JOSÉ LUIS DA CONCEIÇÃO SILVA
DETECÇÃO E SEQUENCIAMENTO PARCIAL DE
POLIPEPTÍDEO ANTIMICROBIANO RICO EM GLICINA
DE Diatraea saccharalis (Lepidoptera: Crambidae)
Tese apresentada ao Curso de PósGraduação em Ciências Biológicas (área de
concentração-Biologia Celular e Molecular),
da Universidade Estadual de Maringá para a
obtenção do grau de Doutor em Ciências
Biológicas.
Maringá
JANEIRO/2009
JOSÉ LUIS DA CONCEIÇÃO SILVA
DETECÇÃO E SEQUENCIAMENTO PARCIAL DE
POLIPEPTÍDEO ANTIMICROBIANO RICO EM GLICINA
DE Diatraea saccharalis (Lepidoptera: Crambidae)
Orientador: Profa. Drª. Maria Aparecida Fernandez
Dados Internacionais de Catalogação-na-Publicação (CIP)
(Biblioteca Central - UEM, Maringá – PR., Brasil)
S586d
Silva, José Luís da Conceição
Detecção e sequenciamento parcial de polipeptídeo
antimicrobiano rico em glicina de Diatraea saccharalis
(Lepidoptera: Crambidae) / José Luis da Conceição
Silva. -- Maringá : [s.n.], 2009.
58 f. : figs., tabs.
Apresentado em inglês.
Resumo: inglês e português.
Orientadora : Profª. Drª. Maria Aparecida
Fernandez.
Tese (doutorado) - Universidade Estadual de
Maringá, Programa de Pós-Graduação em Ciências
Biológicas, área de concentração Biologia Celular e
Molecular, 2009.
1. Diatraea saccharalis. 2. polipeptídeo
antimicrobiano. 3. Gloverina. 4. Lepidoptera. 5.
Bioquímica de insetos. I. Universidade Estadual de
Maringá. Programa de Pós-Graduação em Ciências
Biológicas. II. Fernandez, Maria Aparecida, orient.
III. Título.
CDD 22.ed. 572.65
BIOGRAFIA
José Luis da Conceição Silva, filho de João Pereira da Silva e Maria
da Conceição Silva, nasceu em 07 de Outubro de 1968, na cidade de
Maringá, Estado do Paraná. Concluiu graduação em Ciências Biológicas pela
Universidade Estadual de Maringá no ano de 1994, com habilitação em
licenciatura. Possui titulação de mestre em Ciências Biológicas (área de
Biologia Celular), concluída em 1998, na Universidade Estadual de Maringá.
Atualmente é professor assistente, da Universidade Estadual do Oeste do
Paraná, lotado no Centro de Ciências Médicas e Farmacêuticas-CCMF, área
de Bioquímica. Em maio de 2005 iniciou o Curso de Doutorado em Ciências
Biológicas (área de concentração Biologia Celular e Molecular) pela
Universidade Estadual de Maringá, na qual finaliza o curso com a defesa da
tese no dia 06 de Março de 2009.
Aos meus pais e familiares por me apoiarem nos momentos difíceis
Aos meus grandes amores, Cleuza, Julia e Gabriel por compartilharem
suas vidas carinhosamente comigo.
Agradecimentos
À professora Drª. Maria Aparecida Fernandez, pelo exemplo de luta,
persistência e amor à pesquisa, sua amizade, dedicação e apoio.
À Universidade Estadual de Maringá (UEM), pela oportunidade concedida para
o aperfeiçoamento científico.
Aos docentes do curso de pós-graduação em Ciências Biológicas, área de
concentração Biologia Celular e Molecular da Universidade Estadual de Maringá.
Aos colegas do laboratório de Organização Funcional do Núcleo, pela amizade e
troca de experiência técnico-científico.
Agradeço especialmente aos amigos Juliana Pereira Brava, Joice Felipes
Barbosa, Karen Izume Takeda, Fabricia Gimenes, Lídia Dourado, Simoni Aparecida
dos Santos, Roxelle Ethienne Ferreira Munhoz, Jerônimo Tavares e Celina Heidemann
pela ajuda durante a realização deste trabalho e pelo incentivo nos momentos difíceis.
Aos colegas Marli e Valmir pelo apóio técnico, dedicação e companheirismo.
Aos meus pais, que lutaram muito no passado para que todos os filhos tivessem
a mesma oportunidade de estudo. Espero ainda poder retribuir um pouco do que eles
me deram durante toda a minha vida.
Ao CNPq, que proporcionou apoio financeiro aos projetos da Profª Drª Maria
Aparecida Fernandez e indiretamente a todos os projetos do Laboratório de
Organização Funcional do Núcleo-LORF.
E a todos aqueles que direta ou indiretamente contribuíram para a realização
deste trabalho, agradeço especialmente.
Apresentação
Em consonância com a resolução N.º 07/2007-CPBC do Programa de Pós-Graduação
em Ciências Biológicas – Área de Concentração Biologia Celular e Molecular da
Universidade Estadual de Maringá, esta tese de doutorado é composta por dois artigos
científicos completos, redigidos de acordo com as normas exigidas pela revista
científica em que serão submetidos, assim sendo:
da Conceição Silva, J. L., Barbosa, J. F., Bravo, J. P., de Souza, E. M., Huergo, L.
M., de Oliveira, P. F., Esteves, E., Daffre, S. and Fernandez, M. A.
Identification of Gloverin-like polypeptide in the Sugarcane Borer Diatraea saccharalis
challenged by Septic Injury. Será submetido no formato de Comunicação na
Biosciences, Biotechnology and Biochemistry
da Conceição Silva, J. L., Barbosa, J. F., Bravo, J. P. and Fernandez, M. A.
Antimicrobial polypeptides in Lepidoptera.
Será submetido no formato de Mini-Revisão na Biochemistry and Molecular Biology
Reports
RESUMO GERAL
No início de 1980, surgiu uma nova área de investigação relativa à imunidade
inata e atualmente alguns insetos tornaram-se modelos biológicos para esses estudos. A
imunidade inata em insetos pode ser subdividida em imunidade humoral e celular,
sendo a resposta celular mediada por células livres na hemolinfa denominadas
hemócitos e a resposta humoral efetivada por peptídeos antimicrobianos (AMPs)
produzidos pelo corpo gorduroso (órgão equivalente ao fígado de mamíferos) da larva e
liberados na hemolinfa. Apesar dos avanços significativos nesta área, pouco é
conhecido dentro da ordem Lepidoptera, na qual estão muitas espécies que causam
prejuízos para o setor agro-industrial.
O Brasil possui uma área de 6,6 milhões de hectares de cana-de-açúcar, sendo o
maior produtor mundial, seguido pela Índia e Austrália. A broca da cana-de-açúcar,
Diatraea saccharalis (Fabricius, 1794), é originária das Antilhas, América Central e do
Sul, mas se espalhou para as regiões onde é cultivada a cana-de-açúcar e estabeleceu-se
como uma praga, causando prejuízos consideráveis às indústrias sucro-alcooleiras. O
controle biológico é realizado pela liberação massiva de Cotesia flavipes (Hymenoptera;
Braconidae) no campo. Em D. saccharalis, apenas alguns aspectos da imunidade celular
são conhecidos, contudo, dados sobre sua resposta imune humoral são inexistentes. A
resposta imune humoral em Lepidoptera é caracterizada pela produção de AMPs e sua
rápida liberação na hemolinfa para combater os microorganismos invasores. Entre esses
AMPs, alguns podem ser produzidos constitutivamente, mas as principais classes são
induzidas por injúria séptica ou asséptica.
O principal objetivo deste trabalho foi caracterizar a resposta imune humoral da
larva de D. saccharalis causada por injúria séptica, com o intuito de contribuir para o
conhecimento da imunidade humoral em D. saccharalis. A expressão de AMPs foi
induzida em larvas de 5º ínstar pela injuria com uma agulha contaminada com uma
mistura de bactérias (Gram-positivas e Gram-negativas). Os polipeptídeos presentes
após 14 horas da indução foram analisados pelos métodos eletroforéticos: 1-DE
(eletroforese em gel unidimensional) e 2-DE (eletroforese em gel bidimensional). Um
polipeptídeo de 14 kDa foi detectado em amostras de hemolinfa de larvas submetidas à
injúria séptica com eletroforese 1-DE, e duas frações, com massa molecular de 14 kDa
(HDs1 e HDs2) foram separados em 2-DE. Aplicando a metodologia de MALDITOF/TOF (matriz-assisted laser desorption / ionization-time of flight mass
spectrometry), na fração do polipeptídeo HDs1 digerido com tripsina, foi possível
detectar a seqüência de um peptídeo de 15 resíduos de aminoácidos. A busca por
proteínas homólogas mostrou identidade de 80% com uma classe de polipeptídeos
antimicrobianos denominados gloverinas, as quais, até o momento, são consideradas
exclusivas de Lepidoptera. As gloverinas são polipeptídeos ricos em glicina e
apresentam atividade antimicrobiana somente contra bactérias Gram-negativas. Nossos
dados foram corroborados por ensaios de atividade antimicrobiana, onde frações
parcialmente purificadas da hemolinfa de larvas induzidas mostraram atividade
antimicrobiana contra Escherichia coli (Gram-negativa), não sendo detectada atividade
contra bactérias Gram-positivas e Candida albicans. A análise dos resultados
antimicrobianos, em conjunto com a seqüência de aminoácidos, sugere que o HDs1 é
um polipeptídeo homólogo às gloverinas encontradas em lepidópteros.
Adicionalmente, o presente trabalho apresenta uma revisão sobre polipeptídeos
antimicrobianos, com especial atenção aos ricos em glicina em Lepidoptera. Esta
família é muito heterogênea, mostrando subdivisões de acordo com a composição dos
polipeptídeos. Existem três subdivisões: proteínas semelhantes à atacina, proteínas ricas
em prolina/glicina e proteínas ricas em histidina/glicina. As gloverinas são
polipeptídeos ricos em glicina exclusivos de Lepidoptera, e esta revisão descreve uma
proteína de D. saccharalis semelhante à gloverinas e pertencente ao subgrupo das
proteínas semelhantes à atacina. Nossos resultados contribuem para o conhecimento da
resposta imune inata em D. saccharalis, e, além disso, podem gerar novas alternativas
no controle da broca da cana-de-açúcar.
GENERAL ABSTRACT
In the early 1980s, a new area of research concerning the innate immune
response in insects appeared, and nowadays some insects are currently biological
models for innate immunity studies. The innate immunity in insects can be subdivide in
cellular and humoral immunity, in which the cellular response is mediated by the free
cells in the haemolymph called hemocytes and the humoral response effect of
antimicrobial peptides (AMPs) produced by the fat body (equivalent of the mammalian
liver) of the larva and release into the haemolymph. Despite the significant advances in
this area, little is known within the order Lepidoptera, of which many species are
causing damage to the agro-industrial sector.
In Brazil, sugarcane covers an area of 6.6 million hectares; what makes this South
American country the world's largest producer, followed by India and Australia. The
sugarcane borer, Diatraea saccharalis (Fabricius, 1794), hails from the Antilles, Central
and South America, but has spread to regions where sugarcane is processed and has
evolved into a pest, causing considerable damage to the sugar agro-alcohol industries.
Biological control was achieved by the massive release of Cotesia flavipes
(Hymenoptera, Braconidae) into the fields.
In D. saccharalis, only some aspects of cellular immunity are known; however,
nothing is known about its humoral immune response. The humoral immune response in
Lepidoptera is characterized by the production of antimicrobial peptides (AMPs) and its
rapid release into the hemolymph to combat invading microorganisms. Among these
AMPs, some may be produced constitutively, but the main classes are induced by septic
or aseptic injury.
The main goal of this work was to characterize the humoral immune response of
the D. saccharalis 5th instar larva in response to septic injury, in order to contribute to
the knowledge of the humoral immunity in D. saccharalis. In general, AMP expression
was induced with a mixture of bacteria (Gram-positive and Gram-negative). The
hemolymph polypeptides present after 14 hours of challenge were analyzed by
electrophoretic methods, 1-DE (one-dimensional gel electrophoresis) and 2-DE (twodimensional gel electrophoresis). A polypeptide of 14 kDa was detected in challenged
larva hemolymph samples with 1-DE gel electrophoresis, and two fractions, with
molecular mass of 14 kDa (HDs1 and HDs2) were observed in 2-DE. Applying the
methodology of MALDI-TOF/TOF (matrix-assisted laser desorption/ ionization-time of
flight mass spectrometry), the digested sequence of the HDs1 fragment showed a
peptide of 15 amino acid residues; the database search for protein homologues resulted
in an identity of 80% with a class of antimicrobial polypeptides called gloverins. The
gloverins are glycine-rich polypeptides that are, so far, exclusive to Lepidoptera. Our
data was corroborated by antimicrobial activity assays, where the partially purified
fractions from induced larva showed antimicrobial activity against Escherichia coli
(Gram negative), but no activity was detected against Gram-positive bacteria and
Candida albicans. The antimicrobial analysis results, as well as the amino acid
sequence, suggest that the HDs1 polypeptide is a gloverin-like polypeptide from D.
saccharalis.
In addition, this work showed a review of glycine-rich polypeptides in
Lepidoptera. This family is very heterogeneous, showing subdivisions along the
composition of the polypeptides. There are three subdivisions: attacin-like,
proline/glycine-rich,
and
histidine/glycine-rich.
The gloverins
are
unique to
Lepidoptera, and this review describes the D. saccharalis gloverin-like polypeptides as
belonging to the subgroup of attacin-like. Our results contribute to the knowledge of the
innate immune response in D. saccharalis, and furthermore, can generate new
alternatives in the control of the sugarcane borer pest.