CRISTIANE APARECIDA PEREIRA
EFEITOS DA TERAPIA FOTODINÂMICA IN VITRO EM
BIOFILMES FORMADOS POR Candida albicans,
Staphylococcus aureus E Streptococcus mutans
2009
CRISTIANE APARECIDA PEREIRA
EFEITOS DA TERAPIA FOTODINÂMICA IN VITRO EM BIOFILMES
FORMADOS POR Candida albicans, Staphylococcus aureus E
Streptococcus mutans.
Dissertação apresentada à Faculdade de Odontologia, Campus de São
José dos Campos, Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita
Filho”, como parte dos requisitos para obtenção do título de MESTRE,
pelo Programa de Pós-Graduação em BIOPATOLOGIA BUCAL, Área
Biopatologia Bucal.
Orientador: Prof. Titular Antonio Olavo Cardoso Jorge
São José dos Campos
2009
Apresentação gráfica e normalização de acordo com:
Alvarez S, Coelho DCAG, Couto RAO, Durante APM. Guia prático para
Normalização de Trabalhos Acadêmicos da FOSJC. São José dos
Campos: FOSJC/UNESP; 2008
P414e
Pereira, Cristiane Aparecida.
Efeitos da terapia fotodinâmica in vitro em biofilmes formados por Candida
albicans, Staphylococcus aureus e Streptococcus mutans / Cristiane Aparecida
Pereira. __ São José dos Campos : [s.n.], 2009
91f. : il.
Dissertação (Mestrado em Biopatologia Bucal) – Faculdade de Odontologia
de São Jose dos Campos,Universidade Estadual Paulista, 2009.
Orientador: Prof. Dr. Antonio Olavo Cardoso Jorge
1. Biofilme. 2. Candida albicans. 3. Staphylococcus aureus. 4. Streptococcus
mutans. 5. Terapia fotodinâmica. I. Jorge, Antonio Olavo Cardoso. II.
Universidade Estadual Paulista. Faculdade de Odontologia de São José dos
Campos. III. Título
tD17
Ficha catalográfica elaborada pelo Serviço Técnico de Biblioteca e Documentação da
Faculdade de Odontologia de São José dos Campos – UNESP
AUTORIZAÇÃO
Autorizo a reprodução e divulgação total ou parcial deste trabalho, por
qualquer meio convencional ou eletrônico, desde que citada a fonte.
São José dos Campos, 20 de julho de 2009.
Assinatura :
E-mail: [email protected]
BANCA EXAMINADORA
Prof. Tit. Antonio Olavo Cardoso Jorge (Orientador)
Faculdade de Odontologia de São José dos Campos
Universidade Estadual Paulista – UNESP
Prof. Dr. Aguinaldo Silva Garcez Segundo
Instituto de Pesquisas Energéticas e Nucleares – IPEN
Universidade de São Paulo – USP
Profa Dra Luciane Dias de Oliveira
Faculdade de Odontologia de São José dos Campos
Universidade Estadual Paulista – UNESP
São José dos Campos, 20 de Julho de 2009.
DEDICATÓRIA
À eterna guerreira, minha amada mãe Maria da
Conceição Pereira. Mulher de fibra, que sozinha educou e criou os cinco
filhos, nos guiando sempre pelo caminho da honestidade.
Ao meu noivo, Renato Santana Correia, pela paciência,
compreensão e dedicação. Minha fortaleza, meu porto-seguro, meu amor,
amigo e companheiro.
Aos meus queridos irmãos Simone, César, Elisiane e
Elisimar. Mesmo tão diferentes vocês são parte de mim, por isso são
essenciais.
Aos meus tesouros, razão da minha vida, meus amados
sobrinhos Pedro e Laura.
Àquela que sempre foi o meu maior incentivo, minha
inesquecível amiga Érica de Sá Lopes da Costa (in memorian).
AGRADECIMENTO ESPECIAL
Ao meu orientador, Prof. Titular Antonio Olavo Cardoso
Jorge.
Toda
minha
admiração
por
sua
sabedoria
e
profissionalismo acadêmico se torna secundária quando contemplo o seu
lado humano simples, sensato e honesto, que contribui para construir um
mundo bem mais bonito.
Orientar é ajudar a trilhar um caminho até então
desconhecido, e sob sua orientação eu dei os primeiros passos para este
novo mundo.
Muito obrigada pela confiança, amizade e conhecimentos
transmitidos.
AGRADECIMENTOS
À Deus, por ter me dado o privilégio de concretizar mais
este sonho.
À Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita
Filho”, na pessoa do diretor Prof. Dr. José Roberto Rodrigues e do vicediretor Prof. Dr. Carlos Augusto Pavanelli da Faculdade de Odontologia
de São José dos Campos.
Ao Programa de Pós-graduação em Biopatologia Bucal,
na coordenação da Prof.ª Dra. Cristiane Yumi Koga Ito e Prof.ª Adj.
Rosilene Fernandes da Rocha.
À CAPES (Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal
de Nível Superior) pela bolsa de estudo concedida.
Às secretárias da Seção de Pós-Graduação Rosemary de
Fátima Salgado, Erena Michie Hasegawa, Lílian Faris das Graças e Maria
Aparecida Consíglio de Souza, por serem sempre solícitas.
Aos docentes do Programa de Pós-graduação em
Biopatologia Bucal.
À querida Prof.ª Dra. Juliana Campos Junqueira, pessoa
sábia, que além de compartilhar todo conhecimento adquirido, sempre foi
paciente e atenciosa, e tornou-se uma grande amiga.
À Prof.ª Dra. Luciane Dias de Oliveira, a primeira pessoa
que me acolheu no laboratório, com toda calma e carinho.
À Prof.ª Sônia Khouri, quem me abriu as portas deste
fascinante mundo da Microbiologia.
À Prof.ª Dra Adriana Aigotti Haberbeck Brandão, e toda a
sua família, em especial ao Henrique Haberbeck Brandão, pelo incentivo
e amizade.
À querida Sílvia Scarpel, por toda atenção sempre.
Às minhas adoradas amigas que sempre torceram por
mim e entenderam a minha ausência em muitos momentos: Flávia Villas
Boas Simões Lopes, Flávia Morciani, Aline Carvalho Fava Gomes, Isabel
Chaves Silva Carvalho, Hérica Braga Carneiro, Suzana Costa, Rafaela
Costa, Tábata Bagatim e Bruna Renata Sperandim.
À minha companheira e grande amiga, a aluna de
PROAC Anna Carolina Borges Pereira da Costa. Obrigada seria pouco
para agradecer o quanto você sempre me ajudou e incentivou.
À minha equipe, que sempre me ajudou nos experimentos
e nos demais trabalhos do laboratório, e que se tornaram grandes
amigas, as alunas de Iniciação Científica: Fernanda Freire, Jéssica Mina
Zambrana, Sarah Almeida Coelho Oliveira e Fernanda Silva
Aos meus companheiros do curso de mestrado e do
laboratório de Microbiologia/Imunologia: Joyce da Silva Martins, Bruno
Mello de Matos e Polyana das Graças Figueiredo Vilela. Eu nunca poderia
ter escolhido pessoas tão maravilhosas para trilhar comigo mais este
caminho. Vocês tornaram esta fase muito mais especial, muito obrigada
pela amizade e o carinho.
Às alunas de PROAC, Ana Karina Machado e Vanessa
Maria de Campos Rasteiro, que chegaram recentemente, mas já
enriqueceram a nossa equipe.
À querida Claudia Carreira, por toda sua simpatia e
amizade.
Ao aluno de doutorado Rogério de Lima Romeiro, por
toda ajuda e companheirismo.
Aos alunos de Iniciação Científica, Rodney Rossoni e
Evelyn Santos, pela determinação e amizade.
Às alunas do curso de doutorado Graziella Nuremberg
Back Brito, Marta Majewski e Rosilene Batista de Aguiar Almeida.
Às alunas de mestrado Mary Anne Moreira Bárbara,
Nívea Cristina Sena Costa, Ana Paula Lima e Simone Vilela, muito
obrigada pelo companheirismo sempre.
Ao Prof. Dr. Carlos Eduardo Dias Colombo, por ter
participado do meu exame geral de qualificação, contribuindo com
sugestões
que
foram
essenciais
para
o
desenvolvimento
desta
dissertação.
Aos funcionários do laboratório: Sérgio, Domingos e Ana
Paula, muito obrigada pela colaboração e paciência.
Âb wxzÜtâ wx âÅt xávtwt ÇûÉ áxÜäx á|ÅÑÄxáÅxÇàx
ÑtÜt Öâx tÄzâ°Å ÑxÜÅtÇx†t xÅ v|Åt wxÄx?
wxáà|Çt@
wxáà|Çt@áx t áâáàxÇàtÜ É Ñ° wx âÅ {ÉÅxÅ ÑxÄÉ àxÅÑÉ áây|v|xÇàx
ÑtÜt Öâx xÄx vÉÄÉÖâx É ÉâàÜÉ âÅ ÑÉâvÉ Åt|á tÄàÉAÊ
g{ÉÅtá [âåÄxç
SUMÁRIO
RESUMO..............................................................................................
11
LISTA DE ABREVIATURAS, SIGLAS E SÍMBOLOS.........................
12
1 INTRODUÇÃO...................................................................................
14
2 REVISÃO DA LITERATURA..............................................................
17
2.1 Biofilme dentário............................................................................
17
2.1.1 Colonização por Streptococcus mutans.......................................
19
2.1.2 Colonização por Candida albicans...............................................
20
2.1.3 Colonização por Staphylococcus aureus.....................................
21
2.2 Terapia fotodinâmica......................................................................
23
2.2.1 Fotossensibilizador.......................................................................
23
2.2.2 Laser.............................................................................................
24
2.2.3 Terapia fotodinâmica antimicrobiana............................................
25
3 PROPOSIÇÃO....................................................................................
31
4 MATERIAIS E MÉTODOS..................................................................
32
4.1 Corpos-de-prova.............................................................................
32
4.2 Microrganismos e preparo de suspensões padronizadas.........
33
4.3 Grupos e condições experimentais..............................................
33
4.4 Formação dos biofilmes................................................................
34
4.4.1 Lavagem dos corpos-de-prova......................................................
35
4.5 Terapia fotodinâmica em biofilmes...............................................
35
4.6 Microscopia eletrônica de varredura............................................
38
5 RESULTADOS..................................................................................
44
6 DISCUSSÃO......................................................................................
59
7 CONCLUSÃO....................................................................................... 66
8 REFERÊNCIAS.................................................................................... 67
APÊNDICE A .......................................................................................... 78
ANEXO A ................................................................................................ 90
ABSTRACT.............................................................................................. 91
PEREIRA CA. Efeitos da terapia fotodinâmica in vitro em biofilmes
formados por Candida albicans, Staphylococcus aureus e Streptococcus
mutans [dissertação]. São José dos Campos: Faculdade de Odontologia
de São José dos Campos, Universidade Estadual Paulista; 2009.
RESUMO
O objetivo do trabalho foi avaliar o efeito antimicrobiano da terapia
fotodinâmica (TFD) em biofilmes formados por C. albicans (GI), S. aureus
(GII) e S. mutans (GIII), isolados e em associações (GIV-VII). Os biofilmes
foram formados em discos de resina acrílica esterilizados imersos em
caldo de infusão cérebro coração com 5% de sacarose, inoculados com a
suspensão microbiana e incubados por 5 dias. Após o período de
incubação, os discos foram lavados com solução fisiológica esterilizada
para remover as células não-aderidas. Foram avaliados os efeitos do
fotossensibilizador azul de metileno (AM) na concentração de 0,1 mg/mL
por 5 min e laser AsGaAl (660 nm) por 98 s, isolados e em conjunto. Os
biofilmes foram desprendidos em solução fisiológica em agitador ultrasônico. Foram realizadas diluições e alíquotas semeadas em ágar
seletivos e incubadas por 48 h. Os números de UFC/mL em Log10 foram
analisados estatisticamente (ANOVA, teste de Tukey, p< 0.05). Também
foi realizada a microscopia eletrônica de varredura (MEV) nos discos com
biofilmes dos grupos controle e TFD. Foram observadas reduções
significativas na viabilidade de todos os biofilmes expostos ao AM e laser.
As reduções (log10) foram maiores em biofilmes isolados, com: 40.22%
para C. albicans (GI), 55.91% para S. aureus (GII) e 47.35% para S.
mutans (GIII). Nos biofilmes mistos as reduções (log10) foram: 35.08%
para C. albicans e 43.9% para S. aureus (GIV); 31.54% para C. albicans e
38.7% para S. mutans (GV); 40.12% para S. aureus e 37.14% para S.
mutans (GVI); 19.56% para C. albicans, 28.41% para S. aureus e 24.94%
para S. mutans (GVII). As imagens de MEV demonstraram uma
fotossensibilização letal predominantemente nas camadas superiores dos
biofilmes. Conclui-se que a TFD pode ser uma abordagem útil no controle
de biofilmes bucais.
PALAVRAS-CHAVES: Biofilme. Candida albicans.
aureus. Streptococcus mutans. Terapia fotodinâmica.
Staphylococcus
LISTA DE ABREVIATURAS, SIGLAS E SÍMBOLOS
%= por cento
µg/mL= microgramas por mililitro
µL= microlitro
µm= micrômetro
AM= azul de metileno
AsGaAl= arseneto gálio alumínio
AT= azul de toluidina
BHI= Brain heart infusion (infusão cérebro coração)
células/mL= células por mililitro
cm2=centímetro quadrado
CO2= gás carbônico
F= fotossensibilizador
FDA= ftalocianina dissulfonada de alumínio
h= hora
He-Ne= Hélio-Neônio
HILT= Hight Intensity Laser Treatment
J/cm2 = Joule por centímetro quadrado
J= Joule
kGy= KiloGray
L= laser
L= litro
Laser= Light Amplification by Stimulated Emission of Radiation
LED= Light Emitting Diode
LILT= Low Intensity Level Treatment
Log= logarítmo
MEV= microscopia eletrônica de varredura
mg/L= miligrama por litro
mg/mL= miligrama por mililitro
min= minuto
mL= mililitro
mm= milímetro
MSBS= Mitis salivarius bacitracina sacarose
mW/cm2= miliwatts por centímetro quadrado
mW= miliwatts
NaCl= cloreto de sódio
NADH= nicotinamida adenina dinucleotídeo reduzida
nm= nanômetro
ºC= grau Celsius
p/v= peso por volume
s= segundo
TFD= Terapia fotodinâmica
UFC/mL= unidade formadora de colônia por mililitro
UI/mL= unidade internacional por mililitro
W= watt
1 INTRODUÇÃO
A cavidade bucal apresenta diversos nichos ecológicos
que são colonizados por microrganismos, permitindo a sobrevivência de
uma diversidade de bactérias, vírus e fungos (Socransky et al., 1998).
Atualmente, cerca de 1000 diferentes espécies de microrganismos já
foram detectadas na cavidade bucal de seres humanos, e grande parte
dessas espécies encontram-se organizadas na forma de biofilme (Wilson,
2004).
O biofilme dentário é formado por uma comunidade
diversificada de microrganismos que se acumula em tecidos duros
(dentes) como um filme, embebidos em uma matriz extracelular de
polímeros do hospedeiro e de origem microbiana (Marsh, 2004).
A
colonização
da
cavidade
bucal
é
influenciada
diretamente pela película adquirida (Marsh, 2004); uma camada acelular
constituída de proteínas, glicoproteínas e lipídios (Marcotte; Lavoie,
1998). A película adquirida é formada pela saliva imediatamente após a
profilaxia dos dentes, e pode favorecer a adsorção de microrganismos à
superfície dentária (Marsh, 2004). Se as condições forem favoráveis, os
colonizadores primários, primeiros microrganismos a aderirem à película
adquirida, podem multiplicar-se no substrato e formar micro-colônias
(Rickard et al., 2003). A seguir, ocorre o aumento da diversidade
microbiana até atingir uma comunidade clímax em duas ou três semanas
(Nyvad; Fejerskov, 1995).
Os estreptococos do grupo mutans, principalmente as
espécies Streptococcus mutans e Streptococcus sobrinus são os
principais agentes etiológicos do desenvolvimento da cárie de superfície
lisa dos dentes. O acúmulo de estreptococos na superfície dentária é
15
considerado um fator crítico no desenvolvimento do biofilme cariogênico,
devido à produção de ácidos que proporcionam diminuição do pH do
biofilme, aumentando a possibilidade de desmineralização dos tecidos
dentários (O’Toole et al., 2000).
As leveduras mais freqüentes na cavidade bucal são do
gênero Candida, sendo a espécie Candida albicans considerada um dos
fungos patogênicos normalmente encontrados neste local (O´Sullivan et
al., 2000). As leveduras também podem ser isoladas do biofilme dentário
(Sen et al., 1997) e coagregam-se a espécies bacterianas presentes ou
aderidas diretamente à película adquirida (Arendorf; Walker, 1980;
Nikawa et al., 1998).
Outro microrganismo patogênico oportunista que pode ser
isolado da cavidade bucal é Staphylococcus aureus. Esta bactéria pode
atuar como microbiota suplementar, sendo freqüentemente encontrada
em abscessos periapicais e estomatites protéticas (Martins et al., 2002).
Staphylococcus aureus possui um plasmídio que codifica para ßlactamase e proporciona o desenvolvimento de resistência a antibióticos,
principalmente à penicilina (Machado, 2000). Além disso, tem a
capacidade de produzir enzimas extracelulares, tornando-se uma bactéria
muito agressiva (Sader et al., 1993).
Os antimicrobianos auxiliam a remoção química do
biofilme, porém o uso prolongado de tais agentes pode levar à seleção de
espécies resistentes (Moran et al., 1992). A estrutura do biofilme e as
características das células que o constituem conferem resistência aos
agentes antimicrobianos e às defesas naturais do organismo (Dunne,
2003).
Desta forma, vê-se a necessidade de se desenvolver
tratamentos alternativos com potente atividade antimicrobiana, capazes
de interferir no desenvolvimento do biofilme. Neste contexto, a terapia
fotodinâmica (TFD) surge como uma alternativa de tratamento.
16
O processo de TFD consiste na irradiação de uma luz de
comprimento
de
onda
apropriado
que
ativa
uma
substância
fotossensibilizadora, causando a morte celular por meio da produção de
espécies reativas de oxigênio (Machado, 2000).
Em vista do decréscimo da susceptibilidade de
microrganismos aos métodos convencionais de tratamentos, a avaliação
do efeito antimicrobiano da TFD em biofilmes formados in vitro por
Candida albicans, Staphylococcus aureus, Streptococcus mutans e suas
associações, sobre resina acrílica, torna-se de interesse científico.
2 REVISÃO DA LITERATURA
2.1 Biofilme dentário
A
cavidade
bucal
dos
seres
humanos
apresenta
microbiota complexa, que reflete a diversidade dos habitats e dos
ecossistemas ali localizados (Thylstrup; Fejerskov, 1995). Diferentes
locais na cavidade bucal são colonizados por populações distintas de
microrganismos. Todas as superfícies expostas da boca (dentes, tecidos
periodontais e língua) apresentam microrganismos residentes (Wen;
Brune, 2002). Atualmente, cerca de 1000 diferentes espécies de
microrganismo já foram detectadas na cavidade bucal dos seres humanos
e grande parte delas encontra-se organizada na forma de biofilmes
(Wilson, 2004).
Biofilme pode ser definido como uma comunidade
estruturada de micro-colônias de células microbianas envolvidas em uma
matriz extracelular de polissacarídeos, aderida a um substrato sólido
úmido ou meio líquido do qual elas podem retirar seus nutrientes
(Costerton et al.,1999; Portera, 1999; Wimpenny et al., 2000).
A colonização microbiana não é um processo passivo e
requer aderência do microrganismo à superfícies dentárias (Nyvad;
Fejerskov, 1995). A adesão inicial ocorre por meio da película adquirida
(Marsh, 1992), uma camada acelular que se deposita no esmalte
superficial dos dentes, tendo como principais constituintes substâncias
originárias da saliva e do fluido gengival, como proteínas, glicoproteínas e
lipídios, além de componentes bacterianos, como as glicosiltransferases
(Marcotte; Lavoie, 1998). Por este processo de especificidade, os
18
microrganismos com pouca ou nenhuma afinidade à película são
eliminados pelo fluxo salivar. Assim as interações microrganismo/película
são de suma importância nos estágios iniciais de formação do biofilme
dentário (Gibbons et al., 1990).
A película adquirida começa a ser formada poucas horas
após a limpeza profissional (Bowden; Edwardsson, 1995), e atua como
substrato para a primeira população de microrganismos, conhecida como
colonizadores primários. Após a colonização inicial, os microrganismos
primários crescem rapidamente formando micro-colônias que ficam
embebidas em uma matriz extracelular (Thylstrup; Fejerskov, 1995).
Quando ocorrem mudanças nas condições ambientais no interior do
biofilme em formação e o substrato existente apresenta-se coberto por
bactérias
responsáveis
pela colonização
primária,
microrganismos
distintos tornam-se capazes de se unirem aos primários, e a partir deste
momento o biofilme começa a se desenvolver com múltiplas espécies
(Rickard et al., 2003), até atingir uma comunidade clímax em duas ou três
semanas (Nyvad; Fejerskov, 1995).
A formação de biofilme tem sido considerada uma
importante estratégia microbiana para a sobrevivência e proliferação no
ambiente bucal. A complexa estrutura do biofilme permite a organização
das populações de microrganismos de modo a oferecer proteção contra
os mecanismos de remoção pela saliva e dificultar a ação de agentes
antimicrobianos (Kirkpatrick et al., 2000).
Por estar intimamente relacionada à formação de
biofilmes, a prevenção da doença cárie baseia-se principalmente na
remoção mecânica desses biofilmes (Marsh; Martin, 1992). No entanto,
muitos indivíduos são incapazes ou desmotivados para realizar esse
procedimento com a regularidade e eficiência necessárias. Outro aspecto
importante foi o aumento nas últimas décadas do uso de agentes antisépticos, o que resultou na seleção de espécies resistentes (Wilson et al.,
1996).
19
Os microrganismos organizados em biofilmes apresentam
características de resistência, principalmente devido a penetração
insuficiente de antimicrobianos, velocidade de crescimento e alteração do
estágio metabólico que garante a sobrevivência de tais células em
ambientes hostis (Stewart; Costerton, 2001). Adicionalmente, os biofilmes
apresentam característica de desenvolvimento e traços fenotípicos
únicos, quando comparados com as mesmas células crescidas em
culturas planctônicas, que os tornam 10 a 1000 vezes mais resistentes a
agentes antimicrobianos e fatores imunes do hospedeiro (Davey; O’Toole,
2000; Zanin et al., 2006).
Frente às limitações dos métodos mecânicos de remoção,
e do decréscimo da susceptibilidade de microrganismos em biofilmes aos
antimicrobianos convencionais, a avaliação da eficácia de novas
alternativas como a TFD, torna-se de interesse científico.
2.1.1 Colonização por Streptococcus mutans
Estreptococos são as bactérias predominantes no biofilme
dentário (Jenkinson; Lamont, 1997), sendo Streptococcus mutans
considerado o principal agente etiológico no desenvolvimento da cárie de
superfície lisa (Shen et al., 2004).
Para aderir à superfície dos dentes no biofilme, S. mutans
produz enzimas extracelulares, como as glicosiltransferases que atuam
na formação dos polissacarídeos extracelulares da sacarose. Os glucanos
promovem o acúmulo dos estreptococos (e outros microrganismos bucais)
na superfície do dente, sendo um fator crítico para a formação e estrutura
integral do biofilme, com o acúmulo de ácidos que levam a diminuição do
pH e desmineralização do esmalte dos dentes (Ooshima et al., 2000;
Duarte et al., 2006).
20
O potencial cariogênico de S. mutans é principalmente
dependente das suas propriedades acidogênicas e da habilidade de se
acumular nos dentes, principalmente devido à síntese de glucanos
extracelulares a partir da sacarose (Gibbons, 1984). A produção de ácidos
e a capacidade de metabolização de substratos em meio ácido, foram os
primeiros fatores de virulência atribuídos a microrganismos específicos
relacionados à etiologia da cárie (Köhler et al., 1995).
Além da tolerância aos ácidos e sua produção, S. mutans
ainda possuem como mecanismos de virulência, a capacidade de
sobrevivência no biofilme dentário devido à alta capacidade de adaptação
ao ambiente, presença de adesinas na superfície celular, produção de
glicosiltransferases,
mutacinas
e
polissacarídeos
extracelulares
(Harrington; Russel, 1994; Jackson et al., 1999).
2.1.2 Colonização por Candida albicans
As leveduras mais comuns na cavidade bucal são as do
gênero Candida, sendo Candida albicans considerado um dos fungos
patogênicos normalmente encontrados neste local (O’Sullivan et al.,
2000).
C. albicans são encontradas principalmente no dorso da
língua, onde as papilas filiformes e reentrâncias, como o forame cego e
fissura mediana, servem de sítios que fornecem proteção e favorecem o
desenvolvimento de infecções (Arendorf; Walker, 1980).
A mudança entre a forma de leveduras para hifas
desempenha
papel
importante
no
desenvolvimento
do
biofilme.
Observações realizadas em microscopia demonstraram que as primeiras
camadas do biofilme são formadas pela forma de levedura e em seguida,
nas camadas de hifas, envolvidas por uma extensiva matriz de
21
exopolissacarídeo (Lamfon et al., 2003; El-Azizi et al., 2004; Jãrvensivu et
al., 2004).
Durante
a
maturação
do
biofilme,
as
leveduras
desenvolvem novas propriedades fisiológicas diferentes dos seus
similares planctônicos, o que torna C. albicans resistente a vários
componentes antifúngicos que são rotineiramente utilizados no ambiente
clínico. Dados da literatura relatam que já existem biofilmes formados por
C. albicans resistentes a uma variedade de antifúngicos, incluindo
anfotericina B e fluconazol (Chandra et al., 2001). Os mecanismos
responsáveis pela resistência a antifúngicos podem estar relacionados
com limitações difusionais à passagem do agente pela matriz extracelular,
com as alterações fenotípicas das células no biofilme e ainda com o
desenvolvimento de mecanismos de resistência por alteração do genótipo
das células (Dunne, 2003).
As diferentes formas de candidose bucal, superficial ou
sistêmica, são freqüentemente associadas a biofilmes formados por
C. albicans (Ramage et al., 2005). Porém, existem relatos de isolamento
dessas leveduras em biofilmes dentários (Sen et al., 1997; Nikawa et al.,
1998) coagregadas a espécies bacterianas presentes ou aderidas
diretamente à película adquirida (Arendorf; Walker, 1980; Nikawa et al.,
1998), o que demonstra que os mesmos podem estar correlacionados no
desenvolvimento de cáries e na patogênese de doenças periodontais
(Hannula et al., 2001; Jãrvensivu et al., 2004).
2.1.3 Colonização por Staphylococcus aureus
A espécie Staphylococcus aureus é uma bactéria
reconhecida como um dos principais patógenos responsáveis por ampla
22
incidência de infecções, desde moderadas infecções de pele até
bacteriemias e septicemias graves (Hardy et al., 2004; Kim et al., 2004).
A presença de S. aureus como residente da microbiota
bucal ainda é controversa. Porém, estudos relatam a presença da
bactéria S. aureus na cavidade bucal, sendo neste caso consideradas
pertencentes à microbiota transitória. Dados da literatura revelaram que
94 a 100% dos adultos saudáveis apresentam Staphylococcus spp. na
cavidade bucal, e que o predomínio de S. aureus é de 24 a 36% (Jackson
et al., 1999; Kim et al., 1995).
As infecções bucais causadas por S. aureus incluem:
infecções endodônticas, osteomielites da mandíbula, infecção da glândula
parótida e, uma forma de mucosite oral em idosos, principalmente em
pacientes recebendo nutrição parenteral (Smith et al., 2001).
O uso de antibióticos para o tratamento de doença
periodontal ou outras infecções pode predispor o aumento do número de
Staphylococcus spp. na cavidade bucal, pois estes adquirem facilmente
resistência aos antibióticos podendo resultar em superinfecção. S. aureus
foi o primeiro microrganismo no qual foi verificado o desenvolvimento de
resistência a antibióticos, através do plasmídio ß-lactamase, que
proporcionou resistência à penicilina (Loberto et al., 2004).
Os biofilmes formados por S. aureus são comunidades
embebidas em uma matriz de polímeros extracelulares, composta
principalmente de polissacarídeos de adesão intercelular (Chokr et al.,
2005), que diminuem a penetração de agentes antimicrobianos,
representando
antibióticos.
uma
significante
barreira
terapêutica
para
muitos
23
2.2 Terapia fotodinâmica (TFD)
A primeira demonstração dos efeitos da TFD sobre
microrganismos foi realizada por Raab em 1900, que durante um estudo
sobre os efeitos da acridina em Paramecium caudatum descobriu que a
associação deste corante com a luz era letal para este protozoário
causador da malária. Em 1907, Von Tappeiner e Jodlbauer demonstraram
a
necessidade
da
presença
de
oxigênio
nas
reações
de
fotossensibilização e introduziram o termo “Ação Fotodinâmica” para
descrever este fenômeno (Ackroyd et al., 2001).
O processo de TFD pode ocorrer por dois mecanismos. No
mecanismo do tipo I ocorrer a transferência de elétron entre o
fotossensibilizador no estado triplete excitado e componentes do sistema,
gerando íons-radicais que tendem a reagir com o oxigênio no estado
fundamental, resultando em produtos oxidados. Já no mecanismo do tipo
II ocorre a transferência de energia do fotossensibilizador no estado
triplete, com a geração de oxigênio singleto, um agente altamente
citotóxico (Machado, 2000).
2.2.1 Fotossensibilizador
Para produzir o efeito fotodinâmico, o fotossensibilizador
precisa
ser
biologicamente
estável,
fotoquimicamente
eficiente
e
minimamente tóxico aos tecidos normais (Garcez et al., 2003). Quanto
menos tóxicos forem os corantes e com bandas de absorção próximas ao
comprimento de onda das luzes utilizadas, a eficácia da TFD é elevada,
sem causar danos aos tecidos adjacentes (Bhatti et al., 1997).
24
Como a maioria das espécies bacterianas não apresenta
componentes fotossensíveis ao comprimento de onda utilizado, é
importante a utilização de um fotossensibilizador que absorva para si esta
luz e inicie a formação de radicais livres (Wilson et al., 1992). Assim,
células desprovidas de componentes fotossensíveis endógenos podem
tornar-se sensíveis a luz, quando coradas com fotossensibilizadores ou
agentes cromóforos exógenos, como o azul de metileno (AM), azul de
toluidina (AT), eosina e hematoporfirinas (Wilson, 1993).
O AM é um corante catiônico da classe das fenotiazinas.
É solúvel tanto em água como em álcool, e tem sido utilizado como
corante indicador bacteriológico. Seu estudo tem despertado interesse por
apresentar propriedade eletrocatalítica em relação ao NADH, uma
coenzima da classe das desidrogenases, que tem participação em várias
reações enzimáticas (Shiavo et al., 2000).
O AM possui alta absorção de luz, com picos de bandas
em 660 nm, é efetivo na TFD, demonstrando habilidade em gerar
espécies reativas de oxigênio sendo constantemente utilizado em
aplicações clínicas contra diversas doenças (Tardivo et al., 2005).
2.2.2 Laser
A palavra “laser” é o acrônimo de “Light Amplification by
Stimulated Emission of Radiation”, ou seja, “amplificação da luz por
emissão estimulada de radiação”. É uma luz monocromática que produz
linhas espectrais estreitas, altamente direcional, coerente, podendo ser
focalizada em região muito pequena com grande precisão, concentrando
alta quantidade da energia luminosa (Halliday et al., 2003). Os lasers são
classificados em duas famílias conforme sua potência e a capacidade de
interação com os tecidos: laser de baixa intensidade de energia (LILT -
25
Low Intensity Level Treatment); também chamados de terapêuticos e
lasers de alta intensidade de energia (HILT - Hight Intensity Laser
Treatment) conhecidos como cirúrgicos (Neves et al., 2005).
Os lasers de alta intensidade interagem com os tecidos
por reações fototérmicas, nas quais a energia da luz absorvida pelos
tecidos é transformada em calor. Os de baixa potência são baseados em
efeitos onde a radiação absorvida desencadeará reações fotoquímicas ou
fotofísicas intracelulares ou teciduais, não ocorrendo aumento de
temperatura. O comprimento de onda dos lasers pode cobrir do
infravermelho
ao
ultravioleta,
cada
tipo
emite
um
determinado
comprimento de onda (Mello et al.,2004; Rosa et al, 2005).
Os lasers de baixa intensidade também denominados
laser mole, laser frio, laser terapêutico ou soft-laser, emitem radiação de
baixa potência, sem potencial destrutivo e possuem uma ação
fotoquímica de analgesia, anti-inflamatória e de bioestimulação tecidual,
caracterizados por um comprimento de onda no espectro eletromagnético
geralmente do ultravioleta ao infravermelho, variando de 630 a 940 nm
(Kurachi et al., 2002). Os lasers de baixa potência mais utilizados na TFD
são
aqueles
com
emissão
na
região
vermelha
do
espectro
eletromagnético, como os lasers de Hélio Neônio (He-Ne) e diodo
Arseneto Gálio Alumínio (AsGaAl). Os lasers de He-Ne estão sendo
substituídos pelos lasers de diodo, que apresentam maior potência, são
mais robustos, não necessitam de espelhos e possuem menor custo
(Garcez et al., 2003).
2.2.3 Terapia fotodinâmica antimicrobiana
Os primeiros trabalhos utilizando a TFD em bactérias
orais in vitro foram realizados por Wilson et al. (1992) que demonstraram
26
a eficácia de diferentes associados ao laser He-Ne, com 7,3 mW de
potência, na redução de Porphyromonas gingivalis, Fusobacterium
nucleatum
e
Actinobacillus
actinomycetemcomitans.
Os
autores
observaram que os fotossensibilizadores AT, AM foram eficazes, pois
possibilitaram a eliminação das quatro espécies, após a exposição a luz
laser por apenas 30 s.
Dobson e Wilson (1992) observaram destruição de
biofilmes formados in vitro por Streptococcus sanguis, Porphyromonas
gingivalis,
Fusobacterium
e
nucleatum
Actinobacillus
actinomycetemcomitans, sensibilizados por AT e AM seguido da
irradiação pelo laser de baixa potência He-Ne, com 632,8 nm de
comprimento de onda e potência de 7,3 mW. Estes achados sugerem que
a fotossensibilização letal pode ser um meio eficaz de eliminar as
bactérias periodontopatogênicas do biofilme dental.
Sarkar e Wilson (1993) testaram amostras de biofilme
dentário subgengival de pacientes com periodontite crônica utilizando o
laser com 7,3 mW de potência e AT como fotossensibilizador, o que
reduziu significativamente a viabilidade
de
bactérias
aeróbias
e
anaeróbias, sendo esta redução de 94,2% para os estreptococos.
Em 1994, Burns et al. aplicaram laser AsGaAl e o
fotossensibilizador ftalocianina dissulfonada de alumínio (FDA) em
algumas espécies de bactérias cariogênicas tal como Streptococcus
mutans, Streptococcus sobrinus, Lactobacillus casei e Actinomyces
viscosus. Os autores relataram que o fotossensibilizador isoladamente
não demonstrou efeito satisfatório na viabilidade dos microrganismos
tratados. Porém, quando o fotossensibilizador foi associado a irradiação
laser foi observada uma redução das bactérias de lesões cariogênicas.
Em estudo realizado para avaliar o potencial bactericida
da TFD na remoção de biofilmes dentários, Wilson (1994) utilizou os
lasers
de
baixa
potência
de
He-Ne
e
AsGaAl,
conjugados
respectivamente com os fotossensibilizadores AT e FDA por 60 s. O autor
27
confirmou como efetivo o uso da TFD na eliminação de bactérias
cariogênicas e periodontopatogênicas.
Wilson e Pratten (1995) estudaram o efeito da TFD sobre
cepas de Staphylococcus aureus resistente a meticilina, utilizando um
laser de AsGaAl, de 660 nm de comprimento de onda e 11 mW de
potência, em conjunto com uma FDA por 60 s e 300 s. Os resultados
demonstraram uma redução de 99,6% (60 s) e 99,9% (300 s).
Wood et al. (1999) analisaram, in vitro, o uso da TFD na
eliminação de bactérias em biofilmes formados in vivo, utilizando
ftalocianina catiônica e luz branca de uma lâmpada de filamento de
tungstênio de 600/700 nm de comprimento de onda. Os autores
observaram redução considerável das bactérias do biofilme. Além disso,
os biofilmes tratados apresentaram-se mais delgados e com estruturas
diferentes daquelas dos biofilmes controles.
Usacheva et al. (2001) avaliaram a eficácia bactericida
dos fotossensibilizadores AM e AT sobre diferentes bactérias, na
presença e na ausência dos lasers de argônio e diodo, com 630 e 664 nm
de comprimento de onda, respectivamente. Foram testados os seguintes
microrganismos: Staphylococcus aureus, Streptococcus pneumoniae,
Enterococcus faecalis, Haemophylus influenzae, Escherichia coli e
Pseudomonas aeruginosa. O aumento da densidade de energia e
potência
dos
lasers,
mantendo
a
concentração
constante
de
fotossensibilizador, resultou em uma eliminação maior das bactérias.
Zeina et al. (2001) avaliaram a redução microbiana
através da TFD in vitro, utilizando uma combinação de AM e luz visível e
algumas espécies microbianas representativas daquelas encontradas na
pele saudável e doente como: Staphylococcus aureus, Staphylococcus
epidermidis, Streptococcus pyogenes, Corynebacterium minutissimum,
Propionibacterium acnes e Candida albicans. Todas as espécies testadas
foram susceptíveis à TFD, porém a redução de Candida albicans foi
menor do que as bactérias. Os autores concluíram que a TFD na pele
28
pode
representar
uma
alternativa
ao
tratamento
antimicrobiano
convencional.
Com laser de He-Ne, de 632,8 nm de comprimento de
onda e 35 mW de potência, e o fotossensibilizador AT, Komerik e Wilson
(2002) conseguiram redução microbiana das seguintes bactérias Gramnegativas: Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli e Klebisiella
pneumoniae .
Zanin et al. (2002) observaram que quando um “pool” de
saliva humana era sensibilizado por AT e irradiado pelo laser AsGaAl com
660 nm de comprimento de onda, ocorria um efeito bactericida total sobre
estreptococos do grupo mutans, e efeito bactericida parcial sobre
estreptococos totais. A relevância desse estudo está na eliminação das
espécies mais patogênicas com a preservação de parte da microbiota
residente,
já
que
a
atividade
antimicrobiana
sobre
todos
os
microrganismos da cavidade bucal não é recomendada por tornar o
hospedeiro mais susceptível ao aparecimento de infecções oportunistas.
O’Neill et al. (2002) obtiveram redução de 97,4% dos
microrganismos de biofilmes bucais multi-espécies após a aplicação de
AT e irradiação com laser de He-Ne com 632 nm de comprimento de
onda e 35 mW de potência.
Williams et al. (2003) estudaram a ação antibacteriana do
fotossensibilizador AT e do laser de He-Ne, com 632,8 nm de
comprimento de onda, sobre uma matriz de colágeno e dentina cariada,
ambos infectados por Streptococcus mutans. No colágeno a terapia foi
testada por 30 s e 180 s, já na dentina os tempos utilizados foram de 30 s
e 60 s. Os resultados foram mais eficazes quando utilizado o período de
tempo maior (180 s no colágeno e 60 s na dentina).
Lee et al. (2006) demonstraram a ação do laser diodo na
redução de biofilmes de S. mutans formados em dentina humana com
espessuras variadas (500, 1000 e 2000 µm). Os resultados demonstraram
29
eliminação de 97,7% das bactérias em dentinas com 500 µm de
espessura. Com o aumento da espessura, a redução bacteriana diminuiu.
Soukos et al. (2006) analisaram os efeitos da TFD em
patógenos
endodônticos,
como
Enterococcus
faecalis.
Os
microrganismos foram sensibilizados com azul de metileno e expostos a
irradiação de luz vermelha por 5 min com 665 nm e densidade de energia
de 35 J/cm2. Os autores concluíram que a TFD pode ser um procedimento
complementar para eliminar microrganismos residuais no canal radicular
após tratamento endodôntico convencional.
Wood et al. (2006) compararam a eficácia do corante
eritrosina, azul de metileno e photofrin em biofilme formado por
Streptococcus mutans. Os corantes foram utilizados e irradiados por 15
min com 400 W de energia. A eritrosina foi mais efetiva do que o
photofrin, que por sua vez foi mais efetivo que o azul de metileno. Os
autores
concluíram
que
a
PDT
utilizando
a
eritrosina
como
fotossensibilizador é um tratamento eficaz para prevenir a formação do
biofilme dentário.
Garcez et al. (2007) avaliaram o efeito de dois
fotossensibilizadores associados a laser diodo (660 nm) na eliminação de
bactérias em biofilmes crescidos por 3 dias em canais radiculares. A TFD
promoveu uma redução microbiana de 95%, o que, segundo os autores,
pode desempenhar um importante papel na terapia endodôntica.
Fimple et al. (2008) encontraram 80% de redução de
biofilmes multi-espécies do canal radicular, com a aplicação de AM e
irradiação de laser diodo (665 nm), e concluíram que a TFD pode ser um
complemento eficaz ao tratamento endodôntico convencional.
Recentemente, Fontana et al. (2009) compararam o efeito
antimicrobiano do AM e luz vermelha tanto em culturas planctônicas como
em biofilmes multi-espécies formados por bactérias isoladas da cavidade
bucal. Os autores alcançaram 64% e 32% de redução para culturas
planctônicas e biofilmes, respectivamente. Os autores concluíram que os
30
biofilmes formados por bactérias orais são menos afetados pela TFD do
que na forma planctônica.
3 PROPOSIÇÃO
O
antimicrobiano
da
objetivo
terapia
desta
dissertação
fotodinâmica,
foi
aqui
avaliar
o
representada
efeito
pelo
fotossensibilizador azul de metileno e laser de Arseneto Gálio Alumínio
(AsGaAl), na viabilidade de biofilme formados sobre resina acrílica por
Candida
albicans,
Staphylococcus
isolados e em associação.
aureus,
Streptococcus
mutans,
4 MATERIAIS E MÉTODOS
Este trabalho foi aprovado pelo Comitê de Ética em
Pesquisa
da
Faculdade
de
Campos/UNESP-SJC, conforme
Odontologia
de
São
José
dos
protocolo n° 019/2008 – PH/CEP
(Anexo A)
4.1 Corpos-de-prova
Para o desenvolvimento do presente estudo foram
utilizados como corpos-de-prova 280 discos para confecção de prótese
ocular com pino (Clássico, São Paulo, Brasil), constituídos de resina
acrílica incolor, com 11 mm de diâmetro (figura 1a). Cada corpo-de-prova
recebeu duas camadas de esmalte para unhas (Colorama, São Paulo,
Brasil), no pino (figura 1b) e na base (figura 1c). Desta forma, a área de
aderência do microrganismo para a formação do biofilme foi delimitada
somente para a parte superior do corpo-de-prova. A seguir, os corpos-deprova foram embalados e encaminhados para esterilização por radiação
gama (cobalto 60), com dosagem de 20 kGy por 6 h (Embrarad, São
Paulo, Brasil).
33
4.2 Microrganismos e preparo de suspensões padronizadas
Inicialmente foram preparadas suspensões padronizadas
utilizando cepas padrão de C. albicans (ATCC 18804), S. aureus (ATCC
6538) e S. mutans (ATCC 35688). As cepas de C. albicans (figura 2a)
foram repicadas em ágar Sabouraud dextrose (Difco, Detroit, USA). Já as
cepas de S. aureus (figura 2b) e S. mutans (figura 2c) foram repicadas em
ágar infusão cérebro coração - BHI (Brain Heart Infusion, Difco, Detroit,
USA).
Os
microrganismos
foram
incubados
em
estufa
bacteriológica a 37ºC por 24 h. Todos os ensaios com cepas de
S. mutans foram incubados em estufa bacteriológica sob condições de
microaerofilia (5% de CO2).
Decorrido
o
período
de
incubação,
colônias
dos
microrganismos foram suspensas em solução fisiológica esterilizada
(NaCl 0,9%), e ajustada em espectrofotômetro (B 582, Micronal, São
Paulo, Brasil), até obtenção de suspensão padronizada contendo 106
células/mL. Os parâmetros de densidade óptica e comprimento de onda
utilizados foram, respectivamente: 0,284 e 530 nm para C. albicans (figura
3a), 0,374 e 490 nm para S. aureus (figura 3b), e 0,620 e 398 nm para
S. mutans (figura 3c).
4.3 Grupos e condições experimentais
Após a esterilização, os corpos-de-prova foram divididos
aleatoriamente em 7 grupos, os quais foram submetidos às seguintes
condições experimentais: a) L+F-: biofilmes com a associação de solução
fisiológica e laser; b) L-F+: biofilmes tratados somente com o
34
fotossensibilizador; c) L-F-: biofilmes que receberam apenas solução
fisiológica; e, d) L+F+: biofilmes tratados com o fotossensibilizador e
irradiados pelo laser, conforme quadro 1.
Quadro 1 -
Grupos de microrganismos e condições experimentais
analisadas
Grupos
Condições Experimentais
Microrganismos
L+F-
L-F+
L-F-
L+F+
I – C. albicans
10
10
10
10
II – S. aureus
10
10
10
10
III – S. mutans
10
10
10
10
IV – C. albicans e S. aureus
10
10
10
10
V – C. albicans e S. mutans
10
10
10
10
VI – S. aureus e S. mutans
10
10
10
10
VII - C. albicans, S. aureus e S. mutans
10
10
10
10
Total
70
70
70
70
4.4 Formação dos biofilmes
Os corpos-de-prova esterilizados foram colocados, com o
auxílio de pinça estéril (figura 4a), na primeira fileira de placas de 24
poços (Costar Corning, New York, EUA). Em seguida foram adicionados 2
mL de caldo infusão de cérebro coração - BHI (Brain Heart Infusion, Difco,
Detroit, USA) acrescido de 5% de sacarose em cada poço da placa (figura
4b). Para a formação de biofilmes isolados (grupos I, II e III) cada poço da
placa contendo caldo BHI e um corpo-de-prova foi inoculado com 0,1 mL
da suspensão microbiana (figura 4c). Já nos grupos com associações
(grupos IV, V, VI e VII) foram inoculados 0,1 mL de cada suspensão
35
microbiana referente ao microrganismo utilizado. Por exemplo, para o
grupo IV, foi utilizado 0,1 mL da suspensão de C. albicans e 0,1 mL da
suspensão de S. aureus.
As
placas
foram
mantidas
incubadas
em
estufa
bacteriológica à 37ºC por cinco dias.
4.4.1 Lavagem dos corpos-de-prova
A fim de remover as células microbianas não-aderidas
após o período de formação dos biofilmes, foi realizada a lavagem dos
corpos-de-prova.
Os corpos-de-prova foram transferidos para os poços da
segunda fileira contendo 2 mL de solução fisiológica esterilizada (figura
5a), e a placa foi agitada por 5 min (figura 5b) em agitador orbital (Solab,
Piracicaba, Brasil). Este processo de lavagem foi realizado novamente
nos poços da terceira fileira da placa (figura 5c).
4.5 Terapia fotodinâmica em biofilmes
No processo de TFD foi utilizado laser de baixa potência
de Arseneto Gálio Alumínio (figura 6a) - AsGaAl- (Photon lase III, DMC
Equipamentos, São Carlos, Brasil), com sistema de entrega por fibra
óptica. Como fotossensibilizador foi utilizado azul de metileno (Sigma,
Aldrich, Germany), dissolvido em solução fisiológica esterilizada a uma
concentração de 0,1 mg/mL, seguido de filtração em membrana de
acetato de celulose estéril (figura 6b), com poros de 0,22 µm de diâmetro
(Millipore, São Paulo, Brasil).
36
A irradiação pelo laser AsGaAl, seguiu o protocolo
demonstrado no quadro 2.
Quadro 2 - Protocolo utilizado para irradiação com laser AsGaAl
Comprimento de onda
660 nm
Densidade de energia
10,42 J/cm2
Energia
9,8 J
Potência
100 mW
Área irradiada
0,94 cm2
Tempo
98 s
2
nm: nanômetros J/cm :joules por centímetro quadrado J: joules
mW: miliwats cm2: centímetro quadrado min: minutos s: segundos
Após
a lavagem
todos
os
corpos-de-prova
foram
transferidos para a quarta fileira da placa de 24 poços.
Os
corpos-de-prova
submetidos
às
condições
experimentais L+F+ e L-F+ receberam 0,1 mL de azul de metileno (figura
7a), por 5 min. Já os corpos-de-prova das condições experimentais L+F- e
L-F- receberam 0,1 mL de solução fisiológica esterilizada, também por 5
min (figura 7b). Decorrido este período, os corpos-de-prova das condições
experimentais L+F+ e L+F- foram irradiados, com as placas abertas, pelo
laser por 98 s (figura 7c).
Todo o experimento de TFD foi realizado no escuro, em
câmara de fluxo laminar, com o auxílio de um anteparo negro fosco
colocado sob as placas para evitar o espalhamento de luz.
Para
avaliar
o
efeito
das
diferentes
condições
experimentais realizadas foram quantificados os números de unidades
formadoras de colônias por mililitro (UFC/mL) de microrganismos, obtidos
a partir da suspensão de cada biofilme dos corpos-de-prova.
37
Cada corpo-de-prova foi colocado em um tubo falcon
contendo 10 mL de solução fisiológica esterilizada, e em seguida
homogeneizada por 30 s, utilizando homogeneizador ultra-sônico
(Sonoplus HD 2200 – Bandelin Eletronic) com potência de 50 W (figura
8a), a fim de desprender o biofilme. A suspensão microbiana obtida foi
considerada com fator diluição 10-1, e a partir desta foram realizadas
novas diluições decimais (10-2, 10-3 e 10-4) em solução fisiológica
esterilizada.
Alíquotas de 0,1 mL de cada diluição foram semeadas em
duplicatas em placas de Petri com meio de cultura sólido (figura 8b). No
grupo I, as diluições obtidas do biofilme isolado de C. albicans foram
semeadas em ágar Sabouraud
dextrose. Nos biofilmes isolados de
S. aureus e S. mutans (grupos II e III, respectivamente) as diluições foram
semeados em ágar BHI. Já nos grupos mistos, as diluições dos biofilmes
foram semeadas em meios de cultura seletivos para cada microrganismo,
como segue: a) C. albicans em ágar Sabouraud dextrose com 50 mg/L de
cloranfenicol (União Química, São Paulo, Brasil); b) S. aureus em ágar
manitol (Difco, Detroit, USA); e, c) S. mutans em ágar Mitis Salivarius
(Difco, Detroit, USA) acrescido de 0,2 UI/mL de bacitracina (União
Química, São Paulo, Brasil) e 15% de sacarose (MSBS).
As placas foram incubadas em estufa a 37 ºC por 48 h.
Após o período de incubação, as placas contendo de 30 a 300 colônias
foram contadas e o número UFC/mL transformado em logarítmo de base
10 (Log10).
Os resultados obtidos foram avaliados estatisticamente
pela análise de variância ANOVA, teste Tukey, considerando-se diferença
estatística quando p < 0,05, com o software Minitab 14 (Inc. PA, USA).
38
4.6 Microscopia eletrônica de varredura
Com o objetivo de ilustrar os efeitos da TFD sobre os
biofilmes formados nos corpos-de-prova foi realizada a microscopia
eletrônica de varredura (MEV) no Instituto Nacional de Pesquisas
Espaciais (INPE) de São José dos Campos/SP.
Para a MEV os biofilmes foram crescidos conforme
mencionado anteriormente, sendo dois corpos-de-prova por grupo,
(quadro 3) submetidos as condições experimentais L-F- e L+F+.
Quadro 3 -
Corpos-de-prova submetidos a microscopia eletrônica de
varredura
Grupos
Condições Experimentais
Microrganismos
L-F-
L+F+
I – C. albicans
01
01
II – S. aureus
01
01
III – S. mutans
01
01
IV – C. albicans e S. aureus
01
01
V – C. albicans e S. mutans
01
01
VI – S. aureus e S. mutans
01
01
VII - C. albicans, S. aureus e S. mutans
01
01
Em seguida, os corpos-de-prova transferidos para placas
de 24 poços e fixados em 2 mL de glutaraldeído a 2,5% por 1 h.
Posteriormente os corpos-de-prova foram submersos por 20 min em cada
uma das seguintes concentrações de álcool: 10%, 25%, 50%, 75% e
90%. E finalmente, por 1 h em álcool a 100%. As placas foram incubadas
em estufa bacteriológica por 24 h para a secagem completa dos corposde-prova.
39
Após a secagem os corpos-de-prova foram transferidos
para stubs metálicos (figura 9a) e submetidos ao processo de metalização
por sputtering (Denton Vacuum Desk II, Denton Vacuum, USA) com 10-9
m de espessura de fio de ouro (figuras 9b e 9c). Posteriormente, os
corpos-de-prova foram examinados e fotografados em microscópico
eletrônico de varredura (JSM-5310, JEOL, Japão), operando em 15 kV
nos aumentos de 1000 e 5000 vezes (figura 9d).
40
A
B
C
Figura 1 – Preparo do corpo-de-prova utilizado para formação de biofilme. a) corpo-deprova sem pintura; b) corpo-de-prova com o pino pintado; c) corpo-de-prova
pronto para esterilização, com pino e base pintados com esmalte para unhas.
A
B
C
Figura 2 - Placas com crescimentos de 24 h em meio de cultura sólido, dos
microrganismos utilizados para a formação dos biofilmes. a) C. albicans em
ágar Sabouraud dextrose; b) S. aureus em ágar BHI; c) S. mutans em ágar
BHI.
A
B
C
Figura 3 - Parâmetros de densidade óptica e comprimento de onda, em
espectrofotômetro, utilizados para os diferentes microrganismos. a)
parâmetros utilizados para C. albicans; b) parâmetros utilizados para
S. aureus; c) parâmetros utilizados para S. mutans.
41
B
A
C
Figura 4 - Processo de formação do biofilme. a) transferência dos corpos-de-prova para
a primeira fileira da placa de 24 poços; b) adição do caldo BHI sacarosado;
c) inoculação da suspensão microbiana.
A
B
C
Figura 5 - Lavagem dos corpos-de-prova. a) lavagem dos corpos-de-prova realizada
com solução fisiológica esterilizada nos poços da segunda fileira da placa; b)
agitador orbital onde as placas permaneceram por 5 minutos para auxiliar o
processo de remoção das células microbianas não-aderidas; c) repetição da
lavagem dos corpos-de-prova na terceira fileira da placa.
A
B
Figura 6 - Laser e fotossensibilizador utilizados na TFD. a) aparelho de laser AsGaAl;
b) filtração do fotossensibilizador azul de metileno.
42
A
B
C
Figura 7 - Processo de TFD. a) aplicação do fotossensibilizador azul de metileno, por 5
minutos, nos corpos-de-prova submetidos às condições experimentais L+F+ e
L-F+; B) aplicação de solução fisiológica, por 5 minutos, nos corpos-de-prova
submetidos às condições experimentais L+F- e L-F-; c) irradiação pelo laser
AsGaAl, por 1 minuto e 38 segundos, nos corpos-de-prova submetidos às
condições experimentais L+F+ e L+F-.
A
B
Figura 8 - Quantificação de microrganismos. a) dispersão do biofilme formado no disco
de resina acrílica, através da homogeneização em solução fisiológica com
homogeneizador ultra-sônico; b) semeadura em meio de cultura sólido.
43
A
B
C
D
Figura 9 - Processos de metalização e análise em MEV dos corpos-de-prova; A)
corpos-de-prova no “stub” metálico antes da metalização. B) aparelho
metalizador. C) “stub” com os corpos-de-prova metalizados; D) microscópio
eletrônico de varredura.
5 RESULTADOS
As médias obtidas através dos ensaios realizados e
as análises estatísticas de UFC/mL (Log10) para os biofilmes isolados de
C. albicans, S. aureus e S. mutans, grupos GI, GII e GIII, estão
apresentadas na tabela 1. Através destes resultados foi possível
visualizar os efeitos produzidos pela TFD nos biofilmes isolados.
Tabela 1 - Médias e desvio-padrão dos números de UFC/mL (Log10)
obtidos nos ensaios realizados, nas diferentes condições
experimentais, nos seguintes grupos: GI - biofilmes de
C. albicans; GII - biofilmes de S. aureus; e, GIII - biofilmes de
S. mutans
Condição
GI – Biofilme de
GII – Biofilme de
GIII - Biofilme de
Experimental
C. albicans
S. aureus
S. mutans
A
A
L+F-
5,69±0,03
5,75±0,04
5,85±0,02A
L-F+
5,71±0,04A
5,81±0,04AB
5,87±0,02A
L-F-
5,77±0,03A
5,89±0,03B
5,93±0,04A
L+F+
3,45±0,12B
2,60±0,21C
3,12±0,13B
Letras diferentes indicam diferença estatisticamente significante entre as condições
experimentais (p<0,05, Análise de variância ANOVA, teste Tukey).
G: Grupo L+F-: biofilme irradiado somente com laser L-F+: biofilme tratado somente com
fotossensibilizador L-F-: biofilme não irradiado pelo laser e sem fotossensibilizador
L+F+: biofilme tratado com o fotossensibilizador e irradiado pelo laser.
Na tabela 2 estão os valores de p obtidos quando as
diferentes condições experimentais foram comparadas estatisticamente.
45
Tabela 2 - Valores de p obtidos entre as diferentes condições
experimentais nos seguintes grupos: GI - biofilmes de C.
albicans; GII - biofilmes de S. aureus; e, GIII - biofilmes de S.
mutans
GI – Biofilme de
GII – Biofilme de
GIII - Biofilme de
C. albicans
S. aureus
S. mutans
L-F- e L-F+
0,267
0,371
0,295
L-F- e L+F-
0,052
0,036
0,061
L-F- e L+F+
0,000
0,000
0,000
L-F+ e L+F-
0,854
0,636
0,848
L-F+ e L+F+
0,000
0,000
0,000
L+F- e L+F+
0,000
0,000
0,000
Comparação
Valor de p estatisticamente significante quando <0,05 (Análise de variância ANOVA,
teste Tukey).
G: Grupo L+F-: biofilme irradiado somente com laser L-F+: biofilme tratado somente com
fotossensibilizador L-F-: biofilme não irradiado pelo laser e sem fotossensibilizador
L+F+: biofilme tratado com o fotossensibilizador e irradiado pelo laser.
Para os ensaios realizados com biofilmes dos grupos GIV,
GV, GVI e GVII formados pela associação de microrganismos, as médias
e as análises estatísticas, bem como os valores de p obtidos quando as
diferentes condições experimentais foram comparadas estatisticamente,
estão apresentadas nas tabelas 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 e 10.
46
Tabela 3 - Médias e desvio-padrão dos números de UFC/mL (Log10)
obtidos nos ensaios realizados, nas diferentes condições
experimentais, no grupo GIV: biofilme associado de
C. albicans e S. aureus
Condição
GIV – Biofilme de
Experimental
C. albicans
S. aureus
L+F-
5,38±0,03A
5,45±0,06A
L-F+
5,41±0,04A
5,50±0,07AB
L-F-
5,43±0,04A
5,55±0,07B
L+F+
3,52±0,11B
3,11±0,10C
Letras diferentes indicam diferença estatisticamente significante entre as condições
experimentais (p<0,05, Análise de variância ANOVA, teste Tukey).
G: Grupo L+F-: biofilme irradiado somente com laser L-F+: biofilme tratado somente com
fotossensibilizador L-F-: biofilme não irradiado pelo laser e sem fotossensibilizador
L+F+: biofilme tratado com o fotossensibilizador e irradiado pelo laser
Tabela 4 - Valores de p obtidos entre as diferentes condições
experimentais no grupo GIV: biofilme associado de C.
albicans e S. aureus
Comparação
GIV – Biofilme de
C. albicans
S. aureus
L-F- e L-F+
0,874
0,555
L-F- e L+F-
0,386
0,056
L-F- e L+F+
0,000
0,000
L-F+ e L+F-
0,827
0,555
L-F+ e L+F+
0,000
0,000
L+F- e L+F+
0,000
0,000
Valor de p estatisticamente significante quando <0,05 (Análise de variância ANOVA,
teste Tukey).
G: Grupo L+F-: biofilme irradiado somente com laser L-F+: biofilme tratado somente com
fotossensibilizador L-F-: biofilme não irradiado pelo laser e sem fotossensibilizador
L+F+: biofilme tratado com o fotossensibilizador e irradiado pelo laser.
47
Tabela 5 - Médias e desvio-padrão dos números de UFC/mL (Log10)
obtidos nos ensaios realizados, nas diferentes condições
experimentais, no grupo GV: biofilme associado de
C. albicans e S. mutans
Condição
GV – Biofilme de
Experimental
C. albicans
S. mutans
L+F-
5,42±0,06A
5,63±0,04A
L-F+
5,43±0,05A
5,66±0,02A
L-F-
5,48±0,05A
5,71±0,04A
L+F+
3,75±0,14B
3,50±0,15B
Letras diferentes indicam diferença estatisticamente significante entre as condições
experimentais (p<0,05, Análise de variância ANOVA, teste Tukey).
G: Grupo L+F-: biofilme irradiado somente com laser L-F+: biofilme tratado somente com
fotossensibilizador L-F-: biofilme não irradiado pelo laser e sem fotossensibilizador
L+F+: biofilme tratado com o fotossensibilizador e irradiado pelo laser
Tabela 6 - Valores de p obtidos entre as diferentes condições
experimentais no grupo GV: biofilme associado de C. albicans
e S. mutans
Comparação
GV – Biofilme de
C. albicans
S. mutans
L-F- e L-F+
0,569
0,421
L-F- e L+F-
0,474
0,156
L-F- e L+F+
0,000
0,000
L-F+ e L+F-
0,998
0,929
L-F+ e L+F+
0,000
0,000
L+F- e L+F+
0,000
0,000
Valor de p estatisticamente significante quando <0,05 (Análise de variância ANOVA,
teste Tukey).
G: Grupo L+F-: biofilme irradiado somente com laser L-F+: biofilme tratado somente com
fotossensibilizador L-F-: biofilme não irradiado pelo laser e sem fotossensibilizador
L+F+: biofilme tratado com o fotossensibilizador e irradiado pelo laser.
48
Tabela 7 - Médias e desvio-padrão dos números de UFC/mL (Log10)
obtidos nos ensaios realizados, nas diferentes condições
experimentais, no grupo GVI: biofilme associado de S. aureus
e S. mutans
Condição
GVI – Biofilme de
Experimental
S. aureus
S. mutans
L+F-
5,44±0,06A
5,57±0,06A
L-F+
5,48±0,06A
5,60±0,06A
L-F-
5,53±0,06A
5,65±0,07A
L+F+
3,31±0,14B
3,55±0,12B
Letras diferentes indicam diferença estatisticamente significante entre as condições
experimentais (p<0,05, Análise de variância ANOVA, teste Tukey).
G: Grupo L+F-: biofilme irradiado somente com laser L-F+: biofilme tratado somente com
fotossensibilizador L-F-: biofilme não irradiado pelo laser e sem fotossensibilizador
L+F+: biofilme tratado com o fotossensibilizador e irradiado pelo laser
Tabela 8 - Valores de p obtidos entre as diferentes condições
experimentais no grupo GVI: biofilme associado de C.
albicans e S. mutans
Comparação
GVI – Biofilme de
S. aureus
S. mutans
L-F- e L-F+
0,672
0,514
L-F- e L+F-
0,107
0,149
L-F- e L+F+
0,000
0,000
L-F+ e L+F-
0,624
0,858
L-F+ e L+F+
0,000
0,000
L+F- e L+F+
0,000
0,000
Valor de p estatisticamente significante quando <0,05 (Análise de variância ANOVA,
teste Tukey).
G: Grupo L+F-: biofilme irradiado somente com laser L-F+: biofilme tratado somente com
fotossensibilizador L-F-: biofilme não irradiado pelo laser e sem fotossensibilizador
L+F+: biofilme tratado com o fotossensibilizador e irradiado pelo laser.
49
Tabela 9 - Médias e desvio-padrão dos números de UFC/mL (Log10)
obtidos nos ensaios realizados, nas diferentes condições
experimentais, no grupo GVII: biofilme associado de
C. albicans, S. aureus e S. mutans
Condição
GVII – Biofilme de
Experimental
C. albicans
S. aureus
S. mutans
L+F-
5,07±0,07A
5,08±0,08A
5,14±0,06A
L-F+
5,08±0,07A
5,13±0,07A
5,15±0,06A
L-F-
5,12±0,07A
5,18±0,06A
5,21±0,06A
L+F+
4,12±0,11B
3,71±0,20B
3,96±0,10B
Letras diferentes indicam diferença estatisticamente significante entre as condições
experimentais (p<0,05, Análise de variância ANOVA, teste Tukey).
G: Grupo L+F-: biofilme irradiado somente com laser L-F+: biofilme tratado somente com
fotossensibilizador L-F-: biofilme não irradiado pelo laser e sem fotossensibilizador
L+F+: biofilme tratado com o fotossensibilizador e irradiado pelo laser
Tabela 10 - Valores de p obtidos entre as diferentes condições
experimentais no grupo GVI: biofilme associado de
C. albicans, S. aureus e S. mutans
Comparação
GVII – Biofilme de
C. albicans
S. aureus
S. mutans
L-F- e L-F+
0,704
0,741
0,358
L-F- e L+F-
0,637
0,272
0,161
L-F- e L+F+
0,000
0,000
0,000
L-F+ e L+F-
0,999
0,842
0,964
L-F+ e L+F+
0,000
0,000
0,000
L+F- e L+F+
0,000
0,000
0,000
Valor de p estatisticamente significante quando <0,05 (Análise de variância ANOVA,
teste Tukey).
G: Grupo L+F-: biofilme irradiado somente com laser L-F+: biofilme tratado somente com
fotossensibilizador L-F-: biofilme não irradiado pelo laser e sem fotossensibilizador
L+F+: biofilme tratado com o fotossensibilizador e irradiado pelo laser.
50
A aplicação do fotossensibilizador azul de metileno por 5
minutos, seguida pela irradiação do laser AsGaAl por 98 s, promoveu uma
redução significativa no número de UFC/mL (Log10) dos microrganismos
organizados em
todos os biofilmes dos grupos testados, quando
comparados com os grupos que receberam somente solução fisiológica
(L-F-). Os percentuais de redução de UFC/mL em Log10 dos biofilmes
analisados estão ilustrados na figura 10. Nos biofilmes isolados os
percentuais de redução foram: 40,22% para C. albicans (GI); 55,91%
para. S. aureus (GII); e, 47,35% para S. mutans (GIII). Nos biofilmes
mistos os percentuais foram: 35,08% para C. albicans e 43,9% para S.
aureus (GIV); 31,54% para C. albicans e 38,7% para S. mutans (GV);
40,12% para S. aureus e 37,14%
S. mutans
(GVI);
19,56% para
C. albicans, 28,41% para S. aureus 24,94% para S. mutans (GVII).
Redução Percentual (%) de UFC/mL
60
50
40
30
20
10
0
GI
GII
GIII
GIV
GV
GVI
GVII
Grupos
C. albicans
S.aureus
S. mutans
Figura 10 – Médias e desvio-padrão das reduções de UFC/mL (Log10) obtidas entre os
grupos sem aplicação do fotossensibilizador e não-irradiado pelo laser
(L-F-) e, com aplicação do fotossensibilizador por 5 min e irradiação do laser
por 98 s (L+F+).
51
Pela análise das imagens produzidas por MEV foi
possível visualizar a aderência dos microrganismos apresentadas pelos
diferentes grupos, condição controle (L-F-), bem como compará-las com
os mesmos submetidos ao processo de TFD (L+F+). Através desta
comparação,
observou-se
que
as
reduções
ocorreram
predominantemente nas camadas superiores dos biofilmes (figuras 11 a
17).
52
A
B
C
D
Figura 11 – MEV de biofilmes de C. albicans (grupo I) formados em corpos-de-prova de
resina acrílica após 5 dias de crescimento. A) MEV do corpo-de-prova com
biofilme sem aplicação do fotossensibilizador e não-irradiado pelo laser (LF-), aumento de 1000x; B) MEV do corpo-de-prova com aplicação do
fotossensibilizador por 5 min e irradiação do laser por 98 s (L+F+), aumento
de 1000x; C) MEV do corpo-de-prova com biofilme sem aplicação do
fotossensibilizador e não-irradiado pelo laser (L-F-), aumento de 5000x; D)
MEV do corpo-de-prova com aplicação do fotossensibilizador por 5 min e
irradiação do laser por 98 s (L+F+), aumento de 5000x.
53
A
C
B
D
Figura 12 – MEV de biofilmes de S. aureus (grupo II) formados em corpos-de-prova de
resina acrílica após 5 dias de crescimento. A) MEV do corpo-de-prova com
biofilme sem aplicação do fotossensibilizador e não-irradiado pelo laser (LF-), aumento de 1000x; B) MEV do corpo-de-prova com aplicação do
fotossensibilizador por 5 min e irradiação do laser por 98 s (L+F+), aumento
de 1000x; C) MEV do corpo-de-prova com biofilme sem aplicação do
fotossensibilizador e não-irradiado pelo laser (L-F-), aumento de 5000x; D)
MEV do corpo-de-prova com aplicação do fotossensibilizador por 5 min e
irradiação do laser por 98 s (L+F+), aumento de 5000x.
54
A
B
C
D
Figura 13 – MEV de biofilmes de S. mutans (grupo III) formados em corpos-de-prova de
resina acrílica após 5 dias de crescimento. A) MEV do corpo-de-prova com
biofilme sem aplicação do fotossensibilizador e não-irradiado pelo laser (LF-), aumento de 1000x; B) MEV do corpo-de-prova com aplicação do
fotossensibilizador por 5 min e irradiação do laser por 98 s (L+F+), aumento
de 1000x; C) MEV do corpo-de-prova com biofilme sem aplicação do
fotossensibilizador e não-irradiado pelo laser (L-F-), aumento de 5000x; D)
MEV do corpo-de-prova com aplicação do fotossensibilizador por 5 min e
irradiação do laser por 98 s (L+F+), aumento de 5000x.
55
A
B
C
D
Figura 14 – MEV de biofilmes de associados de C. albicans e S. aureus (grupo IV)
formados em corpos-de-prova de resina acrílica após 5 dias de crescimento.
A) MEV do corpo-de-prova com biofilme sem aplicação do
fotossensibilizador e não-irradiado pelo laser (L-F-), aumento de 1000x; B)
MEV do corpo-de-prova com aplicação do fotossensibilizador por 5 min e
irradiação do laser por 98 s (L+F+), aumento de 1000x; C) MEV do corpode-prova com biofilme sem aplicação do fotossensibilizador e não-irradiado
pelo laser (L-F-), aumento de 5000x; D) MEV do corpo-de-prova com
aplicação do fotossensibilizador por 5 min e irradiação do laser por 98 s
(L+F+), aumento de 5000x.
56
A
B
C
D
Figura 15 – MEV de biofilmes de associados de C. albicans e S. mutans (grupo V)
formados em corpos-de-prova de resina acrílica após 5 dias de crescimento.
A) MEV do corpo-de-prova com biofilme sem aplicação do
fotossensibilizador e não-irradiado pelo laser (L-F-), aumento de 1000x; B)
MEV do corpo-de-prova com aplicação do fotossensibilizador por 5 min e
irradiação do laser por 98 s (L+F+), aumento de 1000x; C) MEV do corpode-prova com biofilme sem aplicação do fotossensibilizador e não-irradiado
pelo laser (L-F-), aumento de 5000x; D) MEV do corpo-de-prova com
aplicação do fotossensibilizador por 5 min e irradiação do laser por 98 s
(L+F+), aumento de 5000x.
57
A
B
C
D
Figura 16 – MEV de biofilmes de associados de S. aureus e S. mutans (grupo VI)
formados em corpos-de-prova de resina acrílica após 5 dias de crescimento.
A) MEV do corpo-de-prova com biofilme sem aplicação do
fotossensibilizador e não-irradiado pelo laser (L-F-), aumento de 1000x; B)
MEV do corpo-de-prova com aplicação do fotossensibilizador por 5 min e
irradiação do laser por 98 s (L+F+), aumento de 1000x; C) MEV do corpode-prova com biofilme sem aplicação do fotossensibilizador e não-irradiado
pelo laser (L-F-), aumento de 5000x; D) MEV do corpo-de-prova com
aplicação do fotossensibilizador por 5 min e irradiação do laser por 98 s
(L+F+), aumento de 5000x.
58
A
B
C
D
Figura 17 – MEV de biofilmes de associados de C. albicans, S. aureus e S. mutans
(grupo VII) formados em corpos-de-prova de resina acrílica após 5 dias de
crescimento. A) MEV do corpo-de-prova com biofilme sem aplicação do
fotossensibilizador e não-irradiado pelo laser (L-F-), aumento de 1000x; B)
MEV do corpo-de-prova com aplicação do fotossensibilizador por 5 min e
irradiação do laser por 98 s (L+F+), aumento de 1000x; C) MEV do corpode-prova com biofilme sem aplicação do fotossensibilizador e não-irradiado
pelo laser (L-F-), aumento de 5000x; D) MEV do corpo-de-prova com
aplicação do fotossensibilizador por 5 min e irradiação do laser por 98 s
(L+F+), aumento de 5000x.
6 DISCUSSÃO
A análise macroscópica dos biofilmes formados nos
corpos-de-prova de resina acrílica, após 5 dias de crescimento, revelou
padrões diferenciados para os grupos com microrganismos isolados em
relação aqueles onde houve associação microbiana.
Nos grupos com microrganismos isolados, observou-se
no GI ausência de biofilme visível a olho nu, formado pela levedura
C. albicans. Já no grupo GII, o biofilme formado por S. aureus foi mais
visível. Entretanto, o grupo GIII de S. mutans foi aquele onde se obteve
biofilme mais aparente.
Nas
associações
de
microrganismos,
a
análise
macroscópica mostrou aumento da espessura dos biofilmes formados. Tal
característica ficou mais evidente quando os microrganismos C. albicans
e S. mutans foram inoculados juntos, o que produziu um biofilme mais
espesso. Resultado semelhante foi obtido por Barbieri et al. (2007), que
ao analisarem a aderência, in vitro, de S. mutans na superfície dentária
verificaram que a mesma foi mais extensa quando esta bactéria foi
cultivada com C. albicans. Esses dados indicam que a interação de C.
albicans e S. mutans em biofilmes pode ter uma característica
mutualística,
onde
ambos
os
microrganismos
são
favorecidos.
Corroborando com esta afirmação, Branting et al. (1989), ao estudarem
a
aderência
de C. albicans em associação com S. mutans em
superfícies acrílicas, sugeriram que a presença de glucanos insolúveis
produzidos pela bactéria podem aumentar a capacidade adesiva da
levedura. Ainda sobre tal característica, Barbieri et al. (2007) concluíram
que as células de C. albicans poderiam ser usadas pela bactéria S.
mutans como suporte para sua aderência.
60
Os
biofilmes
representam
o
tipo
de
crescimento
microbiano predominante na natureza e são cruciais no desenvolvimento
de infecções, uma vez que servem de nicho aos agentes patogênicos e
estão associados a altos níveis de resistência aos antimicrobianos (Kuhn
et al. 2002).
Pode-se atribuir ao biofilme uma série de vantagens para
a colônia microbiana, como melhor comunicação entre células, em função
da continuidade entre as mesmas, o que facilita as atividades
bioquímicas, maior proliferação, acesso a nichos e recursos que não
poderiam ser utilizados por células isoladas e a defesa coletiva contra os
mecanismos de remoção pela saliva e ação de agentes antimicrobianos
(Kirkpatrick et al. 2000).
Neste contexto, a TFD surge como uma alternativa de
tratamento, pois apresenta potente atividade antimicrobiana, apresenta
baixo custo, efeitos colaterais mínimos, ausência de efeitos sistêmicos e
não causa resistência microbiana (Garcez et al., 2003).
A TFD é baseada nos chamados fotossensibilizadores
que são ativados por luz, com comprimento de onda apropriado, gerando
espécies reativas de oxigênio, como o oxigênio singleto, e superóxidos
(Machado 2000, Romanova et al. 2003). Estes produtos são citotóxicos
para a célula alvo, causando desordens na parede celular (Malik et al.
1990) e danos no DNA (Romanova et al. 2003), levando a morte do
microrganismo.
No presente estudo a fotossensibilização pelo AM por 5
min, seguido pela irradiação do laser AsGaAl por 98 s (L+F+), promoveu
reduções estatisticamente significantes nos biofilmes formados em resina
acrílica em todos os grupos analisados, tanto em relação aqueles onde só
foram utilizadas solução fisiológica, considerado controle (L-F-), quanto
nas demais condições
experimentais
testadas (L-F+ e L+F-). Esta
redução foi mais acentuada quando os microrganismos estavam
organizados em biofilmes isolados.
61
Dentre os biofilmes isolados, aqueles
formados por
C. albicans (GI) foram os que sofreram menores reduções, apresentando
média de 2,32 Log10 (40,22%) em relação aos controles. No estudo de
Donnelly et al. (2007), os biofilmes formados por uma cepa de C. albicans
isolada de da cavidade bucal de um paciente com estomatite, crescidos
por 24 h em discos plásticos, apresentaram reduções que variaram de 1,5
log10
até
100%,
de
acordo
com
o
tempo
de
incubação
do
fotossensibilizador AT e o aumento da densidade de energia da fonte de
luz utilizada (635 nm).
Os biofilmes mais sensíveis a TFD foram aqueles
formados isoladamente por S. aureus, os quais apresentaram uma
redução média de 3,29 Log10 (47,35%). Lin et al., (2004) obtiveram
reduções que variaram de 1,2 log até 100%, quando
biofilmes de
S. aureus foram submetidos ao fotossensibilizador merocianina por 10
min, seguido de irradiação por diferentes densidades de energia de uma
fonte de luz verde (512 nm). Já no estudo de Sharma et al. (2008), a
média de redução foi de aproximadamente 3,5 log em biofilmes formados
por uma cepa de S. aureus resistente a meticilina, tratados com AT e
irradiados por laser (640 nm).
A TFD promoveu redução média de 2,81 Log10 (55,91%)
nos biofilmes isolados formados por S. mutans (GIII). Resultado
semelhante foi obtido por Wood et al. (2006), que alcançaram reduções
de 1,5 a 2,6 Log10 em biofilmes de S. mutans com 2 e 12 dias de
crescimento, respectivamente, quando utilizaram o fotossensibilizador AM
em conjunto com uma fonte de luz de 400 W. No estudo realizado por
Zanin et al. (2005), os autores também encontraram reduções similares,
de 2,10 a 3,11 log10 de S. mutans organizados em biofilmes tratados com
AT, conforme o aumento do tempo de irradiação pelo laser He-Ne (632,8
nm).
Os biofilmes mistos foram mais resistentes aos processos
de TFD utilizados no presente estudo, com reduções médias que
62
variaram de 1,00 (19,56%) até 2,44 (43,9%) log10. Estes resultados
demonstram que quanto mais complexo o biofilme, maior é a resistência a
TFD.
Qin et al. (2008) também conseguiram uma redução
mínima, em torno de 21%, do biofilme coletado de pacientes com
periodontite, com a aplicação do AT e laser diodo. Porém no estudo
realizado por Müller et al. (2007) com biofilmes mistos crescidos em
discos de esmalte bovino, foi alcançada redução de apenas 0,4 log10,
considerada sem diferença estatística, com a aplicação de azul de
metileno e laser diodo (665 nm).
Atualmente, existe um consenso de que a obtenção de
efeito antimicrobiano de um determinado agente sobre microrganismos
crescidos em cultura planctônica é apenas um dado indicativo. Os
microrganismos organizados na forma de biofilmes apresentam um
aumento expressivo de resistência aos agentes antimicrobianos (Mah;
O`Toole, 2001). Esta resistência parece estar relacionada à presença da
matriz de polissacarídeos, a alterações na composição da parede celular,
a uma taxa de crescimento celular mais lento, bem como pela expressão
de genes de resistência aos agentes antimicrobianos (Costerton et al.,
1999). Assim, quando estudamos o uso TFD sobre biofilmes devemos
considerar que essas bactérias encontram-se mais resistentes.
Através de relatos da literatura, se observou uma
diferença quanto aos efeitos produzidos pela TFD em culturas
planctônicas dos mesmos microrganismos utilizados no presente estudo.
De acordo com os estudos de William et al. (2003) e Bevilacqua et al.
(2007), onde foi utilizado o fotossensibilizador AT e laser diodo no
primeiro e, Led no segundo, ambos conseguiram reduções de 100%
de S. mutans em culturas planctônicas.
Porém, em outros estudos as reduções encontradas
foram similares, ou até menores as mesmas obtidas na presente
dissertação. Em relação às reduções similares, o estudo realizado por
63
Peloi et al. (2008) com células em suspensão, utilizando Led (663 nm) e
fotossensibilizador AM, as reduções foram de 2,32 a 3,69 log10 e 2,78 a
3,88 log10, para S. aureus e C. albicans, respectivamente, conforme o
aumento do tempo de irradiação da fonte de luz. Outro Já no trabalho
realizado por Souza et al., (2006) com culturas planctônicas de C.
albicans, as reduções obtidas foram inferiores as observadas no atual
estudo, com 0,99 log10 com aplicação de AM e laser diodo (685 nm).
Alguns autores concluíram que a capacidade de formar
biofilmes
está
estritamente
relacionada
com
a
resistência
dos
microrganismos a TFD. Gad et al. (2004) relataram que as cepas de S.
aureus incazapes de produzir biofilmes são as mais sensíveis aos
procedimentos de TFD. Esta informação ficou mais evidente no estudo
realizado por Grinholc et al. (2008), onde cepas de S. aureus formadoras
de biofilmes foram mais resistentes, do que as mesmas sem esta
capacidade, quando sensibilizadas por porfirina e irradiadas por fonte de
luz de 624 nm.
Além da resistência produzida por cepas formadoras de
biofilmes a TFD, alguns parâmetros utilizados são alterados para que os
efeitos produzidos nessas situações sejam semelhantes àqueles obtidos
em
culturas
planctônicas
de microrganismos.
Lin et
al.
(2004)
demonstraram que as doses de luz requeridas para inativar biofilmes de
S. aureus, usando merocianina 540, são muito mais altas daquelas
utilizadas para culturas planctônicas, devido a penetração de luz dentro
dos biofilmes. No estudo realizado por Donnelly et al. (2007), também
foram observadas tais diferenças pois os autores necessitaram de
concentrações maiores de fotossensibilizador e doses mais altas de laser
para conseguir reduções iguais de C. albicans em biofilmes em relação
aos seus similares planctônicos.
A diferença de susceptibilidade de microrganismos em
culturas planctônicas e biofilmes, também foram encontradas em outras
espécies. Rovaldi et al. (2000) obitveram 6 log10 de redução pela
64
fotossensibilização com AM e laser de baixa potência. Entretanto, o
mesmo modelo de tratamento aplicado às amostras de biofilmes
bacterianos, isolados do periodonto de pacientes, realizado por Soukos et
al. (2003), reduziu uma média de 2 Log10.
Em relação aos efeitos isolados do laser (L+F-), foram
observadas reduções significativas nos biofilmes isolados de S. aureus
(GII), quando comparadas com a condição controle (L-F-), o que sugere
uma possível suscetibilidade deste microrganismo ao laser.
O efeito isolado do fotossensibilizador AM na ausência de
irradiação laser (L-F+) não apresentou diferença estatisticamente
significante em relação a condição controle (L-F-) em todos os grupos
analisados. Estes resultados sugerem que o AM não possui efeito
citotóxico para os microrganismos testados. Porém tais dados divergem
de relatos de estudos nos quais, sem a irradiação de luz, o AM
demonstrou atividade antifúngica e antibacteriana natural (Wainwright e
Crossley, 2002, Calzavara-Pinton et al., 2005).
Através das imagens de MEV pode-se observar que a
TFD produziu reduções predominantemente nas primeiras camadas dos
biofilmes, deixando alguns microrganismos em seu interior. De acordo
com O'Neill et al. (2002), este fato pode ser devido a incapacidade do
fotossensibilizador de se difundir através das camadas superficiais para
as mais internas do biofilme. Isto ilustra um potencial problema associado
a TFD, que segundo os autores, poderia ser superado com a seleção de
um fotossensibilizador capaz de penetrar através da matriz do biofilme,
seguido pela irradiação interna do mesmo através de fibra óptica.
As divergências encontradas no presente estudo, em
relação à literatura vigente, devem-se a ausência de protocolos prédefinidos para utilização da TFD. Ocorre que a grande variedade de
modelos laboratoriais, luzes, fotossensibilizadores e parâmetros utilizados
para se estudar a TFD sobre biofilmes orais, tornam a comparação dos
resultados bastante complexa. A concentração, tempo de incubação e
65
tipo
do
fotossensibilizador,
além
do
estágio
fisiológico
dos
microrganismos, período de exposição e densidade de energia do laser,
também pode influenciar os resultados da técnica de TFD (Wilson e Mia,
1993).
7 CONCLUSÃO
Tendo em vista os parâmetros utilizados, pode-se concluir
que a terapia fotodinâmica (TFD), representada neste estudo pela
fotossensibilização com azul de metileno seguida pela irradiação com
laser
de
baixa
potência
AsGaAl,
apresentou
significativo
efeito
antimicrobiano nos biofilmes formados in vitro pelos microrganismos
C. albicans, S. aureus e S. mutans, isolados e em associações. Assim,
parece ser uma abordagem útil no controle de biofilmes bucais.
8 REFERÊNCIAS*
Ackroyd R, Kelty C, Brown N, Reed M. The history of photodetection of the
photodynamic therapy. Photochem Photobiol. 2001;74(5):656-69.
Arendorf TM, Walker DM. The prevalence and intra-oral distribution of
Candida albicans in man. Arch Oral Biol. 1980;25(1):1-10.
Barbieri DSV, Vicente VA, Fraiz FC, Lavoranti OJ, Svidzinski TIE,
Pinheiros RLP. Analysis of the in vitro adherence of Streptococcus mutans
and Candida albicans. Braz J Microbiol. 2007;38:624-31.
Bevilacqua IM, Nicolau RA, Khouri S, Brugnera A Jr, Teodoro GR,
Zângaro RA, et al. The impact of photodynamic therapy on the viability of
Streptococcus mutans in a planktonic culture.Photomed Laser Surg.
2007;25(6):513-8.
Bhatti M, Macrobert A, Meghji S, Henderson B, Wilson M. Effect of
dosimetric and physiological factors on the lethal photosensitization of
Porphyromonas gingivalis in vitro. Photochem Photobiol. 1997;65(6):102631.
Bowden G, Edwardsson S. Ecologia oral e cárie dentária. In: Thylstrup A,
Fejerskov O. Cariologia clínica. 2ªed. São Paulo: Santos; 1995. Cap.3,
p.45-9.
______________________________
*Baseado em:
International Committee of Medical Journal Editors Uniform Requirements for
Manuscripts Submitted to Biomedical journals: Sample References [homepage
na Internet]. Bethesda:US NLM; c2003 [disponibilidade em 2008 ago; citado em
25 ago.] Disponível em:http://www.nilm.nih.gov/bsd/uniform_requirements.html
68
Branting C, Sund ML, Linder LE. The influence of Streptococcus mutans
on adhesion of Candida albicans to acrylic surfaces in vitro. Arch Oral Biol.
1989;34(5):347-53
Burns T, Wilson M, Pearson GJ. Killing of cariogenic bacteria by light from
gallium arsenide diode laser. J Dent. 1994;22(5):273-8.
Calzavara-Pinton PG, Venturini M, Sala R. A comprehensive overview of
photodynamic therapy in the treatment of superficial fungal infections of
the skin, J. Photochem. Photobiol. B Biol. 2005 jan;78(1):1–6.
Chandra J, Mukherjee PK, Leidich SD, Faddoul, FF, Hoyer LL, Douglas
LJ., et al. Antifungal resistance of candidal biofilms formed on denture
acrylic in-vitro. J Dent Res. 2001; 80:903–8.
Chokr A, Watier D, Eleaume E, Pangon B, Ghnassia JC, Mack D, et al.
Correlation between biofilm formation and production of polysaccharide
intercellular adhesin in clinical isolates of coagulase-negative
staphylococci. Int J Med Microbiol. 2005;296(6):381–8.
Costerton JW, Stewart PS, Greenberg EP. Bacterial biofilms: a common
cause of persistent infections. Science. 1999;284(5418):1318-22.
Davey ME, O’Toole GA. Microbial biofilms: from ecology to molecular
genetics. Microbiol Mol Biol Rev. 2000;64(4):847–67.
Dobson J, Wilson M. Sensitization of oral bacteria in biofilms to killing by
light from a low-power laser. Arch Oral Biol.1992;7(11):883-7.
Donnelly RF, Mccarron PA, Tunney MM, David-Woolfson A. Potential of
photodynamic therapy in treatment of fungal infections of the mouth.
Design and characterisation of a mucoadhesive patch containing toluidine
blue O. J Photochem Photobiol B Biol. 2007;86(1):59–69.
Duarte S, Gregoire S, Singh AP, Vorsa N, Schaich K, Bowen WH et al.
Inhibitory effects of cranberry polyphenols on formation and acidogenicity
of Streptococcus mutans biofilms. FEMS Microbiol. 2006;257(1):50-56.
69
Dunne WM. Bacterial Adhesion: Seen Any Good Biofilms Lately? Cllinical
Microbiol Rev. 2003;15(2):155-66.
El-Azizi MA, Starks SE, Khardori N. Interactions of Candida albicans with
other Candida spp. and bacteria in the biofilms. J Appl Microbiol.
2004;96(5):1067-73.
Fimple JL, Fontana CR, Foschi F, Ruggiero K, Song X, Pagonis TC et al.
Photodynamic treatment of endodontic polymicrobial infection in vitro. J
Endod. 2008;34(6):728-34.
Fontana CR, Abernethy AD, Som S, Ruggiero K, Doucette S, Marcantonio
RC et al. The antibacterial effect of photodynamic therapy in dental
plaque-derived biofilms. J Periodontal Res. 2009;8. (in Press)
Gad F, Zahra T, Hasan T, Hamblin MR. Effects of growth phase and
extracellular slime on photodynamic inactivation of Gram-positive
pathogenic bacteria. Antimicrob. Agents Chemother. 2004;48(6):2173-78.
Garcez AS, Ribeiro MS, Tegos GP, Núñez SC, Jorge AO, Hamblin MR.
Antimicrobial photodynamic therapy combined with conventional
endodontic treatment to eliminate root canal biofilm infection. Lasers Surg
Med. 2007;39(1):59-66.
Garcez AS, Souza FR, Núñez SC, Kather JM, Ribeiro MS.Terapia
fotodinâmica em odontologia – Laser de baixa potência para redução
microbiana. Rev Ass Paul Cirurg Dent. 2003;57(3):223-6.
Gibbons RJ. Adherent interactions which may affect microbial ecology in
the mouth. J Dent Res. 1984;63(3):378-85.
Gibbons RJ, Hay DI, Childs WC, Davis G. Role of cryptic receptors
(cryptitopes) in bacterial adhesion to oral surfaces. Arch Oral Biol.
1990;35(1):107-14.
70
Grinholc M, Kawiak A, Kurlenda J, Graczyk A, Krzysztof PB.
Photodynamic effect of protoporphyrin diarginate (PPArg2) on methicillinresistant Staphylococcus aureus and human dermal fibroblasts. Acta
Biochim Pol. 2008;55(1):85-90.
Halliday D, Resnick R, Walker J. Fundamentos de Física. 6ªed. Rio de
Janeiro: LTC; 2003. 350p.
Hannula J, Dogan B, Slots J, Okte E, Asikainen, S. Subgingival strains of
Candida albicans in relation to geographical origin and occurrence of
periodontal pathogenic bacteria. Oral Microbiol Immunol. 2001;16(2):113–
8.
Hardy KJ, Hawkey PM, Gao F, Oppenheim BA. Methicillin resistant
Staphylococcus aureus in the critically ill. Br J Anaesth. 2004;92(1):12130.
Harrington DJ, Russell RR. Identification and characterization of two
extracellular proteases of Streptococcus mutans. FEMS Microbiol
Lett.1994 Aug.; 121(2): 237-41.
Jackson MS, Bagg J, Gupta MN, Sturrock RD. Oral carriage of
staphylococci in patients with rheumatoid arthritis. Rheumatology.
1999;38(6):572-5.
Jãrvensivu A, Hietanen J, Rautemma R, Sorsa T, Richardson M. Candida
yeast in chronic periodontitis tissues and subgingival microbial biofilms in
vivo. Periodon Oral Microbiol. 2004;10(2):106-12.
Jenkinson HF, Lamont RJ. Streptococcal adhesion and colonization. Crit
Rev Oral Biol Med. 1997; 8(2): 175-200.
Kim KJ, You YO, Kim ES. Hemolysin like gene of Staphylococcus
lugdunensis in acute oral infection have partial homology with hemolysin
gene of Staphylococcus aureus. J Oral Biol. 1995;19(1):61-5.
71
Kim KJ, Yun HH, Jeong SI, Cha JD, Kim SM, You YO. Inhibitory effects of
Caesalpinia sappan on growth and invasion of methicillin-resistant
Staphylococcus aureus. J Ethnopharmacol. 2004;91(1):81-7.
Kirkpatrick WR, López-Ribot JL, Mcatee RK, Patterson TF. Growth
competition between Candida dubliniensis and Candida albicans under
broth and biofilm growing conditions. J Clin Microbiol. 2000;38(2):902-4.
Köhler B, Birkhed D, Olsson S. Acid production by human strains of
Streptococcus mutans and Streptococcus sobrinus. Caries Res.
1995;29(5):402-6.
Komerik N, Wilson M. Factors influencing the susceptibility of Gram
negative bacteria to toluidine blue O-mediated lethal photosensitization. J
Appl Microbiol. 2002; 92(4):618-23.
Kuhn DM, Chandra J, Mukherjee PK., Ghannoum MA. Comparison of
biofims formed by Candida albicans and Candida parapsilosis on
bioprosthetic surfaces. Infect Immun. 2002;70:878-88.
Kurachi C, Melo CS, Marcassa LG, Zílio SC, Bagnato VS, Cestari Filho
GA, et al. Implantação clínica da terapia fotodinâmica no Brasil: breve
histórico e resultados alcançados. Rev Soc Bras Cancer. 2002; 20:33-41.
Lamfon H, Porter SR, McCullough M, Pratten J. Formation of Candida
albicans biofilms on non-shedding oral surfaces. Eur J Oral Sci.
2003;111(6):465-71.
Lee BS, Lin YW, Chia JS. Bactericidal effects of diode laser on
Streptococcus mutans after irradiation through different thickness of
dentin. Lasers Surg Med. 2006; 38(1):62-9.
Lin HY, Chen CT, Huang CT. Use of merocyanine 540 for photodynamic
inactivation of Staphylococcus aureus planktonic and biofilm cells. Appl
Environ Microbiol. 2004;70:6453-8.
72
Loberto JCS, Martins CAP, Santos SSF, Cortelli JR, Jorge AOC.
Staphylococcus spp. in the oral cavity and periodontal pockets of chronic
periodontitis patients. Braz J Microbiol. 2004; 35(1):64-8.
Machado AEH. Terapia fotodinâmica: princípios, potencial de aplicação e
perspectivas. Quím Nova. 2000;23(2):237-43.
Malik Z, Hanania J, Nitzan Y. Bactericidal effects of photoactivated
porphyrins - an alternative approach to antimicrobial drugs. J Photochem
Photobiol B. 1990;5(3-4):281-93.Review.
Mah, TC, O´Toole GA. Mechanisms of biofilms resistance to antimicrobial
agents.Trends Microbiol. 2001;9(1):34-9.
Marcotte H, Lavoie MC. Oral microbial ecology and the role of salivary
immunoglobulin A. Microbiol Mol Biol Rev. 1998;62(1):71-109.
Marsh, PD. Dental plaque as a microbial biofilm. Caries Res. 2004;38(3):
204-11.
Marsh PD, Martin M. Oral microbiology. 3thed. London: Chapman & Hall;
1992. 249p.
Marsh, PD. Microbiological aspects of the chemical control of plaque and
gingivitis. J Dent Res. 1992;71(7):1431-8.
Martins CAP, Koga-Ito CY, Jorge C. Presence of Staphylococcus spp. and
Candida spp. in the human oral. Braz J Microbiol. 2002; 33(3):236-40.
Mello NR, Taguchi H, Jorge J, Pedro RJ, Almeida OP, Fukushima K, et al.
Oral Candida flora from brazilian human immunodeficiency virus-infected
patients in the highly active antiretroviral therapy era. Mem Inst Oswaldo
Cruz. 2004; 99(4):425-31.
73
Moran J, Addy M, Roberts S. A comparison of natural product, triclosan
and chlorexidine mouthrinses on 4-day plaque regrowth. J Clin
Periodontol. 1992;19(8):578-82.
Mülller P, Guggenheim B, Schmidlin PR. Efficacy of gasiform ozone and
photodynamic therapy on a multispecies oral biofilm in vitro. Eur J Oral
Sci. 2007;115(1):77-80.
Neves LS, Silva CMS, Henriques JFC, Cançado RH, Henriques RP,
Janson G. A utilização do laser em ortodontia. Rev Dent Press Ortodon
Ortop Facial. 2005; 10(5):149-56.
Nikawa H, Hamada T, Yamashiro H, Murata H, Subiwahjudi A. The effect
of saliva or serum on Streptococcus mutans and Candida albicans
colonization of hydroxyapatite beads. J Dent. 1998;26(1):31-7.
Nyvad B, Fejerskov O. Desenvolvimento, estrutura e ph da placa dental.
In: Thylstrup A, Fejerskov O. Cariologia Clínica. 2aed. São Paulo:
Santos;1995. 412p.
O'Neill JF, Hope CK, Wilson M. Oral bacteria in multi-species biofilms can
be killed by red light in the presence of toluidine blue. Lasers Surg Med.
2002;31(2):86-90.
Ooshima T, Osaka Y, Sasaki H, Osawa K, Yasuda H, Matsumura W. et al.
Caries inhibitory activity of cacao bean husk extract in in vitro and animals
experiments. Arch Oral Biol. 2000;45(8):639-45.
O'Sullivan JM, Jenkinson HF, Cannon RD. Adhesion of Candida albicans
to oral streptococci is promoted by selective adsortion of salivary proteins
to the streptococcal. Microbiology. 2000; 146(1):41-4.
O'Toole GA, Kaplan H, Kolter R. Biofilm formation as microbial
development. Ann Rev Microbiol. 2000 Oct: 54(1): 49-79.
74
Peloi LS, Soares RSS, Biondo CEG, Souza VR, Hioka N, Kimura E.
Photodynamic effect of light-emitting diode light on cell growth inhibition
induced by methylene blue. J. Biosci. 2008;33(2):231–7
Portera C. Forging a link between biofilms and disease. Science.
1999;283(5409):1837-9.
Qin Y, Luan X, Bi L, He G, Bai X, Zhou C et al. Toluidine blue-mediated
photoinactivation of periodontal pathogens from supragingival plaques.
Lasers Med Sci. 2008:23(1):49-54
Ramage G, Saville SP, Thomas DP, López-Ribot JL. Candida biofilms: an
update. Eukaryot Cell. 2005;4(4):633–8.
Rickard AH, Gilbert P, High NJ, Kolenbrarder PE, Handley PS. Bacterial
Coaggregation: an integral process in the development of multi-species
biofilms. Trends Microbiol. 2003;11(2):94-100.
Romanova NA, Brovko LY, Moore L, Pometun E, Savistsky AP, Ugarova
NN, et al. Assessment of photodynamic destruction of Escherichia coli
O157:H7 and Listeria monocytogenes by using ATP bioluminescence.
Appl Environ Microbiol.2003;69(11):6393-8.
Rosa FM, Hammerschmitt T, Souza HP. Utilização do laser de baixa
potência na prevenção e terapêutica da mucosite oral. Stomatos. 2005;
11(21):41-7.
Rovaldi CR, Pievsky A, Sole NA, Friden PM, Rothstein DM, Spacciapoli P.
Photoactive porphyrin derivative with broad spectrum activity against oral
pathogens in vitro. Antimicrob Agents Chemother. 2000;44(12):3364–7.
Sader HS, Pignatari AC, Hollons RJ, Leme I, Jones RN. Oxacillin and
quinolone resistant Staphylococcus aureus in São Paulo, Brazil: a
multicenter molecular and epidemiology study. Infect Control Hosp
Epidemiol. 1993;14(5):260-4.
75
Sakar S, Wilson M. Lethal photosensitization of bacteria in subgingival
plaque from patients with chronic periodontitis. J Periodont Res. 1993;
28(3):204-10.
Sharma M, Visai L, Bragheri F, Cristiani I, Gupta PK, Speziale P. Toluidine
blue-mediated photodynamic effects on staphylococcal biofilms.
Antimicrob Agents Chemother. 2008; 52(1):299-305.
Sen BH, Safavi KE, Sapangberg LSW. Growth patterns of Candida
albicans in relation to radicular dentin. Oral Surg Oral Med Oral
Pathol.1997;84(1):68-73.
Shen S, Samaranayake LP, Yip HK. In vitro growth, acidogenicity and
cariogenicity of predominant human root caries flora. J Dent. 2004;32(8):
667-78.
Shiavo DA, Perez EF, Kubota LT. Estudo eletroquímico do azul de
metileno adsorvido sobre sílica gel quimicamente modificada com óxido
de Nióbio. Quím Nova. 2000;6(23):832-4.
Smith AJ, Jackson MS, Bagg J. The ecology of Staphylococcus species in
the oral cavity. J Med Microbiol. 2001;50(11):940-6.
Socransky SS, Haffajee AD, Cugini MA, Smith C, Kent RL. Microbial
complexes in subgingival plaque. J Clin Periodontol. 1998;25(2):134-44.
Soukos NS, Mulholland SE, Socransky SS, Doukas AG. Photodestruction
of human dental plaque bacteria: enhancement of the photodynamic effect
by photomechanical waves in an oral biofilm model. Lasers Surg Med.
2003;33(3):161-8.
Souza SC, Junqueira JC, Balducci I, Koga-Ito CY, Munin E, Jorge AOC.
Photosensitization of different Candida species by low power laser light. J.
Photochem Photobiol B Biol. 2006;83(1):34-8.
Stewart PS, Costerton JW. Antibiotic resistance of bacteria in biofilms.
Lancet. 2001;358 (9276):135-8.
76
Tardivo JP, Giglio AD, Oliveira CS, Gabrielli DS, Junqueira HC, Tada DB,
et al. Methylene blue in photodynamic therapy: from basic mechanisms to
clinical applications. Photodiagnosis Photodyn Ther. 2005;2:1-17. Review
Thylstrup A, Fejerskov O. O ambiente oral: uma introdução. In_.
Cariologia clínica. 2aed. São Paulo: Santos; 1995. cap.1, p.13-6.
Usacheva MN, Teichert MC, Biel MA. Comparision of the methylene blue
and toluidine blue photobacterial efficacy against gram positive and gram
negative microrganisms. Laser Surg Med. 2001;29(2):165-73.
Wainwright M, Crossley KB. Methylene blue - a therapeutic dye for all
seasons. J Chemother. 2002;14(5):431–43.
Wen ZT, Burne RA. Functional genomics approach to identifying genes
required for biofilm development by Streptococcus mutans. Appl Environ
Microbiol. 2002;68(3):1196-203.
Williams JA, Pearson GJ, Colles MJ, Wilson M. The effect of variable
energy input from a novel light source on the photoactivated bactericidal
action of toluidine blue O on Streptococcus mutans. Caries Res.
2003;37(3):190-3.
Wilson M. Bactericidal effect of laser light ant its potencial use in the
treatment of plaque-related diseases. Int Dent J. 1994;44(2):181-9.
Wilson M, Burns T, Pratten J. Killing of Streptococcus sanguis in biofilms
using
a
light-activated
antimicrobial
agent.
J
Antimicrobial
Chemother.1996;37(2):377-81.
Wilson M, Dobson J, Harvey W. Sensitization of oral bacteria to killing by
low-power laser radiation. Curr Microbiol. 1992;25(2):77-81.
Wilson M. Lethal photosensitization of oral bacteria and its potential
application in the photodynamic therapy or oral infections. Photochem
Photobiol B. 2004;3:412-8.
77
Wilson M, Mia N. Sensitization of Candida albicans to killing by low-power
laser light. J Oral Pathol. 1993;22(88):354-7.
Wilson M, Pratten J. Lethal photosensitisation of Staphylococcus aureus in
vitro: effect of growth phase, serum, and pre-irradiation time. Lasers Surg
Med. 1995;16(3):272-6
Wilson M. Photolysis of oral bacteria and its potential use in the treatment
of caries and periodontal disease. J Appl Bacteriol. 1993;75(4):299-306.
Wimpenny J, Manz W, Szewzyk U. Heterogeneity in biofilms. FEMS
Microbiol Rev. 2000;24(1):661-71.
Wood S, Metcalf D, Devine D, Robinson C. Erytrosine is a potential
photosensitizer for the photodynamic therapy of oral plaque biofilms. J
Antimicrob Chemother. 2006;57(4):680-4.
Wood S, Nattress N, Kirkham J, Shore R, Brookes S, Griffiths J, et al. An
in vitro study of the use of photodynamic therapy for the treatment of
natural oral plaque biofilms formed in vivo. J Photochem Photobiol B.
1999;50(1):1-7.
Zanin ICJ, Brugnera Junior A, Goncalves RB. In vitro study of bactericidal
effect of low level laser therapy in the presence of photosensitizer on
cariogenic bacteria. Laser Dent 2002;2(4610):154-61.
Zanin ICJ, Goncalves RB, Brugnera Junior A, Hope CH, Pratten J.
Susceptibility of Streptococcus mutans biofilms to photodynamic therapy:
an in vitro study. J Antimicrob Chemother. 2005;56(2):680-4.
Zanin ICJ, Lobo MM, Rodrigues LK, Pimenta LA, Hofling JF, Gonçalves
RB. Photosensitization of in vitro biofilms by toluidine blue O combined
with light-emitting diode. Eur J Oral Sci. 2006;114(1):64-9.
Zeina B, Greenman J, Purcell WM, Das B. Killing of cutaneous microbial
species by photodynamic therapy. Br J Dermatol. 2001;144(2):274-8.
78
APÊNDICE A – Dados individuais dos ensaios realizados para cada
grupo de biofilme
Tabela 11 – Números de UFC/mL (Log10), médias e desvio-padrão
obtidos nos ensaios realizados, nas diferentes condições
experimentais, no grupo GI de biofilme de C. albicans.
Ensaio
L+F-
L-F+
L-F-
L+F+
1
5,74
5,76
5,80
3,40
2
5,68
5,70
5,81
3,48
3
5,69
5,71
5,73
3,30
4
5,65
5,62
5,76
3,43
5
5,70
5,77
5,79
3,30
6
5,72
5,71
5,76
3,54
7
5,69
5,76
5,78
3,34
8
5,69
5,72
5,75
3,48
9
5,67
5,69
5,73
3,65
10
5,66
5,68
5,75
3,54
Média
5,69A
5,71A
5,77A
3,45B
DP
0,03
0,04
0,03
0,12
Letras diferentes indicam diferença estatisticamente significante entre as condições
experimentais (p<0,05, Análise de variância ANOVA, teste TUKEY).
DP: Desvio-padrão
L+F-: biofilme irradiado somente com laser L-F+: biofilme tratado somente com
fotossensibilizador L-F-: biofilme não irradiado pelo laser e sem fotossensibilizador
L+F+: biofilme tratado com o fotossensibilizador e irradiado pelo laser.
79
Tabela 12 – Números de UFC/mL (Log10), médias e desvio-padrão
obtidos nos ensaios realizados, nas diferentes condições
experimentais, no grupo GII de biofilme de S. aureus
Ensaio
L+F-
L-F+
L-F-
L+F+
1
5,72
5,81
5,88
2,60
2
5,82
5,88
5,90
2,30
3
5,73
5,73
5,86
2,48
4
5,73
5,80
5,95
2,70
5
5,74
5,83
5,88
2,90
6
5,78
5,83
5,93
2,30
7
5,72
5,81
5,89
2,85
8
5,72
5,80
5,92
2,60
9
5,78
5,83
5,91
2,48
10
5,81
5,82
5,83
2,78
A
Média
5,75
DP
0,04
AB
5,81
0,04
B
5,89
2,60C
0,03
0,21
Letras diferentes indicam diferença estatisticamente significante entre as condições
experimentais (p<0,05, Análise de variância ANOVA, teste TUKEY).
DP: Desvio-padrão
L+F-: biofilme irradiado somente com laser L-F+: biofilme tratado somente com
fotossensibilizador L-F-: biofilme não irradiado pelo laser e sem fotossensibilizador
L+F+: biofilme tratado com o fotossensibilizador e irradiado pelo laser.
80
Tabela 13 – Números de UFC/mL (Log10), médias e desvio-padrão
obtidos nos ensaios realizados, nas diferentes condições
experimentais, no grupo GIII de biofilme de S. mutans
Ensaio
L+F-
L-F+
L-F-
L+F+
1
5,83
5,83
5,94
3,15
2
5,81
5,86
5,95
3,18
3
5,88
5,89
5,91
3,00
4
5,86
5,88
5,89
3,08
5
5,88
5,90
5,98
3,18
6
5,83
5,90
5,93
3,00
7
5,83
5,85
5,87
3,00
8
5,86
5,89
5,90
3,34
9
5,84
5,88
5,98
3,30
10
5,87
5,86
5,94
3,00
A
Média
5,85
DP
0,02
A
A
5,87
5,93
3,12B
0,02
0,04
0,13
Letras diferentes indicam diferença estatisticamente significante entre as condições
experimentais (p<0,05, Análise de variância ANOVA, teste TUKEY).
DP: Desvio-padrão
L+F-: biofilme irradiado somente com laser L-F+: biofilme tratado somente com
fotossensibilizador L-F-: biofilme não irradiado pelo laser e sem fotossensibilizador
L+F+: biofilme tratado com o fotossensibilizador e irradiado pelo laser.
81
Tabela 14 – Números de UFC/mL (Log10), médias e desvio-padrão
obtidos nos ensaios realizados, nas diferentes condições
experimentais, no grupo GIV de biofilme de C. albicans e
S. aureus. Os dados referem-se a levedura C. albicans
Ensaio
L+F-
L-F+
L-F-
L+F+
1
5,35
5,45
5,40
3,38
2
5,40
5,38
5,41
3,48
3
5,38
5,37
5,38
3,60
4
5,36
5,34
5,40
3,48
5
5,34
5,40
5,45
3,40
6
5,41
5,44
5,48
3,70
7
5,37
5,45
5,51
3,54
8
5,38
5,40
5,41
3,65
9
5,45
5,45
5,45
3,60
10
5,37
5,38
5,39
3,40
A
A
A
Média
5,38
5,41
5,43
3,52B
DP
0,03
0,04
0,04
0,11
Letras diferentes indicam diferença estatisticamente significante entre as condições
experimentais (p<0,05, Análise de variância ANOVA, teste TUKEY).
DP: Desvio-padrão
L+F-: biofilme irradiado somente com laser L-F+: biofilme tratado somente com
fotossensibilizador L-F-: biofilme não irradiado pelo laser e sem fotossensibilizador
L+F+: biofilme tratado com o fotossensibilizador e irradiado pelo laser.
82
Tabela 15 – Números de UFC/mL (Log10), médias e desvio-padrão
obtidos nos ensaios realizados, nas diferentes condições
experimentais, no grupo GIV de biofilme de C. albicans e
S. aureus. Os dados referem-se a bactéria S. aureus
Ensaio
L+F-
L-F+
L-F-
L+F+
1
5,54
5,59
5,62
3,04
2
5,54
5,54
5,57
3,00
3
5,38
5,41
5,45
3,18
4
5,45
5,63
5,69
3,08
5
5,39
5,54
5,56
3,18
6
5,40
5,43
5,54
3,00
7
5,51
5,47
5,57
3,18
8
5,45
5,43
5,46
3,20
9
5,45
5,51
5,53
3,26
10
5,43
5,45
5,47
3,00
A
Média
5,45
DP
0,06
AB
5,50
0,07
B
5,55
3,11C
0,07
0,10
Letras diferentes indicam diferença estatisticamente significante entre as condições
experimentais (p<0,05, Análise de variância ANOVA, teste TUKEY).
DP: Desvio-padrão
L+F-: biofilme irradiado somente com laser L-F+: biofilme tratado somente com
fotossensibilizador L-F-: biofilme não irradiado pelo laser e sem fotossensibilizador
L+F+: biofilme tratado com o fotossensibilizador e irradiado pelo laser.
83
Tabela 16 – Números de UFC/mL (Log10), médias e desvio-padrão
obtidos nos ensaios realizados, nas diferentes condições
experimentais, no grupo GV de biofilme de C. albicans e
S. mutans. Os dados referem-se a levedura C. albicans
Ensaio
L+F-
L-F+
L-F-
L+F+
1
5,32
5,34
5,41
3,85
2
5,40
5,45
5,45
3,78
3
5,52
5,41
5,57
3,70
4
5,51
5,53
5,54
3,88
5
5,42
5,44
5,46
3,90
6
5,38
5,45
5,48
3,81
7
5,37
5,40
5,45
3,70
8
5,43
5,38
5,44
3,48
9
5,45
5,46
5,51
3,54
10
5,40
5,40
5,45
3,85
A
Média
5,42
DP
0,06
A
A
5,43
5,48
3,75B
0,05
0,05
0,14
Letras diferentes indicam diferença estatisticamente significante entre as condições
experimentais (p<0,05, Análise de variância ANOVA, teste TUKEY).
DP: Desvio-padrão
L+F-: biofilme irradiado somente com laser L-F+: biofilme tratado somente com
fotossensibilizador L-F-: biofilme não irradiado pelo laser e sem fotossensibilizador
L+F+: biofilme tratado com o fotossensibilizador e irradiado pelo laser.
84
Tabela 17 – Números de UFC/mL (Log10), médias e desvio-padrão
obtidos nos ensaios realizados, nas diferentes condições
experimentais, no grupo GV de biofilme de C. albicans e
S. mutans. Os dados referem-se a bactéria S. mutans
Ensaio
L+F-
L-F+
L-F-
L+F+
1
5,53
5,68
5,66
3,48
2
5,67
5,62
5,72
3,30
3
5,65
5,64
5,68
3,65
4
5,60
5,63
5,66
3,40
5
5,63
5,66
5,72
3,70
6
5,65
5,64
5,76
3,60
7
5,67
5,68
5,71
3,54
8
5,64
5,66
5,72
3,30
9
5,62
5,70
5,73
3,38
10
5,68
5,65
5,76
3,65
A
Média
5,63
DP
0,04
A
A
5,66
5,71
3,50B
0,02
0,04
0,15
Letras diferentes indicam diferença estatisticamente significante entre as condições
experimentais (p<0,05, Análise de variância ANOVA, teste TUKEY).
DP: Desvio-padrão
L+F-: biofilme irradiado somente com laser L-F+: biofilme tratado somente com
fotossensibilizador L-F-: biofilme não irradiado pelo laser e sem fotossensibilizador
L+F+: biofilme tratado com o fotossensibilizador e irradiado pelo laser.
85
Tabela 18 – Números de UFC/mL (Log10), médias e desvio-padrão
obtidos nos ensaios realizados, nas diferentes condições
experimentais, no grupo GVI de biofilme de S. aureus e
S. mutans. Os dados referem-se a bactéria S. aureus
Ensaio
L+F-
L-F+
L-F-
L+F+
1
5,47
5,48
5,59
3,00
2
5,40
5,42
5,45
3,34
3
5,46
5,51
5,56
3,30
4
5,34
5,40
5,45
3,40
5
5,36
5,45
5,51
3,18
6
5,46
5,57
5,62
3,40
7
5,48
5,54
5,54
3,30
8
5,40
5,40
5,45
3,48
9
5,46
5,51
5,54
3,40
10
5,54
5,56
5,57
3,30
A
Média
5,44
DP
0,06
A
A
5,48
5,53
3,31B
0,06
0,06
0,14
Letras diferentes indicam diferença estatisticamente significante entre as condições
experimentais (p<0,05, Análise de variância ANOVA, teste TUKEY).
DP: Desvio-padrão
L+F-: biofilme irradiado somente com laser L-F+: biofilme tratado somente com
fotossensibilizador L-F-: biofilme não irradiado pelo laser e sem fotossensibilizador
L+F+: biofilme tratado com o fotossensibilizador e irradiado pelo laser.
86
Tabela 19 – Números de UFC/mL (Log10), médias e desvio-padrão
obtidos nos ensaios realizados, nas diferentes condições
experimentais, no grupo GVI de biofilme de S. aureus e
S. mutans. Os dados referem-se a bactéria S. mutans
Ensaio
L+F-
L-F+
L-F-
L+F+
1
5,53
5,58
5,62
3,70
2
5,53
5,57
5,68
3,54
3
5,62
5,65
5,65
3,60
4
5,56
5,62
5,66
3,70
5
5,48
5,51
5,53
3,54
6
5,68
5,68
5,76
3,48
7
5,62
5,65
5,68
3,65
8
5,60
5,64
5,71
3,48
9
5,53
5,51
5,54
3,54
10
5,60
5,63
5,72
3,30
A
Média
5,57
DP
0,06
A
A
5,60
5,65
3,55B
0,06
0,07
0,12
Letras diferentes indicam diferença estatisticamente significante entre as condições
experimentais (p<0,05, Análise de variância ANOVA, teste TUKEY).
DP: Desvio-padrão
L+F-: biofilme irradiado somente com laser L-F+: biofilme tratado somente com
fotossensibilizador L-F-: biofilme não irradiado pelo laser e sem fotossensibilizador
L+F+: biofilme tratado com o fotossensibilizador e irradiado pelo laser.
87
Tabela 20 – Números de UFC/mL (Log10), médias e desvio-padrão
obtidos nos ensaios realizados, nas diferentes condições
experimentais, no grupo GVII de biofilme de C. albicans,
S. aureus e S. mutans. Os dados referem-se a levedura
C. albicans
Ensaio
L+F-
L-F+
L-F-
L+F+
1
5,08
5,10
5,11
4,26
2
5,11
5,08
5,15
4,00
3
5,00
5,06
5,10
3,95
4
4,95
5,00
5,04
4,20
5
5,10
5,08
5,11
4,11
6
5,13
5,15
5,15
4,15
7
5,11
5,13
5,18
4,08
8
5,13
5,08
5,16
4,00
9
5,16
5,18
5,20
4,23
10
4,98
4,93
4,98
4,18
Média
5,07A
5,08A
5,12A
4,12B
DP
0,07
0,07
0,07
0,11
Letras diferentes indicam diferença estatisticamente significante entre as condições
experimentais (p<0,05, Análise de variância ANOVA, teste TUKEY).
DP: Desvio-padrão
L+F-: biofilme irradiado somente com laser L-F+: biofilme tratado somente com
fotossensibilizador L-F-: biofilme não irradiado pelo laser e sem fotossensibilizador
L+F+: biofilme tratado com o fotossensibilizador e irradiado pelo laser.
88
Tabela 21 – Números de UFC/mL (Log10), médias e desvio-padrão
obtidos nos ensaios realizados, nas diferentes condições
experimentais, no grupo GVII de biofilme de C. albicans,
S. aureus e S. mutans. Os dados referem-se a bactéria
S. aureus
Ensaio
L+F-
L-F+
L-F-
L+F+
1
5,02
5,08
5,18
3,30
2
5,10
5,11
5,18
3,78
3
5,11
5,18
5,26
3,70
4
5,00
5,04
5,11
3,85
5
5,11
5,11
5,13
3,90
6
5,16
5,18
5,20
3,60
7
5,13
5,20
5,23
3,48
8
5,22
5,24
5,26
3,85
9
5,00
5,02
5,06
3,70
10
4,98
5,10
5,18
3,90
Média
5,08A
5,13A
5,18A
3,71B
DP
0,08
0,07
0,06
0,20
Letras diferentes indicam diferença estatisticamente significante entre as condições
experimentais (p<0,05, Análise de variância ANOVA, teste TUKEY).
DP: Desvio-padrão
L+F-: biofilme irradiado somente com laser L-F+: biofilme tratado somente com
fotossensibilizador L-F-: biofilme não irradiado pelo laser e sem fotossensibilizador
L+F+: biofilme tratado com o fotossensibilizador e irradiado pelo laser.
89
Tabela 22 – Números de UFC/mL (Log10), médias e desvio-padrão
obtidos nos ensaios realizados, nas diferentes condições
experimentais, no grupo GVII de biofilme de C. albicans,
S. aureus e S. mutans. Os dados referem-se a bactéria
S. mutans
Ensaio
L+F-
L-F+
L-F-
L+F+
1
5,13
5,16
5,30
4,04
2
5,18
5,22
5,28
4,11
3
5,08
5,11
5,15
3,95
4
5,20
5,24
5,27
3,90
5
5,15
5,11
5,15
3,78
6
5,08
5,10
5,13
3,85
7
5,26
5,23
5,26
4,00
8
5,15
5,18
5,23
3,90
9
5,11
5,08
5,18
3,95
10
5,04
5,11
5,15
4,08
Média
5,14A
5,15A
5,21A
3,96B
DP
0,06
0,06
0,06
0,10
Letras diferentes indicam diferença estatisticamente significante entre as condições
experimentais (p<0,05, Análise de variância ANOVA, teste TUKEY).
DP: Desvio-padrão
L+F-: biofilme irradiado somente com laser L-F+: biofilme tratado somente com
fotossensibilizador L-F-: biofilme não irradiado pelo laser e sem fotossensibilizador
L+F+: biofilme tratado com o fotossensibilizador e irradiado pelo laser.
90
ANEXO A – Certificado do comitê de ética em pesquisa
Pereira CA. In vitro effects of photodynamic therapy in biofilms of Candida
albicans, Staphylococcus
aureus
and Streptococcus
mutans.
[dissertation]. São José dos Campos: School of Dentistry of São José dos
Campos, UNESP – São Paulo State University; 2009.
ABSTRACT
The purpose of this study was to evaluate the antimicrobial effect of
photodynamic therapy (PDT) in biofilms formed by C. albicans (GI), S.
aureus (GII) and S. mutans (GIII), alone and in associations (GIVGVII).The biofilms were grown in acrylic resin discs immersed in sterile
brain heart infusion broth (BHI) containing 5% sucrose, inoculated with
microbial suspension and incubated for 5 days. On the fifth day, the discs
were washed in sterile saline solution in order to remove loosely bound
material. The effects of the methylene blue (MB) photosensitizers at a
concentration of 0,1 mg/mL for 5 min and AsGaAl laser (660 nm) for 98 s,
alone and conjugated were evaluated. The dics were placed into tubes
with sterile saline solution and sonicated for 30 s in order to disperse the
biofilms. Ten-fold serial dilutions were carried out and aliquots plated in
selective agar which were then incubated for 48 h. Then the numbers
CFU/mL (log10) were counted and analyzed statistically (ANOVA, Tukey´s
test, p< 0,05). Scanning electron microscopy (SEM) on discs with PDT
and control biofilms groups were performed. Significant decreases in the
viability of all microorganisms were observed when biofilms were exposed
to both MB and laser. Reductions (log10) in single-species biofilms were
greater than associated biofilms with: 40.22% for C. albicans (GI), 55.91%
for S. aureus (GII) and 47.35% for S. mutans (GIII). In associated biofilms
the reductions (Log10) were: 35.08% for C. albicans and 43.9% for S.
aureus (GIV); 31.54% for C. albicans and 38.7% for S. mutans (GV);
40.12% for S. aureus and 37.14% for S. mutans (GVI); 19.56% for C.
albicans, 28.41% for S. aureus and 24.94% for S. mutans (GVII).
Scanning electron microscopy micrographs suggested that lethal
photosensitization occurred predominantly in the outermost layers of the
biofilms. It was concluded that PDT using MB photosensitizer and laser
may be a useful approach in the control of oral biofilms.
Keywords: Biofilm. Candida albicans. Staphylococcus
Streptococcus mutans. Photododynamic therapy.
aureus.