CAROLINA COSTA FIGUEIREDO
ANÁLISE DAS VARIAÇÕES DO NÚMERO DE REPETIÇÕES CAG DO GENE
DO RECEPTOR ANDROGÊNICO COMO MÉTODO DE TRIAGEM PARA
SÍNDROME DE TURNER EM MENINAS COM BAIXA ESTATURA
Tese apresentada ao Curso de Pós-Graduação
da Faculdade de Ciências Médicas da Santa
Casa de São Paulo, para obtenção do Título de
Mestre em Medicina.
São Paulo
2007
CAROLINA COSTA FIGUEIREDO
ANÁLISE DAS VARIAÇÕES DO NÚMERO DE REPETIÇÕES CAG DO
GENE DO RECEPTOR ANDROGÊNICO COMO MÉTODO DE TRIAGEM
PARA SÍNDROME DE TURNER EM MENINAS COM BAIXA ESTATURA
Tese apresentada ao Curso de PósGraduação da Faculdade
de
Ciências
Médicas da Santa de São Paulo, para
obtenção do Título de Mestre em Medicina.
Área de Concentração: Pediatria
Orientadora: Profa. Dra. Cristiane Kochi
São Paulo
2007
FICHA CATALOGRÁFICA
Preparada pela Biblioteca Central da
Faculdade de Ciências Médicas da Santa Casa de São Paulo
Figueiredo, Carolina Costa
Análise das variações do número de repetições CAG do
gene do receptor androgênico como método de triagem para
síndrome de Turner em meninas com baixa estatura./ Carolina
Costa Figueiredo. São Paulo, 2007.
Tese de Mestrado. Faculdade de Ciências Médicas da
Santa Casa de São Paulo – Curso de pós-graduação em
Medicina.
Área de Concentração: Pediatria
Orientador: Cristiane Kochi
1. Síndrome de Turner 2. Receptores androgênicos/genética
3. Triagem genética/métodos
BC-FCMSCSP/71-07
Dedicatória
Ao meu querido marido, Sylas
Por todo seu apoio e carinho;
Aos meus pais,
Luiz Fernando e Mary Lou,
Por tudo que me proporcionaram;
Às minhas irrmãs,
Marianna e Juliana,
Sempre presentes e companheiras;
Aos meus amigos,
Pelo incentivo e confiança.
Agradecimentos
À Profa. Dra. Cristiane Kochi,
Que possibilitou a finalização desta tese,
Pelo seu incentivo, confiança, ensinamentos e amizade;
Ao Prof. Dr. Carlos Longui,
Que muito admiro e agradeço pelos ensinamentos na Medicina Molecular e
Endocrinologia Pediátrica;
Ao Prof. Dr. Osmar Monte,
Prezado professor desde a Faculdade, sempre paciente com nossas dúvidas;
Ao Dr. Luis Eduardo Calliari,
Pelos ensinamentos, incentivo, amizade e confiança;
À Dra. Cláudia Dutra Costantin Faria e Dr. Mauro Borghi,
Pelo apoio e colaboração na minha formação;
À Profª. Mylene Neves Rocha,
Companheira incansável, que muito colaborou para a realização desta tese;
À Profª. Dra. Márcia Castaldi Abel,
Pela amizade, companheirismo e primeiros ensinamentos na área de iniciação
científica;
Ao Flávio Richeti,
Pela sua atenção e importante colaboração na finalização desta tese;
À Rosângela Arrabal,
Sempre disponível e muito atenciosa;
À Dra. Nara Michelle de Araújo Evangelista,
Pela sua grande colaboração no ambulatório e no levantamento da casuística;
À Faculdade de Ciências Médicas da Santa Casa de São Paulo e à
Irmandade da Santa Casa de Misericórdia de São Paulo, onde realizei toda
a minha formação, desde a Faculdade de Medicina até a Pós Graduação.
A todas as pacientes e familiares que participaram deste trabalho.
Abreviaturas e Símbolos
ST = Síndrome de Turner
BE = Baixa estatura
TH = Estatura-alvo
ZE = Escore Z de estatura
EN = Estatura de nascimento
PN = Peso de nascimento
IC = Idade cronológica
RNPT-PIG = Recém-nascido pré-termo – pequeno para idade gestacional
RNT-PIG = Recém-nascido a termo – pequeno para idade gestacional
SHOX = Gene Short stature homeoboX-containing
GH = Hormônio de crescimento
Xp = Braço curto do cromossomo X
Xq = Braço longo do cromossomo X
Xr = Cromossomo X em anel
RA = Receptor androgênico
PCR = Reação em cadeia de polimerase
DM = Diabetes mellitus
HAS = Hipertensão arterial sistêmica
IGF = Fator de crescimento insulina-like
STR = Short tandem repeats
SNP = Single nucleotide polymorphism
Sumário
1. INTRODUÇÃO…………………………………………………………….... 01
2. REVISÃO DE LITERATURA.................................................................. 03
2.1 . Métodos de diagnóstico para ST............................................... 07
2.2 . Métodos moleculares de triagem para ST................................ 08
2.3 . Receptor androgênico e análise do DNA pelo GeneScan........ 16
3. OBJETIVO............................................................................................. 20
4. CASUÍSTICA E MÉTODOS................................................................... 21
5. RESULTADOS....................................................................................... 26
6. DISCUSSÃO.......................................................................................... 29
7. CONCLUSÃO........................................................................................ 34
8. ANEXOS................................................................................................ 35
9. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS...................................................... 39
FONTES CONSULTADAS.......................................................................... 44
RESUMO..................................................................................................... 45
ABSTRACT................................................................................................. 46
APÊNDICE.................................................................................................. 47
1
1 – Introdução
Dentre as anormalidades cromossômicas existentes, a síndrome de
Turner (ST) é uma das mais freqüentes, presente em torno de 3% das
concepções. Sua taxa de mortalidade fetal é alta, com cerca de 99% dos fetos
acometidos sofrendo aborto espontâneo, principalmente no primeiro trimestre
da gestação. A incidência varia desde 1:1.800 até 1:5.000 meninas nascidas
vivas em diferentes populações (Lippe, 1991). A prevalência da síndrome ao
nascimento foi estimada na população branca em torno de 25-55 casos por
100.000 meninas (Stratakis et al, 2005).
Algumas das meninas com ST são reconhecidas logo ao nascimento,
quando há alterações dismórficas, como linfedema de mãos e pés ou de
anormalidades cardíacas sugerindo o diagnóstico, porém correspondem a
apenas 20% dos casos e estão relacionadas com a monossomia do
cromossomo X (Gicquel et al, 1998).
Na maioria das vezes, no entanto, o diagnóstico é feito tardiamente na
infância, durante a investigação da baixa estatura, ou na adolescência, pela
combinação de falência do crescimento e atraso puberal, ou apenas na idade
adulta devido à infertilidade ou amenorréia (Massa, VanderschuerenLodeweyckx, 1991; Rosenfeld, 2000).
O diagnóstico precoce possibilita o tratamento adequado da baixa
estatura com o hormônio de crescimento (GH) e a reposição estrogênica em
idade apropriada, melhorando o prognóstico da estatura final e o aspecto
psicossocial das pacientes.
2
Portanto, técnicas que permitam uma triagem das pacientes de risco
seriam importantes para reduzir a idade do diagnóstico e a introdução
adequada do tratamento.
3
2 – Revisão da Literatura
A ST é resultante da monossomia completa ou parcial do cromossomo X
em um fenótipo feminino, associado a alguns caracteres clínicos típicos, sendo
os mais prevalentes a baixa estatura e a disgenesia gonadal (Elsheikh et al,
2002). Em aproximadamente 50% dos casos de ST, ocorre a monossomia
completa do cromossomo X, sendo a outra metade composta por mosaicismos
e outras anormalidades cromossômicas (Stratakis et al, 2005) (tab. 1).
TABELA 1: Freqüência dos cariótipos encontrados na ST.
Cariótipo
Freqüência (%)
45,X
55
46,X,i(Xq)
17
45,X/46,XX e 45,X/47,XXX
14
45,X/46,X,r(X)
5
45,X/46,XY
5
46,XXq e 45,X/46,XXq
2
Outros mosaicismos e
2
translocações
Adaptada de Stratakis et al, 2005.
No entanto, em uma análise citogenética prospectiva de 34.910 recémnascidos, sendo 17.038 do sexo feminino, foram encontrados 9 casos de ST,
com apenas 1 caso apresentando cariótipo 45,X (Nielsen, Wohlert, 1991).
Dentre as anormalidades associadas à ST, a baixa estatura é a mais
freqüente, estando presente em 95 a 100% das meninas. Em 2004, Gravholt
revisou todas as anormalidades relacionadas com a ST e suas respectivas
freqüências, a partir de diferentes estudos publicados (tab. 2). Cada alteração
observada na ST aparece com maior ou menor freqüência de acordo com a
faixa etária (Donaldson et al, 2006).
4
TABELA 2: Principais características fenotípicas da ST e suas freqüências.
_______________________________________________________________
Anormalidades
Frequência (%)
Atraso do crescimento e baixa estatura
95-100
Infertilidade
98
Atraso puberal
85
Atraso da idade óssea
85
Diminuição da densidade mineral
50-80
Enzimas hepáticas elevadas
50-80
Otites de repetição
60
Micrognatia
60
Hipertensão arterial sistêmica (HAS)
50
Cúbito valgo
50
Implantação baixa de cabelos na nuca
40
Pescoço curto
40
Problemas psicológicos
40
Palato alto
35
Encurtamento do 4º metacarpo
35
Deficiências auditivas
30
Hipertelorismo mamário
30
Intolerância à glicose
15-50
Dilatação/aneurisma da aorta
3-42
Válvula aórtica bicúspide
14-34
Pescoço alado
25
Linfedema de mãos e pés nos RN
25
Nevus pigmentados
25
Posição anormal ou duplicação calicial
15
Tireoidite de Hashimoto
15
Coarctação da aorta
7-14
DM tipo 2
10
Rins em ferradura
10
Deformidade de Madelung
5
_____________________________________________________________
Adaptada de Gravholt, 2004.
5
As pacientes com ST, quando não tratadas, atingem aproximadamente
de 86% a 88% da estatura média das mulheres com raça e nacionalidade
similares. Um dos primeiros estudos que procurou melhor entender este
aspecto da síndrome foi realizado por Ranke et al (1983) que avaliaram o
crescimento espontâneo de 150 meninas com ST, sem tratamento com
hormônio de crescimento (GH). Eles descreveram 4 períodos que caracterizam
o crescimento na ST: (a) restrição de crescimento intra-uterino, (b) período de
crescimento próximo ao normal até 2 ou 3 anos de vida, (c) desaceleração
progressiva do ritmo de crescimento a partir dos 3 até os 13 anos de idade, e
(d) ausência do estirão puberal, parcialmente compensado pelo atraso na fusão
das epífises.
Em um estudo subseqüente realizado por Lyon et al (1985),
incorporando os achados de Ranke e de outros 3 estudos europeus foi possível
construir curvas de crescimento específicas para ST, que se apresentavam
com estatura final média em torno de 143 cm. Esse valor assemelha-se ao
encontrado em um estudo brasileiro que avaliou as medidas antropométricas
de pacientes com ST sem tratamento com GH, tendo encontrado estatura final
média de 145,5±6,7cm, com mediana de 143cm (Baldin et al, 2005).
Não há dados que evidenciem alterações do eixo GH-IGF como causa
da baixa estatura nas pacientes com ST, a qual tem sido associada à
haploinsuficiência do cromossomo X, em especial do gene SHOX. Porém,
evidências substanciais têm sido acumuladas nos últimos 20 anos, mostrando
que o uso de GH durante a infância pode melhorar a estatura final.
Em um estudo realizado por Reiter e colaboradores (2001), foram
avaliadas 471 meninas norte-americanas com ST registradas no National
6
Cooperative Growth Study (NCGS). As pacientes apresentavam estatura
próxima da estatura final e iniciaram tratamento com GH em média aos 11,7
anos de idade, algumas a partir dos 2 anos, sendo que 344 delas receberam
reposição estrogênica. Os dados analisados demonstraram que o início do GH
precocemente, por período mais longo sem estrogênios associados, permite a
indução puberal em época adequada (entre 11-12 anos), com maior ganho na
previsão da estatura final. Nas pacientes que iniciaram o tratamento com idade
média de 8,2 anos, o ganho na previsão de estatura final foi de 8,1cm,
significantemente maior que nas pacientes que iniciaram o tratamento com
idade média de 14,9 anos, em que o ganho foi de 4,6cm em relação à previsão
de estatura final.
Resultado semelhante foi encontrado em outro estudo que avaliou 60
pacientes que iniciaram o tratamento com GH em idade média aos 9,5 anos e
reposição estrogênica com 12 ou 15 anos. As pacientes que ficaram maior
tempo com uso isolado do GH apresentaram crescimento maior que as demais,
ficando em média 3,4cm mais altas, com estatura final ou próxima à estatura
final de 150,4cm, enquanto nas demais pacientes a estatura final foi de
147,0cm (Chernausek et al, 2000).
Na análise realizada em 987 pacientes ST registradas no estudo
fármaco-epidemiológico
Kabi
International
Growth
Study
(KIGS),
que
receberam GH e apresentavam estatura próxima da estatura final, foi possível
observar que a média da estatura próxima da final foi de 151 cm, com ganho
de 5 cm em relação à estatura projetada no início do tratamento. Porém, é
importante ressaltar que essas pacientes iniciaram o tratamento com idade
mediana de 9,7 anos (Ranke et al, 2007).
7
2.1 – Métodos de diagnóstico para ST
Atualmente os métodos disponíveis para o diagnóstico da ST incluem a
cromatina oral, o cariótipo e FISH. A cromatina oral baseia-se na identificação
do corpúsculo de Barr, um aglomerado de heterocromatina adjacente à
membrana nuclear, que corresponde ao cromossomo X inativo (Behrman,
Kliegman, 1999). Apesar de ser um método relativamente simples, coletado a
partir de um esfregaço de células interfásicas da mucosa oral, apresenta
limitações. É pouco sensível para detectar mosaicismos de baixa freqüência da
linhagem 45,X e aberrações estruturais do cromossomo X, como 46,X,i(Xq).
Além disso, a ausência do corpúsculo de Baar não dispensa a realização do
cariótipo, já que é necessário afastar a presença de linhagens com
cromossomo Y (Maciel-Guerra, Guerra Júnior, 2002).
O cariótipo é o exame atualmente mais utilizado para o diagnóstico da
ST. Neste método, é realizada análise dos cromossomos dos linfócitos após
cultura das células por 72 horas com fitohemaglutinina, que ficam bloqueadas
na metáfase e visíveis separadamente ao microscópio. Com as técnicas de
coloração, todos os cromossomos podem ser individualmente identificados,
sendo o método de bandeamento Giemsa o mais amplamente usado nos
laboratórios de citogenética. Cada par de cromossomos cora-se de modo
característico em bandas claras e escuras (bandas G), permitindo diferenciálos individualmente (Nussbaum et al, 2002). Destina-se à identificação dos
cromossomos e de suas diferentes regiões, tendo por base sua morfologia,
tamanho e a presença de bandas que são características para cada par,
permitindo a detecção de aberrações numéricas e/ou estruturais, equilibradas e
não equilibradas, totais ou parciais.
8
O FISH (Fluorescence in situ hybridization) é um método citogenéticomolecular que utiliza uma seqüência de DNA marcado com fluorocromo
(sonda), complementar ao DNA alvo que se pretende estudar. É rápido,
sensível e específico para detecção de aberrações cromossômicas na célula
em divisão e também nas intérfases. Pode utilizar sondas centroméricas, que
avaliam o número de cromossomos presentes, sondas para pintura
cromossômica, que coram toda a célula em metáfase e sondas específicas
para mapeamento gênico que identificam deleções, duplicações e rearranjos.
2.2 – Métodos moleculares de triagem para ST
Por se tratar de uma doença freqüente, e como em muitos casos a única
alteração fenotípica é a baixa estatura, seria de grande utilidade um exame
para triagem da ST entre meninas que apresentam redução estatural.
Dependendo da idade, os exames hormonais não são discriminatórios.
Portanto, frente aos métodos disponíveis e considerando a importância do
diagnóstico e tratamento precoces da ST, novos estudos surgem visando a
triagem de grupos de risco para ST possibilitando, assim, a introdução do
tratamento dessas pacientes em idade adequada.
O advento de métodos moleculares tem possibilitado a análise das
anormalidades dos cromossomos sexuais, podendo ser utilizados para o
diagnóstico de doenças como a ST, identificar mosaicismos não detectados
pelo exame citogenético, auxiliar na descoberta da origem parental da
anormalidade cromossômica e na correlação entre genótipo e fenótipo.
Gicquel et al (1998) investigaram 375 meninas com baixa estatura,
através da análise do DNA pelo método de Southern blotting com marcador
9
altamente polimórfico do cromossomo X. Após a extração do DNA, foi realizada
a digestão com enzima EcoRI e hibridização com sonda específica (M27β) para
o mapeamento do cromossomo X na região Xcen-p11.22, ou seja, desde o
centrômero até a posição 11.22 do braço curto do cromossomo X. Os sinais de
hibridização foram quantificados por análise densitométrica e comparados a
duas referências de DNA do sexo feminino (homozigoto 46 XX e heterozigoto
46 XX) para o marcador utilizado, e um DNA de referência para o sexo
masculino 46 XY. Portanto, uma banda única de intensidade reduzida (50% do
controle homozigoto 46 XX) indicaria a presença de um único cromossomo X, e
a presença de duas bandas de diferentes intensidades indicaria tratar-se de
mosaicismo.
Dezoito pacientes foram diagnosticadas como tendo ST (17 pela análise
molecular e 1 caso de mosaicismo detectado somente pelo cariótipo), sendo
que 14 delas não apresentavam alterações fenotípicas da síndrome, apenas
baixa estatura. A incidência da ST nesta população (4,8%) foi bem maior que a
esperada para uma população feminina com baixa estatura (0,8-1,6%),
salientando a vantagem da análise molecular do cromossomo X como um
método alternativo ao cariótipo nos casos em que a baixa estatura não vem
acompanhada de outras características fenotípicas da ST.
Esse método apresentou boa acurácia, com sensibilidade de 94,7% e
especificidade de 97,7%. As desvantagens, além de dispendioso e demorado,
foram a necessidade de laboratório especializado para material radioativo e a
inabilidade em detectar os casos de ST causados por deleção distal do braço
curto do cromossomo X ou por mosaicismo de baixa freqüência da linhagem
45,X (Gicquel et al, 1998).
10
Longui et al (2002) propuseram a detecção molecular de pacientes com
diagnóstico de ST confirmado por cariótipo de sangue periférico (45,X n=18;
45,X/46,XX n=4) através de digestão enzimática pela endonuclease HpaII
durante 4 horas, seguida de PCR utilizando primers do gene do receptor
androgênico (OMIM 313700), localizado na região 11-12 do braço longo do
cromossomo X (Xq11-q12). A qualidade do DNA digerido foi avaliada pela coamplificação do pseudogene-GAPDH. A endonuclease HpaII é capaz de
reconhecer e digerir seqüências CCGG, presentes no gene do receptor
androgênico, quando estas não estão metiladas. Pacientes com ST 45,X
apresentam uma única cópia do cromossomo X, portanto ativa e não-metilada,
que é fragmentada pela ação da endonuclease HpaII, impedindo a amplificação
de bandas durante a reação de PCR. A análise molecular das pacientes com
cariótipo 45,X (n=18) apresentou dois diferentes padrões de amplificação. De
acordo com o cariótipo, 15/18 casos (83,3%) não apresentaram amplificação
de bandas do receptor androgênico, indicando a presença de alelo único do
cromossomo X. No entanto, 3/18 (16,6%) pacientes apresentaram amplificação
de bandas, sugerindo mosaicismo de baixa freqüência, não detectado pelo
cariótipo. Os autores concluíram que o método se demonstrou fácil e eficaz,
podendo ser utilizado para a triagem molecular de pacientes em grupos de
risco. No entanto, apresentou como desvantagem a limitação para detectar
outras anormalidades cromossômicas causadoras da ST, que não a
monossomia do cromossomo X.
Nos últimos 15 anos, a genotipagem com PCR fluorescente quantitativa
(PCR-FQ) foi introduzida como método alternativo à análise citogenética in vitro
de células fetais para o diagnóstico de aneuploidias cromossômicas de forma
11
muito mais rápida (Mansfield, 1993; Pertl et al, 1994, 1996; Adinolfi et al, 1997,
2000). A sua utilidade clínica foi repetidamente confirmada em alguns estudos,
que demonstraram redução dos custos, visto que possibilitou a automatização
de parte do procedimento, além de ter apresentado alta sensibilidade e
especificidade para detectar anormalidades cromossômicas (Pertl et al,
1999a,b; Schmidt et al, 2000; Adinolfi, Sherlock, 2001; Cirigliano et al, 2001a,b;
Levett et al, 2001; Mann et al, 2001).
Atualmente, a PCR-FQ é realizada em vários centros de diagnóstico prénatal na Europa para detectar a maioria das anormalidades cromossômicas,
com resultados que são obtidos em até 24 horas (Schmidt et al, 2000;
Cirigliano et al, 2001b, 2002, 2003; Mann et al, 2001; Voglino et al, 2002; Bili et
al, 2002; Andonova et al, 2004).
Um extenso estudo comparativo entre a PCR-FQ multiplex e a análise
citogenética convencional foi realizado a partir da triagem de 18.000 casos de
amostras fetais (Cirigliano et al, 2004). A PCR-FQ foi realizada utilizando um
amplo número de marcadores cromossômicos. Seis STR (short tandem
repeats) para os cromossomos X e Y, localizados principalmente no braço
longo do cromossomo X (Xq28Yq, Xq11.2-Xq12, Xq26.1, Xq28), seis para o
cromossomo 21, cinco para o cromossomo 18 e quatro para o cromossomo 13
foram selecionados.
Seqüências não-polimórficas dos genes amelogenina (AMXY) e SRY
também foram incluídas para detectar o sexo fetal. Todos os primers sense
foram marcados com diferentes fluorocromos para maior acurácia na
quantificação e tamanho dos produtos da PCR-FQ, e analisados por
12
eletroforese capilar em seqüenciador de DNA automatizado ABI 3100-Avant e
GeneScan 3.7 Software (Applied Biosystems, USA).
O complemento cromossômico normal foi detectado para o STR
correspondente, como dois alelos diferentes com razão entre as áreas de pico
de fluorescência de 1:1 (variando entre 0,9-1,3:1). As trissomias apresentavam
três picos com razão próxima a 1:1:1 ou dois picos não balanceados, com
razão de 2:1.
A extração de DNA e amplificação por PCR-FQ apresentou sucesso em
17.986 casos (99,9%). O diagnóstico de ST 45,X foi baseado na detecção de
um único produto da PCR-FQ para os marcadores polimórficos do cromossomo
X, na ausência do produto amelogenina específico do cromossomo Y, sendo
detectada em 55 dos 56 casos encontrados pela análise citogenética. O único
caso de falso-negativo provavelmente resultou da duplicação submicroscópica
do STR X22 (localizado na região Xq28Yq). A introdução, ao longo do estudo,
de seis marcadores STR para o cromossomo X, aumentou a detecção da
monossomia do cromossomo X.
A PCR-FQ foi capaz de detectar apenas 12 dos 25 casos de fetos com
mosaicismos
pela
análise
citogenética,
incluindo
mosaicismos
dos
cromossomos X, Y, 18 e 21. Este dado esteve de acordo com estudos prévios
(Schimidt et al, 2000; Cirigliano et al, 1999, 2001a,b), em que demonstraram a
ineficácia da PCR-FQ para detecção de casos de mosaicismos cromossômicos
de baixa freqüência. Em 3 casos de amostras fetais (dentre os 12 detectados),
suspeitou-se de mosaicismo 45,X/46,XX pela análise do eletroferograma,
devido à presença de picos entre os alelos não balanceados para os
marcadores do cromossomo X utilizados.
13
O equivalente a 746 casos de aneuploidias foi detectado pela PCR-FQ
contabilizando
93,2%
dos
fetos
com
cariótipo
anormal
pela
análise
citogenética. A sensibilidade do método molecular aumentou para 95,4% se
apenas os casos com relevância clínica fossem considerados. A especificidade
do teste foi de 100% para os cromossomos X, Y, 21, 18 e 13, com valor
preditivo positivo de 100% e valor preditivo negativo de 99,7%. Nenhum
resultado falso-positivo foi observado.
Todas as amostras pré-natais foram processadas em 24-48 horas,
sendo que em 98% dos casos os resultados foram obtidos no dia seguinte. A
análise citogenética convencional foi realizada em todas as amostras, sendo
que os resultados foram obtidos entre 5 até 28 dias. Comparativamente, a
eficiência da PCR-FQ permitiu o aborto terapêutico mais precocemente dos
fetos afetados, diminuindo a ansiedade dos pais e, eventualmente, possibilitou
intervenções terapêuticas.
Os autores observaram que a utilização da PCR-FQ como um teste prénatal é rápida, simples e eficaz, com resultados obtidos em até 24 horas, sendo
possível avaliar 40 amostras ao mesmo tempo, possibilitando o diagnóstico
pré-natal das aneuploidias cromossômicas mais comuns, inclusive nos países
em desenvolvimento (Cirigliano et al, 2004). Por outro lado, necessita utilizar
vários marcadores cromossômicos para melhorar sua eficácia aumentando os
custos do método. Além disso, a análise citogenética convencional continua
sendo indispensável para a confirmação dos casos de resultado normal pelo
diagnóstico pré-natal.
Rocha et al (2005) avaliaram a detecção molecular da ST 45,X com a
digestão enzimática pela endonuclease HpaII, seguida da reação de PCR
14
utilizando primers do gene do receptor androgênico (OMIM 313700). A análise
molecular foi realizada a partir da extração de DNA em papel de filtro de 304
recém-nascidos com fenótipo do sexo feminino. A integridade do DNA digerido
foi avaliada pela co-amplificação do gene DAX-1 (OMIM 300473).
A análise inicial apresentou 223 casos (73%) em que houve amplificação
dos dois genes, excluindo a ST 45,X. As 81 amostras restantes (27%) não
apresentaram amplificação de bandas do gene do receptor androgênico. Após
uma nova extração, digestão e PCR, 65/81 apresentaram resultado normal
(80% dos casos repetidos e 21% dos casos originais). No entanto, 16/81
permaneceram com resultado anormal (5%). Com o intuito de diminuir o alto
índice de casos suspeitos, as amostras foram analisadas pelo método do
GeneScan para determinar o número de alelos do gene do receptor
androgênico, após reação de PCR com primers marcados com 6-FAM (6carboxifluoresceína).
Os resultados do GeneScan foram normais em 14/15, com a
demonstração de dois alelos presentes e, em apenas 1 caso, um único alelo foi
detectado, o que poderia representar monossomia do cromossomo X ou dois
alelos do mesmo tamanho.
Comparativamente ao cariótipo, os autores concluíram que o método se
demonstrou simples e rápido, com resultados obtidos em até 30 horas. Uma
limitação deste protocolo foi a capacidade de detectar apenas os casos de ST
45,X, que correspondem a aproximadamente 50% dos casos. Possivelmente,
se aperfeiçoado, poderia ser utilizado como método de triagem neonatal da ST.
Outro método estudado para triagem da ST foi a genotipagem baseada
na detecção de SNPs (single nucleotide polymorphisms) em segmentos
15
específicos do cromossomo X e Y, com análise quantitativa através de
pirosequenciamento (Meng et al, 2005).
O pirosequenciamento é especialmente vantajoso para a detecção de
SNPs devido ao seu alto grau de acurácia quantitativa. Trata-se de um
software específico para análise da metilação em regiões com repetições
CpGs, sendo capaz de analisar 96 amostras em paralelo, utilizando um ensaio
com 4 enzimas: ATP sulfurilase, luciferase, apirase e DNA polimerase.
Para o desenvolvimento de um painel de SNPs para a triagem da ST, 22
SNPs com heterozigose maior que 25% para o cromossomo X, entre as
regiões Xp22 a Xq28 foram selecionadas do banco de dados dbSNP. Para o
cromossomo Y, um painel com 8 SNPs foi selecionado.
Amostras de DNA de 25 casos de ST foram selecionadas para a
genotipagem por pirosequenciamento. A combinação de pelo menos quatro
marcadores foi capaz de identificar 100% das 13 amostras de mosaicismos.
Comparativamente à PCR-FQ, a genotipagem com pirosequenciamento
teve vantagem em identificar todas as causas de ST, incluindo mosaicismos e
deleções parciais, sendo útil para a triagem neonatal da ST e outras
anormalidades cromossômicas. Porém, trata-se de equipamento específico e
caro, proveniente de um só fabricante (Biotage).
Portanto, como a ST é uma doença freqüente e que apresenta comorbidades, cujo diagnóstico e tratamento precoces são importantes, é de
interesse o desenvolvimento de técnicas moleculares que permitam a detecção
rápida dessa anormalidade.
O resumo das técnicas moleculares descritas para triagem da ST, com
suas respectivas vantagens e desvantagens é apresentado na tabela 3.
16
TABELA 3: Características dos métodos de triagem para diagnóstico da ST.
Método
Southern blot
Marcador
M27β
Nºpac. Vantagens
Desvantagens
Referências
375
Não detecta
Gicquel et al, 1998
Acurácia
mosaicos/XdelXp
Sondas radioativas
Digestão/PCR RA
22
Fácil e
Apenas ST 45,X Longui et al, 2002
eficaz
PCR-FQ
STR
18000
Rápido
Não detecta
Cirigliano et al, 2004
mosaicos
Digestão/
RA
304
Rápido
Apenas ST 45,X Rocha et al, 2005
SNP
25
Toda ST
Caro/específico
Genotipagem
Pirosequen-
Meng et al, 2005
ciamento
RA (receptor androgênico); STR (short tandem repeats); SNP (single nucleotide
polymorphisms).
2.3 – Gene do receptor androgênico (RA) e análise do DNA pelo GeneScan
O RA é uma proteína nuclear, membro da família dos receptores de
hormônios esteróides, que apresenta habilidade em ativar a transcrição de
genes-alvo com semelhantes elementos de resposta hormonal (Quigley et al,
1995).
O gene do RA (HUMARA; OMIM:313700) foi localizado inicialmente no
braço longo do cromossomo X, na região Xq11-13 (Chang et al, 1988; Lubahn
et al, 1988), sendo a localização revisada para Xq11-12 (Brown et al, 1989)
(Fig.1). O gene tem uma extensão de 75-90 Kb, possui oito exons separados
por introns que variam de 0,7 a mais de 26 Kb de tamanho (Fig. 2). Sua
proteína é codificada por uma região de aproximadamente 2757 pares de
bases (Quigley et al, 1995).
17
Exon 1
Exon 2
Domínio N-terminal
Exon 3
Exon 4
Exon 5
Domínio de ligação ao DNA
Exon 6
Exon 7
Exon 8
Domínio de ligação hormonal
AGTACAnnnTGTTCT
Testosterona/ 5αdihidrotestosterona
Elemento de resposta ao receptor
androgênico
FIGURA 1: Domínios do receptor androgênico: Domínio N-terminal codificado
pelo exon 1; Domínio de ligação ao DNA, codificado pelos exons 2 e 3 e
Domínio de ligação ao andrógeno, codificado pelos exons 4 a 8 (adaptado de
Maclean et al, 1997 e Brinkmann et al, 1995).
O RA é uma proteína que apresenta três domínios: domínio N-terminal
codificado pelo exon 1 e constituído por 1613 pares de bases, sendo
responsável pela regulação da transcrição do gene; domínio de ligação ao DNA
codificado pelos exons 2 e 3, constituído por 65 aminoácidos e que apresenta
dois dedos de zinco capazes de se ligar aos elementos responsivos presentes
nos genes-alvo da ação androgênica; e domínio de ligação ao andrógeno,
codificado pelos exons 4 a 8 (Brinkmann et al, 1995).
O exon 1 codifica o extenso domínio ativador da transcrição que é
constituído por 555 aminoácidos e possui uma extensão correspondente a mais
da metade da proteína. Na sua região 5’, especificamente a partir do códon 58,
há uma extensão polimórfica de glutaminas codificadas pelo trinucleotídeo
CAG, cuja importância ainda não está completamente elucidada (Gelmann,
2002).
18
Gene do receptor androgênico
Exon
1
Intron
2
EXON 1
3
4
5
6
7
8
REGIÃO
PROMOTORA
CAGCAGCAGCAGCAG...CAGCAGCAGCA
Ilha CpG
FIGURA 2: Gene do receptor androgênico: situado no braço longo do
cromossomo X (região Xq 11-12) e constituído por 8 exons. A região promotora
do gene, localizada no exon 1, possui uma ilha CpG constituída por repetições
CAG.
Observou-se que essa região de repetições CAG, altamente polimórfica,
contém uma média de 21±2 repetições, com uma variação de 11-31 em uma
população
caucasiana
de
ambos
os
sexos
(La
Spada,
1997).
Há
aproximadamente 20 diferentes tamanhos de alelos e 90% das mulheres são
heterozigotas para esse número de repetições.
O ensaio padrão para determinar o tamanho da repetição CAG envolve
PCR da região contendo a seqüência de repetição (CAG)n, seguida de
eletroforese em gel desnaturante de poliacrilamida (Edwards et al, 1992; Irvine
et al, 1995). Dependendo de como os produtos de PCR são marcados, se
radioativamente ou com compostos fluorescentes, a detecção pode ser feita
por auto-radiografia ou detecção de fluorescência através de aparelho
automatizado com eletroforese capilar e equipado com software adequado. O
tamanho dos alelos é obtido por meio de comparação com uma curva padrão
19
composta de fragmentos contendo repetições CAG de tamanho conhecido,
determinada a partir do sequenciamento do DNA (Boorman et al, 2002).
A análise automatizada do tamanho dos fragmentos por eletroforese
capilar é mais rápida e precisa que outros métodos, como por exemplo, a
marcação radioativa. É realizada através de um sistema de detecção a laser,
em que os fluorocromos emitem cores que são decompostas por um
espectrógrafo e depois captadas por uma câmera, que possui filtros virtuais.
Essa câmera envia os dados para um software específico (GeneScan) para
leitura dos fragmentos.
Esse método apresenta algumas vantagens que são: separações
rápidas, não há necessidade do preparo do gel, injeções automáticas das
amostras (reduzindo erros), alta sensibilidade podendo obter resultados em
amostras com pouco DNA ou com DNA degradado, e possibilidade de avaliar
alelos de tamanhos diferentes. Além disso, permite analisar até 48 amostras
em apenas 24 horas (Kochi et al, 2007).
20
3 – Objetivo
O objetivo deste estudo foi analisar as variações do número de
repetições CAG do gene do receptor androgênico como método molecular de
triagem para o diagnóstico da ST em um grupo de meninas com baixa estatura.
21
4 – Casuística e Métodos
Sessenta e duas pacientes do sexo feminino, em acompanhamento no
ambulatório de Endocrinologia Pediátrica da Irmandade da Santa Casa de
Misericórdia de São Paulo para investigação de baixa estatura, foram
selecionadas para esse estudo.
Os critérios de inclusão foram: sexo feminino, presença de baixa
estatura na primeira consulta, definida como estatura abaixo do percentil 3 do
gráfico do National Center for Health Statistics (NCHS) e/ou estatura abaixo de
–1 desvio-padrão da estatura-alvo (TH), ausência de fenótipos sugerindo
outras doenças genéticas, ausência de doenças crônicas, neurológicas ou uso
de medicamentos que pudessem justificar a baixa estatura. O estudo foi
aprovado pelo Comitê de Ética desta Instituição e o consentimento dos pais ou
responsáveis obtido.
Os dados clínicos avaliados foram: estatura e peso de nascimento,
estatura dos pais, idade óssea, idade e estatura iniciais, presença ou não de
cardiopatias e/ou alterações renais (sugestivas da ST), otites de repetição,
tireoidite de Hashimoto e alterações fenotípicas, como pescoço alado, cúbito
valgo, nevus, hipertelorismo mamário e baixa implantação de cabelos na nuca,
levantadas a partir de dados revisados dos prontuários.
Os anticorpos anti-tireoidianos foram considerados positivos para
valores acima de 50UI/mL para anticorpo anti-tireoglobulina e de 100UI/mL
para anticorpo anti-tireoperoxidase, em qualquer momento do seguimento
clínico.
As pacientes com fenótipo sugestivo de ST realizaram exames
complementares (ecocardiografia e ultrassonografia de vias urinárias).
22
A estatura inicial e TH foram expressas em escore Z de acordo com
dados de referência do NCHS-2000 (“US Growth Charts”, 2000). A idade óssea
foi avaliada de acordo com o método de Greulich Pyle (Greulich, Pyle, 1950).
O escore Z (zE) foi calculado utilizando-se a seguinte fórmula:
zE= estatura encontrada–média da estatura para o sexo feminino e idade cronológica
desvio-padrão para o sexo feminino e idade cronológica
A estatura-alvo (TH) foi calculada pela fórmula:
TH = estatura da mãe + (estatura do pai – 13)
2
A média (desvio-padrão) da idade cronológica do grupo avaliado foi de
6,4 anos (3,5), com variação de 1,09 a 15,98 anos.
Metodologia
Após a inclusão das pacientes no estudo e obtenção dos dados clínicos
e antropométricos, foi colhida amostra de sangue periférico e realizados os
seguintes procedimentos:
a) Extração de DNA a partir de sangue periférico
b) Reação de PCR, utilizando primers sense marcados com fluorocromo e
primers anti-sense, que apresentam complementaridade específica para
a seqüência do exon 1 do gene do receptor androgênico, incluindo as
repetições CAG
c) Avaliação do produto amplificado através do software GeneScan (versão
3.7 para Windows NT Platform, Applied Biosystems, Foster City,
Califórnia, EUA).
23
Extração de DNA das Amostras do Sangue Periférico
As amostras de sangue periférico foram processadas para extração de
DNA pelo método de Lahiri & Nurberger, 1991, modificado por Cavalli, 1996 e
Salazar, 1997 (Anexo 1).
Resumidamente foi realizada a hemólise com uso de solução contendo
Triton (0,27%), seguida pela lise dos leucócitos com NaCl (400mM) e SDS
(1%). A precipitação das proteínas foi realizada com NaCl 5M e a precipitação
do DNA foi obtida com o uso de etanol 100%. O produto final da extração foi
ressuspenso em ddH2O e mantido a _20ºC até a realização da reação de PCR.
Reação de PCR
As amostras de DNA foram submetidas a uma reação de PCR,
utilizando primers específicos para a sequência do exon 1 do gene do receptor
androgênico (HUMARA gene, OMIM: 313700), localizado na região Xq11-12.
Os primers sense do gene do receptor androgênico, marcado com fluorocromo
6-FAM (6 carboxi-fluoresceína), e anti-sense utilizados apresentavam as
seguintes seqüências, respectivamente: 5’ 6-FAM - GGG TAA GGG AAG TAG
GTG GAA 3’ e 5’ ACT GCG GCT GTG AAG GTT 3’ (Invitrogen Corporation,
Carlsbad, CA, USA).
Na reação de PCR foram adicionados os primers sense marcado na
concentração de 5 pmol e anti-sense na concentração de 20 pmol, em conjunto
com 200 µmoles de cada dNTP, buffer 10X, 0,1U de Taq DNA polimerase
(GeneAmp – kit reagente de PCR com AmpliTaq DNA polimerase – Perkin
Elmer, Branchburg, New Jersey, EUA) e 50 mmolar de MgCl2. O volume final
da reação foi de 50 µL.
24
A reação de PCR foi realizada em termociclador GeneAmp PCR System
9700 (Applied Biosystem, Foster City, CA, EUA) sob as seguintes condições:
desnaturação inicial a 94ºC por 3 minutos, 30 ciclos com tempos de
desnaturação, anelamento e extensão de 30 segundos, 1 minuto e 1 minuto,
respectivamente, e extensão final de 72ºC por 7 minutos. As temperaturas de
desnaturação e extensão foram iguais em todas as reações, sendo de 94ºC e
72ºC, respectivamente, e a temperatura de anelamento ideal foi de 61ºC. O
produto final da PCR era constituído por 395 pares de bases.
Análise dos Fragmentos (GeneScan)
Após a amplificação do fragmento, o produto da PCR foi diluído em
ddH2O na proporção de 1:5. A seguir, foi adicionado 0,25µL do marcador
interno de peso molecular GeneScan 500 ROX e 24,5µL de formamida
deionizada (Applied Biosystems) a 1µL dessa diluição. A mistura foi
desnaturada a 95ºC por dois minutos e mantida em gelo até ser submetida à
eletroforese capilar no analisador automático de DNA ABI PRISM 310 (Applied
Biosystems). Os parâmetros da eletroforese capilar foram: temperatura de
60ºC, corrente de 7-9 µA e tempo de corrida de 28 minutos por amostra.
Os resultados foram analisados através do software GeneScan,
podendo ser apresentados na forma de eletroferograma, que mostra o local do
pico fluorescente como uma função do tamanho do fragmento ou do tempo de
migração. Cada eletroferograma representa uma injeção. Os alelos menores
apresentam amplificação maior, portanto, são vistos picos maiores, enquanto
que os alelos maiores originam picos menores no eletroferograma.
25
Avaliação do número de alelos
O software GeneScan é capaz de determinar o número e o tamanho
relativo dos fragmentos amplificados, dependendo do número de repetições
CAG presentes no exon 1 do gene do receptor androgênico. Dessa forma, foi
possível analisar se a paciente era homozigota ou heterozigota para o
cromossomo X, ou seja, se apresentava 1 ou 2 alelos, respectivamente.
Comissão de Ética
O projeto foi aprovado pela Comissão de Ética em Pesquisa da
Irmandade da Santa Casa de Misericórdia de São Paulo.
Análise Estatística
A comparação das variáveis antropométricas entre as pacientes com
diagnóstico confirmado de ST pelo cariótipo com as meninas com cariótipo
46,XX foi feita por meio do teste t-Student. Para avaliar a diferença da
freqüência de alterações fenotípicas entre as mesmas foi usado o teste do quiquadrado. Os programas utilizados foram o SPSS for Windows, versão 10.0.1
(SPSS Inc., Chicago, EUA) e o SigmaStat for Windows, versão 2.03 (SPSS
Inc., Chicago, EUA).
26
5 – Resultados
Os dados clínicos analisados do grupo estão resumidos na tabela 4.
TABELA 4. Análise dos dados clínicos do grupo estudado.
Dados Clínicos
Média
Desvio-padrão
Intervalo
IC inicial
6,4 anos
3,5
1,09 a 15,98 anos
Z Estatura
-2,6
1,03
-6,4 a -1,15
Z TH
-0,92
0,99
-3,85 a 1,03
Peso de nascimento
2522 g
770
735 a 3600 g
Estatura de nascimento
44 cm
4,9
31 a 50 cm
IC = idade cronológica; TH = estatura-alvo.
Das 62 pacientes analisadas, 20 (32%) eram recém-nascidas pré-termo
ou a termo, pequenas para idade gestacional (RNPT-PIG ou RNT-PIG).
A análise pelo GeneScan das 62 amostras demonstrou 48 casos
(77,5%) de heterozigotos (HTZ), ou seja, pacientes que apresentavam dois
alelos para o gene do receptor androgênico e 14 casos (22,5%) de
homozigotos (HMZ), ou seja, pacientes com apenas 1 alelo ou que
apresentavam alelos do pai e da mãe com o mesmo tamanho de fragmentos,
impedindo a diferenciação dos mesmos (Fig. 3).
heterozigoto
homozigoto
FIGURA 3: Exemplo da avaliação pelo software GeneScan.
27
No grupo das 14 pacientes com resultado homozigoto foi realizado
cariótipo em 9, sendo feito diagnóstico de ST 45,X em 5 casos e 4 pacientes
apresentavam cariótipo 46,XX, dando uma prevalência de ST 45,X no grupo
total de pacientes avaliadas de 8,0%.
No
grupo
das
48
pacientes
heterozigotas
ao
GeneScan,
21
apresentavam cariótipo, sendo 17 casos de pacientes 46,XX. Dos 4 casos
restantes, dois apresentavam cariótipo 45,X/46,XX, um 45,X/46XiXq e o outro,
cariótipo 46XdelXp. Nos 3 casos de mosaicismo, os cariótipos apresentavam
baixa freqüência da linhagem de células 45,X, o que pode justificar a presença
de dois alelos na análise pelo GeneScan.
Quando avaliamos os eletroferogramas dos casos de mosaicismo, em 2
de 3 pacientes, foi observado um desbalanço entre a altura dos picos dos dois
alelos,ou seja uma diferença acima de 30% entre as mesmas (Fig.4), que é
maior do que a observada nos heterozigotos normais.
FIGURA 4: Eletroferograma de uma paciente com cariótipo 45,X/46,XX, com
desbalanço entre a altura dos picos dos alelos (sendo que 363 e 379
representam o tamanho dos fragmentos; 2488 e 909, as alturas dos picos).
Não foi realizado cariótipo em todas as pacientes porque algumas delas
apresentaram aumento da velocidade de crescimento com recuperação
estatural, outras abandonaram o acompanhamento e nos casos restantes o
cariótipo foi solicitado, porém ainda sem resultado obtido.
28
A sensibilidade para detecção de ST 45,X foi de 100%, com
especificidade de 81%, em relação às pacientes que apresentavam cariótipo
(n=30). O valor preditivo positivo foi de 55,5% e o valor preditivo negativo foi de
100%. Se considerarmos a detecção da ST como um todo, a sensibilidade do
nosso método foi de 77,7% e a especificidade de 81%, no grupo de pacientes
com cariótipo.
Na nossa casuística, das 62 meninas com baixa estatura, apenas 17,7%
apresentavam alterações fenotípicas como pescoço alado, hipertelorismo
mamário, presença de nevus, baixa implantação de cabelos na nuca e cúbito
valgo, sendo as mais freqüentes a baixa implantação de cabelos e cúbito valgo.
Quando comparamos as pacientes com diagnóstico confirmado de ST
pelo cariótipo com as meninas com cariótipo 46,XX, observamos que não
houve diferença significativa em relação ao escore Z de estatura, escore Z de
estatura-alvo, peso e estatura de nascimento e às freqüências das alterações
fenotípicas.
29
6 – Discussão
A ST é uma causa importante de baixa estatura em meninas, levando a
um comprometimento estatural acentuado.
O diagnóstico precoce da ST é de grande importância, pois permite o
tratamento com GH logo no momento da desaceleração do crescimento,
recuperando a estatura final, além da indução puberal em idade apropriada,
evitando possíveis problemas psicológicos. O acompanhamento multidisciplinar
dessas pacientes previne o surgimento de co-morbidades, como a obesidade e
síndrome metabólica e possibilita novos métodos de criopreservação do tecido
ovariano (Sävendahl, Davenport, 2000; Massa et al, 2005; Donaldson et al,
2006).
O acompanhamento precoce e adequado leva a melhor qualidade de
vida, com redução das co-morbidades e, consequentemente, aumenta a
expectativa de vida das pacientes com ST (Elsheikh et al, 2002; Sybert,
McCauley, 2004; Doswell et al, 2006).
A baixa estatura é a principal alteração encontrada na ST, presente em
95 a 100% dos casos, enquanto outras características fenotípicas podem estar
ausentes. Por esse motivo, é de fundamental importância a exclusão deste
diagnóstico em meninas com baixa estatura (Gicquel et al, 1998).
Na nossa casuística não houve diferença significante na freqüência de
alterações fenotípicas entre as pacientes com ST confirmada pelo cariótipo e
aquelas com cariótipo 46,XX, sugerindo que as meninas com baixa estatura
devam ser investigadas sempre para ST, independentemente da presença de
estigmas.
30
Neste estudo, foi proposto um método molecular para triagem da ST em
um grupo de risco, utilizando extração de DNA em sangue periférico, seguida
de PCR e análise dos fragmentos do gene do receptor androgênico pelo
GeneScan. Com este protocolo, utilizando apenas um único marcador
polimórfico para o cromossomo X foi possível analisar as pacientes em um
período inferior a 24 horas.
Este método foi previamente validado por nosso grupo em dois outros
estudos. O primeiro avaliou a eficácia da metodologia realizando a extração do
DNA em papel de filtro para a triagem neonatal da ST 45,X (Rocha et al, 2005)
e o segundo avaliou a influência parental da origem do cromossomo X na
estatura de pacientes com ST 45,X (Kochi et al, 2007).
Analisando os resultados obtidos, o nosso método foi capaz de detectar
todos os casos de ST 45,X e a maioria dos casos de mosaicos, com um único
marcador polimórfico.
Na maioria dos estudos previamente citados, métodos moleculares mais
trabalhosos e menos sensíveis, como o Southern blotting (Gicquel et al, 1998),
ou métodos utilizando um amplo número de marcadores (Cirigliano et al, 2004;
Meng et al, 2005) foram necessários para detecção da ST.
A cromatina sexual, por ser um teste simples e de baixo custo, que
utiliza apenas reagentes de coloração e microscópio, tem sido utilizada como
teste de triagem quando existem dúvidas em relação ao sexo do paciente
(Beiguelman, 1982; Valle, 2001). Porém, na ST a técnica da cromatina X
mostrou-se pouco sensível para a detecção de mosaicismos com baixa
freqüência da linhagem celular 45,X, aberrações estruturais do cromossomo X
e a presença do cromossomo Y (Fedrizzi et al, 1993; Maciel-Guerra, Guerra Jr,
31
2002). Alguns estudos avaliaram o uso da cromatina X para triagem de
anormalidades cromossômicas, demonstrando sua ineficácia para esta
finalidade,
visto
que
não
dispensa
a
confirmação
pelo
cariótipo,
independentemente dos resultados obtidos (Gardner, 1976; de Mel, 1992).
Uma desvantagem do nosso método é sua limitação em detectar as
outras anormalidades estruturais do cromossomo X, principalmente as
deleções do braço curto do cromossomo X e a presença do cromossomo Y ou
de material derivado do cromossomo Y. Por esse motivo, a inclusão de outros
marcadores, especialmente para o braço curto do cromossomo X e para o
cromossomo Y poderiam ampliar a detecção da ST e reconhecer o risco para
evolução de tumores gonadais.
Com a inclusão desses dois marcadores, para o braço curto do
cromossomo X e para o cromossomo Y, e aumentando o número de pacientes
com mosaicismo para melhor avaliação da eficácia do nosso método na
detecção desses casos, a técnica estudada seria capaz de detectar a grande
maioria dos casos de ST.
A freqüência esperada de ST diagnosticada em meninas com baixa
estatura é provavelmente abaixo de 1%. O estudo escocês de Vimpani e
colaboradores, em 1981, avaliando 208 meninas com baixa estatura (<_2,5DP),
entre 2 e 4 anos, através do cariótipo, identificou apenas um caso de ST.
Gicquel e colaboradores, utilizando o método de Southern Blotting para
triagem de ST em meninas com baixa estatura, detectaram a síndrome em
4,8% dos casos. No nosso estudo, 8,0% das meninas avaliadas foram
diagnosticadas com ST 45,X pelo método de análise do tamanho dos
32
fragmentos, sugerindo que técnicas moleculares para triagem desse grupo são
importantes.
A maior prevalência da ST encontrada na nossa casuística pode ser em
parte explicada pelo fato do nosso serviço tratar-se de hospital terciário, que
recebe pacientes já triadas, sendo afastadas doenças pediátricas gerais. Outro
motivo que poderia explicar este aumento de prevalência seria o fato de 32%
das pacientes da nossa casuística apresentaram-se como RNPT-PIG e/ou
RNT-PIG, que também é um fator de risco para ST. Dos 5 casos
diagnosticados pelo nosso método como ST 45,X, 2 casos eram recémnascidos pequenos para idade gestacional, 2 casos eram recém-nascidos
adequados para idade gestacional e o último caso não soube informar peso
e/ou estatura de nascimento.
Muitos autores sugerem que a monossomia do cromossomo X é fatal e,
portanto, os casos diagnosticados como 45,X são na verdade mosaicismos não
detectados pelas técnicas citogenéticas convencionais. A monossomia do
cromossomo X é geralmente detectada em 50% das pacientes com ST,
enquanto os mosaicismos e anormalidades estruturais do cromossomo X na
outra metade.
Gicquel et al detectaram 61,1% de mosaicismos e anormalidades
estruturais do cromossomo X. Esses dados são consistentes com o fato de que
as pacientes envolvidas nesse estudo foram triadas por apresentarem baixa
estatura, enquanto que a monossomia do cromossomo X pode ser
diagnosticada mais precocemente pela presença de dismorfismos.
33
No nosso estudo, no entanto, dos 30 cariótipos colhidos, nove foram
diagnosticados como ST, sendo que 5/9 (55,5%) eram pacientes 45,X, com
idade cronológica média de 10 anos ao diagnóstico.
A sensibilidade para detecção de ST 45,X foi de 100% na nossa
casuística, com especificidade de 81%, mostrando que essa técnica é uma boa
opção para realização de triagem da ST 45,X. Estudos maiores e com a
associação de mais marcadores polimórficos seriam importantes para ampliar a
detecção das outras anormalidades causadoras da ST.
34
7 – Conclusão
Concluímos que o método molecular de análise das variações do
número de repetições CAG do gene do receptor androgênico pelo GeneScan é
rápido e sensível para detecção da ST 45,X, sendo potencialmente útil para
triagem da ST em meninas com baixa estatura.
35
8 – Anexos
8.1 - Extração de DNA do sangue periférico
(Método de Lahiri & Nurberger, 1991 – modificado por Cavalli 1996 e Salazar
1997)
Preparo:
• Sangue colhido em tubo com EDTA (tampa roxa)
• Estabilizar sangue à temperatura ambiente
• Ligar banho seco, fixando temperatura em 65 oC
1. Adicionar 600 µL de sangue em tubo Eppendorf e adicionar 900 µL solução TTKM1
(repetir este ítem ao redor de 2X, até que não hajam mais hemácias no precipitado).
Agitar suavemente até a lise das hemácias pelo triton. Centrifugar a 5000 rpm
(5min, RT) e descartar o sobrenadante.
2. Lavar o precipitado com 1mL solução TKM1 (retirada do triton), pipetando
suavemente. Centrifugar a 5000 rpm ( 5min, RT ).
3. Ressuspender o precipitado em 200µl de TKM2 e adicionar 20µL SDS
10%.
4. Incubar à 65oC por 15 min.
5. Adicionar 60µL
NaCl 5M (precipitar proteínas).
Aplicar vortex por 30
segundos
6. Centrifugar à 12000 rpm (10 min, RT).
7. Recuperar cuidadosamente o sobrenadante (desprezar o precipitado)
8. Adicionar 2 volumes (~ 1mL) Etanol Absoluto invertendo tubo até
precipitar DNA.
9. Centrifugar à 13000 rpm (10 min, RT). Descartar o sobrenadante e lavar
DNA precipitado com 500 µL Etanol 70%.
10. Centrifugar novamente à 13000rpm (10 min, RT). Descartar sobrenadante e
deixar precipitado secar (RT , 5 min , tubo invertido sobre papel filtro).
36
11. Ressuspender DNA em 100µL ddH2O ou TE (Tris-HCl 10 mM / EDTA
1mM, pH 8).
TKM1
Concentração final
Tris-HCl , pH 7,6………………… 10 mM
KCl ……………………………….. 10 mM
MgCl ……………………………… 10 mM
EDTA …………………………….. 2 mM
Para 1 litro
1.58 g
0.75 g
0.95 g
4 mL
TTKM1
Concentração final
Tris-HCl , pH 7,6………………… 10 mM
KCl ……………………………….. 10 mM
MgCl ……………………………… 10 mM
EDTA …………………………….. 2 mM
Triton-X …………………………... 0,27%
Para 1 litro
1.58 g
0.75
0.95 g
4 mL
2.7 mL
Concentração final
Tris-HCl , pH 7,6……………… 10 mM
KCl …………………………….. 10 mM
MgCl …………………………… 10 mM
EDTA …………………………..
2 mM
NaCl …………………………… 400 mM
Para 1 litro
1.58 g
0.75 g
0.95 g
4 mL
23.40 g
TKM2
37
8.2 – Planilha com dados do grupo de pacientes estudado
38
EN = estatura de nascimento; PN = peso de nascimento; IC = idade
cronológica; OMA = otite média aguda; acs = anticorpos; nc = nada consta.
39
9 – Referências Bibliográficas
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45
Resumo
A síndrome de Turner (ST) é uma das anormalidades cromossômicas
mais freqüentes, presente em cerca de 3% das concepções. Sua incidência
varia desde 1:1.800 até 1:5.000 meninas nascidas vivas em diferentes
populações.
Na maioria das vezes, o diagnóstico é feito tardiamente na infância ou
durante a adolescência. Novas técnicas que possibilitem o diagnóstico precoce
permitiriam o tratamento adequado da baixa estatura e a reposição estrogênica
em idade apropriada, melhorando o prognóstico da estatura final e o aspecto
psicossocial das pacientes.
No nosso estudo, foram avaliadas 62 meninas com baixa estatura pelo
método de análise do tamanho dos fragmentos do gene do receptor
androgênico, sendo possível detectar todos os casos de ST 45,X e a maioria
dos casos de mosaicismo, utilizando apenas um único marcador. A
sensibilidade para detecção de ST 45,X foi de 100% e a especificidade de
81%.
Concluímos que o método molecular de análise das variações do
número de repetições CAG do gene do receptor androgênico pelo GeneScan é
rápido e sensível para detecção da ST 45,X, sendo potencialmente útil para
triagem da ST em meninas com baixa estatura.
46
Abstract
Turner
syndrome
is
one
of
the
most
commom
chromosomal
abnormalities, present in about 3% of the conceptions. The incidence varies
between 1:1.800 and 1:5000 live births among girls in different populations.
In many instances the diagnosis of Turner syndrome may be delayed
until childhood or during adolescence. Early diagnosis of TS allows appropriate
growth hormone treatment with better final height prognosis and initiation of
estrogen therapy in adequate chronological age, preventing psychosocial
disorders in these patients.
In our study, 62 growth-retarded girls were evaluated by analysis of the
relative size of amplified fragment of the androgen receptor gene. Employing
only one X chromosome marker, this molecular approach was able to detect all
cases of 45,X ST and the majority of mosaicisms. The sensibility and specificity
for 45,X ST detection was 100% and 81%, respectively.
In conclusion, the determination of the number of CAG-repeats of the
androgen receptor gene by GeneScan analysis is a fast and sensitive method
to detect 45,X TS and potentially useful for the screening of TS patients among
short girls.
47
Apêndice
48