Workshop Plantas Medicinais e Fitoterapêuticas nos Trópicos. IICT /CCCM, 29, 30 e 31 de Outubro de 2008
Importância das plantas aromáticas medicinais nas novas estratégias de controlo de vectores da malária
_________________________________________________________________________________________________________________
IMPORTÂNCIA DAS PLANTAS AROMÁTICAS MEDICINAIS NAS NOVAS
ESTRATÉGIAS DE CONTROLO DE VECTORES DA MALARIA
Diara K Rocha** , António S.Grácio ** e Olívia C. Matos.1
*
Instituto Nacional de Recursos Biológicos, I.P. L-INIA, Quinta do Marquês, Av. República, Nova Oeiras, 2784-505
Oeiras.
[email protected]
**
Instituto Higiene Medicina Tropical – Unid. Entom. Medica, Rua da Junqueira 96, 1349-008 Lisboa.
Resumo
Os mosquitos são o maior grupo de insectos responsável pela transmissão de muitas doenças a nível mundial, como a
malária, arboviroses, nomeadamente a Febre-amarela e o Dengue. A luta contra a malária e as arboviroses implica
um esforço contínuo e integrado da investigação, quer ao nível do tratamento, quer ao nível da prevenção da doença.
O recurso a insecticidas sintéticos para o controlo das populações de mosquitos vectores de agentes patogénicos tem
sido questionado devido a factores relacionados com a quimio-resistência dos vectores aos insecticidas e às
repercussões ambientais da utilização dos mesmos. Deste modo, torna-se absolutamente necessário investir no
desenvolvimento de métodos alternativos de controlo dos vectores de agentes patogénicos e, no presente estudo,
pretende-se avaliar as propriedades biocidas das plantas Thevetia peruviana Schum, Mentha pulegium Linnaeus.,
Juniperus communis L., Azadirachta indica A. Juss., e Sambucus nigra L., e a sua eficácia no controlo dos
mosquitos Anopheles atroparvus van Thiel, 1927 (Diptera, Culicidae). O An. atroparvus foi o principal vector da
malária em Portugal e também vector do vírus West Nile. Este trabalho apresenta os resultados da actividade
larvicida de óleos essenciais de quatro plantas sobre larvas do terceiro estádio de An. atroparvus. Todos os óleos
testados demonstraram propriedades larvicidas, sendo mais eficazes os óleos de Mentha pulegium e de Juniperus
communis.
As plantas estudadas fornecem potencial bioinsecticida que poderá contribuir para o controlo biológico dos insectos
vectores de agentes patogénicos como alternativa menos tóxica, para o Homem e para o ambiente em geral.
Palavras-chave: Plantas aromáticas; Controlo; Vectores da malária
1. INTRODUÇÃO:
Nos países em desenvolvimento, especialmente, em África, a malária causa elevada
mortalidade e morbilidade nas populações. A prevalência da doença estima-se em cerca de 300500 milhões de casos clínicos por ano, dos quais mais de 90% ocorrem na África Subsariana
(TDR/WHO, 2002).
O combate à malária tem encontrado barreiras significativas, sendo as mais relevantes a
quimio-resistência dos agentes patogénicos aos fármacos antimaláricos e a resistência dos
vectores à maioria dos insecticidas disponíveis. A utilização dos constituintes de extractos de
1
Workshop Plantas Medicinais e Fitoterapêuticas nos Trópicos. IICT /CCCM, 29, 30 e 31 de Outubro de 2008
Importância das plantas aromáticas medicinais nas novas estratégias de controlo de vectores da malária
_________________________________________________________________________________________________________________
plantas remonta a tempos imemoriais, sendo as piretrinas, a nicotina e a rotenona os primeiros
compostos utilizados no controlo de insectos (MATOS, 2000). A utilização dos extractos
vegetais e larvicidas inorgânicos, como insecticidas naturais, foi muito comum na fase anterior à
disponibilização dos insecticidas sintéticos, existentes no mercado, que surgiram na década de
1940 (BALANDRIN et al, 1985) Apesar da eficácia dos insecticidas sintéticos, tem sido
ponderado algumas limitações ao seu emprego, nomeadamente o desenvolvimento de
resistências, os efeitos adversos ao ambiente e ao Homem. Assim se torna relevante investir em
novas abordagens de luta anti-vectorial.
Os produtos naturais de origem vegetal surgem como uma prometedora fonte de
compostos activos com aptidão para o controlo de vectores de agentes patogénicos. Dado que a
sua síntese está muitas vezes associada aos mecanismos de defesa das plantas contra inimigos
naturais, os biocidas derivados de plantas apresentam geralmente maior especificidade para os
organismos-alvo, sendo muitas vezes biodegradáveis e com menores riscos ambientais (RAWS,
1986). Estes produtos compreendem uma gama alargada de compostos químicos com acção
sinergista, quer a nível dos processos comportamentais, quer fisiológicos, o que reduz a
probabilidade da hipótese dos insectos desenvolverem mecanismos de resistência (SAXENA e
SUMITHRA, 1989). O facto do material vegetal ser em grande parte de origem tropical e a
hipótese de se poderem desenvolver tecnologias de extracção a nível local representa uma mais
valia, do ponto de vista económico nos países menos desenvolvidos (CHILDS, 2001).
O presente trabalho tem como objectivo a avaliação das propriedades insecticidas de óleos
essenciais de Mentha pulegium, de Juniperus communis, de Azadiracta indica e de extractos de
Sambucus nigra, de Thevetia peruviana e de A. indica sobre as larvas do terceiro estádio, pupas e
ovos de Anopheles atroparvus.
Thevetia peruviana Schum (Apocynaceae) é um arbusto, ou pequena árvore perenifólia,
originária das Índias Ocidentais e do México. Por ser muito usada como ornamental encontra-se
actualmente mais ou menos dispersa por todas as regiões tropicais e subtropicais. Existem alguns
trabalhos referentes à utilização da T. peruviana como biocida, particularmente como insecticida
(SATPATHI e GHATAK, 1990a, 1990b; NAGARAJA e RAO, 1987; ROCHA et al,. 2005),
fungicida (LAKSMANAN et al, 1990; SUNDRIYAL, 1991; KURUCHEVE et al., 1997; GATAGONÇALVES et al., 2003), bactericida (OBASI e IGBOECHI, 1991; SAXENA e JAIN, 1990) e
rodenticida (OJI et al., 1993)
2
Workshop Plantas Medicinais e Fitoterapêuticas nos Trópicos. IICT /CCCM, 29, 30 e 31 de Outubro de 2008
Importância das plantas aromáticas medicinais nas novas estratégias de controlo de vectores da malária
_________________________________________________________________________________________________________________
Mentha pulegium Linnaeus planta da família das Lamiaceas, nativa do Oriente Médio e
Norte da África. Foi dispersa na Europa pelos Árabes e Romanos e foi introduzida na América.
Planta de clima temperado a subtropical, tendo-se aclimatado a regiões subtropicais semi-áridas.
È referida frequentemente como antimicrobiana e insecticida sendo útil, nomeadamente, no
controlo de fungos e insectos do armazenamento (CONCEIÇÃO, 2008; MAGRO et al., 2008).
Juniperus communis é um arbusto perene da família das cupressáceas que, geralmente,
não atinge mais de um metro de altura, embora se encontrem espécimes que cheguem dos 2 aos 7
m, em forma arbustiva ou arbórea, principalmente na Europa. É designado vulgarmente como
cedro, genebreiro, junípero, junípero-comum, zimbrão, zimbro, zimbro-anão, zimbro-comum,
zimbro-rasteiro e zimbro-vulgar. Os seus óleos são ricos em hidrocarbonetos monoterpénicos
(CAVALEIRO et al., 2003), os quais apresentam potencial biocida.
Azadirachta indica A. Juss., neem é o nome de uma árvore da família Meliaceae, única no
seu género botânico. O seu nome científico faz referência à sua origem, a Índia. As suas folhas,
frutos, sementes, casca e madeira têm diversas aplicações, tanto como fonte de materiais usados
pela medicina, veterinária, cosmética, como na produção de adubos e no controlo de pragas e
insectos vectores de agentes patogénicos (OKUMO et al, 2007; ROCHA et al., 2006).
Sambucus nigra L (Caprifoliaceae), é um arbusto que está largamente representado em
Portugal, com interesse na produção de bebidas e na indústria alimentar, realçando-se o seu uso
como fonte de antocianinas e corantes alimentares. No que se refere ao uso do Sambucus nigra
como insecticida, encontram-se actualmente alguns trabalhos publicados (ERTÜRK, 2006;
ROCHA et al., 2007).
2. MATERIAL E MÉTODOS
Folhas de Thevetia peruviana provenientes da Ilha de Santiago, Arquipélago de Cabo
Verde, foram usadas no presente estudo. Os insectos são provenientes de uma colónia
estabilizada no laboratório há mais de uma década e oriundos de Águas-de-Moura.
A preparação dos extractos envolveu uma redução do teor de humidade por secagem,
extracção, filtragem e evaporação. Determinou-se a massa fresca das folhas e em seguida, estas
foram distribuídas em tabuleiros e secas à temperatura máxima de 35º C em ambiente arejado e
no escuro, durante 8 dias. Findo este período, determinou-se a massa seca das folhas numa
3
Workshop Plantas Medicinais e Fitoterapêuticas nos Trópicos. IICT /CCCM, 29, 30 e 31 de Outubro de 2008
Importância das plantas aromáticas medicinais nas novas estratégias de controlo de vectores da malária
_________________________________________________________________________________________________________________
balança técnica e procedeu-se à sua trituração num moinho manual. Calculou-se o rendimento de
secagem.
2.1. Preparação de extractos vegetais
O extracto aquoso foi obtido pesando-se 200 g de folhas secas e moídas, num Erlenmayer
de 2 litros, a que se adicionou 1,5 l de água. A extracção foi realizada a quente, numa placa
eléctrica de aquecimento a 70ºC, com agitação magnética durante 30 minutos.
Os extractos de metanol (MeOH) e de acetato de etilo (EtOAc) foram obtidos por
maceração, a frio. Para cada um dos solventes pesaram-se 200 g de folhas secas e moídas para
um balão de 3 litros. Adicionou-se 1 litro de metanol ou acetato de etilo p.a. a 100%. Estas
misturas foram agitadas manualmente, com movimentos circulares, para garantir que todo o
material vegetal ficasse submerso no respectivo solvente. Foram então colocadas num agitador
(Gyratory Shaker - Model G2 New Brunswick, USA), a 50 rpm. Os balões foram devidamente
tapados com filme de alumínio e parafilme, de modo a evitar a evaporação do solvente e
mantidos em agitação, no escuro e à temperatura ambiente, durante 5 dias.
Após a extracção, quer por fervura (H2O), quer por maceração (MeOH e EtOAc),
procedeu-se à filtragem dos extractos recorrendo a um sistema Buckner-Kitasato sob pressão
reduzida. Usou-se um filtro Whatman nº 4, com 110 mm de diâmetro. O filtrado obtido a partir
do extracto aquoso correspondia a um volume final de 1 litro e foi conservado a 4ºC. Por sua vez,
os filtrados dos extractos em MeOH e em EtOAc foram recolhidos em balões de evaporação,
previamente tratados, o solvente removido até à secura, sob vácuo, num evaporador rotativo
(Rotavapor-R114, Büchi-Waterbath B-480). Todo o material de vidro utilizado na evaporação foi
passado 2 vezes com acetona, de modo a eliminar eventuais resíduos contaminantes e colocado
durante alguns minutos numa estufa a 40ºC. Antes e depois da evaporação os balões foram
pesados numa balança de precisão, de modo a viabilizar a determinação do rendimento de
extracção de cada solvente.
As folhas de S. nigra foram colectadas no Norte de Portugal e a extracção e
fraccionamento dos extractos brutos foram efectuados através de técnicas idênticas as descritas
para T. peruviana, tendo sido optimizado como solvente para os nossos ensaios o acetato de etilo.
Os óleos essenciais de T. peruviana, M. pulegium e J. communis foram obtidos por
métodos convencionais (hidrodestilação, Soxhlet).
4
Workshop Plantas Medicinais e Fitoterapêuticas nos Trópicos. IICT /CCCM, 29, 30 e 31 de Outubro de 2008
Importância das plantas aromáticas medicinais nas novas estratégias de controlo de vectores da malária
_________________________________________________________________________________________________________________
O óleo e o extracto de A. indica (neem), proveniente do Brasil, foram também usados
neste estudo. As substâncias derivadas de neem, em particular a azadiractina, são conhecidas
pelas propriedades medicinais e pelos seus efeitos de repelência nos insectos, nomeadamente
contra Aedes aegypt (CORIA e tal., 2008).
2.2. Ensaios biológicos
A sensibilidade das larvas e pupas de Anopheles atroparvus aos extractos, de T. peruviana
e S. nigra e aos óleos de M. pulegium, J. communis e A. indica, foi determinada através de ensaios
biológicos, realizados em tinas de vidro com água (250 mL). As diferentes concentrações de cada
um dos extractos (0,1; 0,2; 0,4 e 0,6 mg/ml) e dos óleos (0,020; 0,040; 0,100; 0,180 ml/L) foram
adicionadas, misturaram-se bem os solutos do extracto com água durante cerca de 30 segundos e
deixaram-se em repouso durante 15 minutos, período ao fim do qual se colocaram em cada
modalidade de teste 25 larvas ou 25 pupas. Os problemas de solubilidade foram atenuados com
aplicação de Tween 20. Após um ensaio preliminar para optimização das concentrações
preparam-se 4 réplicas do ensaio em água ou com cada um dos solventes usados. O teste de
sensibilidade foram feitos segundo as normas estabelecidas pela Organização Mundial de Saúde
(WHO, 1997), tendo sido efectuadas algumas adaptações. Fizeram-se observações ao fim de 3,
12, 24, 48 e 96 horas. As pupas que sobreviveram ao contacto com os extractos e passaram a fase
adulta, foram monitorizadas ao longo de quatro semanas, de modo, a avaliar um eventual efeito
na oviposição (resultados não apresentados).
As concentrações letais foram obtidas por interpolação pela análise de Probit, através do
programa “Stastical Product and Social Science (SPSS)”.
3. RESULTADOS
Os resultados obtidos confirmam as propriedades insecticidas da T. peruviana. Os
extractos aquosos e metanólicos foram pouco tóxicos para as larvas e as pupas. Porém, os de
acetato de etilo exibiram elevado efeito larvicida (Tabela 1) (CL50=0,13 mg/ml, CL90=0,94
mg/ml) (Fig 3) e pupicida (CL50=0,06 mg/ml, CL90=0,12 mg/ml) ao fim de 48 horas.
5
Workshop Plantas Medicinais e Fitoterapêuticas nos Trópicos. IICT /CCCM, 29, 30 e 31 de Outubro de 2008
Importância das plantas aromáticas medicinais nas novas estratégias de controlo de vectores da malária
_________________________________________________________________________________________________________________
Tabela 1 -Registo de mortalidades corrigidas e das actividades das larvas e pupas,
24 horas após contacto com extractos de T. peruviana.
Mortalidade
Actividade larvicida
Actividade pupicida
% (L)
(95%C.I., mg/ml)
(95%C.I., mg/ml)
0,1
43,3 / 83,5
CL50
CL50
0,2
58,8 / 100
0,13
(0,10 - 0,19)
0,06
(0,02-0,07)
0,4
76.3 / 100
CL 90
CL 90
0,6
84,5 / 100
0,94
(0,66 -1,73)
0,12
(0,10-0,14)
Control
0
Thevetia
peruviana (mg/ml)
O ensaio de toxicidade dos óleos essenciais (Tabela 2) demonstra uma elevada
sensibilidade das larvas do 3º estádio do An. atroparvus ao J. communis relativamente ao A.
indica, com valores de CL50 na ordem dos 35ml/L para J. communis e 199 ml/L para A. indica, a
um intervalo de confiança de 95 %. O óleo essencial de M. pulegium também apresenta elevadas
percentagens de mortalidade larvar, 24 após o início do ensaio.
É notório que os melhores resultados foram obtidos com os óleos essenciais de J.
communis e de M. pulegium que induziram 100% de mortalidade nas larvas do 3º estádio, 24
horas após o contacto. Em todos estes ensaios não se registaram mortalidades nos grupos
controlos.
6
Workshop Plantas Medicinais e Fitoterapêuticas nos Trópicos. IICT /CCCM, 29, 30 e 31 de Outubro de 2008
Importância das plantas aromáticas medicinais nas novas estratégias de controlo de vectores da malária
_________________________________________________________________________________________________________________
Tabela 2 -Registo de mortalidades corrigidas e das actividades das larvas, 24 horas após
contacto com óleos essenciais de M. pulegium e de J. communis.
Mentha
pulegium
(ml/L)
Mortalidade
% (L)
Actividade
larvicida
(95%C.I., mg/ml)
0,020
0/100
CL 50
0,020
24/100
CL 50
0,040
24/100
58
[46-70]
0,040
52/100
35
[27-44]
0,100
84/100
CL 90
0,100
96/100
CL 90
0,180
100/100
109
[87-162]
0,180
100/100
83
[61-157]
Control
0
Control
0
Juniperus
Mortalidade
communis
% (L)
(ml/L)
Actividade
larvicida
(95%C.I., mg/ml)
Analisando os resultados, verificou-se que as larvas de A. atroparvus se mostraram
susceptíveis ao extracto EtOAc de S. nigra, com doses letais mínimas para 50% e 90%,
determinadas graficamente, de CL50=4mg/L e CL90=30mg/L respectivamente, conforme se
indica na Fig. 1. Foi feito um teste de qui-quadrado de ajustamento, cujo valor foi X2=0,175 para
um nível de significância em que p=0,916 com 2 graus de liberdade.
No cálculo da recta de regressão, obteve-se p =3,47 + 1,42 x e um alto coeficiente de
correlação R2=0,97 (Fig. 1).
7
Workshop Plantas Medicinais e Fitoterapêuticas nos Trópicos. IICT /CCCM, 29, 30 e 31 de Outubro de 2008
Importância das plantas aromáticas medicinais nas novas estratégias de controlo de vectores da malária
_________________________________________________________________________________________________________________
CL50=4mg/L
CL90=30mg/L
Fig. 1 - Recta de regressão do Probit da mortalidade (%) das larvas de A. atroparvus em função do
logaritmo da concentração (mg/L) do extracto EtOAc de Sambucus nigra às 24 horas.
4. CONCLUSÕES
Dos três extractos estudados, os potenciais larvicidas foram os extractos acetato de etilo
de T. peruviana e S. nigra. Os óleos essenciais com actividade larvicida mais eficazes foram os
de M. pulegium e J. communis, com efeitos de letalidade de 100%, 24 horas após o contacto
inicial.
As concentrações letais obtidas estão de acordo com relatos de ensaios anteriores
realizados quer com outras espécies quer com T. peruviana (RONGSRIYAM e BASKORO,
1996). Os resultados de S. nigra são promissores no controlo larvar de mosquitos em estudo e são
pela primeira vez apresentados a aplicação do extracto desta espécie em ensaios laboratoriais.
O uso de insecticidas de síntese no controlo de vectores de doenças tem causado imensos
problemas, pelo que se considera importante estudar os métodos alternativos de controlo. Os
insecticidas convencionais têm causado efeitos adversos no meio ambiente devido, por um lado,
aos micropoluentes e, por outro, à resistência fisiológica desenvolvida pelos vectores a grande
parte dos insecticidas sintéticos (BROWN, 1986). Esses factores fazem com que seja de facto
8
Workshop Plantas Medicinais e Fitoterapêuticas nos Trópicos. IICT /CCCM, 29, 30 e 31 de Outubro de 2008
Importância das plantas aromáticas medicinais nas novas estratégias de controlo de vectores da malária
_________________________________________________________________________________________________________________
imperioso fazer mais investimentos na pesquisa de insecticidas que revelem maior segurança para
o ambiente e para o homem e que tenham uma acção específica para os alvos biológicos.
Recentemente tem aumentado muito o interesse pelo estudo das plantas medicinais e sua
aplicação como alternativa a utilização dos insecticidas de síntese. Grande parte dos trabalhos
realizados nessa área tem sido direccionada para o combate às pragas agrícolas e não se tem
explorado muito a utilização das plantas no controlo de mosquitos vectores de doenças.
Como perspectivas futuras pretende-se avaliar os efeitos desses extractos e dos compostos
activos noutras espécies de insectos alvos e efectuar estudos de eficácia de repelência de óleos
essenciais.
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS:
BALANDRIN M.F., KLOEKE J.A., WURTELE E.S., BOLLINGER W.H. (1985), “Natural plant chemicals:
sources of industrial and medicinal materials”. Science 228: 1154-1160.
BROWN, A.W.A. (1986), Insecticide resistance in mosquitoes: a pragmatic review. J. Am. Mosq. Control Assoc. 2:
123-140.
CAVALEIRO, C., SALGUEIRO, L.R., CUNHA A.P. DA, FIGUEIREDO A.C., BARROSO J.G., BIGHELLI A.,
CASANOVA J. (2003), Composition and variability of the essential oils of the leaves and berries from Juniperus
navicularis, Biochemical Systematics and Ecology 31 193–201.
CHILDS, F.J. (2001), Improvement of neem and its potential benefits to poor farmers. Department of International
Development. UK; pp. 32.
CONCEIÇÃO, C. (2008), Potencialidades de Produtos Naturais de origem vegetal como meio de protecção contra
Sitophilus Zeamais Motschulsky (Coleóptera: Curculionidae) em Milho Armazenado. Tese de Doutoramento em
Engenharia Agronómica,UTL-ISA, 252 pp.
CORIAA, W. ALMIRONA, , , G. VALLADARESA, C. CARPINELLAB, F. LUDUEÑAA, M. DEFAGOA E S.
PALACIOSB (2008), Larvicide and oviposition deterrent effects of fruit and leaf extracts from Melia azedarach
L. on Aedes aegypti (L.) (Diptera: Culicidae). Bioresource Technology 99 (8) 3066-3070.
ERTÜRK, O. (2006), Antifeedant and toxicity effects of some plant extracts on Thaumetopoae solitaria Frey.
(Lep.: Thaumetopoeidae).
GATA-GONÇALVES, L., NOGUEIRA, J.M.F., OLÍVIA MATOS, RAÚL BRUNO DE SOUSA (2003)
“Photoactive extract from Thevetia peruviana with antifungal properties against Cladosporium cucumerinum”. J.
Photoch. And photob. B: Biology. Elsevier. 70: 51-54.
KURUCHEVE, V., ECHILAN, J.G., JAYARAJ, J. (1997), “Screening of higher plants for fungitoxicity against R.
solani in vitro. Indian Phytopathol. 50(2):235-241.
LAKSMANAN, P.; MOHAN, S.; JEYARAJAN, R. (1990), “Antifugal properties of some plant extracts against
Thanatephorus cucumeris, the causal agent of collar rot disease of Phaaseolus aureus”. Madras Agricultural
Journal. 77: 1-4.
9
Workshop Plantas Medicinais e Fitoterapêuticas nos Trópicos. IICT /CCCM, 29, 30 e 31 de Outubro de 2008
Importância das plantas aromáticas medicinais nas novas estratégias de controlo de vectores da malária
_________________________________________________________________________________________________________________
MAGRO, ANA MARGARIDA BARATA, OLÍVIA MATOS, MARGARIDA BASTOS, MANUELA CAROLINO,
ANTÓNIO MEXIA (2008), Fungos/Fungi. In Contribuição para a protecção do arroz armazenado/ Contribution
for integrated management of stored rice pests (Mancini, R., Carvalho, O., Timlick, B. & Adler, C. eds.). Lisboa,
Capítulo 1, 1-11.
MATOS, O. C. (2000), Uso de Substâncias Naturais de Origem Vegetal com Actividade Biológica na Protecção das
Culturas Agrícolas, Agronomia Lusitana 48 (Suplemento nº 2): 1-44.
NAGARAJA, R.P., RAO, P.N. (1987), “Malarial vector, Anopheles stephensi Control with insect development
inhibitors”. Bangladesh Journal of Zoology. 15:101-107.
OBASI, N.B., IGBOECHI, A.C. (1991), “Seed oil distillates of Thevetia peruviana (SYN. T. neriifolia): analysis and
antibacterial activity”. Fitoterapia LXII(2):159-162.
OJI, O., MADUBUIKE, F.N., NWALOZIE, M.C., (1993), “Mortality in rats following dietary inclusion of Thevetia
neriifolia seeds”. Fitoterapia 64:.137-139.
OKUMO, O. F.; KNOLS, B.GJ. & FILLINGER, U. (2007), “Larvicidal effects of a neem (Azadirachta indica) oil
formulation on the malaria vector Anopheles gambiae “. Malaria Journal 6 (63).
RAWS R.L. (1986), “Experts probe issues, chemistry of light-activated pesticides”. Chem. Eng. News Sep 22:2124.
ROCHA, D.K. MATOS, O.C. GRÁCIO, A.J.P. (2007), Eur. J. Trop. Medicine and Int. Health,12 (I),249
ROCHA, D.K., MATOS, O.C. E GRÁCIO, A.S. (2006), “Actividade larvicida de óleos essenciais em Anopheles
atroparvus van Thiel, 1927”. Acta Parsitológica Portuguesa, 13 (1 - 2): 15-17.
ROCHA, D.K., MATOS, O.C., & GRÁCIO, A.S. (2005), “Plants Extracts useful to control vectors of malaria.
Abstract Book of 15 th European SOVE Meeting, 110.
RONGSRIYAM, Y., BASKORO, T. (1996), Medic.l Ann. Report. Faculty of Tropical Medicine.
SATPATHI, C.R.; GHATAK, S.S. (1990a.)”Evaluation on the efficacy of some indigenous plant extracts against
Henosepilachna vigintiopunctata (F) (Coccinellidae: Coleoptera) a pest of brinjal”.Environment and Ecology.
8:1293-1295.
SATPATHI, C.R.; GHATAK, S.S. (1990b.) “Efficacy of some plant extracts against Cydia critica (Meyr) and
Plutella xylostella (L)”. Environment and Ecology, 8: 646-649.
SAXENA, S.C., SUMITHRA, L. (1989) “Toxicity of a new plant extract against mosquitoes”. Ad. Bios. 8: 149-154
SAXENA, V.K., JAIN, S.K. (1990),. “Thevetia peruviana kernel oil: a potencial bactericidal agent”. Fitoterapia
LXI(4): 348-349.
SUNDRIYAL, R.C. (1991), “Fungitoxic properties of flower extracts of some wild plants of Garhwal Himalaya”.
Advances in Plant Sciences. 4: 230-234.
TDR/WHO-TRAINING IN TROPICAL DISEASE, 2002. Malaria Fact. Sheet WHO, Geneva.
WARE, G.W. (1982), Pesticides: Theory and application. Thompson Publications, Fresno, Califórnia. Pp.308.
WHO, (1997), Vector Control: “Methods for use by Individuals and Communities”. Prepared by Jan A. Rozendaal,
412.
10