AVALIAÇÃO DA TOXICIDADE DE NANOPARTÍCULAS DE
TiO2 EM NÁUPLIOS DE ARTEMIA SALINA NUM
AMBIENTE AQUÁTICO MARINHO
Cláudia Turra1, Marcela Bronberger Soquetta2, Solange Binotto
Fagan3, Marta Palma Alves3, Luiz O. S. Bulhões3, Sergio R. Mortari3,
Solange Hoelzel3
EVALUATION OF TOXICITY OF TiO2 NANOPARTICLES IN ARTEMIA
SALINA NAUPLLII IN AQUATIC MARINE
RESUMO
Este trabalho teve por finalidade avaliar a toxicidade de nanopartículas de TiO2
anatase em náuplios de Artemia salina. Soluções contendo diferentes
concentrações de TiO2 foram feitas e colocadas em contato direto com os
náuplios durante cerca de 48 h. Ficou constatado que a solução salina utilizada
para solubilizar o TiO2 nanométrico fez com que as nanopartículas presentes
formassem dois grupos de diferentes diâmetros: um com predominância de 100
nm e outro em torno de 6 nm. Após a observação do comportamento dos
náuplios, foi verificado que a amostra controle (que não continha TiO2)
apresentou 100% de mortandade após 36 h, além de um aspecto turvo da água
presente no tubo de ensaio, enquanto as amostras de TiO2 não apresentaram
mortandade dos náuplios nem turbidez da água, mesmo após 48h de estudo, não
sendo possível a determinacão da CL50, o que comprova que o material analisado
não apresentou citotoxicidade in vivo nas concentrações utilizadas, o que inspira
a continuidade deste estudo.
Palavras-chave: dióxido de titânio, organismos aquáticos, nanopartículas,
toxicidade
ABSTRACT
This work evaluated the toxicity of TiO2 nanoparticles in Artemia salina nauplii.
We made solutions with different ammounts of TiO2 that became in direct
contactt with the nauplii for 48 h. The saline solution used to solubilize the TiO2
formed two groups of nanoparticles: one with 100 nm of diameter and another
with 6 nm. After 36 h, 100% of the nauplii in pure salt water were dead and the
water was turbid. The samples with TiO2 did not presented dead nauplii and the
water was still clear, even after 48 h. The IC50 was not determined, so the
material did not presented in vivo citotoxicity with the used concentrations, what
inspire the realization of new studies.
Keywords: titanium dioxide, aquatic organisms, nanoparticles, toxicity
________________________________
1Mestre
em Nanociências – UNIFRA, Santa Maria - RS. [email protected]
de Alimentos – UFPEL, Pelotas - RS. [email protected]
3Professor(a) do Curso de Doutorado em Nanociências – UNIFRA, Santa Maria – RS.
[email protected]; [email protected]; [email protected];
[email protected]; [email protected]
2Química
INTRODUÇÃO
O termo nanotecnologia (ou nanociência) vem sendo utilizado desde a
descoberta de que materiais em escala nanométrica podem apresentar
características e comportamento distintos dos mesmos materiais em escala
macroscópica (DURÁN, MATTOSO e MORAIS, 2006). Podemos definir
nanotecnologia como sendo a habilidade de se trabalhar com estruturas
nanométricas, onde 1 nanometro (1 nm) equivale a 10-9 m, sendo 80000 vezes
menor que o diâmetro de um fio de cabelo e 10 vezes maior do que o diâmetro
de um átomo de H (CORBETT et al., 2000). Assim, uma escala em que varie de
1 a 100 nm recebe o nome de nanoescala (ALVES, 2004).
Nos últimos anos, a produção de nanopartículas de TiO2 vem aumentando
em decorrência da sua necessidade em produtos como filtros solares, esmaltes,
vernizes, plásticos, papel, alimentos e suas embalagens, produtos farmacêuticos
e cremes dentais. Este material é capaz de aumentar a brancura de fármacos,
queijo cottage e leite desnatado, por exemplo (TUCCI et al., 2013). Em 2005, a
cada 2000 toneladas de TiO2 produzido, 1300 foram usadas nestes tipos de
produtos. Cinco anos depois, a demanda aumentou para 5000 toneladas e a
tendência é que este número aumente ainda mais nos próximos anos.
Consequentemente, espera-se que a quantidade de pessoas em contato com este
material também aumente, seja através de manipulação de produtos (produção de
TiO2 nanométrico e aplicação nas mais diversificadas áreas industriais) ou pelo
consumo dos mesmos (WEIR et al., 2012).
No caso de efluentes originados da lavagem e eliminação biológica deste
material, há uma preocupação maior com relação à contaminação do solo, lençol
freático e águas superficiais (AUGUSTINHO e FERREIRA, 2004). Esses
resíduos implicam em problemas ligados à contaminação do meio ambiente.
Sendo assim, existe a importância de se avaliar os efeitos que essas
nanopartículas podem provocar em organismos vivos, principalmente os
aquáticos que estão em contato direto com diversas concentrações deste material.
Neste caso, torna-se viável a utilização de náuplios, que por apresentarem grande
sensibilidade frente a pequenas concentrações de substâncias tóxicas, podem ser
inclusive utilizados como indicadores de toxicidade das mesmas.
Atualmente, existe um desencontro no que diz respeito à toxicidade de
nanopartículas de TiO2, uma vez que alguns estudos relatam o potencial efeito
tóxico deste material em organismos vivos enquanto outras pesquisas
comprovam o seu caráter seguro. Entretanto, existe também um ponto de
concordância entre os pesquisadores: novos estudos, principalmente in vivo
precisam ser feitos o quanto antes. Tucci e colaboradores (2013), por exemplo,
relatam que as nanopartículas de TiO2 não afetam a proliferação nem a morte
celular, mas têm um efeito rápido e considerável sobre as mitocôndrias. No seu
estudo, em 268 metabólitos, 85 apresentaram alterações significativas,
principalmente relacionadas ao estresse celular. Além disso, o estudo demonstrou
alterações no metabolismo celular, consideradas significativas e potencialmente
patogênicas, finalizando com a conclusão de que estudos de longo prazo de
exposição in vivo são extremamente necessários.
Uma vez que o TiO2 é comercializado principalmente sob as fases anatase
e rutila, é importante avaliar também qual das duas fases pode apresentar
toxicidade em potencial. Sendo assim, Sayes e colaboradores (2010)
pesquisaram a respeito de toxicidade de nanopartículas entre 3 e 10 nm e
descobriram que a fase anatase é 100 vezes mais tóxica do que uma amostra
equivalente de material em fase rutila. Isto leva a crer que os efeitos citotóxicos
estão relacionados não ao tamanho das nanopartículas, mas sim à fase em que
elas se encontram.
Em vista da quantidade de aplicações possíveis deste material e, com base
nos estudos realizados até o momento, que mostram um potencial considerável
de toxicidade in vivo do TiO2 nanoparticulado, se faz cada vez mais importante o
desenvolvimento de novos estudos que comprovem a sua biocompatibilidade
(FADEEL e GARCIA-BENNETT, 2010).
REFERENCIAL TEÓRICO
DIÓXIDO DE TITÂNIO (TiO2)
O titânio (Ti) é um metal de transição pertencente ao quarto grupo da
tabela periódica, com número atômico 22 e massa molar de 47,90 g/mol. Até
recentemente, isoladamente, era considerado uma curiosidade de laboratório, até
que se descobriu a possibilidade de sua produção comercial através de processos
químicos. É um dos metais mais abundante na crosta terrestre, sendo encontrado
sob a forma de óxidos e de titanatos ferrosos (TiO2 e TiFeO3, respectivamente)
(FUJISHIMA, ZHANG e TRYK, 2008).
Em temperatura ambiente, os dióxidos de titânio apresentam-se
principalmente sob as formas anatase (Figura 1-a), brookita (Figura 1-b) e rutila
(Figura 1-c), sendo a estrutura mais estável a rutila (daí a ser empregada na
utilização de filtro solares e como agente branqueador de certos alimentos) e a
menos estável a brookita. Existem diferenças interiônicas entre os átomos de Ti e
O que formam o dióxido em todas as fases. Apesar das diferenças interiônicas
entre titânio e oxigênio nas fases rutila e anatase, as distâncias entre Ti e O são
levemente maiores na fase rutila (FUJISHIMA, ZHANG e TRYK, 2008; CARP,
HUISMAN, RELLER, 2004).
(a)
(b)
(c)
Figura 1 – Estruturas cristalinas do dióxido de titânio (TiO2) nas fases (a)
anatase; (b) rutila e (c) brookita (Fonte: CARP, HUISMAN, RELLER, 2004).
A fase anatase é mais estável para tamanhos menores do que 11 nm, a
brookita para valores de tamanho entre 11 e 35 nm e a rutila para partículas
maiores do que 35 nm (CARP, HUISMAN, RELLER, 2004).
Atualmente, o TiO2 nanométrico vem sendo estudado devido ao seu poder
antimicrobiano (BROOK et al., 2007), sua propriedade fotocatalítica (BIZARRO
et al., 2009) e para o uso em cosméticos e gêneros alimentícios (TUCCI et al.,
2013), o que faz com que haja uma maior produção e manipulação deste material
por trabalhadores e o público em geral.
TOXICIDADE
Existe uma preocupação acerca da exposição principalmente de pessoas
que produzem e/ou manipulam o TiO2 em pó no que diz respeito à inalação e até
mesmo ingestão deste produto e uma possível ação inflamatória e
desenvolvimento de asma (HUSSAIN et al., 2011). Há estudos que relatam que,
além de oferecer proteção contra os raios solares, o TiO2 nanométrico também
pode ocasionar patologias na pele, como irritação e sensibilização, danos
genotóxicos e até mesmo câncer (TUCCI et al., 2012). Além disso, o uso dessas
nanopartículas em bebidas, alimentos e algumas embalagens de alimentos
também inspira cuidados com relação à sua ingestão e uma hipotética relação
com doença de Crohn e possibilidade de carcinogênese (LOMER, THOMPSON
e POWELL, 2002). Outro problema se encontra na eliminação desses produtos
por parte de quem os consome, uma vez que materiais contendo TiO2
nanométrico são excretados sob a forma de fezes/urina, podendo também ser
lavados de superfícies e fazendo parte do esgoto comum (WEIR et al., 2012).
Há pesquisas comprovando a não toxicidade aguda das nanopartículas
(com diâmetros entre 20 e 80 nm) de TiO2 para uma exposição oral única de 5 g/
kg. Entretanto, a mesma pesquisa mostra alterações de fatores bioquímicos, os
quais comprovam a indução de lesões no fígado e rins dos animais. Além disso,
ficou comprovado como este material se deposita nos rins, baço, fígado e
pulmões, o que ocasionou um dano hepático (degeneração central ao redor da
veia principal e necrose irregular de hepatócitos) e renal (líquidos proteínicos no
túbulo renal e inchaço no glomérulo renal) evidentes (WANG et al., 2007).
Evidências sugerem que exista relação da doença de Crohn com uma
combinação de predisposição genética e fatores ambientais, tais quais o uso de
micro e nanopartículas de TiO2 como agentes bactericidas e branqueadores de
determinados alimentos, que acabam por se acumular nos macrófagos do trato
intestinal, causando inflamações transmurais (em toda a parede intestinal).
Somente como aditivo alimentício, é calculado que pessoas estejam ingerindo
aproximadamente 1012 partículas por dia (LOMER, THOMPSON e POWELL,
2002).
ARTEMIAS SALINAS E CL50
A Artemia salina é um tipo de microcrustáceo de água salgada,
constituinte do plâncton (microanimais e microplantas que ficam suspensos na
água) e que vem sendo utilizada em ensaios de citotoxicidade desde o início da
década de 50 (LHULLIER, HORTA e FALKENBERG, 2006). Os cistos de
Artemia salina são facilmente encontrados no comércio, principalmente em
casas de venda de peixes ornamentais e aquários, têm baixo custo e são capazes
de permanecerem viáveis por anos em estado seco, desde que armazenados em
locais com condições apropriadas (MEYER et al., 1982). Além disso, os
náuplios destes crustáceos são organismos que apresentam uma grande
sensibilidade às substâncias tóxicas em pequenas concentrações, eclodem
rapidamente (em torno de 36 h) e têm um ciclo de vida relativamente curto
(aproximadamente 50 h de vida). Devido a essas características, os náuplios de
Artemia salina são muito utilizados em ensaios de citotoxicidade, bioatividade
(isolamento de compostos bioativos), comportamento, purificação e até mesmo
para compreensão de atividade hepatotóxica e como correlação com algumas
linhagens de células tumorais (FOSTER e TULLIS, 1984; GUNASEKARA et
al., 2011; HISEM et al., 2011).
Segundo Gunasekara e colaboradores (2011), os náuplios de Artemia
salina apresentam um tamanho que varia de 750 a pouco mais de 4000 µm,
dependendo da dieta que estes microanimais recebam. Assim, um náuplio de
aproximadamente 750 µm apresenta um trato digestivo com um diâmetro
aproximado de 60 µm por um comprimento que se estende por toda sua
anatomia (portanto, 740 µm), sendo capaz de deglutir partículas menores, ou
seja, nanométricas.
A metodologia empregada para a eclosão dos cistos de Artemia salina foi
desenvolvida por Meyer e colaboradoress em 1982 e até hoje é empregada como
técnica padrão (com pequenas modificações, dependendo do ambiente em que se
trabalha) tanto em laboratórios, para os ensaios citados anteriormente, quanto por
criadores de peixes ornamentais, que utilizam estes náuplios como alimento vivo
em aquários.
Para a avaliação da citotoxicidade de um determinado material, é
verificado o valor da concentração letal média (CL50), que nada mais é do que a
concentração do material capaz de eliminar 50% dos organismos vivos estudados
em cada amostra.
METODOLOGIA
AMBIENTE AQUÁTICO MARINHO SIMULADO
O ambiente aquático marinho foi simulado utilizando-se 1,5 L de água
comum num aquário, juntamente com 2 colheres de sopa de sal marinho grosso
iodado e uma pedra porosa de aeração, como as utilizadas em aquários maiores,
para a circulação de oxigênio na água. O pH foi ajustado com bicarbonato de
sódio (NaHCO3) para que ficasse em torno de 7,0 a 8,0. A temperatura da sala foi
mantida constante a 28 ºC e a temperatura da água foi mantida com a utilização
de lâmpada amarela bem próxima ao aquário.
ARTEMIAS SALINAS
Primeiramente, uma colher de chá de ovos de Artemia salina foi colocado
em um recipiente contendo 500 mL de água doce comum juntamente com 0,5
mL de água sanitária. Este processo foi necessário para o amolecimento das
cascas dos ovos e também para a desinfecção de uma eventual contaminação por
organismos patogênicos. Sendo assim, os ovos permaneceram nesta mistura em
um Béquer sob aeração durante 5 minutos. Depois, este volume de água foi
filtrado em papel filtro de forma que os ovos fossem lavados diversas vezes a
fim de que qualquer resquício de água sanitária fosse removido.
Após o enxágue dos ovos, estes foram colocados em água doce comum e
deixados em aeração por uma hora para que fossem hidratados. Após uma hora,
os ovos foram novamente filtrados e colocados no aquário que continha o
ambiente marinho simulado para que eclodissem, liberandos os náuplios de
Artemias salina em torno de 24 a 36 h. O aquário foi mantido sob iluminação
artificial desde o momento em que os ovos foram colocados em ambiente
aquático marinho simulado até o descarte dos náuplios de artemias, cerca de 50 h
após a eclosão e permaneceu tampado com tampa de acrílico contendo orifícios
para evitar evaporação e espalhamento de água salgada devido ao fluxo de
bolhas de ar.
Os náuplios foram observados e mensurados, primeiramente com auxílio
de lupa com aumento de 4x, da marca Optech (Alemanha), no laboratório de
Nanotecnologia da UNIFRA. Depois, foi possível fazer observações e medições
com o microscópio da marca Zeiss, modelo Primo Star (Alemanha), no
laboratório de Hematologia, da mesma instituição.
AMOSTRAS DE TiO2
As amostras de nanopartículas de TiO2 na fase anatase foram
previamente sintetizadas no laboratório de Nanotecnologia e de Cerâmicas da
UNIFRA. Posteriormente, foram caracterizadas no Laboratório de Engenharia
de Processos da UFSM, Laboratório de Sólidos e Superfícies da UFRGS e
UFSCar, além do Laboratório de Nanotecnologia da UNIFRA. Por não terem
sido utilizadas em experimentos dentro da instituição, as amostras permaneceram
armazenadas em recipientes e local adequados. Neste estudo foram avaliadas
nanopartículas de TiO2 anatase (Figura 2), com diâmetro médio de 20 nm.
Inicialmente, uma amostra de 0,05 g de TiO2 foi solubilizada em 10 mL
de solução salina, obtendo-se assim a “solução-mãe”, de concentração 50 µg/
mL. Em seguida, foram feitas diluições em balões volumétricos a partir da
solução mãe, utilizando-se 1 mL desta para 10, 100 e 1000 mL de água MiliQ
(1/10, 1/100 e 1/1000, respectivamente). Assim, cada uma das soluções continha
uma concentração de TiO2 igual a 5 µg/mL (1/10), 0,5 µg/mL (1/100) e 0,005
µg/mL (1/1000), que foram chamadas de Solução A, B e C, respectivamente.
Para uma nova análise a respeito do efeito que a solução salina poderia
causar às nanopartículas de TiO2, cada uma das soluções diluídas sofreu uma
nova diluição. Para isso, foi utilizado 20 µL de cada solução para 50 mL de água
MiliQ. As medições foram feitas em cubetas de quartzo do aparelho Zetasizer®
Nano, modelo ZEN 3600 (Malvern Instruments, UK), que recebia 3 mL desta
última solução.
Figura 2 – TiO2 anatase em pó
DELINEAMENTO EXPERIMENTAL
Após a eclosão dos ovos, foi retirada a aeração por 10 minutos para que
as cascas fossem para a superfície da água e os náuplios de Artemia salina
migrassem para o fundo do aquário. Os náuplios foram então retirados com
auxílio de uma pipeta de Pasteur e colocados em número de n = 10 em tubos de
ensaio, separados em 4 grupos: Grupo I - contendo somente 10 mL de água
salgada (controle); Grupo II - contendo 9 mL de água salgada e 1 mL de solução
A (5 µg de TiO2); Grupo III - contendo 9 mL de água salgada e 1 mL de solução
B (0,5 µg de TiO2) e Grupo IV - contendo 9 mL de água salgada e 1 mL de
solução C (0,05 µg de TiO2). Todas as análises foram feitas em triplicata,
totalizando 12 amostras e 120 náuplios utilizados. Todas as amostras
permaneceram sob iluminação natural.
Os tubos de ensaio foram observados durante 48h, sendo verificada a
mortandade dos náuplios de cada amostra. A mortandade dos organismos
aquáticos evidenciaria a citotoxicidade do composto testado.
RESULTADOS E DISCUSSÕES
Primeiramente, foi verificado o efeito da solução salina utilizada para
solubilizar o TiO2. Para isso, utilizamos o aparelho Zetasizer® Nano, modelo
ZEN 3600 (Malvern Instruments, UK). Sabendo-se que o material já havia sido
caracterizado anteriormente e que o diâmetro médio encontrado foi de 19,7 nm,
foi possível comparar os novos tamanhos das populações de nanopartículas
predominantes. Ficou clara a existência de dois grupos com tamanhos de
partículas de aproximadamente 100 nm e 3 nm. Mesmo com uma aglomeração
capaz de aumentar em 5 vezes o tamanho das nanopartículas, ainda assim, os
náuplios poderiam ingerir as mesmas, conforme visto na revisão bibliográfica.
Foi constatado que o ambiente marinho simulado apresentou condições
ótimas para a eclosão dos náuplios: pH = 7,49, Tágua = 28,7 ºC e Tambiente = 30 ºC.
Após 36 h, os ovos eclodiram em náuplios de aproximadamente 750 µm (Figura
3) e foram separados em 12 tubos de ensaio.
Figura 4 - Náuplios de Artemia salina aumentados 4 vezes (a) 10 vezes (b)
40 vezes (c) e 100 vezes (d)
Em aproximadamente 36 h, as amostras do Grupo I (controle) se
apresentaram levemente mais turvas que as amostras dos Grupos II, III e IV,
além de uma sedimentação no fundo dos tubos de ensaio. Em contrapartida, no
mesmo intervalo de tempo, todos os náuplios dos Grupos II, III e IV
permaneceram vivos e a água continuava límpida. Depois de 48 h, foi constatado
que um número médio de n=3 náuplios morreram, ou seja, enontramos um n
inferior à metade da população em cada tubo de ensaio, o que ocorreu muito
provavelmente em decorrência do curto ciclo de vida destes organismos.
Sendo assim, para as soluções contendo TiO2 com concentrações iguais a
5 µg/mL; 0,5 µg/mL e 0,05 µg/mL, não foi possível determinar a CL50, o que
indica a continuação deste estudo para concentrações maiores. Como a água
presente nos Grupos II, III e IV permaneceu limpa com relação à água do Grupo
I, atribuímos um efeito de tamanho de partícula, que aumentou a área superficial
do TiO 2 em pó, que neste caso, agiu como agente fotocatalítico,
descontaminando a água de eventuais detritos gerados pelos náuplios (FREIRE
et al., 2000; FUJISHIMA, ZHANG e TRYK, 2008).
CONCLUSÕES
Com este trabalho, concluímos que o método para eclosão e criação dos
náuplios de Artemia salina se mostraram satisfatórios, segundo a metodologia
empregada. Também foi possível constatar que o pó de TiO2 quando solubilizado
com solução salina apresenta duas populações distintas de nanopartículas: uma
com 100 nm e outra com 6 nm, ambas de fácil deglutição pelos náuplios, que
apresentaram um tamanho médio de 750 µm. Para as soluções de TiO2 com
concentrações iguais a 5 µg/mL; 0,5 µg/mL e 0,05 µg/mL, não foi constatada
citotoxicidade in vivo nos náuplios, não sendo possível, até o momento, a
determinação da CL50. Foi observado que a água que continha solução de TiO2
permaneceu cristalina quando comparada à água pura da solução controle devido
à propriedade fotocatalítica do TiO2 juntamente com sua grande área superficial,
devido ao seu tamanho nanométrico.
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