RESPOSTAS DESAFIO 3
OBSERVAÇÕES
Questão prévia: Onde o DNA está presente e como podemos isolá-lo?
Considere a descrição de um protocolo.
Verifique que o DNA também está presente em
outras organelas.
O DNA está presente no núcleo das células de qualquer organismo, dentro
de pequenos pacotes genéticos chamados cromossomos. Para isolá-los os
cientistas separaram-no dos outros componentes celulares.
1. Por que o material precisa ser macerado para isolar o DNA?
O material deve ser macerado para que a parede celular, uma estrutura
espessa e rígida presente em células vegetais, seja rompida.
2. Qual o papel do detergente presente na solução de lise no processo de
extração do DNA?
A função do detergente é desestruturar as moléculas de lipídios das
membranas biológicas. Desta maneira, as membranas sofrem ruptura e
todo o conteúdo celular – inclusive o DNA – fica disperso na solução.
3. De que é composta a molécula de DNA?
A molécula de DNA é constituída por duas longas cadeias de nucleotídeos,
que são formados por um grupo fosfato, uma pentose (a desoxirribose) e
uma base nitrogenada. Ao longo da molécula observamos a existência de
quatro tipos de nucleotídeos, de acordo com a base nitrogenada que
apresentam: adenina (A), timina (T), citosina (C) e guanina (G).
4. Visto que o DNA não é solúvel em álcool, o que ocorre com suas
moléculas quando colocadas neste meio?
As moléculas se agrupam, pois o álcool desidrata o DNA, de forma que este
não mais fica dissolvido no meio aquoso. Como o DNA tem menor
densidade que os outros constituintes celulares, ele surge na superfície do
extrato. Quanto mais gelado o álcool, menos solúvel será o DNA
5. Responda novamente a questão prévia e compare com a resposta dada
antes de realizar esta atividade.
O DNA está presente no núcleo das células de qualquer organismo, dentro
de pequenos pacotes genéticos chamados cromossomos. Para isolá-los os
cientistas separaram-no dos outros componentes celulares. As células são
fragmentadas e o DNA é separado do conteúdo lipídico das membranas da
célula e dos organitos. Em seguida o DNA é separado das proteínas.
PROTOCOLO PARA OBTENÇÃO DE DNA DE DOIS VEGETAIS (GOIABA E
TOMATE)
MATERIAL
-1 TOMATE E 1 GOIABA
-1 PENEIRA
-2 SACOS PLÁSTICOS
-DETERGENTE NEUTRO
-SAL DE COZINHA
-ÁGUA QUENTE
-COPOS DESCARTÁVEIS
-PALITOS DE CHURRASCO
-ÁLCOOL ANIDRO 96° REFRIGERADO A APROXIMADAMENTE 10°C
-1 COLHER DE CHÁ
-TUBOS PLÁSTICOS
N/D
PROCEDIMENTO:
1. CORTAR AS FRUTAS EM PEDAÇOS PEQUENOS PARA AUXILIAR NO
PROCESSO DE MACERAÇÃO DAS MESMAS;
2. AMASSAR OS PEDAÇOS COM O AUXÍLIO DO SACO PLÁSTICO;
3. APÓS O PROCESSO DE MACERAÇÃO, PASSAR A PASTA FORMADA PARA O
COPO DESCARTÁVEL;
4. ADICIONAR UMA PEQUENA QUANTIDADE DE DETERGENTE NEUTRO
SOBRE A SUBSTANCIA MACERADA;
5. ACRESCENTAR UMA COLHER DE CHÁ DE SAL DE COZINHA CHEIA A
MISTURA;
6 ADICIONAR ÁGUA QUENTE PREENCHENDO TODO O COPO, MISTURAR
COM O AUXÍLIO DE UMA COLHER EVITANDO A FORMAÇÃO DE ESPUMA;
7. COAR COM UMA PENEIRA NORMAL, LEVANDO O MATERIAL FILTRADO
PARA UM NOVO COPO PLÁSTICO;
8.ADICIONAR EM CADA TUBO PLÁSTICO UM TIPO ESPECIFICO DE MISTURA
(GOIABA E TOMATE) NA QUANTIDADE DE 6 ML EM CADA TUBO E
COMPLETAR COM A MESMA QUANTIDADE DE ÁLCOOL (6 ML)
DELICADAMENTE SEM AGITAR, FORMANDO UMA CAMADA BIFÁSICA POR
DIFERENÇA DE DENSIDADE;
9. OBSERVAR O APARECIMENTO DE UMA "NUVEM" OU O AGLOMERADO
DE DNA;
10. COM O AUXÍLIO DE UM PALITO, RETIRAR O AGLOMERADO DE DNA DA
SOLUÇÃO PARA FACILITAR A VISUALIZAÇÃO.
1. Por que o material precisa ser macerado para isolar o DNA?
O Alimento deve ser macerado para que a parede celular (estrutura
espessa e rígida presente em células vegetais) seja rompida. Esse
procedimento também dissocia os tecidos, permitindo que a solução de lise
(água, detergente e cloreto de sódio) aja sobre um número maior de
células, liberando um grande número de moléculas de DNA.
2. Qual o papel do detergente presente na solução de lise no processo de
extração do DNA?
O detergente desestrutura as moléculas de lipídio das membranas
biológicas, sofrendo estas, a ruptura e todo o conteúdo celular fica disperso
na solução (incluindo também o DNA).
3. De que é composta a molécula de DNA?
É formada por fita dupla de unidades menores chamadas nucleotídeos e
estas estruturas são formadas por uma pentose (açúcar de cinco carbonos)
associada a um ou mais grupos fosfato e a uma base nitrogenada (adenina,
guanina, timina e citosina). As duas cadeias unem-se através de pontes de
hidrogênio entre as bases nitrogenadas dos nucleotídeos.
4. Visto que o DNA não é solúvel em álcool, o que ocorre com suas
moléculas quando colocadas neste meio?
O álcool provoca a desidratação do DNA e suas moléculas passam a se
agrupar. O DNA tem menor densidade que os outros constituintes da
célula, surgindo na superfície do extrato.
5. Responda novamente a questão prévia e compare com a resposta dada
antes de realizar esta atividade.
Através de estudos, sabemos que a maior parte do DNA se encontra no
núcleo da célula, mas não temos ideia de como isolá-lo. Depois do
experimento aprendemos que existem várias técnicas e procedimentos que
torna possível (comprovadamente) a extração do ácido desoxirribonucléico,
formando uma "nuvem de forma condensada".
Considere a descrição de um protocolo.
EXTRAÇÃO DE DNA VEGETAL
MATERIAL
* ½ de cebola grande e 1 banana;
* 01 faca de cozinha
* 01 potinho graduado;
* 01 coador de chá;
* 01 pilão plástico;
* 02 tubos de 50 mL com tampa;
* 01 colher de chá
* 01 potinho dosador;
* 01 pote plástico grande para manter o álcool gelado;
* Gelo;
* Água quente (70° C);
* 01 pano para limpeza;
* 20mL de álcool etílico 99,5° gelado (a cerca de 10° C);
* 10 mL de solução de lise (7 mL de água destilada + 1 colher de detergente
neutro e incolor + 1 colher de cloreto de sódio puro);
* Corantes Hematoxilina e Azul de metileno;
* Lâminas e lamínulas;
* Microscópio óptico.
PROCEDIMENTO
* Retirar a casca da cebola e cortá-la em pedaços bem pequenos. No caso
da banana fazer o mesmo;
* Macerar os pedaços com auxílio do pilão até formar uma pasta. Se
necessário acrescentar uma quantidade mínima de água;
* Com o auxílio da colher colocar o macerado na peneira apoiada sobre o
potinho dosador e pressionar contra a malha, de modo a peneirar o
material;
* Preparar a solução de lise misturando o cloreto de sódio, a água e o
detergente incolor. O detergente permite a desestruturação das moléculas
de lipídios das membranas biológicas. O sal proporciona o ambiente
favorável para a extração de DNA, neutralizando a carga negativa dos
grupos fosfatos dessa molécula;
* Usar o potinho graduado para colocar 10 mL de solução lise no tubo de 50
mL e adicionar em seguida ao mesmo tubo 10 mL do caldo peneirado;
* Tampar o tubo e movimentá-lo suavemente, evitando a formação de
espuma, até que o caldo se misture com a solução de lise;
* Colocar o tubo na vasilha com água quente(70º) e deixar em banho-maria
por 20 minutos. Temperaturas menores que 70°C requerem maior tempo
de incubação.
* Em uma única vasilha poderão ser colocados os tubos dos dois vegetais. A
temperatura elevada promove agitação das moléculas, facilitando a ação
do detergente em desestabilizar as membranas lipídicas;
* Retirar o tubo da água quente e colocar em um banho de gelo por 5
minutos. O resfriamento do filtrado no gelo permitirá a precipitação do
DNA.
* Adicionar lentamente, com o auxílio de uma pipeta, 20 mL de álcool
etílico 99,5° gelado, deixando escorrer pela parede do tubo. Adicionar o
álcool gelado em velocidade lenta auxilia na eficiência de precipitação do
DNA;
* A molécula de DNA não é solúvel em álcool e, desta maneira, tende a
formar um aglomerado de moléculas quando em meio alcoólico. Observar
o aparecimento do aglomerado de DNA como uma “nuvem” branca na fase
alcoólica. Caso ainda não seja possível a visualização, misture
delicadamente a amostra e aguarde 5 minutos;
* Como a banana apresenta uma alta quantidade de pectina, o que dificulta
a correta identificação do DNA, pode-se retirar com uma pipeta Pasteur a
camada de pectina, apresentada como uma camada cheia de bolhas e de
consistência de geleia.
Verifique que não é possível visualizar DNA no
microscópio óptico.
* Com o auxílio da colher de chá, retirar o aglomerado filamentoso de DNA
da solução.
* Separar duas amostras do aglomerado filamentoso de DNA e colocar um
corante (Hematoxilina e Azul de Metileno) diferente em cada uma das
amostras a fim de obter uma melhor visualização do aglomerado de DNA.
* Com o bastão ou palito de dente, faça movimentos circulares no
aglomerado corado e coloque em uma lâmina cobrindo com lamínula.
Observe os filamentos de DNA na objetiva 40.
Resposta – pergunta inicial
O DNA é encontrado nos cromossomos das células, nos animais e vegetais
nas mitocôndrias, e nos vegetais, nos cloroplastos. O rompimento precisa
de diversas técnicas nos laboratórios.
Questão 1.
Para que ocorra o rompimento celular e os produtos químicos utilizados
cheguem mais facilmente em todas as células.
Questão 2.
A membrana plasmática e membrana nuclear são compostas
principalmente por lipídeos (gorduras). A função do detergente é
desestruturar as moléculas de lipídeo das membranas biológicas. Dessa
maneira, as membranas sofrem ruptura e todo o conteúdo celular e
inclusive o DNA, fica disperso na solução.
Questão 3.
A molécula de DNA é composta por uma fita dupla de nucleotídeos. As duas
cadeias unem-se através de pontes de hidrogênio entre as bases
nitrogenadas dos nucleotídeos.
As cadeias de nucleotídeos são formadas por uma pentose (açúcar de cinco
carbonos) associada a um ou mais grupos fosfato e a uma base
nitrogenada.
O DNA é composto por uma desoxirribose e um grupo fosfato. As quatro
bases nitrogenadas contidas no DNA são: adenina, citosina, guanina e
timina.
Questão 4.
O álcool desidrata o DNA, de maneira que este não fica mais dissolvido no
meio aquoso. Além disso, o DNA tende a não ser solúvel em álcool e assim,
suas moléculas se agrupam. Como o DNA tem menor densidade que os
outros constituintes celulares, ele surge na superfície do extrato. Quanto
mais gelado o álcool, menos solúvel será o DNA.
Questão 5.
Antes podia-se pensar que isolar o DNA fosse um processo bastante
complexo, o que a experiência mostrou não ser. Também pode-se observar
que existem diversas proteções envolvidas com o DNA, e que precisam ser
rompidas para a sua extração, como: a membrana plasmática, parede
celular e carioteca. E os componentes da lise servem para isso.
Protocolo
A diminuição da temperatura, da solução no final do protocolo, pode
aumentar facilmente a visualização do DNA. A diminuição da temperatura
diminui também o coeficiente de solubilidade da solução (o DNA fica cada
vez mais precipitado e evidente).
N/D
Questão Previa:
Onde o DNA está presente e como podemos isolá-lo?
O DNA está presente no núcleo das células e para isolá-lo requer a
utilização de meios específicos, como laboratórios adequados e pessoas
capacitadas.
N/D
1. Por que o material precisa ser macerado para isolar o DNA?
O maceramento das frutas permite a execução do processo rompimento da
parede celular espessa rica em pectina, (A pectina é o componente mais
importante na união das paredes celulares das plantas e frutas. É
quimicamente um polissacarídeo). Dessa forma, rompe-se a membrana
que cerca o núcleo, facilitando sua visualização e garantindo a eficácia da
solução de lise que será posteriormente adicionada.
2. Qual o papel do detergente presente na solução de lise no processo de
extração do DNA?
A membrana plasmática celular possui uma bicamada de fosfolipídios em
sua composição. Sendo os lipídios insolúveis em água, o detergente, que
possui caráter anfifílico (estrutura química com uma parte polar e outra
apolar) e um componente denominado lauril sulfato de sódio, desfaz as
ligações fosfolipídicas, causando a desintegração do núcleo e cromossomos
e deixando o DNA e todo o conteúdo celular disperso no álcool.
3. De que é composta a molécula de DNA?
O DNA é formado por duas cadeias de nucleotídeos, e cada nucleotídeo é
formado por uma molécula de desoxirribose, uma molécula de fosfato e
uma base nitrogenada. As cadeias de nucleotídeos ligam-se entre si por
fortes pontes de hidrogênio, formando uma dupla hélice.
4. Visto que o DNA não é solúvel em álcool, o que ocorre com suas
moléculas quando colocadas neste meio?
O álcool gelado causa a desidratação nas moléculas de DNA, fazendo com
que as mesmas encontrem-se em um estado de aglutinação. Como o DNA
possui densidade mais baixa do que os outros componentes celulares, ele
se eleva à superfície, sobre o álcool e a solução de lise com a fruta,
formando uma massa filamentosa e esbranquiçada, o que proporciona o
surgimento de uma outra fase na mistura heterogênea recém formada pelo
álcool gelado e o ambiente salino.
5) Responda novamente a questão prévia e compare com a resposta dada
antes de realizar esta atividade.
Questão prévia: Mas onde o DNA está presente e como podemos isolá-lo?
Sabemos que o DNA está presente no núcleo das células e achávamos que
para isolá-lo seria necessário a utilização de meios específicos, como
laboratórios adequados e pessoas capacitadas. Mas com a realização do
experimento abaixo( Protocolo modificado)
Podemos perceber que é muito simples sem precisar de laboratório pelo
menos pra extrair o DNA de frutas...A extração do DNA, uma das etapas do
seu estudo, é acessível e está ao alcance de todos. Conseguimos isolá-lo de
forma simples, conforme o protocolo modificado por nossa equipe.
PROTOCOLO MODIFICADO:
EXTRAÇÃO DO DNA DO MORANGO
Materiais:
- 03 morangos
- 01 faca
- - 01 potinho graduado( copo de Becker) ou copo de vidro comum
- 01 colher de chá de sal e detergente
- 01 peneira
- 01 saquinho transparente
- 15 mL de água quente( 3 colheres de sopa cheias) 50°C .
- 25 mL de álcool etílico hidratado de 46º ou 70º, gelado ( o de 70º aparece
o resultado mais rápido) ou 5 colheres de sopa cheias.
- Termômetro.
Procedimento:
- Macerar os morangos no saquinho
- Acrescentar o sal, o detergente e a água quente ao saco
- Peneirar o material
- Colocar o material no potinho graduado( copo de Becker) ou copo de
vidro comum e acrescentar o álcool
EXTRAÇÃO DO DNA DA BANANA
Materiais:
- ½ banana
- 01 faca
- 01 potinho graduado(copo de Becker) ou copo de vidro comum
- 01 colher de chá de sal e detergente
- 01 peneira
- 01 saquinho transparente
- 15 mL de água quente (3 colheres de sopa cheias) 50°C .
- 25 mL de álcool etílico hidratado de 46º ou 70º, gelado ( o de 70º aparece
o resultado mais rápido) (5 colheres de sopa cheias)
- Termômetro.
Procedimento:
- Macerar a banana no saquinho
- Acrescentar o sal, o detergente e a água quente ao saco
- Peneirar o material
- Colocar o material no potinho graduado e acrescentar o álcool pelas
paredes do copo.
O procedimento e materiais utilizados foram pensados e alterados de modo
que viesse a facilitar ainda mais essa prática. Como por exemplo, o uso do
álcool etílico mais comum e facilmente encontrado. Mesmo simplificando
ainda mais, pudemos observar a otimização do resultado. Conforme as
fotos enviadas por email o DNA da BANANA e Do Morango ficam bem
evidentes.
Realizamos nossa prática no laboratório da nossa escola, mas pode ser feito
de maneira simples e segura na sala de aula mesmo ou até em casa.
Com as respostas do documento já enviadas, respondo então o desafio.
Uma nova forma de extração do DNA:
1. Macerar bem o material escolhido.
2. Misturar o material macerado a 2/3 de água quente de um copo de
200ml.
3. Adicionar o detergente e o sal. Misture sem fazer bolha.
4. Deixe descansar por cinco minutos.
5. Adicione o álcool gelado devagar, escorregando-o na parede do
recipiente para que o mesmo vá para o fundo do recipiente.
6. Espere em torno de cinco minutos e o DNA estará visível.
QUESTÃO PRÉVIA
É provável que você tenha visto na mídia que, hoje em dia, é muito fácil
fazer um teste de paternidade e obter resultados confiáveis, ou que o
mapeamento e sequenciamento do genoma humano pode “abrir portas”
para a cura de muitas doenças. Para ter acesso a todas as informações
contidas no DNA, o primeiro procedimento a ser realizado é seu
isolamento.
N/D
Verifique que o DNA também está presente em
outras organelas.
A técnica de isolamento foi desenvolvida há mais de 50 anos e foi a partir
dela que os cientistas conseguiram desvendar a estrutura da molécula de
DNA em 1953. Mas onde o DNA está presente e como podemos isolá-lo?
Resposta: O DNA pode ser encontrado dentro do núcleo de todas as
células. Ele pode ser isolado a partir da mistura da substância amassada,
com sal, álcool e água quente. Colocado num copo e esperado a mistura se
assentar, o DNA se forma na parte superior do líquido.
MATERIAL
• 3 morangos;
• 1 Becker;
• 1 coador de chá;
• 1 saco plástico;
• 1 colher de chá de detergente;
• 1 colher de chá de sal;
• Geladeira para manter o álcool gelado;
• 150 mL Água quente (60o C);
• 200 mL de álcool etílico 70%, gelado (a cerca de 10o C);
• 1 palito de churrasco
PROCEDIMENTO
• Retirar apenas as folhas do ápice dos morangos;
• Macerar os morangos dentro do saco plástico com o auxílio das mãos;
• Com o auxílio da colher colocar o sal e o detergente dentro do saco
plástico e misturar;
• Na peneira apoiada sobre o Becker coloca a solução que estava dentro do
saco plástico e adiciona 150ml de água quente;
• Lentamente, adiciona 200 mL de álcool etílico gelado, deixando escorrer
pela parede do Becker;
• Observar o aparecimento do aglomerado de DNA como uma “nuvem”
branca na fase alcoólica.
• Caso ainda não seja possível a visualização, misture delicadamente a
amostra e aguarde 5 minutos;
• Com o auxílio do palito de churrasco, retirar o aglomerado filamentoso de
DNA da solução.
QUESTÕES
1. Por que o material precisa ser macerado para isolar o DNA?
RESPOSTA: Devido o DNA localizar-se dentro da célula, para que seja
separado, será necessário retirá-lo de dentro dela, esse processo de
maceração promove o rompimento da parede celular facilitando, assim, o
contato com os produtos químicos posteriormente a serem utilizados para
o efetivo isolamento.
2. Qual o papel do detergente presente na solução de lise no processo de
extração do DNA?
RESPOSTA: O detergente vai destruir a membrana plasmática, além de que
ela é composta por lipídeos que é insolúvel em água ,mas não em álcool
que contém no detergente. Que com a quebra dessa membrana o
conteúdo celular DNA e Proteína se dispensa na solução.
3. De que é composta a molécula de DNA?
RESPOSTA: O DNA é uma molécula composta de duas fitas complementares
que se unem e formam uma estrutura em hélice, por causa das duas fitas
denomina-se "dupla hélice", bem parecido com uma escada em espiral,
cuja composição química é de açúcares (pentose: desoxirribose), fosfatos e
bases nitrogenadas (Adenina, Timina, Guanina e Citosina). A adenina vai se
ligar a timina fazendo uma ligação dupla, enquanto a citosina vai se ligar a
guanina fazendo uma tripla.
4. Visto que o DNA não é solúvel em álcool, o que ocorre com suas
moléculas quando colocadas neste meio?
RESPOSTA: Adicionando álcool na solução e sendo ele mais denso que o
DNA e o DNA não solúvel em álcool, o ato resulta na separação da molécula
do DNA do resto do soluto, formando uma mistura heterogênea.
5. Responda novamente a questão prévia e compare com a resposta dada
antes de realizar esta atividade.
RESPOSTA: Como foi respondido antes, o DNA está presente dentro de cada
célula do corpo humano, mais precisamente, dentro do núcleo. Para
isolarmos o DNA, primeiro amassamos os morangos para romper a parede
celular. Depois colocamos sal para as células sofrerem osmose. Em seguida,
colocamos detergente para destruir a membrana celular (que é feita de
lipídios). E por último acrescentamos álcool, pois o material genético não se
mistura com o álcool, ocorrendo assim a separação e o DNA ficando visível
em forma de espuma.
Questão prévia:
O DNA, que carrega as informações genéticas, está, na sua maioria, contido
no núcleo das células eucariontes e no citoplasma das células procariontes.
Acreditamos que poderemos isolar o DNA através do experimento, pois
temos a ideia de que ele não é solúvel em álcool. Sendo assim, acreditamos
que ficará preso à fase alcoólica, mas não misturado à ela.
Questão 1:
Os materiais são macerados para romper as paredes e membranas
celulares e expor mais superfície de contato do interior das células com os
produtos químicos.
Questão 2:
O detergente é responsável por dissolver os lipídios presentes nas
membranas celulares, desestruturando-as e dispersando o material interno
(inclusive o DNA) na solução.
Questão 3:
A molécula do DNA (Ácido DesoxirriboNucleico) é composta por um fita de
dupla hélice de nucleotídeos, cujas ligações são feitas por pontes de
hidrogênio. Um nucleotídeo é formado por uma pentose (açúcar com cinco
carbonos), um grupo fosfato e uma base nitrogenada. No caso do DNA,
temos como pentose a desoxirribose e como bases nitrogenadas a adenina,
a guanina, a timina e a citosina. As duas primeiras chamam-se púricas e as
duas últimas pirimídicas.
Questão 4:
Já que o DNA não é solúvel em álcool, suas moléculas se agrupam e, sendo
menos densas que o restante dos materiais celulares, passam a surgir na
superfície da solução.
Questão 5:
Em relação à pergunta inicial, mantemos a resposta. O DNA está presente
em todas as células. Porém, ao realizar o experimento, percebemos a fácil
acessibilidade ao mesmo, de tal forma que não imaginávamos existir. Um
processo de simples passos nos proporcionou a observação da vida.
Alterações do protocolo:
Seguimos todos os passos, com exceção de dois. No lugar de tubos, usamos
béqueres para melhorar a visualização. Além disso, não usamos pilões para
macerar. Inserimos os vegetais em plásticos fechados e maceramos
manualmente, obtendo resultados mais rápido e facilmente.
N/D
MATERIAL
1 manga ou 1 kiwi
1 faca de cozinha
1 funil
1 Béquer
1 pilão
1 filtro de papel
1 sacos plástico
1 colher de sopa de detergente
1 pitada de sal
20 ml de agua fervida
20 ml de álcool gelado
PROCEDIMENTO
• Retire a casca da manga e corte-a em pequenos pedaços. No caso do kiwi
fazer o mesmo.
• Macere os pedaços com auxílio do pilão até formar uma mistura
homogênea.
• Acrescente uma colher de sopa de detergente, uma pitada de sal e 20 ml
de água fervida. Misture bem.
• Em seguida, peneire a mistura no béquer utilizando funil e filtro de papel.
• Acrescente 20 ml de álcool gelado e aguarde dois minutos.
Questões
QUESTÕES:
1) Por que o material precisa ser macerado para isolar o DNA?
Além da membrana plasmática, as células vegetais são revestidas pela
parede celular, que é mais resistente. O material é macerado para quebrar
esta primeira “barreira” da célula e para expor a membrana plasmática que
será desagregada pelo detergente.
2) Qual o papel do detergente presente na solução de lise no processo de
extração do DNA?
A membrana plasmática possui uma composição lipoproteica, e o
detergente, por ser polar e apolar, consegue causar a ruptura da
membrana desagregando seus lipídios. Desse modo, o citoplasma é
liberado no meio. A membrana nuclear também possui composição
lipoproteica, e é também desagregada pelo detergente, liberando o
material nuclear na solução, incluindo o DNA.
3) De que é composta a molécula de DNA?
O DNA é composto por uma desoxirribose e as bases nitrogenadas são
Adenina, Guanina, Citosina e Timina. É formado por dois filamentos
enrolados (duas cadeias de nucleotídeos) formando uma dupla hélice
ligada por pontes de hidrogênio.
4) Visto que o DNA não é solúvel em álcool, o que ocorre com suas
moléculas quando colocadas neste meio?
O DNA fica suspenso no meio e assim poderá ser visualizado facilmente. O
álcool e o DNA são menos densos que a água e por isso fica na parte
superior da solução.
5) Responda novamente a questão prévia e compare com a resposta dada
antes de realizar esta atividade.
As moléculas e o álcool não se misturam, estas são desidratadas pelo
álcool.
N/D
QUESTÃO PRÉVIA
Toda a informação necessária para criar um organismo encontra-se no
DNA. Esta molécula é usada durante o período de vida de um organismo
para fornecer instruções para milhões de processos celulares que ocorrem
constantemente.
Para esse desafio decidimos escolher uma forma prática e de baixo custo
para realizá-lo, utilizando apenas materiais encontrados no nosso âmbito
escolar.
MATERIAL
*Duas fontes vegetais de DNA
*Sal grosso
*Detergente
*Água fria
*Liquidificador
*Coador
*Seis béqueres
*Etanol gelado 96°
PROCEDIMENTO
As membranas celulares e nucleares das células são desagregadas com
detergente, em solução salina, liberando os ácidos nucleicos que
precipitam com a adição de etanol gelado.
A- Preparação da amostra
Escolher e triturar a fonte de DNA. Bater no liquidificador durante 20
segundos. Adicionar água. Coar a massa, até obter um suco espesso.
B-Teste de pectina
Separar uma parte do suco e misturar com uma quantidade equivalente de
etanol. Agitar a mistura, deixar repousar e observar o precipitado formado.
(Figura 1)
Interpretando: Um coágulo frágil, mais ou menos gelatinoso, que se rompe
quando é feita uma agitação leve indicando um teor médio de pectina.
C- Lise das membranas celulares
No resto do suco, dissolver uma pitada de sal grosso antes de acrescentar
duas colheres de detergente. Misturar suavemente e deixar em repouso
durante 10 minutos. Observar a lise das membranas celulares. (Figura 2)
D-Precipitação do DNA vegetal
Acrescentar um volume equivalente de etanol gelado, com cuidado para
não misturar as camadas, de forma a observar os agregados formados.
(Figura 3)
CONCLUSÃO
O DNA é solúvel em álcool, mas torna-se insolúvel na presença de sal
(NaCl), porque o sódio neutraliza a carga negativa dos grupos fosfatos. O
etanol formará uma camada na superfície por ser menos denso que a
solução aquosa. (Figura 4)
N/D
Questão prévia - No núcleo das células. Podemos isolá-lo através do
rompimento das membranas.
Considere a descrição de um protocolo.
1 - Porque ao macerar, há a separação das células.
2 - O detergente tem a função de limpar a gordura da membrana
plasmática.
3 - Bases nitrogenadas (adenina, guanina, citosina e timina), pentose
(desoxirribose) e fosfato.
4 - O álcool desidrata as moléculas.
5 - Mesma conclusão da questão prévia.
MATERIAL
• 1 cebola média e/ou 1/3 de banana
• 01 faca de cozinha;
• 01 potinho graduado;
•01 palito de churrasco
• 01 coador de chá;
• 01 pilão de madeira;
• 02 sacos plásticos transparentes de supermercado;
• 04 tulipas de chope ou copos grandes;
• 01 colher de chá;
• 01 pote plástico grande para manter o álcool gelado;
• 01 recipiente de plástico para colocar a água quente
e um colher de chá de detergente neutro
• Gelo;
• Sal (Na Cl)
• Água quente (60o C);
• 01 pano para limpeza;
• 40 mL de álcool etílico (20 ml para cada copo ou tulipa) 90 ˚ ou 92 o
gelado (a cerca de 10o C);
• 300 mL de solução de lise (água + detergente + sal de cozinha), sendo
150ml para cada copo;
PROCEDIMENTO
• Retirar a casca da cebola e cortá-la em pedaços bem pequenos. No caso
da banana fazer o mesmo.
• macerar os pedaços bem picados com auxílio do pilão dentro dos sacos
plástico. No caso, a cebola e a banana em sacos diferentes até a máxima
textura de pasta.
Se necessário acrescentar , em cada saco, uma quantidade mínima de água
com uma colher de chá de sal de cozinha;
• Com o auxílio da colher colocar os macerados em copos contendo a água
quente e uma colher de detergente neutro em cada tulipa;
• movimentá-lo suavemente, evitando a formação de espuma, até que o
macerado se misture com a solução de lise e aguardar de 5 a 10 minutos
onde as duas tulipas ou copos ficaram por mais 5 minutos em um
recipiente com gelo;
• Em seguida, peneirar os macerados em outras duas tulipas com peneira
apoiada sobre estas e pressionar o macerado com cuidado;
• logo após essa etapa, adiciona-se o álcool gelado com cuidado pelas
bordas da tulipa;
• Aguardando alguns minutos
• Observar o aparecimento do aglomerado de DNA como uma “nuvem”
N/D
branca na fase alcoólica.
• Caso ainda não seja possível a visualização, misture delicadamente a
amostra e aguarde 5 minutos;
• Com o auxílio do palito, retirar o aglomerado filamentoso de DNA da
solução.
Algo interessante na tulipa da banana é a presença da pectina
(polissacarídeo formado por monômeros de ácido galacturônico unidos
entre si por ligações glicosídicas. Suas moléculas compõem a parede celular
de vegetais produtores de sementes, desempenham a função de
cimentação intercelular e atuam de forma conjunta com outros
polissacarídeos, como a celulose e hemicelulose) flutuando como um gel .
QUESTÃO PRÉVIA
É provável que você tenha visto na mídia que, hoje em dia, é muito fácil
fazer um teste de paternidade e obter resultados confiáveis, ou que o
mapeamento e seqüenciamento do genoma humano pode “abrir portas”
para a cura de muitas doenças.
Para ter acesso a todas as informações contidas no DNA, o primeiro
procedimento a ser realizado é seu isolamento. A técnica de isolamento foi
desenvolvida há mais de 50 anos e foi a partir dela que os cientistas
conseguiram desvendar a estrutura da molécula de DNA em 1953. Mas
onde o DNA está presente e como podemos isolá-lo?
RESPOSTA
Onde se encontra o DNA na célula?
Cerca de 99% do DNA encontra-se no núcleo da célula. O restante DNA
encontra-se em locais específicos como, por exemplo, organelas (as
mitocôndrias e os cloroplastos possuem o seu próprio DNA), no citoplasma
de seres procariontes (bactérias e cianobactérias) já que não possuem
carioteca. Pode ser encontrado no interior de vírus , envolvidos por
proteínas denominadas capsômeros que constituem o capsídeo e junto
com o envelope de alguns vírus com o HIV no nucleocapsídeo.
O isolamento acontece separando as membranas, celular e nuclear que
são compostas principalmente por lipídios. As proteínas encontram-se
aprisionadas na bicamada lipídica. Os organoides celulares são compostos
por proteínas, ácidos nucleicos (DNA e RNA), envolvidos por uma
membrana. As paredes celulares das células vegetais são compostas
essencialmente por polissacarídeos. As pequenas estruturas celulares são
compostas por substâncias com diferentes propriedades químicas, pelo que
os procedimentos experimentais devem ser definidos de modo a separar
um determinado constituinte celular das restantes partes, sem causar
muitos danos.
QUESTÕES
1. Por que o material precisa ser macerado para isolar o DNA?
Resposta: O ato de macerar (espremer ou empurrar um corpo para extrairlhe o liquido) é necessário, pois se colocássemos o material vegetal todo
haveria dificuldade de ação dos produtos químicos no alimento. A solução
que é feita com o objetivo de romper as membranas da célula e a parede
celular celulósica. Esta experiência não irá conseguir ser completada se não
houver maceração , pois é a partir dela que as células, por se encontrarem
em grupos menores que a situação anterior, conseguem sofrer a
modificação necessária para a extração do DNA, aumentando assim a
fragilização de seus envoltórios e aumentando a superfície de contato dos
componentes extras e intracelulares facilitando a liberação principalmente
dos constituintes do núcleo.
2. Qual o papel do detergente presente na solução de lise no processo de
extração do DNA?
Resposta : Os detergentes são normalmente empregados para dissolver
gorduras ou lipídios. Como a membrana celular e a membrana nuclear
(carioteca) que tem em sua composição química uma grande quantidade de
lipídios (natureza fosfolipoproteica), sob a ação do detergente, estes se
tornam solúveis e são extraídos com as proteínas que também fazem parte
das membranas.
3. De que é composta a molécula de DNA?
Resposta: O DNA, ácido desoxirribonucleico, é de fundamental importância
para diversos organismos e estruturas moleculares presentes na Terra,
desde vírus até as plantas, pois ele carrega sequências únicas de genes
capazes de representar características do indivíduo. A tal molécula dupla
fita é constituída pelos chamados nucleotídeos. Esses, por outro lado, são
formados, cada, por um carboidrato de cinco carbonos (C) chamado de
pentose ligado a uma base nitrogenada e por fim a um grupo fosfato, o que
difere dos nucleosídeos por esses não terem o grupo fosfato.
Na pentose podemos averiguar as ligações fosfodiéster que são
responsáveis por interligar as moléculas dos nucleotídeos, que é feita pelo
íon hidroxila (OH) no 3º carbono e pelo fosfato no 5º carbono do
carboidrato. As bases se diferem em purinas: maiores, heterocíclicas e com
anéis aromáticos (adenina e guanina) e as pirimidinas: menores e sem o
fenômeno de ressonância dos elétrons (timina e citosina). Cada uma das
bases tem afinidade com a outra: timina ligada à adenina e guanina ligada
à citosina. Para, então se formar a dupla fita do DNA é preciso ter ligações
entre as bases e elas ocorrem através das mais fortes ligações: as pontes de
hidrogênio. Essas pontes variam de quantidade para cada dupla de base:
entre adenina e timina há duas pontes e entre guanina e citosina há três
pontes. Por fim, vale destacar algumas principais diferenças do RNA em
relação ao DNA: ele não é formado por uma dupla fita de sequências de
nucleotídeos; ao invés de timina tem a chamada uracila como mais uma
base nitrogenada; enquanto o DNA tem o açúcar desoxirribose O prefixo
"desoxi" quer dizer sem o átomo de oxigênio. Portanto, estruturalmente a
diferença esta na ausência do átomo de oxigênio de numero 5 na ribose e
que a ribose tem um grupo hidroxila ligado ao carbono 2 e a desoxirribose
não tem.
4. Visto que o DNA não é solúvel em álcool, o que ocorre com suas
moléculas quando colocadas neste meio?
Resposta: O sal de cozinha ou Na Cl (cloreto de sódio) fornece íons positivos
que são resultantes da dissociação causada pela água que neutralizam a
carga negativa do grupo fosfato do, resultando na aglutinação das
moléculas de DNA, isto é, reduzindo a repulsão DNA necessário para a fase
de precipitação do DNA. E como ácido nucleico não é solúvel em álcool,
todos os componentes da mistura permanecem na solução, com exceção
do DNA que precipita na camada alcoólica.
5. Responda novamente a questão prévia e compare com a resposta dada
antes de realizar esta atividade.
Resposta: comparando a resposta da pergunta prévia com os resultados,
por ser um experimento de conhecimento popular, pode-se dizer que foi
previsível e redundante. Pois, a afinidade de elementos lipídicos químicos
ratificaram as prévias deduções.
Devido ao fato da membrana plasmática apresentar um uma bicamada de
fosfolipídios e proteínas, sendo os fosfolipídios anfifílicos, o detergente
seria a maneira mais simples de realizar a quebra da arquitetura do
mosaico fluido.
Que por ser um vegetal apresenta ainda outro revestimento de
polissacarídeo de difícil digestão, a celulose, esta que o processo de
maceração tem o objetivo de enfraquecer para aumentar a superfície de
contato. Justificando a necessidade do cloreto de sódio, as propriedades
químicas da molécula de DNA assim como as propriedades químicas
resultantes da quebra da ligação iônica do sal pela água são maneiras de
deixar mais separado ainda o ácido nucleico dos demais constituintes onde
o álcool proporciona um comportamento mais aglutinador do DNA
juntamente com o sal. Analisando que é uma célula eucarionte, se viu a
necessidade de lise dos revestimentos por meio do detergente.
1- É necessário esmagar ou amassar a fruta para que os produtos químicos
usados na extração (detergente e sal) cheguem até as células.
2- O caráter apolar do detergente, em contato com as membranas das
células do morango e da banana, também apolares, gera a sua quebra. A
quebra das membranas permite que o DNA fique livre na solução.
3- O DNA é composto por uma desoxirribose e um grupo fosfato, além das
bases nitrogenadas, que podem ser: Adenina, Timina, Guanina e Citosina
4- O sal e o álcool fazem com que as moléculas de DNA fiquem juntas, por
coesão. Quanto mais próximas estiverem as moléculas de DNA, mais fácil
será a visualização.
5- O DNA pode ser detectado no núcleo (centro) de qualquer célula de um
organismo, dentro de pequenos pacotes genéticos chamados
cromossomos, com exceção das células vermelhas do sangue (hemácias)
que são anucleadas, portanto, não têm DNA. Podemos isolá-lo através da
quebra das membranas das células de uma fruta, por exemplo, e misturá-lo
a uma solução polar, isolando o DNA que irá subir em forma de uma
"nuvem de algodão". O que mudou em relação aos nossos conhecimentos,
foi a noção da técnica de isolamento no DNA.
Materiais:
Figura 1: morango
Figura 2: kiwi
Figura 3: faca de cozinha
Figura 4: tubos graduados
Figura 5: coador de chá
Figura 6: macerador
Figura 7: 2 potinhos de 50mL
Figura 8: 2 colheres de chá
Figura 9: pano de limpeza
Figura 10: 20mL de álcool etílico 90ºGL gelado (10ºC)
Figura 11: 10mL de solução lise (água + detergente + sal de cozinha)
Procedimento:
Figura 12/13 - Maceramos os pedaços com o auxílio do cadinho até formar
uma pasta;
Figura 14 - Colocamos o macerado na peneira apoiada sobre o pote
dosador e pressionamos contra a malha, de modo a peneirar o material;
Figura 15/16 - Usamos o tubo graduado para colocar 10mL da solução lise
no potinho de 50mL e adicionamos, em seguida, o caldo peneirado;
Figura 17 - Colocamos o potinho na vasilha com água quente (60ºC) e
deixamos em banho-maria por 15 minutos e, em seguida, retiramos o tubo
da água quente e adicionamos lentamente, com o auxílio do potinho
graduado, 20mL de álcool etílico gelado, deixando-o escorrer pela parede
do tubo;
Figura 18/19 - Observamos o aparecimento do aglomerado de DNA como
uma “nuvem” branca na fase alcoólica;
Figura 20/21 - Com o auxílio da colher de chá, retiramos o aglomerado
filamentoso de DNA da solução.
Verifique que há presença de DNA em outras
organelas.
N/D
Respostas:
1) Por que o material precisa ser macerado para isolar o DNA?
Ao macerar o material (processo mecânico), há rompimento das paredes
celulares do vegetal (compostas, primordialmente, pelo polissacarídeo
celulose) e ruptura de algumas membranas plasmáticas. Esse procedimento
também aumenta a superfície de contato da amostra, algo imprescindível
para a rapidez das reações, pois resulta em mais área para contato entre os
reagentes e o substrato, no caso: solução lise (água + detergente + sal) e
membranas celulares.
2) Qual o papel do detergente presente na solução lise no processo de
extração do DNA?
A função do detergente é de desestruturar as moléculas de lipídio das
membranas biológicas, uma vez que os lipídios são os principais
componentes das membranas plasmática e nuclear. Desta maneira, as
membranas sofrem ruptura e todo o conteúdo celular, inclusive o DNA, fica
disperso na solução.
3) De que é composta a molécula de DNA?
Constitui-se por duas extensas cadeias de polinucleotídeos, que, por sua
vez, são formados quimicamente por um grupo fosfato (responsável pelo
caráter ácido da molécula), uma pentose (desoxirribose) e as bases
nitrogenadas, classificadas em:
- Purinas: moléculas maiores compostas por mais de um anel de carbono e
nitrogênio, representadas pela Adenina (A) e Guanina (G);
- Pirimidinas: moléculas menores formadas por um único anel,
representadas pela Timina (T) e Citosina (C).
As duas cadeias encontram-se “trançadas”, constituindo uma estrutura de
dupla-hélice, na qual as bases nitrogenadas unem-se em um modelo
padrão de combinação através de pontes de hidrogênio, havendo três
pontes entre citosina e guanina e duas entre timina e adenina.
4) Visto que o DNA não é solúvel em álcool, o que ocorre com suas
moléculas quando colocadas neste meio?
Devido ao caráter apolar desempenhado na solução, principalmente
quando em baixa temperatura, o álcool desidratará o material genético,
resultando no agrupamento de DNA. Junto a isso, há o fato de o DNA ser
menos denso que o álcool etílico (C2H5OH) e os demais componentes,
intensificando o processo de separação e ocasionando a sua visível
localização na parte superior da amostra.
5) Responda novamente a questão prévia e compare com a resposta dada
antes de realizar essa atividade.
O DNA localiza-se no interior das células, sequenciado nos cromossomos.
Nas células procariontes, pelo fato de não possuírem carioteca e alguns
organoides, o seu material genético permanece disperso no citoplasma, em
uma área denominada nucleoide. Tal expressividade é característica dos
domínios Bacteria e Archae.
Já nas células eucariontes, o DNA se faz presente nas mitocôndrias e,
majoritariamente, no núcleo celular, de forma mais organizada e separada
dos líquidos citoplasmáticos. Representam o domínio Eukarya.
Existem vários processos que isolam o DNA do resto do material celular,
como a extração orgânica, a separação magnética, a tecnologia baseada em
sílica e a de troca iônica. Porém, pelos altos custos ou impossibilidade de
realização, são raramente executadas em escolas. Portanto, há um
processo simples de extração e isolamento do DNA em laboratório escolar
que foi realizado no protocolo e detalhado nas respostas, e envolve
maceração, solução lise, banho-maria e álcool.
A descrição a seguir, se refere a um procedimento de extração de DNA de
vegetais, de forma prática, rápida e de baixo custo, buscando otimizar os
resultados obtidos com os processos descritos no formulário original do
presente desafio.
Materiais:
• ½ de goiaba e/ou ½ de tomate
• 2 sacos plásticos de capacidade entre 1l e 1,5l
• 1 faca de cozinha
• 1 mão-de-pilão
• 1 peneira de plástico
• 1 potinho dosador ou seringa milimétrica
• 3 copos de vidro ou de plástico (copo 1: para o caldo peneirado/ copo 2:
para fazer a solução lise/ copo 3: para a mistura do caldo com a solução
lise)
• 1 colher de chá
• 1colher de sopa
• Água quente (60°C)
• 20 ml de álcool etílico 90° gelado (a cerca de 10°C)
• 1 vasilha plástica grande para manter o álcool gelado
• 10 ml de solução lise (5 ml de água, 3 ml de detergente e uma colher de
chá de bicarbonato de sódio)
• 1 pano para limpeza
Procedimento:
• Retirar a casca da goiaba e cortá-la em partes pequenas. Cortar o tomate
em pedaços, após a retirada apenas do seu pedúnculo.
• Inserir os pedaços no saco plástico e macerar com o auxílio da mão-depilão.
• Depois de macerado, peneirar o material sobre o copo 1, com a ajuda da
peneira de plástico e da colher de sopa.
• Após estar preparada a solução lise no copo 2, colocar 10 ml dessa no
copo 3 e em seguida adicionar 10 ml do caldo peneirado.
• Usar o outro saco plástico para revestir o copo 3 no intuito de tampá-lo,
logo após, movimentar o sistema levemente para que o caldo se misture
com a solução lise, porém, tendo cuidado para não formar espuma.
• Colocar o copo 3, ainda tampado, em banho-maria durante 15 minutos.
• Retirá-lo da água quente e com o auxilio da seringa ou do potinho
graduado, adicionar 20 ml de álcool etílico 90° gelado, através da parede do
recipiente.
• Observar durante 5 minutos o aparecimento gradativo do DNA como uma
“nuvem” na fase alcoólica.
• Depois de decorrido o tempo necessário, retirar delicadamente o DNA
com o uso da seringa ou da colher de chá.
Importância da utilização dos processos e reagente contidos no
experimento.
Maceramento: Todas as células vegetais possuem uma rígida camada
constituída principalmente de celulose, chamada parede celular. O
maceramento é feito no intuito de romper essa parede das células, assim
como desagregar os tecidos, para facilitar a ação da solução lise sobre um
grande número de células.
Peneiração: Esse procedimento possibilita a retirada de materiais
indesejáveis para a extração do DNA.
N/D
Detergente: Tem a função de abalar a estrutura fosfolipídica contida na
membrana plasmática das células para assim permitir a fragmentação
dessa e a consequente dispersão do DNA na solução.
Bicarbonato de Sódio: Em substituição ao NaCl, o bicarbonato de sódio,
além de ser o neutralizador das cargas negativas do grupo fosfato do DNA,
através dos íons Na+, que são liberados em solução aquosa, essa substância
também atua como potencializador da ação do detergente. Além do mais,
promove uma pequena alteração no Ph da solução, o que pode facilitar a
inativação das enzimas DNAses.
Banho-Maria: Com esse procedimento, busca-se melhorar a ação do
detergente através do aumento da agitação das moléculas proporcionado
pela mudança de temperatura. Além disso, essa variação promove a
inativação de DNAses, que podem degradar o DNA.
Álcool: Promove a desidratação do DNA para que esse não fique mais em
meio aquoso. Por ter uma tendência a ser insolúvel em álcool, o DNA se
aglomera e forma uma estrutura filamentosa na superfície do extrato, por
possuir menor densidade que os outros constituintes do sistema.
EXTRAÇÃO DE DNA DO TOMATE E DA UVA PRETA.
Materiais usados:
150 ml de água
1 colher de sopa de detergente
1 colher de chá de sal de cozinha
1 tomate grande ou 1 cacho de uva pequeno
1 bolsa plástica pequena
25 ml de álcool comum 90° (etanol)
1 pano limpo
2 béquer de 250 ml
2 tubos de ensaio
1 bastão de vidro para mexer
1 Palito para churrasco
Procedimentos:
Passo1: Selecionar 1 tomate grande, lavá-la bem antes da experiência.
Passo2: Em uma bolsa plástica colocar a tomate, e com seus próprios dedos
esmagá-la, até formar uma pasta quase homogênea.
Passo 3: Em um recipiente, fazer uma mistura de 150ml de água, 1 colher
de sopa de detergente neutro e 1 colher de chá de sal.
Passo 4: Em outro recipiente, colocar a pasta feita do tomate amassado, e
50ml da mistura de água, sal e álcool.
Passo 5: Esperar 30 minutos, deixando a pasta em temperatura ambiente e
mexendo as vezes de maneira lenta, evitando o surgimento de espuma.
Passo 6: Passar essa pasta através de um pano limpo, separando assim os
pedaços sólidos de tomate, obtendo assim um líquido.
Passo 7: Em um tubo de ensaio, colocar 15 ml desse líquido, e logo após
colocar 25 ml de álcool comum, colocando-o delicadamente pela parede do
tubo, podemos então observa o DNA na interfase do álcool e do líquido, e
logo após ele flutua através do álcool e para no topo do tudo de ensaio.
Passo 8: Observar o aparecimento do aglomerado de DNA como uma
“nuvem” branca na fase alcoólica. Com o auxílio de um palito para
churrasco, retirar o aglomerado filamentoso de DNA da solução.
Obs. Os materiais listado acima servem para apenas uma extração e os
mesmos procedimentos podem ser utilizados para a uva.
N/D
Utilizamos no nosso experimento;
N/D
01 Fruto do mandacaru; 01 Ameixa; 04 Embalagens de vidro de papinha
para bebê; 02 Embalagens vidro de azeitona; 01 Garrafa pet; Algodão; 01
Peneira;Termômetro; 01 Faca de cozinha; Sal de cozinha; Detergente
neutro; Álcool; Gelo; Fogão; 01 Panela; Água; 01 Pilão plástico; Filme
plástico; 01 peneira; 01 colher de chá.
Inicialmente a poupa do vegetal foi retirada e/ou cortada em pedaços
pequenos e colocada no pilão, que em seguida foram macerados
formando-se uma pasta. O macerado foi peneirado sobre um dos frascos
de vidro de 90 ml e pressionado para obtenção de um caldo. Enquanto isso,
o álcool foi colocado no gelo. Ao caldo foi adicionada a solução de lise (sal
de cozinha, detergente e água), que após misturados, foram filtrados em
um funil de plástico feito a partir de uma garrafa pet cortada ao meio, com
a tampa perfurada e forrada internamente com algodão. Após filtrada a
solução, o recipiente com a mistura foi fechado com filme plástico e levado
ao banho-maria com temperatura de 60ºC por 20 min. Após o banho-maria
o recipiente foi posto sobre gelo por 5 minutos para resfriar. Após o
resfriamento, a mistura foi colocada em um frasco maior e a ele foi
adicionada a mesma quantidade de álcool gelado, escorrendo com cuidado
pela parede do vidro. O recipiente foi fechado, foram feitos leves
movimentos circulares com o recipiente e após alguns minutos percebeu-se
a formação do precipitado e aglomerados de DNA.
Introdução:
O ácido desoxirribonucleico, DNA, é a molécula responsável por todas as
informações genéticas de todos os seres vivos. Desde Mendel, cientistas já
sabiam que havia algum mecanismo de herança entre os seres vivos,
sabiam que havia uma espécie de padrão responsável pela informação dos
seres. Em 1869, Johann Miescher conseguiu isolar o DNA e verificar sua
característica ácida, mas apenas em 1953 que Watson e Crick conseguem
descobrir sua estrutura. Tal fato representou um estupendo avanço para a
microbiologia. Sem a descoberta, não seriam possíveis os estudos de
evolução, transgenia e até mesmo a prevenção e tratamento de muitas
doenças, além de ter sido um passo significativo para o entendimento da
vida.
Nesse experimento, isolaremos moléculas de DNA de células vegetais. Um
procedimento relativamente simples, mas bastante interessante e que
desperta ainda mais a curiosidade pela biologia e pelos mecanismo
responsáveis pela vida.
Materiais usados:
- 1 Banana Prata
- 1 Cebola Branca
- 1 Repolho verde
- 1 Termômetro
- 3 Béqueres
- 1 Faca de cozinha
- 3 Coadores de papel
- 1 Rolo de filme plástico
- 1 tubo de detergente neutro
- 250 ml de álcool etílico 90°G L (gelado)
- 1 Saco de gelo
- 1 kg de de sal de cozinha refinado
- 1 colher de sopa
- 1 Colher de sobremesa
- 1 litro de água potável
- 1 forma retangular de bolo
- 1 funil
N/D
Procedimento:
1-Utilizando a faca de cozinha, corta-se todos os vegetais em pedaços
pequenos.
2-Prepara-se a solução de lise( 3/4 do volume do béquer de água, 1 colher
de sopa de detergente neutro - para uma melhor visualização- e 1 colher de
sobremesa de sal de cozinha.
3-Mistura-se com uma colher a solução de lise lentamente para que não
haja formação de espuma.
4-Adiciona os vegetais picados a solução de lise e identifica-se cada béquer
com uma numeração (1-Repolho Verde; 2- banana Prata; 3 - Cebola
Branca).
5-Cobre-se cada béquer com uma porção de filme plástico.
6-Coloca-se os béqueres em uma forma retangular em banho maria por 20
minutos e fogo brando.
7-Passa-se as três misturas por funis com filtros de papel e reserva-se os
coados em béqueres devidamente identificados, mais uma vez.
8-Coloca-se os coados em gelo por 5 minutos.
9-Adiciona-se o álcool concentrado gelado - 2 graus Celsius, como
evidenciado pelo termômetro - ao coado lentamente.
10- Deixa-se a solução em repouso por 5-15 minutos.
Questionamentos sobre o experimento:
1 - Por que o material precisa ser macerado para isolar o DNA ?
A maceração funciona quebrando as membranas das células dos vegetais,
dispersando o conteúdo citoplasmático na solução e, principalmente,
ajudando para uma maior homogeneização das partículas vegetais com a
mistura de lise, facilitado a atuação o detergente sobre as células.
2 - Qual o papel do detergente presente na solução de lise no processo de
extração do DNA?
As moléculas de detergente possuem uma parte polar e outra apolar, desse
modo, o detergente interage tanto com a água como com os fosfolipídios que também possuem parte apolar e polar - constituintes da membrana
plasmática e da carioteca, ocasionando sua lise (ruptura), liberando o
conteúdo celular na solução.
3 - De que é composta a molécula de DNA?
O DNA - Ácido Desoxirribonucleico, ADN - é um polímero de nucleotídeos
unidos por ligação fosfodiéster. Ele é formado por duas cadeias unidas por
pontes de hidrogênio entre as bases nitrogenadas dos nucleotídeos e
possui formato helicoidal. O nucleotídeo é formado por uma base
nitrogenada, uma pentose, a desoxirribose, e um grupo fosfato. É a
molécula responsável pelo armazenamento de todas as informações
genéticas de um individuo e responsável também pela hereditariedade na
reprodução.
4 - Visto que suas moléculas não é solúvel em álcool, o que ocorre com suas
moléculas quando colocadas nesse meio?
O álcool funciona isolando e aglomerando as moléculas de DNA livres na
solução, que não são solúveis. A baixa temperatura do álcool ajuda a
diminuir ainda mais a possibilidade de o DNA se dissolver, assim, o
aglomerado de DNA facilita bastante a visualização.
5 - Qual a função do sal adicionado ?
A adição de sal libera íons positivos (Na+) e negativos (Cl-), esses íons são
fundamentais para impedir que o Conjunto de DNA e proteínas histonas
não se repilam. Os íons positivos neutralizam o grupo fosfato, de carga
parcial negativa no DNA, e os íons negativos, as histonas.
Além disso, o sal também aumenta a densidade da solução facilitando que
o DNA se desloque para o álcool, de menor densidade.
6 - O que é a pectina ?
A pectina é uma proteína encontrada na parede celular de células vegetais,
desempenhando várias funções, como aprisionar água e dar estrutura.
Nesse experimento, a pectina também é extraída e pode ser confundida
com o DNA. Então, como diferenciar o DNA da pectina? Simples, o DNA por
ser mais denso, se localiza mais para o meio da fase alcoólica, enquanto a
pectina, menos densa, se acumula na parte superior da solução. Outra
maneira de diferenciar se dá por meio do estado de agregação das
moléculas, as moléculas de DNA se encontram mais unidas umas as outras,
em maior aglutinação, já as de pectina são mais dispersas e podem ser
facilmente quebradas com agitação.
7- Por que a utilização do gelo?
A variação brusca de temperatura promove a lise celular, facilitando o
isolamento do material genético.
PROTOCOLO PARA EXTRAÇÃO DE DNA DE VEGETAIS Materiais
• 1 cebola e 1 banana
• Faca de cozinha
• 1 colher de sopa
• 1 colher de chá
• Garfo
• Copos de vidro (2 por vegetal)
• 1 pote graduado
• Peneira pequena
• Gelo
• Tigela
• Travessa
• Água quente
• 100 ml de álcool etílico 70° (congelador – de um dia para o outro)
• Água
• Detergente
• Sal
• Filme plástico
• Kit caipirinha (tipo pilão de plástico)
PROCEDIMENTO
1. Cortar a cebola em pedaços bem pequenos e macerar com o kit
caipirinha. Fazer o mesmo, separadamente, com a banana.
2. Coloque a água na travessa para aquecer em fogo brando.
3. Misturar 150ml de água com 1 c.s. de detergente e 1 c.c de sal em um
copo de vidro e mexer devagar para não fazer espuma.
4. Colocar o material macerado no copo com a solução lise e passar o filme
plástico para fechar (um copo para cada vegetal).
5. Colocar os copos na travessa com água quente para banho-maria
durante 20 minutos.
6. Retire os copos do banho-maria e filtre o material na peneira, deixando o
material cair no outro copo (um copo para cada filtrado).
7. Passar o filme plástico nos copos com material filtrado e colocar em uma
tigela com o gelo durante 5 minutos.
8. Retire os copos da travessa e adicione o 50ml de álcool gelado
lentamente, deixando escorrer pela parede do copo.
9. Observe o DNA como uma nuvem formada na fase do álcool, acima do
material filtrado.
OBS.: No experimento com a banana, podemos observar também a pectina,
um polissacarídeo que encontramos nas frutas. A pectina é a parte
aglomerada com pequenas bolhas na superfície do material do copo.
N/D
Para este experimento, será utilizado uma banana e metade de uma
unidade de tomate. Antes de amassar a banana, certifique-se que a mesma
está sem casca e no caso do tomate, que ele está bem picado. Amasse
ambos, mas em pratos diferentes. Depois disso, em dois copos adicione
água até a metade de cada, com cada um contendo quatro colheres de
sopa de detergente (não necessariamente neutro) e uma colher de chá de
sal. Logo depois, adicione a mistura de banana em um e do tomate em
outro e misture novamente, colocando os dois copos em banho-maria por
15 minutos. Passado esse tempo, coloque os copos numa tigela com gelo e
espere 5 minutos. Filtre num filtro de café e adicione metade de um copo
de álcool etílico (álcool comum) gelado e misture com um canudo até ficar
uma "nuvem" de DNA fragmentada na parte de cima do líquido.
1) A fruta/verdura precisa ser macerada para que a parede celular quebre,
fazendo com que o DNA fique "livre".
2) O detergente vai auxiliar na dissolução da bicamada lipídica, responsável
pela membrana plasmática, e na dissolução da carioteca que vai liberar o
núcleo e as membranas da organela.
N/D
3) Formada por duas longas cadeias de nucleotídeos. O nucleotídeo sendo
formado por um grupo de fosfato, uma pentose e uma base nitrogenada
(Adenina, Guanina, Timina e Citosina).
4) Elas ficam suspensas, fazendo com que a solução tenha mais de uma
fase, possibilitando o agrupamento dos filamentos e visão das moléculas
fragmentadas.
Extração do DNA, de uma forma mais prática utilizando a maceração do
material e sem uso de produtos químicos.
Material utilizado:
-Banana
-Tomate
-Bisturi
-Lâmina
-Microscópio
Procedimento:
Utilizamos a banana, colocamos em uma sacola plástica por
aproximadamente dezoito horas (pra que amadureça mais rápido ),
amassamos ela com pouca força e com as pontas dos dedos, em seguida
retiramos a casca utilizando o bisturi recolhemos uma fina camada da parte
interna do envoltório. Essa amostra foi colocada na lâmina e foi observada
no microscópio, assim podendo ser visto o DNA da banana.
Verifique que não é possível visualizar DNA no
microscópio óptico.
O experimento foi modificar o protocolo dado, utilizando material do dia a
dia, como copo de vidro, pilão de café, peneira, seringa graduada, panela,
fogão, copo graduado de forma que apresentou resultado da extração de
DNA da cebola.
O DNA está presente em todas as células do organismo vivo e fornece todas
as células instruções nas células, ocorridas no núcleo da célula. Cerca de
99% do DNA encontra-se no núcleo da célula. O restante DNA encontra-se
em locais específicos, como por exemplo organelas (as mitocôndrias e os
cloroplastos possuem o seu próprio DNA). Apesar dessas organelas terem o
seu próprio cromossoma elas não podem contar com a sua informação. As
mitocôndrias e cloroplastos necessitam de genes especiais situados noutros
organitos. Para a maioria das funções, estes organitos utilizam os
cromossomas nucleares.
N/D
Resposta da pergunta prévia
O DNA está presente em todas as células de um indivíduo e seu isolamento
se faz através da utilização de materiais como o álcool que isola esse
componente nuclear.
1. Por que o material precisa ser macerado para isolar o DNA?
Para aumentar a superfície de contato da célula e facilitar a ação dos
demais componentes. (Precisa melhorar)
2. Qual o papel do detergente presente na solução de lise no processo de
extração do DNA?
Detergente rompe as membranas celulares pela desestruturação da
bicamada lipídica.
O detergente e um Tensoativo, ou seja, tem afinidade com a água e
gordura (lipídios) no caso presente na camada lipídica da célula.
3. De que é composta a molécula de DNA?
A molécula de DNA (ácido desoxirribonucleico) é formada por duas longas
cadeias de nucleotídeos. Quimicamente, o nucleotídeo de DNA é
constituído de um grupo fosfato, uma pentose (a desoxirribose) e uma base
nitrogenada. Ao longo da molécula observamos a existência de quatro tipos
de nucleotídeos, de acordo com a base nitrogenada que apresentam:
adenina (A), timina (T), citosina (C) e guanina (G).
4. Visto que o DNA não é solúvel em álcool, o que ocorre com suas
moléculas quando colocadas neste meio?
Como o DNA tende a não ser solúvel em álcool, a adição desse componente
impede o faz precipitar, facilitando seu agrupamento. Quanto mais gelado
o álcool, menos solúvel será o DNA. Lembrando que a molécula de DNA
pode ser extremamente longa, mas seu diâmetro é de apenas 2
nanômetros, visível apenas em microscopia eletrônica. Assim sendo, o que
se vê após a precipitação e um emaranhado formado por milhares de
moléculas de DNA.
5. Responda novamente a questão prévia e compare com a resposta dada
antes de realizar esta atividade.
O DNA está presente em todas as células de um indivíduo. O núcleo é
fundamental nesse processo e sabemos que nele está contido todas as
informações. Com o experimento podemos perceber que o desvendar de
um DNA não é tão complexo como se imagina e que com a descoberta das
técnicas de estudo do DNA fica mais claro a resolução de problemas ligados
a ele.
Considere a descrição de um protocolo.