Técnicas de isolamento de
organelos
Estudo de
processos
metabólicos
Fraccionamento
celular e
isolamento de
organelos ou
partículas
1
Estrutura duma célula animal
Estrutura duma célula vegetal
2
Organelos duma célula eucariótica
•
•
•
•
•
•
•
•
Lisossomas
Peroxissomas
Mitocôndrias
Cloroplastos
Retículo endoplásmico (ER)
Complexo de Golgi
Núcleo
(Citosol)
Lisossomas
•
Responsáveis pela
degradação de:
alguns componentes
celulares
material captado do
meio extracelular
•
Características:
– membrana única
– pH do lumen ≅ 5
– hidrolases ácidas
catalisam reacções de
degradação
3
Peroxissomas
•
Responsáveis pela
degradação de:
ácidos gordos
compostos tóxicos
•
Características:
– membrana única
– contém oxidases e
catalase
Mitocôndrias
•
Local da produção aeróbica de
ATP
•
Características:
– membrana externa
– espaço intermembranar
– membrana interna
– matriz
4
Cloroplastos
•
Local da fotossíntese nas
plantas e algas verdes
•
Características:
– membrana externa
– espaço intermembranar
– membrana interna
– estroma
– membranas tilacóides
– lumen dos tilacóides
Retículo endoplásmico (ER)
•
Responsável por:
parte da síntese lipídica
maioria da síntese proteica
armazenamento do ião Ca++
destoxificação
•
Características:
– rede de túbulos e vesículas
membranares fechadas e
interligadas
– composto por regiões lisas
e rugosas
5
Complexo de Golgi
•
Modifica e exporta muitos
produtos do ER
•
Características:
– compartimentos e vesículas
achatadas
– composto por 3 regiões:
cis (entrada), media, trans
(saída)
– cada região contem um
conjunto de enzimas diferente
Núcleo
•
Separa:
– o DNA do citosol
– a transcrição e a tradução
•
Características:
– membrana externa
– membrana interna
– poros nucleares
– nucléolo
6
Citosol
•
Porção da célula envolvida pela
membrana plasmática mas que não é
parte de nenhum organelo
•
Características:
– citoesqueleto
– polirribossomas
– diversidade de enzimas do
metabolismo
Fraccionamento celular
1.Disrupção/homogenização
- dispersão do tecido
- ruptura controlada das células
- libertação dos organelos
7
Fraccionamento celular
1.Disrupção/homogenização
2. Fraccionamento
- separação do homogenato em partículas
- recorre, p.ex., a diferenças de tamanho/forma,
densidade, carga superficial
Fraccionamento celular
1.Disrupção/homogenização
2. Fraccionamento
3. Análise
- microscopia
- enzimas marcadores
- pigmentos ou proteínas específicas
8
1.Disrupção/homogenização
- dispersão do tecido e ruptura controlada das células
- método e dimensões do aparelho adaptadas a cada caso
(eficiência
eficiência da ruptura vs. minimizar danos mecânicos)
mecânicos
osmóticos (lise hipotónica)
métodos
digestão enzimática
(ex. lipases, proteases)
mecânicos
ex. métodos
mecânicos:
homogenizador
tipo Potter
misturador
comercial
homogenizador
de lâminas
almofariz
homogenizador
para eppendorfs
9
RUPTURA DO
TECIDO/CÉ
ÉLULAS:
TECIDO/C
Organelos retirados
do meio envolvente
libertação de
ácidos e outras
substâncias
utilizaç
utilização de meio
acumuladas
de extracç
extracção isoisonalguns
osmó
osmótico p.ex.,
p.ex.,
organelos
com sacarose ou
sorbitol
oxidações
(>O2,
oxidases)
desnaturação
proteica
libertação de
proteases, lipases,
(ex.dos lisossomas)
Substâncias
antioxidantes
(ex.c/SH)
ex.c/SH)
Soluç
Solução tampão
manté
mantém pH
realizar todo o processo a
baixa temperatura (≈ 4ºC)
2. Fraccionamento
- separação dos homogenato em partículas com base
essencialmente em diferenças nas suas propriedades
físicas
centrifugação
(≠ tamanho/forma
e/ou densidade)
alguns
métodos
electroforese
(≠ carga eléctrica)
cromatografia
(≠ solubilidade,
dimensão, etc)
partição
(≠ solubilidade)
10
-podem usar-se vários métodos em sequência
- separação de organelos quase sempre recorre
à centrifugação
CENTRÍFUGA (ou CENTRIFUGADORA):
Geralmente tem um motor, que faz rodar um
rotor que contém tubos com as amostras
experimentais.
Pode ser refrigerada.
CENTRIFUGAÇÃO
Utilização da força centrífuga para separar
componentes biológicos com base nas suas
propriedades de sedimentação.
separar
estruturas
ou
macromoléculas de diferente
massa ou densidade, presentes
numa solução.
UTILIZAÇÕES
PRINCIPAIS:
separar
matéria
sólida
(resíduo)
dos
solutos
dissolvidos (no sobrenadante)
11
Rotor basculante
- mais fácil retirar o sobrenadante sem deslocar o resíduo do
fundo do tubo
- MAS… não permite velocidades de rotação tão elevadas
como rotores de ângulo fixo.
Rotor de ângulo fixo
sobrenadante
resíduo
resíduo
resíduo
- permite velocidades de aceleração mais elevadas.
12
PRINCÍPIOS DA CENTRIFUGAÇÃO
Fc=mω2r
força de sedimentação duma partícula de
massa m; ω-velocidade angular do rotor;
r-distância da partícula ao eixo de rotação
OU SEJA, QUANTO MAIOR FOR A MASSA DE UMA
PARTÍCULA E MAIOR A FORÇA CENTRÍFUGA, MAIS
RAPIDAMENTE ELA SE DESLOCA NUM CAMPO DE
FORÇA CENTRÍFUGA.
- Forças que se opõem à centrifugação:
1. força de impulsão ou flutuação
2. Resistência da fricção (atrito)
13
1. força de impulsão ou flutuação:
Fi=mω2rνρ
ν−volume parcial específico da partícula;
ρ−densidade da solução
Fc= mω2r − mω2rνρ = mω2r(1-νρ)
OU SEJA:
- QUANTO MAIS DENSA FOR UMA PARTÍCULA (i.e.,
menor for ν), MAIS RAPIDAMENTE SE DESLOCA NUM
CAMPO DE FORÇA CENTRÍFUGA
- QUANTO MAIS DENSA FOR A SOLUÇÃO, MAIS
LENTAMENTE UMA PARTÍCULA SE DESLOCA NUM
CAMPO DE FORÇA CENTRÍFUGA.
2. força de atrito
- depende de factores como a viscosidade do
meio, a forma da partícula, etc
ex:
mais atrito
menos atrito
QUANTO MAIOR FOR O COEFICIENTE DE
ATRITO, MAIS LENTAMENTE SE DESLOCA UMA
PARTÍCULA
NUM
CAMPO
DE
FORÇA
CENTRÍFUGA.
14
TIPOS DE CENTRIFUGAÇÃO
- Centrifugação diferencial
- Centrifugação em gradientes de densidade
- Centrifugação diferencial:
- centrifugações sequenciais, a velocidades cada vez mais
elevadas
15
Fraccionamento celular por centrifugação
diferencial
- Centrifugação em gradientes de densidade
inicial
final
força centrífuga
aumento
da
densidade
do meio
partículas menos densas
partículas de densidade
intermédia
partículas mais densas
- a densidade da solução aumenta ao longo do tubo
- as partículas distribuem-se de acordo com as densidades
- melhor separação, mas:
- mais demorado
- mais caro
- menor capacidade
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Separação de organelos por
centrifugação em gradientes de
densidade
CONVERSÃO RCF/r.p.m
- Aceleração duma centrífuga expressa normalmente
em RCF (força centrífuga relativa à aceleração da
gravidade)
- RCF expresso em xg
- centrífugas regulam-se em rotações por minuto (r.p.m.)
para obter a mesma força centrífuga em rotores
de diferentes raios r, e centrífugas diferentes:
RCF=1,19x10-5(r.p.m.)2r
(r expresso em cm)
17
3. Análise
microscopia
(c/ corantes
específicos)
alguns
métodos
actividade de enzimas
marcadores (específicos
dum determinado
organelo)
pigmentos ou proteínas específicas
concentração de proteína
Alguns marcadores:
Componente celular
Marcador
Núcleo
DNA
Mitocôndrias
Succinato desidrogenase
citocromo oxidase
Lisossomas
fosfatase ácida
Peroxissomas
catalase
Citosol
lactato desidrogenase
18
Pró
Próximo trabalho:
1.
disrupç
disrupção/
ão/homogenizaç
homogenização
(almofariz + areia de quartzo)
Homogenizar num meio
isotónico (MI)
atenç
atenção aos componentes do meio de
homogenizaç
ção!
homogeniza
ão!
2.
Filtrar através de gaze
para um tubo de centrífuga
sobrenadante
pos
3.
- nuclear
Centrifugar
1000x
g , 5 min
fracção nuclear
4.
Deitar sobrenadante
num tubo limpo
sobrenadante
pos
5.
10.000x
g ,
fracção mitocondrial
5 min
6.
1.
- mitocondrial
Centrifugar
decantar sobrenadante
e ressuspender fracção
mitocondrial
fraccionamento
(centrifugaç
(centrifugação
diferencial)
Homogenizar num meio
isotónico (MI)
2.
Filtrar através de gaze
para um tubo de centrífuga
sobrenadante
pos
3.
- nuclear
Centrifugar
1000x
g , 5 min
fracção nuclear
4.
Deitar sobrenadante
num tubo limpo
sobrenadante
pos
5.
- mitocondrial
Centrifugar
10.000x
g ,
fracção mitocondrial
5 min
6.
decantar sobrenadante
e ressuspender fracção
mitocondrial
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análise de:
• Consumo de oxigénio
• Proteína
• Actividade
da succinato
desidrogenase
20