Marcelo Maraschin
Laboratório de Morfogênese e Bioquímica Vegetal,
Departamento de Fitotecnia, Universidade Federal de Santa
Catarina – Florianópolis/SC.
[email protected]
Engenharia do
PESQUISA
Robert Verpoorte
Division of Pharmacognosy, Leiden/Amsterdam Center for
Drug Research, Leiden University, Leiden, The Netherlands.
[email protected]
Foto cedida pelos autores
METABOLISMO SECUNDÁRIO
Otimização da produção de metabólitos secundários em culturas de células vegetais
esde os tempos antigos as
12.000/g, respectivamente. Todavia, além
alguns grupos taxonômicos, não sendo
plantas vêm sendo utilizado alto valor agregado que algumas
considerados essenciais ao metabolismo
das nas sociedades humadrogas de origem vegetal apresentam,
basal da célula vegetal, donde surge a
nas com propósitos teraesta área demonstra um grande potencidenominação metabólitos secundários.
pêuticos, sendo que suas
al no que concerne ao desenvolvimento
No âmbito da interação planta/ambiente
propriedades tóxicas ou curativas foram
de novos medicamentos, uma vez que a
(efeito atrativo/repulsivo a microrganisdescobertas pelo homem principalmendiversidade química associada à diversimos, insetos, vertebrados, plantas, etc.),
te enquanto este buscava por alimento.
dade biológica encontrada em ecossistedesempenham um importante papel,
De fato, o conhecimento etnobotânicomas terrestres e aquáticos, é um imporgarantindo a sobrevivência das espécies
farmacológico acumulado ao longo de
tante aspecto a ser considerado em
no ecossistema. Adicionalmente, metagerações tem servido como base para o
processos e diretrizes de desenvolvibólitos secundários são utilizados em
desenvolvimento de fármacos
escala industrial para a prode grande importância, tais
dução de inseticidas, coranAjmalicina
Quinina
como : digoxina, quinina, mortes, flavorizantes, aromatizanfina, hiosciamina, ácido salicítes e medicamentos. Exemlico e artemisina. Neste conplos de metabólitos secundátexto, os metabólitos secundários de grande importância
rios vegetais apresentam um
na indústria farmacêutica são
grande valor do ponto de vista
mostrados na Figura 1. A dessocial e econômico e, como
peito do alto valor econômiexemplo, na década de 80 foco de alguns destes biofármaram identificados 121 composcos, baixos níveis de produtitos de origem vegetal, provevidade têm sido usualmente
nientes de 95 espécies, os quais
encontrados nos sistemas de
têm sido usualmente empregaprodução agrícola convencidos como terapêuticos nos paonais, decorrentes de uma
íses ocidentais. Além disso, do
série de motivos. Tal fato gera
total de medicamentos aprovaa necessidade de desenvolMorfina
Taxol
dos no período 1983-1994, 6%
ver sistemas alternativos de
são obtidos diretamente de esprodução e, neste contexto, o
Figura 1: Estrutura molecular de metabólitos secundápécies vegetais, sendo denocultivo de células e tecidos
rios vegetais utilizados como biofármacos
minados produtos naturais, 24%
vegetais tem sido considerasão compostos derivados e 9%
do como um sistema de alto
foram desenvolvidos a partir de commento de novos biofármacos. Como
potencial para a superação desse propostos vegetais cuja estrutura molecular
estimativa, cerca de 110.000 compostos
blema, embora algumas dificuldades conserviu como unidade precursora em
têm sido identificados até o presente,
cernentes à sua viabilidade econômica
processos de síntese.
sendo que deste total, os terpenóides
ainda não tenham sido superadas.
Do ponto de vista econômico, podeconstituem o maior grupo [~ 33.000
Em função disso, diversas estratégias
se mencionar os alcalóides indólicos
compostos], seguidos pelos alcalóides
têm sido empregadas objetivando auterpenoídicos vincristina (utilizado no
[~16.000 compostos] (1). Anualmente,
mentar os valores de produtividade de
tratamento de leucemia) e vinblastina
4000 novos compostos de origem vegecompostos bioativos em sistemas de
(usado na terapia de corio-carcinomas e
tal têm sido relatados, com uma tendêncultura de células e tecidos vegetais,
na doença de Hodgkin’s) de Catharancia de crescimento para este valor. Como
incluindo a manipulação epigenética, a
thus roseus, os quais têm seus valores de
característica geral, tais compostos moselucidação de vias biossintéticas e a
mercado estimados em US$ 6.000 e
tram um padrão de ocorrência restrito a
aplicação de técnicas de biologia mole24
Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento
cular, segundo uma abordagem de engenharia de vias metabólicas. O presente artigo enfoca algumas estratégias frequentemente adotadas quando se busca
a otimização da produção de metabólitos secundários em sistemas de culturas
de células vegetais.
(A)
Manipulação epigenética
Provavelmente, a primeira estratégia
utilizada para otimizar a produção de
metabólitos secundários em cultivos celulares vegetais foi a manipulação epigenética. Tal estratégia considera a identificação e seleção de linhagens celulares
de maior potencial produtivo, otimização do meio de cultura, manipulação de
fatores de ambiente (intensidade luminosa, fotoperíodo, temperatura, CO ,
2
O , e.g.), a influência do nível de dife2
renciação celular, a adição de inibidores
ou precursores ao meio de cultura e a
elicitação.
Identificação, seleção clonal e otimização do meio de cultura: Ao longo das
últimas décadas, vários relatos têm sido
feitos na literatura mostrando incrementos na produção de metabólitos secundários através da identificação e seleção
de linhagens celulares com maior potencial de biossíntese/acúmulo de metabólitos secundários. A seleção de clones
celulares pode ser feita através da adição
de compostos tóxicos (ácido nicotínico,
e.g.) ou seletivos ao meio de cultura, os
quais atuam de modo a permitir apenas
a sobrevivência de células com maior
capacidade de metabolização do intermediário, ou ainda através de alterações
nos fatores ambientais. Todavia, com
relativa frequência e de modo espontâneo, observa-se a expressão de variação
genética em linhagens selecionadas, de
modo que o potencial de biossíntese
do(s) composto(s) de interesse é uma
característica instável. As razões que
determinam tal fato não são claramente
conhecidas até o presente momento. A
hipótese baseada na variação genética e
seleção celular (2) tem sido proposta
com o intuito de explicar a heterogeneidade/instabilidade observada em culturas de células vegetais quanto à produção de metabólitos secundários. Buscando superar tal problema, a identificação de clones de maior produtividade
tem sido feita através do cultivo de
protoplastos (single cell), ou de pequenos agregados celulares (cell nursery
culture) em programas de longa duração. Os resultados indicam que para
algumas espécies esta abordagem possi-
(B)
Figura 2. Estruturas de fitoanticipinas constitutivas encontradas em
células de (a) Sorghum bicolor e (b)
Cicer arietinum. As antocianinas
pelargonidina e cianidina têm ação
protetora contra radiação UV, enquanto as isoflavonas formononetina
(FGM) e biochanina A (BGM) são
inibidores de infecção fúngica (Lo &
Nicholson, 1998 e Barz & Mackenbrock, 1994)
bilitou a obtenção de linhagens com alto
potencial produtivo e estáveis, como no
caso de berberina e antocianina em
cultivos celulares de Coptis, Thalictrum
e Euphorbia, respectivamente. A superação da instabilidade neste sistema é
atribuída à redução da heterogeneidade
genética nos cultivos ao longo dos sucessivos subcultivos. A otimização da
composição do meio de cultura se mostra como uma estratégia efetiva para a
obtenção de incrementos de produtividade de metabólitos secundários in vitro. A literatura disponível ilustra este
aspecto enfocando a utilização de constituintes de natureza orgânica ou inorgânica. Contudo, um meio de cultura que
ofereça condições ótimas ao incremento
da biomassa celular é, via de regra,
antagônico à síntese do(s) composto(s)
de interesse. Em função disto, o estabelecimento de um meio de cultura adequado simultaneamente ao crescimento
celular e à produção é bastante difícil.
Um sistema de produção envolvendo
dois estágios tem sido proposto (3)
como estratégia para superar a condição
de antagonismo entre o crescimento
celular/biossíntese metabólitos secundários. Este sistema consiste no cultivo
celular
em
meio
de
crescimento,inicialmente, de modo a favorecer o máximo acúmulo de biomassa, seguido pela transferência para o
meio de produção, onde a biossíntese
do(s) metabólito(s) de interesse é favorecida. Incrementos de produtividade
de 84% e 47% para o triterpenóide
velutinol A e seu derivado glicosilado
MV8612 foram obtidos em cultivos celulares de Mandevilla velutina (4) com a
utilização deste sistema. Entretanto, como
regra geral, esta abordagem somente
funciona se um nível basal do composto
de interesse estiver presente no cultivo
celular. Se as células não sintetizam o
composto, como no caso de morfina,
hiosciamina e vinblastina, tal estratégia,
de fato, não poderá ser utilizada.
Adição de precursores : Em diversos
cultivos celulares a produção de metabólitos secundários pode ser positivamente afetada pela adição de intermediários da via biossintética. Como exemplo disto, culturas de células de Catharanthus roseus suplementadas com secologanina mostraram elevação nos teores de estrictosidina, o precursor comum
na biossíntese de alcalóides indólicos
monoterpenoídicos (5). Resultados similares foram encontrados com a adição
de L-Triptofano, com uma resposta tempo-dependente, enquanto a produção
de ajmalicina não foi afetada. É interessante mencionar três aspectos básicos
ao se considerar esta metodologia como
estratégia para a obtenção de incremen-
(A) Brassilexina
(B) Orizalexina A
(C) Micosinol
Figura 3. Estrutura química de fitoalexinas produzidas por células de
(a) Brassica, (b) Oryza e (c) Coleostephus como resposta à infecção
por microrganismos (Keen, 1990).
Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento
25
tos de produtividade de metabólitos de
interesse: a) a concentração do substrato; b) o metabólito de interesse é (ou
não) um produto final da via biossintética; c) a capacidade celular de acúmulo
do composto. No primeiro caso, a adição de precursor(es) pode induzir aumentos de produção do composto bioativo, na medida em que permite superar a pequena disponibilidade de substrato no meio de reação, especialmente
quando a arquitetura da via biossintética
é linear, como no caso da maioria das
vias de biossíntese de metabólitos secundários conhecidas. Em segundo lugar, se o metabólito alvo não é um
produto final da via biossintética, a taxa
de seu catabolismo pode tornar inefetiva
a adição de precursor(es). Neste contexto, tem sido demonstrado que a taxa de
síntese e de degradação de ajmalicina
são similares em culturas celulares de
Catharanthus roseus, de modo que não
foi observado acúmulo deste alcalóide
em cultivos suplementados com precursor. A curta meia-vida de compostos na
planta, como observado para nicotina
(22 horas) e morfina (7,5 horas) reforça
a importância deste aspecto. A capacidade celular de acúmulo de metabólitos
secundários não tem sido estudada em
profundidade até o presente momento.
Contudo, é esperado haver um limite de
acúmulo destes compostos, o que influencia a produtividade dos cultivos. Como
exemplo, a produção de antocianinas
em cultivos celulares de Catharanthus
roseus é dependente da percentagem de
células produtoras, quando todas as células têm similar conteúdo daquele composto.
Células diferenciadas: Como regra
geral, em plantas há uma grande correlação entre citodiferenciação e metabolismo secundário, Um aumento de 4-6
vezes no teor de alcalóides (voafilina,
aparicina, and 3S-hidroxi-voacangina),
concomitante a um incremento no nível
de diferenciação celular foi observado
em culturas celulares de Tabernaemontana pandacaqui (6). A ocorrência de
estruturas compacto-globulares (agregados celulares exibindo um alto grau
de diferenciação) foi observada em cultivos de Tabernaemontana and Cinchona, os quais produziram quantidades
bastante superiores dos alcalóides aspidospermatanos valesamina e O-acetilvalesamina e de quinina, respectivamente,
em relação ao controle. Ao longo da
última década, o cultivo de meristemas e
raízes recebeu grande atenção quanto
ao seu potencial como sistema produtor
26
Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento
cas (biorreatores com nebulização, e.g.),
dificultando a produção de biomassa em
larga escala, com um consequente aumento nos custos de produção.
Figura 4. Estrutura de oligossacarídeos elicitores isolados de parede celular de (a) plantas e fungos
(b, c, e d). O grau de polimerização (n) varia de 11 a 14 (Hahn et
al., 1992)
de compostos bioativos. Os resultados
têm demonstrado valores de produtividade nos cultivos semelhantes aqueles
observados na planta ex vitro, ou mesmo
valores mais elevados, via manipulação
epigenética. Uma metodologia que tem
despertado grande interesse neste contexto é a transformação genética de
(A)
(B)
Figura 5. Aspectos estruturais de
moléculas sinalizadoras em células
vegetais: [A] ergosterol e [B] ácido
jasmônico (R = H), ou seu metil
éster (metil jasmonato, R = CH3)
plantas com Agrobacterium rhizogenes,
uma bactéria de solo capaz de infectar
células vegetais, causando a proliferação do crescimento radicular (hairy roots).
O cultivo de raízes (ou pêlos radiculares) transformados pode ser realizado
em meio de cultura desprovido de reguladores de crescimento, apresentando
estabilidade genética e bioquímica, e
produção similar àquela observada em
raízes não-transformadas (3). No entanto, este sistema requer a utilização de
biorreatores com características específi-
Elicitação : Elicitores bióticos são
compostos que induzem respostas de
defesa em células vegetais contra infecções microbianas, em particular a produção de fitoalexinas, ou ainda induzem
aumentos no nível de fitoanticipinas
constitutivas (Fig. 2) Fitoalexinas são
compostos com atividade antibiótica, de
baixo peso molecular, formados e acumulados em células vegetais em resposta à infecções por microrganismos (Fig.
3). Elicitores de natureza abiótica (radiação UV e íons de metais pesados)
também têm sido utilizados neste contexto. Este princípio tem sido aplicado
em estudos de biossíntese de fitoalexinas, como também para aumentar a
produtividade de metabólitos secundários em cultivos celulares vegetais. Em
geral, a elicitação de uma cultura celular
resulta na síntese de novo de compostos,
algumas vezes não encontrados na planta intacta (dihidropiranocumarina, e.g.),
ou no aumento da produção de metabólitos secundários nos cultivos in vitro
(antraquinonas, e.g.). Todavia, a eficiência do tratamento com um dado elicitor,
no que concerne à indução de produtividade de um composto, depende de
vários fatores, sendo a resposta de indução restrita a certas vias biossintéticas.
Em função disto, a escolha correta do
elicitor é fundamental, não havendo
regras indicadoras de uma combinação
adequada para o sistema célula/elicitor.
Além disto, a concentração do elicitor, a
densidade de inóculo, o momento de
adição do elicitor, o período de contato
entre as células e o agente de elicitação
e o teor de nutrientes do meio de cultura
são fatores importantes a se considerar,
quando se busca a otimização da produção de biofármacos através desta abordagem. Na prática, poli/oligossacarídeos (oligossacarinas – Fig. 4) de parede
celular de plantas ou microrganismos,
enzimas (celulases, hemicelulases e pectinases, e.g.), peptídeos, glicopeptídeos
e lipídios têm sido usados como elicitores. Da mesma forma, compostos sinalizadores envolvidos em vias de transdução, como o ácido jasmônico e seu metil
éster, ou ainda o ergosterol (Fig. 5)
podem induzir respostas de estresse
celular, levando ao aumento da síntese/
acúmulo de metabólitos secundários.
Provavelmente, cada espécie vegetal tem
uma classe de compostos que são sintetizados após o estímulo causado pelo
elicitor, os quais não são
gene(s), o(s) qual(is)
encontrados na planta na
poderá(ão) ser oriundo(s)
ausência deste estímulo. Asda planta em si, de outra
sim, muitos compostos de
espécie vegetal, ou ainda
interesse, constitutivamende outro organismo (bactéte formados na planta, não
ria, e.g.). Independente do
são passíveis de indução
objetivo, a engenharia mepor elicitores em cultivos
tabólica tem como pressucelulares, como observado
posto básico o conhecimenpara quinina, morfina e vinto de todos os passos consblastina. Por outro lado,
tituintes da via biossintética
compostos outros como ⇒ Velutinol A [(15R, 16R, 20S)-14,16:15,20:16,21-triepoxi-15-16do metabólito de interesse,
ácidos fenólicos (Catharan- seco-14β,17α-pregn-5-ene-3β,15-diol] (Bento et al., 1995).
aspecto que limita a aplicathus roseus), triterpenos
ção desta abordagem, visto
(Tabernaemontana divarique a maioria destas vias
cata), velutinol A e seu
são conhecidas apenas a
derivado glicosilado (Mannível de seus intermediáridevilla velutina – Fig. 6)
os. Com o conhecimento
tiveram suas concentrações
da via biossintética a nível
aumentadas em culturas de
dos intermediários envolvicélulas. Metabólitos cuja bidos, o passo seguinte é a
ossíntese é induzida são
identificação das enzimas
usualmente produzidos em
envolvidas e a determinaaltos níveis, podendo alção de quais destas aprecançar valores de 3 a 10%,
sentam função regulatória.
com base em peso seco. A
Além disto, é importante
utilização desta estratégia
considerar outros aspectos
possibilita a indução de inintrínsecos ao processo de
cremento de produtividasíntese, como a arquitetura
Figura 6. Mandevilla velutina
de em momento específico
da via biossintética, a exis(Apocynaceae), planta nativa de
do processo produtivo. No
tência de etapas regulatóriecossistemas de restinga e
entanto, o maior problema verificado até
as, o transporte do produto final e a
cerrado no Brasil, fonte de
o presente momento reside no número
compartimentalização. A arquitetura da
velutinol A, um antagonista de
limitado de compostos que tem sua
via biossintética poderá ser linear, ou
bradicinina (BK)
biossíntese aumentada, os quais, em
mesmo apresentar-se como uma rede
alguns casos, não são o produto final de
complexa. No primeiro caso, a situação
interesse.
é mais simples no que concerne à sua
ca de células transformadas e também
manipulação, contudo, em sendo o perEngenharia Metabólica
sobre os mecanismos de regulação de
fil da via biossintética uma rede complevias biossintéticas de metabólitos secunxa de etapas (terpenóides, e.g.), a posA introdução de genes em plantas ou
dários são fatores limitantes nesta aborsibilidade de manipulação no contexto
células vegetais através de técnicas de
dagem. Entretanto, os progressos que
da engenharia metabólica é tarefa que
engenharia genética (sistema Agrobactêm sido alcançados na tecnologia gêniencontrará maior grau de dificuldade. A
terium e o bombardeamento com partíca permitirão um aumento no número
existência de mecanismos de regulação
culas metálicas coloidais, e.g.) permite a
de genes clonados, bem como um maior
a nível enzimático é bastante comum
alteração da expressão de genes envolentendimento das vias biossintéticas em
(retro-inibição), como observado na bividos em vias biossintéticas de interesse
seus aspectos estruturais e regulatórios,
ossíntese de triptofano em culturas de
e assim modificar a produção de metade modo que perspectivas interessantes
células de C. roseus. Nesta via, a superbólitos secundários. Agrobacterium tude aplicação da engenharia metabólica
expressão da antranilato sintetase (AS)
mefaciens tem sido amplamente utilizasurgem no que se refere à otimização da
não apresentou efeito positivo, porque a
da para a transformação de plantas,
produção de compostos de interesse.
mesma é inibida pelo produto final da
apresentando como maior restrição o
Num contexto mais amplo, a engenharia
via biossintética (7). Adicionalmente, é
número limitado de hospedeiros, princimetabólica objetiva o incremento do
importante considerar o efeito que a
palmente dicotiledôneas, ainda que nem
fluxo de carbono em direção ao produto
compartimentalização exerce sobre a
todas as espécies deste grupo. O bomfinal de interesse. Neste sentido, diverbiossíntese de metabólitos secundários,
bardeamento com partículas é, em prinsas estratégias têm sido utilizadas busindicando que o transporte do produto
cípio, aplicável a qualquer espécie, mas
cando superar o(s) evento(s) limitante(s),
final e/ou de intermediários da via biosainda que a transformação seja viável, a
bloqueando vias metabólicas competitisintética atuam como agentes de regularegeneração da planta a partir da célula
vas ou do catabolismo pela utilização de
ção desta. A biossíntese de alcalóides
transformada tem se mostrado uma taregenes com transcrição no sentido inverindólicos terpenoídicos requer no mínifa difícil. Além disso, a reduzida disponiso (anti-sense), ou ainda pelo uso de
mo três compartimentos : os plastídios
bilidade de genes e promotores especíanticorpos. O aumento da atividade de
[produção de triptofano e a porção terficos ao objetivo em tela, o pouco couma determinada enzima poderá ser
penoídica do produto final], o citosol
nhecimento sobre a estabilidade genéticonseguido com a clonagem de seu(s)
[descarboxilação do triptofano] e o vaBiotecnologia Ciência & Desenvolvimento
27
cúolo [ligação entre triptamina e secologanina] (8). A clonagem de genes de
plantas relacionados à vias biossintéticas
foi primeiramente realizada, em escala
comercial, com o intuito de alterar a
coloração de flores. Outra aplicação diz
respeito à introdução do gene tdc (triptamina descarboxilase) em plantas de
tabaco, resultando no aumento da produção de triptamina em níveis que atingem 1% com base em peso seco. No
entanto, a instabilidade dos cultivos celulares transgênicos em relação à produção de metabólitos secundários têm sido
mais recentemente observada, ainda que
estes apresentem níveis superiores de
expressão do produto gênico (enzima).
Por outro lado, alguns estudos têm demonstrado que a despeito da expressão
de estabilidade de clones celulares
transgênicos, o fluxo total através da
via biossintética de alcalóides indólicos apresenta um comportamento
de instabilidade, como observado
em linhagens selvagens de C. roseus.
Outra importante e óbvia conclusão
refere-se ao fato de que a superação
de uma etapa limitante da via biossintética remete, automaticamente,
ao encontro da próxima etapa com
esta característica.
discutido anteriormente. Na tentativa de
superar essas dificuldades, estratégias
para otimizar a produção in vitro de
compostos bioativos têm sido continuamente desenvolvidas e revistas, com
resultados promissores, sendo que para
o atual momento, maior atenção vem
sendo dada à utilização combinada das
abordagens anteriormente discutidas. Os
avanços em estudos de engenharia metabólica permitirão incrementos de produtividade de metabólitos secundários
nos cultivos in vitro, contribuindo para a
redução dos custos de produção, ou
mesmo viabilizando a produção de novos compostos. É importante considerar
que nos casos em que a produção de um
biofármaco não é possível por métodos
agrícolas convencionais ou químicos, ou
Conclusões
Muitos metabólitos secundários de grande importância econômica são produzidos em quantidades
muito baixas, ou ainda não são produzidos (e.g. morfina, vinblastina,
vincristina) em cultivos de células
vegetais até o presente momento.
Em decorrência disto, somente uns
poucos produtos gerados a partir
desta tecnologia alcançaram uma
escala comercial (e.g. chiconina e
misturas de polissacarídeos). A produção industrial de biofármacos a partir da
biotecnologia vegetal sugere à análise
duas questões básicas : a) a viabilidade
da tecnologia disponível b) a competitividade econômica desta tecnologia em
relação aos métodos de produção existentes. Em muitos casos, a tecnologia
disponível se mostra viável, ainda que
cálculos do custo de produção indiquem
a necessidade de incrementos de produtividade, para que tais processos sejam
adequados do ponto de vista econômico. As razões que concorrem para este
quadro são o alto investimento necessário, principalmente devido ao custo de
depreciação do biorreator e também a
baixa produtividade de metabólitos secundários dos cultivos celulares, como
28
Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento
Figura 7. Exemplos de mecanismos
de regulação de vias biossintéticas
considerados na engenharia de
metabolismo secundário. A concentração do produto final (PF) é dependente de alguns fatores: a) nível
de inibição da atividade enzimática
pelo produto (retro-inibição
A⇒E1); b) disponibilidade do substrato (B) em via não linear; c) transporte e compartimentalização. A
engenharia metabólica requer a
identificação de todos os constituintes da via biossintética (intermediários e enzimas - E1→E7)
mesmo quando sua demanda não é
totalmente suprida, a biotecnologia vegetal poderá ser o sistema final de pro-
dução.
Referências Bibliográficas
1) Hegnauer, R.; Hegnauer M. (1992).
Chemotaxonomie der Pflanzen. Generalregister, Birkhäuser Verlag, Basel.
2) Ohta, S.; Verpoorte, R. (1992).
Ann. Rep. Nat. Sci. Home Econ., 32:923.
3) Schlatmann, JE. (1995). Ajmalicine production by Catharanthus roseus. Process operation and modelling. Ph.D thesis, Delft University of
Technology, The Netherlands.
4) Maraschin, M. (1998). Variação
somaclonal, metabolismo de carbono
e caracterização bioquímica e imunológica nos cultivos celulares de Mandevilla velutina (MART) WOODSON
(Apocynaceae). Tese de Doutorado, Departamento de Bioquímica/
UFPR.
5) Contin, A.; Collu, G.; van der
Heijden, R.; Verpoorte, R. (1999).
Plant Physiol. Biochem., 37:139144.
6) Sierra, MI.; van der Heijden, R.;
Schripsema, J.; Verpoorte, R. (1991)
Planta Medica, 57:543-547.
7) Bongaerts, RJM. (1998). The chorismate branching point in Catharanthus roseus. Aspects of anthranilate synthase regulation in relation
to indole alkaloid biosynthesis. Ph.
D. thesis, Leiden University, The
Netherlands.
8) Verpoorte, R.; van der Heijden,
R.; Gulik, WM.; Hoopen, HJG.(1997).
The Alkaloids, 40:1-187.
9) Lo, SCC.; Nicholson, RL. (1998).
Plant Physiology, 116:979-989.
10) Barz, W.; Mackenbrock, U.
(1994). Plant Cell, Tissue and Organ
Culture, 38:199-211.
11) Keen, NT. (1990). Phytoalexins
and Their Elicitors. In : Chemistry and
Biochemistry of Microbial-Plant Interactions, Hoagland, RE, (ed.). ACS Symposium Series, Stoneville.
12) Hahn, MG.; Cheong, JJ.; Alba, R.;
Enkerli, J.; Côte, F. (1992). Oligosaccharides elicitors: structures and recognition. In : Mechanisms of Plant Defense
Response, Fritig, B; Legrand, M. (ed.).
Kluwer Academic Publ. Dordrecht.
13) Bento, E. S.; Calixto, J. B.; Hawkes,
G. E.; Pizzolatti, M. G.; Sant’Ana, A. E. G.
& Yunes, R, A. The structure of velutinol
A is (15R, 16R, 20S)-14,16:15,20:16,21triepoxy-15-16-seco-14b,17a-pregn-5ene-3b,15-diol. A combined quantitative
Overhauser effect and molecular modelling study. J. Chem. Soc., Perkin Trans.,
2:1359-1366, 1996.