___________________________________________________________________________ Delineamento Cross-Over Livia Maria Andaló Tenuta Disciplina: Estatística Experimental OC Prof. Dr. Carlos Tadeu dos Santos Dias Piracicaba 2003 ___________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________ Definição O delineamento cross-over é um delineamento que apresenta semelhanças com o quadrado latino, mas com algumas vantagens sobre este. Nesse tipo de delineamento, todos os tratamentos são aplicados às mesmas unidades experimentais, após agrupá-las em grupos de número igual ao número de tratamentos. Assim, considerando que se tenha 2 tratamentos, A e B, as unidades experimentais são divididas aleatoriamente em 2 grupos, que iniciam o experimento em um dos dois tratamentos. Após um período de intervalo, conhecido como “wash-out”, o outro tratamento é aplicado àquelas unidades experimentais. Neste caso, têm-se 2 seqüências de tratamentos, AÆB e BÆA. O delineamento cross-over é muito utilizado em pesquisas com seres humanos, sejam elas na área médica ou odontológica. A principal vantagem desse delineamento é eliminar a grande variação existente entre indivíduos em resposta a um tratamento, tendo em vista que todos os tratamentos são atribuídos a todos os indivíduos. Isso também proporciona uma diminuição no número de indivíduos necessários para se testar diferentes tratamentos. Um dos principais problemas relacionados aos delineamentos cross-over é a dificuldade de eliminar efeitos residuais, também chamados de “carry-over”, de um tratamento anterior sobre outro subseqüente. Uma medida tomada para evitar efeitos “carryover” é a inclusão de um período de “wash-out” entre os tratamentos, de modo que todo efeito residual do tratamento anterior seja eliminado. Mesmo com a realização de períodos de “wash-out”, o efeito “carry-over” ainda pode persistir, e será abordado em maiores detalhes. ________________________________________________________________________ 1 ___________________________________________________________________________ Efeito “carry-over” O efeito “carry-over” considera que o efeito de um tratamento pode persistir e influenciar ou modificar o efeito dos tratamentos aplicados subseqüentemente. Os efeitos “carry-over” apresentam-se sob uma variedade de formas: podem ser efeitos de aprendizado ou de fadiga, tendo, respectivamente, efeito positivo ou negativo na resposta. Além disso, em se tratando de voluntários humanos, um efeito negativo do primeiro tratamento pode condicionar o indivíduo a produzir um resultado negativo no segundo tratamento. Por outro lado, uma resposta positiva no primeiro tratamento pode fazer com que o voluntário aumente as chances do tratamento subseqüente, mesmo sendo o placebo, apresentar um resultado positivo. A distribuição dos tratamentos dentro do delineamento cross-over pode influenciar grandemente a resposta obtida. Assim, nos delineamentos onde um tratamento A é sempre seguido por um tratamento B, um tratamento B é sempre seguido por um tratamento C, e assim sucessivamente, há dificuldade em se estimar o verdadeiro efeito de cada tratamento; uma maior resposta do tratamento B pode não ser reflexo da superioridade de B, mas sim do efeito “carry-over” positivo de A sobre B. Assim, idealmente no delineamento dos tratamentos, todos os tratamentos devem ser seguidos por todos os demais tratamentos, como é apresentado a seguir (linhas representam diferentes indivíduos ou seqüências, colunas representam diferentes períodos): n=2 n=4 n=6 AB BA ABCD BDAC CADB DCBA ABCDEF BDAFCE CAEBFD DFBEAC ECFADB FEDCBA ________________________________________________________________________ 2 ___________________________________________________________________________ n=8 n=10 ABCDEFGH BDAFCHEG CAEBGDHF DFBHAGCE ECGAHBFD FHDGBEAC GEHCFADB HGFEDCBA ABCDEFGHIJ BDFHJACEGI CFIADGJBEH DHAEIBFJCG EJDICHBGAF FAGBHCIDJE GCJFBIEAHD HEBJGDAIFC IGECAJHFDB JIHGFEDCBA Nota-se que acima são apresentados apenas quadrados latinos para n par. No caso de n ímpar, deve-se lançar mão de pares de n x n quadrados latinos (linhas representam diferentes indivíduos ou seqüências, colunas representam diferentes períodos): ABC BCA CAB n=7 n=5 n=3 ACB BAC CBA ABDEC BCEAD CDABE DEBCA EACDB ACBED BDCAE CEDBA DAECB EBADC ABECGFD BCFDAGE CDGEBAF DEAFCBG EFBGDCA FGCAEDB GADBFEC AGDFBCE BAEGCDF CBFADEG DCGBEFA EDACFGB FEBDGAC GFCEABD Método para testar a capacidade de diferenciar efeitos de tratamento e de “carry-over” Mesmo utilizando quadrados balanceados dentro do delineamento cross-over, ainda assim a separação (S) entre os efeitos de tratamentos e “carry-over” ainda não é perfeita. Entretanto, o valor de S pode ser estimado, como apresentado por Ratkowski et al., 1993: ________________________________________________________________________ 3 ___________________________________________________________________________ n Ed Er V S=100 (1 – V) 2 0 0 0,707 29,3% 3 80,0 44,4 0,408 59,2 4 90,0 62,5 0,289 71,1 5 94,7 72,0 0,224 77,6 6 96,6 77,8 0,183 81,7 7 97,6 81,6 0,154 84,6 8 98,2 84,4 0,134 86,6 9 98,6 86,4 0,118 88,2 10 98,9 88,0 0,105 89,5 11 99,1 89,3 0,095 90,5 12 99,2 90,3 0,087 91,3 onde: Ed = n2-n-2 . (100) - eficiência dos efeitos de tratamento diretos n2-n-1 Er= (n2-n-2) . (100) - eficiência dos efeitos de tratamento residuais (“carry-over”) n2 e V é calculado a partir da tabela de contingência de tratamento x “carry-over”. Para tornar a separação entre efeitos de tratamento e de carry-over igual a 100%, deve-se utilizar um período extra de tratamento, pela repetição do último período. Exemplo para n=4: Seqüência Período 1 2 3 4 5 1 A B C D D 2 B D A C C 3 C A D B B 4 D C B A A ________________________________________________________________________ 4 ___________________________________________________________________________ Exemplo para n=5: Período 1 2 3 4 5 6 1 A B D E C C 2 B C E A D D 3 C D A B E E 4 D E B C A A 5 E A C D B B Seqüência Seqüência Período 1 2 3 4 5 6 1 A C B E D D 2 B D C A E E 3 C E D B A A 4 D A E C B B 5 E B A D C C Modelo matemático Considerando um experimento que utiliza 3 tratamentos, A, B e C, aplicados a 6 indivíduos utilizando um par de quadrados latinos balanceados, como descrito em “efeito ‘carry-over’”, um modelo matemático para a variável resposta poderia ser escrito assim: Yisk = µ + γs + pk + ti + δkαr + εisk onde: yisk: é a variável resposta obtida no período k, k=1, 2 ou 3, para a seqüência s, s=1, 2 ou 3 no quadrado latino 1 e s=4, 5 ou 6 no quadrado latino 2, que recebeu o tratamento i, i=A, B ou C no período k e apresentando efeito carry-over do tratamento r, r=A, B ou C, no período k-1; µ: efeito da média geral; γs: efeito devido à seqüência s, s=1, 2, ..., 6; pk: efeito do período k, k=1, 2 ou 3, e está dentro dos quadrados 1 e 2; ti: efeito direto do tratamento i, i=A, B ou C; αr: efeito “carry-over” de primeira ordem devido ao tratamento r, r=A, B ou C aplicado no período anterior; δk: indicador variável, cujo valor é zero no primeiro período e 1 nos demais εisk: é o erro experimental ~N(0, σ e2 ) ________________________________________________________________________ 5 ___________________________________________________________________________ Exemplos de delineamento cross-over Exemplo 1: Doze voluntários participam de um estudo in situ para avaliar o efeito de 3 diferentes agentes clareadores (A, B e C) sobre o esmalte humano. Cada voluntário recebe um dispositivo intrabucal contendo 4 espécimes de esmalte humano previamente esterilizado, para ser utilizado continuamente, sendo o agente clareador aplicado durante a noite, antes do voluntário se deitar, durante 7 dias. Ao final da fase experimental, os 4 espécimes de esmalte são coletados para avaliar a alteração em sua microdureza causada pelo agente clareador. Um período de “wash-out” de 7 dias é aguardado entre as fases experimentais, para que então o voluntário receba o próximo tratamento distribuído a ele. Planejamento do experimento: Voluntários 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 o A B C A A B B C B C A C o 2 período B A A C C C A B C A B B 3o período C C B B B A C A A B C A 1 período As seqüências de tratamentos (ABC, BCA, CAB, ACB, BAC, CBA) estão englobadas em 2 quadrados latinos, como descrito anteriormente, sendo que cada tratamento segue cada um dos demais 2 vezes. Nesse delineamento, existem 2 voluntários para cada seqüência, e isso deve ser colocado no modelo. O efeito do voluntário dentro da seqüência deve ser usado como resíduo para testar o efeito de seqüência. O modelo matemático para a variável resposta, microdureza, pode ser descrito assim: yijks = µ + γs + ξs(j) + pk + ti + δkαr + εijk onde: yijks: é a média de microdureza dos 4 espécimes de esmalte do i-ésimo agente clareador, no j-ésimo indivíduo, no k-ésimo período, na s-ésima seqüência µ: é a média geral γs: é o efeito da s-ésima seqüência ________________________________________________________________________ 6 ___________________________________________________________________________ ξs(j): é um efeito aleatório devido ao voluntário j, j=1, 2 (2 sendo o número total de voluntários na seqüência s) pk: é o efeito do período k ti: é o efeito do tratamento i αr: é o efeito carry-over devido ao tratamento r ter sido aplicado no período anterior, δk é um indicador variável, cujo valor é zero no primeiro período e 1 no segundo período εijk: é o erro experimental ~N(0, σ e2 ) No SAS o experimento seria testado assim: data CLAREADOR; input Y SEQ VOLUNT PERIODO TRAT $ CARRY $ @@; if CARRY='0' then CARRY='C'; cards; 300 1 1 1 A 0 303 1 11 1 A 0 280 1 1 2 B 305 1 1 3 C B 310 1 11 3 C B 302 2 6 1 B 320 2 6 2 C B 325 2 9 2 C B 290 2 6 3 A 322 3 3 1 C 0 317 3 10 1 C 0 310 3 3 2 A 290 3 3 3 B A 302 3 10 3 B A 292 4 4 1 A 320 4 4 2 C A 330 4 5 2 C A 298 4 4 3 B 333 5 8 1 C 0 325 5 12 1 C 0 310 5 8 2 B 300 5 8 3 A B 280 5 12 3 A B 300 6 2 1 B 289 6 2 2 A B 303 6 7 2 A B 322 6 2 3 C run; proc glm; class SEQ VOLUNT PERIODO TRAT CARRY; model Y=SEQ VOLUNT(SEQ) PERIODO TRAT CARRY/ss1 random VOLUNT(SEQ); lsmeans TRAT CARRY/adj=tukey pdiff; run; A 0 C C 0 C C 0 A 290 305 301 290 295 304 280 310 327 1 2 2 3 4 4 5 6 6 11 2 B 0 9 1 B 0 9 3 A C 10 2 A C 5 1 A 0 5 3 B C 12 2 B C 7 1 B 0 7 3 C A ss2; Resultados: Class Level Information Class SEQ VOLUNT Levels 6 12 Values 1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 PERIODO 3 1 2 3 TRAT 3 A B C CARRY 3 A B C Number of observations 36 ________________________________________________________________________ 7 ___________________________________________________________________________ The GLM Procedure Dependent Variable: Y Source DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F Model 17 6495.452186 382.085423 7.34 <.0001 Error 18 936.547814 52.030434 Corrected Total 35 7432.000000 R-Square Coeff Var Root MSE Y Mean 0.873984 2.364988 7.213212 305.0000 Source SEQ VOLUNT(SEQ) PERIODO TRAT CARRY Source SEQ VOLUNT(SEQ) PERIODO TRAT CARRY DF Type I SS Mean Square F Value Pr > F 5 6 2 2 2 410.000000 903.333333 255.500000 4815.500000 111.118852 82.000000 150.555556 127.750000 2407.750000 55.559426 1.58 2.89 2.46 46.28 1.07 0.2171 0.0373 0.1141 <.0001 0.3646 DF Type II SS Mean Square F Value Pr > F 5 6 2 2 2 404.538155 894.754109 54.068524 4027.140760 111.118852 80.907631 149.125685 27.034262 2013.570380 55.559426 1.56 2.87 0.52 38.70 1.07 0.2230 0.0386 0.6034 <.0001 0.3646 Least Squares Means Adjustment for Multiple Comparisons: Tukey-Kramer Y LSMEAN LSMEAN Number 295.763661 295.519809 321.333333 1 2 3 TRAT A B C Least Squares Means for effect TRAT Pr > |t| for H0: LSMean(i)=LSMean(j) Dependent Variable: Y i/j 1 2 3 1 0.9969 <.0001 2 3 0.9969 <.0001 <.0001 <.0001 ________________________________________________________________________ 8 ___________________________________________________________________________ Y LSMEAN LSMEAN Number 305.549863 300.558060 306.508880 1 2 3 CARRY A B C Least Squares Means for effect CARRY Pr > |t| for H0: LSMean(i)=LSMean(j) Dependent Variable: Y i/j 1 2 3 1 0.5343 0.9756 2 3 0.5343 0.9756 0.3710 0.3710 Para analisar os resultados, deve-se lançar mão da soma de quadrados tipo II, ou soma de quadrados ajustada, porque esta utiliza o efeito de tratamento para testar tratamento, enquanto que a soma de quadrados tipo I utiliza efeito de tratamento e “carryover” para testar tratamento. Conclui-se que o delineamento foi adequado, pois não houve efeito “carry-over” (p=0,3646). Além disso, houve diferença entre os tratamentos com agentes clareadores, que pode ser descrito da seguinte forma, com p<0.01: Clareador A a Clareador B a Clareador C b ________________________________________________________________________ 9 ___________________________________________________________________________ Exemplo 2: Um estudo in situ, com 6 voluntários, utilizando o delineamento cross-over, avaliou a concentração de flúor no esmalte dental após tratamento com água (tratamento A) ou sacarose (tratamento B). Os tratamentos foram realizados durante um período de 14 dias; a dosagem de flúor no esmalte foi associada à profundidade de esmalte removida, utilizada como covariável. Os voluntários 1, 3 e 4 foram sorteados para iniciar o experimento utilizando o tratamento A, e os demais voluntários para iniciar o experimento utilizando o tratamento B. 1o período o 2 período 1 2 3 4 5 6 A B A A B B B A B B A A O modelo matemático para a variável resposta, flúor na placa dental, pode ser descrito assim: yijks = µ + γs + ξs(j) + pk + ti + βXij + δkαr + εijk onde: yijks: é a média de microdureza dos 4 espécimes de esmalte do i-ésimo agente clareador, no j-ésimo indivíduo, no k-ésimo período, na s-ésima seqüência µ: é a média geral γs: é o efeito da s-ésima seqüência ξs(j): é um efeito aleatório devido ao voluntário j, j=1, 2 ou 3 (3 sendo o número total de voluntários na seqüência s) pk: é o efeito do período k ti: é o efeito do tratamento i β: é o coeficiente de regressão linear indicando a dependência de yij em xij. Assume-se que a verdadeira relação entre yij e xij é linear, e que os coeficientes de regressão para cada tratamento são idênticos, que os efeitos de tratamentos somam zero e que a co-variável xij não é afetada pelo tratamento αr: é o efeito carry-over devido ao tratamento r ter sido aplicado no período anterior, δk é um indicador variável, cujo valor é zero no primeiro período e 1 no segundo período εijk: é o erro experimental ~N(0, σ e2 ) ________________________________________________________________________ 10 ___________________________________________________________________________ No SAS o experimento seria testado assim: data FESMALTE; input Y SEQ VOLUNT PERIODO TRAT $ PROF CARRY $ @@; if CARRY='0' then CARRY='B'; cards; 300 1 1 1 A 10 0 330 1 1 2 B 9.8 A 280 2 2 1 290 2 2 2 A 12.0 0 305 1 3 1 A 9.7 0 320 1 3 2 310 1 4 1 A 12 0 330 1 4 2 B 14 A 280 2 5 1 290 2 5 2 A 10.1 B 312 2 6 1 B 10 0 300 2 6 2 run; proc glm; class SEQ VOLUNT PERIODO TRAT CARRY; model Y=SEQ VOLUNT(SEQ) PERIODO TRAT PROF CARRY/ss1 random VOLUNT(SEQ); lsmeans TRAT CARRY/adj=tukey pdiff; run; B B B A 9.7 A 8.8 A 7 0 12 B ss2; Resultados: Class Level Information Class Levels Values SEQ 2 1 2 VOLUNT 6 1 2 3 4 5 6 PERIODO 2 1 2 TRAT 2 A B CARRY 2 A B Number of observations 12 The GLM Procedure Dependent Variable: Y DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F Model 9 3122.132032 346.903559 4.26 0.2044 Error 2 162.784635 81.392318 11 3284.916667 Source Corrected Total R-Square Coeff Var Root MSE Y Mean 0.950445 2.968501 9.021769 303.9167 ________________________________________________________________________ 11 ___________________________________________________________________________ Source DF Type I SS Mean Square F Value Pr > F 1 4 1 1 1 1 1704.083333 646.333333 444.083333 270.750000 12.143282 44.738749 1704.083333 161.583333 444.083333 270.750000 12.143282 44.738749 20.94 1.99 5.46 3.33 0.15 0.55 0.0446 0.3619 0.1446 0.2097 0.7365 0.5357 DF Type II SS Mean Square F Value Pr > F 1 4 1 1 1 1 1625.849636 246.523362 119.429833 176.110514 16.548698 44.738749 1625.849636 61.630840 119.429833 176.110514 16.548698 44.738749 19.98 0.76 1.47 2.16 0.20 0.55 0.0466 0.6372 0.3495 0.2791 0.6962 0.5357 SEQ VOLUNT(SEQ) PERIODO TRAT PROF CARRY Source SEQ VOLUNT(SEQ) PERIODO TRAT PROF CARRY Least Squares Means Adjustment for Multiple Comparisons: Tukey-Kramer TRAT A B Y LSMEAN 291.982321 311.973803 H0:LSMean1= LSMean2 Pr > |t| 0.2791 Least Squares Means Adjustment for Multiple Comparisons: Tukey-Kramer CARRY A B Y LSMEAN 296.162247 307.793877 H0:LSMean1= LSMean2 Pr > |t| 0.5357 Pela análise dos resultados, observa-se que não houve efeito de tratamento, ou seja, a concentração de flúor no esmalte não diferiu após os tratamentos in situ com água ou sacarose. O modelo utilizado também não apresentou efeitos de “carry-over”. A covariável profundidade não interferiu significantemente no modelo, podendo ser removida. Isso aumenta em uma unidade o grau de liberdade do resíduo, mas ainda mantém a semelhança entre os tratamentos: ________________________________________________________________________ 12 ___________________________________________________________________________ The GLM Procedure Dependent Variable: Y DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F Model 8 3105.583333 388.197917 6.49 0.0758 Error 3 179.333333 59.777778 11 3284.916667 Source Corrected Total R-Square Coeff Var Root MSE Y Mean 0.945407 2.543990 7.731609 303.9167 Source DF Type I SS Mean Square F Value Pr > F 1 4 1 1 1 1704.083333 646.333333 444.083333 270.750000 40.333333 1704.083333 161.583333 444.083333 270.750000 40.333333 28.51 2.70 7.43 4.53 0.67 0.0128 0.2201 0.0722 0.1232 0.4716 DF Type II SS Mean Square F Value Pr > F 1 4 1 1 1 1701.388889 516.000000 376.041667 170.016667 40.333333 1701.388889 129.000000 376.041667 170.016667 40.333333 28.46 2.16 6.29 2.84 0.67 0.0129 0.2768 0.0871 0.1903 0.4716 SEQ VOLUNT(SEQ) PERIODO TRAT CARRY Source SEQ VOLUNT(SEQ) PERIODO TRAT CARRY Least Squares Means Adjustment for Multiple Comparisons: Tukey-Kramer TRAT A B Y LSMEAN 293.666667 310.500000 H0:LSMean1= LSMean2 Pr > |t| 0.1903 Least Squares Means Adjustment for Multiple Comparisons: Tukey-Kramer CARRY A B Y LSMEAN 296.583333 307.583333 H0:LSMean1= LSMean2 Pr > |t| 0.4716 ________________________________________________________________________ 13 ___________________________________________________________________________ Exemplo 3: Ratkowski et al., 1993, apresentam dados de Bliss, 1967, utilizando um delineamento não balanceado para estimação de efeitos “carry-over”. Os dados formam 3 quadrados latinos 4 x 4. Os tratamentos consistiram de 4 dosagens de amina dadas a 12 coelhos (A=12,5 mg, B=50 mg, C=200 mg e D=800 mg). As dosagens foram dadas aos 4 animais em cada quadrado latino em 4 dias diferentes, os dias sendo os mesmos nos 3 quadrados, com os 4 animais sendo diferentes a cada quadrado. A variável resposta foi aumento no diâmetro da pupila (mm). O layout dos quadrados e as respostas (subscrito) foram como se segue, os coelhos constituindo as linhas: Quadrado 1 2 3 Período Período Período 1 2 3 4 1 2 3 4 1 D7 C5 B2 2 C4 D6 3 B3 4 A1 1 2 3 4 A1 C4 D5 A1 B2 B3 A0 D5 C3 A1 B3 D6 C4 B2 A0 A0 D4 C3 A0 A1 C6 D7 A1 B3 C4 D5 D7 C3 B2 A0 B3 D6 C3 B2 A2 D7 C4 C4 B2 A0 D6 O tratamento A segue o tratamento B 7 vezes e nunca segue o tratamento C; o tratamento C segue o D 7 vezes; o tratamento B segue o C 5 vezes, etc. Utilizando o cálculo de quiquadrado para a tabela de contingência tratamento x “carry-over”, encontra-se S=45,3%. Se o delineamento fosse planejado adequadamente, os 3 quadrados latinos com n=4 poderiam chegar a uma eficiência de separação de efeito de tratamento e “carry-over” de 71,1%. O modelo matemático para a variável resposta, aumento no diâmetro da pupila, pode ser descrito assim: yijks = µ + γs + ξs(j) + pk + ti + δkαr + εijk ________________________________________________________________________ 14 ___________________________________________________________________________ onde: yijks: é o aumento no diâmetro da pupila do i-ésimo tratamento, no j-ésimo coelho, no k-ésimo período, no s-ésimo quadrado µ: é a média geral γs: é o efeito do s-ésimo quadrado ξs(j): é um efeito aleatório devido aos coelhos dentro de quadrados pk: é o efeito do período k ti: é o efeito do tratamento i αr: é o efeito carry-over devido ao tratamento r ter sido aplicado no período anterior, δk é um indicador variável, cujo valor é zero no primeiro período e 1 no segundo período εijk: é o erro experimental ~N(0, σ e2 ) A análise estatística do estudo no SAS ficaria: data AMINA; input Y QUAD COELHO PERIODO TRAT $ CARRY $ @@; if CARRY='0' then CARRY='D'; cards; 7 1 1 1 D 0 5 1 1 2 C D 2 1 1 3 B C 1 1 1 4 1 2 1 C 0 6 1 2 2 D C 1 1 2 3 A D 3 1 2 3 1 3 1 B 0 1 1 3 2 A B 6 1 3 3 C A 7 1 3 1 1 4 1 A 0 3 1 4 2 B A 6 1 4 3 D B 3 1 4 4 2 5 1 C 0 5 2 5 2 D C 1 2 5 3 A D 2 2 5 6 2 6 1 D 0 4 2 6 2 C D 2 2 6 3 B C 0 2 6 1 2 7 1 B 0 3 2 7 2 B A 4 2 7 3 C B 5 2 7 2 2 8 1 B 0 2 2 8 2 A B 7 2 8 3 D A 4 2 8 3 3 9 1 B 0 0 3 9 2 A B 5 3 9 3 D A 3 3 9 0 3 10 1 A 0 4 3 10 2 D A 3 3 10 3 C D 2 3 10 7 3 11 1 D 0 3 3 11 2 C D 2 3 11 3 B C 0 3 11 4 3 12 1 C 0 2 3 12 2 B C 0 3 12 3 A B 6 3 12 run; proc glm; class QUAD COELHO PERIODO TRAT CARRY; model Y=QUAD COELHO(QUAD) PERIODO TRAT CARRY/ss1 ss2; random COELHO(QUAD); lsmeans TRAT CARRY/adj=tukey pdiff; means PERIODO; run; 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 A B D C B A D C C B A D B A C D A B C D D C B A ________________________________________________________________________ 15 ___________________________________________________________________________ Os resultados são: Class Level Information Class Levels QUAD Values 3 COELHO 1 2 3 12 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 PERIODO 4 1 2 3 4 TRAT 4 A B C D CARRY 4 A B C D Number of observations 48 The GLM Procedure Dependent Variable: Y Source DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F Model 20 192.5058832 9.6252942 18.60 <.0001 Error 27 13.9732835 0.5175290 Corrected Total 47 206.4791667 Source QUAD COELHO(QUAD) PERIODO TRAT CARRY Source QUAD COELHO(QUAD) PERIODO TRAT CARRY R-Square Coeff Var Root MSE Y Mean 0.932326 22.27804 0.719395 3.229167 DF Type I SS Mean Square F Value Pr > F 2 9 3 3 3 7.0416667 5.1875000 1.5625000 177.1776961 1.5365204 3.5208333 0.5763889 0.5208333 59.0592320 0.5121735 6.80 1.11 1.01 114.12 0.99 0.0040 0.3867 0.4051 <.0001 0.4125 DF Type II SS Mean Square F Value Pr > F 2 9 3 3 3 7.0733959 5.8190692 0.9521513 133.7539893 1.5365204 3.5366980 0.6465632 0.3173838 44.5846631 0.5121735 6.83 1.25 0.61 86.15 0.99 0.0040 0.3081 0.6123 <.0001 0.4125 ________________________________________________________________________ 16 ___________________________________________________________________________ Least Squares Means Adjustment for Multiple Comparisons: Tukey-Kramer TRAT A B C D Y LSMEAN LSMEAN Number 0.80924363 2.26216322 4.03980685 5.85742206 1 2 3 4 Least Squares Means for effect TRAT Pr > |t| for H0: LSMean(i)=LSMean(j) Dependent Variable: Y i/j 1 1 2 3 4 0.0216 <.0001 <.0001 2 3 4 0.0216 <.0001 0.0011 <.0001 <.0001 0.0007 0.0011 <.0001 0.0007 Least Squares Means Adjustment for Multiple Comparisons: Tukey-Kramer CARRY A B C D Y LSMEAN LSMEAN Number 3.67423045 3.06286241 3.16242968 3.06911322 1 2 3 4 Least Squares Means for effect CARRY Pr > |t| for H0: LSMean(i)=LSMean(j) Dependent Variable: Y i/j 1 1 2 3 4 0.6333 0.4919 0.6109 Level of PERIODO 1 2 3 4 2 3 4 0.6333 0.4919 0.9976 0.6109 1.0000 0.9979 0.9976 1.0000 N 12 12 12 12 0.9979 --------------Y-------------Mean Std Dev 3.50000000 3.16666667 3.25000000 3.00000000 2.31595258 1.74945879 2.30118547 2.21564684 ________________________________________________________________________ 17 ___________________________________________________________________________ O valor de p associado ao efeito “carry-over”, 0,4125, indica que não há efeito residual entre os pares de tratamentos. Apesar da soma de quadrados tipo II ser a adequada para testar se existem efeitos significantes de tratamento, é possível que a soma de quadrados de tratamento ajustada seja subestimada quando o delineamento não separa adequadamente os efeitos de tratamento e “carry-over”. Esse não é o caso desse exemplo, pois o valor de 133,7540 é menor do que o apresentado para a soma de quadrados tipo I, e ainda assim altamente significante (p<0,00001). Então, pode-se concluir que existem diferenças significantes entre os tratamentos. A diferença entre os grupos pode ser descrita assim: A=12,5 mg amina a B=50,0 mg amina b C=200 mg amina c D=800 mg amina d ________________________________________________________________________ 18 ___________________________________________________________________________ Conclusão O estudo dos delineamentos cross-over é um capítulo à parte dentro da Estatística. Este trabalho mostrou as idéias principais contidas no delineamento, como a estimação do efeito “carry-over” e a utilização de layouts adequados para melhor separar o efeito de tratamento e o residual, além de apresentar alguns exemplos práticos. Modelos utilizando outros delineamentos em associação ao cross-over, como parcelas subdivididas ou fatorial, trazem grande limitação ao estudo dos efeitos presentes no delineamento original, e apresentam soluções específicas e complexas, além do objetivo deste trabalho. Apesar disso, os delineamentos cross-over aparecem como uma ferramenta muito interessante para estudos que envolvem seres humanos e animais, permitindo a eliminação de grande parte da variabilidade devido aos indivíduos. ________________________________________________________________________ 19 ___________________________________________________________________________ Bibliografia Campbell MJ, Machin D. Medical statistics: a commonsense approach. 3.ed. Chichester, John Wiley & Sons, 1999. Cochran WG, Cox GM. Experimental designs. 2.ed. New York, John Wiley & Sons, c1957. Jones B, Kenward MG. Design and analysis of cross-over trials. New York, Chapman and Hall, 1989. Kushner HW, De Maio G. Understanding basic statistics. San Francisco, Holden-Day Inc., 1980. Montgomery, D. Design and analysis of experiments. 3.ed. John Wiley & Sons, 1991. Ratkowski DA, Evans MA, Alldredge JR. Cross-over experiments: design, analysis, and application. New York, Marcel Dekker Inc., 1993. ________________________________________________________________________ 20