Ferramentas biotecnológicas para o
estudo funcional de genes
Márcia Margis-Pinheiro
Laboratório de Genética Vegetal
Departamento de Genética
Universidade Federal do Rio Grande do Sul
http://www.ufrgs.br/RNAi/NGFP.htm
Ferramentas biotecnológicas para o estudo
funcional de genes
Análises in silico
Análise de promotores
Avaliação da expressão gênica
Superexpressão e silenciamento de genes
Estudo da localização subcelular dos
produtos gênicos
Modificação Genética de Plantas: aplicações
• Melhoramento genético
•Biorreatores
• Estudo funcional de genes
Modificação Genética de Plantas: aplicações
• Melhoramento genético
•Biorreatores
• Estudo funcional de genes
PESQUISA BÁSICA
Porque precisamos estudar a função dos genes?
1) Obstáculo para a manutenção e estabilidade da produção
agrícola: susceptibilidade das plantas aos estresses
ambientais (bióticos e abióticos);
2) Manipulação de características nutricionais: depende do
conhecimento das vias que governam a síntese e o
catabolismo dos metabólitos produzidos pela planta.
Desafio...
Identificar novos genes alvos para desenvolver estratégias
eficientes para manipulação genética de plantas mais
resistentes ao estresses ambientais ou que apresentem
características novas e de interesse biotecnológico.
Determinação de função de genes em plantas
1) Estudos de seqüenciamento e homologia
2) Estudo de expressão:
- Quantificação dos níveis do produto gênico
- Estudos de promotores (*)
3) Estudos de ganho de função
- Superexpressão (*)
- Expressão ectópica (*)
4) Estudos de perda de função (Gene knockout)
- Alelos que ocorrem naturalmente
- Mutações induzidas de deleções
- Produção de mutantes insercionais (*)
- Silenciamento gênico (*)
(*) Estratégias que dependem da produção
de plantas transgênicas
Estudos de seqüenciamento e homologia
Identificação de genes a partir do sequenciamento do
DNA e atribuição de funções.
O papel da Bioinformática:
1- Encontrar o gene;
2- Fazer predição (promotores, seqüência
codificante, etc)
3- Classificar funcionalmente os genes
Exemplo:
Seqüenciamento do genoma da soja:
● ~46,000 genes que codificam proteínas.
● É preciso entender a função de um grande número
de genes.
● Muitas das seqüências gênicas preditas precisam
ser confirmadas experimentalmente
ANOTAÇÃO DE SEQUÊNCIAS GÊNICAS
http://www.phytozome.net/
http://www.phytozome.net/
Plantas transgênicas e o estudo da expressão
gênica
Regulação da expressão gênica:
Regulação transcricional
- Fatores de transcrição
- Elementos-cis
Plantas transgênicas e o estudo da expressão
gênica
● Através do estudo de promotores é possível
identificar a presença de elementos de regulação
em cis essenciais para a expressão do gene.
● Esses estudos poderão revelar promotores de
padrão de expressão específicos, os quais poderão
ser úteis para a expressão controlada de genes de
interesse em plantas transgênicas.
● Estudo de promotores
• Isolamento da região promotora do gene
• ~2 kb antes do códon de iniciação;
• Amplificação do DNA genômico com primers específicos;
• Clonagem no vetor pGEM-Teasy → pHGWFS7,0
pHGWFS7,0
KARIMI et. al., 2005
3'O
CS
Produção de vetores para o estudo do promotores
GUS
Lima et al, 2002
Padrão de expressão do gene P4 em Plantas Transgênicas de Tabaco
Lima et al, 2002
Padrão de expressão do gene P4 em Plantas Transgênicas de Tabaco
cultivadas a 28 ○ C (painéis superiores) e à 42○ C (painéis inferiores)
Lima et al, 2002
Superexpressão
1) Produção de plantas transgênicas expressando
níveis alterados do produto do gene em estudo.
2) Em seguida, o fenótipo dessas plantas pode ser
analisado e correlacionado com os níveis de
expressão do transgene.
A superexpressão do gene é possível graças à
utilização de promoteres fortes, em geral o promotor
35S do vírus do mosaico da couve-flor (CaMV), que
em dicotiledôneas é expresso de maneira
constitutiva.
Silenciamento gênico
Produção de
plantas
transgênicas
expressando RNAi
Silenciamento gênico
mediado por RNA
Waterhouse and Helliwell, 2003
Plantas transgênicas silenciadas – Tecnologia RNAi
Chs_hairpin
Chalcona sintase
Moléculas de dsRNAs
silenciada
Hairpin - hp
Bastam 18 a 26 nt !
Exemplos de Plantas Transgênicas com tecnologia RNAi :
Batata resistente ao PVY ou PLRV
Mamão resistente ao PRSV
Soja menos alergênica – protease 30-kda
Algodão com maior teor de ácido oléico
Nt
ASR silenced plants are
sensitive to drought
Ra01
(2007)
(2007)
(2008)
(2009)
Mortel et
al., 2007
Expressão
diferencial de genes
que codificam para
fatores de
transcrição WRKY
em resposta à
Ferrugem Asiática
Genes
selecionados:
GmWRKY20
GmWRKY
Gm
WRKY27
GmWRKY
Gm
WRKY46
GmWRKY
Gm
WRKY57
METODOLOGIA
Identificação, isolamento e
clonagem dos genes de
interesse
Construção de vetores para
transformação vegetal
(superexpressão e silenciamento
por RNAi)
Caracterização dos níveis de
expressão gênica (qRT(qRT-PCR) sob
diversas condições
Transformação de soja e análises moleculares, bioquímicas
e fenotípicas das plantas obtidas.
Infecção pelo patógeno causador da Ferrugem Asiática
• Coleta de amostras: Embrapa Soja (Londrina /PR), abril/2009
– Cultivar Embrapa–48 (Susceptível) x PI 561356
(Resistente)
– Folhas controle x folhas inoculadas
– Triplicatas biológicas
– Variação temporal (horas após a inoculação):
1h
12h
24h
48h
96h
192h
Superexpressão
Silenciamento
Construção dos cassetes gênicos
Construção dos cassetes gênicos
Confirmação da integração do transgene
Técnica: PCR
WRKY 57 - Superexpressão
Embriões
L
600 bp
+
+
1
2
3
4
5
Plantas
6
7
1
2
3 WT
Confirmação da integração do transgene
Técnica: PCR
WRKY 27 – Silenciamento
Plantas
L
270 bp
+
1
2
WT
Confirmação da integração do transgene
Técnica: expressão de GFP
Expressão GFP observada um mês após a transformação em embriões resistentes à
higromicina (B,C);
(B,C); e em raízes (D) e tricomas foliares (F) de plantas aclimatadas.
aclimatadas. Tecidos
selvagens (WT) são mostrados em A, D e E. Aumento:
Aumento: 40
40x
x. Microscópio de fluorescência
Olympus® (filtro BP, excitação – 488nm
488nm / emissão – 505505-530 nm).
nm).
Plantas obtidas
Tabela 1. Número de linhagens
transgênicas estabelecidas
Gene
Cultivar
Bombardeamento
Superex.
WRKY 20
WRKY 27
WRKY 57
Silenciam.
IAS-5
Superex.
5
Bragg
4
BRSMG 68
Vencedora
2
IAS-5
Bombardeam./
Agrobacterium
1
1
Confirmação do silenciamento do gene
WRKY 27
Técnica: RT-qPCR
Fig.1 Níveis de
expressão (RTqPCR) do gene
GmWRKY27 em
plantas não
transformadas e
plantas da linhagem
GmWRKY27-RNAi
(Teste t de Student,
p<0.05).
WT
WRKY 27 RNAi
Bioensaio: Desenvolvimento de P. pachyrhizi em
folhas destacadas 12 dias após a inoculação.
Lesões
WT
Pústulas
WRKY 27 RNAi
Fig.2 A) Número de lesões e pústulas em plantas não transformadas e plantas da
linhagem GmWRKY27-RNAi (Teste t de Student, p<0.05). (B) Lesões Tan e pústulas
em folha de planta não transformada. (C) Lesões Tan e pústulas em folha de planta da
linhagem GmWRKY27-RNAi.
Localização subcelular do produto gênico
Fusão traducional do gene em estudo com o gene da
proteína GFP.
RB p35S
Fusão
T35S
NptII
Transformação genética de células ou plantas.
Análise no microscópio confocal.
LB
Exemplo:Localização subcelular da proteína codificada pelo gene OsAPx1
Localização subcelular da proteína codificada pelo gene OsAPx6
OsAPx6:GFP
RB p35S
OsAPx6
GFP
T35S
NptII
LB
Localização subcelular das proteínas OsAPX em
protoplastos de plantas de arroz
RB
pUbi
GFP
Transgenic calli
ASR5 lies in nucleus,
cytosol and
chloroplasts
Protoplasts
ASR5
T35S
Hpt
LB
CONCLUSÃO
A manipulação genética de plantas oferece inúmeras
possibilidades de estratégias para o estudo da
função e da regulação da expressão gênica.