Faculdades Metropolitanas Unidas – FMU
Amanda Milani Cardoso
INSEMINAÇÃO ARTIFICIAL EM ÉGUAS
São Paulo
2010
2
Faculdades Metropolitanas Unidas – FMU
Amanda Milani Cardoso
INSEMINAÇÃO ARTIFICIAL EM ÉGUAS
Monografia apresentada como Trabalho
de Conclusão de Curso do curso de
Medicina Veterinária orientada pela
Professora Giovana D´Andréa Pavão.
São Paulo
2010
3
FICHA CATALOGRÁFICA
Cardoso, Amanda Milani
Inseminação Artificial em Éguas/Amanda Milani Cardoso,
2010
Trabalho
de
Conclusão
de
Curso
–
Faculdades
Metropolitanas Unidas – FMU
1 – Reprodução equina; 2 – sêmen; 3 - técnicas inseminação
artificial
4
Faculdades Metropolitanas Unidas – FMU
Amanda Milani Cardoso
INSEMINAÇÃO ARTIFICIAL EM ÉGUAS
Monografia apresentada como requisito de
avaliação de conclusão de graduação em Medicina
Veterinária- FMU
Orientadora: Profa. Giovana D´Andréa
Pavão
Defendido e aprovado em 15 de Junho de 2010
pela
banca
examinadora
professores:
Prof. Giovana D´Andréa Pavão
FMU – Orientadora
Prof. Dr. Cynthia Maria Carpigiani Teixeira
FMU
Prof. Dr. Aline Machado Zoppa
FMU
constituída
pelos
II
Dedico aos meu pais, Edivaldo e
Elisabete, e aos meus irmãos
Samantha, Bruna e Caio a grande
conquista do meu sonho.
III
Agradecimentos
Agradeço infinitamente meu Pai e minha Mãe, sem eles nada seria possível,
eles foram os responsáveis pela realização do meu maior sonho.
Agradeço meus irmãos pela paciência que tiveram comigo durante esses
cinco anos acadêmicos, e que estiveram sempre ao meu lado.
Agradeço aos meus amigos de classe, pois em eles seria tudo sem graça,
agradeço pelas brigas, ajudas e muitas risadas durante esses anos.
Agradeço a todos
acadêmica, especialmente
minha iniciação científica e
professora Cynthia Maria
sobre Florais.
os professores que fizeram parte da minha formação
à Professora Aline Zoppa pelo apoio na realização da
pela minha participação na campanha de castração, e a
Carpigiani Teixeira pelos conhecimentos transmitidos
Agradeço todos veterinários que acompanhei em meus estágios durante os
anos de faculdade, a todos veterinários do Hospital Veterinário Santa Inês, aos
residentes do Hospital Veterinário FMU dos anos 2007 e 2008, aos residentes do
departamento de reprodução animal 2009 e 2010 da UNESP e em especial os
veterinários da Central Eqüina de Reprodução, Amanda, Bruno e Gelton, agradeço
pelo rico conhecimento adquirido com vocês.
Agradeço a Dra. Luciana Corazza Cury Dinana pelos conselhos que me
incentivaram a dar início a essa trajetória que hoje estou concluindo.
Agradeço a Professora Giovana D´Andréa
paciência na elaboração deste trabalho.
Pavão pelo apoio, ajuda e
IV
“No curso da vida, cada questão é uma
batalha. Haja o que houver no decorrer da
jornada da vida, batalhem para desabrochar
infalivelmente as flores da felicidade.”
(Daisaku Ikeda)
V
Resumo
A inseminação artificial (IA) trata-se de uma biotécnologia utilizada para obter
produtos de pais com alta qualidade genética, com a vantagem de não necessitar a
presença física do garanhão selecionado, reduzindo assim traumas decorrentes do
transporte dos animais ou da própria monta natural. Além disso, ocorre redução de
transmissão de doenças venéreas e infecciosas com ao endometrite, decorrentes do
contato direto entre égua e garanhão, aumenta o numero de éguas inseminadas por
ejaculado e conseqüentemente a taxa de prenhez, proporcionando melhora na
viabilidade econômica da equideocultura. Para que a IA seja satisfatória, é
necessário manejo minucioso tanto da égua quanto do garanhão, sendo este
realizado pelo ultra-som, exames de citologia e biopsia uterina, para avaliação da
condição uterina e controle folicular da égua, utilização de hormônios para indução
da ovulação, favorecendo o momento adequado de realizar a IA e impedir que haja
perdas reprodutivas alem biotécnicas como a injeção intracitoplasmática de
espermatozóide (ICSI), utlizadas para animais com problemas reprodutivos como
falha na maturação do ovócito, ou em garanhões que possuam sub-fertilidade, como
garanhões
que
possuem
falha
na
maturação
espermática,
espermatozóides com caudas imóveis
Palavra-Chave: égua, sêmen, garanhão, Inseminação artificial
produzindo
VI
Abstract
The artificial insemination (AI) it’s a biotechnology utilized to obtain products of
parents with high genetic quality, with the advantage of do not need the physical
presence of the stallion selected, reducing like this resulting traumas of the transport
of the animals or of the own natural triviality. Beyond that, infectious and venereal
illnesses transmission reduction with the endometrite, resulting of the straight contact
between mare occurs and stallion, increase the number of mares inseminated by
ejaculated and consequently the rate of pregnancy, providing improvement in the
economic feasibility of the equine creation.
For that it AI to be satisfactory, is
necessary so much management of the mare how much of the stallion, being this
carried out by the ultrasound, exams of cytology and biopsy uterine, for evaluation of
the uterine condition and control follicular of the mare, utilization of hormones for
induction of the ovulation, favoring the adequate moment of carry out it AI and stop
that have loses reproductive haul biotechnical as the Intracytoplasmic Sperm
Injection (ICSI), used to animals with reproductive problems as fails in the ripening of
the ovocito, or in stallions that possess sub-fertility, like stallions that possess fault in
the ripening spermatic, producing spermatozoids with tails property
Key-words:, mare, semen, stallion, artificial insemination.
VII
SUMÁRIO
RESUMO ..................................................................................................................V
ABSTRACT ............................................................................................................. VI
1.INTRODUÇÃO .........................................................................................................1
2. REVISÃO DE LITERATURA ..................................................................................2
2.1. Ciclo estral da égua ..............................................................................................2
2.1.1. Eixo-Hipotálamo-Hipófise-Gonadal ...................................................................3
2.2. Controle folicular ...................................................................................................5
2.3. Exame do aparelho reprodutor .............................................................................6
2.3.1 Palpação retal ..........................................................................................6
2.3.2. Ultrassonografia transretal ......................................................................7
2.3.3. Exame vaginal ........................................................................................9
2.3.4. Citologia uterina ......................................................................................9
2.3.5. Biópsia Endometrial ..............................................................................10
2.4. Hormonioterapia .................................................................................................10
2.4.1 Sincronização de Estro .....................................................................................10
2.4.2. Hormônios indutores da ovulação ...................................................................10
2.4.2.1. HCG (Gonadotrofina coriônica humana) ..............................................11
2.4.2.2. GnRH (Hormônio liberador de gonadotrofinas)....................................12
2.4.2.3. EPE (Extrato de Pituitária Eqüina) .......................................................12
2.5. Sêmen ................................................................................................................13
2.5.1. Coleta de sêmen ...................................................................................14
VIII
2.5.2. Análise do sêmen .................................................................................16
2.5.2.1. Volume ....................................................................................16
2.5.2.2. Concentração ..........................................................................16
2.5.2.3. Motilidade/Vigor ......................................................................17
2.5.2.4. Morfologia................................................................................17
2.5.3. Dluição do Sêmen .................................................................................18
2.5.4. Tipos de sêmen/Dose inseminante.......................................................20
2.5.4.1. Sêmen fresco .........................................................................20
2.5.4.2. Sêmen resfriado……………….................................................20
2.5.4.3 Sêmen congelado ....................................................................21
2.6. Técnicas de Inseminação Artificial .....................................................................23
2,6.1. Momento da Inseminação Artificial .........................................................23
2.6.2. Métodos de Inseminação Artificial ..........................................................24
2.6.2.1. Inseminação no corpo do útero ...............................................24
2.6.2.2. Inseminação no corno uterino .................................................25
2.6.2.3. Inseminação Histeroscópica ...................................................25
2.6.2.4. Injeção Intracitoplasmática de espermatozóides ....................26
2.6.2.4.1. Recuperação e maturação de ovócitos .......................27
2.6.2.4.2. Preparação do sêmen .................................................27
2.6.2.4.3. Injeção do espermatozóide no óvulo ...........................28
3. CONSIDERAÇÕES FINAIS ..................................................................................29
REFERÊNCIAS .........................................................................................................30
1 – INTRODUÇÃO
Na espécie eqüina, a inseminação artificial (IA) vem sendo empregada com
sucesso devido a sua facilidade de implantação no plantel, proporcionando bons
índices de fertilidade, menor desgaste do garanhão, e melhora do progresso
genético (WEISS et al., 2003).
Para se maximizar a eficiência reprodutiva de um sistema de criação de
eqüinos, faz-se necessário a obtenção de um potro por ano de todas as éguas do
rebanho bem como a obtenção de um maior número possível de embriões no caso
de éguas doadoras. Para isto são realizadas biotecnologias como a inseminação
artificial (IA).
A inseminação artificial (IA) trata-se de uma técnica utilizada para obter
produtos de pais com alta qualidade genética, com a vantagem de não necessitar a
presença física do garanhão selecionado, reduzindo traumas decorrentes do
transporte dos animais ou até mesmo resultantes da monta natural. Além disso, com
esta biotecnologia, há redução de transmissão de doenças venéreas e infecciosas
como a endometrite, decorrentes do contato direto entre égua e garanhão,
aumentando o numero de éguas inseminadas por ejaculado, e da taxa de prenhez
proporcionando melhora na viabilidade econômica (BLANCHARD et al., 2003).
Devido ao crescimento da utilização de biotecnologias de reprodução eqüina,
vem-se estudando sobre os efeitos de cada técnica e suas vantagens,
aperfeiçoando-as, desde o manejo adequado dos animais ao acompanhamento do
ciclo estral para acompanhamento do controle folicular ovariano. O mesmo é
realizado para melhoria da qualidade de sêmen, escolhendo o método adequado
para a coleta do ejaculado, até mesmo à realização de procedimentos no
laboratório, colocando em contato com diferentes diluentes em condições térmicas
adequadas (PYCOCK, 2008).
2
2 – REVISÃO DE LITERATURA
2.1 – CICLO ESTRAL DA ÉGUA
No eqüino, o ritmo circanual da reprodução é primariamente regulado pelas
mudanças no fotoperíodo ao longo do ano. Este sinal ambiental é traduzido para um
sinal endócrino na glândula pineal, que está localizada no centro do cérebro. Essa
glândula secreta melatonina durante a fase de menor luminosidade, esse hormônio
possui atividade inibidora de gonadotrofinas. Na égua, dias curtos são associados à
queda na secreção de gonadotrofinas e conseqüente diminuição na atividade
ovariana. A duração do anestro varia entre éguas e também na mesma égua entre
os anos (DAELS, 2006).
Na égua o ciclo estral é dividido em estro (5 – 7 dias), que é a fase folicular, e
diestro (14 – 16 dias), que é a fase luteolítica. O estro é caracterizado pela presença
de folículo dominante, edema uterino, relaxamento de cérvix, edema de vulva e
comportamento de receptividade sexual, sinais esses causados pelo aumento de
estrógeno circulante que é produzido pelas células da granulosa do folículo
dominante, preparando o trato genital da égua para receber e transportar os
espermatozóides até a oviduto onde irá ocorrer a fecundação (ANDRADE, 1993).
O diestro é o período entre a última ovulação e um novo estro. Este período,
de aproximadamente 14 dias, é caracterizado pela formação e presença do corpo
lúteo após a ovulação (glândula endócrina temporária), que tem a função de produzir
progesterona (P4). Esta, quando está com concentração alta no organismo,
demonstra sinais na égua como relutância ao garanhão, fechamento da cérvix e
preparação do útero para receber o embrião, como o aumento da atividade
secretora das glândulas endometriais e inibição da motilidade do endométrio e do
estro, e os sinais permanecem até a lise do corpo lúteo, que ocorre entre 14 a 16
dias, totalizando 21 dias cada ciclo estral (ANDRADE, 1993).
3
2.1.1 – EIXO HIPOTÁLAMO-HIPÓFISE-GONADAL
O hipotálamo está localizado na região central do diencéfalo onde possui
ligação neural com a hipófise anterior (neuro - hipófise). O controle hormonal do ciclo
estral ocorre pelo eixo hipotálamo – hipófise – gonadal, através da interação na
liberação dos hormônios hipotalâmicos, hipofisários, ovarianos e uterinos. Entre os
hormônios que interagem com este eixo para o trato reprodutivo feminino, destacamse: hormônio liberador de gonadotrofina (GnRH) liberado pelo hipotálamo; hormônio
folículo estimulante (FSH)
e hormônio luteinizante
(LH) são as gonadotrofinas
liberadas pela hipófise anterior; os esteróides progesterona e estradiol bem como os
hormônios peptídicos como a inibina que são liberados pelo ovário; e a
prostraglandina (PGF2a) liberada através do endométrio. (GINTHER et al., 1992).
O Ciclo estral das éguas se inicia por estimulação luminosa (Solstício de
verão) que incide pela retina ocular, estimula seus receptores de rodopsina,
conectando com a glândula pineal, responsável por sintetizar e secretar o hormônio
melatonina. Esta, na espécie eqüina, com o estímulo luminoso, inibe a síntese do
hormônio melatonina, com isto ocorre um aumento na freqüência de liberação do
GnRH pelo hipotálamo, onde é sintetizado e armazenado (HAFEZ et al, 2004).
O aumento da freqüência de liberação do GnRH é o que induz a hipófise
anterior a liberar o FSH, que nas gônadas femininas estimula as células da
granulosa a produzirem estrógeno, que estimula o aumento de células da granulosa
e também o número de receptores de gonadotrofinas. A produção de FSH através
da freqüência do GnRH, é inibida pelo aumento no nível de estrógeno (E2),
produzido pelos folículos em desenvolvimento, o estrógeno diminui a freqüência de
liberação do GnRH, assim, essa nova freqüência do GnRH estimula a produção e
liberação de LH (hormônio luteinizante) que age no final da maturação folicular e é o
responsável por estimular a indução da ovulação (GINTHER, 1992)
Ocorre também a liberação do hormônio inibina pelo folículo dominante no
final da sua maturação, que tem a função de inibir somente a síntese de FSH na
4
hipófise, colaborando para que o LH chegue no seu pico de concentração
(GINTHER, 1992).
O LH é o responsável em induzir a ovulação pela ruptura da parede do
folículo maturado, com subseqüente liberação do óvulo para o interior do oviduto
favorecendo o desenvolvimento do corpo lúteo na cavidade remanescente no interior
do ovário após a ovulação. Após a ovulação ocorre formação do corpo hemorrágico
e dentro de 24 a 48 horas, desse corpo hemorrágico se forma o corpo lúteo. Este
corpo lúteo ou corpo amarelo é o responsável pela produção do hormônio
Progesterona (P4) (ANDRADE, 1993).
A progesterona é um hormônio esteróide secretado pelo corpo lúteo, placenta
e glândula adrenal, sua função é preparar o endométrio para implantação do
embrião e manutenção da gestação pelo aumento da atividade secretora das
glândulas endometriais e inibindo a motilidade do endométrio e o estro. O estrógeno
produzido pelas células da granulosa do folículo dominante, através do colesterol, é
o hormônio responsável pelo estro na égua, com sinais de receptividade ao
garanhão, edema de vulva, relaxamento de cérvix e útero e a presença do folículo
dominante, os níveis de estrógeno aumentam conforme o crescimento folicular
(HAFEZ et al., 2004).
O estrógeno trata-se do hormônio produzido pelas células da granulosa do
folículo dominante, através do colesterol, e é responsável pela manifestação de cio
na égua,como receptividade ao garanhão, edema de vulva, relaxamento da cérvix e
útero e a presença do folículo dominante. Os níveis séricos de estrógeno aumentam
conforme o crescimento folicular (ANDRADE, 1983).
A prostaglandina (PGF2a), hormônio secretado pelo útero, Este, é
responsável por promover a luteólise do corpo lúteo e conseqüentemente diminuir a
concentração sérica de PGF2a, permitindo o crescimento de uma nova onda
folicular (GINTHER et al., 1992).
5
2.2 – CONTROLE FOLICULAR
O controle folicular na égua é realizado diariamente para avaliar a fase do
ciclo estral e garantir um acompanhamento preciso do momento da ovulação,
ficando assim mais eficaz as técnicas reprodutivas aplicadas. O cio da égua dura de
5 a 7 dias e a ovulação ocorre com folículo pré-ovulatório medindo em média 35 a
40 milímetros, pelo menos 36 horas antes do final do cio, sendo que a inseminação
deve ser realizada o mais próximo possível da ovulação (MIES, 1987).
6
O tamanho folicular quando associado ao grau de edema endometrial são
fatores determinantes para decidir a hora da inseminação da égua. Um grau de
edema endometrial alto (entre dois e três) e presença de um folículo pré-ovulatório
com aproximadamente 35 a 40 milímetros (mm) são indicadores da eminência da
ovulação. Em contraste, a presença deste mesmo grau de edema endometrial
associado a um folículo com 30 mm, indicam um cio inicial (SAMPER, 1997).
2.3 – EXAME DO APARELHO REPRODUTOR DA FÊMEA
O exame ginecológico é realizado tanto em doadoras como em receptoras
para avaliar as condições do útero e do ovário da égua, ainda mais quando são
utilizados garanhões valiosos, cujo intuito é de otimizar o uso do sêmen (ANDRADE,
1983).
Os exames ginecológicos realizados são: a ultrassonografia uterina, que
avalia o escore de edema uterino; a palpação retal, que avalia o tônus uterino
(flácido no estro, devido ao edema alto do endométrio), consistência folicular, e
abertura ou fechamento da cérvix; o exame vaginal, que avalia edema de vulva
característico no estro, e a conformação vulvar; a citologia uterina que avalia a
presença de agentes causadores de endometrites (MOREL, 2003).
A biópsia uterina é um exame realizado pela análise de um fragmento uterino,
tais amostras podem permitir identificação de anormalidades, assim como indicar
evidência de degeneração uterina (BLANCHARD et al., 2003).
2.3.1 – PALPAÇÃO RETAL
A palpação retal é realizada pela introdução da mão do veterinário
examinador pela região do reto, a fim de diagnosticar alguma alteração em útero,
cérvix, ovários e tubas uterinas. Os ovários variam de tamanho conforme o
crescimento folicular, alcançando o tamanho de até 4 centímetros (cm) ou mais,
sendo essa uma variação individual entre éguas. O útero apresenta níveis de tônus
7
em três graus de edema e cérvix possui três níveis de abertura, sendo característico
de estro os maiores níveis de ambos (BLANCHARD et al., 2003).
Com a avaliação deste exame o estro é definido por relaxamento uterino,
relaxamento da cérvix e aumento do ovário por desenvolvimento folicular seguido de
flutuação folicular quando próximo da ovulação, indicando o memento adequado da
inseminação da égua. Já o diestro é determinado após a ovulação e
desaparecimento dos sinais de estro, devido a produção do hormônio progesterona
(P4) pelo corpo lúteo. Na palpação o útero estará tenso e a cérvix fechada (MOREL,
1999).
2.3.2 – UTRASSONOGRAFIA TRANSRETAL
Em 1980, a ultrassonografia foi apresentada como uma modalidade
diagnóstica potencialmente valiosa na rotina de reprodução eqüina, desde sua
apresentação, os diagnósticos em reprodução eqüina expandiram ao ponto que o
instrumento
tornou-se
fundamental,
quase
indispensável,
ferramenta
para
veterinários (BLANCHARD et al., 2003).
Os aparelhos de ultrassonografia usados para examinar o trato reprodutivo de
eqüinos são do tipo B-modal em tempo real, e a freqüência do transdutor linear
utilizado é de a 5 a 7,5 MHz. Esta fornece imagens detalhadas de estruturas
pequenas dos órgãos próximos ao transdutor e com boa resolução (LOURENÇO
apud GINTHER, 1995).
A ultrassonografia é uma eficiente ferramenta utilizada para avaliação do
momento da indução da ovulação, não somente pela precisão proporcionada
através da mensuração do diâmetro folicular como também pela classificação do
grau de edema endometrial, que é classificado de 0 a 5, e sendo 0 a ausência de
edema, e 5 o edema máximo (MELLO, 2006).
8
O transdutor linear de alta freqüência do ultra-som, que forma imagens em
tonalidades de cinza e preto, é introduzido pelo do reto e seguindo a diante localiza
o corpo do útero seguido pelos cornos uterinos e seus ovários (KÄHN et al., 1994).
O escaneamento do útero em corte horizontal transcreve uma imagem linear
do corpo do útero, e em corte transversal transcreve a imagem dos cornos uterinos,
formando uma imagem circular do corno uterino. O útero quando edemaciado, pela
liberação de estrógeno pelo folículo dominante, vai formar uma imagem circular com
as vilosidades uterinas aparentes. Nos ovários vão se formar imagens esféricas dos
folículos, que no seu interior apresentam uma imagem anecóica (imagem de cor
preta, característica dada por estruturas com líquido em seu interior (MIES, 1987).
De um modo geral, o folículo prestes a se romper tem as paredes flácidas e
mede alguns centímetros de diâmetro (4 a 5 ou mais). As inseminações devem ser
praticadas quando o folículo está na iminência de se romper, sendo aconselhado
fazer nova inseminação no dia imediato. (MIES, 1987).
9
2.3.3 – EXAME VAGINAL
Para realizar esse exame toda região da vulva e áreas ao redor devem ser
cuidadosamente limpas, para evitar a contaminação do trato reprodutivo com
fungos, bactérias ou debris celulares. O espéculo vaginal é inserido na cavidade
vaginal para permitir o exame, com uma pequena quantia de lubrificante estéril
colocado antes da introdução na vagina, utilizando uma lanterna para iluminar a
vagina pelo espéculo. Através desse exame é possível diagnosticar hímen
persistente, vaginites, aderências, lacerações de cérvix, acumulo de secreção
purulenta ou urina na cavidade vaginal (BLANCHARD et al., 2003).
2.3.4 – CITOLOGIA UTERINA
Através de um swab fixado a um aparelho de citologia uterina eqüina, células
do lúmen uterino são recuperadas para verificar para a presença de um processo
inflamatório ativo ou de uma endometrite infecciosa. A coloração com preparações
de corante para citologia (eosina-hematoxilina) permite o exame sob um microscópio
da amostra obtida para a análise da presença de glóbulos brancos (geralmente
neutrófilos), microrganismos, e células endometriais. Os neutrófilos são indicadores
de uma endometrite, que aumenta a gravidade de acordo com o aumento da
presença de neutrófilos nos campos analisados (BLANCHARD et al., 2003).
10
2.3.5 – BIÓPSIA ENDOMETRIAL
Esse exame é um dos mais importantes na avaliação do potencial reprodutivo
da égua, levando a um prognóstico da capacidade da égua em seguir com uma
prenhez resultando em um potro saudável (BLANCHARD et al., 2003).
2.4 – HORMONIOTERAPIA
A utilização de agentes indutores da ovulação no manejo reprodutivo de
éguas apresenta um papel fundamental na otimização dos resultados das
biotecnologias, dentre elas a inseminação artificial, seja utilizando sêmen fresco,
refrigerado ou congelado (GINTHER, 1992).
Para alcançar estes fins, programas de luz artificial e administração de
hormônios são usados para acelerar o inicio da estação reprodutiva, induzir a
ovulação em éguas em estro e aumentar as chances de prenhez em éguas de potro
no período pós-parto (BLANCHARD et al., 2003).
2.4.1 – SINCRONIZAÇÃO DE ESTRO
A sincronização do cio e da ovulação é uma terapia hormonal realizada em
éguas dentro de um programa de IA que possuem um corpo lúteo funcional de
quatro dias ou mais. Para essa terapia o hormônio prostaglandina é utilizado, assim
permitindo inseminações em períodos pré determinados pelo encurtamento do
diestro ou prolongamento através de progestágenos (HAFEZ et al., 2004).
A prostaglandina em uma única aplicação promove a luteólise de corpo
lúteo ativo e persistente ciclo estral folicular. A vantagem da utilização da
prostaglandina é reduzir o período de diestro de forma econômica e eficiente, sendo
o método mais preciso e prático para o controle e sincronização do ciclo estral da
égua ou para tratamento de éguas problema (ANDRADE, 1993).
11
Após a aplicação de prostaglandina, o corpo lúteo regride em vinte e quatro a
setenta e duas horas, o que permite o crescimento folicular, sendo assim o início dos
sinais de estro dentro de 3 a 5 dias (HAFEZ et al., 2004).
A utilização de progestágeno exógeno (100mg/dia via intra-muscular) exerce
uma retroalimentação negativa na secreção de LH após a regressão do corpo lúteo,
o que vai aumentar o período de diestro. O cio e a ovulação ocorrem de dois a oito
dias após a suspensão da aplicação do progestágeno (GINTHER, 1992).
2.4.2 – HORMÔNIOS INDUTORES DA OVULAÇÃO
Os hormônios Gonadotrofina coriônica humana (hCG), Hormônio liberador de
gonadotrofinas (GnRH) e Extrato de Pituitária Eqüina (EPE) são hormônios que
atuam reduzindo o intervalo pré-ovulatório, facilitando a sincronização da ovulação e
com isso otimizando o uso do garanhão na hora mais próxima da ovulação. Porém,
para que possa ser eficiente, a utilização das drogas indutoras de ovulação deve ser
realizada com o acompanhamento diário do estro, através de palpação retal e ultrasom, monitorando o crescimento folicular e o edema uterino, para que a
administração dos indutores seja realizada no momento adequado evitando falhas
na indução (HAFEZ et al., 2004).
2.4.2.1 – hCG (Gonadotrofina coriônica humana)
O hCG tem sido utilizado por muitos anos para diminuir o período de estro e
acelerar a ovulação, sua eficiência é amplamente demonstrada na indução da
ovulação realizada quando a égua apresenta um folículo pré-ovulatório de pelo
menos 35mm sendo capaz de induzir a ovulação em até 48 horas em 80% dos
casos (GINTHER, 1992 apud BERGFELT, 2000).
O hCG tem atividade semelhante ao LH e utilizando-se uma dosagem de
2000-3000 unidades via intravenosa. A via intramuscular pode ser usada, mas é
mais provável induzir a formação de anticorpos que potencialmente pode reduzir a
eficácia do hCG em ciclos subseqüentes na mesma estação reprodutiva. Os critérios
12
necessários antes de administração de hCG são: o folículo deve estar ao menos
com 35 mm, o útero com edema endometrial presente em ultrassonografia, a égua
deve exibir sinais de estro e a cérvix deve estar relaxada. Quando estes critérios são
encontrados na hora da administração, normalmente ocorre a ovulação entre 24 a
48 horas (SMITH, 2007).
2.4.2.2 – GnRH (Hormônio liberador de gonadotrofinas)
Foi sugerido que GnRH pode ser mais bem-sucedido do que o hCG em
induzir ovulação em folículos maduros e maiores por não causar refração de
resposta pela formação de anticorpos como ocorre com o hCG, melhorando assim a
eficiência na indução da ovulação (MOREL, 2003).
O acetato de deslorelina é um análogo sintético do GnRH eficiente na indução
da ovulação por se semelhante ao LH. Utiliza-se 1 miligrama (mg) via intra-muscular
e não se pode utilizar sintéticos de GnRH para bovinos em eqüinos, pois eqüinos
necessitam de GnRH de meia vida longa devido a sua longa onda de liberação de
LH. O produto lançado inicialmente no mercado Estados Unidos chamado de
deslorelina 2,1-mg (Ovuplant®; Lboratório Fort Dodge), em forma de implante
subcutâneo contendo deslorelina deixou de ser usado em cavalos por alterar o cilclo
estral (ALVARENGA et al., 2010) .
2.4.2.3 – Extrato de Pituitária Eqüina (EPE)
O EPE é um preparado bruto de glândulas pituitárias eqüina, essa
metodologia utilizada para a extração dos hormônios LH e FSH do preparado de
pituitária eqüina envolve na fase final a utilização de um sistema de filtragem por
membranas de diálise que permitem a passagem de todas substâncias presentes
com pesos moleculares menores que 12.000 a 14.000, o que, na espécie eqüina,
garante a seleção tanto do FSH com peso molecular de 33.200 quanto do LH com
33.500 de peso molecular (ARAUJO, 2006).
13
O EPE tem demonstrado excelentes resultados na indução da ovulação em
doses de 10mg, causando a ovulação dentro de 34 a 48 horas após a aplicação, ao
contrário do hCG, não induz a formação de anticorpos. Entretanto deve-se levar em
consideração a heterogenicidade das amostras de EPE (GINTHER, 1992).
A heterogenicidade ocorre pela variação dos níveis de FSH e LH presentes
no EPE de acordo com a partida preparada, devido à variação individual, sexo, faixa
etária, estágio reprodutivo e época do ano que são coletadas as pituitárias para
produção do extrato, (ARAUJO apud CARMO, 2003).
Porém o tratamento não apresenta muito valor prático, visto que as doses
necessárias são anti-econômicas e poderão provocar ovulações múltiplas, o que é
indesejável na égua pelo fato de aumentar a probabilidade da ocorrência de gêmeos
e, conseqüentemente, de abortos (ANDRADE, 1993).
2.5 – SÊMEN
Esta é a etapa do programa de inseminação artificial mais crítica, visto que
envolve a preparação dos garanhões, como condicionamento para subir no
manequim, condicioná-lo ao manejo de lavagem peniana realizada pré-coleta, e
determinação das técnicas adequadas e intervalos de coleta. O ideal é que o
garanhão somente rufie a égua em cio o suficiente para a descida e lavagem do
pênis, a rufiação em tempo prolongado estimula o aumento de volume da fração em
gel do sêmen (ANDRADE, 1993).
A estação reprodutiva dos garanhões não é muito bem delimitada e pode-se
colher sêmen durante todo ano. Entretanto, variações sazonais consideráveis são
notadas em relação ao número de montas por ejaculado, no volume da fração do
sêmen sem gel, no número total de espermatozóides por ejaculado, na aglutinação
espermática e na motilidade, tanto no sêmen fresco quanto no diluído (HAFEZ et al.,
2004).
14
2.5.1 – COLETA DE SÊMEN
Ao longo dos anos as técnicas de colheita de sêmen para eqüinos foram
desenvolvidas e aperfeiçoadas, desde a massagem da ampola do ducto deferente,
camisa peniana, vagina artificial, esponja, colheita direta da cavidade vaginal ou
uterina, a colheita de sêmen do epidídimo de garanhão que já é descrita, sendo uma
biotecnologia importante para a reprodução eqüina. A técnica que recupera
espermatozóides viáveis do epidídimo é uma importante técnica para obter reservas
genéticas de animais geneticamente valiosos ou de machos de espécies ameaçadas
de extinção (GRANEMANN, 2006).
A coleta através da vagina artificial é a mais utilizada na prática, sendo
associada com resultados mais satisfatórios, pois melhora a qualidade do sêmen por
evitar o contato com secreções da fêmea, e com materiais contaminados e evita a
perda de sêmen, devido ao filtro de nylon acoplado ao copo coletor que separa a
fração em gel do sêmen com perdas mínimas de espermatozóide (ANDRADE,
1993).
A preparação da vagina artificial é realizada com o preenchimento interno
com água à 50°C para equilibrar a temperatura com o material da vagina artificial
fornecendo uma temperatura interna de 44° a 48°C, pois acima disso pode ocorrer
injúrias irreversíveis ao sêmen. Apenas alguns garanhões respondem mais
favoravelmente a coleta de sêmen com uma vagina artificial de temperatura interna
de 50° C (BLANCHARD et al., 2003; MOREL, 1999).
A pressão de luminal da vagina artificial deve ser ajustada para fornecer
contato uniformemente ajustado ao redor do pênis, sem interferir na penetração na
vagina artificial. É importante o pênis penetrar completamente na vagina artificial
logo no primeiro impulso ao montar no manequim, mantendo-se o pênis nesta
posição completamente inserido, ao contrário, a glande do pênis dilatará e poderá
ser grande e impedir a penetração plena do pênis na vagina artificial. A superfície
15
interna da vagina artificial deve ser lubrificada com um lubrificante estéril de não
espermicida antes de inserção de pênis (BLANCHARD et al., 2003).
A ejaculação do garanhão pode ser verificada com as seguintes
características: movimento da cauda para cima e para baixo; contrações dos
músculos perianais; sapatear e fluxo pulsátil uretral da ejaculação, com a
confirmação da ejaculação deve-se retirar cuidadosamente a vagina artificial do
pênis do garanhão sem incliná-la para não refluir o sêmen do copo coletor (PAPA et
al., 2007).
16
2.5.2 – ANÁLISE DO SÊMEN EQUINO
Imediatamente após sua coleta, o sêmen deve ser rapidamente transportado
ao laboratório para reduzir as possibilidades de trauma físico, a exposição à luz,
choque térmico, ou calor excessivo, pois esses fatores causam injúrias irreversíveis
aos espermatozóides. Todos os materiais que vão entrar em contato com o sêmen
(inclusive o diluidor de sêmen) devem ser aquecidos a temperatura de 37° a 38° C
antes da realização da coleta (BLANCHARD et al., 2003).
A fração de gel do sêmen sem filtrar, também pode ser retirada por aspiração
cuidadosa com uma seringa para evitar a perda de espermatozóides, sendo que
com um filtro de nylon utilizado no copo coletor na hora da coleta a perda se sêmen
é mínima (BLANCHARD et al., 2003).
Parâmetros como motilidade, concentração e morfologia espermáticas são
avaliados nas amostras de sêmen (fresco, resfriado ou congelado). A motilidade
espermática é estimada pela análise de uma gota sêmen entre lâmina e lamínula,
enquanto as anormalidades espermáticas são avaliadas em esfregaços corados.
Ambas as técnicas são realizadas sob uso de microscopia óptica. E a concentração
é avaliada pela Câmara de Neubauer (ARRUDA et al, 2007).
2.5.2.1 – VOLUME
O volume seminal é medido em mililitros (ml). A fração em gel do sêmen é
excluída do volume, devido a dificuldade de manuseio da amostra. Geralmente, os
volumes dos ejaculados entre garanhões demonstraram uma larga variabilidade
individual (ANDRADE et al., 1993). O volume pode variar de 20 a 100 ml. (PAPA et
al., 2007).
2.5.2.2 – CONCENTRAÇÃO
Retira-se do volume ejaculado uma alíquota de 20 microlitros (µl) utilizando-se
uma micropipeta e coloca-se em um tubo de ensaio contendo 1 mililitro (ml) de água
destilada e aquecida, ou se faz 1 gota de sêmen em 19 gotas de água destilada.
17
Após boa homogeneização, monta-se uma Câmara de Neubauer, preenchendo seus
dois retículos para análise. A concentração é determinada contando-se todos os
espermatozóides presentes em 5 quadrados de cada retículo em cada lado da
câmara, sendo que a variação do numero de espermatozóides entre cada lado da
câmara não pode ser mais que 10% (se for maior repete-se a operação). Após a
operação calcula-se a média aritmética entre os valores encontrados, sendo essa
média a concentração espermática por ml da amostra (PAPA et al., 2007).
Numa análise completa de sêmen, o número total de espermatozóides na
amostra coletada é determinado através da multiplicação entre o valor do volume e o
valor concentração, ambos obtidos na análise. O resultado é a quantidade total de
espermatozóides na amostra (CARD, 2010).
2.5.2.3 – MOTILIDADE/VIGOR
Para avaliação de motilidade, o sêmen fresco é diluído com diluente comercial
de sêmen e analisado através de um microscópio óptico com uma placa
aquecedora. A porcentagem de espermatozóides em movimento linear rápido
representa a porcentagem de motilidade dos espermatozóides da amostra, essa
porcentagem tem a escala de 0 a 100% (BLANCHARD et al., 2003; PAPA et al.,
2007).
Ao mesmo tempo da avaliação da motilidade espermática é avaliado o vigor
espermático e classificado numa escala de 0 a 5. A classificação é acordo com a
velocidade com que o espermatozóide se desloca, quanto maior a velocidade, maior
é a escala, portanto, maior o vigor (PAPA et al., 2007).
2.5.2.4 – MORFOLOGIA
A morfologia do sêmen é expressa como a percentagem de células normais,
sendo mais facilmente observada quando os espermatozóides estão parados
(ANDRADE, 1993). A amostra de sêmen do garanhão deve ser filtrada para retirar a
fração em gel, pois o gel impossibilita a interpretação da amostra. A amostra de
18
sêmen já filtrada é misturada com corantes, assim corados permitem a avaliação da
morfologia e patologias espermáticas (CARD, 2010).
As patologias afecções encontradas na análise morfológica do sêmen são: do
forma irregular do acrossomo devido à incorreta manipulação, choque térmico ou
senilidade; alterações da cabeça do espermatozóide; alterações da inserção da
cauda, como gotas citoplasmáticas; alterações de cauda, como cauda enrolada; e
formas teratológicas (PAPA et al., 2007).
2.5.3 – DILUIÇÃO DE SÊMEN
Existem numerosos diluentes que são utilizados para resfriar, transportar e
congelar o sêmen de garanhões e sua finalidade é favorecer a longevidade máxima
de fertilidade das células espermáticas, embora existam significativas variações e
imprevisibilidade de tolerância dos espermatozóides aos diluentes frente a técnicas
de resfriamento e congelamento por resposta individual de cada garanhão (WEISS
et al., 2003).
Em nosso país, existem comercialmente quatro diluentes para diluição e
transporte de sêmen eqüino (Equimix, Max-Sêmen, Botu-Sêmen e Botu-Turbo),
meios que podem ser utilizados tanto para inseminação artificial de sêmen fresco
como refrigerado e congelado. O diluente Botu-Turbo é composto de estimulantes
de motilidade que parecem melhorar a resistência a refrigeração (5º C) de sêmen de
garanhões que apresentem baixa qualidade. (ALVARENGA et al., 2010).
Carvalho et al. (2005) demonstraram que o diluente à base de glicina e leite
desnatado, acrescido do aminoácido taurina, apresentou resultados superiores dos
parâmetros espermáticos e da fertilidade, quando comparado ao diluente à base de
leite desnatado e glicose.
Na utilização de sêmen fresco, Weiss et al. (2003) concluíram que não existe
diferença significativa entre éguas inseminadas com sêmen “in natura” (inseminado
19
imediatamente após a coleta sem nenhum procedimento laboratorial), e diluído
quando inseminadas imediatamente após a coleta.
O sêmen fresco é diluído na proporção de 1:1 (proporção de sêmen para
diluente), e tem como vantagens o tratamento antibiótico, diminuindo a
contaminação bacteriana do sêmen; diluição de fatores tóxicos presentes no plasma
seminal; melhora da fertilidade do sêmen devido ao suporte de nutrientes contidos
no diluidor (CANISSO apud SQUIRES et al., 1999).
O sêmen para ser refrigerado deve ser diluído na proporção de 1:2 (proporção
de sêmen para diluente), e deve ser mantido à temperatura de 5ºC, o que permite
ser utilizado por até 48 horas. O sêmen mantido a 15 - 20ºC deve ser utilizado de
preferência entre as 12 horas de sua colheita. O transporte do sêmen deve ser
realizado em caixas que não permitam variações de temperatura (CANISSO et al.,
2008).
Os diluentes de congelação são compostos com açúcares, eletrólitos, gema
de ovo e leite com variável concentração de 1,6 a 20%, de glicerol entre os diluentes
existentes no mercado (SNOECK et al., 2007).
Diferentes antibióticos, tampões, açúcares e, mais recentemente, a adição de
agentes indutores de funcionalidade da célula espermática estão sendo investigados
a fim de se obter uma melhor preservação do ejaculado de garanhões com baixa
qualidade seminal (NUNES et al., 2006).
O diluente deve ser adicionado ao sêmen para que haja a proteção do
espermatozóide durante o processo de centrifugação. A centrifugação forma um
pelet com plasma seminal sobrenadante sendo descartado e é adicionado diluente
para congelação no pelet, onde os espermatozóides são ressuspendidos, depois se
prossegue com as etapas de congelação de sêmen (KIRK et al., 2005).
O que determina a quantidade de diluente de congelação a ser utilizado é a
quantidade de espermatozóides contidos no ejaculado, que são distribuídos em
20
palhetas, sendo a quantidade de palhetas a serem utilizadas é que vai determinar o
volume de diluente a ser adicionado no pelet (KIRK et al., 2005).
2.5.4 – TIPOS DE SÊMEN E DOSES INSEMINANTES
Recentes avanços em processamento de sêmen e técnicas de inseminação
artificial permitiram reprodução bem-sucedida com doses de sêmen em diversas
escalas abaixo do que a dose recomendada. Essas técnicas são mais trabalhosas e
consomem mais tempo, mas permitem um melhor aproveitamento do sêmen por
ejaculado. (BRINSKO, 2006).
2.5.4.1 - SÊMEN FRESCO
O sêmen fresco pode ser utilizado na forma “in natura” ou diluído. As doses
consagradas para inseminação artificial com sêmen fresco em éguas é de 250 a
500×10⁶ espermatozóides de motilidade progressiva por dose, para se alcançar
índices satisfatórios de prenhez, sendo a dose de 500×10⁶ espermatozóides a dose
mais comumente recomendada (BRINSKO, 2006).
2.5.4.2 – SÊMEN RESFRIADO
A inseminação artificial (IA) com sêmen eqüino refrigerado tem se difundido
entre os haras, pois possibilita utilizar garanhões geneticamente superiores,
direcionando melhor os acasalamentos. A obtenção de boas taxas de prenhez
depende, além da freqüência e momento da IA controlados e de fatores
relacionados com a refrigeração do sêmen como o equipamento utilizado para
transporte, curva de refrigeração, temperatura final de estocagem, tempo de
preservação, taxa de diluição, concentração e volume da dose inseminante e a
variação individual entre garanhões (NUNES et al., 2006).
A dose inseminante geralmente recomendada para sêmen resfriadotransportado é igual à dose de sêmen fresco, isto é, 500 ×10⁶ de espermatozóides
com motilidade progressiva. (BRINSKO, 2006).
21
2.5.4.3 – SÊMEN CONGELADO
A reação inflamatória uterina é exacerbada depois da inseminação com
sêmen congelado. Estudos mostraram que o plasma seminal (que é retirado durante
criopreservação) proporciona uma inibição uterina da reação inflamatória após a
cobertura, sendo o seu efeito de imunossupressor do útero (DEALS, 2003).
A IA com sêmen congelado ainda tem questões técnicas para serem
solucionadas, como a variação individual de cada sêmen frente à criopreservação, o
baixo rendimento de doses por ejaculado, o manejo intensivo das éguas durante as
inseminações, maior custo por prenhez, além da grande oscilação das taxas de
prenhez em relação às obtidas com Monta Natural (MN) ou IA com sêmen a fresco
ou refrigerado (NUNES et al, 2006).
A avaliação do sêmen coletado tem maior importância quando o destino do
ejaculado é o congelamento. A porcentagem da motilidade deve estar em torno de
70% ou mais, com um mínimo de 60% de motilidade, com as células espermáticas
apresentando vigor adequado de no mínimo 4 de vigor, com nítida motilidade
progressiva.
A
concentração
mínima
espermatozóides por ml (ANDRADE, 1983).
para
congelamento
é
de
60×10⁶
22
A viabilidade espermática diminui de acordo com tempo de armazenamento e
o efeito prejudicial do tempo de armazenagem varia conforme o garanhão. Para se
determinar a dose mínima que cada sêmen consegue alcançar na sua variação
individual deve ser testada para alcançar índices satisfatórios de prenhez. Isto
permite uso mais eficiente de sêmen para garanhões com motilidade progressiva
que diminui após congelamento, armazenamento e descongelamento (até menor
que 30% de motilidade), sendo necessário aumentar o número de palhetas
utilizadas por inseminação (BRINSKO, 2006).
A dose inseminante recomendada quando se utiliza sêmen congelado de
garanhões com fertilidade normal é de 800×10⁶ espermatozóides com motilidade
progressiva e mesmo utilizando um alto número de espermatozóides a taxa de
concepção com sêmen congelado varia entre 30 a 70% (CARD, 2010).
23
2.6 – TÉCNICAS DE INSEMINAÇÃO ARTIFICIAL (IA)
Em muitos programas de IA, sem acompanhamento ultrassonográfico, as
éguas são inseminadas dia sim dia não, começando no segundo ou terceiro dia de
estro, até que ovulação é detectada ou até que a égua não apresente mais sinais
comportamentais de estro. Quando utilizado sêmen de garanhões com alta
fertilidade, índices satisfatórios de prenhez podem ser obtidos quando as éguas são
inseminadas dentro de 72 horas antes de ovulação. Quando com acompanhamento
ultrassonográfico se limita o número de inseminações e melhora a eficiência total do
programa reprodutivo reduzindo o risco de contaminação de iatrogênica do sistema
reprodutivo da égua, por isso a importância de realizar a técnica de IA o mais
próximo possível da ovulação (BLANCHARD et al., 2003).
2.6.1 – MOMENTO DA INSEMINAÇÃO ARTIFCIAL
A viabilidade dos espermatozóides no trato reprodutivo da fêmea varia de
acordo com o tipo de sêmen utilizado (fresco, resfriado ou congelado). Isto é o que
determina a hora mais adequada para a inseminação. Uma vez dentro do útero, os
espermatozóides migram ao oviduto onde se ligam à parede e ficam armazenados
como num reservatório, e são liberados gradualmente do epitélio para o lúmen do
oviduto (DAELS, 2003).
Utilizando sêmen refrigerado o indicado é fazer a inseminação dentro de 24
horas depois do resfriamento do e sêmen, pois se for mantido por mais horas ocorre
queda na fertilidade. Se não o ocorrer a ovulação até 24 horas após a IA, deve-se
realizar uma nova inseminação, pois o sêmen resfriado tem sua viabilidade dentro
do trato reprodutivo dá égua por 24 horas (PAPA et al.,2007).
O sêmen congelado tem sua viabilidade dentro do trato reprodutivo da fêmea
por 12 horas, por isso a importância da IA ser realizada próxima à ovulação, que
caso não ocorra dentro de 12 horas, a IA deverá ser repetida. Pose-se realizar a IA
com sêmen congelado em até 6 horas após a ovulação, que é a duração da
viabilidade do óvulo depois da ovulação (PAPA et al.,2007).
24
Samper (1997) afirma que éguas que são inseminadas dentro de 48 a 24
horas antes da ovulação, possuem um alto índice de concepção, assim alcançando
altas taxas de prenhez.
Há evidência de que espermatozóides que sofreram o processo de
congelação não se ligam à parede do oviduto perdendo a capacidade de se
armazenarem, sendo assim o sêmen congelado com um tempo de vida menor no
oviduto em relação aos espermatozóides de sêmen fresco e resfriado, sendo assim
necessário realizar a inseminação artificial com sêmen congelado no momento mais
próximo possível da ovulação (DAELS, 2003).
2.6.2 – MÉTODOS DE INSEMINAÇÃO ARTIFICIAL
A inseminação Histeroscópica e inseminação na ponta do corno uterino são
técnicas de reprodução assistida vantajosas, não-cirúrgicas que são usadas em
éguas no cio com uma dose reduzida de sêmen tal como: sêmen sexado fresco,
sêmen sexado congelado, ou sêmens criopreservados de garanhões que já
morreram (CARD, 2010).
2.6.2.1 – INSEMINAÇÃO NO CORPO DO ÚTERO
A inseminação convencional em éguas é feita por via vaginal, na qual a mão
do inseminador com luva de palpação guia uma pipeta até a passagem da cérvix e o
sêmen é depositado no corpo do útero (MIES, 1987).
Com essa técnica utiliza-se sêmen fresco “in natura” (sem adição de
diluentes) e sêmen fresco diluído. O sêmen fresco “in natura” tem desvantagens,
pois possui a tendência de aglutinação de espermatozóides, e neste caso a
concentração espermática é maior do que a porcentagem de espermatozóides
móveis viáveis. Diluindo-se o sêmen, há a prevenção da aglutinação espermática e
a redução das influências de concentração (VIANNA, 2000)
25
2.6.2.2 – INSEMINAÇÃO NA PONTA DO CORNO UTERINO
A Inseminação ponta do corno uterino é utilizada para sêmen congelado, a
técnica é realizada passando uma pipeta flexível de inseminação artificial pela
vagina e através da cérvix, que alcançará o corpo do útero assim que atravessar a
cérvix. A pipeta é então direcionada ao corno uterino ipsilateral ao ovário que sofreu
o processo da ovulação com auxilio da mão do inseminador que é introduzida no
reto identificando a ponta da palheta no corno uterino desejado, ou se numa
localização incorreta, a pipeta é retirada somente até a parte cranial da cérvix e
redirecionada. Assim o sêmen é depositado na ponta do corno uterino, utilizando
múltiplas palhetas, dependendo da dose inseminante desejada (CARD, 2010).
Algumas éguas exigem sedação para o procedimento. O sêmen então é
depositado na ponta do corno uterino. Múltiplas palhetas podem ser aplicadas
usando um mandril que permita a retirada da palheta (CARD, 2010).
2.6.2.3 – INSEMINAÇÃO HISTEROSCÓPICA
Enquanto a primeira técnica usa pipeta flexível que é levada sob palpação
transretal em direção da ponta do corno uterino, IA sobre a papila uterina exige
controle visual por um endoscópio flexível. Com baixas doses entre 1 e 5 milhões de
espermatozóides, os índices de prenhez por inseminação é acima de 50% utilizando
essa técnica (AURICH, 2006).
Para esse procedimento as éguas são sedadas via intra-venosa por alfa
agonistas, tal como xilazina associada com butorfanol para reduzir movimentos ou
qualquer desconforto durante o procedimento, e proteger o equipamento no caso da
égua se tornar impaciente, ou ansiosa. O equipamento de endoscópico deve ser
quimicamente esterilizado, geralmente com produtos baseados em glutaraldeído
(CARD, 2010).
O procedimento fica mais fácil para se executar utilizando um endoscópio
com bom fluxo de ar, esse fluxo deve ter a capacidade de insuflar uma luva de
26
palpação retal dentro de 30 segundos. Uma quantia pequena de lubrificante estéril é
aplicada nos lados do endoscópio. É necessário um inseminador usando uma luva
de palpação e uma luva estéril protegendo o equipamento que passa pela vagina, e
passa a cérvix chegando no útero. A cérvix é segurada e fechada ao redor do
endoscópio e o útero é insuflado com ar ou gás, levando menos que 20 segundos
para completa insuflação uterina (CARD, 2010).
O inseminador verá a bifurcação dos cornos uterinos e passará o endoscópio
para o lado do corno uterino com folículo pré-ovulatório. Durante a passagem do
endoscópio no útero deve-se ter cuidado para manter a orientação, e a localização
deve se confirmada pelo reto fim do procedimento (AURICH, 2006).
A papila uterotubária aparece como uma pequena montanha que se localiza
dorsalmente no fim do corno uterino. O sêmen é depositado diretamente na
superfície da papila, seguido por ar para ejetar completamente o sêmen do
equipamento, tal que se forma uma espuma. A vantagem desta técnica está em
poder utilizar pequenas doses de sêmen (CARD, 2010).
2.6.2.4 – INJEÇÃO INTRACITOPLASMÁTICA DE ESPERMATOZÓIDE (ICSI)
ICSI é uma técnica de fertilização “in vitro” (técnica realizada em laboratório
fora do animal), através da injeção de um único espermatozóide dentro de um
ovócito.
O
espermatozóide
é
aspirado
por
uma
micropipeta
de
um
micromanipulador, e o ovócito é recuperado por aspiração folicular do ovário com
folículos em dominância. A ICSI não necessita de reação acrossomal ou capacitação
espermática para a fusão com a membrana do ovócito, sendo uma das vantagens
da técnica (ULIANI et al., 2009).
As principais indicações para o uso de ICSI são: falha na ovulação, bloqueio
no oviduto, infecções uterinas severas, sêmen de baixa qualidade ou escasso,
éguas que morreram e teve seus ovócitos armazenados, e tem como mais uma
vantagem não requerer estimulação hormonal da doadora (ULIANI et al., 2009).
27
Os impactos de tecnologias reprodutivas assistidas em nascimento de potros
com defeitos atualmente não são claras (AURICH, 2006).
Outra vantagem é a de fertilizar o ovócito mesmo com espermatozóide sem
motilidade e com defeitos. O zigoto criado sofre várias divisões até mórula ou
blastocisto inicial antes de ser transferido por técnica trans-cervical a uma égua
receptora sincronizada (AURICH, 2006).
2.6.2.4.1 – RECUPERAÇÃO E MATURAÇÃO DOS OVÓCITOS
A recuperação de ovócitos em éguas vivas é realizado por aspiração dos
ovócitos tanto pelo flanco como pela aspiração transvaginal guiada por ultra-som,
sem comprometer as habilidades da reprodutora. Ovócitos podem também serem
recuperados de ovários de éguas “post mortem”. (ULIANI et al., 2009).
O procedimento de aspiração via transvaginal necessita da sedação prévia da
égua; um equipamento de ultra-som com um transdutor curvilíneo que é usado para
visualização da aspiração folicular (ULIANI et al., 2009).
Após a aspiração dos ovócitos, é feita a seleção dos mesmos pela morfologia
do cumulus, depois são transferidos para um meio de maturação onde permanecem
por 24 a 36 horas dentro de uma estufa de maturação in vitro. (ULIANI et al., 2009).
2.6.2.4.2 – PREPARO DO SÊMEN
Para ICSI em eqüinos, três diferentes preparações de espermatozóides têm
sido usadas: fresco, refrigerado e congelado. Pelo fato de o espermatozóide injetado
ser circundado pela membrana plasmática, é possível que o processo de
congelação, o qual pode resultar em mudanças na membrana espermática, tenha
um efeito benéfico na difusão dos fatores espermáticos no citoplasma do ovócito
levando à ativação (ULIANI et al., 2009).
28
2.6.2.4.3 – INJEÇÃO DO ESPERMATOZÓIDE NO ÓVULO
O Piezzo drill é um aparelho que causa vibrações por minuto na pipeta de
injeção, facilitando a penetração do espermatozóide na zona pelúcida e garantindo a
quebra das membranas do espermatozóide e do ovócito (AURICH, 2006).
To procedimento deve ocorrer submerso em óleo, usando uma pipeta de 120
a 140 mm para segurar o ovócito na posição adequada e a pipeta de injeção do
espermatozóide tem 7 a 8 mm. Depois de fertilizados podem ser transferidos
diretamente para o oviduto ou cultivados até a fase de blastocisto inicial para ser
transferido para receptora como na técnica de transferência de embriões (ULIANI et
al., 2009).
29
3 – CONSIDERAÇÕES FINAS
O uso da inseminação artificial em eqüinos cresce a cada ano devido as suas
vantagens e distribuição da genética de animais com qualidade superior além de sua
viabilidade econômica. Assim os estudos hoje realizados em torno desse assunto,
trazem melhorias para conhecimento já existente dessa técnica tornando-a cada vez
mais eficiente e viável para os criadores.
O manejo tanto da égua como do garanhão são importantes pilares para o
sucesso da utilização da inseminação artificial. Os principais manejos para aumentar
os índices de prenhez através da IA são os de controle do ciclo estral das éguas
(momento adequado da inseminação), a maneira com que o sêmen é colhido e
manipulado, a habilidade do inseminador, a dose inseminante aplicada, a técnica de
inseminação empregada e principalmente o tipo de sêmen empregado (fresco,
refrigerado e congelado), devido suas variações de fertilidade, pois sêmens de boa
qualidade quando utilizados a fresco, podem não responder bem aos processos de
congelação ou resfriamento, o que reduz muito a sua fertilidade, portanto é
importante conhecer a características de cada sêmen para conseguir adaptar da
melhor o tipo de sêmen utilizado associado à técnica escolhida para utilizar.
30
REFERÊNCIAS
ANDRADE, Lúcio Sergio. Fisiologia e manejo da reprodução eqüina. 2ª ed.
Recife: Parque Gráfico da Fábrica de Discos Rozemblit, 1983.
ALVARENGA, Marco Antonio; CARMO, Márcio Teoro; OLVEIRA, José Victor.
Transferência de Embriões na Espécie Eqüina. Botucatu – Sp, Abril, 2010.
ARAUJO, Gustavo Henrique Marques. Efeito do tratamento com extrato de
pituitária ou FSH purificado eqüino sobre a concentração plasmática de
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