Biofísica
Métodos Experimentais em Biofísica
- Espectrometria de Massas
- Cristalografia de Proteínas
1
© 2015 Dr. Walter F. de Azevedo Jr.
Prof. Dr. Walter F. de Azevedo Jr.
Espectrometria de Massas (Fundamentos)
Se um objeto está movimentando-se numa
dada trajetória, e submetemos esse objeto
a uma força lateral (F), teremos uma
mudança na sua trajetória. Consideremos
o lançamento de uma bola de basquete,
imagine que estamos com uma mangueira
d’água, e direcionamos um jato d’água
para a bola. Sua trajetória será alterada,
devido à força transversal F exercida sobre
a bola. Consideremos uma outra situação,
uma bola de tênis, com a mesma
velocidade (v) da bola de basquete. Se
dirigirmos o mesmo jato d’água para a bola
de tênis, teremos um desvio da trajetória
maior ainda. Estamos considerando que
ambas as bolas estão com a mesma
velocidade (v) e o jato d’água exerce a
mesma força F.
R
v
F
2
Espectrometria de Massas (Fundamentos)
O que podemos tirar qualitativamente
desse experimento? O desvio da
trajetória pode ser expresso pelo raio da
curva (R) que a bola descreve ao ser
submetida a uma força transversal (F).
Assim, um desvio grande equivale a
dizer que a bola descreve uma curva
com raio menor.
Olhando-se a física do sistema, temos
uma bola submetida a uma aceleração
centrípeta, que a coloca em uma
trajetória circular, pelo menos enquanto
submetida à força exercida pela água da
mangueira.
Rbola de basquete
v
F
Rbola de tênis
v
F
4
Espectrometria de Massas (Fundamentos)
A força é que leva à aceleração
centrípeta, causando a trajetória circular
de raio (R). A força centrípeta (F) é dada
pela equação abaixo:
Rbola de basquete
mv 2
F
R
v
F
onde R é o raio da circunferência, m a
massa da bola e v a velocidade da bola.
Isolando-se o raio da circunferência (R)
da equação acima temos:
mv 2
R
F
A partir da equação do raio, vemos que
para uma força e velocidade constantes,
temos que o raio da circunferência (R) é
proporcional à massa da bola (m).
Rbola de tênis
v
F
5
Espectrometria de Massas (Fundamentos)
Olhando a equação do raio da trajetória,
vemos que o termo entre parênteses é
constante, o que varia é a massa da bola
e, consequentemente, o raio da
circunferência.
v
R  m
F
2
Rbola de basquete
v
F



A equação acima é uma forma de
determinarmos a massa (m) de uma
partícula a partir do raio (R) da
circunferência descrita pela partícula
quando submetida a uma força
conhecida, como a exercida por um jato
d’água.
Rbola de tênis
v
F
5
Espectrometria de Massas (Fundamentos)
Isolando-se a massa (m) da equação
anterior temos:
Rbola de basquete
v
RF
m 2
v
Resumindo, num experimento onde
lançamos um partícula com velocidade
(v) constante, sabemos a velocidade (V)
e a força (F), podemos determinar a
massa (m).
Este é o princípio para entendermos o
funcionamento de espectrômetro de
massas.
F
Rbola de tênis
v
F
6
Espectrometria de Massas (Fundamentos)
Quando temos uma partícula com carga
q, se deslocando com velocidade v em
uma região, onde temos um campo
elétrico E e um campo magnético B, essa
partícula fica sujeita a uma força devido
aos campos elétrico e magnético, essa
força (F) é chamada força de Lorentz e
tem a seguinte expressão:
R
v
F  Eq  qvB
Estamos considerando que o campo
magnético (B) é perpendicular à
velocidade da partícula, como no
desenho ao lado.
F
B
x
Campo magnético perpendicular
ao plano do slide, x indica essa situação
7
Espectrometria de Massas (Fundamentos)
Considerando-se somente o campo magnético B, a partícula será sujeita a uma força
(F), dada pela seguinte equação:
F  qvB
Essa força de aceleração centrípeta submete a partícula a uma aceleração radial (a),
fazendo com que uma partícula de massa m e velocidade v descreva uma trajetória
circular com raio R, essa força centrípeta tem a seguinte expressão:
2
mv
F
R
Igualando-se as duas equações acima, chegamos a seguinte expressão para a massa
(m) de uma partícula, com raio da trajetória (R) num campo magnético constante (B):
2
mv
qBR
F
 qvB  m 
R
v
8
Espectrometria de Massas (Fundamentos)
Considerando que temos um campo magnético (B) constante entre os polos norte e
sul de um ímã, temos uma força (F) atuando sobre uma partícula com carga positiva e
velocidade v, como indicada na figura abaixo.
v
B
F
Partícula com carga positiva deslocando-se num campo magnético constante gerado por um ímã.
Figura disponível em: <http://www.school-for-champions.com/science/magnetism_lorentz.htm#.VFzoQpV0zIU
>
Acesso em: 19 de outubro de 2015.
9
Espectrometria de Massas (Fundamentos)
Muito bem, as observações
anteriores servem de base para
o entendimento de umas das
técnicas mais usadas na análise
de moléculas biológicas no
século XXI, a espectrometria de
massas. Esta técnica permite
que as massas moleculares de
amostras
de
proteínas,
peptídeos e outras moléculas
biológicas sejam determinadas
com precisão, a partir do desvio
que apresentam ao deslocaremse num campo magnético
gerado por um eletromagneto.
Ao lado temos o diagrama
esquemático
de
um
espectrômetro de massas típico.
Descreveremos
cada
componente do equipamento
nos próximos slides.
Ionização
Aceleração
eletromagneto
Para
bomba de
vácuo
amostra
vaporizada
Deflexão
Detecção
amplificador
gravador de
dados
Diagrama esquemático de um espectrômetro de massas.
Imagem disponível em:
< http://www.chemguide.co.uk/analysis/masspec/howitworks.html >.
Acesso em: 19 de outubro de 2015.
10
Espectrometria de Massas (Ionização)
A amostra (átomos ou moléculas) é vaporizada. Essa amostra vaporizada é injetada e
submetida ao processo de ionização, que ocorre na câmara de ionização, mostrada
abaixo. Nessa câmara temos um feixe de elétrons gerados a partir de um filamento
de metal aquecido. Os elétrons são atraídos para uma placa metálica positiva,
chamada armadilha de elétrons (electron trap). A amostra vaporizada, ao passar pelo
feixe de elétrons, é ionizada, gerando íons positivos, ou seja, temos agora uma
amostra formada em parte por partículas com carga +1. A grande maioria dos íons
gerados tem carga +1, mas podemos ter íons com carga maior. Esses íons são
forçados para direita pelo repelente de íons (ion repeller). A câmara de ionização é
mantida num potencial elétrico de +10.000 Volts, que promove a ejeção de cargas
positivas.
Armadilha de elétrons
Repelente de
íons
Amostra vaporizada
Diagrama esquemático da câmara de ionização de um espectrômetro de massas.
Imagem disponível em: < http://www.chemguide.co.uk/analysis/masspec/howitworks.html >.
Acesso em: 19 de outubro de 2015.
Elétrons
Íons positivos
Filamento de metal aquecido
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Espectrometria de Massas (Aceleração)
O feixe com as partículas da amostra sai da câmara de ionização e atravessa três
fendas, como indicado na figura abaixo. As fendas aceleradoras de feixes são
chamadas de lentes eletrostáticas, pois realizam o “foco” do feixe de íon. Essas
fendas têm como função gerar um feixe de partículas estreito e permitir a aceleração
das partículas carregadas da amostra vaporizada. As fendas apresentam potencial
elétrico decrescente, da esquerda para direita, sendo que a fenda final apresenta um
potencial elétrico de 0 volts. Tal arranjo de fendas possibilita a aceleração do feixe de
partículas carregadas.
Placa final a 0 Volts
Placa intermediária
Câmara de ionização a
+ 10.000 Volts
Feixe de íons
Diagrama esquemático das fendas aceleradoras de feixe de um espectrômetro de massas.
Imagem disponível em: < http://www.chemguide.co.uk/analysis/masspec/howitworks.html >.
Acesso em: 19 de outubro de 2015.
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Espectrometria de Massas (Deflexão)
Ao chegar ao eletromagneto, o feixe é submetido a uma deflexão que é inversamente
proporcional à massa da partícula, ou seja, partículas mais leves sofrem maiores
desvios. Outra parâmetro que afeta o desvio é a carga, íons mais positivos são mais
defletidos, assim se tivermos, para uma mesma massa, um íon com carga +2, esse
sofrerá um desvio maior que uma partícula com mesma massa mas carga +1. Como o
desvio do feixe de partículas depende da massa e da carga, é padrão combinarmos
essas informações na razão m/z (massa/carga). Por exemplo, se um íon tem uma
massa atômica de 12 e uma carga de +1, sua razão m/z é 12. Veja que o “z” é
minúsculo, não confundir com “Z” maiúsculo, usado para representar o número
atômico.
Eletromagneto
Feixe de íons
misturados
Feixe de íons C
Feixe de íons A
Diagrama esquemático do eletromagneto de um espectrômetro de massas.
Imagem disponível em: < http://www.chemguide.co.uk/analysis/masspec/howitworks.html >.
Acesso em: 19 de outubro de 2015.
Feixe de íons B
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Espectrometria de Massas (Deflexão)
No diagrama esquemático abaixo temos a indicação de três feixes de íons. Se
considerarmos que todos os feixes são de partículas com carga +1, temos que o feixe
A tem as partículas mais leves, seguido do feixe B, sendo o mais massivo o feixe C.
Eletromagneto
Feixe de íons
misturados
Feixe de íons C
Feixe de íons A
Diagrama esquemático do eletromagneto de um espectrômetro de massas.
Imagem disponível em: < http://www.chemguide.co.uk/analysis/masspec/howitworks.html >.
Acesso em: 19 de outubro de 2015.
Feixe de íons B
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Espectrometria de Massas (Detecção)
No diagrama visto no slide anterior, temos que só o feixe B chega ao detector de
íons, os outros feixes colidem com as paredes do espectrômetro de massas e são
removidos pela bomba de vácuo. Um íon do feixe B, ao chegar no detector de íons,
colide com a placa metálica do detector, essa placa está ligada a um fio. O íon, que
colidiu com a placa, captura um elétron da placa, tornando-se neutro (carga elétrica
zero). A captura do elétron do metal, deixa uma lacuna de elétron na placa metálica,
que é preenchida por um elétron do fio ligado à placa metálica. Essa corrente é
detectada e amplificada. Quanto mais íons colidirem com a placa metálica do detector
de íons, mais elétrons serão capturados e maior será a corrente gerada. Assim, a
corrente gerada é proporcional ao número de íons que atinge o detector.
Feixe de íons B
Íon positivo
elétrons
Caixa de metal
Para o amplificador
Diagrama esquemático do detector de íons de um espectrômetro de massas.
Imagem disponível em: < http://www.chemguide.co.uk/analysis/masspec/howitworks.html >.
Acesso em: 19 de outubro de 2015.
15
Espectrometria de Massas (Detecção)
Os íons do feixe A podem ser detectados diminuindo-se a intensidade do campo
magnético. Já os íons do feixe C, necessitam um aumento na intensidade do campo
magnético, para que possam atingir o detector de íons.
Feixe de íons B
Íon positivo
elétrons
Caixa de metal
Para o amplificador
Diagrama esquemático do detector de íons de um espectrômetro de massas.
Imagem disponível em: < http://www.chemguide.co.uk/analysis/masspec/howitworks.html >.
Acesso em: 19 de outubro de 2015.
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Espectrometria de Massas (Detecção)
A análise realizada pelo espectrômetro de massas gera um espectro de massas, que é
mostrado num gráfico onde temos no eixo vertical a abundância relativa do íon e no
eixo x a razão m/z. A abundância relativa é diretamente proporcional à intensidade
corrente medida, assim o que temos também é uma representação da intensidade
relativa das correntes medidas. Esse gráfico é chamado de espectro de massas da
amostra. No caso abaixo temos uma amostra do elemento químico molibdênio. Pelo
espectro vemos que o isótopo mais abundante do molibdênio é o de razão m/z igual a
98.
abundância
relativa
Espectro de massas do molibdênio.
Imagem disponível em: < http://www.chemguide.co.uk/analysis/masspec/howitworks.html >.
Acesso em: 19 de outubro de 2015.
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Espectrometria de Massas (MALDI)
Há diversos refinamentos da técnica de espectrometria de massas, especificamente
com foco em cada uma das etapas do processo. Por exemplo, no método MALDI
(matrix-assisted laser desorption ionization), temos uma mistura da amostra a ser
analisada com uma substância de baixa massa molecular, se comparada com uma
proteína. Essa substância absorbe radiação ultravioleta, pois a maioria do
espectrômetros de massa, que usam o método MALDI, apresentam um laser na faixa
UV. A mistura amostra+substância é dissolvida em solvente orgânico e levada a uma
câmara de vácuo, que leva à solidificação da mistura amostra+substância.
Raio
laser
Íon da
amostra
Para o analisador
de massa
Método de ionização da amostra MALDI. A amostra a ser
analisada é misturada a uma substância que absorve radiação
ultravioleta, por exemplo a substância 2,5-dihidroxi ácido
benzoico. Essa mistura é dissolvida em solvente orgânico, por
exemplo acetonitrilia, e injetado numa câmara de vácuo para
cristalizar, o que forma a matriz. Imagem disponível em: <
http://www.magnet.fsu.edu/education/tutorials/tools/ionization_
maldi.html >.
Acesso em: 19 de outubro de 2015.
Matriz
ionizada
Mistura amostra/matriz
18
Espectrometria de Massas (MALDI)
A remoção do ar na câmara de vácuo leva à evaporação do solvente orgânico e à
cristalização da mistura amostra + substância, formando o que chamamos de matriz.
Essa matriz é pulverizada a partir de um feixe de laser de alta intensidade, como
ilustrado abaixo. A substância absorve UV ionizando-se e transferindo parte da energia
absorvida para a proteína (amostra). A amostra é levada à ionização no processo.
Todos os detalhes do processo de ionização da amostra não são totalmente
entendidos, mas o resultado líquido é que a amostra é levada à ionização.
Raio
laser
Íon da
amostra
Para o analisador
de massa
Método de ionização da amostra MALDI. A amostra a ser
analisada é misturada a uma substância que absorve radiação
ultravioleta, por exemplo a substância 2,5-dihidroxi ácido
benzoico. Essa mistura é dissolvida em solvente orgânico, por
exemplo acetonitrilia, e injetado numa câmara de vácuo para
cristalizar, o que forma a matriz. Imagem disponível em: <
http://www.magnet.fsu.edu/education/tutorials/tools/ionization_
maldi.html >.
Acesso em: 19 de outubro de 2015.
Matriz
ionizada
Mistura amostra/matriz
19
Espectrometria de Massas (MALDI)
O diagrama abaixo ilustra os principais passos do método
de MALDI aplicado na análise de um peptídeo (amostra).
O peptídeo ionizado permite a análise da massa dos seus
fragmentos.
Espectro de massas do peptídeo
Diagrama da técnica MALDI. Figura modificada da original disponível em:
http://mutage.oxfordjournals.org/content/15/5/415.full.pdf+html .
Acesso em: 19 de outubro de 2015. Bakhtiar R., Tse FLS. Mutagenesis (2000) 15 (5): 415-430.
20
Espectrometria de Massas (TOF)
A sigla TOF representa em inglês time of flight, ou seja, tempo de voo. É um método
de espectrometria de massas que não usa o desvio num campo magnético (B) para
determina a razão m/z de uma amostra, e sim seu tempo de voo (time of flight). O
diagrama abaixo ilustra o princípio. A amostra ionizada é submetida a uma diferença
de potencial (V0) que acelera as partículas de massa m, essas partículas entram numa
região sem campo elétrico e magnético, chamada de espaço de deriva (drift space). A
diferença de potencial (V0) faz com que as partículas com carga q tenham energia
potencial U = qV0, que é convertida em energia cinética (K), como indicado abaixo.
1 2
K  mv
2
U  qV0
Considerando-se que toda energia
potencial U é convertida em energia
cinética K, temos:
1 2
m 2V
mv  qV0   20
2
q
v
21
Espectrometria de Massas (TOF)
Pela equação abaixo vemos que a razão m/z, onde z é a carga q, depende somente
da velocidade da partícula (v) na região de dereviva (drift space) e do potencial (V0).
Considerando-se que a espaço percorrido no voo tem um comprimento x, o tempo de
voo (t) da partícula será dado por:
t
x
v
1/ 2
onde
 2qV0 
v

 m 
1/ 2
 m 

 t  x
 2qV0 
Assim, quanto maior a razão m/q da
partícula, maior o tempo de voo (t).
O uso concomitante dos métodos MALDI
e TOF leva a um espectrômetro de
massas MALDI-TOF, muito usado para o
estudo de amostras biológicas como
proteínas, peptídeos e ácido nucleicos.
22
Espectrometria de Massas (Espectro de Massas)
Na análise dos espectros de
massas
de
peptídeos,
terminamos com os valores
das massas dos resíduos de
aminoácidos, assim, para
identificar
sobre
qual
aminoácido o pico no espectro
de massa se refere, temos
que fazer uso de uma tabela
de massas moleculares dos
resíduos de aminoácidos,
como a indicada ao lado.
Lembrem-se que para o Cterminal, temos que somar o
peso atômico do oxigênio e do
hidrogênio.
Amino Acid
Short
Abbrev.
Formula
Mon. Mass§
(Da)
Avg. Mass (Da)
Alanine
A
Ala
C3H5NO
71.03711
71.0788
Cysteine
C
Cys
C3H5NOS
103.00919
103.1388
Aspartic acid
D
Asp
C4H5NO3
115.02694
115.0886
Glutamic acid
E
Glu
C5H7NO3
129.04259
129.1155
Phenylalanine
F
Phe
C9H9NO
147.06841
147.1766
Glycine
G
Gly
C2H3NO
57.02146
57.0519
Histidine
H
His
C6H7N3O
137.05891
137.1411
Isoleucine
I
Ile
C6H11NO
113.08406
113.1594
Lysine
K
Lys
C6H12N2O
128.09496
128.1741
Leucine
L
Leu
C6H11NO
113.08406
113.1594
Methionine
M
Met
C5H9NOS
131.04049
131.1986
Asparagine
N
Asn
C4H6N2O2
114.04293
114.1039
Pyrrolysine
O
Pyl
C12H21N3O3
255.15829
255.3172
Proline
P
Pro
C5H7NO
97.05276
97.1167
Glutamine
Q
Gln
C5H8N2O2
128.05858
128.1307
Arginine
R
Arg
C6H12N4O
156.10111
156.1875
Serine
S
Ser
C3H5NO2
87.03203
87.0782
Threonine
T
Thr
C4H7NO2
101.04768
101.1051
Selenocysteine U
Sec
C3H5NOSe
150.95364
150.0388
Valine
V
Val
C5H9NO
99.06841
99.1326
Tryptophan
W
Trp
C11H10N2O
186.07931
186.2132
Tyrosine
Y
Tyr
C9H9NO2
163.06333
163.1760
Fonte da tabela em: <
http://en.wikipedia.org/wiki/Proteinogenic_amino_acid >.
Acesso em: 19 de outubro de 2015.
23
Espectrometria de Massas (Espectro de Massas)
Na biologia, o espectrômetro de massas MALDI-TOF pode ser usado para o
sequenciamento de peptídeos, ou seja, para a determinação da sua sequência de
resíduos de aminoácidos, baseado na massa precisa de cada fragmento identificado
no espectro de massas, como indicado na figura abaixo. Na figura abaixo, cada pico
representa a massa molecular precisa de um fragmento do peptídeo analisado.
Vejamos o processo de determinação da sequência em detalhes.
GVLVVAASGNSGASSISYPAR
Espectro de massas de um peptídeo com 21 resíduos de aminoácidos. Imagem disponível em: <
http://www.pnas.org/content/96/13/7131/F3.large.jpg>.Acesso em: 19 de outubro de 2015. Keough T et al. PNAS 1999;96:7131-7136
24
Espectrometria de Massas (Espectro de Massas)
A análise do espectro de massas visa determinar a estrutura primária do peptídeo
analisado. O primeiro pico da esquerda para direita representa o C-terminal do
peptídeo. O eixo x indica a razão m/z, como estamos considerando que todos os íons
têm carga +1, a massa do primeiro pico equivale a uma massa de 175 Da, próxima à
massa da arginina presente num C-terminal. Assim, o C-terminal (final do peptídeo) é
uma arginina. Para identificar os próximos aminoácidos, seguimos com os picos. No
espectro a diferença entre cada pico consecutivo indica a massa do aminoácido.
Abaixo, a seta vermelha indica que para o próximo pico temos uma diferença de 71,2
Da, ou seja, uma alanina.
GVLVVAASGNSGASSISYPAR
Espectro de massas de um peptídeo com 21 resíduos de aminoácidos. Imagem disponível em: <
http://www.pnas.org/content/96/13/7131/F3.large.jpg>.Acesso em: 19 de outubro de 2015. Keough T et al. PNAS 1999;96:7131-7136
25
Espectrometria de Massas (Espectro de Massas)
O segundo pico indica uma diferença de massas de 97,0 Da, uma prolina. Seguindose o processo identificamos todos os picos e temos a sequência de aminoácidos do
peptídeo. Na aplicação do espectrômetro de massas para o sequenciamento de
proteínas, temos que a amostra da proteína é submetida à clivagem a partir da ação
de proteases, como tripsina. Os fragmentos da proteólise são purificados a partir da
técnica de cromatografia líquida e injetados no espectrômetro de massas para
sequenciamento. Os trechos dos peptídeos sequenciados são sobrepostos e a
sequência completa da proteína é determinada.
GVLVVAASGNSGASSISYPAR
Espectro de massas de um peptídeo com 21 resíduos de aminoácidos. Imagem disponível em: <
http://www.pnas.org/content/96/13/7131/F3.large.jpg>.Acesso em: 19 de outubro de 2015. Keough T et al. PNAS 1999;96:7131-7136
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Cristalografia de Proteínas
3. Interpretação do padrão de
difração de raios X. A figura
abaixo é o registro da difração de
raios X de um cristal. Os raios X
interagem com o cristal, o que
produz um padrão de difração. A
análise
desta
informação
possibilita a resolução de estrutura
3D.
Etapas para resolução da
estrutura
3D
de
macromoléculas biológicas
por cristalografia
2. Coleta de dados de difração de raios X no LNLS.
Os cristais apresentam um arranjo ordenado de
moléculas, como uma pilha de tijolos ordenados. Na
analogia, cada tijolo representa uma molécula. As
distâncias entre os átomos são da ordem de 1 Å (0,1 nm
ou 10-10 m), usando-se raios X (com comprimento de
onda da ordem de Å ) teremos difração.
1. Cristalização. Nesta
etapa a macromolécula é
trazida a um estado de
supersaturação
que
favorece a formação de
cristais,
como
os
mostrados acima. Os
cristais de moléculas
biológicas normalmente
apresentam dimensões
inferiores a 1 mm de
comprimento em cada
aresta.
5. Análise. A partir da estrutura
resolvida procedemos à análise,
onde relaciona-se a estrutura 3D à
sua função biológica.
4. Resolução da estrutura.
A partir da análise do
padrão de difração é
possível gerar mapas de
densidade eletrônica (à
direita). A interpretação de
tais mapas gera a estrutura
3D de molécula.
27
Cristais de Pequenas Moléculas
Geodo de ametistas (MCT-PUCRS)
© 2009 Dr. Walter F. de Azevedo Jr.
© 2009 Dr. Walter F. de Azevedo Jr.
Normalmente os cristais inorgânicos e de pequenas moléculas de uma forma geral
são rígidos, transparentes e com arestas bem definidas, como os cristais de ametista
e quartzo mostrados abaixo. A rigidez estrutural é reflexo das fortes interações que
estabilizam o arranjo cristalino, tais como interações iônicas e ligações covalentes.
Cristal de Quartzo (MCT-PUCRS)
28
Cristais de Pequenas Moléculas
© 2011 Dr. Walter F. de Azevedo Jr.
© 2013 Dr. Walter F. de Azevedo Jr.
Abaixo temos exemplos de cristais inorgânicos, como os cristais de rubi, não
lapidados e lapidados (foto da esquerda) e os cristais de quartzo (foto da direita). Os
cristais são da coleção do Natural History Museum, London-UK (2011, 2013).
29
Cristais de Macromoléculas Biológicas
As cristalizarmos proteínas, peptídeos e ácidos nucleicos esses apresentam-se como
cristais relativamente frágeis, transparentes (na maioria) e com arestas bem definidas.
Abaixo temos 3 cristais proteínas e peptídeos: enoil-redutase de Mycobacterium
tuberculosis (Oliveira et al. 2006), mastoparano isolado de vespa Anterhynchium
flavomarginatum micado (Delatorre et al., 2001) e uropesina (Canduri et al., 2001).
Oliveira JS, Pereira JH, Canduri F, Rodrigues NC, de Souza ON, de Azevedo Jr. WF, Basso LA, Santos DS. J. Mol. Biol.
359(3):646-666, 2006.
Delatorre, P, Olivieri, JR, Ruggiero Neto, J, Lorenzi, CC, Canduri, F, Fadel, V, Konno, K, Palma, MS, Yamane, T, De Azevedo Jr.,
W F. Biochim. Biophys. Acta. 1545(1-2):372-376, 2001.
Canduri, F, Teodoro, LG, Fadel, V, Lorenzi, CC, Hial, V, Gomes, RA, Neto, JR, De Azevedo Jr., WF. Acta Crystallogr. Sect. D30
Biol. Crystallogr. 57(11):1560-70, 2001.
Cristais de Macromoléculas Biológicas
Cristais de proteína apresentam:
1) Fragilidade mecânica, devido às
ligações que estabilizam o cristal. Nos
cristais de pequenas moléculas as
ligações
que
estabilizam
o
empacotamento cristalino normalmente
são iônicas e covalentes, nos cristais de
macromoléculas biológicas as ligações
são normalmente ligações de hidrogênio.
2) Alto conteúdo de solvente. Os
cristais de macromoléculas biológicas
apresentam alto conteúdo de solvente, se
comparados com cristais de pequenas
moléculas, tal conteúdo de solvente
permite que ligantes possam difundir-se
pelo retículo cristalino, permitindo o
estudo de complexos entre proteínas e
ligantes.
Cristal da proteína lisozima, com dimensões aproximadas de
1 mm x 1mm x 1mm. A proteína cristalizada apresenta-se
como tijolos empilhados de forma ordenada. Podemos
pensar que cada molécula de proteína é um tijolo. A
fragilidade mecânica do arranjo deve-se às fracas interações
intermoleculares, que estabilizam o cristal de proteína. Tais
interações são normalmente ligações de hidrogênio.
31
Cristais de Macromoléculas Biológicas
Canais de solvente
Cristais de proteína normalmente apresentam:
3) Fragilidade a danos causados por
radiação. A exposição de cristais de
proteínas às radiações ionizantes, como
raios X, leva à quebra de ligações e a
geração de radicais livres no retículo
cristalino, que podem quebrar as frágeis
ligações de hidrogênio que estabilizam o
cristal. No empacotamento das moléculas
cristalizadas temos grandes canais de
solventes, como mostrado ao lado. As
moléculas de água, quando expostas à
radiação ionizante, podem formar radicais
livres, que quebram as ligações de
hidrogênio envolvidas na manutenção do
arranjo cristalino.
Canais de solvente
32
Rede Cristalina
Para estudos de cristalografia, faz-se necessário uma definição de cristal. Para facilitar
a visualização, consideremos um cristal bidimensional. Num plano temos um conjunto
de pontos (construção matemática), igualmente espaçados, cada ponto apresenta
igual vizinhança, de forma que, um observador sobre um ponto qualquer olhando para
uma dada direção, não conseguirá diferir ao deslocar-se para outro ponto da rede.
Resumindo, os pontos são indistinguíveis, quando consideramos sua vizinhança.
Esses pontos formam uma rede. Acoplando-se a cada ponto da rede, uma base de
átomos (entidade física), sendo a mesma base de átomos para todos os pontos da
rede, teremos uma rede cristalina, ou cristal bidimensional.
+
Rede
+ base de átomos
=
Rede= construção matemática
Base de átomos= entidade física
=
cristal bidimensional
33
Retículo Cristalino
No caso tridimensional, temos que cada ponto do espaço tem que satisfazer a
condição de igual vizinhança em três dimensões. Os pontos têm que apresentar igual
espaçamento, formando assim um retículo (construção matemática). Acoplando-se a
cada ponto do retículo uma base de átomos (entidade física), temos um retículo
cristalino, o cristal tridimensional. A base de átomos pode ser tão simples como
átomos isolados ou tão complexas como um capsídeo de um vírus.
Retículo= construção matemática
Base de átomos= entidade física
Retículo + base de átomos = Retículo cristalino
34
Retículo Cristalino
Na figura ao lado, cada molécula está
representada só com os carbonos alfa,
com uma linha ligando os átomos. Tal
representação simplifica a figura e dá
idéia dos elementos de estrutura
secundária presentes na proteína. A visão
estereográfica permite ver a profundidade
de figura. A figura da direita é a visão do
olho direito e a da esquerda do olho
esquerdo. Olhando para ambas figuras,
de forma relaxada, é possível ter noção
de tridimensionalidade da figura. Deixe
seu nariz no centro da figura e relaxe os
olhos, para visualizar em 3D. A caixa que
envolve as 4 moléculas é a cela unitária.
Canduri, F, Teodoro, LG, Fadel, V, Lorenzi, CC, Hial, V, Gomes, RA, Neto, JR, De Azevedo Jr., WF. Acta Crystallogr. Sect. D35
Biol. Crystallogr. 57(11):1560-70, 2001.
Cela Unitária
Podemos pensar o cristal como uma pilha de tijolos ordenados. Cada tijolo encaixado
noutro. Desta forma temos uma pilha bem formada e com extremidades retas. O tijolo
básico que forma esta pilha é a cela unitária. Num cristal ela contém uma ou mais
moléculas. A cela unitária é a menor unidade que apresenta a simetria do cristal. A
partir da translação ao longo dos eixos do retículo teremos o cristal. Os eixos da cela
unitária recebem o nome de a, b e c, o ângulo entre os eixos a e b é chamado , entre
os eixos b e c é  e por último entre a e c o ângulo .
c


α ângulo entre b e c
β ângulo entre a e c
γ ângulo entre a e b
b

a
36
Cristalização de Macromoléculas Biológicas
Para cristalizarmos uma macromolécula
biológica é necessário trazê-la a um
estado de supersaturação. Consideremos
uma proteína dissolvida em um tampão.
Para que a proteína seja levada a formar
cristais, é necessário que as moléculas da
proteína dissolvidas na solução, sejam
trazidas a uma situação onde as
moléculas estejam próximas umas das
outras. Para levar a proteína a tal
situação,
podemos
aumentar
sua
concentração (eixo vertical), ou aumentar
a concentração do sal presente na
solução da proteína. O diagrama ao lado
ilustra
as
diferentes
regiões
de
solubilidade da proteína.
37
Cristalização de Macromoléculas Biológicas
O processo de cristalização da proteína
normalmente deve ser lento (muitas horas
ou dias), ou seja, considerando-se a
proteína inicialmente numa região abaixo
da curva de solubilidade, devemos
aumentar a concentração salina, ou da
proteína, de modo a trazê-la na região de
supersaturação, de forma lenta. Na região
de supersaturação teremos as moléculas
da proteína próximas umas das outras, o
que, em casos favoráveis, promoverá o
aparecimento dos primeiros núcleos
cristalinos. Esses microcristais servirão de
base para o crescimento de cristais
maiores, adequados para experimentos
de difração de raios X.
38
Cristalização de Macromoléculas Biológicas
Para
cristalizarmos
proteínas,
normalmente usamos o método de
difusão de vapor. Uma gota de proteína é
colocada sobre uma lamínula. Na gota
adicionamos uma solução contendo sal,
ou outro agente precipitante, como
polietileno glicol (PEG). Colocamos essa
lamínula sobre um poço, onde temos a
solução do precipitante. Ao fecharmos
esse sistema ocorrerá difusão de
moléculas de água da gota para o poço,
levando a proteína, em casos favoráveis,
a um estado de supersaturação, que pode
levar à formação dos primeiros núcleos
cristalinos.
39
Cristalização de Macromoléculas Biológicas
O aumento da solubilidade de uma macromolécula a baixa concentração salina
(<0,5M) é chamada salting-in. Segundo a teoria de Debye-Hückel para soluções
iônicas, um aumento na força iônica reduz a atividade dos íons em solução e aumenta
a solubilidade do composto iônico. Uma forma alternativa de se tratar o fenômeno é
considerar o salting-in como o resultado da competição entre grupos carregados na
superfície da macromolécula e os íons em solução. Na ausência de íons no solvente,
a macromolécula precipita devido à atração de eletrostática entre cargas opostas em
diferentes partes da macromolécula. Se os íons são adicionados à solução, esses
blindam os grupos carregados na macromolécula e aumentam a sua solubilidade.
a)
+
-
-
+
b)
-
+
+
-
-
+
+
-
Fenômeno de salting-in. a) Macromolécula biológica sem a presença de íons dissolvidos na solução. A atração eletrostática entre
os grupos carregados em duas os mais macromoléculas causa a aglomeração e precipitação. b) Íons blindam a 40
interação
eletrostática entre as macromoléculas, aumentando a solubilidade.
Cristalização de Macromoléculas Biológicas
Solução do poço
Sequência de eventos para a montagem de uma gota de cristalização: a) Colocase 1-2L da solução da macromolécula biológica sobre a lamínula de vidro. b)
Adiciona-se 1-2L da solução do reservatório à gota com a solução da macromolécula
biológica. c) Ao final temos uma gota (2+2) com a solução de macromolécula biológica
mais a solução do reservatório.
41
Cristalização de Macromoléculas Biológicas
Com o aumento do número de
macromoléculas cristalizadas, tornou-se
óbvio que muitas das condições de
cristalização se assemelhavam, ou seja,
havia uma concentração de resultados
positivos
de
cristalização
de
macromoléculas,
usando-se
número
limitado de precipitantes, tampões e
aditivos. Isto levou à proposição de
diversos métodos de cristalização (Carter
& Carter, 1979), onde um número limitado
de condições de cristalização eram
tentados,
usando-se
pequenas
quantidades
da
macromolécula
(miligramas). A partir da observação dos
resultados
preliminares
desses
experimentos era possível determinar que
tampão, aditivo e agente precipitante
seriam os mais favoráveis e a partir daí
proceder-se a sucessivos melhoramentos
até se conseguir cristais adequados.
Jancarik, J, & Kim, S. -H. (1991) J. Appl. Crystallogr. 24,42
409-411.
Cristalização de Macromoléculas Biológicas
Por
tentativa
e
erro
a
matriz
multimensional
foi
simplificada
eliminando-se as condições que podem
ser parcialmente representadas por
resultados de outras condições, a
proposta original apresenta 58 condições.
Comercialmente a empresa Hampton
Research, (USA) simplificou o método
original, e disponibiliza um kit com 50
condições
de
cristalização.
Comercialmente há outros kits usando-se
como princípio a variação de pH, força
iônica e agentes precipitantes.
Fonte: http://www.hamptonresearch.com/products/ProductDetails.aspx?cid=1&sid=17&pid=1
43
Cristalização de Macromoléculas Biológicas
Um dos sistemas usados para cristalização de proteínas é a placa linbro, mostrada
acima. Essa placa apresenta 24 poços, que permite testarmos diversas condições de
cristalização. As lamínulas são colocadas sobre cada um dos poços, e vedadas com
graxa de vácuo.
Fonte: http://www.hamptonresearch.com
44
Coleta de Dados de Difração de Raios X
Cristais de proteínas são frágeis, assim diversos cuidados são tomados na
manipulação desses. Na coleta de dados de difração de raios X, uma forma possível
de manipularmos os cristais e deixando-os saturados de solvente e inseri-los num
capilar, como mostrado na figura acima. Os cristais nessa situação podem ser levados
45
para coleta de dados de difração de raios X.
Coleta de Dados de Difração de Raios X
Uma forma alternativa de coletarmos dados, é transferir o cristal para uma solução
com protetor criogênico (polietileno glicol, glicerol entre outros). Usando-se esse
método, o cristal pode ser exposto a um fluxo de nitrogênio líquido e transferido para
uma base metálica (cabeça goniométrica). O cristal fica pronto para a coleta de dados.
46
As temperaturas criogênicas minimizam os dados causados pela radiação.
Coleta de Dados de Difração de Raios X
Foto disponível em: < http://www.hamptonresearch.com >.
Acesso em: 19 de outubro de 2015.
Na figura da esquerda vemos uma base de cobre usada como suporte para cristais. À
direita temos um cristal inserido num laço. A exposição ao nitrogênio líquido leva à
formação de um filme rígido e transparente que mantém o cristal no laço.
47
Difração de Raios X
A cristalografia por difração de raios X,
usada para resolução de estruturas de
proteínas, baseia-se na interferência de
ondas eletromagnéticas. As figuras ao
lado mostram interferência entre ondas,
temos duas ondas em fase, ondas 1 e 2,
onde seus máximos e mínimos coincidem
e a onda apresenta o mesmo
comprimento de onda, o resultado da
soma das duas é uma onda com a
amplitude resultante igual à soma das
amplitudes das ondas 1 e 2. No caso de
interferência destrutiva, temos as ondas
fora
de
fase,
exatamente
meio
comprimento de onda, onde o máximo da
onda 1 coincide com o mínimo da onda 2,
o resultado da soma é uma onda de
amplitude zero.
Interferência
construtiva
4
3
1
3
2
1
1
1
2
3
4
5
6
1
-1
-1
-2
-2
-3
-3
-4
-4
4
3
2
3
2
1
1
2
3
4
5
6
-1
-1
-2
-2
-3
-3
-4
-4
4
4
3
3
2
2
1
1
1
2
3
4
5
6
-1
-1
-2
-2
-3
-3
-4
-4
2
3
4
5
6
2
4
2
1
1
4
2
Interferência
destrutiva
1
2
3
4
5
6
1
2
3
4
5
6
48
Difração de Raios X
Abaixo temos uma animação que vemos interferência construtiva e destrutiva para de
duas ondas. As ondas 1 e 2 são representadas acima, o resultado das duas ondas está
representada na onda debaixo. Vemos quando os pico coincidem temos uma
interferência construtiva, e a onda desenhada com a linha grossa, atinge o máximo.
Onda 1
Onda 2
Ondas 1 + 2
Imagem disponível em: < http://www.xtal.iqfr.csic.es/Cristalografia/parte_05-en.html> .
Acesso em: 19 de outubro de 2015.
49
Difração de Raios X
Para
resolver
uma
estrutura
de
macromoléculas biológicas (proteína ou
ácido nucleico), a partir da difração de
raios X, precisamos cristalizá-las. O cristal
é um arranjo ordenado das moléculas, no
caso proteínas ou ácido nucleicos. Uma
forma de imaginarmos um cristal é por
meio da analogia com uma pilha de
tijolos, onde cada tijolo é uma molécula e
a pilha ordenada de tijolos o nosso cristal.
A incidência de raios X sobre um cristal
gera um padrão de difração, a partir do
qual podemos elucidar a estrutura
tridimensional da macromolécula.
Pilha ordenada de tijolos. Na nossa analogia, cada tijolo
representa uma molécula. A pilha de tijolos é o cristal.
Foto disponível em:
<http://www.sciencephoto.com/media/358564/enlarge >
Acesso em: 19 de outubro de 2015.
50
Difração de Raios X
Considere um conjunto de planos paralelos de um cristal, como mostrado na figura
abaixo, com distância interplanar (d). Incidindo sobre este conjunto de planos
paralelos temos raios X de comprimento de onda . Podemos analisar a difração de
raios X como se fosse resultado da reflexão dos raios X pelos planos. Para que ocorra
difração, num dado ângulo , é necessário que as ondas difratadas sofram
interferência construtiva. Usando-se a analogia com uma pilha de tijolos, onde cada
tijolo é uma molécula cristalizada, podemos pensar que os planos paralelos são as
superfícies dos tijolos, que como estão empilhados, formam planos paralelos.
Raios X


d
d
51
Difração de Raios X
Analisemos a diferença de caminho
ótico dos feixes 1 e 2, indicados na
figura. O feixe 2 percorre a distância
A + B a mais que o feixe 1. Assim,
para que as ondas dos feixes 1 e 2
sofram interferência construtiva, a
diferença de caminho ótico entre elas
deve ser um número inteiro de
comprimentos de onda.
1
1
2
2




A
d

B

d

A + B = 2.A = 2 d.sen 
d
d.sen 
52
Difração de Raios X
A diferença de caminho ótico (2 d.sen
 ) tem que ser um número inteiro de
comprimento de ondas (n.), onde n
é inteiro, assim temos:
1
1
2
2


2 d.sen  = n. (Lei de Bragg)


A
d

B

d

n.λ
d
2.senθ
d
 =1,54.10-10m
d.sen 
53
Difração de Raios X
Num experimento típico de difração de raios X, temos a fonte de radiação, o cristal e o
detector, como mostrado no diagrama esquemático abaixo. Normalmente os ângulos
de difração são expressos em relação ao feixe incidente, ou seja, 2 .
2

Fonte de raios X

Cristal
54
Difração de Raios X
2

Feixe de raios X

Feixe direto
Cristal
Filme fotográfico ou placa de imagem
No caso de colocarmos um filme fotográfico para registrar a imagem de difração de
raios X, como mostrado no diagrama abaixo, teremos um padrão de difração de raios
X bidimensional, quanto mais distante o ponto de difração de raios X do ponto central
da figura (feixe direto) maior o ângulo de espalhamento (2). A foto da direita foi girada
90º com relação ao diagrama de esquerda. No aparato experimental o filme ou placa
de imagem está perpendicular ao plano.
Filme fotográfico ou placa de imagem
55
Cristalização de Proteínas no Espaço
Experimentos de cristalização no
espaço normalmente geram cristais
de melhor qualidade para estudos
de difração de raios X. As
condições de microgravidade do
espaço,
propiciam
um
empacotamento cristalino mais
ordenado, gerando cristais que
difratam à mais alta resolução. A
proteína uropesina (Canduri et al.,
2001) foi cristalizada em condições
de microgravidade na missão STS95 do ônibus espacial Discovery (
Disponível
em:
<
http://www.youtube.com/watch?v=N
9IFiQNY8mE >).
Fonte: http://www.aviationspectator.com/more-aviation-photos?page=405. Crédito: NASA
Cristal de uropepsina .
56
Relação com Outras Disciplinas
Diversas técnicas físicas são de
fundamental importância para o estudo de
sistemas biológicos, entre elas a
cristalografia por difração de raios X e a
espectrometria de massas. Tais técnicas
tem fundamentos na Física e na
Química. As principais aplicações da
cristalografia e da espectrometria estão
relacionadas com as disciplinas de
Bioquímica Estrutural e Biologia
Molecular.
Biologia
Molecular
Química
Aula de
hoje
Bioquímica
Estrutural
Física
57
Material Adicional (Artigo Indicado)
Artigo indicado
Segue um artigo de revisão sobre cristalografia de proteínas:
Protein crystallography in drug discovery.
Canduri F, de Azevedo WF.
Curr Drug Targets. 2008 Dec;9(12):1048-53.
58
Referências
Drenth, J. (1994). Principles of Protein X-ray Crystallography. New York: SpringerVerlag.
Rhodes, G. (2000). Crystallography Made Crystal Clear. 2nd ed.San Diego: Academic
Press.
Stout, G. H. & Jensen, L. H. (1989). X-Ray Structure Determination. A Practical Guide.
2nd ed. New York: John Wiley & Sons.
59