no futuro.
Após análise por este colegiado, tendo por referência as normas e diretrizes da
Resolução 196/96, foi decidido pela APROVAÇÃO do referido protocolo.
Solicitamos as seguintes correções:
1) Já que não há previsão para inclusão de menores de idade ou indivíduos que
necessitarão de representante legal, retirar o parênteses "ou responsável legal" do
Termo de Consentimento Livre e Esclarecido;
2) Solicitamos a correção da Folha de Rosto no relativo a Área de conhecimento.
Está corretamente indicado como GENÉTICA, mas ao classificar o Grupo foi
colocado como Grupo 2, quando o correto e Grupo 1.
Informamos, outrossim, que deverão ser apresentados relatórios parciais/anuais e
relatório final do projeto de pesquisa.
Além disso, qualquer modificação ou emenda ao protocolo original deverá ser
submetida para apreciação do CEP/Fiocruz.
Marlene Braz
Coordenadora do Comitê de Ética em Pesquisa
Em Seres Humanos da Fundação Oswaldo Cruz
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ANEXOS
Raquel Lima de F. Teixeira
ANEXO 6
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ANEXOS
Raquel Lima de F. Teixeira
ESTRATÉGIA DE GENOTIPAGEM DE CYP2E1, GESTM1 E GSTT1 HUMANOS
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
500 pb
400 pb
300 pb
413 pb
352 pb
200 pb
100 pb
Figura 34: Gel de agarose 2% com o perfil de digestão (Rsa I) dos três
genótipos de CYP2E1 para o SNP -1053 CT (Ver Capítulo 4). (1 e 13)
Marcador de peso molecular de 100 pb; (2) genótipo mutante homozigoto
(c2/c2); (3 a 8) genótipo tipo-selvagem homozigoto (c1/c1); (9 a 12) genótipo
heterozigoto (c1/c2).
1
2
3
4
5
6
7
8 9 10 11
603 pb
536 pb
271 pb
273 pb
Figura 35: Gel de agarose 2,5% com PCR padrão para detectar a
presença do gene GSTM1 tipo-selvagem (GSTM1*A ou GSTM1*B)
(Ver Capítulo 4). (1) DNA X174 digerido com Hae III; (2, 3, 4, 5,
7, 9, 10) amostras GSTM1*A-B/GSTM1*A-B ou GSTM1*AB/GSTM1*0; (6 e 8) amostras GSTM1*0/GSTM1*0.
1
2
3
4
5
6
7
8
9 10 11 12 13 14 15 16
1353 pb
1460 pb
603 pb
466 pb
Figura 36: Gel de agarose 1,5% com PCR/GSTT1 (Ver Capítulo 4): (1) DNA X174
digerido com Hae III; (2, 3, 4, 15) amostras com genótipo GSTT1*A/GSTT1*A; (5, 6, 7, 11,
12, 13) amostras com genótipo GSTT1*0/ GSTT1*0; (8, 9, 10, 14, 16) amostras com
genótipo GSTT1*A/GSTT1*0.
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