Disciplina: Biologia e Geologia (11º ano)
PROTOCOLO: Extracção de DNA de células vegetais
 A extracção de DNA pode ser realizada a partir de diferentes tipos de células eucarióticas.
 Consta fundamentalmente de quatro etapas:
 ruptura das células para libertação dos núcleos – através de acções mecânicas e químicas para romper as paredes e as membranas,
bem como os invólucros nucleares a fim de “soltar” o DNA existente nos núcleos.
 Separação do DNA dos restos das paredes e das estruturas membranares das células – através da filtração
 separação dos componentes básicos dos cromossomas : DNA e proteínas – precipitação das proteínas e libertação das
macromoléculas de DNA
 separação do DNA da solução – através do etanol o DNA foi precipitado e separado podendo ser visualizado
 Porquê a cebola, kiwi, banana, ervilhas…?
– célula eucariótica , com núcleo bem definido contendo ácidos nucleicos – DNA.
 Quais as etapas fundamentais da extracção do DNA?
ruptura das células para libertação dos núcleos
Separação do material genético dos restos das paredes e das estruturas membranares
separação dos componentes básicos dos cromossomas: proteínas e DNA
separação do DNA da solução
 Qual o papel da “varinha mágica “ ou do almofariz?
Permite uma homogeneização mecânica Para romper a membrana que delimita a célula como um todo para libertar o núcleo
existente no seu interior
 Qual o papel do detergente?
Como a varinha ou o almofariz não consegue romper os núcleos ( porque são demasiado pequenos) recorre-se à emulsificação
para libertar o DNA.
As membranas celulares são formadas por uma bicamada de fosfolípidos onde se integram algumas proteínas. (A experiência
quotidiana revela que o uso de detergentes na lavagem da loiça retira as gorduras que sujam os pratos. Na realidade o
detergente é uma substância emulsionante que desagrega as gorduras em gotas muito pequenas que ficam misturadas na água.
Acontece o mesmo na digestão dos lípidos pela acção do suco biliar devido à presença do bicarbonato de sódio)
Quando o detergente entra em contacto com as membranas nucleares, as suas moléculas penetram na estrutura membranar e
separam as macromoléculas fosfolipídicas, provocando também a desnaturação das proteínas, o que provoca a ruptura do
invólucro nuclear e a dissolução do material genético na mistura de extracção.
 Qual a utilidade do cloreto de sódio?
Pelo facto de no exterior da molécula de DNA ( esqueleto açúcar – fosfato) possuir uma carga negativa devido à ionização do grupo
fosfato logo, e naturalmente, as moléculas de DNA sofreriam repulsão umas em relação às outras por possuir cargas iguais.
Assim, quando dissolvemos o sal da cozinha na água, este composto dissocia-se rapidamente em NA+ e Cl- . Desta forma, num
meio com estes iões, a carga negativa do DNA é neutralizada com a ligação de Na+ ao grupo fosfato e assim é impedida a
repulsão das moléculas de DNA e permitida a agregação dessas moléculas de modo a formar filamentos relativamente
espessos e compridos ( logo, mais visíveis)
 Por que razão é necessário adicionar clorofórmio ou altas temperaturas?
As histonas (proteínas carregadas positivamente – com aa com grupos amina – NH3+ ) são as responsáveis, no interior da célula, por
neutralizar as cargas negativas dos grupos fosfato. Mas existem outras proteínas associadas ao DNA que é necessário retirar
para isolar ao máximo o DNA. Assim, o clorofórmio e outros agentes químicos, como as altas temperaturas, valores extremos de
pH, permitem a desnaturação ( precipitação) das proteínas e perda de funcionalidade porque interfere com as ligações
responsáveis pela estrutura da proteína.
 Por que razão é necessário adicionar um álcool ao filtrado que contêm DNA?
O DNA é insolúvel no etanol à temperatura e concentração usadas.
Quando o etanol é lentamente adicionado ao filtrado, o DNA precipita. Uma vez que o DNA precipitado é menos denso que a água,
os filamentos de material genético acumulam-se no topo da camada do filtrado e ascendem lentamente na camada (superior) do
etanol.
Escola Secundária Alcaides de Faria
LMAE