POTENCIAL MUTAGENICO EM ÁGUAS COLETADAS EM DIFERENTES
PONTOS NO PERÍMETRO URBANO NO MUNICÍPIO DE ALTA FLORESTA – MT
ATRAVÉS DO TESTE Allium (Allium cepa)
Messias Galvão1; Daniel Pereira Miranda2; Gerlane de Medeiros Costa3; Angelita
Benevenuti da Silva4; Isane Vera Karsburg5
1. Graduado em Ciências Biológicas pela Universidade do Estado de Mato Grosso,
Campus de Alta Floresta - MT, Brasil.
2. Mestrando em Genética e Melhoramento pela Universidade Federal de Viçosa MG, Brasil.
3.Profa Mestre da Universidade do Estado de Mato Grosso, Campus de Alta
Floresta - MT, Brasil.
4. Mestre em Genética e Melhoramento de Plantas – UNEMAT – Brasil.
5. Profa Dra da Universidade do Estado de Mato Grosso, Campus de Alta Floresta MT, Brasil. ([email protected])
Recebido em: 31/03/2015 – Aprovado em: 15/05/2015 – Publicado em: 01/06/2015
RESUMO
A presença de agentes químicos no meio ambiente vem sofrendo um crescente
aumento pela atividade humana. A detecção destes agentes e seus prováveis
efeitos nos organismos com uma certa antecedência é importante nos estudos dos
impactos ambientais que podem trazer. O Allium Test possibilita a avaliação dos
efeitos ou danos que agentes mutagênicos podem causar. Faz-se necessário que a
amostra esteja em constante divisão mitótica para as observações. Este trabalho
teve por objetivo analisar a mutagenisidade de águas coletadas em diferentes
pontos no perímetro urbano no município de Alta Floresta-MT. Para realização
desse trabalho, os bulbos da cebola foram expostos a quatros tipo diferentes de
tratamento mais dois tratamentos controle negativo em água e o positivo em acetona
15%. Foram analisadas 3750 células por tratamento. Foram observados três tipos
diferentes de anormalidades na mitose, obtendo o índice mitótico que foi de 13,75%
células com anomalias e 86,25% células normais. O teste com Allium cepa mostrou
ser eficiente, pois todos os tratamentos com águas poluídas apresentaram algum
tipo de anomalia, menos o tratamento testemunha. Isso demonstra que o Allium Test
é uma ferramenta útil e relativamente barata na detecção precoce de agentes
químicos expostos no meio ambiente e que os ambientes analisados apresentam
poluentes prejudiciais à saúde humana.
PALAVRAS-CHAVE: Bioteste vegetal, genotoxicidade, citotoxicidade.
MUTAGENIC POTENTIAL COLLECTED IN WATERS IN DIFFERENT POINTS IN
THE PERIMETER URBAN IN ALTA FLORESTA CITY - MT THROUGH THE TEST
Allium (Allium cepa)
ABSTRACT
The presence of chemicals in the environment has been suffering an increasing by
human activity. The detection of pathogens and their likely effects on organisms well
in advance are important in the study of environmental impacts that they can bring.
Allium Test enables the assessment of the effects or damage mutagens can cause. It
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is necessary that the specimen is constant mitotic division for the comments. This
study aimed to analyze the water mutagenisidade collected at different points in the
urban area in the municipality of Alta Floresta-MT. To perform this task, the onion
bulbs were exposed to four different kind of treatment negative control plus two
treatments in water and 15% acetone positive. The 3750 cells were analyzed per
treatment. Three different types of abnormalities in mitosis were observed, obtaining
mitotic index was 13.75% cells with anomalies and 86.25% normal cells. The test
with Allium cepa is efficient because all treatments with polluted water had some type
of anomaly, the less control treatment. This demonstrates that the Allium Test is a
relatively inexpensive and useful tool in the early detection of chemical agents
exposed in the environment and that the analyzed environments present harmful
pollutants to human health.
KEYWORDS: plant bioassay, genotoxicity, cytotoxicity.
INTRODUÇÃO
Grande parte dos danos ao ecossistema aquático é decorrente em grande
parte devido a contaminantes lançados ao meio devido à falta de conhecimento
adequado e compreensão para lidar com os seus efeitos tóxicos (SINGH et al.,
2014). A detecção destes produtos e seus prováveis efeitos nos organismos são
importantes no estudo do impacto que eles podem trazer às populações animal,
vegetal e humana (COSTA & MENK, 2000). VUJOŠEVIĆ et al., (2008) relatam que o
aumento do uso da água como fonte de água potável está produzindo uma
crescente preocupação em relação a presença de agentes genotoxicos e/ou
cancerígenos em rios e lagos.
Os distúrbios causados por esses xenobióticos no meio ambiente levam
inicialmente a uma perturbação comportamental, fisiológica, bioquímica ou estrutural
em um determinado organismo. Se estas alterações forem observadas com uma
certa antecedência, pode ser possível identificar problemas ambientais antes que o
ecossistema seja afetado como um todo (JIMENEZ & STEGEMAN, 1990). Esse é o
conceito básico que sustenta a utilização de bioindicadores de poluição ambiental se
baseando no fato de que os biomarcadores são úteis e podem ser definidos como
sistemas indicadores que geralmente incluem subsistemas de um organismo
completo, usados para identificação de um alvo específico (SILVA et al., 2003).
Para monitorar a presença de compostos genotóxicos em águas
contaminadas são necessários testes sensíveis e vários bioensaios podem ser
utilizados neste processo (AMARAL et al., 2007). Entre os bioindicadores mais
utilizados, a Allium cepa, tem mostrado excelentes resultados na detecção de
potencial genotóxico de águas (SIDDIQUI et al., 2011; OLIVEIRA et al., 2012;
DÜSMAN et al., 2014), elementos químicos (JIANG et al., 2014; ELEFTHERIOU et
al., 2012), agrotóxicos (OZAKCA & SILAH, 2013; DIZDARI & KOPLIKU, 2013;
GRILLO et al., 2015) entre diversos outros testes.
Nas anormalidades cromossômicas em Allium cepa, vários tipos podem ser
encontrados nas fases da mitose (prófase, metáfase, anáfase e telófase). Esta
análise não é simples, já que requer um conhecimento preciso das fases da divisão
celular e suas possíveis anormalidades (LEME e MARIN-MORALES, 2009).
Avaliar a toxicidade de águas é fundamental para o não haver danos à saúde
humana e animais. Conforme SINGH (2014) organismos aquáticos como peixes e
camarões acumulam poluentes diretamente da água ou indiretamente através da
ingestão de outros organismos. O autor ainda afirma que de os poluentes
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genotóxicos podem não apenas atingir os organismos aquáticos, mas também o
homem através da cadeia alimentar.
O trabalho objetivou analisar a citotoxicidade e a genotoxicidade das águas
coletadas em diferentes pontos no perímetro urbano de Alta Floresta-MT através do
teste Allium.
MATERIAL E MÉTODOS
O experimento foi realizado no laboratório de Citogenética e Cultura de
Tecidos Vegetais da UNEMAT do Campus de Alta Floresta-MT.
Local de Coleta
Foram estabelecidos quatro pontos de coleta de água para o tratamento,
coletando-se dois litros de água superficial em cada ponto. Sendo:
QUADRO 1 - Amostras e locais das coletas de água, Alta Floresta-MT.
Tratamentos
Controle negativo
Controle positivo
Ponto A
Ponto B
Ponto C
Ponto D
Referencial dos pontos de coleta
Testemunha
Testemunha
Esgoto de laticínio
Localização
Água de torneira
Acetona a 15%
S 09° 54’41.7” / W
0,56º 03’ 01.2”
Estação de tratamento de esgoto
S 09º 51’ 15.0” / W
0,56° 06’ 03.8”
Córrego próximo à estação de tratamento S 09º 51’ 21.1” / W
de esgoto
0,56° 05’ 45.7”
Esgoto de frigorífico
S 09° 50’ 19.8” / W
056° 03’ 28.4”
FIGURA 01. Locais das coletas de água. A) Esgoto de laticínio; B) Estação de
tratamento de esgoto; C) Córrego próximo à estação de tratamento
de esgoto; D) Esgoto de frigorífico. Alta Floresta- MT.
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Avaliação da Ação Mutagênica
A análise da citotoxidade e genotoxicidade foi realizada utilizando 60 bulbos
de Allium cepa L., 10 por amostra de água, divididos em 4 tratamentos e com os
controles negativo e positivo. Os bulbos foram colocados em contato com as águas
em copos, acomodando-os em local fechado e mantidos por um período de quatro
dias para a germinação. Diariamente foi feita a troca de água para todos
tratamentos.
Após as raízes germinarem e obterem cerca 3 cm, estas foram coletadas e
fixadas em solução fresca de metanol: ácido acético (3:1) sendo trocado por três
vezes em intervalos de 15 minutos, em seguida foram mantidos em refrigeração de
4ºC até o momento da confecção das laminas.
Os meristemas radiculares de cada amostra foram lavados cuidadosamente
em água destilada com o auxílio de uma pipeta de plástico em placa de Petri com
três trocas de água consecutivas. Posteriormente as radículas foram
cuidadosamente secas em papel absorvente e colocadas na solução de acido
clorídrico (HCl) 5N por um período de 15 minutos. Feito isso as mesmas foram
lavadas novamente conforme o procedimento anterior.
As radículas foram postas sobre a lâmina, e com o auxílio do bisturi, foi
seccionada a região meristemática, restando na lâmina apenas o material
necessário para a análise. Neste material selecionado foi acrescentada uma gota do
corante orceína acética 2%, realizando-se uma leve dissociação com o auxílio de um
bisturi. Em seguida o material foi coberto com a lamínula, iniciando-se assim o
esmagamento com o bastão de vidro, retirando o excesso do corante com papel
filtro. O índice mitótico foi obtido dividindo-se o número de células em mitose
(prófase + metáfase + anáfase + telófase) pelo número total de células (interfase +
mitose) multiplicando-se por 100 (OLIVEIRA et al., 1996; PIRES et al., 2001).
Análise dos Dados
O material foi observado em microscópio óptico com objetiva de 40x. As
células foram analisadas aleatoriamente, utilizando o método de varredura, onde
cada tratamento resultou em 15 lâminas analisadas, sendo 250 células por lâmina,
totalizando 3750 células por tratamento. As imagens (anomalias) de interesse foram
fotografadas com o uso de objetiva de 100X de um microscópio fotômico binocular
(Leica ICC 50) acoplado a um computador e no software LAZ EZ V1. 7.0.
As médias de células normais e anormais foram submetidas à análise de
variância e, para as causas de variações significativas, foi utilizado o teste de Skott
Knott ao nível de 0,05% de probabilidade para comparação das médias conforme
FERREIRA (2003).
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Analisando as amostras dos pontos de coleta A, B, C e D foram observadas
células com irregularidades na prófase com cromossomos isolados (Figura 2.A) Em
células no estagio de metáfase, foram observadas alterações com cromossomos
isolados (Figura 2.C), e na metáfase normal (Figura 2.D), pode-se observar que
todos os cromossomos estão pareados sem nenhum fragmento de cromatina.
Na anáfase foram verificadas células com cromossomos isolados (Figura
2.E), os dois grupos de cromossomos migrando para lados opostos dos pólos da
célula com fragmentos de cromatina e cromossomos inteiros separado do grupo.
Comparando-se com anáfase normal (Figura 2.F) pode-se visualizar que os dois
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grupos de cromossomos estão migrando para os lados opostos da célula sem
nenhum cromossomo separado do grupo.
Células em estagio de telófase quando irregulares, apresentaram micronúcleo
(Figura 2.H) observa-se um fragmento de núcleo celular separado do grupo de
cromossomo já migrado para o polo da célula. Os resultados estão de acordo com
UMBUZEIRO & ROUBICEK (2003), os autores citam que, os agentes mutagênicos
são substâncias que induzem alterações na molécula de DNA. Essas alterações
podem ser corrigidas pelo próprio mecanismo de reparo das células, mas, quando
não reparadas ou reparadas erroneamente, originam mutações gênicas e
cromossômicas.
SIDDIQUI et al., (2011) relatam que anormalidades cromossômicas nas
células de A. cepa, constatando a presença de cromossomos fragmentados, pontes
de cromatina, cromossomo retardatário e presença de micronúcleo das raízes em
contato com águas residuais industriais. Para complementar, MOURA (2011)
também observou metáfase com cromossomo isolado e células com micronúcleos,
decorrente de alteração estrutural nas células somáticas de Allium cepa em contato
com extrato pirolenhoso de Tectona grandis, ou seja, substâncias induziram
mutações cromossômicas.
FIGURA 2. Diferentes fases mitóticas de Allium cepa obtidas da ação dos
diferentes tratamentos de água. A) Prófase com cromossomo
isolado; B) Prófase normal; C) Metáfase com cromossomo isolado;
D) Metáfase normal; E) Anáfase com cromossomo isolado; F)
Anáfase final normal; G) Anáfase normal; H) Telófase com presença
de micronúcleo; I) Telófase normal; I) Barra = 10 µm. Alta FlorestaMT.
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No quadro 1, o índice mitótico (IM) entre as amostras analisadas foi acima do
controle negativo com exceção das células do ponto A que foram inferiores aos
anteriores e o controle negativo (Tabela 1).
Pode-se observar que o material do ponto D foi o que obteve o menor número
de células em interfase, demonstrando que as células somáticas das raízes estão
em ativa divisão celular, e, segundo FASCHINETO (2007), a ocorrência de um
grande número de células em interfase está associado ao efeito antiproliferativo das
células mitóticas. Com isso, pode-se inferir que, devido a esse efeito antiproliferativo
das células, há uma diminuição do crescimento radicular. Fato explicado por
OLIVEIRA et al., (2012), os mesmos constataram a diminuição do crescimento das
raízes de Allium cepa em contato com água do Rio dos Sinos-RS em dois pontos
(Novo Hamburgo e São Leopoldo) em relação ao tratamento controle. Os autores
sugeriram que tal efeito se deve a maior concentração de substancias tóxicas nestas
amostras. Verifica-se que o tratamento D não inibiu a divisão celular em comparação
aos restantes. É notável também a presença de anormalidades nas células em todos
os estágios da mitose, evidenciando que os agentes genotóxicos podem agir em
qualquer fase da mitose. Esse mesmo resultado foi encontrado por MIRANDA et al.
(2013), analisando a genotoxicidade de solo contaminado por detritos domésticos, o
mesmo percebeu a presença de algumas fases anômalas, evidenciando a presença
de micronúcleos e de cromossomos isolados. As anormalidades apareceram em
todos os estágios mitóticos, desde prófase à telófase.
Analisando a tabela 1, observou-se que entre as 3750 células/tratamento
analisadas dos tratamentos A, B, C e D obteve-se um índice mitótico mais alto com
20,40% obtido do ponto de coleta D. Com base neste dado é perceptível que as
células das raízes expostas aos tratamentos com água contaminada diminuíram sua
divisão celular normal, comprovando que existe algum agente genotóxico que causa
retardo na divisão celular. MOHAMMED et al., (2015) verificaram que com a
frequência de aberrações cromossômicas, houve uma diminuição no número de
células em divisão em contato com diferentes doses de forskolin (planta com
potencial medicinal) e DÜSMAN et al., (2011) afirmam que as águas de córregos
urbanos localizados em Maringá- PR, causaram a inibição da divisão celular,
provavelmente resultante da ação de componentes químicos presente na água,
afetando o crescimento e desenvolvimento de A. cepa.
TABELA 1 - Índice mitótico e % de anomalias encontradas nas células de cebola
tratadas água coletada em diferentes pontos no perímetro urbano de
Alta Floresta – MT.
Tratamentos
Total de
Nº de Células em
IM (%) Anomalias (%)
Células
Mitose (%)
Analisadas
Controle negativo
3750
41,79
27,9b*
Controle positivo
3750
0,11
0.01d
Ponto A
3750
37,73
24.40c
12,40
Ponto B
3750
36,40
29.20b
7,20
15,01
Ponto C
3750
55,63
40.61a
Ponto D
3750
70,21
49.81a
20,40
CV (%)**
3,81
*Letras diferentes na coluna ocorreram diferenças significativas a 0,05% pelo Skott Knott.
** Coeficiente de variação.
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Analisando a figura 3, pode-se observar que a frequência de anomalias do
tipo “cromossomo isolado” foi o que ocorreu em maior número (37,81%), o que é
justificado pelo fato desse tipo de anomalia ter ocorrido em quase todas fases
mitóticas. Também foi possível avaliar o potencial genotóxico das águas do rio Preto
no trabalho realizado por MASCHIO (2009), no referido trabalho foi evidenciado
aberrações cromossômicas e micronúcleo em células meristemáticas de Allium
cepa. As mais observadas foram alterações em células em anáfase (ponte, perda, e
multipolaridade), em metáfase, como também a presença de células binucleadas,
células com micronúcleos e quebras cromossômicas, concordando com o presente
trabalho os tipos de aberrações cromossômicas encontradas.
As aberrações cromossômicas, também se devem a desestruturação dos
microtubulos celulares, comprovado por JIANG et al., (2014) que analisaram o efeito
de chumbo sobre células meristemáticas de A. cepa e com o aumento da
concentração, os microtubulos eram mais danificados, o que poderia causar a morte
celular. No referido trabalho o arranjo dos microtubulos estavam intimamente
relacionados às aberrações cromossômicas. ELEFTHERIOU et al., (2012)
estudaram o efeito do elemento químico cromo (Cr) em microtubulos de A. cepa em
diferentes concentrações e tempos de exposição e ANDRIOLI et al., (2012)
utilizaram o Zineb (componente da formulação de fungicida) em diferentes
concentrações utilizando o mesmo bioindicador, ambos trabalhos resultaram no
desarranjo estrutural dos microtubulos, resultando em aberrações cromossômicas o
quanto mais desarranjado eram os microtubulos.
FIGURA 3. Frequência de anormalidades em células meristemáticas de
Allium cepa. Alta Floresta- MT.
Quanto ao índice de genotoxicidade das fases mitótica, a que mais ocorreu
anomalia foi a anáfase, o que se justifica pelo fato de que esta fase ocorre em dois
tipos diferentes de anomalias, ponte anafásica e cromossomo isolado (figura 4). Na
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interfase e citocinese, não foram encontradas anomalias. SOUZA (2006) analisou
efluentes de uma indústria de papel e celulose e verificou que ocorreram aberrações
nas células meristemáticas de Allium cepa, encontrando apenas as aberrações
cromossômicas: C-metáfase, pontes anafásicas e anáfase desorganizadas, tanto no
efluente tratado como no não tratado, corroborando com o presente trabalho,
evidenciando que a anáfase sofreu maior número de anomalias. SANTOS (2013)
também observou que as aberrações cromossômicas foram vistas com maior
frequência nas anáfases com pontes de cromatina e com cromossomo isolado.
POHREN et al., (2013) ao avaliarem, através do teste com Allium cepa, um solo
contaminado com metais pesados, encontraram células com micronúcleos e
cromossomos isolados, e inferiu que estas alterações podem ocorrer
espontaneamente ou através da exposição a agentes químicos ou físicos por meio
de mecanismos clástogênicos e ações que envolvem mecanismos aneugênicos.
FIGURA 4. Frequência de genotoxicidade das fases mitóticas em células
meristemáticas de Allium cepa. Alta Floresta- MT.
Os testes com bioensaios com o Allium Test mostraram-se eficiente, pois
conforme apresentado anteriormente todos os tratamentos com água poluída por
dejetos químicos apresentou algum tipo de anomalia, menos o tratamento
testemunha, o qual foi usado somente para comparação, não usado para obter o
índice genotóxico. Os tratamentos com águas poluídas causaram genotoxicidade
nas células meristemáticas de Allium cepa indicando a presença de substâncias
químicas capazes de causarem alterações em organismos vivos.
Devido aos cromossomos fornecerem uma indicação susceptível de toxidade,
o Allium Test torna-se um procedimento rápido e de baixo custo quanto à indicação
de produtos químicos, poluentes e contaminantes que possam representar riscos
ambientais e efeitos deletérios a saúde humana.
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CONCLUSÕES
O uso do bioindicador Allium cepa se mostrou eficiente para avaliar o índice
de genotoxicidade e a citotoxicidade dos quatro pontos coletados. Em todos
tratamentos foram obtidas aberrações cromossômicas caracterizando contaminação
nos locais avaliados, inclusive, no córrego em comparação à testemunha. Deve-se
fazer análises mais precisas para descobrir quais são os agentes causadores da
toxicidade das águas, principalmente do córrego.
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