Escola Estadual de
Educação Profissional - EEEP
Ensino Médio Integrado à Educação Profissional
Curso Técnico em Agroindústria
Microbiologia e Procedimentos de
Análise Microbiológica de Alimentos
Governador
Cid Ferreira Gomes
Vice Governador
Francisco José Pinheiro
Secretária da Educação
Maria Izolda Cela de Arruda Coelho
Secretário Adjunto
Maurício Holanda Maia
Secretário Executivo
Antônio Idilvan de Lima Alencar
Assessora Institucional do Gabinete da Seduc
Cristiane Carvalho Holanda
Coordenadora de Desenvolvimento da Escola
Maria da Conceição Ávila de Misquita Vinãs
Coordenadora da Educação Profissional – SEDUC
Thereza Maria de Castro Paes Barreto
Escola Estadual de Educação Profissional [EEEP]
Ensino Médio Integrado à Educação Profissional
Disciplina
Microbiologia e Procedimentos de Análise
Microbiológica de Alimentos
Josefranci Moraes de Farias
Consultora
AGROINDÚSTRIA – Microbiologia e Procedimentos de Análise Microbiológica de Alimentos
Escola Estadual de Educação Profissional [EEEP]
Ensino Médio Integrado à Educação Profissional
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Escola Estadual de Educação Profissional [EEEP]
Ensino Médio Integrado à Educação Profissional
INDICE
1 FATORES INTRÍNSECOS E EXTRÍNSECOS DE CONTROLE DE
DESENVOLVIMENTO MICROBIANO EM ALIMENTOS. ............................................ 5
1.1 INTRÍNSECOS: .................................................................................................................... 6
1.1.1 Atividade de Água (Aa; Wa):..................................................................................... 6
1.1.2 pH ............................................................................................................................. 7
1.1.3 Potencial de oxi – redução (Eh) ................................................................................ 8
1.1.4 Composição química. ................................................................................................ 9
1.1.5 Fatores Antimicrobianos Naturais. ........................................................................... 9
1.1.6 Interações entre Microrganismos............................................................................ 10
1.2 EXTRÍNSECOS .................................................................................................................. 12
1.2.1 Temperatura ambiental (o mais importante) ......................................................... 12
1.2.2 Umidade relativa do ambiente ............................................................................... 12
1.2.3 Composição gasosa do ambiente .......................................................................... 13
2 CONCEITO DOS OBSTÁCULOS DE LEISTNER ........................................................ 13
2.1 APLICABILIDADE ............................................................................................................. 13
1 INTRODUÇÃO ................................................................................................................... 15
2 CARACTERIZAÇÃO DAS DOENÇAS DE ORIGEM ALIMENTAR ........................ 15
3 DOENÇAS MICROBIANAS DE ORIGEM ALIMENTAR........................................... 16
3.1 MICRORGANSIMOS QUE NÃO OFERECEM RISCO DIRETO A SAÚDE ..................................... 17
3.2 MICRORGANISMOS QUE OFERECEM RISCO BAIXO E INDIRETO Á SAÚDE: ......................... 18
3.2.1 Escherichia coli ....................................................................................................... 18
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3.3 MICRORGANISMOS QUE OFERECEM UM RISCO DIRETO MODERADO E COM DIFUSÃO
LIMITADA .............................................................................................................................. 19
3.3.1 Bacillus cereus......................................................................................................... 19
3.3.2 Staphylococcus aureus ............................................................................................ 22
3.3.3 Clostridium perfringens........................................................................................... 25
3.4 MICRORGANISMOS QUE OFERECEM UM RISCO DIRETO MODERADO E COM DIFUSÃO
POTENCIALMENTE EXTENSA .................................................................................................. 29
3.5 MICRORGANSIMOS QUE OFERECEM RISCO DIRETO E GRAVE ........................................... 29
3.6 MICRORGANISMOS QUE NÃO POSSUEM CLASSIFICAÇÃO ................................................ 44
3.7 FUNGOS PRODUTORES DE MICOTOXINAS ........................................................................ 52
3.7.1 Principais Micotoxinas encontradas em alimentos: ............................................... 53
3.7.2 Fatores que favorecem a desenvolvimento de Fungos e Produção de Micotoxinas55
3.7.3 Fatores que podem Inibir o Crescimento de Fungos e Toxinas: ............................ 55
3.7.4 Detoxicação dos Alimentos Contaminados ............................................................. 56
3.8 VIROSES DE ORIGEM ALIMENTAR .................................................................................... 57
3.8.1 Características Gerais dos Vírus ............................................................................ 57
3.8.2 Vírus de Importância em Alimentos. ...................................................................... 58
3.9 BACTÉRIAS DETERIORANTES ........................................................................................... 60
3.9.1 Utilização de Carboidratos ..................................................................................... 60
3.9.2 Utilização de Proteínas e Substâncias nitrogenadas não-protéicas ....................... 61
3.9.3 Utilização de Lipídios.............................................................................................. 61
3.9.4 Outros tipos de Deterioração .................................................................................. 62
3.10 ALTERAÇÕES DEVIDO AO CRESCIMENTO DE FUNGOS E LEVEDURAS ............................... 63
3.10.1 Utilização de Proteínas e Lipídeos........................................................................ 63
3.10.2 Utilização de Carboidratos ................................................................................... 63
3.11 DETERIORAÇÃO DE ALIMENTOS ENLATADOS ................................................................ 64
3.12 ALTERAÇÕES QUÍMICAS CAUSADAS POR MICRORGANISMOS ......................................... 65
4 PREPARAÇÃO DE MATERIAL DE LABORATÓRIO PARA ANÁLISES
MICROBIOLÓGICAS .......................................................................................................... 66
4.1 CONSIDERAÇÕES GERAIS................................................................................................. 66
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4.2 PROCEDIMENTOS:...................................................................................................... 74
4.3 COLETA/TRANSPORTE/ ESTOCAGEM/ PREPARAÇÃO DE AMOSTRAS PARA ANÁLISE ...... 76
5- PREPARAÇÃO DE AMOSTRA PARA A ANÁLISE PELA TÉCNICA DE
LAVAGEM SUPERFICIAL OU PELA TÉCNICA DE ESFREGAÇO DE
SUPERFÍCIE .......................................................................................................................... 85
5.1- TÉCNICA DE LAVAGEM SUPERFICIAL .............................................................................. 85
5.2- TÉCNICA DE ESFREGAÇO DE SUPERFÍCIE ......................................................................... 87
6- CONTAGEM TOTAL DE MICRORGANISMOS AERÓBIOS
MESÓFILOS/PSICROTRÓFICOS E DE FUNGOS E LEVEDURAS EM PLACAS.... 89
7- CONTAGEM DE COLIFORMES TOTAIS, COLIFORMES FECAIS E E. COLI. 97
AGROINDÚSTRIA – Microbiologia e Procedimentos de Análise Microbiológica de Alimentos
INTRODUÇÃO
A presença de
microrganismos nos alimentos não significa necessariamente um
perigo para a saúde dos consumidores ou uma qualidade inferior destes produtos. A maior
parte dos alimentos se converte em perigo potencial ao consumidor só depois de terem sido
violados os princípios elementares de higiene. Práticas consideradas de risco podem levar
contaminações ao produto final, podendo causar alterações de ordem sensorial, até
possibilidade de ocorrência de toxinfecções alimentares.
Vários agentes causadores de doenças no homem podem ser transmitidos pelos
alimentos:

produtos químicos (metais pesados, pesticidas);

toxinas naturais de plantas e de animais (alcalóides, histaminas);

vírus (hepatite, poliovírus);

bactérias patogênicas;

fungos toxigênicos;
Veremos a seguir, os microrganismos que, presentes em alimentos, podem ser
responsáveis pelo que denominamos
“doenças microbianas de origem alimentar” ou
“toxinfecções alimentares”.
Embora as estatísticas brasileiras sejam precárias, acredita-se que a incidência de
doenças microbianas de origem alimentar em nosso país seja bastante elevada. Mesmo em
países desenvolvidos, nos quais o abastecimento de gêneros alimentícios é considerado
seguro do ponto de vista de higiene e saúde pública, a ocorrência de doenças desta natureza é
significante e vem aumentando, apesar dos avanços tecnológicos nas áreas de produção e
controle de alimentos. Nos Estados Unidos, estima-se que 24 milhões de casos ocorram por
ano, um em cada 10 habitantes.
1
Fatores Intrínsecos E Extrínsecos De Controle De Desenvolvimento Microbiano Em
Alimentos.
“Os processos de preparo e preservação de alimentos evoluem constantemente nas
sociedades industriais. Entretanto nenhum deles á capaz de garantir a qualidade
microbiológica do produto final”.
AGROINDÚSTRIA – Microbiologia e Procedimentos de Análise Microbiológica de Alimentos
O grande erro está em pensar que tais processos possam substituir a qualidade inicial
da matéria prima e as medidas de higiene na fabricação.1
Os microrganismos precisam ser vistos não como inimigos ou aliados, mas como seres
vivos, que evoluem e ocupam os nichos ecológicos disponíveis, com excelentes estratégias de
sobrevivência.
Conhecê-los intimamente é, cada vez mais, fundamental na indústria de alimentos.

Alimentos:

Fatores intrínsecos – características próprias do alimento;

Fatores extrínsecos – características ligadas ao ambiente do alimento.
Intrínsecos:
a) atividade de água (Aa; Wa);
b) acidez (pH);
c) potencial de oxi-redução (Eh);
d) composição química;
e) fatores antimicrobianos naturais;
f) interações entre microrganismos presentes.
Extrínsecos:
a)
umidade;
b)
temperatura ambiental;
c)
composição química da atmosfera.
Importante: estes fatores podem ter efeito interativo.
1
AGROINDÚSTRIA – Microbiologia e Procedimentos de Análise Microbiológica de Alimentos
1.1
1.1.1
Intrínsecos:
Atividade de Água (Aa; Wa):
Aa  (disponibilidade de H2O para reações) P/ Po.
Po  pressão parcial de vapor d’água contida no alimento *.
P  pressão parcial de vapor d’água pura *.
* numa dada temperatura.
Quanto maior a disponibilidade de H2O, maior a chance de crescimento do
microrganismo.
Quanto mais se baixa a atividade d’água, menor a chance de crescimento do
microrganismo.
Fatores que abaixam Aa:

Adição de açucares, sais e glicerol;

Desidratação;

Congelamento.
Observações importantes:
1 - Valores referenciais de AaO: .
a 1,0
Mínimo = 0,60 leveduras osmofílicas. Máximo  a 1,0;
2 - bactérias não se multiplicam em água pura. (Aa=1);
3 - há valores ótimo e mínimo de água para cada tipo de organismo. Ex.: bactérias precisam
de Aa maior que fungos; Gram (-) mais do que Gram (+);
4-
a maioria das bactérias deteriorantes de alimentos precisam de Aa
em torno de 0,91;
5-
Fungos deteriorantes suportam Aa de 0,80;
6-
Bactérias causadoras de toxinfecções variam entre 0,86
(Staphylococcus aureus) e 0,94 (C. perfringens);
7-
Baixar a Aa significa impedir a multiplicação microbiana, isto é,
mantê-las mais tempo na fase lag, o que diminui a população final de bactérias, isto é,
supõe-se que haja bactérias viáveis. É um processo de conservação de alimentos, mas não
dispensa a qualidade da matéria prima; higiene do produto e a manutenção do produto em
condições adequadas de conservação;
AGROINDÚSTRIA – Microbiologia e Procedimentos de Análise Microbiológica de Alimentos
8-
Alguns microrganismos não apresentam diminuição da taxa de
multiplicação em baixa Aa, mas deixam de produzir enterotoxinas. Ex: Staphylococcus
aureus.
1.1.2
pH
Há valores mínimos, ótimos e máximos. De modo geral pH neutro (6,5 - 7,5) é o
ideal. As bactérias não toleram grandes variações de pH; fungos e leveduras são mais
acidófilos. Em função do pH os alimentos são divididos em 3 grupos:

Baixa acidez  pH acima de 4,5;

Ácidos

Muito ácido  pH abaixo de 4,0.
 pH entre 4,0 e 4,5;
“Classificação baseada no pH mínimo para multiplicação e produção de toxina do C.
botulinum (4,5) e no pH mínimo para a multiplicação da maioria das bactérias”.
Em geral:
1-
Frutas; refrigerantes; vinhos e vinagres  deterioração em geral
devido a fungos e leveduras (pH < 3,5).
2-
Carnes e pescados  pH ideal para a proliferação de bactérias,
fungos e leveduras.

Carnes  relação “stress” vs. Glicogênio.
Ação do pH adverso sobre o metabolismo dos microrganismos:
Estende a fase LAG.
Age sobre:
a) enzimas em geral;
b) internalização de nutrientes.
Reação microbiana ao pH adverso:
a) em pH ácido  ativação de amino descarboxilases  gera amina: o pH eleva-se
b) em pH alcalino  ativação de amino  desaminases  gera ácido orgânico, o pH
diminui.
1.1.3
Potencial de oxi – redução (Eh)
Definição: refere-se a troca de elétron
substrato que perde elétron * oxida-se:
substrato que ganha elétron reduz-se.
AGROINDÚSTRIA – Microbiologia e Procedimentos de Análise Microbiológica de Alimentos
A transferência de elétron entre dois substratos cria uma diferença de potencial
elétrico entre eles, que pode ser expresso em Volts (V) ou milivolts (mV).
O que isto tem a ver com oxigênio?

Aeróbios  Eh mais alto (+ positivo) para se multiplicar (+350  +500 mV).
Ex: Pseudomonas; Moraxella; Acinetobacter; Flavobacterium;

Anaeróbios Eh baixo (+ negativo) para se multiplicar (-100) Ex.: C. botulinum;
Desulfotomaculam nigrificanns.

Facultativos  Eh baixo ou alto. Ex.: Enterobacteriacea.
Em geral:

Vegetais +300  +400 mV;

Carnes
a) Grandes massas inteiras  -200 mV;
b) Moídas  +200 mV;
c) No abate  +200; após 30 horas  -250 (anaeróbios).
1.1.4
Composição química.
Necessidade dos microrganismos: fonte de energia; fonte de nitrogênio; vitaminas;
sais minerais; H2O.
a) Fonte de energia: I - comuns: açucares, álcoois; aminoácidos;
II - alguns microrganismos; amido;
III - poucos: lipídios.
b) Fonte de nitrogênio: aminoácidos, nucleotídeos; peptídeos e proteínas.
c) Fonte de vitaminas (coenzimas): complexo B; biotina; ácido pantotênico.
Obs.: Gram (+) são mais exigentes; Gram (-) e fungos sintetizam todos.
d)
Minerais: sódio; potássio; cálcio; magnésio; ferro; cobre; manganês;
molibidênio; zinco; cobalto etc.
1.1.5
Fatores Antimicrobianos Naturais.
Certos fatores presentes naturalmente nos alimentos retardam ou impedem a
multiplicação microbiana:
I– Estruturas biológicas barreiras mecânicas. Ex.: casca das nozes; das frutas; dos ovos;
película que envolve sementes;
AGROINDÚSTRIA – Microbiologia e Procedimentos de Análise Microbiológica de Alimentos
II - Condimentos: óleos essenciais.
Exemplos:
Cravo
eugenol
Alho
alicina
Canela
eugenol e aldeído cinâmico
Orégano
timol e isotimol
AGROINDÚSTRIA – Microbiologia e Procedimentos de Análise Microbiológica de Alimentos
III – Alimentos:

ovo: pH desfavorável (9 - 10);
o clara:
 lisozima  destrói parede de Gram (+);
 avidina; conalbumina.

Leite:  fatores específicos: imunoglobulina; linfócitos;
 sistema lactoperoxidade (SLP)*:
*
H2O2  (SLP)  O2 ;
*
O2  (oxida)  SH - enzimas microbianas.
*SLP  bactericida para Gran (-); bacteriostático para Gran (+).

Sistema lactoferrina:
o quelante de Fe+ (inibidor da multiplicação microbiana);

frutas e vegetais:
o Ácido hidroxicinâmico; taninos; óleos essenciais;
1.1.6
Interações entre Microrganismos.
A produção de metabólitos por um tipo de microrganismo que prolifera em um
alimento pode afetar, positivamente ou negativamente, a sobrevivência de outro grupo
presente no mesmo alimento:
1) bactérias láticas acidificam o alimento e impedem o cresciemtno de outros
microrganismos;
2) bactérias alcalinizantes produzem aminas em alimentos ácidos por ação de
descarboxilases  pH alcalino  crescimento de bactérias que estavam inibidas pelo
pH ácido.
Ex.:
alimento fermentado  leveduras  pH favorável ao crescimento de
C. botulinum  produção de toxina.
3) Ação de contaminante
a) alimento + Staphylococcus aureus + P. aeruginosa triptofano.
(inibido)
b)
alimento
+
(contaminante)
tiamina + triptofano  multiplicação estafilocócica 
enterotoxina..
AGROINDÚSTRIA – Microbiologia e Procedimentos de Análise Microbiológica de Alimentos
1.1.6.1 Interações Específicas.
a) Bacteriocinassubstâncias produzidas por microrganismos com atividade bactericida.

Histórico.
E. coli  colininas, ativas contra outras E. coli e esterobactérias.
As bactérias láticas (LAB) são excelentes produtoras de bacteriocinas.

Categoria química.
Proteínas simples ou conjugadas (lipídios e açúcares).
a) Lantibióticos

proteínas
com
a.a.
pouco
comuns
(deidroalanina;
deidrobutinina ) + anéis de lantionina;
b) Não lantibióticos  a.a. comuns; sem os anéis.

Mecanismos de ação.
Acredita-se que:
a) há ligação das bacteriocinas a receptores da superfície bacteriana;
b) permeabilização da membrana citoplasmática;
c) formação de canais iônicos;
d) fluxo rápido de componentes celulares de baixo PM;
e) interrupção do gradiente eletroquímico da membrama  perda da viabilidade
bacteriana.

Uso de bacteriocinas em alimentos.
1) FDA  auoriza o uso da nisina (Lactocillus latis spp lactis): impede o desenvolvimento
de Gram (+) e germinação de esporos; não age contra Gram (-). Usadas em muitos
alimentos para controlar microrganismos patogênicos / deteriorantes.
2) Há altos investimentos em pesquisa de novas bacteriocinas.
Exemplos:
I- Nova LAB em geral
=> Lactococcus cremoris
 diplocina;
=> Pediococcus
 pediocina;
=> Lactobacillus plantarum
 plantanicina;
=> Lactobacillus herveticus
 hervetina;
=> Lactobacillus brevis
 lactobrevina;
=> Lactobacillus reuteris
 reuterina;
=> Lactobacillus bulgaricus
 bulgaricina;
AGROINDÚSTRIA – Microbiologia e Procedimentos de Análise Microbiológica de Alimentos
=> Lactobacillus acidophilus
 lactocina;
=> Lactobacillus sake
 sakacina (*)
(*) usada em hambúrgueres contra Pseudomonas, Listeria e Salmonellas.
II- LAB específicas  desenvolvidas a pedido da indústria para aumentar o “shelf-life” de
alimentos: resistência a 100ºC  podem ser adicionadas durante o processo de fabricação do
alimento. Indústrias de RGS já adicionaram nisina no envoltório de salsicha.
b)
Probióticos
Ação por exclusão competiva: adição de microrganismo inócuo a um produto, de
forma a ocupar o “ninho ecológico” disponível e impedindo, portanto, a entrada de patógenos
da mesma especificidade ecológica.
Ex.: colonização de epitélio superficial da mucosa gastro intestinal de frangos recém
nascidos com bactérias não patogênica, para impedir a intalação de patógenos tais como
Salmonella e Campylobacter. Usado notadamente na Finlândia e Suíça. Uso em estudo em
outros países.
1.2
1.2.1
Extrínsecos
Temperatura ambiental 2 (o mais importante)
Microrganismos se desenvolvem em baixa, média e alta temperatura.

Temperatura baixa:
o psicrófilos 0o.C  20o.C; ótimo 10o.C  15o.C;
o psicrotróficos 0o. 7o.C, com duas sub-categorias:

Europsicotróficos
não formam colônias visíveis até o
6o.
10o.
dia entre 0o.C - 7o.C.
Ex.: Yersinia enterocolitica, Hafnia alvei.

Estenopsicrotróficos formam colônias em
5 dias, nas mesmas
condições.
Ex.: Pseudomonas fragi e Aeromonas hydrophyla.
2
Mesófilos : 25o.C- 40o.C – ótimo 35o.
Termófilos: 40o.C a 60o.C – ótimo 55o.
AGROINDÚSTRIA – Microbiologia e Procedimentos de Análise Microbiológica de Alimentos
1.2.2
Umidade relativa do ambiente
Relaciona-se a Aa do alimento: quando a umidade do alimento está em equilíbrio com
a da atmosfera.
Então, alimentos conservados em ambiente com UR acima da sua Aa, tendem a absorver
umidade, aumentando
UR = Aa X 100
sua Aa e vice-versa. Isto promoverá
modificações na capacidade de multiplicação dos microrganismos
existentes, em função da Aa final.
1.2.3
Composição gasosa do ambiente
Corresponde ao teor maior ou menor de O2  predomínio de aeróbios ou anaeróbios.
“Atmosferas modificadas” - substituição total ou parcial só oxigênio por outros gases (recurso
tecnológico para aumentar a vida útil dos alimentos).
Ex.: embalagens à vácuo ou com diferentes combinações de oxigênio, nitrogênio e gás
carbônico.
Efeito do CO2  atmosferas contendo 10% de CO2 são usadas para conservação de frutas
(pêras, maçãs, pêssegos, nectarinas): competição com o etileno.
Atualmente também se usa CO2 para maior tempo de armazenamento de grandes
massas de carne vermelha.
2
Conceito dos obstáculos de Leistner
O estudo das ações sinergísticas ou antagônicas entre os fatores extrínsecos e
intrínsecos que afetam a sobrevivência de microrganismos no alimento levou à “teoria dos
obstáculos de Leistner” (hurdle theory).
2.1

Aplicabilidade
Tecnologia dos obstáculos  Utilização simultânea de mais de uma forma de
controle
microbiológico nos alimentos: salga; acidificação; processamento
térmico; adição de conservantes; etc.

Modelagem matemática  Com o auxílio da informática é possível a introdução
de modelos matemáticos que permitem prever a probabilidade de um alimneto
causar toxinfecção, bem como sua vida útil.
Tais modelos levam em conta o crescimento/ produção de toxinas por microrganismos
nos alimentos, em função do n o.de fatores intrínsicos e extrínsecos. Sinérgicos ou
AGROINDÚSTRIA – Microbiologia e Procedimentos de Análise Microbiológica de Alimentos
antagônicos que apresente. Estes modelos apresentam boa correlação com os resultados
obtidos.
Figura 1- ilustração do conceito dos obstáculos (Leistner, 1992).
AGROINDÚSTRIA – Microbiologia e Procedimentos de Análise Microbiológica de Alimentos
Microbiologia em alimentos
1
Introdução
A presença de microrganismos nos alimentos não significa necessariamente um perigo
para a saúde do consumidor ou uma qualidade inferior destes produtos. A maior parte dos
alimentos se converte em perigo potencial ao consumidor só depois de terem sido violados os
princípios elementares de higiene. Práticas consideradas de risco podem levar contaminações
ao produto final, podendo causar alterações de ordem sensorial, possibilitando a ocorrência
de toxinfecções alimentares.
Vários agentes causadores de doenças no homem podem ser transmitidos pelos
alimentos:

Produtos químicos (metais pesados, pesticidas);

Toxinas naturais de plantas e de animais (alcalóides, histaminas);

Vírus (hepatite, poliovirus);

Parasitas (amebas, helmintos);

Bactérias patogênicas;

Fungos toxigênicos;
Veremos a seguir, os microorganismos que, presentes em alimentos, podem ser
responsáveis pelo que denominamos “doenças microbianas de origem alimentar”
ou
“toxinfecções alimentares”.
Embora as estatísticas brasileiras sejam precárias, acredita-se que a incidência de
doenças microbianas de origem alimentar em nosso país seja bastante elevada. Mesmo em
países desenvolvidos, nos quais o abastecimento de gêneros alimentícios é considerado seguro
do ponto de vista de higiene e saúde pública, a ocorrência de doenças desta natureza é
significante e vem aumentando, apesar dos avanços tecnológicos nas áreas de produção e
controle de alimentos. Nos Estados Unidos, estima-se que 24 milhões de casos ocorram por
ano, afetando, um em cada 10 habitantes.
2
Caracterização das doenças de origem Alimentar
É muito comum pessoas incriminarem os alimentos que acabaram de consumir como
causadores, dos distúrbios gastrintestinais que venham a apresentar. Considerando o fato que,
em condições normais, um indivíduo alimenta-se várias vezes ao dia, qualquer doença ocorre
AGROINDÚSTRIA – Microbiologia e Procedimentos de Análise Microbiológica de Alimentos
sempre “após a refeição”. Entretanto, antes que determinado alimento possa ser incriminado
como causador de um problema gastrintestinal, várias providências são necessárias.
De acordo com o Center for Disease Control and Prevention (CDC), dos Estados
Unidos, define-se como surto de doença de origem alimentar a ocorrência de dois ou mais
casos de doenças associados a um único alimento.
A identificação de um surto de doença de origem alimentar é realizada através de um
inquérito epidemiológico, conduzido entre os indivíduos que tenham e que não tenham
consumido o(s) alimento(s), que tenham apresentado sintomas característicos, quer não, e
também através de exames laboratoriais em amostras clínicas e nas amostras de alimentos.
Deve-se considerar também que nem todos os indivíduos que consomem o mesmo alimento
contendo um agente patogênico apresentam a mesma sintomatologia. O período de incubação,
a gravidade e a duração da doença podem ser diferentes, em função da idade, do estado
nutricional, da sensibilidade individual e da quantidade de alimento ingerido.
Em grande parte dos surtos de doença microbiana de origem alimentar relatados, a
identificação do alimento causador é inferida apenas com base no inquérito epidemiológico.
Somente em alguns raros casos reportados, a identificação do microorganismo patogênico no
material clínico e nas amostras de alimentos foi possível.Isto pode ser explicado porque:
a) O(s) alimentos(s) suspeito(s) não está (ão) mais disponível (is) para análise
laboratorial;
b) Não é possível caracterizar o alimento suspeito;
c) A análise laboratorial é limitada, pois, devido ao custo, é impraticável investigar
todos os patogênicos possíveis;
d) As metodologias laboratoriais empregadas para isolamento e identificação dos
inúmeros patógenos não são 100% eficientes.
3
Doenças Microbianas de Origem alimentar
As doenças microbianas de origem alimentar podem ser subdivididas em duas grandes
categorias:
a) Intoxicações alimentares, causadas pela ingestão de alimentos contendo toxinas
microbianas pré-formadas. Estas toxinas são produzidas durante a intensa proliferação
do(s) microrganismo(s) patogênico(s) no alimento. Neste grupo estão Clostridium
botulinum, Staphylococcus aureus, Bacillus cereus
forma emética e os fungos
produtores de micotoxinas.
AGROINDÚSTRIA – Microbiologia e Procedimentos de Análise Microbiológica de Alimentos
b) Infecções alimentares, causadas pela ingestão de alimentos contendo células viáveis
de microrganismos patogênicos. Estes microrganismos aderem à mucosa do intestino
humano e proliferam, colonizando-o. Em seguida, pode ocorrer a invasão da mucosa e
penetração nos tecidos, ou ainda, a produção de toxinas que alteram o funcionamento
das células do trato gastrintestinal. Entre as bactérias invasivas, destaca-se a
Salmonella, Shigella, Escherichia coli invasora, Yersinia enterocolítica, entre outras.
Entre as toxigênicas, incluem-se Vibrio cholerae, Escherichia coli enterotoxigênica,
Campylobacter jejuni, entre outras.
A seguir, serão descritas as principais características dos microorganismos
patogênicos de interesse em alimentos e das toxinfecções alimentares que causam. Estes
microrganismos foram agrupados em quatro categorias:
1. Bactérias Gram - positivas (gram (+));
2. Bactérias Gram – negativas (Gram (-));
3. Fungos produtores de micotoxina;
4. Vírus
Para efeitos didáticos, as bactérias serão divididas de acordo com a epidemiologia.
A importância de microrganismos em alimentos depende de algumas condições como:
o número em que são encontrados; o tipo de microrganismos e do alimento; o tratamento pelo
qual o alimento foi submetido; o processamento e a estocagem; se o alimento está pronto para
o consumo ou se sofrerá algum processamento térmico; e a individualidade de quem o ingere.
Dentre os inúmeros tipos destes microorganismos, as atenções são mais concentradas
naqueles predominantes que podem causar deterioração ou algum dano à saúde,
principalmente os que não são comum ao alimento, chegando até ele pela manipulação, ou
pelo contato com superfícies de utensílios ou maquinários.
O ICMSF – International commission on microbiological specifications for foods –
(1984) usando como definição os critérios microbiológicos aplicáveis para os alimentos e
procurando caracterizar a qualidade sob aspectos higiênico-sanitário e riscos potenciais à
saúde do consumidor, distinguiu cinco grupos de microrganismos:
3.1
Microrgansimos que não oferecem risco direto a saúde
São microrganismos não patogênicos que, em presença excessiva no alimento podem
causar deterioração ou redução da vida de prateleira. As análises realizadas neste grupo são a
contagem padrão em placas (contagem geral de mesófilas) e contagem de fungos e leveduras
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que nos informam as condições vigentes ao longo do processamento (utensílios,
equipamentos, mãos, qualidade do ar).
3.2
Microrganismos que oferecem risco Baixo e Indireto á Saúde:
Sua avaliação quantitativa oferece informações sobre as condições higiênico-sanitárias
durante o processamento ou sobre técnicas utilizadas para preservação. Neste grupo estão
incluídos os microrganismos denominados indicadores; uma ênfase especial é dada aos
coliformes totais e fecais, cujo habitat exclusivo ou preferencial é o trato intestinal de animais,
juntamente com outras enterobactérias. Sua presença poderia revelar uma contaminação fecal
direta ou indireta no alimento, e conseqüentemente risco de introdução de patógenos. Dentre
os indicadores de contaminação fecal da água e alimentos, os coliformes são os mais
utilizados, baseados
principalmente na facilidade de isolamento
e identificação,
predominância em números realtivos e tempo de sobrevivência adequado.
Coliformes são bactérias gram negativas, não esporuladas, na forma de bastonetes e
que fermentam a lactose com produção de ácido e gás dentro de 24 á 48 horas á 32-37o.C. a
definição do grupo abrange os gêneros Escherichia, Klebsiella, Citrobacter e Enterobacter.
A contagem de coliformes pode diferenciar dois grupos: totais e fecais. O primeiro é utilizado
para avaliar as condições higiênicas sendo que as altas contagens significam contaminação
pós-processamento, limpeza, sanificação e tratamento térmico deficientes; ou ainda,
multiplicação durante o processamento ou estocagem. O índice de coliformes fecais é
emepregado como indicador de contaminação fecal, isto é, condições higiênico-sanitárias,
presumindo-se que a população deste grupo é constituída de uma alta proporção de
Escherichia coli, que tem seu habitat exclusivo no trato intestinal do homem e animais.
3.2.1
Escherichia coli
Como as salmonelas e shigelas pertencem á família das enterobacteriaceas, sendo, no
entanto incluída no grupo coliforme que se caracteriza por bactérias que fermentam a lactose,
com produção de gás. As cepas envolvidas em processos patogênicos são morfológicas e
bioquimicamente indistinguíveis das não patogências. Diversos tipos de alimentos têm sido
incriminados em casos e surtos infecciosos atribuídos a este microrganismo; medidas de
controle para a E.coli são as mesmas atribuídas à outras enterobacterias, constituindo em
higiene rigorosa de pessoal, equipamentos e utensílios, principalmente em alimentos infantis.
Caracterísitcas gerais
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Escherichia coli
é a espécie predominante entre os diversos microrganismos
anaeróbios facultativos que fazem parte da flora intestinal de animais de sangue quente. Esse
microrganismo pertence à família Enterobacteriaceae e entre suas principais características
destacam-se: bacilos Gram(-), não esporulados, capazes de fermentar glicose com produção
de ácido e gás. A maioria fermenta também a lactose, com produção de ácido e gás, embora
alguns sejam anaerogênicos. Apresentam antígenos somáticos O, relacionados com proteínas
dos flagelos e ainda, antígenos K, relacionados com polissacarídeos capsulares. Foram, até o
momento, descritos 173 antígenos 0,56 H e 100 K diferentes.O siginificado da presença de
E.coli em um alimento deve ser avaliado sob dois ângulos. Inicialmente, E.coli, por ser uma
enterobacteria, uma vez detectada no alimento, indica que esse alimento tem uma
contaminação de origem fecal e, portanto sta em condições higiênicas insatisfatórias.O outro
aspecto a ser considerado é que diversas linhagens de E. coli são comprovadamente
patogênicas para o homem e para os animais, que serão descritas nos próximos itens deste
material.
3.3
Microrganismos que oferecem um risco direto Moderado e com
Difusão Limitada
Este grupo inclui bactérias potencialmente patogênicas, cuja presença em alimentos,
em números elevados, poderá causar processos de intoxicação ou infecção de origem
alimentar. São classificados como difusão limitada porque só são passíveis de desencadearem
um processo patológico quando estão em número elevado. Os principais representantes do
grupo
são
Bacillus
cereus,
Clostridium
perfringens
e
Staphylococcus
aureus
enterotoxigênico.
3.3.1
Bacillus cereus
As bactérias pertencentes ao gênero Bacillus compreendem um grande número de
espécies, estando relatadas, até o momento, 48 espécies diferentes. As bactérias deste gênero
caracterizam-se por uma intensa atividade metabólica, já que produzem enzimas que
degradam muitos substratos orgânicos. Devido a esta caracterísitca, a identificação deste
microrganismo é bastante complicada, não havendo um consenso geral sobre a melhor forma
de faze-la.
Bacillus cereus é bacilo Gram (+) grande, aeróbio, mesófilo, com flagelos peritríquios,
e produtor de esporos que podem ser centrais ou subterminais. Cepas de B.cereus são capazes
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de utilizar vários carboidratos; glicose, frutose, trealose, sacarose, salicina, maltose, manose,
m-inositol e lactose. São capazes de hidrolizar amido, caseína e gelatina. São catalase
positivos e oxidase variável. Todas as cepas são produtoras de hemolisinas, sendo conhecidas
pelo menos duas: cereolisina (termoestável) e hemolisina termolábil. São também produtores
de fosfolipases do tipo C.
B.cereus multiplica-se bem entre 10o.C e 48o.C, apresentando um ótimo de
temperatura entre 28o.C e 35o.C. a atividade de água mínima necessária para seu crescimento
é 0,95 sendo o crescimento bastante reduzido quando a concentração de NaCl do meio é
7,5 %. A faixa de pH em que ocorre a multiplicação varia de 4,9 a 9,3.
Características da doença
B.cereus pode causar duas formas distintas de gastroenterite; a síndrome diarréica e a
síndrome emética.
A síndrome diarréica caracteriza-se por um período de incubação que varia de oito a
16 horas, e seus principais sintomas são a diarréia intensa, dores abdominais, tenesmos retais,
raramente ocorrendo náuseas e vômito. Aduração da doença é de 12 a 24 horas. Os alimentos
envolvidos nos caos de gastrenterite diarréica por B. cereus, descritos na literatura, são
vegetais crus e cozidos, produtos cárneos, pescado, massa, leite, sorvete, pudins á base de
amido, entre outros.
A síndrome emética caracteriza-se por um período de incubação curto (de uma a cinco
horas), causando vômitos, nauseas e mal-estar geral e, em alguns casos, diarréia com seis a 24
horas de duração. Esta síndrome está quase que exclusivamente associada a alimentos
farináceos, contendo cereais, principalmente arroz. Um número bastante significativo de casos
já foi descrito envolvendo o arroz preparado a moda chinesa, ou seja, cozido no vapor e
mantido á temperatura ambiente. Nestas condições, o auqecimento é insuficiente para destruir
os esporos, que são comuns nos cereais. Os esporos germinam, e, devido á temperatura
favorável, ocorre a multiplicação rápida das células vegetativas resultantes. A mistura do
arroz preparado desta forma com outros ingredientes (carne, ovos, vegetais, frango), comum
na comida oriental, agrava ainda mais o problema.
Mecanismo de patogenicidade
A maioria das cepas de B.cereus é capaz de produzir uma série de metabólitos
extracelulares, dos quais alguns estão relacionados com seu mecanismo de virulência. Entre
estes metabólitos, destacam-se as toxinas diarréica e as toxinas eméticas, responsáveis pelas
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síndromes anteriormente mencionadas. Segundo vários pesquisadores, estas sídromes só se
manifestam quando um alimento contém número elevado de células viáveis de B.cereus
(entre 107 e 109 células).
A toxina diarréica é uma enterotoxina de natureza protéica, termolábil, sendo destruída
pelo aquecimento a 55o. C por 20 minutos. É inativada pela tripsina, pepsina e pela
proteinase, e instável em pH inferior a 4,0. A toxina diarréica age estimulando a adenilciclase
da mucosa intestinal, provocando acúmulo de sais e eletrólitos (Na+ e Cl-) e interferindo na
absorção de glicose e de aminoácidos. A toxina é também fortemente necrótica. A
enterotoxina produzida por B.cereus não dá reação cruzada com a enterotoxina termolábil
produzida pelo vibrião colérico, por Escherichia coli e por Clostridium perfringens. A
enterotoxina é produzida durante a fase logarítmica do crescimento bacteriano.
Devido às manifestações clínicas provocadas pela enterotoxina de B. cereus ela é
também conhecida por diversos outros nomes: enterotoxina diarréica. Fator de
permeabilidade vascular, toxina dermonecrótica, toxina intestino necrótica, fator LRIL
(ligated rabbit ileal loop). Além diso, a toxina diarréica é letal para camundongos quando
injetada intravenosamente.
A toxina emética não é tão conhecida quanto a enterotoxina, devido à falta de um
modelo biológico sensível adequado. Esta toxina não tem os mesmos efeitos biológicos
apresentados pela toxina diarréica, mas induz vômitos em curto período de tempo após a
ingestão. É resistente ao aquecimento a 126o.C por 90 minutos. Apresenta baixa ou nenhuma
antogenicidade e sua produção ocorre na fase final da fase logarítmica de crescimento, sendo
liberada em grandes quantidades durante a lise celular. Alguns estudos sugerem que a
produção desta toxina ainda não é conhecida até o momento, não existem evidências
suficientes sobre a produção simultânea das toxinas eméticas e diarréicas por uma mesma
cepa de B.cereus.
Epidemiologia
B.cereus é largamente distribuído na natureza, sendo o solo o seu reservatório natural.
Por esta razão, contamina facilmente alimentos como vegetais, cereais, condimentos, etc.
Dentre os vegetais, destaca-se o arroz, que tem sido o alimento mais freqüentemente
envolvido em surtos de origem alimentar. Várias espécies de Bacillus estão presentes no solo
úmido no qual se cultiva o arroz, e B.cereus, em especial, permanece associado com a planta
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durante todo o seu desenvolvimento. A freqüência de isolamento de B.cereus em arroz cru é
de 40% a 100%.
B cereus é também encontrado na superfície de carne bovina, suína e de frango,
certamente devido á contaminação com o solo. B. cereus é um problema sério também em
laticínios (queijos e sorvetes), sendo seus esporos muito comuns em leite em pó. No Brasil,
B.cereus tem sido isolado de vários tipos de alimentos: queijos, farinhas, amidos, alimentos
desidratados, carne moída, com índices de positividade entre 18% e 97%.
Vários estudos têm demonstrado que B.cereus faz parte da flora fecal de indivíduos
normais, havendo algumas indicações que sua presença é mais comum nos meses de verão, e
dependente dos hábitos alimentares. Entretanto, B.cereus não coloniza o intestino, não
persistindo por longos períodos.
Medidas de Controle
Os esporos das cepas de B.cereus associadas com doenças de origem alimentar têm
D95oC de 24 minutos aproximadamente. Cepas não associadas com doenças têm D95oC que
pode variar entre um minuto e meio e 36 minutos. Portanto, o consumo de alimentos recémpreparados não oferece risco. Das várias formas de tratamento térmico, o cozimento em vapor
sob pressão, a fritura e o assar em forno quente destroem tanto células vegetativas quanto
esporos. Cozimento em temperaturas inferiores a 100o.C pode não ser eficaz para destruição
de todos os esporos de B.cereus.
3.3.2
Staphylococcus aureus
Caracterísitcas gerais e Epidemiologia
São cocos agrupados em cachos de uva, gram positivos, algumas cepas produzem
toxina, anaeróbio facultativo, mas prefere a aerobiose, desenvolve em pH entre 4,2 – 9,3,
tendo como ótimo o pH 7,0, a temperatura oscila entre 6,5 a 45o.C (ótima de 30-37o. C) e
atividade de água mínima 0,86. São halófilicos e osmofílicos e tolerantes a concentrações de
10 % a 20 % de NaCl e a nitratos, o que torna os alimentos curados veículos potenciais para
as mesmas.
Tanto o S. aureus como o S. epidermídes são comumente encontrados na pele e
mucosas de humanos e animais de sangue quente. De acordo com Bergey’s Manual of
determinative bacteriology (1986), 19 espécies fazem parte deste gênero. Destas, as seguintes
apresentam interesse potencial em microbiologia de alimentos: S.aureus, S.hyicus,
S.chromogens e S. intermedius, sendo o S.aureus o mais importante. Com exceção de
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S.chromogens, as demais espécies apresentam testes positivos para coagulase (plasma de
sangue de coelho) e termonuclease (Tnase).
O S. aureus encontrado em vários tipos de alimentos é facilmente transmissível
quando a higiene pessoal deixa a desejar. Apresença de S. aureus
em alimentos pode
significar que as operações na sua manipulação foram desenvolvidas em condições
insatisfatórias do ponto de vista sanitário sendo a origem da contaminação os manipuladores,
utensílios e equipamentos. Entre os principais alimentos estão os de origem animal
industrializados (frango, carne, presunto, leite, queijos, etc.), e aqueles que sofrem maior
manipulação como saladas, doces com ou sem recheio entre outros. Algumas cepas de
S.aureus são produtoras de toxinas, isto quando atingem um número de 1,000,000 ou mais de
células viáveis por grama de alimento em condições ótimas, a enterotoxina torna-se evidente
em quatro a seis horas.
As toxinas são termo-estáveis resistindo até 100o.C por 60 minutos, enquanto que as
células morrem em 2 minutos á 65,5o.C. além do homem, a maioria dos animais domésticos
também é portadora ou apresenta-se contaminada pela bactéria. Exemplo típico é a mastite
estafilocócica do gado leiteiro. Caso o leite infectado seja consumido ou utilizado no
prepararo de queijos, haverá chances de ocorrer intoxicação.
O S.aureus pode estar presente em alimentos crus, e é comumente destruído durante o
cozimento e processamento. Usualmente os alimentos são contaminados depois do cozimento
pelas mãos de manipuladores ou em alimentos que não requerem aquecimento.
A contaminação de queijos também já causou vários surtos tanto antes como depois
do advento do emprego do leite pasteurizado na sua fabricação. Neste último caso, pode
ocorrer contaminação pós-processamento ou utilização de fermentos (starters) contaminados
por S.aureus.
Os indivíduos portadores representam mais de 50% da população, carregando estes
microrganismos de tempos em tempos nas narinas, gargantas e mãos.
Características da doença
S.aureus causa intoxicação provocada pela ingestão do alimento que apresenta a
toxina pré-formada. Portanto, o agente causal não é a bactéria per se, mas várias toxinas (A,
B, C1,C2,C3,D,E) produzidas por esta bactéria, conhecidas como enterotoxinas. Atualmente,
sabe-se que as espécies S.intermedius e S.hyicus também são capazes de produzir toxinas.
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O período de incubação de um surto varia, geralmente, de 30 minutos a oito horas,
sendo a média de duas a quatro horas, após a ingestão do alimento contaminado.
Os sintomas variam com o grau de suscetibilidade do indivíduo, concentração da
enterotoxina no alimento e a quantidade consumida do alimento.
Os principais sintomas são náuseas, vômitos, cãibras abdominais geralmente bem
dolorosas, diarréia e sudorese. Podem ocorrer ainda dores de cabeça, calafrios, queda de
pressão arterial e, raríssimas vezes, febre, quando a quantidade de toxina ingerida é grande. A
doença não é fatal, amenos que o indivíduo esteja debilitado. Quando há choque, desidratação
e muito vômito é necessária a hospitalização para que os fluidos e os eletrólitos sejam
repostos.
Mecanismos de patogenicidade
Além das enterotoxinas, as cepas de S.aureus produzem várias outras toxinas, como
-toxina, -toxina, estafiloquinase, toxina do choque tóxico, etc. No entanto, apenas as
enterotoxinas não têm interesse em alimentos. Atualmente, essa denominação para as
enterotoxinas não é considerada a mais adequada, uma vez que os sintomas da intoxicação
parecem estar mais relacionados ao estímulo imunológico do que ao desequilíbrio eletrolítico
da mucosa.
As enterotoxinas são termoresistentes. Tal fator é especialmente importante para a
indústria de alimentos, porque a maioria dos alimentos processados sofre algum tratamento
térmico durante o processamento. Por exemplo, a pasteurização do leite destruirá o
microrganismo – S.aureus- mas não inativará a toxina, caso esteja presente.
Apesar das enterotoxinas não serem destruídas facilmente pelo calor, sabe-se que as
quantidades geralmente presentes em alimentos (0,5-10g/100g de alimento) envolvidos em
surtos de intoxicação são desnaturadas durante o processo de enlatamento. Isto, no entanto,
não é motivo para que os cuidados durante o armazenamento dos alimentos sejam
negligenciados, permitindo a sua produção antes do processamento.
Não existe concordância entre os vários autores sobre a quantidade mínima de
enterotoxina necessária para causar sintomatologia em seres humanos. De um maneira geral,
estima-se entre 0,015 e 0,37 g de enterotoxina por quilo de peso corpóreo. Características
individuais também devem ser levadas em consideração.
AGROINDÚSTRIA – Microbiologia e Procedimentos de Análise Microbiológica de Alimentos
Na realidade as enterotoxinas não apresentam uma única, mas sim várias formas de
ação, entre elas:
Ação Emética 
é a reação mais freqüentemente observada neste tipo de
intoxicação. Os sítios desta ação parecem localizar-se no intestino. Este estímulo é transferido
através dos nervos vago e simpático ao centro do vômito, que faz parte do sistema nervoso
central (SNC). O centro do vômito induz, de alguma maneira, a retroperistalsia do estômago e
do intestino delgado provocando o vômito. Por esta razão, as toxinas estafilocócicas deveriam
se denominadas neurotoxinas e não enterotoxinas.
Ação Diarréica  a diarréia é o segundo sintoma mais comum na intoxicação
alimentar estafilocócica, uma provável explicação é a ativação de um mecanismo secretor de
Na Cl, além disso, caso uma quantidade suficiente de enterotoxina esteja presente no
alimento, ela causará inflamação e irritação de mucosa do estômago e intestino delgado.
Medidas de controle
Como os estafilococos encontram-se amplamente disseminados pela natureza, tornase impossível a sua eliminação do ambiente.
A manipulação do alimento pelo homem, um dos reservatórios desta bactéria, já indica
uma provável contaminação. O aquecimento do alimento logo após a sua manipulação
destróis as células bacterianas e ajuda na prevenção da intoxicação. No entanto, se cuidados
apropriados não forem tomados após este aquecimento, o microrganismo poderá desenvolverse e produzir a toxina.
Para prevenir a intoxicação estafilocócica, é importante manter os alimentos
suscetíveis sob refrigeração. O resfriamento rápido de toda a massa alimentícia é uma das
medidas para a prevenção e controle desta intoxicação. Quando da impossibilidade destas
medidas, deve-se tomar cuidados especiais para se evitar a contaminação no preparo deste
alimento.
No caso de enterotoxinas, acredita-se serem necessárias entre 105 e 106 unidades
formadoras de colônias de S.aureus por grama do alimento para que a toxina seja formada em
níveis capazes de provocar intoxicação. Como normalmente, a bactéria encontra-se presente
em números baixos, é preciso que ocorra sua multiplicação. Ao controlar-se, portanto, fatores
que afetam o crescimento de S. aureus, a produção da enterotoxina também estará sendo
controlada e, conseqüentemente, os surtos de intoxicação.
AGROINDÚSTRIA – Microbiologia e Procedimentos de Análise Microbiológica de Alimentos
O crescimento de S.aureus é inibido por cepas de Lactococcus lactis ssp e L.lactis ssp
cremoris;
portanto a competição microbiana ajuda no controle destas intoxicações. A
degradação de enterotoxinas por alguns microrganismos competidores também já foi
sugerida.
3.3.3
Clostridium perfringens
Características do microrganismo.
Clostridium perfringens é um bacilo Gram (+), anaeróbio, esporulado, apresenta
cápsula e é imóvel. Produz uma série de proteínas biologicamente ativas, algumas com
atividade tóxica e outras com atividade enzimática. De acordo com a produção das quatro
toxinas extracelulares mais importantes ( toxinas alfa, beta, epsilon e iota), as cepas de C.
perfringens são classificadas em cinco tipos : A, B. C, D e E. todos os cinco tipos produzem
a toxina alfa, que tem atividade fosfolipásica (lectinase) e é hemolítica. A toxina beta é
produzida por C.perfringens dos tipos B e C, a toxina epsilom por C. perfringens tipos B e D
e a toxina iota é produzida somente pelo tipo E.
Os tipos A, C, e D são também produtores de enterotoxina, mas quase todos os casos
descritos de toxinfecção alimentar por este microrganismo foram causados por cepas do tipo
A.
C. perfringens tem intensa atividade metabólica em alimentos. É capaz de produzir
uma grande variedade de enzimas hidrolíticas extracelulares, incluindo colagenase,
hialuronidase, deoxirribonuclease, lecitinase, proteases que hidrolisam caseína e gelatina. É
também capaz de fermentar um grande número de carboidratos (glicose, lactose, frutose,
galactose, maltose, inositol, manose, amido, sacarose). Durante a fermentação há intensa
produção de gás (H2 e CO2) e de produtos finais ácidos. Para sua multiplicação, é
imprecindível a presença de vitaminas e de nucleotídeos.
Uma das características mais importantes de C.perfringens
é sua capacidade de
multiplicação em temperatura alta, estando a temperatura ótima entre 40 e 45 ºC. o tempo de
geração de 7,1 minutos a 41o.C é um dos menores entre as bactérias de interesse em
alimentos. As temperaturas mínima e máxima para multiplicação, relatadas na literatura, são
15o.C e 51,7o.C, respectivamente. No entanto, para esporulação, a temperatura ótima fica
entre 35o.C e 40o.C.
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C.perfringens multiplica-se melhor em pH entre 6,0 e 7,0. os mesmos valores valem
também para esporulação. Valores de pH inferiores a 5,0 ou superiores a 80,3 são bastante
inibidores para microrganismos.
Com relação à umidade, C.perfringens não é muito tolerante a baixa Aa. Pra sua
multiplicação, a Aa mínima deve estar entre 0,95 a 0,97, e para a esporulação, 0,98,
dependendo das demais características intrínsicas do alimento. Concentrações de NaCl em
torno de 7 a 8% são necessárias para inibir a multiplicação da maioria das cepas de
C.perfringens.
Embora C.prefringens não seja considerado um microrganismo anaeróbio estrito, o
crescimento inicial é dependente do potencial de oxido-redução. O valor ótimo para
multiplicação está em torno de –200mV.
Caracterísitcas da doença
Clostridium perfringens
é responsável por dois tipos diferentes de toxinfecção
alimentar. Cepas do tipo A causam a intoxicação alimentar na forma clássica e as do tipo C
causam a enterite necrótica, bem mais grave.
Sintomas de intoxicação alimentar por C.perfringens do tipo a são dores abdominais
agudas, diarréia com náuseas e febre, sendo os vômitos raros. Os sintomas aparecem mais
freqüentemente entre 08 a 12 horas após a ingestão de alimentos contendo número elevado de
células (106 a 107 células por grama de alimento ou mais) e a duração dos sintomas é
freqüentemente de 12 a 24 horas. Normalmente, esta intoxicação alimentar é branda,
raramente causando a morte dos indivíduos afetados. Entretanto, a ocorrência desta
intoxicação é muito comum, em todas as partes do mundo.
A enterite necrótica, causada por C.prefringens tipo C, é rara. Os sintomas são dores
abdominais agudas muito intensas, diarréia sanguinolenta, algumas vezes vômitos, e
inflamação necrótica do intestino delgado, sendo freqüentemente fatal. Os casos descritos na
literatura têm sido associados ao consumo de carne de porco mal cozida.
Mecanismo de patogenicidade
A intoxicação alimentar é causada por uma enterotoxina que aparece quando se forma
o esporo de C.perfringens. Seu papel no processo de esporulação não é conhecido. Mesmo
cepas chamadas “não-enterotoxigênicas” produzem pequena quantidade de enterotoxina, mas
essa quantidade é insuficiente para causar a doença. Acredita-se que este fenômeno ocorre
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porque o calor provoque, em nível genérico, alterações no sistema regulador de produção de
toxina.
A enterotoxina é formada durante o processo de esporulação. A esporulação de
C.perfringens pode ocorrer excepcionalmente no alimento, mas este fenômeno ocorre
principalmente no intestino. Entretanto, é pouco provável que a toxina pré-formada em um
alimento venha a causar intoxicação, uma vez que grandes quantidades de toxina (8 a 10 mg)
são necessárias para o desenvolvimento dos sintomas. Além disso, a enterotoxina não resite
ao pH ácido do trato digestivo, nem à ação de enzimas digestivas. Desta forma, a intoxicação
alimentar ocorre pela ingestão de alimentos contendo números elevados de células viáveis de
C.perfringens, que esporulam no intestino delgado, liberando a enterotoxina durante este
processo.
A enterotoxina produzida por C.perfringens, após ativação pela tripsina, liga-se aos
receptores localizados no bordo em escova da célula epitelial intestinal. A toxina, uma vez
ligada ao recptor, interage com a membrana causando o surgimento de poros pelos quais
extravasa o conteúdo celular, resultando em diarréia. Há grande eliminação de sódio e
potássio, e a absorção de glicose é inibida. A toxina é termolábil, sendo destruída pelo
aquecimento a 60o.C por 10 minutos.
Epidemiologia
C.perfringens faz parte da microbiota do solo especialmente as cepas do tipo A, sendo
também comum no conteúdo intestinal do homem e de muitos animais. Sua ampla
distribuição na natureza é devida aos esporos que C.perfringens produz, altamente resistentes
ás condições ambiente (oxigênio, etc..).
Esse microrganismo é facilmente isolado dos alimentos, tanto crus quanto
processados, e seu envolvimento em casos de doenças de origem alimentar é bastante grande.
Em muitos países, C.perfringens é o agente etiológico mais freqüentemente isolado em surtos
desta natureza. Uma carateristica curiosa destes surtos é que na meioria dos casos relatados o
número de indivíduos efetados é alto. Isto certamente é devido ao fato de os surtos por
C.perfringens serem causados pelo consumo de alimentos preparados em grandes quantidades
e consumidos várias horas após. Neste período, o microrganismo se multiplica nos alimentos
quando mantidos em temperatura inadequada (em estufas ou temperatura ambiente), em vez
de serem refrigerados. Mesmo quando refrigerados, o frio pode demorar a alcançar o interior
dos produtos, devido ao seu grande volume e a multiplicação existe. Nestes casos, há intensa
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atividade metabólica e aumento da velocidade de multiplicação, a população de
C.perfringens, nestas condições, eleva-se rapidamente para 105-106 células ou mais por grama
de produto, necessárias para causar doenças no homem.
Alimentos á base de carne bovina e de carne de frango têm sido os principais
causadores de intoxicação alimentar por C.perfringens. A maioria dos surtos relatados é
associada á alimentação em estabelecimentos institucionais (restaurante, hospitais, fábricas,
escolas, etc.)
Medidas de controle
A temperatura de 60o.C inativas rapidamente as células vegetativas de C. perfringens,
a resistência térmica dos esporos varia de cepa para cepa. Em geral, existem dois tipos de
esporos: os termorresistentes, com D
termosensíveis, com D
90
90
O
C entre 15 e 145 minutos e z de 9 a 16o.C, e os
O
C de três a cinco minutos e z de 6 a 8o.C. os esporos da classe
termorresistente requerem um choque térmico de 75-100o.C por 5 a 20 minutos para
germinarem mais facilmente. As razões para essa diferença na resistência térmica ainda não
estão suficientemente explicadas, os esporos de ambas as classes sobrevivem ao cozimento de
alimentos e podem ter sua germinação estimulada pelo aquecimento.
3.4
Microrganismos que oferecem um risco direto Moderado e com
Difusão potencialmente extensa
São capazes de causar processos patológicos mesmos em números reduzidos; possuem
facilidade de se difundirem pelos alimentos a partir de um produto contaminado, fazem parte
deste grupo bactérias potencialmente patogênicas, como shigella, Vibrio parahaemolyticus,
Vibrio vulnificus e salmonella spp, também a E.coli enteropatogênica.
3.5
Microrgansimos que oferecem Risco Direto e Grave
São altamente patogênicos, cuja presença é inaceitável em alimentos para consumo
humano, exemplo: Clostridium botulinum, C.perfrigens tipo C, Vibrio cholerae e Salmonella
typhi.

Salmonella
Este gênero compreende numerosas espécies, entre as quais as mais responsáveis por
infecções como a S.typhi, S.typhimurium, S.enteritis, S .panamá, S. newport, etc. Dentre as
enfermidades de origem alimentar, a Salmonella tem sido apontada como a responsável pela
maioria dos surtos onde o agente etiológico foi detectado. A incidência real é desconhecida,
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uma vez que pequenos surtos freqüentemente não são relatados. Todas as espécies e estirpes
de salmonela freqüentemente não são relatados. Todas as espécies e estirpes de salmonela
presumidamente podem ser patogênicas para o homem, e os sintomas da doença bem como a
gravidade varia de acordo com o tipo.
As salmonelas chegam ao alimento por diversas fontes, fezes humans e animais, águas
poluídas, manipuladores portadores assintomáticos, e a partir daí são transferidas do alimento
cru, para os alimentos cozidos, mãos, utensílios e superfícies. Em relação ao manipulador
portador, este se caracteriza por excretar microrganismos por tempo indeterminado, com
pouca ou nenhuma evidência da doença, a possibilidade da contaminação dos alimentos por
manipuladores infectados não deve ser ignorada, apesar de alguns autores atribuírem 2% da
causa de surtos por contaminação de portadores assintomáticos, outros autores atribuem 15,5
à 63%.
Características do microrganismo
O gênero Salmonella pertence à família Enterobacteriaceae e compreende bacilos
gram negativos não produtores de esporos. São anaeróbios facultativos, produzem gás a paritr
de glicose (exceto S. typhi) e são capazes de utilizar o citrato como única fonte de carbono. A
maioria é móvel, através de flagelos peritríquios, exceção feita à S.pullorum e à S.gallinarum,
que são imóveis.
A taxonomia do gênero Salmonella é baseada na composição de seus antígenos de
superfície, que são os antígenos somáticos (O), os flagelares (H) e os capsulares (KauffmannWhite). Algumas salmonelas não têm antígeno O, e quando cultivadas em meio sólido
formam colônias de aspecto irregular (colônias rugosas); não podem, portanto, ser
sorotipadas, recebendo a denominação “não-tipáveis”.
Os antígenos O e Vi são termorresistentes, não sendo destruídos pelo aquecimento a
100o.C por duas horas. Os antígenos H são termolábeis. Para determinação de sorotipo de
uma Salmonella,
os antígenos H que recobrem a célula precisam ser eliminados pelo
aquecimento. Existem várias formas de classificação de Salmonella, o que torna bastante
confusa a sua compreensão. As publicações mais importantes na área de microbiologia de
alimentos continuam adotando o esquema de Kauffmann e White, razão pela qual este
esquema é também aqui adotado.
Outro esquema de classificação de Salmonella,
proposto por Edwards e Ewing,
reconhece apenas três espécies: S.typhi, S.cholerasuis e S.enteritidis. Esta última espécie
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abriga todas as demais salmonelas, que são consideradas sorotipos se uma mesma espécie
(por exemplo: Salmonella enteritidis sorotipo typhimurium).
O esquema de lê Minor, por suas vez, considera que o gênero Salmonella é formado
por apenas uma espécie (S.entérica), com sete subespécies (choleraesuis, salamae, arizonae,
diarzonae, houtanae, bongori e indica).
A subespecie
choleraesuis
contém todos os
sorotipos da classificação de edwards e ewing. Desta forma, um exemplo de grafia correta de
acordo com este esquema é: salmonella entérica sbsp. Choleraesuis sotipo typhimurium,
sendo, no entanto, comum observar que as salmonelas são grafadas de forma simplificada,
citando-se apenas o gênero e o sorotipo (Salmonella typhimurium). Mais recentemente,
Reeves e Cols, propuseram que a subespecie bongori fosse considerada uma espécie de
Salmonella.
Devido a dificuldade de se classificar as salmonelas somente pelos antígenos de
superfície que apresentam, outras formas de classificação têm sido propostas e empregadas.
As mais importantes são a biotipagem, baseada em reações bioquímicas, a fagotipagem ,
baseada na sensibilidade a bacteriófagos específicos, e o perfil plasmidal, no qual as
salmonelas são classificadas de acordo com os plasmídios (segmentos de ácido
deoxirribonucleico extracromossômico) que contém. Essas formas alternativas de
classificação são indispensáveis em estudos epidemiológicos.
O pH ótimo para multiplicação das salmonelas fica próximo de 7,0, sendo que valores
superiores a 9,0 e inferiores a 4,0 são bactericidas. Dependendo da natureza do ácido utilizado
para a acidificação, o pH mínimo pode subir para 5,5. O ácido acético, o ácido propiônico e o
ácido butírico são mais inibitórios que o ácido clorídrico, para um mesmo pH. As salmonelas
não toleram concentrações de sal superiores a 9%. O nitrato é inibitório e seu efeito é
acentuado pelo pH ácido. Revelam pouca exigência em nutrientes disponíveis, e são fracas
competidoras na presença de outras bactérias, principalmente as lácticas.
Temperatura ideal para multiplicação e Salmonella é 35-37o.C, sendo a mínima de
5o.C e a máxima 47o.C. Vários estudos indicam, no entanto, que valores máximo e mínimo
dependem do sorotipo.
Caracterísitcas da doença
As doenças causadas por Salmonella costumam ser subdividdidas em três grupos: a
febre tifóide, causada por Salmonella tbyphi, as febres entéricas, causadas por Salmonella
paratyphi (A, B e C) e as enterocolites (ou salmoneloses), causadas pelas demais salmonelas.
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A febre tifóide só acomete o homem, e normalmente é transmitida por água e
alimentos contaminados com material fecal humano. Os sintomas são muito graves e incluem
septicemia (multiplicação de salmonella no sangue), febre alta, diarréia e vômitos. A infecção
se inicia com a penetração nas células epiteliais intestinais, invasão da lâmina própria
(camada logo abaixo á camada epitelial), e entrada na corrente linfática. Os microrganismos
são, então, fagocitados por células de defesa chamadas macrófagos, com a liberação de
inúmeras bactérias na corrente circulatória, através da qual podem atingir diversos órgãos,
como o fígado, baço e vesícula biliar, até estabelecer uma infecção sistêmica. Enquanto está
no interior dos macrófagos, S. typhi não é destruída por antibióticos, razão pela qual a
antibioticoterapia nem sempre é eficiente em um único tratamento.
O reservatório de S.typhi é o homem. Algumas pessoas se tornam portadoras durante
muito tempo, memo após a eleiminação dos sintomas.Esses portadores costumam ser a
principal fonte de contaminação de água e alimentos com S. typhi. Alguns casos de febre
tifóide foram associados ao consumo de leite cru, mariscos e vegetais crus.
As febres entéricas são bastante semelhantes á febre tifóide, mas os sintomas clínicos
são mais brandos. Geralmente ocorrem, septicemia, febre, vômitos e diarréia. Enquanto a
febre tifóide pode durar de uma a oito semanas, as febres entéricas duram, no máximo três
semanas. Estas doenças também podem ser causadas por consumo de água e alimentos,
especialmente leite crú, vegetais crus, mariscos e ovos.
A febre tifóide e as febres entéricas são normalmente tratadas com cloranfenicol ou
ampicilina.
As salmonelas caracterizam-se por sintomas, que incluem diarréia, febre dores
abdominais e vômitos. Os intomas aparecem em média, 12 a 36 horas após o contato com o
microrganismo, durando entre um a quatro dias. De modo geral, as enterocolites por
Salmonella não necesitam de tratamento com antibióticos. Em alguns casos, a
antibioticoterapia agrava o quadro clínico e pode prolongar o estado de portador. Nas crianças
pequenas e recém nascidos, a salmonelose pode ser bastante grave, já que a Salmonella
podem atingir a corrente circulatória e provocar lesões em outros órgãos. No adulto algumas
patologias, quando presentes, podem agravar a doenças. Por exemplo, a salmonelose em um
indivíduo com esquistossomose se caracteriza por bacteremica (circulação do microrganismo
pelo sangue), febre de evolução prolongada, anemia e esplenomegalia. Indivíduos aidéticos
ou com outras deficiências imunológicas podem ter salmoneloses muito graves. Existem
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relatos de meningites (principalmente em crianças), osteomielites e problemas renais
decorrentes de infecções por Salmonella.
Em todos casos, a antibioticoterapia é
indispensável.
Nos animais, as manifestações clínicas são bastante semelhantes. No gado bovino, a
doença é caracterizada por febre, fezes diarréicas, anorexia, depressão e redução na produção
de leite. Animais infectados podem excretar elevados números de Salmonella nas fezes e
também no leite e no sangue. Os suínos são particularmente susceptível às infecções por
S.cholerasuis e S.typhimurium. Os sintomas clínicos não se limitam a enterocolite, mas
freqüentemente evoluem para septicemia, com elevados índices de mortalidade. Também as
aves, principalmente jovens, são suscetíveis ás infecções por salmonella,
sendo este
microrganismo responsável por grande perda de animais em granjas.
Mecanismos de patogenicidade
Diversos estudos têm demonstrado que as salmonelas apresentam simultaneamente
múltiplos fatores de virulência quando causam doença no homem. Estes fatores podem agir
sinergisticamente ou individualmente.
As infecções começam na mucosa do intestino deslgado e do cólon. As salmonelas
atravessam a camada epitelial intestinal, alcançam a lâmina própria (camada na qual as
células epiteliais estão ancoradas), onde proliferam. As salmoneloses são fagocitadas pelos
monócitos e macrófagos, resultando em resposta inflamatória, decorrente da hiperatividade do
sistema reticuloendotelial. Ao contrário do que ocorre na febre tifóide e nas febres entéricas,
nas enterocolites a penetração se Salmonella fica limitada à lâmina própria. Nestes casos,
raramente se observa septicemia ou infecção sistêmica, ficando a infecção restrita a mucose
intestinal. A resposta inflamatória está relacionada também com a liberação de
prostaglandinas, que são estimuladoras de adenilciclase, o que resulta em um aumento de
secreção de água e eletrólitos, provocando diarréia aquosa.
Nos últimos anos, diversos trabalhos têm sido conduzidos para se verificar a
capacidade de Salmonella produzir toxinas (citotoxinas e enterotoxinas), além das
endotoxinas conhecidas há muito tempo. O papel das endotoxinas como agentes causadores
de diarréia através do acúmulo de fluidos na luz intestinal tem sido bastante questionado.
Os resultados referentes ás investigações sobre a existência de uma enterotoxina são
bastante controvertidos. Acredita-se que o processo diarréico manifesta-se á custa de uma
toxina de natureza protéica, semelhante à toxina colérica.
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Uma citotoxina, inibidora de síntese protéica em células eucarióticas, parece também
estar associada ao processo infeccioso.
Antigamente, acredita-se que para que um indivíduo adquirisse uma salmonelose de
origem alimentar era necessára a ingestão de um número elevado (>108) células viáveis de
Salmonella no alimento. Vários estudos, no entanto, têm demonstrado que diversos fatores
podem alterar esse valor. O estabelecimento dos sintomas de salmonelose, bem como a sua
gravidade, dependem do sorotipo de Salmonella envolvido, da competência dos sistemas de
defesa inespecíficos e específicos do indivíduo afetado e das características do alimento
envolvido. Assim por exemplo, em alimentos com elevado teor de lipídeos, as salmonelas
ficam “protegidas” dentro dos glóbulos de gordura, não sendo afetadas pelas enzimas
digestivas ou pela acidez gástrica. Nestes casos, doses infectantes de até 50 células por grama
podem ser desencadeadoras de doença. Entre alimentos dessa natureza destaca-se o chocolate
em barra, envolvido em diversos surtos.
Epidemilogia
Atualmente, Salmonella é um dos microrganismos mais freqüentemente envolvidos
em casos e surtos de doenças de origem alimentar em diversos paises inclusive Brasil. Na
Inglaterra e paises vizinhos, 90% dos casos são causados por Salmonella. Dados recentes
publicados nos Estados Unidos, Canadá e Japão indicam que os relatos de ocorrência de
salmonelose de origem alimentar aumentam a cada ano. Nesses paises, e também no Brasil,
S.typhimurium é o sorotipo mais comumente encontrado nos alimentos. A distribuição
geografica dos demais sorotipos parece ser variável. Assim, certos sorotipos como S.
typhimurium e S. enteritidis não têm distribuição geográfica definida, sendo isolados com
freqüência semelhante dos diferentes países. Entretanto, outros sorotipos têm distribuição
regional mais restrita: S.derby é muito comum no México, mas é raro nos Estados Unidos,
S.panamá
tem grande importância na Europa e S.weltewreden
na Asia. S.virchov é
freqüentemente isolado de humanos no Reino unido e na ex-união soviética. Em um grande
estudo realizado com 1,5 milhão de cepas de Salmonella, isoladas de material humano entre
os anos de 1934 e 1975, em 109 países, verificou-se que os sorotipos mais freqüentes eram S.
typhimurium, S. enteritidis, S. infantis e S. heidelberg.
No Brasil, levantamento recém
concluído indicou que S.typhimurium, S.agona, S.antum e S.oraniemburg são os quatro
sorotipos mais freqüentemente encontrados no homem, em alimentos e amostras ambientais.
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Uma faceta interessante da epidemilogia de Salmonella é o surgimento e subseqüente
desaparecimento de alguns sorotipos em determinadas localidades. Entre os vários casos
relatados na literatura, destaca-se o caso do sorotipo S.hadar, detectado pela primeira vez em
1954 em Israel. Depois desse isolamento, esse sorotipo passou a ser comum na Inglaterra,
tanto em material clínico humano quanto em carne de aves, passando a ser isolado também na
França, Canadá e Estados Unidos. Após um período de ocorrência elevada (1975-1979), a
frequencia de S. hadar na Inglaterra diminuiu bastante, mas é o quinto sorotipo comum no
Canadá. Outro exmplo é a S. eastbourne, raramente isolada nos Estados Unidos e Canadá
antes de 1973. Neste ano ocorreu um grande surto internacional encolvendo chocolates
contaminados com S. eastbourne. Após este surto, o sorotipo praticamente desapareceu.
As salmonelas são amplamente distribuídas na natureza, sendo o trato intestinal do
homem e de animais o principal reservatório natural. Entre os animais as aves (galinhas,
perus, patos, gansos) são o reservatório mais importante. Suínos, bovinos, eqüinos e animais
silvestres (roedores, anfíbios e répteis) também apresentam salmonelas. Os animais
domésticos (cães, gatos, pássaros, etc.) podem ser portadores de salmonelas, representando
grande risco, principalmente paa crianças. As aves têm um papel especialmente importante,
pois podem ser portadores assintomáticos, excretando continuamente salmonelas pelas fezes
animais nessas condições podem causar contaminações cruzadas de grande importância nos
abatedouros de aves.
Inúmeros surtos de toxinfecção alimentar causados por Salmonella são conhecidos,
envolvendo os mais variados tipos de alimentos. Verifica-se, no entanto, que carne de aves e
outros tipos de carne são os mais freqüentemente envolvidos. Salmonelose associada a
laticínios é quase sempre, causada por: leite crú ou inadequeadamente pasteurizado e também
queijo. Quanto a produtos derivados de ovos, os mais freqüentemente envolvidos em surtos
são as saladas á base de ovos, sorvetes e outras sobremesas de fabricação caseira. A maioria
dos relatos de surtos causados por S. enteridis, estão associados ao consumo de alimentos a
base de ovos crus, ou insuficientemente cozidos e carne de aves.
Nos últimos anos tem se observado um aumento na incidência de salmonelose causada
por S. enteritidis,
envolvendo ovos e produtos à base de ovos. Este sorotipo tem a
peculiaridade de colonizar o canal ovopositor das galinhas, o que causa a contaminação da
gema durante a formação do ovo. A infecção dos ovos se dá mais pela contaminação com
fezes e penetração via casca durante a postura do que pela transovariana.
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Hábitos alimentares podem influenciar consideravelmente a epidemiologia das
salmonelose. Assim, no Iraque, é comum salmonelose humana causada por leite de ovelha e
de búfala que são consumidos após ligeiro aquecimento e conservação em temperatura
ambiente. Em países do Oriente Médio, os produtos preparados com gergelim são
freqüentemente envolvidos. O consumo de vísceras de animais em determinados países
(China, África do Sul, Israel) tem causado vários surtos de salmonelose.
Recentemente foram relatados alguns episódios de salmonelose de origem alimentar
associados a viagens aéreas internacionais. Preparação e armazenamento de grandes
quantidades de alimentos em cozinhas de aeronaves, manuseio excessivo, controle
inadequado de temperatura das câmaras de conservação dos alimentos prontos para consumo
são condições favoráveis para a multiplicação de salmonelas.
As salmoneloses de origem alimentar podem estar limitadas a um único indivíduo ou a
um pequeno grupo de indivíduos relacionados, como podem também estar associadas a surtos
de grandes proporções, envolvendo milhares de pessoas. É importante lembrar que os animais
podem ser afetados por Salmonella, resultando em grandes prejuízos para os criadores. Nesse
caso, destacam-se as infecções por S. Dublin no gado bovino, por S.pullorum e S. gallinarum
nas aves, S. abortus-bovis no gado bovino e S.cholerae-suis nos suínos.
Medidas de controle
O calor é uma forma eficiente para a destruição de salmonelas nos alimentos.
/algumas salmonelas são mais resistentes que outras ao calor (por ex.: S.seftenberg 775W é
10 a 20 vezes mais resistente que uma salmonela comum). A composição do alimento onde a
salmonela está é extremamente importante. A presença de sacarose, por exemplo, pode dobrar
a resistência térmica de S.typhimurium. A presença de água é também importante em
ambiente seco. A diferença pode ser bastante grande: experimentos conduzidos com ovos
desidratados e ovos inteiros indicam que a resistência térmica nos ovos desidratados pode ser
de até 60 vezes maior do que nos ovos líquidos.
Uma forma interessante para o controle de Salmonella em produtos á base de carne de
aves é a chamada exclusão competitiva. Neste processo, impede-se que a Salmonella colonize
o trato gastrintestinal das aves ainda na fase inicial de suas vidas. Os animais recém nascidos
são submetidos a um tratamento com culturas microbianas mistas contendo bactérias inócuas,
que vão ocupar os sítios de adesão das salmonelas, excluindo-as da flora intestinal dos
animais. Desta forma, reduz-se consideravelmente a presença de salmonelas em uma granja,
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resultando em menor índice de contaminação nos animais ali produzidos. Este processo vem
sendo utilizado com grande sucesso em diversos países europeus.

Shigella
Características do Microrganismo
Bactérias do gênero Shigella são bacilos Gram(-), não formadores de esporos,
pertencentes à família enterobacteriaceae.Este gênero é constituido por quadro espécies.
Cada uma delas possui distintos sorogrupos: S.dysenteriae (sorogrupo A), S. flexneri (soro
grupo B), boydii (sorogrupo C) e S. sonnei (sorogrupo D). Estudos com DNA, no entanto,
revelam que as quatro espécies estão intimamente realcionadas com E.coli. A diferença
marcante entre elas, e que as shigelas causam disenteria, enquanto que o mesmo não ocorre
com a maioria das capas de E.coli.
A temperatura ótima de crescimento é 37o.C, mas cresce na faixa de 10o.C a 40o.C.
toleram concentrações de sal de 5% a 6% e são realtivamente sensíveis ao calor. São
microrganismos adaptados ao homem e primatas. Adoença é diseminada através da via fecaloral, mas algumas vezes o alimento e a água entram nesta rota.
Características da doença
Shigella spp causa uma doença denominada disenteria, um tipo de diarréia na qual as
fezes apresentam sangue e muco.
O período de incubação da doença é de um a sete dias, geralmente inferior a quatro
dias. O número de microrganismos necessários para causar a infecção assintomática ou fraca,
sem febre, até uma disenteria fulminante caracteriza-se por fezes muco-sanguinolentas, com o
paciente apresentando fezes, desidratação, tenesmos, toxemia, e até convulsões em crianças
com menos de quatro anos.
Epidemiologia
Apesar da maioria dos casos de shigelose ser disseminada através da transmissão
pessoa a pessoa, já foram relatados muitos surtos de infecção ocasionados pela ingestão de
alimentos ou água contaminados. Esta contaminação, no entanto, é sempre em virtude da
presença de fezes humanas provenientes, geralmente, das mãos de um indivíduo
assintomático ou com a doença em forma branda, não diagnosticada.
No Brasil as shigelas são os principais agentes de enterocolite, sendo S.flexneri e S.
sonnei isolados mais freqüentemente.
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A shigelose está sempre associada à higiene pessoal e condições sanitárias deficientes.
As instituições para doentes mentais, comunidades urbanas de baixas condições sócioeconômicas e creches infantis são considerados locais de alto risco.
Mecanismo de patogenicidade
As células de Shigela spp, além de aderir às células epiteliais da mucosa do intestino
grosso, mais especificamente, do íleo terminal; e cólon, atuam invadindo e multiplicando-se
no interior dessas células, destruindo-as durante o processo. Shigella dysenteriae produz uma
toxina: a toxina de Shiga, que apresenta várias atividades tóxicas, embora esta toxina possa
contribuir, de alguma forma, para danificar a mucosa intestinal, seu principal papel parece
estar relacionado a síndrome de uremia hemolítica (HUS) decorrente da complicação da
shigelose. Nesta síndrome ocorre a falência renal que algumas vezes se desenvolve em
crianças, poucos dias após um ataque de desinteria, podendo ser fatal.
Medidas de controle
As medidas de controle e prevenção de shigelose de
origem alimentar estão
relacionadas com a boa higiene pessoal e educação dos manipuladores de alimento. A
contaminação de alimentos ou água com Shigella spp indica contaminação recente com fezes
humanas, devido a fragilidade desses microorganismos.

Escherichia coli patogênicas
Com base nos fatores de virulência, manifestações clínicas e epidemiologia, as
linhagens de E. coli consideradas patogênicas são, atualmente, agrupadas em cinco classes:
1a.) EPEC (E. coli enteropatogênica clássica)
2a.) EIEC (E. coli enteroinvasora)
3a.) ETEC (E. coli enterotoxigênica)
4a.) EHEC (E. coli entero-hemorrágica)
5a.) EaggEC (E. coli enteroagregativa)
Alguns livros importantes de Microbiologia de alimentos mencionam também uma
outra linhagem denominada FEEC (E.coli facultativamente patogênica), aparentemente
associada a surtos esporádicos de diarréia. A existência desses patógenos, no entanto, não foi
ainda aprovada, razão pela qual não foram aqui incluídos.
1a.) EPEC (E. coli enteropatogênica clássica)
EPEC é conhecido há muitas décadas como um importante microrganismo causador
de gastrenterite em crianças.
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Os recém nascidos e os lactentes jovens são os mais susceptíveis á infecção por EPEC.
A diarréia provocada por EPEC é clinicamente, mais grave do que aquelas provocadas
por outros patógenos. A diarréia é geralmente, acompanhada de dores abdominais, vômitos e
febre. A duração da doença varia de seis horas a três dias (média de 24 horas), com período de
incubação variando entre 17 e 72 horas (média de 36 horas).
Atualmente, em países desenvolvidos, EPEC é isolada em surtos esporádicos e com
freqüência muito baixa em casos de diarréia endêmica. Entretanto, em países menos
desenvolvidos, principalmente naqueles localizados em zona tropical, EPEC está entre os
principais agentes enteropatogênicos, em especial na diarréia do lactente, com índices de
mortalidade bastante altos. No Brasil, EPEC é responsável por cerca de 30% dos casos de
diarréia água em crianças pobres com idade inferior a seis meses, com predominância dos
sorotipos O111:[H], O111:[H2]; O119:H6 e O55:H6. Entretanto, crianças com idade superior
a um ano raramente são afetadas. Estudos recentes têm demonstrado que infecções por EPEC
podem estar associadas com diarréia crônica.
Nos anos 60-70, diversos surtos causados pelo consumo de água e/ou alimentos
contendo EPEC foram registrados, em diversas partes do mundo. Esses surtos estavam
associados com cepas pertencentes principalmente aos sorogrupos O86 e O111, envolvendo
tanto crianças quanto adultos.
2a.) EIEC (E. coli enteroinvasora)
As cepas de EIEC são capazes de penetrar em células epiteliais e causar manifestações
clínicas semelhantes às infecções causadas por Shigella.
A maioria das cepas de EIEC apresenta diversas características bioquímicas que as
tornam diferentes das demais cepas de E. coli, mas as tornan bastante semelhantes à Shigella.
Entre essas características especiais stão a incapacidade de descarboxilar a lisina, a não
fermentação ou fermentação tardia da lactose e ausência de flagelos.
A gastrenterite provocada por EIEC é bastante semelhante áquela provocada por
Shigella. Os sintomas característicos da doença são: disenteria, cólica abdominal, febre e mal
estar geral, com eliminação de sangue e muco com fezes, o período de incubação varia entre
oito e 24 horas (média de 11 horas). Estudos realizados com voluntários adultos indicam que
a dose de infecção é alta (106 a 108 células).
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EIEC acomete mais comumente crianças maiores, e adultos, mas o seu isolamento de
pacientes com diarréia não é freqüente.
Alguns estudos têm apontado surtos relacionados com a ingestão de água e/ou
alimentos contaminados com EIEC, envolvendo principalmente o sorogrupo O124.
Entretanto, acredita-se que a via de transmissão mais comum seja o contato interpessoal.
3a.) ETEC (E. coli enterotoxigênica)
A esse grupo de E.coli
pertencem àquelas cepas que são capazes de produzir
enterotoxinas. Normalmente um número limitado de sorotipos de E. coli é associado com
regularidade a casos de diarréia por ETEC. Esporadicamente, outros sorotipos podem estar
envolvidos também.
A doença provocada por ETEC caracteriza-se pela diarréia aquosa, normalmente
acompanhada de febre baixa, dores abdominais e náuseas. Em sua forma mais severa, essa
doença assemelha-se bastante à cólera: fezes aquosas (“água de arroz”) que levam á
desitratação. O período de incubação varia de oito a 44 horas (média 26h). A dose de infecção
também é alta (106 a 108 células).
Em indivíduos desnutridos, a gastrenterite pode durar várias semanas, levando a um
quadro de desidratação grave. Entretanto, em casos de “diarréia do viajante”, a doença pode
ser leve, e normalmente é autolimitada, não sendo necessária nenhuma intervenção médica.
As bactérias pertencentes a esse grupo são importantes causas de diarréia em países
subdesenvolvidos. Nas regiões endêmicas, onde as condições de saneamento são precárias,
principalmente nos trópicos, a doença atinge pessoas de todas as faixas etárias. Além disso,
ETEC é considerada um dos principais agentes etiológicos da chamda “diarréia do viajante”,
acometendo indivíduos que se locomovem nas áreas desenvolvidas para regiões com
problemas de saneamento básico. Nos Estados Unidos e na Europa, ETEC raramente é
isolada em casos de diarréia esporádica, embora ocasionalmente surtos tenham sido
registrados. Esses surtos ocorrem devido ao consumo de água ou de alimentos contaminados
com ETEC. ETEC pode produzir uma toxina termolábil (LT) e/ou uma enterotoxina
termoestável (ST). A toxina termolábil é inativada por um aquecimento a 60o.C por 30
minutos e a toxina termoestável suporta 100o.C por até 30 minutos.
4a.) EHEC (E. coli entero-hemorrágica)
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A designação de EHEC tem algumas propriedades que as diferenciam das demais
cepas de Escherichia coli: não são capazes de utilizar sorbitol, são -glucuronidase negativas
e têm dificuldades de se multiplicar ou não se multiplicam nas temperaturas normalmente
empregadas para pesquisa de E. coli em alimentos (44,5o.C / 45,5o C).
A colite hemorrágica é caracterizada clinicamente por dores abdominais severas e
diarréia aguda, seguida de diarréia sanguinolenta, diferindo das manifestações clínicas
causadas por outros agentes invasores, pela grande quantidade de sangue nas fezes e ausência
de febre. O período de incubação varia de três a nove dias, com média de quatro dias. A
duração da doença varia de dois a nove dias. A enterocolite pode evoluir para uma doença
grave chamda síndrome urêmica hemolítica (HUS).
O mecanismo de patogenicidade está relacionado com a produção de citotoxinas.
Embora a E. coli do sorotipo O157:H7 seja a mais estudada, cepas de E coli pertencentes a
diversos outros sorotipos já foram descritas como produtoras de citotoxinas.
O gado é um reservatório natural de EHEC, razão pela qual os alimentos de origem
animal, principalmente a carne bovina, parecem ser o principal veículo desse patógeno.
Diversos surtos de colite hemorrágica ocorrida nos Estados Unidos, Canadá e Japão foram
claramente associados com o consumo de hambúrgueres. Por isso, a síndrome provocada por
EHEC tem recebido a denominação de “doença do hambúrguer”.
5a.) EaggEC (E. coli enteroagregativa)
Escherichia coli enteroagregativa é uma linhagem patogênica recentemente descrita,
sendo poucos os dados disponíveis a respeito desses microorganismos. As cepas de EaggEC
parecem estar associadas com casos crônicos de diarréia. Sua ocorrência em alimentos ou em
casos de surtos de origem alimentar ainda não foi relatada.

Clostridium botulinum
Características do microrganismo
São bacilos Gram (+), apresentam flagelos peritríqueos e são formadores de esporos.
Os esporos são ovais, o esporângio e dilatado e geralmente subterminal. São aneróbios
estritos, capazes de produzir toxinas, de natureza protéica, sendo conhecidas as toxinas A, B,
C1,C2, D, E, F e G.
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Os tipos A, B, E e F são causadores de botulismo no homem. Os tipos patogênicos
para animais são predominantemente C e D, embora os tipos A, B e E possam estar
envolvidos também. O tipo G ainda é pouco conhecido, não tendo sido associado com
doença até o momento.
As cepas de C.botulinum são classificadas em quatro grupos, desginados I., II, II e IV,
de acordo com o tipo de toxina que produzem e a atividade sobre proteínas e açúcares. Ao
grupo I pertencem as cepas produtoras de neurotoxina do tipo A e as cepas proteolíticas
produtoras de toxinas B e F; no grupo II estão as cepas que produzem toxina tipo E e as cepas
não proteolíticas produtoras de toxinas B e F; o grupo III compreende as cepas produtorras de
toxinas C e D e o grupo IV aquelas produtoras de toxina G. As cepass do tipo A são
uniformemente proteolíticas, cepas do tipo E são não-proteolíticas, cepas do tipo C e D são
fracamente ou não proteolíticas e as cepas do tipo G são fracamente proteolíticas. As cepas
do tipo B e F podem ser proteolíticas e não-proteolíticas.
Os limites mínimos de temperatura de multiplicação do C.botulinum são 10o.C para as
cepas do grupo I e 3,5o.C para as cepas do grupo II, e os limites máximos são 45-50o.C e 4045o.C para os grupos I e II, respectivamente.
O pH mínimo para multiplicação das cepas do grupo I varia entre 4,6 e 4,8, e para os
demais grupos é de 5,0. Limites máximos de pH estão em torno de 8-9.
A concentração salina é um dos fatores importantes no controle o botulismo. Em
alimentos nos quais o sal (NaCl) é o principal redutor de Aa, a Aa mínima para multiplicação
do C. botulinum é 0,94 e 0,97 para as cepas dos grupos I e II, respectivamente. Quando o sal
é substituído por glicerol, estes valores diminuem para 0,91 e 0,94 respectivamente.
Com relação ao potencial de óxido-redução, limites máximos de Eh tanto para cepas
proteolíticas quanto não-proteolíticas estão em torno de –200mv. Alimentos com Eh superior
a este valor não permitem a multiplicação e a produção de toxina de C.botulinum.
Características da doença
O termo botulismo, utilizado para designar a intoxicação pelo C. botulinum, provém
de botulus, que significa salsicha em latim, devido ao envolvimento deste alimento nos
primeiros casos de botulismo cientificamente comprovados, ocorridos na Europa Central no
final do século passado.
Atualmente, três formas de botulismo são conhecidas: botulismo clássico,
correspondente à intoxicação causada pela ingestão de alimentos contendo neurotoxinas;
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botulismo de lesões (would botulism), que é uma doença infecciosa causada pela proliferação
e consequente liberação de toxinas em lesões infectadas com C. botulinum, e o botulismo
infantil, que é também uma doença infecciosa causada pela ingestão de esporos de C.
botulinum e subseqüente germinação, multiplicação e toxigênese no intestino de crianças pela
sintomatologia de botulismo, as três formas dessa doença são clinicamente muito
semelhantes.
O botulismo de origem alimentar tem um período de incubação que, em geral, varia de
12 a 36 horas, dependendo da quantidade de toxina ingerida. A doença inicia-se às vezes com
problemas gastrintestinais como náuseas, vômitos e diarréia, mas estes efeitos não são
causados pela neurotoxina, já que inexistem nos casos de botulismo de lesões e de botulismo
infantil. Às vezes, a diarréia ocorre nos primeiros estágios da doença, e, em seguida, é
substituída pela constipação intestinal.
O início da ação da neurotoxina botulínica provoca fadiga e fraqueza muscular. Estes
sintomas são acompanhados por problemas de visão, tais como queda das pálpebras, resposta
alterada de pupila à luz e visão dupla. Secura da boca, dificuldade de deglutição e de controle
da língua são sintomas característicos. A musculatura que controla a respiração é
progressivamente paralisada, podendo provocar a morte em três a cinco dias por parada
respiratória.
O tratamento dos indivíduos afetados envolve a soroterapia, na qual se neutraliza a
toxina com anti-soro, e a remoção da toxina do estômago ou do intestino através de lavagens
ou da ingestão de substâncias eméticas ou catárticas. Paralelamente, á necessário o
restabelecimento da função respiratória. A soroterapia é bastante eficiente nos primeiros
estágios da doença.
Mecanismos de patogenicidade.
O botulismo é uma intoxicação causada pela ingestão de toxinas pré-formadas nos
alimentos.
Atualmente, reconhece-se a existência de oito toxinas distintas, produzidas por C.
Botulinum, designadas A, B, C1, C2, D, E, F e G., todas de natureza protéica. De acordo com
o tamanho da sua molécula, as toxinas podem apresentar-se nas formas S (small),
M(médium), L (large) e LX (extralarge). A toxina M, mais comum em alimentos, é formada
por um componente tóxico, correspondente a um agregado de formas S, e por um componente
atóxico.
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Com exceção de toxina C2, as demais toxinas botulínicas apresentam ação
neurotóxica, através do bloqueio da liberação do neurotransmissor nas junções
neuromusculares. Tanto os sistemas colinérgicos e adrenérgicos são afetados, mas
concentrações mais elevadas de
toxina são necessárias para inibir a liberação
de
noradrenalina do que acetilcolina. O mecanismo neurotóxico compreende três etapas: ligação
da toxina aos sítios receptores na membrana pré-sináptica, mediada pela cadeia H;
internalização da toxina, e, finalmente, o bloqueio da liberação do neurotransmissor. Após a
internalização da toxina, não é mais possível bloquear seu efeito neurotóxico.
A toxina C2 é diferente das demais toxina, pois não apresenta a ligação covalente
entre as cadeias H e L, e não tem atividade neurotóxica. Seu efeito é mais citotóxico e se
expressa através da perda de proteínas plasmáticas para a luz intestinal e acúmulo de fluido
intestinal.
De modo geral, uma cepa de C. botulinum produz somente um tipo de toxina. A
produção de toxina ocorre durante a multiplicação bacteriana, mas apenas pequena quantidade
de toxina é liberada para o ambiente nesta fase. A liberação em massa ocorre quando se inicia
o processo e lise da célula bacteriana.
Algumas toxinas, especialmente aquelas produzidas por cepas não proteolíticas,
requerem ativação com proteases, tais como tripsina, para efetividade nos testes de
laboratório, ativação que ocorre naturalmente durante a passagem da toxina pelo estómago.
Epidemiologia
C. botulinum encontra-se amplamente destribuído pela natureza, sendo o solo e o
ambiente aquático seu habitat principal. Vários trabalhos realizados em diversos países
indicam que o número de esporos de C. botulinum no solo pode ser bastante elevado.
C. botulinum do tipo A é o mais freqüente no oeste dos Estados Unidos e em países da
América Latina, como Argentina e Brasil. Os do tipo B são comuns no leste dos Estados
Unidos e na Europa. Entretanto, as cepas americanas são do tipo proteolítico (grupo I) e as da
Europa são não-proteolíticas (grupo II). O tipo E parece ser exclusivo do ambiente aquático,
sendo comum no Japão, na Suécia e na antiga União Soviética. Os animais sadios têm um
importante papel na distribuição dos esporos e tanto vertebrados como invertebrados contém
C. botulinum no seu conteúdo intestinal.
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Os sedimentos aquáticos também contêm número elevado de esporos de C. botulinum
e, portanto, peixes apresentam um risco em potencial. Embora não se observe predominância
de algum tipo de C. botulimum no ambiente aquático, verifica-se que no pescado marinho o
tipo E é freqüentemente isolado em diversos países, inclusive no Brasil.
Surtos de botulismo têm sido descritos em vários países, mas acredita-se que sua
freqüência seja maior do que a relatada. No Canadá, Japão, Alasca, Irã e Escandinávia a
grande maioria dos surtos é causada por produtos marinhos contaminados com C. botulinum
do tipo E. Na Europa (Alemanha, França, Itália e Polônia), vários surtos já foram relatados
envolvendo produtos cárneos contaminados com C. botulinum do tipo B. Nos Estados
Unidos, os principais alimentos envolvidos em surtos de botulismo são as conservas vegetais
de preparação caseira, quase sempre envolvendo o C. botulinum do tipo A. Mel, contendo
elevado número de esporos de C. botulinum, esteve envolvido em diversos surtos de
botulismo infantil ocorridos nos Estados Unidos e Canadá. Vários casos foram relatados na
Argentina, causados por conservas vegetais caseiras contendo C. botulinum do tipo A. No
Brasil, já existem vários casos suficientemente comprovados e diversos trabalhos relatam
casos de botulismo animal.
Medidas de controle
Para que um alimento não seja o causador de botulismo é necessário impedir que a
neurotoxina botulínica venha a ser formada. Para tanto, é necessário impedir a germinação
dos esporos e a proliferação de células de C. botulinum, quando a toxina é formada.
A microbiota competitiva tem um papel protetor de extrema importância na inibição
da multiplicalçao e da produção de toxinas de C. botulinum. Alguns
microrganismos
fermentativos (bactérias láticas, por exemplo) produzem ácidos em quantidade suficiente
para impedir a multiplicação e outras substâncias inibitórias como bacteriocinas, água
oxigenada e antibióticos.
Os nitritos e os nitratos são conservadores químicos utilizados há muito tempo na
preparação da carne, e pode ser aumentada pela adição de ascorbato ou de isoascorbato. O
mecanismo de ação de nitrito ainda não está completamente elucidado, mas sabe-se que, além
de ser responsável pela coloração rosada característica dos produtos cárneos, o nitrito age no
controle de C. botulinum em alimentos.
Um alimento não causará botulismo se todas as células vegetativas e esporos de C.
botulinum forem destruídos. Esta destruição normalmente é obtida através de tratamento
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térmico elevado. Embora as células vegetativas apresentam baixa resistência térmica,
semelhante à de outros microrganismos patogênicos, os esporos de C. botulinum são bastante
resistentes ao calor. Esporos do grupo II são menos resistentes. Deve-se levar em conta que a
resistência térmica
é influenciada por uma série de fatores como pH, Aa, composições no
meio onde os esporos estão, estre outros.
As neurotoxinas de C. botulinum são termolábeis, sendo destruídas pelo aquecimento
a 80 °C durante 30 minutos ou a 100°C em poucos minutos.
O congelamento, assim como a refrigeração, não tem qualquer efeito prático na
destruição de células vegetativas, esporos ou neurotoxinas botulínicas.
3.6

Microrganismos Que Não Possuem Classificação
Listeria monocytogenes.
Características do microrganismo
Conhecido como microbiologistas há muito tempo, na área de Microbiologia
Veterinária. Porém, tornou-se um dos mais importantes patógenos veiculados por alimentos
na década de 80, devido a eclosão de diversos surtos de listeriose humana.
Apesar de na nona edição do Bergey s Manual of Systematic Bacteriology oito
espécie estarem relacionadas ao gênero listeria – L monocytogenes, L ivanovii, L. innocua, L.
welshimeri, L. seeligeri, L. denitrificans foi reclassificada como Jonesia denitrificans e,
recentemente, as espécies L. grayi e L. murrayi foram agrupadas em uma única espécie,
Listeria grayi. A espécie L. ivanovii, por sua vez, foi subdividida em duas subespécies: L.
ivanovii subsp. Ivanovii e L. ivanovii subsp. Londoniensis.
L. monocytogenes _ é um bacilo Gram (+), não formador de esporos, aneróbio
facultativo, móvel devido a flagelos peritríquios, apresentando movimento característico
denominado tombamento, que auxilia na sua identificação; apresente reação positiva para
catalase e negativa para oxidade.
L. monocytogenes apresenta crescimento na faixa de 25o.C a 44o.C, embora existam
relatos sobre o crescimento de 0o.C. Este microrganismo suporta repetidos congelamentos e
descongelamentos. O tempo de geração a 35o.C varia conforme o meio em que se encontra:
em leite achocolatado é de 0,65h, em creme 0,67 h e em leite desnatado e integral é de 0,69
hora. A 4o.C, esses tempos são de 1,34 a 1,56 dias em leite desnatado.
Embora o pH ótimo para o crescimento desta bactéria esteja entre seis a oito, ele pode
crescer em uma faixa maior, entre cinco a nove. Em meios de cultura, no entanto, já se
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verificou seu crescimento em pH 9,5. Ambientes com pH inferior a 4,5 e superior a 9,5 são
considerados hostis a L. monocytogenes.
Com relação à concentração de NaCl, constatou-se a sua sobrevivência em 10,5% e
13% quando incubada a 37o.C por 15 dias e 10 dias respectivamente. Em concentrações de
20%-30% de NaCl, o tempo de sobrevivência foi reduzido para 5 dias. Mas, se a temperatura
é reduzida para 4o.C, a bactéria pode sobreviver por mais de 100 dias em concentrações entre
10,55 e 30,5% de NaCl.
A atividade de água ótima para seu crescimento é próxima a 0,97. Contudo, esta
bactéria tem a capacidade de se multiplicar em atividade de água considerada baixa para a
multiplicação de patógenos – 0,92. Já foi relatada a sobrevivência de L. monocytogenes a
4o.C por, pelo menos, 132 dias em caldo tripticase soja contendo NaCl na concentração de
25,5%, com atividade de água de aproximadamente, 0,83.
Na indústria de carne, L.
monocytogenes por ser problema, uma vez sobrevive aos níveis recomendados de nitrato de
sódio e de cloreto de sódio (120mg/Kg de NaNO3 e 3% de NaCl).
Características da doença e Mecanismo de patogenicidade
O intestino humano é o ponto de entrada de L. monocytogenes no organismo, através
de células epiteliais do ápice das microvilosidades. Elas difundem-se, então, não só pelo
interior desta célula como também de uma célula para outra. Na fase seguinte, são ingeridas
por macrófagos, mas tal fato não induz a uma resposta inflamatória significante. Na verdade,
as células de L. monocytogenes, uma vez dentro dos macrófagos, encontram-se protegidas dos
leucócitos polimorfonocleares.
Já foi verificado em animais experimentais que cepas virulentas são capazes de se
multiplicar em macrófagos, rompendo estas células e produzindo septicemia. Quando isso
ocorre, os microrganismos podem atingir outras áreas do organismo, podendo envolver o
sistema nevoso central, o coração e outros locais.Em mulheres grávidas, pode haver a invasão
do feto e, dependendo do estágio em que a gravidez se encontra, pode ocorrer aborto, parto
prematuro, nascimento de natimorto ou haver septicemia neonatal. Quando um recém nascido
é infectado na sintomatologia tem início de uma a quatro semanas após o nascimento,
havendo relatos, no entanto, de períodos de quatro dias.
Na fase entérica, a sintomatologia é semelhante a da gripe, acompanhada de diarréia e
febre moderada. No entanto, em alguns casos estes sintomas são inaparentes. Pode ocorrer
também o desenvolvimento de um estado de portados de duração indefinida.
AGROINDÚSTRIA – Microbiologia e Procedimentos de Análise Microbiológica de Alimentos
A ocorrência de bacteremia por L. monocytogenes em adultos não é rara. O sintoma
mais comum é febre, mas estes pacientes queixam-se, também, de fadiga, mal estar, podendo
haver ou não presença de náusea, vômitos, dores e diarréia. O índice de mortalidade é de 30%
entre os imunodeprimidos, debilitados ou recém nascidos.
Nos casos de comprometimento do sistema nesrvoso central, a manifestação dá-se
através do aparecimento
de meningite, encefalite e de abscessos. A meningite é a
manifestação mais comum, ocorrendo principalmente em recém nascidos e idosos. Seu
desenvolvimento clínico é fulminante, com índice de mortalidade de, aproximadamente, 70%.
Entre outras formas localizadas de listeriose podem ser citadas
a endocardite e
osteomielite. Estas, no entanto, são formas raras.
O período de incubação da listeriose varia de um dia a algumas semanas, sendo a dose
infecciosa de L. monocytogenes desconhecida.
A ingestão de alimentos contaminados com L. monocytogenes é particularmente
perigosa para gestantes, recém nascidos e indivíduos com síndrome de imunodeficiência
adquirida, cirrose, carcinomas e outras doenças que provocam comprometimento de sistema
imunológico.
Epidemiologia
L. monocytogenes encontra-se amplamente disseminada da natureza. Tanto o homem
como os animais e o ambiente servem como reservatório desta bactéria. No homem, o seu
isolamento de indivíduos assintomáticos, provavelmente, é conseqüência da colonização do
trato intestinal.
A bactéria já foi isolada de uma grande variedade de animais, entre eles carneiros,
gado bovino, cabras, porcos, cavalos, gansos, gaivotas, patos, pombas, perus, galinhas,
cachorros e lebres. Também já foi isolada de peixes, artrópodes, larvas de insetos e rãs.
Na década de 80 ocorreram vários surtos de listeríose. O primeiro deles, que despertou
os microbiologistas de alimentos para o problema da L. monocytogenes, ocorreu no Canadá.
O alimento incriminado foi salada de repolho tipo coleslaw.
Um surto ocorrido em 1983, nos Estados Unidos, envolveu 49 indivíduos, com índice
de mortalidade de 29%. O veiculo foi leite pasteurizado. Ainda neste mesmo país, em 1985,
um surto de listeriose foi relatado envolvendo queijo mole, tipo mexicano.
Outro surto, também por causa do queijo do tipo mole, ocorreu na Suíça, entre 1983 e
1987, com 122 casos e 31 mortes.
AGROINDÚSTRIA – Microbiologia e Procedimentos de Análise Microbiológica de Alimentos
L. monocytogenes tem sido isolada de diferentes alimentos, tais como leite cru e
pasteurizado, queijos, carne bovina, suína, de aves,
peixes, embutidos carne moída de
diferentes animais, produtos cárneos crus e termoprocessados, além de produtos de origem
vegetal, de origem marinha e refeições preparadas. Estes isolamentos têm sido realizados não
só em outros países como também no Brasil.
Em relação à sua presença em leite pasteurizado, vários estudos vêm sendo realizados
com o intuído de esclarecer sua termotolerância. No entanto, ainda há discordância sobre esta
questão, sendo que recentemente duas teorias estão sendo estudadas na tentativa de elucidá-la.
A primeira delas relaciona-se ao fenômeno da resposta do choque térmico: quando células
de L. monocytogenes são expostas a temperaturas subletais, entre 44-48o.C, antes de serem
submetidas á temperatura final de tratamento, elas apresentam um aumento da resistência
térmica. A segunda teoria diz respeito à metodologia empregada para recuperação de
microrganismos estressados por processamento térmico. O uso de térmicas anaeróbias para a
recuperação destas células leva à recuperação de um número maior de células do que quando
recuperadas na presença de oxigênio.
Medidas de controle
Com a finalidade de prevenir infecções de origem alimentar por Listeria
monocytogenes é necessário que haja um controle no local de processamento do alimento.
Uma vez que esta bactéria é encontrada distribuída amplamente na natureza – no solo, água,
vegetais, animais, insetos, sere humanos -, que pode desenvolver-se em ampla faixa de
temperatura e de pH, além de ser uma das células vegetativas de maior resistência térmica,
deve-se prevenir sua entrada no ambiente da indústria de alimentos. Para tanto, deve-se fazer
o controle do microrganismo nos pontos de origem da matéria primário de medidas que
minimizem as chances de contaminação.
Outras medidas a serem tomadas no local de produção são:

Limpeza e sanificação dos alimentos;

Construção da indústria de maneira a impedir a entrada de animais, poeira e
insetos;

Evitar o contato do produto final com a matéria primária, evitando, assim, a
contaminação cruzada;
AGROINDÚSTRIA – Microbiologia e Procedimentos de Análise Microbiológica de Alimentos

Apresentação pela indústria de um setor de controle de qualidade que se aplique
não somente aos parâmetros de processamento, mas também ao controle do
ambiente, inclusive do pessoal.

Campylobacter jejuni, Campylobacter coli e Campylobacter lari.
Características do microrganismo
Embora várias espécies de Campylobacter estejam associadas à doença, C. jejuni, C.
coli e C. lari (anteriormente denominado Campylobacter NARTC e C. laridis) são as
espécies mais freqüentemente isoladas em casos de gastrenterite humana.
Recentemente foi proposta a criação da família Campybacteriaceae para abrigar as
inúmeras espécies de Campylobacter. Entre suas principais características destacam-se: forma
de bacilos curvos, espiralados, muito finos e compridos (0,2 a 0,5 nm de largura e 0,5 a 5nm
de comprimento), Gram (-), móveis com único flagelo polar que apresenta de duas a três
vezes o comprimento da célula. O flagelo é responsável pelo seu movimento característico em
saca-rolha ou em vaivém. Não formam esporos e culturas de vários dias adquirem morfologia
cocóide. Não fermentam nem oxidam açucares, obtendo energia a partir de aminoácidos ou de
componentes intermediários do ciclo do ácido tricarboxílico. São oxidase positiva e redutores
de nitrato. As espécies C. coli e C. lari são bastante semelhantes a C. jejuni, sendo a
diferenciação entre elas baseada apenas em testes bioquímicos.
A característica mais marcante do gênero Campylocacter é a
microaerofilia,
requerendo tensão baixa de oxigênio para sua multiplicação. O crescimento é inibido quando
a concentração de O é menor que 3% e maior que 15%, sendo 5% a concentração ideal.
Além disso, são capnofílicos, ou seja, requerem cerca de 10% de CO2 para sua multiplicação.
C. jejuni, C. lari crescem em faixa estreita de temperatura, que varia entre 30o.C e
47oC, com um ótimo de 42o.C,
razão pela qual são, muitas vezes, denominados
campilobacters termofílicos.
Essas bactérias são altamente sensíveis ao sal, sendo essa sensibilidade variável em
função da temperatura. Assim, não se multiplicam em meios contendo 2% de NaCl, quando
mantidos a 30o.C ou 35o.C A
4o.C, são sensíveis a 1% de NaCl. São também bastante
sensíveis ao pH ácido e à desidratação.
Características da doença.
AGROINDÚSTRIA – Microbiologia e Procedimentos de Análise Microbiológica de Alimentos
A infecção por C. jejuni pode manifestar-se de várias formas, sendo a enterocolite a
mais comum. A sintomatologia da campilobacteriose (C. coli, C.
lari e C. jejuni) é
clinicamente semelhante á causada por diversos outros patógenos estéricos. O período de
incubação varia normalmente de dois a cinco dias, podendo se estender até 10 dias. A doença
caracteriza-se por causar diarréia acompanhada de febre baixa e dores abdominais. Em alguns
casos, a febre aguda da diarréia dura dois e três dias, mas as dores abdominais podem
persistir por até três semanas.
Mecanismo de patogenicidade
O mecanismo pelo qual C. jejuni causa ainda não está suficientemente esclarecido.
Resultados obtidos até o momento indicam que sua patogenicidade é multifatorial. A adesão
à mucosa intestinal é indispensável. Já foi demonstrado que algumas cepas de C. jejuni são
capazes de produzir toxinas. Entre
as toxinas produzidas por C. jejuni destaca-se uma
enterotoxina termolábil (semelhante à toxina colérica)
e citotoxinas. Muitos pacientes
apresentam sangue e muco das fezes, o que sugere um mecanismo invasivo do cólon. Em
alguns casos, C. jejuni penetra na mucosa intestinal, multiplicando-se na lâmina própria, tal
como ocorre com Salmonella spp. e Yersinia enterocolitica.
Epidemiologia
C. jejuni tem sido caracterizado como agente de enterocolite em diversas partes do
mundo. Nos Estados Unidos, acredita-se que seja mais freqüente que Salmonella e Shigella
juntos. Na Inglaterra, a freqüência é semelhante á de salmonella, e vem aumentando
ultimamente. No Brasil, tem-se demonstrado que C. jejuni é também um importante agente de
gastrenterite aguda e crônica, afetando principalmente crianças. Nos países em
desenvolvimento, a enterocolite é endêmica e a freqüência de casos assintomáticos é elevada.
C. jejuni e C. coli são microrganismos comensais de trato gastrintestinal de uma
grande variedade de animais domésticos e silvestres. São isolados de bovinos, suínos, gatos,
cães, roedores e principalmente, de aves (pombos, frangos, patos, perus), com freqüência que
varia de 30% a 100%. C. lari faz parte da flora intestinal de gaivotas e de outras aves de
ambientes aquáticos e, menos freqüentemente, de mamíferos. C. coli é comum em suínos. Os
animais representam, portanto, a fonte mais importante de transmissão destes patógenos.
Além da transmissão através do contato com animais contaminados, C. jejuni e C. coli
podem ser transmitidos por portadores de infecções ativas. A transmissão pode ser indireta
através da ingestão de água e alimentos contaminados. A maioria dos surtos já descritos foi
AGROINDÚSTRIA – Microbiologia e Procedimentos de Análise Microbiológica de Alimentos
associada ao consumo de leite cru, proveniente tanto de bovinos quanto de outros animais.
Acredita-se que a contaminação do leite seja decorrente da contaminação com fezes, devido a
condições precárias de higiene durante a ordenha dos animais. Mastite bovina por
Campylobacter spp também pode ser causa de contaminação de leite cru. O leite pasteurizado
não representa um veiculo importante, visto que Campylobacter não resiste á pasteurização.
Carnes de aves e de outros animais, inadequadamente preparadas, têm sido incriminadas
também.
Inúmeros trabalhos têm sido conduzidos com o propósito de se observar à ocorrência
de Campylobacter em alimentos, em várias partes do mundo. Esses microrganismos são
isolados freqüentemente de carne de frango recém-abatido. A freqüência, nesse caso, é mais
baixa quando as carnes são refrigeradas ou congeladas. Campylobacter pode ser facilmente
isolado de miúdos de frango, como fígado, moela, etc. o isolamento a partir do leite cru é
difícil, apesar de este alimento ser um veículo mais comum em casos de surtos. A carne
bovina e suína, bem como seus derivados, também representam uma fonte importante.
Medidas de controle
São rapidamente destruídos pelo calor, não sobrevivendo aos processos de tratamento
térmico utilizado em alimentos. Não sobrevivem ao processo de pasteurização (D55Oc = 0,7 a
1 min), nem ao aquecimento a 60o.C por 10 minutos. São inativados mais rapidamente em
alimentos conservados em geladeira (4o. C) do que naqueles conservados em temperatura
ambiente. A 25oC a eliminação é mais rápida que a 30o.C. Campilobacters são altamente
sensíveis ao congelamento de alimentos. No entanto, após a redução brusca que ocorre no
início do congelamento, as células sobreviventes podem permanecer durante muitas semanas.
Devido a sua alta sensibilidade aos processos corriqueiros de tratamento dos
alimentos, acredita-se que sua presença em alimentos prontos para consumo seja
consequência de contaminações cruzadas com alimentos crus, principalmente carnes de aves.

Yersinia enterocolítica
Características do microrganismo.
As bactérias
do gênero Yersinia pertencem à família Enterobacteriaceae e,
atualmente, as seguintes espécies são reconhecidas: Y pestis, Y pseudotuberculosis, Y
enterocolitica, Y frederiksenii, Y kristensenii, Y intermédia, Y aldovae, Y rohdei, Y
bercovieri, Y mollaretii, Y ruckeri.
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Baseado em suas características bioquímicas, as cepas de Y
enterocolitica
são
classificadas em biótipos que diferem em número e testes bioquímicos.
Características da doença
A fonte de infecção é, provavelmente, a via oral, tendo, portanto, os alimentos e a
água uma grande importância na transmissão da doença.
A região do trato intestinal afetada é a ileocecal, provocando enterite, ileíte terminal e
linfadenite mesentérica. No caso de enterite, os sintomas mais comuns são febre, às vezes
sanguinolenta, diarréia e dores abdominais. Náuseas e vômito são freqüentes.
Infecções extras intestinais por Y enterocolitica podem ocorrer, entre elas, septicemia,
artrite, síndrome de Reiter, eritema nodoso, endocardite, glomerulonefrite e lúpus erimatoso.
Epidemiologia
Apesar de ser uma bactéria amplamente distribuída na natureza, apenas alguns
sorotipos são patogênicos para o homem e prevalecem em suínos. Esses sorotipos são 03, 05,
08 e 09, sendo a Y enterocolitica 03, fagotipo VIII, o mais comum no Brasil.
Suínos são considerados a principal fonte de sorotipos patogênicos de Y enterocolitica
para o homem, uma vez que o intestino e a faringe de recém nascidos são facilmente
colonizados, tornando-os portadores.
Outros animais
dos quais já foi isolada são vacas, chinchilas, coelhos, cobaias,
macacos, peixes, aves, carneiros e cavalos.
Y. enterocolitica é uma bactéria psicotrófica e, portanto, os alimentos refrigerados de
origem animal tornam-se importante fator de risco para o consumidor. Esse fato pode ser
exemplificado por dois maiores surtos de infecção de origem alimentar, onde os veículos
transmissores foram leite pasteurizado e, no outro, leite achocolatado, essas bactérias tem sido
isolada de diversos alimentos em diferentes países, inclusive no Brasil. Entre esses alimentos
podem ser citados: carnes de diferentes origens e seus derivados, leite cru e pasteurizado,
produtos de lacticínios e verduras. Entre as carnes, as línguas suínas, principalmente,
apresenta alto índice de possibilidade para Y enterocolitica sorotipo O3, que é patogênica.
O isolamento de Y. enterocolítica
de amostras de leite pasteurizado é decorrente,
provavelmente, de uma contaminação pós-processamento e não devido a sua resistência à
temperatura de
enterocolitica
pasteurização. Em relação à água, já se constatou a presença de Y.
em
diversas
amostras,
tendo
em
alguns
casos
epidemiologicamente, a surtos de infecção.
AGROINDÚSTRIA – Microbiologia e Procedimentos de Análise Microbiológica de Alimentos
sido
ligada,
Mecanismo de patogenicidade
A patogenicidade das cepas virulentas de Y enterocolitica ocorre através da invasão
da mucosa intestinal provocando os sintomas característicos de gastrenterite. Algumas cepas
de Y. enterocolitica são capazes de causar dor abdominal tão intensa que leva a confundir essa
infecção com uma apendicite. A maioria das infecções é autolimitante, uma vez a resposta do
hospedeiro é capaz de conter a multiplicação e eliminar as bactérias, através da ação dos
polimorfonucleares.
Algumas cepas de Y. enterocolitica produzem uma enterotoxina termoestável (Yst),
entretanto, como ela não é produzida a temperaturas acima de 30o.C, uma vez que o gene
responsável pela sua produção só é expresso a 26o.C, seu papel na patogenicidade é
considerado nulo. Outro aspecto que contribui para corroborar para tal fato é que várias cepas
patogênicas, apresentndo outros fatores de virulência, não são produtoras da toxina. A
virulência de Y. enterocolitica manifesta-se através de plasmídeos de virulência.
Medidas de controle
Como os animais são importantes reservatórios de Yersinia spp e ou suínos
particularmente de Y. enterocolitica, a medida de controle mais importante a ser considerada é
a eliminação do microrganismo presente nesses animais.
A conscientização dos manipuladores de alimentos, quanto a higiene pessoal, também
é importante no controle desta doença.
Uma vez que a água pode ser um veículo de transmissão, inclusive a utilizada na
indústria de alimentos, o uso de água não tratada, de qualquer fonte, na produção de alimentos
acarretará, sempre, um certo risco.
3.7
Fungos Produtores De Micotoxinas
Os fungos não desejáveis em alimentos são capazes de produzir uma grande variedade
de enzimas que, nos mesmos, provocam a sua deterioração, acarretando grandes prejuízos.
Além disso, muitos fungos podem produzir metabólitos secundarios tóxicos, denominados
micotoxinas. E, quando ingeridos podem causar alterações biológicas prejudiciais tanto no
homem como nos animais, denominadas micotoxicoses. Não confudir com micoses, que
representa o desenvolvimento do fungo no hospedeiro.
Casos de intoxicações por micotoxinas são conhecidos desde a idade média e,
atualmente, já foram isoladas mais de 300 toxinas diferentes produzidas por pelo menos 80
espécies diferentes de fungos.
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As micotoxicoses podem resultar da ingestão de toxinas por 3 tipos de fungos;
a) Fungos macroscópicos: os mais conhecidos são os cogumelos tóxicos Ex: “death cap
mushroom” ou Amanita plalloides.
b) Fungos parasíticos: infectam
causam doenças nas plantas no campo. Alternaria,
Cladosporium, Fusarium.
c) Fungos de estocagem: são aqueles que, sob condições ideais, são capazes de crescer
rapidamente durante o cultivo, colheita, secagem, transporte e estocagem. Aspergillus,
Penicillium.
Obs: b e c são denominados fungos microscópicos.
3.7.1
Principais Micotoxinas encontradas em alimentos:
Embora, no II Congresso Internacional de Micotoxinas, realizado em 1987, tenha sido
elaborado um documento com as principais toxinas que devem ser estudadas: Aflatoxinas,
Toxinas do Ergot, Ocratoxina (OTA), Zearalenona, Tricotecenos, Patulina e Citrinina. Na
Itália, em uma reunião em 1996, foram citadas como a 5 toxinas principais “the big 5”:

Aflatoxinas

Ocratoxina,

Toxina T-2,

Deoxinilvalenol (DON = Vomitoxina),

Fumonisinas.
3.7.1.1 Aflatoxinas
Dentre as micotoxinas, tem sido dado maior atenção às aflatoxinas, devido a sua
propriedade marcadamente hepatocarcinogênica e altamente toxigênica, existem 4 tipos de
aflatoxina, a B1 e B2, e a G1 e G2. Outros efeitos biológicos destas micotoxinas no
organismo
são:
teratogênia,
atividade
mutagênica,
aberrações
cromossomiais
e
imunorreatividade. Sendo que a ação das mesmas pode alterar devido ao quadro nutricional,
principalmente se o indivíduo estiver em dificiência protéica.
Fungos produtores: por algum tempo jungou-se que o Aspergillus flavus fosse o único
fungo que produzia aflatoxina, mas sabe-se atualmente que existem mais espécies de
Aspergillus e mesmo outros gêneros produtores tais como; A.parasiticus (predominante em
países tropicais, é considerado um dos mais ativos), A.niger, A. oryzae, A.wentii, A. ostianum,
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A.fumigatus e A.frenesii. Do gênero Penicillium temos o P. puberulum, P. citrinum, P.
variable e P. frequentans.
Alimentos implicados: principalmente o amendoim, onde a aflatoxina foi
primeiramente isolada, por implicação em surto na Inglaterra que matou 400.000 perus
alimentados com ração à base de amendoim brasileiro; outros: milho, centeio, sorgo, ervilha,
sementes de girassol, cevada, arroz, castanhas, frutas secas e chás, etc.
3.7.1.2 Ocratoxina A (OTA)
Outra micotoxina com propriedades tóxicas acentuadas, largamente distribuída na
natureza e nos alimentos, sendo os principais: café, amendoim, soja, trigo, arroz, pimenta do
reino, vegetais em decomposição, solo, superfície de presunto, entre outros.
A ocratoxina A é uma nefrotoxina, causa nefropatia com excessiva aliminação de
urina, provocando muito sede, seu alvo secundário é o fígado, freqüentemente é fatal. Em
laboratório apresenta teratogênica em ratos, sendo poucos os relatos de carcinogênese.
Fungos produtores: são do gênero Aspergillus e Penicillium.
Aspergillus: ochraceus, sulphureus, melleus,
sclerotiorum, ostianus, alliacius,
petrekko. Penicillium: palitana, commune, cyclopium,variable, purpurecens.
Obs: boa parte dos fungos produtores de OTA é encontrada associada a outros fungos
produtores de micotoxinas (citrinina e outras toxinas do fusarium), apresentando efeito
sinégico.
3.7.1.3 Toxina T – 2 e deoxinilvalenol (DON) ou Vomitoxina
Estas micotoxinas fazem parte do grupo dos tricotecenos que apresentam cerca de 30
compostos bioquimicamente ativos. Os fungos produtores são várias espécies de Fusarium
sp, além de Mycothecium sp, Trichoderma sp, Calonectria sp, Cephalosporium sp e
Stachybotrys sp. O Fusarium tricintum possui sinômimos: F. poae, F. sporotrichioides e F.
sporotrichiella, e foi o mais isolado em milho e associada com toxidade.
Principais alimentos passíveis de contaminação dão o milho (onde o tricoteceno mais
encontrado é o DON = Vomitoxina), cevada e outros cereais.
Estas micotoxinas tanto em animais como o homem, afetam os centros de produção de
sangue, causam danos no sistema nervoso, trato gastrointestinal e cardiovascular e
hemorragias. Em humanos o nome da doença é Aulequia Tóxica Alimentar, originária na
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Rússia durante a II guerra Mundial, onde a fome levou a população a ingerir grande
quantidade a alimentos contaminados, e apresenta alta taxa de mortalidade.
3.7.1.4 Fumonisinas
Um novo grupo de micotoxinas, isolado em 1988. Atualmente, existem 6 membros
distintos a FB1, FB2, FB3, FB4, FA1, FA2. Estas toxinas são produzidas por fungos do
gênero Fusarium principalmente F. moniliforme Sheldon, F. proliferatum Nuremberg e F.
subglutians.
Sua ocorrência em alimentos, principalmente em milho, tem sido relacionada a
doenças fatais em animais, em humanos seu efeito tóxico mais comum é o câncer de esôfago.
3.7.2
Fatores que favorecem a desenvolvimento de Fungos e Produção de Micotoxinas
Os fatores que favorecem o desenvolvimento de fungos e produção de toxinas, são
classificados em 03 categorias: fatores físicos, químicos e biológicos, são eles:

Umidade relativa (do ar);

Conteúdo de umidade do alimento bem como a sua composição;

Temperatura;

Luz;

Ventilação;

Microclima (composição da atmosfera gasosa);

Danos mecânicos;

Competição microbiológica;

Linhagem do fungo contaminante e fungicidas;

pH (alimentos ácidos são excelentes substratos, mas a faixa entre 5-6 é ideal).
Obs: O fator que mais contribui p/o aparecimento dos fungos é a umidade alta.
3.7.3
Fatores que podem Inibir o Crescimento de Fungos e Toxinas:
A umidade é o primeiro e mais importante fator a ser controlado, tanto a ambiental,
quanto à umidade interna do alimento (quando possível).
O microclima em ambientes
com atmosfera controlada (armazéns, embalagens)
quando alterado para 100% de CO2, inibe completamente o crescimento de fungos e suas
toxinas.
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O ambiente de armazenamento e ou comercialização deve ser bem aerado, limpo,
bem iluminado, com controle de temperatura e umidade, desratização e desincetização.
Fungicidas são utilizados por agricultores, possuem uma boa eficiência, porém, devem
ser usados com cautela devido à toxidez que podem causar em animais e seres humanos, e,
apresentam um outro inconveniente, são dispendiosos.
3.7.4
Detoxicação dos Alimentos Contaminados
Infelizmente, a contaminação por micotoxinas pode ocorrer, não obstante esforços em
relação à sua prevenção. Portanto, outros meios devem ser considerados, reconhecendo-se que
devem ser aplicados apenas se as medidas preventivas falharem e não como prática de
armazenagem. Estes meios implicam na remoção do material contaminado ou destruição da
toxina, podendo ser efetuados de diferentes formas:

Remoção física de grãos contaminados por fungos, pode ser realizada
manualmente,
eletronicamente, por densidade, microscopia, através da luz
ultravioleta ou polimento.

Remoção química: extração química de aflatoxinas por meio de solventes polares,
mistura de solventes e azeotrópicas; a desvantagem é que não conseguem extrair a
toxina completamente, além de alguns produtos alterarem as características
organolépticas.

Remoção por adsorção: agentes sequestrantes de aflatoxinas ou “esponjas
químicas”, não possui efeito tóxico, mas é método ainda caro.

Destruição por agentes físicos: calor, irradiação, raios ultravioletas.

Destruição química: tenta converter as toxinas em agente não tóxicas, têm sido
testadas várias substãncias: água oxigenada, amônia, soluções de sódio ou cálcio,
trimetilamina ou hidróxido de cálcio e ozonização. A maioria foi eficiente, mas,
as características organolépticas foram alteradas.
3.8
3.8.1
Viroses de Origem Alimentar
Características Gerais dos Vírus
Os vírus são considerados parasitas intracelulares obrigatórios, podendo parasitar não
só animais e vegetais com também bactérias, fungos e algas. Para a síntese dos componentes
necessários à sua estrutura, os vírus utilizam-se dos sistemas enzimáticos de célula parasitada.
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Cada partícula viral é constituída por um cerne de ácido nucléico (DNA ou RNA, nunca
ambos), recoberto por uma camada protéica chamada cápside. O conjunto ácido nucléico –
invólucro protéico constitui o nucleocápside. A cápside é formada por múltiplas subunidades
morfológicas denominadas capsômeros. Alguns vírus possuem ainda um envoltório de
natureza glicoprotéica e/ou lipídica, que, às vezes, apresenta espículas salientes que lembram
espinhos.
Os vírus têm tamanho bastante reduzido, variando entre 10 e 200 nm. A grande
maioria dos vírus tem seus elementos organizados segundo estruturas
helicoidais e
isométricas. Nos vírus de estrutura helicoidal os capsômeros organizam-se segundo simetria
helicoidal, dispondo-se o ácido nucléico na parte interna das unidades protéicas, associado às
mesmas. Nos vírus de estrutura isométrica, os capsômeros organizam-se segundo simetria
icosaédrica, isto é, formando um corpo de 20 faces triangulares equiláteras, 12 vértices e 30
arestas. A grande maioria dos vírus de interesse em alimentos em estrutura ecosaédrica.
Os vírus são classificados de acordo com a natureza do ácido nucléico viral: RNA ou
DNA. Os vírus de interesse em alimentos são todos RNA, normalmente de fita simples.
A multiplicação dos vírus inteiramente dentro da célula parasitada. O ciclo envolve as
seguintes etapas: adsorção, penetração, desnudação, transcrição, tradução, replicação,
maturação e liberação. A adsorção à célula hospedeira depende da existência de receptores
específicos na membrana celular, em geral de natureza glicoprotéica, e também de estruturas
especiais na partícula viral que podem ser as espículas ou ainda peptídeos na superfície viral.
A penetração é mediada ou pela invaginação da membrana celular em volta da partícula viral
ou pela fusão do invólucro viral com a própria membrama celular ou ainda pela simples
penetração do vírus através da membrana celular. Na desnudação, o envoltório da partícula
viral é removido pela ação das enzimas celulares para sintetizar m – RNA (RNA
mensageiro), necessário para o processo de síntese protéica. Nos vírus RNA, o RNA viral
pode funcionar como m – RNA ou ainda ser copiado para formar RNA à custa da ação de
uma enzima RNA polimerase RNA dependente. Um terceiro mecanismo que pode ocorrer
vírus RNA envolve a ação de uma enzima chamada transcriptase reversa, que sintetiza DNA,
a partir de RNA. Nos vírus DNA, o DNA precisa ser transcrito para RNA, através de
mecanismos que dependem das características do genoma viral. Na tradução, uma vez
sintetizado, o m- RNA liga-se aos ribossomos celulares iniciando a síntese das proteínas
virais. Na replicação, o o genoma viral dá origem a novos genomas, e, na maturação, estes
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novos genomas acoplam-se às proteínas virais para formar novas partículas virais. Na
liberação, a célula hospedeira sofre uma lise celular, liberando grandes aglomerados de
partículas Virais. Alguns tipos de vírus não causam essa lise celular, podendo permanecer
associados indefinidamente à célula hospedeira.
Os vírus podem ser transmitidos diretamente de um hospedeiro para outro, podendo
haver envolvimento de água e/ou alimentos na transmissão (veículos). Podem também ser
transmitidos por via indireta, através de vetores, que podem ser animais (vetores biológicos)
ou mecânicos (fomites).
3.8.2
Vírus de Importância em Alimentos.
As doenças virais humanas causadas pelo consumo de água e alimentos são
relativamente poucas, merecendo destaque a hepatite A, a poliomielite e as gastrenterites por
rotavírus e por vírus Norwalk. No Brasil, as estatísticas são poucas, mas nos Estados Unidos
às viroses correspondem à cerca de 2% do total dos surtos de origem alimentar.
3.8.2.1 Hepatite A
O vírus da hepatite A é um vírus RNA de fita simples, pertencente ao grupo dos
enterovírus. A hepatite A, anteriomente denominada hepatite infecciosa, transmite-se pela via
fecal – oral, sendo a água e os alimentos contaminados os principais veículos durante as
epidemias. Entre os alimentos merecem destaque os moluscos bivaldes, que podem
contaminar-se durante seu cultivo em águas contaminadas. O consumo de moluscos crus tem
sido incriminado em diversos casos de hepatite A, assim como saladas cruas. Na hepatite, o
vírus atinge a mucosa intestinal e passa para o fígado pela via sanguínea do sistema porta. As
lesões hepáticas consistem em necrose celular do parênquima hepático, proliferação nas
células de kupfer, com acúmulo de macrófagos, linfócitos e leucócitos não áreas de necrose.
O período de incubação varia de dois e seis meses. Os pacientes mantêm sua capacidade
infectante durante um período de duas a três semanas antes do aparecimento de icterícia
(acúmulo de bilirrubina no sangue, responsável pela coloração amarelada da pele dos
doentes), e duas semanas após a regressão deste sintoma. O vírus da hepatite A tem elevada
resistência ao calor, suportando temperaturas de 60o.C por meia hora.
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3.8.2.2 Poliomielite
A poliomielite é uma virose do sistema nervoso, causado por um vírus que tem como
hospedeiro natural o homem e como habitat o intestino, sem risco para o hospedeiro quando
este tem anticorpos em níveis protetores. Na ausência destes anticorpos, os vírus atingem o
sistema nervoso central, atingindo as células da medula óssea, que são destruídas. Embora
atualmente não ocorra em países desenvolvidos, vários casos de poliomielite causados por
consumo de leite cru foram relatados entre os anos 1914 e 1950, nos Estados Unidos.
Atualmente, esta doença está praticamente erradicada em muitos países devido ao adverso de
vacinas eficientes, à melhora nas condições de higiene durante a produção de alimentos e à
pasteurização do leite. Água, verduras cruas e mariscos são também importantes vias de
transmissão. É importante ressaltar que os poliovírus são excepcionalmente resistentes:
sobrevivem em água não tratada por até 160 dias, em solo por até 120 dias e em mariscos por
até 90 dias.
3.8.2.3 Gastrenterites por rotavírus
Os rotavírus são vírus RNA de fita dupla, e causam gantrenterite principalmente em
crianças com idade inferior a seis anos. Os rotavírus causam alterações no fluxo de água e
eletrólitos no nível da mucosa intestinal, resultando em diarréia. Os vírus causam também
lesões nas células do intestino delgado, principalmente nas da parede lateral e do topo das
vilosidades. O processo infeccioso instala-se em cerca de 48 horas, regredindo após três a
cinco dias. Os vírus, no entanto, podem ser eliminados por muitos dias após terem cessado os
sintomas (até 40 dias). As gastrenterites por rotavírus são mais comuns nos meses de inverno.
Água e alimentos podem ser importantes veículos de transmissão dos rotavírus.
3.8.2.4 Gastrenterites por Vírus Norwalk
Os vírus Norwalk são vírus RNA de fita simples, e tem esse nome devido á cidade
norte americana em que causaram um grande surto em 1968. Sua morfologia não é muito bem
difinida. Esses vírus são causadores de gastrenterites semelhantes àquelas causadas pelos
rotavírus, mas são mais freqüentes no verão, e têm duração mais curta: 12 a 48 horas. O
período de incubação é de 48 horas, e são afetadas tanto adultas quanto crianças. Vários
relatos de surto de origem alimentar indicam que água, vegetal cru e pescado são os veículos
mais importantes.
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3.8.2.5 Medidas de Controle
A contaminação de alimentos com vírus pode ser primária e secundária. Exemplos de
alimentos com contaminação primária são os vegetais que se contaminam nas plantações
irrigadas com água servidas ou fertilizadas com adubo humano, carnes prevenientes de
animais doentes e moluscos cultivados em águas contaminadas. A contaminação secundária
ocorre durante o processamento, vetores, ou direta, através de manipulações. Estes últimos
constituem-se no elemento de maior importância na contaminação de alimentos por vírus.
3.8.2.6 Detecção em Alimentos
Os testes laboratoriais de pesquisa de vírus em alimentos empregam culturas celulares
obtidas de tecidos normais e tecidas neoplásticos e também o estudo morfológico das
partículas virais nos alimentos através de microscopia eletrônica ou raios X. Estas técnicas
são muito trabalhosas e de pouca aplicação para alimentos, sendo a presença do vírus
usualmente determinada de forma indireta, através da pesquisa de microrganismos
indicadores de contaminação fecal. Convém lembrar que a correlação entre essas
determinações tem sido bastante questinada.
3.9
3.9.1
Bactérias Deteriorantes
Utilização de Carboidratos
Praticamente todos os carboidratos podem ser metabolizados como substrato para o
crescimento microbiano. A maioria das bactérias é capaz de metabolizar diretamente mono e
dissacarídeos por um processo oxidativo ou fermentativo; entretanto, polissacarídeos não
penetram atravé da membrana celular e devem ser previamente hidrolisados. É o caso de
vegetais que têm em sua composição, conferindo rigidez, a pectina. Muitas bactérias
apresentam atividade pectinolítica, causando a ruptura da molécula de
pectina com o
conseqüente amolecimento e liquefação dos tecidos (deterioração denominada “podridão
mole”). Dentre essas
bactérias, destacam-se os gêneros: Clostridium, Aeromonas,
Enterobacter, Erwinia e Pseudomonas.
A metabolização dos carboidratos por um processo fermentativo, dá origem a uma
série de produtos que dependem dos diversos gêneros e espécies de bactérias contaminadas.
Assim, quando se observa no leite um sabor e odor ácidos é provável a ocorrência de
fermentação butírica e lática, pelos gêneros: Clostridium, Lactococcus, Pediococcus,
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Lactobacillus, Streptococcus e Leuconostoc. Este último gênero, juntamente com algumas
espécies de lactobacilos é capaz de produzir diacetil, que possui aroma bastante pronunciado
de manteiga, sendo sua presença inaceitável em alguns alimentos, particularmente sucos
cítricos e cervejas.
3.9.2
Utilização de Proteínas e Substãncias nitrogenadas não-protéicas
Os microrganismos não conseguem metabolizar as moléculas menores de proteínas,
os peptídeos, e não a proteína intacta, uma vez que esta não consegue penetrar através da
membrana celular; no entanto, compostos com baixo peso molecular, como dipeptídeos e
aminoácidos, podem penetrar e ser metabolizados pela maioria dos microrganismos.
A ruptura da molécula de proteína causa, como alteração principal, modificações na
textura do tecido, com conseqüente amolecimento e mudanças no aroma. Por outro lado,
metabolização de aminoácidos e substâncias nitrogenadas não-protéicas constituem a
principal causa de alterações de alimentos protéicos. Os produtos resultantes irão depender de
alguns fatores: tipo de microrganismos deteriorante, natureza do aminoácido, temperatura,
disponibilidade de oxigênio e tipos de inibidores presentes.
As bactérias que demonstram intensa atividade proteolítica são: Bacillus, Clostridium,
Proteus, Aeromonas e Pseudomonas. Este último gênero
produz várias alterações em
alimentos de origem animal: modificações no aroma de pescados, caracterizado por odor
pronunciado de frutas, devido a metabolização de aminoácidos como glicina, leucina e serina.
Ao contrário do que ocorre na deterioração de carboidratos, que envolve queda do pH
devido á produção de ácidos, na deterioração protéica observa-se uma elevação de pH.
Variações nas medidas de pH podem auxiliar na constatação dessas deteriorações.
3.9.3
Utilização de Lipídios
Os óleos puros e as gorduras não são atacados por microrganismos, pois, como já foi
visto, eles não se multiplicam na ausência de água. No entanto, em alimentos gordurosos, que
apresentam uma fase aquosa associada à gordura, o crescimento microbiano pode ocorrer. É o
que acontece com alimentos como creme de leite, margarinas e manteigas.
As gorduras presentes nos alimentos estão susceptíveis a processos de hidrólise e
oxidação que acarretam modificações, principalmente no aroma dos alimentos. Algumas
bactérias produtoras de lípases (enzimas que catalisam a degradação das gorduras):
Acinetobacter, Aeromonas, Pseudomonas, Alcaligenes, Enterobacter, Flavobacterium,
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Micrococcus, Bacillus e Staphylococcus. Muitas dessas bactérias são psicrotróficas e estão
associadas à deterioração de alimentos refrigerados.
O processo de deterioração das gorduras denomina-se rancificação. Existem dois tipos
de rancificação: a hidrolítica, geralmente de origem enzimática, podendo ser causada por
microrganismos; e a oxidativa, que não depende da ação de microrganismos.
Alguns testes químicos são utilizados para medir a intensidade de rancificação
oxidativa de alimentos gordurosos: o índice de peróxidos e o teste do ácido tiobarbitúrico
(TBA) constituem bons indicadores.
3.9.4
Outros tipos de Deterioração
Além da metabolização de lipídios, proteínas e carboidratos, o desenvolvimento
microbiano pode causar ainda, modificações na viscosidade e alterações na cor dos alimentos.
As alterações na viscosidade dos alimentos, normalmente, ocorrem devido à síntese de
polissacarídeos, a partir de dissacarídeos. Estas substâncias originam a formação de um limo
superficial nos alimentos, ou então alteram a viscosidade de alimentos líquidos, além de
alterarem o sabor. Exemplos de bacterias que estão envolvidas nesse tipo de deterioração: no
leite, por exemplo, o crescimento de Enterobacter aerogenes e Alcaligenes causa um aumento
na viscosidade. Leuconostoc mesenteroides, Bacillus subtilis e E. coli alteram a viscosidade
do leite e de sucos concentrados. Cepas de Lactobacillus plantarum afetam, principalmente,
bebidas (cervejas) e produtos de origem vegetal como chucrutes e outros. As Pseudomonas
alteram a superfície de alimentos, provocando limosidade em carnes frescas e refrigerantes.
As alterações na coloração do alimento podem ser provocadas por diversos gêneros
bacterianos produtores de pigmentos. Dentre as bactérias produtoras de pigmentos destacamse os gêneros Halococcus e Halobacterium, halófilos comumente envolvidos Neisseria
deterioração de produtos cárneos e de pescados, salgados e desidratados, que produzem um
pigmento – a bactorubeína – que confere à superfície do alimento cor variando de vermelha a
rósea.
Pseudomonas estão associadas à produção de pigmentos fluorescentes e não
fluorescentes. Em produtos cárneos refrigerados, é comum a formação de um pigmento de
coloração verde (clorofina). Cabe acrescentar que se deve diferenciar a coloração esverdeada
produzida por Pseudomonas, da
produzida por bactérias dos gêneros lactobacillus e
leuconostoc, observada em alguns produtos cárneos curados, embalados a vácuo. Este tipo de
alteração é devido à oxidação do pigmento vermelho da carne curada, que se transforma em
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porfirina pela ação do peróxido de hidrogênio, metabólito produzido por esses
microrganismos.
3.10
Alterações devido ao crescimento de fungos e leveduras
Os fungos, compreendendo também as leveduras, apresentam maior tempo de geração
do que as bactérias; sendo assim, só serão agentes deteriorantes principais quando o alimento
oferecer condições seletivas de multiplicação: pH ácido, atividade de água inferior a 0,94,
temperatura entre 25o.C e 28o.C e substrato rico em carboidratos, particularmente açúcares
simples.
A ocorrência de espécies patogênicas de leveduras em alimentos é praticamente
desconhecida; entretanto, várias espécies aparecem deteriorando sucos naturais de frutas,
sucos concentrados, maioneses, chucrutes, picles, leite condensado, geléias, polpas
concentradas, recheios de produtos de confeitarias, xaropes e produtos desidratados.
3.10.1 Utilização de Proteínas e Lipídeos
A ação de leveduras sobre proteínas e outras substãncias nitrogenadas é praticamente
nula. Por outro lado, alguns gêneros de Cândida e Torulopsis são capazes de atuar sobre
lipídios.
3.10.2 Utilização de Carboidratos
A utilização de carboidratos pelas leveduras pode ser oxidativa ou fermentativa. As
leveduras oxidativas (film yeasts)
são de maior importância, uma vez que crescem na
superfície de alimentos ácidos, como picles e sucos envasados em vidro. Ao utilizarem
ácidos orgânicos e álcoois, elevam o pH do produto. Com a elevação do pH, pode ocorrer o
desenvolvimento de microrganismos pouco resistentes a ácidos, como é o caso de Clostridium
botulinum em picles e outros alimentos ácidos. As leveduras envolvidas nesse tipo de
deterioração são: Pichia, Hansenula, Debaromyces, Cândida e Trichosporon.
Zigsaccharomyces bailli cresce em meio contendo até 70% de glicose, além de tolerar
concentrações moderadas de etanol, 10% de cloreto de sódio e apresentar resistência a alguns
conservantes, como benzoato e sorbato de sódio.
Ao contrário das leveduras, a imensa maioria dos gêneros de fungos é aeróbia estrita,
necessitando, portanto, de oxigênio atmosférico para evidenciar crescimento. Uma exceção à
natureza aeróbia estrita de fungos é o gênero Byssoclamys, particularmente as espécies B.
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fulva e B. nívea, que são importantes agentes de deterioração de alimentos envasados, que
apresentam vácuos pronunciados causando intensa deterioração de vegetais, em função da
atividade pectinolítica. Além disso, a resistência térmica acentuada dessas espécies contrasta
com a maioria das outras espécies de fungos.
Os fungos tornam inaceitável o alimento para consumo quando seu crescimento,
representado pelo micélio, é visível. O micélio é uma massa de hifas que pode apresentar
diferentes aspectos e cores: seco, úmido, gelatinoso, compacto
ou não, com aparência
algodonosa; pode ser incolor ou colorido com tonalidades de vermelho, amarelo, castanho,
verde cinza ou preto.
Outro grupo importante grupo é o dos fungos de armazenamento, que provocam
deterioração em grãos e cereais armazenados. Os gêneros envolvidos nesse tipo de
deterioração são: Aspergillus flavus, A. glaucus, A. candidus e Penicillium spp. Algumas
espécies
produzem micotoxinas tornando importante o controle da proliferação desses
microrganismos em alimentos.
Alguns fungos são psicrotróficos, provocando a deterioração de alimentos
refrigerados. São eles: Penicillium, Cladosporium, Tricothecium e Aspergillus. Os alimentos
salgados e parcialmente desidratados podem ser deteriorados por espécies
halófilas de
fungos, como é o caso da alteração denominada “dun” em bacalhau salgado, provocada por
Sporendonema expizoun. Essa alteração é caracterizada por pequenos tufos de cor preta ou
casdtanho na superfície dos alimentos.
A simples presença de micélios, flagmentos de hifas e outras estruturas fúngicas em
alimentos industrializados, bem como contagens acima dos padrões estabelecidos indicam má
qualidade de matéria-prima ou falhas higiênicas ao longo do processo.
3.11
Deterioração de Alimentos Enlatados
Um alimento enlatado está comercialmente estéril quando não apresenta
microrganismos capazes de deteriorar o produto.
Sendo assim, por esterilidade comercial, não se subentende esterilidade absoluta, uma
vez que células visíveis podem ser recuperadas de alimentos comercialmente estéreis. Um
alimento enlatado pode sofrer alterações por causas variadas:
a) Problemas de natureza microbiológica, que envolvem subprocessamento térmico,
resfriamento inadequado das latas após a esterilização comercial, reinfecção dos
alimentos por vazamento das latas e deterioração pré-processamento térmico.
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b) Problemas químicos, particularmente e corrosão interna de latas, com liberação de
hidrogênio e conseqüentemente estufamento das mesmas.
c) Problemas físicos, destacando-se o enchimento excessivo das latas, com ausência
de inadequação do espaço-livre, exaustão deficiente, operação incorreta da
autoclave, causando vácuo excessivo nas latas, com conseqüente contração do
corpo da lata (apainelamento).
Os gêneros de microrganismos envolvidos de deterioração de enlatados dependerão,
prncipalmente, do pH dos alimentos.
Porém é importante ressaltar que alimentos enlatados oferecem riscos potenciais de
proliferação de bactérias patogênicas, inclusive Clostridium botulinum, razão pela quais
medidas extremas se segurança devem ser adotadas em seu processamento.
Entretanto, outros microrganismos termofílicos podem deteriorar alimentos anlatados.
São eles: Bacillus stearothermophillus, causador de deterioração tipo “flat-sour” (produção de
ácidos a partir de açúcares, sem formação de gás)
em alimentos pouco ácidos. Esses
microrganismos são anaeróbios e podem se desenvolver em temperaturas de até 70o.C.
O Bacillus coagulans é menos resistente à temperatura, porém tolera mais a presença
de ácidos do que o B. stearothermophillus. É, normalmente, o agente deteriorador de tomates
enlatados. Clostridium thermosaccharolhticun fermenta açúcares, com produção de ácidos e
de grandes quantidades de gases, causando o estufamento da lata. Seus esporos são
termoresistentes. Desosulfotomaculum nigrificans atuam sobre açúcares, podendo produzir
H2S, a partir de aminoácidos sulfurados como cisteína e cistina.
O H2S
pode combinar-se com o ferro, resultando na formação de sulfetos. Em
conseqüência, tanto o alimento como a superfície interna da lata adquire coloração escura.
3.12
O
Alterações Químicas causadas por Microrganismos
desenvolvimento de alguns tipos de microrganismos nos alimentos acarreta
alterações na composição química, propriedades organolépticas ou ainda na sua estrutura,
processo este denominado de biodegradação. E podem ser assim especificadas:

Fermentações: onde os microrganismos metabolizam os carboidratos; existem
vários tipos: fermentação láctica, alcoólica, ácida mista ou fórmica, butanóica,
butírica, propiônica. Alguns microrganismos implicados (variam com o substrato
AGROINDÚSTRIA – Microbiologia e Procedimentos de Análise Microbiológica de Alimentos
e o tipo de fermentação):
Leuconostoc, Lactobacillus, Streptococcus,
Saccharomyces, Clostridium, Bacillus, etc.
Obs: Lembrando que as fermentações quando induzidas ou esperadas naturalmente
são desejáveis e economicamente rentáveis, mas também temos as indesejáveis, que
neste caso o alimento acusa de alguma forma a contaminação, no entanto, a maioria
dos patógenos não provoca deterioração aparente.

Putrefação: onde há degradação de proteínas, ocorre em alimentos de alto valor
protéico, principalmente carne e derivados. Microrganismos implicados:
Clostridium, Bacillus, Pseudomonas.

Rancificação: “ranço”
em alimentos com alto valor lipídico. Alguns
microrgansimos: Pseudomonas, Cândida, Aspergillus, etc.

Entre outras alterações que ocorrem devido ao crescimento microbiano, levando à
rejeição do alimento, podem ser citadas as modificações na viscosidade e as
alterações de cor devido à produção de pigmentos ou o crescimento de fungos:

Alterações da viscosidade: alguns microrganismos que são capazes de hidrolisar
polissacarídeos podem fazer o processo inverso, isto é através de dissacarídeos
sintetizam polissacarídeos, ex: Leuconostoc e E. coli, utilizam sacarose e maltose
para produção de amiloses e dextranas que vão alterar o alimento produzindo um
limo superficial em carnes frescas refrigeradas, em leite e cerveja alterando a
viscosidade.

Alterações na coloração: podem ser provocadas por diversos gêneros bacterianos
produtores de pigmentos. Ex. o Halococcus e o Halobacterium, halofílicos
importantes na deterioração de pescados e carnes desidratados e salgados,
produzem um pigmento que varia do róseo ao vermelho.

Alterações devidas a fungos e leveduras: ex. leveduras oxidativas, rugosas e
brancas, conhecidas como film yeasts, crescem na superfície de alimentos ácidos
como picles, e alteram o pH elevando-o e propiciando o desenvolvimento de
microrganismos pouco resistentes ao ácido como o patógeno Clostridium. E os
fungos que produzem as micotoxinas, substâncias altamente prejudiciais ao
organismo de animais e humanos.
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4
Preparação de material de laboratório para análises microbiológicas
4.1
Considerações gerais
1- Normas de Higiene e Ordem Pessoais

Usar avental

Deixar de fora do laboratório casacos, bolsas, livros, etc.

Não colocar objetos de uso pessoal em cima da bancada

Não participar dos trabalhos se portador de algum ferimento nas mãos

Lavar sempre as mãos ao entrar e antes de sair do laboratório

Não fumar, comer ou ingerir líquidos dentro do laboratório.

Não tocar os olhos, boca ou nariz com as mãos.

Não umidecer etiquetas com a língua

Não fazer uso de lenços ou avental para limpar objetos ou instrumentos de
trabalho.

Tratar os cortes ou rasgões imediatamente, limpando com solução antisséptica e
com curativos.

Comunicar imediatamente qualquer suspeita de haver contraído uma enfermidade
conseqüência de uma infecção no laboratório.
2- Normas de trabalho microbiológico

No início de cada análise traçar um plano de trabalho considerando o tempo
necessário para uma análise e sua leitura

Trabalhar sempre de maneira ordenada, tranqüila, constante e metódica, evitando
movimentos desnecessários como trocas de lugar, assento, etc.

Limpar e desinfectar a superfície de mesas e balcões antes e depois do trabalho de
cada dia

Efetuar registro de análise, anotando o tipo de produto, procedência, dia e hora da
entrada no laboratório e qualquer outra observação prévia à análise. Na análise
propriamente dita anotar: método, meio de cultura empregado e resultados obtidos.

Identificar as amostras antes de iniciar a análise e em geral, não descartar até obter
os resultados.

O material a analisar deve ser tocado exclusivamente com instrumentos estéreis e
nunca com as mãos.
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
Evitar salpicar mesas e pisos com água ou soluções corantes

No caso de derramamento fortuito de material infectado, desinfectar e esterilizar
imediatamente.

Colocar todo o material usado, tais como lâminas, pipetas, etc. em recipientes,
adequados com solução desinfectante.

O material utilizado deve receber a seguinte seqüência de tratamento: esterilização,
lavagem, secagem, esterilização e armazenamento.

Os cultivos após leitura devem ser esterilizados

Não retirar qualquer cultivo do laboratório

Manter registro de controle diário de temperatura de estufas

Realizar o controle diário de contaminação ambiental em câmaras assépticas e
fluxos laminares

Analisar conservas e produtos esterilizados somente em câmaras assépticas ou
fluxo laminar classe II
3- Normas de colheita de amostras

A colheita de amostras constitui a primeira fase da análise do produto

Dentro do conceito de que a análise começa com a colheita da amostra, o serviço
de colheita deve estar bem integrado com o laboratório, devendo haver
sincronismo entre a remessa e a capacidade do laboratório em executar a análise.

As amostras para exame bacteriológico deverão ser enviadas separadas daquelas
destinadas a exames físico-químicos

Sempre que possível tais amostras devem ser enviadas em sua embalagem
original, evitando modificações em suas características originais. Quando tal
procedimento for inviável, em função do volume mínimo disponível para coleta,
aceitar-se-a fracionamento pela pessoa que o efetuar, desde que o mesmo seja
realizado em condições assépticas, cabendo neste caso ao fracionador da amostra,
toda a responsabilidade pela inoculação da mesma, de microrganismos estranhos a
sua flora original.

As amostras
para exame microbiológico deverão ser acondicionadas em
recipientes estéreis e íntegros(sem perfurações, rechaduras) na quantidade mínima
de 400g. Quando o peso unitário não atingir o mínimo aqui estabelecido, deverão
ser colhidas tantas unidades para se obter aquele quantitativo. Neste caso, cuidados
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especiais são necessários para que todas as amostras pertençam a um mesmo lote,
partida, da data de fabricação, etc.

Em casos especiais, a amostra poderá ser acompanhada de relatório adicional,
contendo informações que possam auxiliar na conduta do trabalho.

Somente serão aceitas pelo laboratório as amostras que vierem acompanhadas de
indicação precisa do(s) tipo(s) de exame a ser(em) realizado(s).

Depois de colhidas, as amostras deverão ser acondicionadas adequadamente, para
evitar qualquer alteração nas mesmas até sua chegada ao laboratório. Assim as
amostras de produtos facilmente alteráveis deverão ser acondicionadas em
recipientes isotérmicos, e acompanhadas de gelo ou outra substância refrigerante,
cuidando-se sempre pra que não haja contatoss deste com a amostra.

Providências especiais deverão ser tomadas para que o tempo decorrido entre a
colheita da amostra e sua chegada ao laboratório seja o mais breve possível,
recomendando-se que seja utilizado mecanismos que impliquem a estocagem
intermediária entre o ponto de colheita e o laboratório.

Somente serão aceitos para análise, amostras que houverem sido acondicionadas
em embalagem lacrada pela pessoa que efetuou a colheita, sugerindo-se para tal a
utilização de lacre ou outro tipo de fechamento hemético, que não possa ser
violado sem que se torne evidente. Tal providência se faz necessária para evitar a
substituição ou adulteração das amostras entre o ponto de colheita e o laboratório,
com reflexos no resultado da análise.

Todas as amostras que chegarem ao laboratório em condições diferentes das aqui
preconizadas serão recusadas, cabendo ao laboratório notificar à pessoa que
realizou a colheita, as razões de não aceitação.
4- Preparo da amostra

Produtos esterilizados-cuidados especiais deverão se observados na abertura dos
recipientes hermeticamente fechados. Posicionar a lata com a borda não codificada
para cima e costura lateral voltada para o lado oposto ao analista. Colocar sobre a
mesma, algodão embebido comhipoclorito de sódio a 5%. Usando um abridor,
previamente esterilizado, abrir um pequeno orifício no centro. Mantendo a pressão
do abridor, retira-lo lentamente. Alargar a abertura até o tamanho desejado e
transferir porções do conteúdo para os meios de cultivo indicado.
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
Produtos sólidos -com o auxílio de pinças, tesouras ou bisturis, cortar e pesar
assepticamente 25 g representativos da amostra, em copos de homogeneizador ou
sacos plásticos, tarados. Adicionar 225 mL de água peptonada a 0,1 %. Em se
tratando de cultivo de microrganismos halofilicos, substituir a água peptonada por
solução salina a 3%. Homogeinizar no máximo 2 minutos a 8000-25000 rpm. No
Stomacher 60 segundos são suficientes para dispersar a maioria dos produtos Esta
é a diluição 10-1. Homogeinizar e pipetar 1 mL para tubos contendo 9 mL de
mesmo diluente (diluição 10-2). E assim preparar as diluições desejadas, segundo o
tipo de análise a ser realizada. Produtos congelados devem ser descongelados em
refrigerador a 2-5o.C, por um tempo máximo de 18 horas antes da análise.

Produtos em pó, granulado, pastoso, etc.- com o auxílio de espátula ou colher,
pesar assepticamente 25 g da amostra em copos de homogeneizador ou sacos
plásticos tarados. Adicionar 225 mL de água peptonada a 0,1% ou solução salina a
3%, quando se tratar de halofilicos. Homogeinizar e preparar as diluições
desejadas.

Produtos líquidos e água - agitar ou inverter o recipiente com a amostra 25 vezes.
No caso do mesmo estar sem espaço livre, aspirar 10 vezes com pipeta. Pipetar
assepticamente 1 mL da amostra, transferindo para um tubo com 9 mL de água
peptonada a 0,1% ( diluição 10-1). Homogeneizar e pipetar 1 mL do tubo contendo
o mesmo diluente, ( diluição 10-2). Preparar assim as diluições sucessivas
necessárias às análises a serem efetuadas.
5. Preparo de Meios de Cultura
Considerações gerais
O crescimento de uma bactéria em laboratório é observado pela semeadura em meios
de cultura.
Quanto ao estado físico podem ser considerados 3 grupos de meios: líquidos, sólidos e
semi-sólidos. Os líquidos são obtidos pela dissolução dos nutrientes em água. Os meios
sólidos são obtidos pela adição de um agente solidificante sendo o agar-agar geralmente
preferido. O agar-agar é um polissacarídeo obtido de certas algas; não é tóxico para as
bactérias. É um composto que apresenta a vantagem de fundir 80-100°C e solidificar à
40 – 45°C. Além disso, a estrutura fibrosa do agar-agar permite a difusão dos nutrientes
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mesmo as macromoleculares. A concentração do agar- agar nos meios sólidos é de
geralmente 1,5 a 2,0%, podendo variar dependendo da pureza do agar empregado.
Os meios de cultura devem conter fontes de carbono, nitrogênio, sais inorgânicos e em
certos casos vitaminas e outros fatores de crescimento.
A composição do meio de cultura é variável segundo as exigências nutritivas do
microrganismo em estudo. Alguns germes são capazes de se proliferar em meios
extremamente simples, como por exemplo, a Escherichia coli que crece abundantemente
em meios contendo apenas glicose e sulfato de amônio. Por outro lado existem bactérias
como Lactobacillus leichmannii, com reduzida capacidade sintética sendo necessária a
inclusão de cerca de 12 nutrientes. Além da composição química é preciso considerar:
1.fornecimento de oxigênio (em alguns casos);
2. certo grau de umidade;
3. pH do meio;
4. esterilidade;
5. prevenção da contaminação externa do meio já esterilizado.
Existem no comércio, meios de cultura em pó, solúveis em água, dissolve-se uma
certa quantidade de pó (de acordo com as misturas que acompanham o meio) e esterilizase. Apresentam certas vantagens como economia e tempo de preparação de meios
uniformes
c) Prováveis causas de erros na preparação de meios de cultura desidratados
1. Problemas de pH e mudança de cor no meio de cultura (causa provável):
superaquecimento, mistura inadequada, excesso de tempo no esterilizador. Uso
de material de vidro com álcali, recipientes contaminados, água destilada,
impura, fusão do meio repetidas vezes, armazenamento à altas temperaturas,
hidrólise dos ingredientes
2. Solubilidade imcompleta (causa provável): aquecimento inadequado,
mistura incompleta causando superaquecimento de algumas partes do meio,
água destilada de má qualidade, recipiente muito pequeno, impedindo uma boa
homogenização do líquido.
Nota: em alguns casos exite um precipitado depois da esterilização do meio.
Agitar suavemente o recipiente de vidro antes de coloca-lo nas placas de Petri.
Ex.: Agar BEM, Agar Mueller Hinton
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3. Escurecimento: superaquecimento na dissolução ou na esterilização do Agar.
4. Falta de consistência do Agar: o Agar não está em solução; misturado de
forma ineficiente, peso errado do pó desidratado; pH do meio muito ácido.
Ex: agar extrato de malte com pH muito ácido não permite a geleificação do
meio, excesso de inoculo bo Agar tornando-o diluído ou por fusão do Agar
repetidas vezes.
Perda das propriedades nutricionais ou mudanças nas características de
crescimento repetidas fusões do Agar; aquecimento prolongado e excessivo;
mistura inadequada; material queimado nas paredes do recipiente; grande
quantidade de inoculo.
5. Armazenamento de meios de cultura desitradados
Os frascos com pó devem ser armazenados em lugar fresco e seco evitando
a luz direta.
Todos os meios de cultura são higroscópicos, logo que são abertos, tendem
a tomar umidade do meio ambiente.
É particularmente importante fecha-los o mais depressa possível, com uma
tampa interior e outra exterior, apertando bem cada frasco. É necessário
também não colocar os frascos em lugares onde se encontram equipamentos
de aquecimento, pois isso pode provocar reações inexatas e um
desenvolvimento inadequado.
6- Técnicas de inoculação de bactérias
Os microganismos necessitam de um meio de cultura adequado para seu crescimento
in vitro. Mas, além dos componentes presentes no meio, outros fatores interferem no seu
desenvolvimento: são fatores ambientais como temperaturas (psicrófilas, mesófilas ou
termófilas) e tensão de oxigênio (aeróbias, anaeróbias,microaerófilas e anaeróbias
facultativas).
Inoculando um microrganismo em um meio de cultura que possua todos esses
requisitos nutritivos
e fatores ambientais adequados, o microrganismo inicia seu
desenvolvimento, passando pelas diversas fases da curva de crescimento, desde a fase de
latência, logarítimica, estacionária, até a fase da morte.
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A fase logarítmica (exponencial) é caracterizada por divisões sucessivas, originando a
fomação de um grupamento de bactérias da mesma espécie que é denominado colônia.
Esta é visualizada sem o auxílio do microscópio, sendo então considerada como
característica macroscópica das bactérias.
Como cada espécie possui um tipo morfológico colonial diferente, estas de vem ser
analisadas quanto a elevação, forma, tamanho, bordas e pigmentação. Em um meio de
cultura, um único tipo de colônia observado é denominado de cultura pura; vários tipos
de colônia, cultura mista. Em microbiologia, há várias técnicas de inoculação de
microrganismos; algumas são utilizadas para exames qualitativos e outras para estudos
quantitativos(contagem de bactérias), as quais serão descritas adiante.
a) Técnicas de inoculação – indica-se a realização de uma bacterioscopia antes da
inoculação com objetivo de uma melhos escolha do meio de cultura a ser semeado.
b) Normas utilizadas – as seguintes normas denvem ser seguidas nas inoculções dos
meios de cultura: o fio e a alça de platina devem ser flambados antes e depois de
qualquer inoculação, ou seja, devem ser aquecidos ao rubro no cone interno da chama do
bico de bunsen. Para a coleta do material, devem ser resfriados na parte interna do
recipiente com meio de cultura; os recipientes (tubo de ensaio, placas de petri, etc) com
meio de cultura devem ser sempre abertos próximo ao bico de bunsen; a boca do tubo de
ensaio deve ser aquecida após a retirada e antes da colocação da tampa. A tampa nunca
deve ser colocada sobre o balcão, sendo retirada e mantida segura pelo dedo mínimo da
mão
direita
durante
a
inoculação.
c) Técnicas de semeadura em meios líquidos - inocula-se a cultura com o auxílio de
alça de platina em meio líquido
d) Técnica de semeadura em meio sólido inclinado – inocula-se a cultura da bactéria
em um meio de cultura inclinado em tubo fazendo estrias na superfície do Agar
e) Técnica de semadura em meio sólido em tubo - inocula-se a cultura de bactérias
em meio sólido utilizando a alça de platina em profundidade de 2/3 do meio e não
deverá ser mais que uma única picada
f) Técnica de semeadura em meio sólido em placa (tecnica de esgotamento) -
a
técnica de esgotamento em placa consiste em depor sobre um ponto da superfície do
meio uma alíquota do material e depois espalha-la em dois ou três setores, por meio de
alça de platina sem recarregá-la, de maneira a obter quantidades progressivamente
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menores de material. Temos que obter rarefação sufuciente do material, de modo a
formar colônias perfeitamente isoladas. O sucesso da semeadura está em grande
número de estrias, não perfurar o meio, não voltar a al/ca sobre a estria e pegar
pequena quantidade de material para semear.
g) Técnica de semeadura em placa pour – plate - a técnica pour-plate ou por
incorporação pode ser realizada com o objetivo de se obter colônias isoladas (estudo
qualitativo) ou para realizar a contagem de colônias em placa (estudo qualitativo).
Após realizar as diluições deve ser feito o plaqueamento. Agitando-se e retirando-se 1
mL de cada diluição e transferindo para placas estéreis. Em seguida, colocar 15 a 20
mL de Agar fundido em cada uma delas. As placas devem ser suavemente submetidas
a movimentos rotatórios, visando perfeita mistura da cultura com o Agar, esperar
solidificar e inverter as placas.
h) Condições de incubação – após a inoculação as bactérias deverão ser inoculadas em
ambiente com tensão de oxigênio e temperatura ideal para o desenvolvimento
pretendido (aeróbias, anaeróbias, psicrófilas, mesófilas, termófilas, etc.). O tempo
também vai depender do microrganismo em estudo. Após os períodos determinados as
colônias se tornarão visíveis macroscopicamente.
OBJETIVO da preparação de materiais para laboratório: Uniformizar os procedimentos de
preparação de material de laboratório para análises microbiológicas.
4.2
1-
PROCEDIMENTOS:
Descontaminação e descarte de resíduos contaminados
i) Submeter todo o material à esterilização em autoclave a 121o.C, por 30 minutos
observando-se os seguintes cuidados:
1. Afrouxar as tampas de todos os frascos com tampa de rosca
2. Adicionar água ou solução detergente aos estojos de descarte de pipetas, para
amolecer os resíduos e facilitar a posterior remoção.
2-
Lavagem
1-
Usar detergentes aniônicos, com compostos alcalinos; em casos
especiais utilizar agentes mais fortes como solução sulfocrômica, constituída de
ácido sulfúrico e dicromato de potássio, e a solução alcoólica 1N de hidróxido de
sódio.
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2-
Remover todo o material descontaminado presentes nos frascos e
utensílios.
3-
Mergulhar todo o material em solução detergente e deixar de molho
por 2 horas.
4-
Os tubos de Durhan deverão ser colocados de molho em frascos
separados.
5-
Retirar o algodão das pipetas antes de coloca-las de molho.
6-
Efetuar de seis (06) a doze (12)
enxágües sucessivos em água
corrente, seguidos de uma a vários enxágües em água destilada.
3-
Acondicionamento
1-
As placas de petri devem ser acondicionadas em estojos porta
placas de aço inoxidável, ou embrulhadas em papel Kraft em grupos de até 10
placas.
2-
As pipetas deverão ser preenchidas em um bocal com algodão
hidrófobo, acondicionadas em estojos de aço
inoxidável ou embrulhadas
individualmente em papel Kraft.
3-
Os tubos de ensaio deverão ser tampados com suas
respectivas tampas de rosca ou tampão de algodão. Acondicionados em cestas e
cobertos com papel Kraft.
4-
Os frascos homogeneizados ou outros frascos auxiliares
deverão ser cobertos com papel Kraft e amarrados com barbante, individualmente.
5-
Espátulas, pinças, tesouras e demais utensílios deverão ser
acondicionados individualmente em papel Kraft.
4-
Esterilização
1-
Não trabalhar com autoclaves excessivamente cheias.
2-
As pipetas deverão ser esterilizadas em autoclaves.
3-
As tampas dos tubos de ensaio deverão ser afrouxadas durante a
esterilização e após o término, deverão ser completamente fechadas.
4-
Na esterilização de vidraria vazia em autoclaves é recondável liberar
o vapor imediatamente após o término do tempo de esterilização.
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5-
No caso de meios de cultura, diluentes e reagentes, é necessário
aguardar que a pressão baixa até zero, antes de descarregar o vapor.
5-
Preparo da vidraria
1- Toda a vidraria nova para ser colocada em água destilada por 24 horas, enxaguada e
submetida a teste de pH.
2- Tampas de plástico ou borracha, de tubos de roscas ou outros frascos, devem passar
por um tratamento para remoção de resíduos tóxicos. Deverão ser mergulhados em
água destilada, autoclavar por 121 °C/15´ e enxaguar em água destilada. Repetir este
procedimento por duas vezes.
6-
Testes para verificação da eficiência da lavegem e enxágüe na remoção de
resíduos
1 – tomar alguns frascos de uma batelada de material lavado, principalmente aqueles
submetidos a tratamento com solução sulfocrômica ou solução de NaOH e adicionar
gotas de solução 0,04% de azul de bromotimol, observando a cor.
2 – Verificação da presença de resíduos tóxicos
j) Preparar 3grupos de placas de Petri:
k) Lavar 6 placas de forma usualmente utilizada no laboratório (A).
l) Lavar 6 placas de maneira usualmente utilizada no laboratório e depois submeter a 12
enxágues adicionais, com 12 porções diferentes de água destilada (B).
m) Lavar 6 placas de Petri e deixar secar sem enxaguar a solução detergente( C).
3 – Usar cada grupo para contar uma suspensão de E. coli ou. Aerogenes por
plaqueamento em profundidade de Agar Padrão para Contagem (PCA). Calcular a
média do número de colônias desenvolvidas nas 6 placas de cada grupo e comparar
as médias obtidas.
Se a diferença entre as médias dos grupos A, B e C for menor do que 15% significa
que o detergente utilizado não apresenta ação contra os microrganismos.
Se a diferença entre as médias dos grupos A e C for maior ou igual a 15% significa
que o detergente apresenta efeito tóxico contra os microrganismos. Se a diferença
entre os grupos A e B for maior ou igual a 14% significa que o método de enxágüe
utilizado pelo laboratório não foi eficiente para remover completamente esses
resíduos. Se, por outro lado, a diferença entre as médias A e B for menor do que 15%
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significa que o método de lavagem o enxágüe utilizado pelo laboratório foi eficiente
para remover os resíduos.
4 – Para avaliar a presença de resíduos em tubos ou frascos, preparar o caldo e a suspensão
de E. coli ou E. aerogenes em 3 grupos de frascos, lavados da mesma forma recomendada
para os grupos A, B e C de placas de petri. Verificar a contagem final obtida nessas
suspensões. Após a incubação por contagem padrão em placas e comparar os resíduos de
formas análogas à utilizada para as placas.
4.3
Coleta/Transporte/ Estocagem/ Preparação De Amostras Para
Análise
OBJETIVO: uniformizar os procedimentos de coleta/ transporte/ estocagem / preparação de
amostras para a análise.
PROCEDIMENTOS:
1- Coleta de amostras de alimentos em enbalagens individuais.
n) As amostras deverão
ser encaminhadas ao laboratório nas enbalagens originais
fechadas e intactas. O laboratório não deverá aceitar a amostra caso esta esteja
violada.
o) A embalagen unitária do produto deverá conter uma qualidade de alimento duas
vezes o peso ou volume da unidade analítica.
2- Coleta de amostras de alimentos em embaligens não individuais.
p) Alimentos em grandes quantidades (tanques, grades, enbalagens), deverão ser
transportadas ao laboratório em porções representativas da massa em sacos estéreis,
sob condições assépticas.
Observações:
q) Uma unidade de amostras deverá conter no mínimo 2 vezes a unidade analítica e de 3
a 4 vezes esse valor paa a separação da contra prova e prevenção de possíveis perdas.
r) Um frasco de coleta nunca deverá ser preenchido totalmente pelo alimento, utilizar
apenas ¾ da capacidade do frasco.
3- Procedimentos para a coleta
a.
Homogeneizar toda a massa de alimento, antes de iniciar
a coleta de unidade de amostra.
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b.
Para alimentos impossíveis de serem homogeneizados,
deve-se compor a unidade de amostra com porções de diferentes partes do
conteúdo.
c.
Deve-se evitar a coleta apenas das regiões próximas a
abertura do tanque.
d.
Deve-se limpar as torneiras com álcool 70% e flambar,
caso a coleta seja efetuada por esta, e deixar escoar uma certa quantidade, antes de
iniciar a coleta.
e.
Para
coletar
amostras
de
pó,
deve-se
utilizar
amostradores tipo caladores ou amostradores de tubos múltiplos, usando uma
amostrador para cada amostra e estes deverão estar estéreis.
f.
Deve-se utilizar furadeira com broca estéril para coletas
de amostras congeladas. As raspas que saem no momento da perfuração são
coletadas em frascos estéreis.
4- Coletas de alimentos envolvidos em surtos de toxinfecçõs alimentares.
1-
Coletar e analizar o mais rápido possível.
2-
Não coletar alimentos que já estejam em decomposição.
3-
Caso não haja sobras de refeições ou contra-prova das mesmas, seguir as
alternativas:
4-
Coletar os vasilhames onde as refeições se encontravam acondicionadas.
5-
Coletar amostras do lote de ingredientes e matéria-prima uilizadas na
preparação dos mesmos.
6-
Coletar amostras de refeições similares, preparadas posteriormente sob as
mesmas condições.
5- Coleta de amostras de água
1- As amostras de água cloradas deverão ser neutralizadas imediatamente após a coleta,
com tiossulfato de sódio a 10%.
5.1- Transporte e estocagem das amostras.
s) Transportar e estocar as amostras de alimentos da mesma forma como o produto é
normalmente estocado e comercializado.
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t) Os alimentos comercializados estéreis em ambalagens herméticas podem ser
transportados e mantidos à temperatura ambiente devendo ser protegidos contra a
exposição a temperaturas superiores a 45o. C.
u) Alimentos de baixa atividade de água podem ser transportados e estocados à
temperatura ambiente, devendo ser protegidos contra a umidade.
v) Os alimentos perecíveis comercializados na forma refrigerada devem ser
transportados e mantidos sob refrigeração, até o momento da análise.
Observação: Essas amostras não deverão ser congelasdas e o tempo máximo de
estocagem, decorrido entre a coleta e análise não deverá utrapassar 36 horas.
w) Amostras de ostras, mexilhões, mariscos, etc, comercializados na forma refrigerada,
sem congelamento, devem ser analizados dentro de no máximo 6 horas após a coleta.
x) Amostras de água em geral devem ser mantidas sob refrigeração e analisadas no
máximo 30 horas apos a coleta, não devendo ser congeladas.
y) Amostras de ovo líquido resfriado devem ser analisadas, se possível dentro de 4 horas
após a coleta, não devendo ser congeladas.
z) Amostras de produtos vegetais fermentados ou acondicionados, não comercialmente
estéreis, devem ser estocadas sob refrigeração por não mais do que 24 horas, não
devendo ser congeladas.
aa) Amostras destinadas à inumeração de Vibrio sp, C perfringens e bactérias lácticas
não devem ser congeladas, devido à grande susceptibilidade desses microrganismos às
injúrias pelo congelamento.
bb) Amostras de alimentos perecíveis comercializados na forma congelada devem ser
transportadas e mantidas congeladas até o momento da análise, não podendo sofrer
descongelamento total ou parcial durante o transporte. A temperatura de estocagem
dessas amostras não deve ser superior a –10° C.
cc) O transporte refrigerado de amostras perecíveis refrigeradas por ser feito em caixas
plásticas de isopor com gelo, sendo recomendável que o gelo seja mantido dentro de
sacos plásticos, para evitar o acúmulo de líquido nas caixas. Caixas bem fechadas e
com gelo suficiente para envolver toda a embalagem ou frasco de amostra podem
manter temperaturas de refrigeração adequadas por até 24-30 horas. Se o transporte
for prolongado, pode-se utilizar gelo seco, porém, certos cuidados devem ser
observados:
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a) Se a temperatura da amostra for permeável aos gases ou tornar-se quebradiça
com o frio, deve-se usar embalagem secundária para prevenir um possível
contato com CO2 com a amostra. Geralmente um embrulho em papel grosso é
suficiente para prevenir esse problema;
b) Não se deve colocar gelo seco em contato direto com amostras que devem ser
apenas resfreiadas, pois elas podem congelar.
6- Recepção e preparação das amostras para análise
a) Na recepção de amostras para análise no laboratório, devem ser observadas as condições da
embalagem e as condições em que foi feito o transporte, antes da aceitação do pedido de
análise.
b) Deve ser recusadas qualquer amostra com embalagem rasgada, furada, violada, com corpos
estranhos ou qualquer outro tipo de defeito, bem como amostras transportadas sob condições
inadequadas. Se o interessado estiver encaminhando amostras com embalagem já aberta ou
com selo violado (comum no cado de amostras encaminhadas para responder a reclamações
de consumidores, por exmplo), pode-se proceder à análise, dependendo do tipo de
embalagem, tipo de produto e microrganismos investigados, porém, as condições em que a
amostra foi recebida devem constar da identificação da amostra e do laudo final de análise.
ATENÇÃO:
Não há sentido em fazer teste de esterilidade comercial em amostras de alimentos cujas
embalagens foram abertas antes do momento de análise;
Não há sentido em analizar amostras de alimentos resfriados ou congelados que foram
transportados à temperatura ambiente.
c) A preparação das amostras para a análise envolve basicamente duas etapas: a retirada da
unidade analítica, que deve ser feita de forma a garantir
que a porção removia seja
representativa de todo o conteúdo da unidade de amostra e a preparação de diluições
decimais seriadas de unidade analítica, para inoculação nos meios de cultura. No caso de
alimentos sólidos ou líquidos concentrados, a primeira diluição (10) deve ser acompanhada
de uma adequada homogeneização da unidade analítica, que deve ser conseguida por
agitação, trituração em liquidificador ou dispersão em “stomacher”.
7- Preparação de amostras de alimentos sólidos ou líquidos concentrados
a)Antes de abrir as embalagens, desinfetar a área externa com etanol 70%, para remover os
contaminantes presentes. No caso de latas destinadas ao teste de esterilidade comercial, lavar
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as latas com água e detergente e, em seguida, desinfetar com álcool iodado (etanol 70%
suplementado com 4% de iodo). Observar e anotar qualquer anormalidade nas embalagens,
bem como no conteúdo interno, como odor e/ou aparência estranha, ou presente de corpos
estranhos.
b)Retirar assepticamente uma unidade analítica de 25g de amostras e transferir para o frasco
de homogeneização previamente esterilizado e tarado. Na retirada da unidade analítica,
obedecer aos seguintes cuidados:
A abertura das embalagens e a retirada
da unidade analítica devem ser feitas,
preferencialmente, no interior de câmaras de fluxo laminar, para prevenir qualquer
contaminação ambiente da amostra. Na imposibilidade de uma câmara de fluxo laminar,
deve-se trabalhar na região próxima à chama de um bico de Bunsen de tamanho médio,
chama azulada, com as portas e janelas do laboratório fechadas para evitar correntes de ar.
Todos os instrumentos e utensílios utilizados na abertura das embalagens e retirada das
unidades analíticas (tesouras, pinças, facas, espátulas, etc)
esterilizados em autoclave ou estufa de esterilização
devem ser previamente
mergulhados
em etanol 70% e
flamejados no momento do uso.
Amostras de líquidos concentrados e de alimentos pastosos, moídos ou em pó devem ser
revolvidas com uma espátula estéril em movimentos circulares, antes da retirada de unidade
analítica não deve exceder 15 mínutos.
Para retirada da unidade analítica de peças de alimentos sólidos, como cortes de carne,
salsichas, queijos duros, etc, deve-se usar uma faca ou tesoura estéril para cortar pedaços
menores, de diversos pontos da peça, até se obter a quantidade requerida para a análise. No
caso de peixes inteiros, recomenda-se remover uma parte da pele, carregando a menor
quantidade possível dos tecidos internos, ou utilizar o método da esfregaço de superfície.
Se a amostra for heterogênea, como é o caso de bolos rechesados, tortas, sobremesas e outros
pratos prontos para consumo, por exemplo, compostos por diferentes camadas de
composições distintas, a unidade analítica deve ser composta com porções tomadas de cada
uma das camadas. Eventualmente, dependendo do microrganismo investigado e da razão da
análise, pode-se macerar toda a amostra e retirar a unidade analítica no macerado. Em outras
situações, ao contrário, pode ser rcomendável tomar unidades analíticas separadas, de uma ou
mais camadas distintas e analisar separadamente. Um exemplo de situação em que essa
prática pode vir a ser necessária é a análise de alimentos suspeitos em surtos de toxinfecções
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alimentares, em que as camadas foram preparadas separadamente e posteriormente reunidas
no prato completo, podendo conter números e tipos de microrganismos diferentes em cada
camada.
Alimentos congelados devem, de preferência, ser preparados para a análise sem congelamento
prévio, pois o processo de descongelamento pode provocar injúrias a um número significativo
de células
dos microrganismos. Além disso, o recongelamento de amostras, depois da
retirada da unidade analítica, para estocagem como contra-amostra, deve ser evitada sempre
que possível. Os resultados obtidos nema eventual análise dessa porção, depois de um
segundo processo de congelamento/descongelamento, sempre serão menos confiáveis, em
função das perdas das células por injúria ou morte. Esse cuidado é particularmente importante
no caso de amostras destinadas à detecção ou contagem de Vibrio sp. C. perfringens e
bactérias lácticas, particularmente sensíveis às injúrias pelo congelamento. Para estocagem de
contra-amostras, nesses casos, a unidade analítica deve ser retirada sem descongelamento
prévio, com a ajuda do método da furadeira elétrica, se necessário. Quando não for possível
retirar a unidade analítica sem descongelar a amostra, o descongelamento deve ser feito em
geladeiras e, sempre que possível, na embalagem original. Geralmente 18 horas são
suficientes para descongelar a maioria das amostras de alimentos em geladeira. Se um
descongelamento rápido for requerido, pode-se manter a amostra a 20-25o.C por três horas
seguidas, seguidas de, no máximo, 15 minutos a temperaturas mais altas (não superior a 40o.
C), removerndo-se a unidade analítica, se possível, antes do complexo descongelamento. Em
nenhum caso essas amostras devem atingir temperaturas superiores à 5o.C, antes do início
das análises.
Se a quantidade de amostras encaminhadas prara a análise for menor do que a unidade
analítica requerida, deve-se submeter metade à análise, desde que a quantidade de amostra +
diluente (diluição 10-1) no copo do liquidificador seja suficiente para cobrir as facas do
aparelho.
Para a análise simultânea de Salmmonella, é requerida uma unidade analítica adicional,
geralmente de 25g, diluída diretamente em 225 ml de caldo de pré-enriquecimento.
Amostras de moluscos em conchas devem ser preparadas obedecendo aos seguintes
procedimentos: lavar as mãos com água e sabão e, em seguida, com etanol 70%. Com uma
escova abrasiva estéril, esfregar as conchas sob água corrente (tratada) removendo todos os
resíduos aderidos à casca. Colocar as conchas sobre uma toalha estéril e aguardar que a água
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escorra e seque naturalmente. Com as mãos limpas e higienizadas com álcool, abrir as
conchas com o auxílio de uma faca estéril, recolhendo os organismos e o líquido que escorre
do interior das conchas entre a abertura de uma concha e outra.
Amostras de ovos em casca devem ser preparadas obedecendo aos seguintes procedimentos
para a análise do conteúdo interno; retirar os ovos da geladeira e transferir para uma estufa a
20o.C, por um certo período de tempo. Em seguida passar à estufa de 25o.C, também por um
período de tempo e em seguida transferir para a temperatura ambiente, para equilibrar
definidamente a temperatura. Esses cuidados visam evitar o acúmulo de condensado na casca
fria, que favorece a penetração de bactérias para o interior. Lavar os ovos com água e
detergente, garantindo que a água de lavagem se encontre numa temperatura 11o.C acima da
temperatura dos ovos, porém não inferior a 32o.C. Drenar o excesso de líquido, mergulhar os
ovos em etanol 70% por 10 minutos e flambar. Lavando e desenfetando bem as mãos,
segurar os ovos, quebrar a casca e verter o conteúdo a um período inicial de 1 a 2 minutos de
homogeneização, antes da adição de diluente e homogeneização definitiva da diluição 10-1.
Diluição 10-1: Adicionar à unidade analítica de 25g, 225ml de diluente e homogeneizar,
obedecendo as seguintes recomendações:
Os diluentes recomendados para a análise da maioria dos alimentos são a água peptonada
0,1%, a água salina peptonada ou tampão fosfato pH 7,2. A duluição inicial recomendada para
a maioria doa alimentos sólidos é 1:10. Há casos especiais em que se recomenda a utilização
de outros diluentes ou outras diluições iniciais, a maioria deles discutidos em cap[itulos
específicos. As diferenças mais freqüentes são:
c)Na análise de alguns derivados de leite, o diluente recomendado é a solução de citrato
de sódio 2%
(queijos, leite em pó de baixa solubilidade, iogurte e outros leites
fermentados) ou a água destilada estéril (leite em pó de alta solubilidade, leite
condensado, concentrado ou evaporado).
d)Na análise de Salmonella a diluição inicial diretamente no caldo de pré-aquecimento.
No caso de amostras preparadas pelo método de lavagem ou esfregaço de superfície, o
material diluído no caldo de pré-aquecimento pode ser utilizado na realização das demais
análises.
e)Na análise de moluscos em concha (ostras, mexilhões, mariscos), a primeira diluição
deve ser 1:1 e, caso não seja posível pipetar o material, diluir a 1:3.
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f)Na análise de condimentos, pode-se trabalhar com uma unidade analítica de 11 gramas,
diluídas em 99ml diluente.
g)Na análise de espessantes, pode-se trabalhar com unidade analíticas de 5 a 12,5 gramas,
recomendando-se diluição inicial de 1:100, em função da alta viscosidade do material.
A homogeneização da unidade analítica com o diluente pode ser feita de diferentes
formas, dependendo das características da amostra analisada.
h)Alimentos líquidos concentrados, moídos ou em pó: podem ser homogeneizados por
simples agitação manual do frasco (invertendo-se 25 vezes em aço de 30 cm) ou em
“shaker” rotativo. Amostras de condimentos em casca ou raiz, como canela em casca, por
exemplo, devem ser previamente moídas em liquidificador (100 gramas, 30 segundos em
baixa rotação).
i)Alimentos sólidos em peças: (como cortes de carne, queijos duros, chocolate em barra,
etc): podem ser homogeneizados por trituração em liquidificador, com rotação de 8000 a
15000 rpm por 1 a 2 minutos. Dependendo da resistência do alimento, pode ser gerada em
quantidade significativa de calor, principalmente se o tempo requerido para a completa
trituração da amostra ultrapassas os 2 minutos. Nas situações em que isso seja esperado,
recomenda-se que o diluente seja pré-resfriado em banho de gelo, antes do início da
homogeneização.
j)Alimentos pastosos: (como extrato de tomate, goiabada, purês, queijos mole, sorvetes
de massa etc): podem ser homegeneizados por dispersão em “Stomacher” (30 a 60
segundos). Amostras de maionese e outras coberturas para saladas exigem pelo menos 2
minutos, para uma boa homogeneização e, análise de coliformes, E. coli, Salmonella, S.
aureus, Listéria e Yersinia devem ser tratadas com uma solução estéril de NaOH 1N na
quantidade necessária para neutralizar a acidez.
l)Espessantes: Na homogeneização de espessantes por agitação, o diluente não deve ser
adicionado ao produto, pois isso dificultará a dispersão. A prática recomendável é pesar a
unidade analítica em um pedaço de papel ou de alumínio estéril à agitação. Nesse caso, é
recomendável utilizar um agitador magnético, esterilizando-se previamente a barra
magnética.Opcionalmente, essas amostras podem ser homogeneizadas em “stomacher”
por 2 minutos.
m)Pós de baixa solubilidade: Amostras de alimentos em pó com baixa solubilidade,
como ovo em pó e leite em pó instantâneo, também são melhor homogeneizadas se a
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agitação for feita com o auxílio do agitador magnético, adicionando-se o diluente aos
poucos, sob constante agitação.
n)Alimentos gordurosos: Para homogeneizar alimentos sólidos com alto teor de gordura
(>20%) , como toucinho defumado, por exemplo, recomenda-se utilizar o diluente
previamente suplementado com 1% (peso/volume) de Tergitol 7 aniônico, Tween 80 ou
triton x-10, para facilitar a emulsificação. A homogeneização é conseguida com 1 a 2
minutos em liquidificador, baixa rotação (8000rpm). Essa forma de homogeneização
também pode ser utilizada por amostras de manteiga, margarina, gorduras e similares, que
alternativamente podem ser homogeneizadas por fusão em banho Maria (40o.C/15 min),
adição de diluente pré-aquecido a 40o.C, agitação e preparação das diluições seriadas
rapidamente, antes que a suspensão resfrie.
O intevalo entre a homogeneização analítica e a preparação das diluições posteriores não
deve ultrapassar 3 minutos.
o)Diluições seriadas: Para a preparação da segunda diluição (10-2) transferir
assepticamente 1 ml da diluição 10-1 para 9 ml de diluente ou 10 ml da 10-1
para 90
ml de diluente. As diluições subseqüentes são obtidas de maneira similar, transferindo-se
1 ou 10 ml da diluição anterior para 9 ou 90 ml de diluente. Ao preparar as diluições
seriadas, procurar obedecer as seguintes recomendações:
1.
O diluente utilizado na preparação das diluições 10-2 e superiores deve ser o
mesmo utilizado na preparação da primeira diluição (10-1). Não necessário, entretanto,
suplementar o diluente, nos tubos de diluição, com Tween 80, Tergitol 7 ou triton X-100,
para a 2a. e demais diluições de amostras gordurosas.
2. O número de diluições requeridas depende do nível de contaminação esperado. Por
exemplo, se a contagem estimada encontra-se por volta de 2.500 a 25.000/g de amostra,
as diluições recomendadas para a contagem em placas são a 10-1, 10-2 e 10-3 para se
obter placas com contagens entre 25 e 250 colônias. Caso não haja possibilidade de se
estimar previamente o nível de contaminação
da amostra, então deve-se preparar e
inocular um maior número de diluições (10-1 a 10 -7 ).Na transferência de volumes entre
as diluições, usar sempre uma pipeta diferente para cada situação. Antes de retirar o
volume a ser transferido, agitar vigorosamente o tubo ou frasco, invertendo 25 vezes em
arco de 30 cm ou com auxílio de um agitador tipo “vortex”. Na seleção das pipetas para a
análise escolher sempre pipetas que tenham capacidade no máximo 10 vezes superior ao
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volume que vai ser coletado. Por exemplo, para pipetar volume de 1 ml, utilizar pipetas de
no máximo 10 ml. A pipeta deve ser completamente preenchida e o volume descarregado
a partir da marca superior, mesmo que se vá liberar um volume menor
do que a
capacidade da pipeta. Deve-se evitar a liberação de volumes a partir da última e penúltima
marca inferiores das pipetas. A liberação do volume deve ser feita com a ponta da pipeta
encostada na parede interna do tubo ou frasco, de forma que o líquido escorra pela parede.
Não se deve flambar pipetas. Caso a ponta venha a tocar qualquer superfície não estéril,
como a parte externa do porta-pipetas, a boca das outras pipetas ou as paredes externas do
tubo ou frasco de diluição, por exemplo, a pipeta deve ser descartada e substituída por
outra.
8- Preparação de amostras de líquidos para análise
dd) Amostras líquidas devem ser colocadas em frascos com espaço suficiente para a
agitação devem ser misturadas antes da retirada da unidade analítica, inveertendo-se a
embalagem 25 vezes, num arco de 30 cm. Se não houver espaço-livre para a agitação
da amostra, utilize um segundo frasco, estéril, e misture a massa do produto
transferindo a amostra de um frasco para o outro, por 3 vezes. Amostras de bebidas e
refrigerantes gaseificados devem ser transferidas para um frasco estéril e, com a tampa
ligeiramernte aberta, agitadas em “shaker” até a completa expulsão dos gases. O
intervalo entre a mistura da amostra e a retirada da unidade analítica não deve
ultrapassar 3 minutos.
ee) Antes de abrir as embalagens, limpar a área externa com etanol 70%, para remoção
dos contaminantes presentes.
ff) Diluição 10-1: Transferir assepticamente uma porção de 1 ml da amostra para 9 ml de
diluente,
utilizando
os
mesmos
diluentes
recomendados
anteriormente.
Alternativamente pode-se transferir 10 ml de amostra para 90 ml de diluente ou 25 a
50 ml de amostra para 225
a 450 ml de diluente, dependendo do grau de
contaminação esperado. Na análise da Salmonella, a unidade analítica recomendada
é 25 ml e a primeira diluição (10-1) é feita diretamente no caldo de préenriquecimento. Ao pipetar o volume da amostra para a primeira diluição evite
mergulhar a pipeta numa profundidade superior a 2,5 cm. Utilize uma pipeta com
capacidade no máximo 10 vezes superior ao volume que vai ser pipetado.
gg) Diluições seriadas: Seguir o mesmo procedimento descrito para alimentos sólidos.
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5- Preparação de amostra para a análise pela técnica de lavagem superficial ou
pela técnica de esfregaço de superfície
a) No caso de alimentos cuja contaminação é predominantemente superficial, em lugar de
se coletar uma unidade analítica da amostra, transferindo-se junto as partes internas da
peça, pouco representativas, pode-se coletar diretamente os contaminantes externos,
usando-se a técnica da lavagem superficial ou a técnica de esfregaço de superfície.
5.1-
Técnica de lavagem superficial
a)Aplicação: Carcaças de aves inteiras, cortes de aves, camarões descabeçados, pequenos
peixes, cascas de ovos, condimentos em grãos, sementes ou folhas, nozes, amêndoas,
amendoins e superfícies de embalagens.
b)Procedimento: Transferir toda a amostra ou parte dela (maioria dos alimentos, 50 g,
condimentos, 11g) para um frasco ou saco plástico estéril tarado e pesar. Adicionar o
volume de diluente requerido para a diluição inicial desejada, na maioria dos casos 1:1, ou
seja, 1 ml de diluente por grama de amostra, de forma que cada mililitro do lavado vai
corresponder a um grama de amostra. Lavar a amostra agitando vigorosamente o frasco,
manualmente por 50 vezes, ou em “shaker”. No caso de sacos, pode-se não só agitar a
amostra, como também massagear as peças com as mãos por fora dos sacos, tomando-se
os devidos cuidados para que as pontas ou outras protuberâncias não venham a furar a
embalagem. Para a seleção dos diluentes e preparação das diluições subseqüentes, sequir
as recomendações no item 2.7. Na análise de Salmonella, o diluente utilizado é o próprio
caldo pré-enriquecimento.
OBSERVAÇÃO: No caso da análise de carcaças inteiras de frangos, a primeira
diluição usualmente não é 1:1, sendo mais comum a adição de 300 ml de diluente,
independente do peso da carcaça. Neste caso, o peso da amostra representado por
cada milimitro de lavado é calculado em função do peso total da carcaça. Se for
requerida a análise simultânea de Salmonella, a lavagem das carcaças deve ser
feita diretamente com o caldo de pré-enriquecimento e o material obtido também
deve ser utilizada para a realização das demais análise. No caso de condimentos
em grãos, sementes e folhas, ou no caso de nozes e amêndoas sem casca, a
diluição usual é 1:10, em lugar de 1:1 e a lavagem é mais eficiente se for utilizado
o auxílio do “shaker” por 5 minutos (10 minuitos para nozes e amêndoas com
película).
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c)Cálculo dos resultados: os resultados devem ser expressos em unidade formadores de
colônias (UFC)/grama, se a contagem for feita em placas, ou em número mais provável.
Inicialmente, deve-se calcular o NMP ou UFC por mililitro de água de lavagem, com a
concentração de microrganismos inicial, recolhida da amostra. Como se fosse uma
amostra sem diluição (10o.). Em sequida, deve-se converter o NMP ou UFC obtido por
mililitro de água de lavagem em NMP ou UFC por grama de amostra, em função da
diluição inicial utilizada na lavagem (peso de amostra: volume de diluente). Se a diluição
for 1:1, cada ml de lavado corresponderá a 1 g de amostra e o valor do NMP ou UFC/g
será iqual ao valor obtido por ml. Se a diluição dor diferente de 1:1, deve-se primeiro
calcular a quantos gramas de amostra corresponde 1 ml de lavado. Por exemplo, se uma
carcaça de 1,5 kg for lavada com 300ml de diluente, cada ml de lavado corresponderá a 5
g de amostra. Neste caso, o NMP ou UFC/g de amostra será iqual ao NMP ou UFC/ml
de lavado, dividido por cinco.
5.2-
Técnica de esfregaço de superfície
a)Aplicação: Peixes inteiros, carcaças e cortes de bovinos, suínos e aves superfícies de
equipamentos, mesas, utensílios e embalagens.
b)Procedimento: Usando o molde estéril delimitar a área a ser amostrada. Aplicar um
“swab”
com pressão, numa inclinação aproximada de 45o, descrevendo primeiros
movimentos da esquerda para a direita e depois de cima para baixo. Deve-se rodar
continuamente a “swab”, para que toda a superfície do algodão entre em contato com a
amostra. No exame de superfícies secas, recomenda-se umedecer o “swab” no diluente
antes da utilização, comprimindo-o contra as paredes do frasco de diluente, para remover
o excesso de líquido. O “swab” não deve ser segurado próximo do algodão e a parte
manuseado da haste deve se quebrada na borda interna do tubo de diluente, antes de se
mergulhar o material amostrado.
c)Esfregaço de meias carcaças de bovinos e suínos: Deve-se selecionar cinco pontos em
partes distintas da carcaça, sendo estes demarcados com moldes estéreis de 10 cm2 (um
molde para cada ponto) e aplicar o “swab” em cada um dos pontos. Colocar os 5 “swabs”
em um mesmo frasco, com 25 ml de diluente, agitar em “vortex” (2 minutos), ou
manualmente (invertendo-se 25 vezes em arco de 30 cm) e proceder às análises
pertinentes. Cada mililitro de diluente corresponderá a 2 cm de superfície e os resultados
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são expressos por cm
de amostra. Na análise de salmonella, o diluente utilizado é o
próprio caldo de pré-enriquecimento.
d)Cálculo dos resultados: Os resultados devem ser expressos em NMP ou UFC por cm
de amostra. Inicilamente deve-se calcular o NMP ou UFC por mililitro de dimuente onde
foi suspenso o material coletado com o “swabs”. Considerar essa suspensão como se fosse
uma amostra de diluição (10o). Em sequida, deve se converter o NMP ou UFC/ml de
suspensão de NMP ou UFC/cm2
de amostra. Para tanto, calcular a quantos cm
coresponde cada ml de suspensão corresponde a 2 cm2 de amostra, porém, essa relação
pode ser alterada a critério do analista, dependendo do tipo de amostra e objetivo da
amostragem. É recomendável trabalhar sempre com volumes de diluente múltiplos das
áreas amostradas, para facilitar os cálculos. No caso das meias carcaças de bovinos, o
NMP ou UFC/cm2
será igual ao valor obtido por ml de suspensão, dividido por dois.
Numa outra situação, em que um esfregaço de 100 cm2 de área fosse suspendido em 10
ml de diluente, por exemplo, em que um esfregaço de 100 cm2 de área fosse suspendido
em 10 ml de diluente, por exemplo, cada ml de suspensão corresponderá a 10 cm2
de
área e o NMP ou UFC/cm2 seria iqual ao valor obtido por ml de suspensão, dividido por
dez.
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6- CONTAGEM
TOTAL
DE
MICRORGANISMOS
AERÓBIOS
MESÓFILOS/PSICROTRÓFICOS E DE FUNGOS E LEVEDURAS EM
PLACAS.
Objetivo: Uniformizar os procedimentos de preparação de material de laboratório para
análises microbiológicas.
Introdução
O método de contagem de microrganismos em placas é o método geral, que pode ser
utilizado tanto para contagem de grandes grupos microbianos, como os aeróbios mesófilos,
os aeróbios, psicrófilos, os fungos e leveduras e os clostrídios sulfito redutores, dentre outros,
como também com a contagem de gêneros e espécies em particular, como Staphylococcus
aureus, Bacillus cereus e Clostridium
perfringens, por exemplo. Essa versatilidade é
decorrente do princípio do método, que se baseia na premissa de que cada célula microbiana
presente em uma amostra irá formar, quando fixada em um meio de cultura sólido adequado,
uma colônia visível e isolada. Variando o tipo (meio de enriquecimento, meio seletivo, meio
seletivo-diferencial) e as condições de incubação (temperatura a atmosfera), é
possível
selecionar o grupo, gênero e espécie que se deseja contar. Com as células microbianas muitas
vezes ocorrem em agrupamentos (pares, tétrades, cachos, cadeias etc), não é possível
estabecer uma relação direta entre o número de colônias e o número de células. A relação
correta é feita entre o número de colônias e o número de “unidades formaduras de colônias”
(UFC), que podem ser tanto células individuais como agrupamentos característicos de certos
microrganismos.
Procedimentos
Contagem pelo metodo de plaqueamento em profundidade
a)Preparação das amostras e diluições seriadas: Seguir os procedimentos descritos no
item de Recepção e preparação das amostras para a análise.
b)Inoculação: selecionar três diluições adequadas da amostra e inocular 1 ml de cada
diluição em placas de Petri separadas, estéreis e vazias, abrindo apenas o suficiente para
inserir a pipeta, próximo ao bico de Bunsen.
Para obter bons resultados, deve-se observar os seguintes cuidados:
1.
Depositar o inóculo fora do centro da placa, pois isso facilitará a posterior
mistura com meio de cultura, utilizar pipetas de no máximo 10 ml.
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2. Selecionar as diluições em função do nível de contaminação, estimado da amostra,
deforma a obter placas com 25 a 250 colônias. Se o nível de inoculo esperado encontra-se
na faixa de 2.500 a 25.000 UFC/g ou ml, por exemplo, as diluições recomendadas são 101
, 10-2 e 10-3. Se a contaminação esperada estiver acima dessa faixa, deve-se inocular
diluições mais altas. Caso não seja possível estimar previamente o nível de contaminação
da amostra, então se recomenda inocular mais do que três diluições, partindo da diluição
inicial. Na análise de espessantes (gomas, pectinas, carboximetilcelulose etc), a unidade
analítica varia de 5 a 12,5 g e a diluição inicial deve ser 1:100, em função a viscosidade
do material. Se as contagens esperadas são baixas, deve-se inocular 10 ml da diluição 10-2,
distribuídos em 5 placas (2 ml/placa). Na análise de condimentos, particularmente cravo,
canela, mostarda moída, alho e cebola em pó, a presença de compostos antimicrobianos
naturais na amostra pode resultar em contagens errôneas nas primetras diluições. Para
prevenir este problema, pode ser necessário incluir diluições, plaquear 10 ml da 10-2,
distribuídos em 5 placas. Embora não seja imprescindível, para aumentar a precisão das
contagens recomenda-se inocular duas ou mais placas por diluição (duplicata ou triplicata)
e não utilizar pipetas com capacidade maior do que 2 ml.
c)Adição do meio de cultura: verter nas placas inoculadas, 15 a 20 ml de Agar padrão
para Contagem (PCA), previamente fundido e resfriado a 45o.C. Misturar o inóculo com
o meio de cultura movimentando suavemente as placas, numa superfície plana, em
movimentos na forma de oito ou em movimentos circulares, 8 a 10 vezes no sentido
horário e oito a dez vezes no sentido anti-horário. A forma de movimentar as placas para a
mistura do inoculo (em oito ou em movimentos circulares) deve ser mantida pela analista
durante toda a análise, não se devendo alternar hora uma prática, hora outra. Para
conseguir bons resultados, é necessário observar os seguintes cuidados:
1.Depois de resfriar o meio de cultura em água corrente, ou retira-lo do banho a
45o. C, secar o frasco, para evitar respingos de água nas placas, no momento do
plaqueamento. Evitar agitação com movimentos bruscos, para que não haja
formação de bolhas no meio.
2.A mistura do meio de cultura com o inoculo deve ser feita imediatamente após a
adição do meio, para não haver risco de solidificação do agar. A movimentação
das placas deve ser feita cuidadosamente, para evitar respingos de meio nas
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bordas ou nas tampas das placas. Para facilitar esta etapa do trabalho, utilizar
preferencialmente placas altas (20 X 100mm) no plaqueamento em profundidade.
3. Para prevenir a eventual ocorrência de colônias superficiais espalhadas, podese recobrir a superfície do meio, após a solidificação, com uma sobrecamada
fina do mesmo meio.
4. O tempo decorrido entre a preparação da primeira diluição da amostra e a
preparação de última placa não deve ultrapassar 20 minutos, para evitar o
ressecamento e aderência do inoculo no vidro da placas.
d)Incubação: Aguardar a completa solidificação do meio de cultura, distribuindo as
placas numa superfície plana. Inverter as placas e incubara 35o.C por 48 horas. No caso
de produtos vegetais fermentados ou acidificados não comercialmente estéreis,
recomenda-se incubar a 32o.C/3 dias, cobrindo a superfície das placas com sobrecamada
do mesmo meio.
e)Contagem das colônias e cálculos dos resultados: (consultar o anexo I, com exemplos
de cálculos em diferentes situações). Selecionar as placas com 25 a 250 colônias e contar
as colônias com o auxílio de uma lupa, em um contador de colônias. Calcular o número de
colônias pelo inverso da diluição inoculada (Exemplo 1 ).
UFC / g ou mL 
n o Colônias
diluição
Caso tenha sido utilizada mais de uma placa por diluição (duplicata ou triplicata),
considerar como número de colônias a média aritmética da contagem obtida em cada uma das
placas duplicata ou triplicata (exemplo 2). Usar notação exponencial e apenas uma casa
decimal depois da vírgula, na apresentação dos resultados.
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Tabela 1– Exemplos para o cálculo do número de UFC/g ou ml na contagem em placas.
Exemplo Nplacas/ diluição
1
1
2
2
10-1
10-2
10-3
Contagem (UFC/g ou mL
INC
*230
21
230
 2 ,3 x10 4
10  2
INC
*230
21
INC
*230
23
230
 2 ,3 x10 4
10  2
3
1
INC
INC
*370
370
 3,7 x10 5 est
10  3
4
1
INC
INC
*8/cm 2
8 x 65
 5, 2 x10 5 est
3
10
5
1
INC
INC
*21/cm2
21 x 65
 1, 4 x10 6
3
10
6
1
INC
INC
>*100/
2
cm
7
1
*13
1
0
8
1
0
0
0
9
2
INC
INC
*237
INC
INC
*263
*27
3
0
*27
2
0
INC
*243
*34
INC
*228
*28
INC
*240
*26
INC
*228
*28
INC
*240
*23
INC
*225
*21
INC
*260
*40
INC
*140
32
10
2
11
1
12
2
13
2
14
2
15
1
¿ 6500
ou
10 − 3
6,5 x 10 6
est
13
 1 , 3 x 10 2 ( est )
10  1
¿1
=ou
10 − 1
10
est
237 2631
=2,5 x 105
1x10 − 3
27  21
 2 , 4 x10 2
1
2 x10
243
34
 3
2
10
10  2 ,9 x10 4
2
228  240 28  26

2 x10  2
2 x10  2  2,5 x10 4
2
228  240 28  23

2 x10  2
2 x10  3  2, 4 x10 4
2
225  260 21  40

2 x10  2
2 x10  3  2,7 x10 4
2
140
 1, 4 x10 4
2
10
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16
2
INC
*138
42
INC
*162
30
138  162
 1,5 x10 4
2 x10  2
*Contagens efetivamente utilizadas no cálculo dos resultados
f)Contagem de colônias e cálculo dos resultados em situações não usuais
1.Todas as placas apresentam mais de 250 colônias: Nestes casos, nunca apresente o
resultado como “INCONTÁVEL”, pois há três alternativas para estimar o número de
UFC/g ou ml. Se for possível contar todas as colônias da placa, deve-se contar e calcular
o núnero de UFC a partir da contagem obtida (Exemplo 3). Se não for possível contar
todas as colônias de placa, mas o número de colônias/cm estiver abaixo de 10, contar as
colônias em 12 quadrados em 1 cm2, 6 quadrados consecutivos na horizontal e 6
quadrados consecutivos na vertical, utilizando os quadrados demarcados no contador de
colônias (Exemplo 4). Calcular o número médio de colônias/cm2 e, a partir da média/cm2,
determinar o número total de colônias por placa, multiplicando a média pela área total da
placa (65 cm2, no caso das placas de diâmetro externo 100 mm). Utilizar este número total
de colônias para calcular o número de UFC. Se o número de colônias/cm for maior do
que 10, contar as colônias em quatro quadrados representativos da distribuição das
colônias nas placas e calcular o número de UFC da mesma forma utilizada no caso de 12
quadrados (Exemplo 5). Se o número de colônias/cm2 for maior do que 100, apresentar
como maior que 6.500/diluição (Exemplo 6). Em todos esses casos, o resultado deve ser
apresentado como contagem estimada.
2.Nenhuma placa atingiu 25 colônias: Contar as colônias com número mais próximo de
25, calcular o número de UFC (Exemplo 7) e aparesentar o resultado como contagem
estimada.
3.Nenhuma placa com crescimento: Apresentar o resultado como menor do que
1/diluição, valor estimado (Exemplo 8).
4.Placas em duplicata, uma com 25-250 colônias e uotra com mais de 250 ou menos
de 25: Considerar o número de colônias de ambas as placas, utilizando a média para
calcular o número de UFC (Exemplos 9 e 10).
5.Duas diluições consecutivas com 25-250 colônias: calcular o número de UFC de cada
diluição e comparar os resultados. Se um dos resultados for maior do que o dobro do
outro, considere apenas o menor (Exemplo 11, 12 13 e 14).
6.Placas com espalhamento: Há dois tipos distintos de espalhamentos: espalhamentos
resultantes da desintegração de agrupamentos de células, durante a mistura do inoculo
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com o meio, levando à formação de filmes de umidade na superfície do meio ou entre o
meio e o fundo da placa. A distinção entre os dois tipos é facilmente visualizada, porque
nos espalhamentos do primeiro tipo sempre se pode observar crescimento de colônias
individuais. As placas com espalhamento, poderão ser contadas nas seguintes condições:
se nenhuma das zonas de espalhamento individuais tiver tamanho superior a 25% da área
da placa e, ainda, se a área total coberta por zonas de espalhamento não ultrapassar 50%
da placa. Para contar placas com zonas de espalhamento do primeiro tipo, cada zona deve
ser contada como uma única UFC. Não conte as colônias individualmente dentro dessas
zonas. Para contar placas com zonas de espalhamento de dois tipos, selecionar uma região
da placa, livre de espalhamento e contar as colônias em diversos quadrados de 1 cm2.
Calcular a média de colônias/cm2, multiplicar pela área total da placa (65 cm2 no caso de
placas com diâmetro externo de 100 mm) e utilizar este valor estimado para calcular o
número de UFC. Apresentar o resultado como contagem estimada.
7.Placas em que o crescimento é proporcionalmente maior nas maiores diluições:
Estas situações são uma indicação da possível presença de substâncias inibidoras na
amostra. Esta conclusão, entretanto, depende da confirmação e, a menos que a
confirmação seja feita, o resultado deve ser apresentado como acidente de laboratório,
caso não seja possível repetir a análise. Pode ser também decorrente da contaminação
acidental da amostra durante o planejamento.
Contagem pelo método de gotejamento em superfície
1.Preparação das amostras e diluições seriadas: Seguir os procedimentos descritos no
item de Recepção e preparação das amostras para a análise. Para a contagem de bolores e
leveduras em alimentos de umidade intermediária, recomenda-se que, antes da
homogeneização, a amostra seja mantida de molho no diluente, por um certo período de
tempo, para amolecer o produto e facilitar a liberação dos microrganismos presentes.
2.Preparação das placas: para o plaqueamento em superfícies, as placas devem ser
previamente preparadas, com 15 a 20 ml do meio adequado ao grupo de microrganismos
que se objetiva contar. Para contagem total de aeróbios mesófilos ou psicrófilos, usar o
Ágar Padrão para Contagem (PCA). Para a contagem de fungos e leveduras, pode-se usar
o PCA suplementado com 100mg/l de cloranfenicol. O Agar dicloran Rosa de Bengala
Cloranfenicol (DRBC), o Agar Batata Dextrose Acidificado (PDA acidificado) ou o
Agar Batata Dextrose com antibióticos. O DRBC é considerado a melhor opção para a
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contagem de fungos, leveduras, seguido do PCA-cloranfenicol. Antes da utilização, a
superfície do meio deve ser secada, o que pode ser feito em estufa (50o..C/2h ou 35o.C /1
noite, tampas fechadas) ou em câmara de fluxo laminar (0,5 a 1 hora, com tampas
parcialmente abertas ).
3.Inoculação: Selecionar três diluições adequadas da amostra. Inocular 0,1 ml de cada
diluição na superfície das placas previamente preparadas, uma ou mais placas para cada
diluição. Usando uma alça de Drigalski, espalhar o inóculo por toda a superfície do meio,
até que todo o excesso de líquido seja absorvido. Observar os seguintes cuidados para se
obter bons resultados:
3.1.Usar pipetas de no máximo 1 ml para a transferência de inoculo de 0,1 ml. Não
assoprar a pipeta nem mudar a ponta de posição, para liberar a última gota.
3.2.Fazer o espalhamento da placa de maior para a placa de menor diluição,
flambando a alça de Drigalski com etanol 70%, entre uma placa e outra. Resfriar
a alça na parte interna da tampa da placa antes de coloca-la em contato com o
inoculo.
3.3.Como o volume do inoculo utilizado no planejamento em superfície é 10 vezes
menor do que o usado no plaqueamento em profundidade, o limite de detecção do
método passa para 100UFC/g, para amostras sólidas, ou 10 UFC/ml, no caso de
amostras líquidas. Caso o nível de contaminação esperado da amostra esteja
abaixo dessa faixa, deve-se inocular um volume maior da primeira diluição,
distribuindo esse volume por várias placas. A distribuição mais comumente
utilizada é: três placas com 0,3 ml e uma placa com 0,1 ml. No espalhamento das
placas
com 0,3 ml, o tempo requerido para a absorção do líquido é maior,
exigindo cuidados para que não permaneçam filmes de umidade na superfície, com
a conseqüente formação de zonas de espalhamento.
4.Incubação: aguardar que as placas sequem (no mínimo 15 minutos inverter e incubar):
4.1.Contagem total de aeróbios mesófilos; 35o.C/48 h
(32o.C
no caso de
derivados de leite), placas invertidas.
4.2.Contagem total de aeróbios psicrotróficos: 7o.C/10 dias ou 17o.C/16 h seguidas
de 7/3 dias, placas invertidas.
4.3.Contagem de fungos e leveduras: 25o./5 dias, placas não invertidas.Observar as
placas com três dias de incubação e, caso haja crescimento de bolores com
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colônias espalhadas, efetuar a contagem com três dias, para prevenir a perda das
placas por espalhamento total dessas colônias. Caso não se observe risco de
espalhamento, reincubar as placas e contar com cinco de incubação.
4.6.OBSERVAÇÃO: O tempo/temperatura de referência para a contagem total de
aeróbios psicrotróficos é 7o.C/10 dias, porém há várias outras condições de incubação que
podem ser utilizadas em situações particulares:

Plaqueamento em superfície: 7o. C/1-8 dias

Análise de leite: 18o.C/45 h

Análise de carne: 20o.C/3 dias
25ºC/24 horas
5.Contagem das colônias e cálculo dos resultados: seguir as mesmas orientações
descritas para plaqueamento em profundidade, porém, multiplicar a resultado por 10
(dez), para levar em conta o volume dez vezes menor inoculado no plaqueamento em
superfície. No caso de fungos e leveduras, recomenda-se contar placas com 10 a 150
colônias, em lugar de 25 a 250.
UFC / g ou mL 
n o Colônias
x10
diluição
Contagem pelo método de plaqueamento em gotas
1. Preparação das amostras e diluições seriadas: Seguir os procedimentos descritos no
item de Recepção e preparação das amostras para a análise.
2.Preparação das placas: Seguir o mesmo procedimento descrito para o plaqueamento
em superfície, item 3.2.2, porém, garantir uma secagem mais rigorosa da superfície das
placas, mantendo 24 horas a 39-45o.C e, antes de usar, 0,5 a 1 hora com as tampas meio
abertas na câmara de fluxo laminar.
3.Inoculação: Dividir a placa em 9 setores, marcando o fundo com caneta vidrográfica
(três linhas horizontais e três linhas verticais). Preparar previamente três soluções
adequadas da amostra e, utilizando pipetas graduadas de 0,1 ml, inocular três gotas de
0,01 ml de cada diluição, em três quadrados adjacentes da placa (triplicata), com cuidado
para que as gotas não escorram para fora dos respectivos quadrados. Não espalhar as
gotas. Mantendo as placas numa superfície plana, aguardar que o líquido seja absorvido
pelo meio de cultura, o que requer aproximadamente 30 minutos, se a superfície das
placas estiver bem seca.
Observar os seguintes cuidados, para se obter melhores resultados:
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3.1.Para a transferência das gotas, as placas devem ser colocadas numa superfície
bem plana e qualquer movimentação deve ser feita com o máximo cuidado, até a
completa absorção do meio, para evitar que as gotas escorram para os quadrados
vizinhos.
3.2.Liberar o volume das gotas sempre a partir das 7 marcas superiores das pipetas
de 0,1 ml, evitando as 3 últimas marcas inferiores, pois nessa região há maior erro
na medida dos volumes. Antes de coletar o volume de cada diluição, para a
inoculação nas placas, não esquecer de agitar vigorosamente os tubos de diluição,
invertendo 25 vezes em arco de 30 cm, ou com o auxílio de um agitador tipo
“vortex”. Ao selecionar as diluições a serem inoculadas, considerar que o
plaqueamento em gotas não se aplica a amostras com nível de contaminação
abaixo de 1000/g ou ml. A primeira razão desta limitação é o pequeno volume
inoculado e a segunda é a capacidade de pipeta, que não permite a transferência de
líquidos viscosos ou com sólidos em suspensão, comum nas duas primeiras
diluições de alimentos sólidos.
4.Incubação: Aguardar a completa absorção do líquido das gotas pelo meio de cultura e
incubar nas mesmas condições recomendadas para o plaqueamento em superfície.
5.Contagem das colônias e cálculo dos resultados: Contar as colônias das gotas com no
máximo 30 colônias. Para calcular o número de UFC/g ou ml, tirar a média do número de
colônias nas três gotas de diluição inoculada, multiplicar pelo inverso da diluição e em
seguida por 100, para considerar o volume inoculado.
UFC / g ou mL 
n o Colônias
x100
diluição
7- Contagem De Coliformes Totais, Coliformes Fecais e E. coli.
OBJETIVO: Familiarizar com a técnica de contagem de coliformes totais coliformes fecais e
E. coli
Procedimentos
Análise de alimentos em geral (ABNT, 1991, VANDERZANT, SPLITTOESSER eds.,
1992)
a)Preparação das amostras e diluições seriadas: Seguir os procedimentos descritos no
item de Recepção e preparação das amostras para a análise.
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b)Inoculação (teste Presuntivo): Selecionar três diluições adequadas da amostra e, com
uma pipeta de, no máximo, 10 mL, inocular uma série de três tubos de Caldo Lauril
Sulfato triptose (LST) por diluição, adicionando 1 mL da diluição por tubo com 10 ml
de LST.
OBSERVAÇÕES:
A.Selecionar as diluições em função da contagem estimada de coliformes na
amostra examinada. Por exemplo, para amostras com contagens estimadas na faixa
de 3 a 1.000/g ou ml, as diluições recomendadas são a 10
-1
, 10-2
e 10-3.
Havendo suspeita de contagens acima desa faixa, deve-se inocular diluições
maiores. Ao contrário, havendo expectativa de contagens
reduzidas, deve-se
inocular 3 porções de 10 ml da primeira diluição em 3 tubos com 10 ml de LST
dupla concentração e 3 porções de 1 ml
da diluição inicial e da diluição
subseqüente e tubos de LST concentração simples.
B.Na análise de espessantes (gotas, pectinas etc), a diluição inicial deve ser 1:100 (
unidade analítica de 5 a 12,5 g), em função da viscosidade do material. Se as
contagens esperadas são baixas, deve-se inocubar 10 ml da diluição 10-2 em 3
tubos com 10 ml de LST em concentração dupla.
C.Na análise de condimentos, principalmente cravo, canela, mostarda moída e alho
e cebola em pó, a presença de compostos antimicrobianos naturais na amostra pode
resultar em contagens errôneas nas primeiras diluições. Para prevenir esse
problema, pode ser necessário inocular diluições mais altas, a partir da 10-2, e no
caso de contagens baixas transferir 10-1 e 0,1 mL da 10-2.
D.Na análise de leite e produtos lácteos, o teste presuntivo em caldo LST é
suprimido, sendo a inoculação feita diretamente numa série de 3 tubos de caldo
Verde Brilhante (VB), incubados a 32o.C/24-48 h. A ocorrência de crescimento
com produção de gás, após 24 ou 48 horas de incubação, é considerada
confirmativa da presença de coliformes totais e o Número Mais Provável (NMP)
/g ou ml é determinado em uma tabelade NMP adequada às diluições inoculadas.
A conformação de coliformes fecais deve ser feita dos tubos de VB com
crescimento e produção de gás.
E.No exame de amostras de ostras, mexilhões e mariscos (moluscos bivalves),
recomenda-se utilizar uma série de 5 tubos. Na análise de maionese e outras
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coberturas para saladas, recomenda-se neutralizar a acidez da amostra com NaOH
1 N estéril, depois de homogeneização e antes da inoculação nos tubos de LST.
F.Se se pretende proceder à contagem de E. coli pelo método de LST-MUG,
deve-se utilizar o caldo LST suplementado com 50 mg/L de 4-metilumbeliferilbeta-D-glucoronídeo (MUG), distribuído em tubos não fluorescentes, previamente
selecionados. A presença do MUG não interfere na seqüência normal da análise
para contagem de coliformes totais e fecais.
C. Inocubação: Incubar os tubos de LST a 35o.C por 24 horas e observar se há
crescimento com produção de gás. Em caso positivo (crescimento e produção de gás),
passar aos itens subseqüentes. Em caso negativo (crescimento e/ou produção de gás),
reincubar até completar 48 horas e repetir a leitura, passando para os itens subseqüentes
em caso de crescimento com produção de gás.
D. Contagem de coliformes totais: tomar todos os tobos de LST (ou LST-MUG) com
produção de gás e transferir uma alçada bem carregada de cada cultura para tubos de caldo
Verde Brilhante Bile (VB). Incubar a 35o.C por 24-48 horas e observar se há crescimento
com produção de gás, confirmativo da presença de coliformes totais e determinar o
Número Mais provável (NMP)/g ou ml em uma tabela de NMP apropriada ás diluições
inoculadas.
E. Contagem de coliformes fecais: tomar os tubos de LST (ou LST-MUG) com
produção de gás e transferir uma laçada bem carregada de cada cultura para tubos de caldo
E. coli (EC). Incubar em banho-maria a 45,5o.C (maioria dos alimentos) ou 44,5o.C
(água, moluscos bivalentes, peixes e derivados de peixes) por 24 horas e observar se há
crescimento com produção de gás. Anotar o número de tubos de EC com produção de
gás, confirmativo da presença de coliformes fecais e determinar o NMP/g ou ml em uma
tabela de NMP adequada
às diluições inoculadas. Para a incubação a 45,5o.C, devem
ser utilizados banhos com variação de temperatura não superior a 0,1o.C.
Na
indisponibilidade de banhos nessa faixa de variação é preferível que a incubação seja feita
a 44,5o.C, para prevenir ocorrência de falsos resultados negativos.
OBSERVAÇÕES:
1.A incubação dos tubos de EC deve ser sempre acompanhada de um tubo inoculado com
a cepa padrão positiva (E. coli)
e um tubo inoculado com a cepa padrão negativa
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(Enterobacter aerogenes ). Todos os tubos devem permanecer mergulhados na água, até
uma altura superior à superfície do meio de cultura.
2.Pretende-se proceder à confirmação e contagem de E. coli pelo método tradicional,
deve-se reincubar os tubos de EC, negativos para crescimento e/ou produção de gás, por
24 horas adicionais, submetendo à conformação tanto os tubos positivos em 24 horas
como em 48 horas.
3.Contagem de E. coli (método tradicional): de cada tubo de EC com produção de gás em
24 horas ou 48 horas, estriar uma alçada da cultura em placas de Agar Eosina Azul de
Metileno (BEM). Incubar as placas a 35o.C
por 24 horas e observar se há
desenvolvimento de colônias típicas de E. coli (nucleadas com centro preto, com ou sem
brilho metálico). Havendo colônias típicas, transferir duas colônias bem isoladas de cada
placa, para tubos de Agar Padrão para Contagem (PCA) inclinados a incubar os tubos a
35o.C por 24 horas. A partir das culturas puras em PCA, fazer coloração
de Gram e
inocular os meios teste abaixo, para realização de provas bioquímicas de indol, VM, VP e
citrato (IMVC).
OBSERVAÇÃO: Todos os meios podem ser inoculados a partir de uma única alçada de
cultura, porém, o caldo Citrato de Koser (ou o Ágar Citrato de Simmons) deve ser inoculado
em primeiro lugar, para evitar a introdução de compostos e carbono originários dos demais
meios-teste.
4.Caldo citrato de Koser (teste de citrato): Inocular uma alçada com inoculo leve da
cultura, incubar a 35o.C/72 a 96 horas e observar se há crescimento (teste positivo) ou não
(teste negativo). As cepas de E. coli são citrato positivas. Alternativamente, pode-se
utilizar o Agar Citrato de Simmons para o teste de citrato. Transferir um inóculo leve da
cultura para a rampa dos tubos de Agar Citrato de Simmons e incubar a 35o.C/48 horas.
O crescimento com viragem alcalina, alterando a cor do meio de verde para o azul, é
indicativo de teste positivo. O não crescimento e a não alteração da cor do meio indicam
teste negativo.
5.Caldo triptona 1% (teste de indol): Inocular uma alçada com inoculo leve da cultura e
incubar a 35o.C/24 horas. Adicionar 5 gotas de reagente de Kovacs a cada 4 ml de cultura
e agitar levemente. Observar se há desenvolvimento de um anel vermelho-violeta na
superfície do meio da cultura (teste positivo) ou se o anel permaneceu na cor amarela do
reagente (teste negativo). As cepas de E. coli podemser indol positivas ou negativas.
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6.Caldo VM-VP (teste de vermelho de metila e Voges-Proskauer): Inocular uma alçada
com inoculo leve da cultura e incubar a 35o.C/48 horas. Para teste de VP, transferir
assepticamente 1 ml da cultura para um tubo de ensaio, adicionar 0,6ml de soluçãode
naftol 5% e agitar. Adicionar em seguida 0,2 ml de solução de KOH 40%, agitar e
adicionar uma pitada leve de cristais de creatina, para acelerar a reação. Deixar descansar
e observar periodicamente, por ate 1 hora, o desenvolvimetno de uma cor vermelha ou
rósea no meio de cultura (teste positivo). A permanência do meio na cor do reagente
(amarela ou ligeiramente escerdeada) indica teste negativo. As cepas de E. coli são VP
negativas. Reincubar a cultura remanescente no caldo VM-VP por 48 horas adicionais e
realizar o teste de VM com 96 horas de incubação. Para a realização do teste, adicionar a
cada 2,5 ml
da cultura, 5 gotas da solução de vermelho de metila, observando
imediatamente se o meio adquiri uma coloração vermelha (teste positivo) ou amarela
(teste negativo). As cepas de E. coli são VM positivas. Considerar com E. coli todas as
culturas com as seguintes características: bastonetes gram negativos, indol (+) ou (-), VM
(+)
e citrato (-). Anotar quantos tubos de caldo EC, estriados em BEM, foram
conformados como E. coli e determinar o NMP/g ou ml em uma Tabela de NMP
adequada às diluições inoculadas (Apêndice 2).
7.Contagem de E. coli (método LST-MUG): Tomar todos os tubos de LST-MUG com
crescimento em 24 ou 48 horas, com ou sem produção de gás e observar sob lâmpada
ultravioleta (3 a 6 w), ondas longas (365 nm), numa cabine escura. Considerar como
positivo todos os tubos que apresentarem fluorescência azul, confirmativa da presença de
E. coli. Anotar o número de tubos positivos e determinar o NMP em uma tabela adequada
às diluições utilizadas (Apêndice 2).
AGROINDÚSTRIA – Microbiologia e Procedimentos de Análise Microbiológica de Alimentos
OBSERVAÇÕES:
a.O 4-metilumbeliferil-D-glucoronídeo (MUG)
é um composto não fluorescente,
utilizado como substrato para indicar a presença da enzima B-glucoronidase. Essa enzima
é caracteristicamente produzida por E. coli (96 das cepas, incuindo cepas anaerogênicas),
mas não pelos seus acompanhantes habituais na análise de água e alimentos
(Enterobacteriaceae), exceto Shigella (44%) e Salmonella (29%). Quando o MUG é
degradado beta-glucoronidase, o produto resultante (4-umbeliferona) é fluorescente sob
luz UV. O teste é capaz de detectar 83 a 95% dos tubos positivos, se a incubação for feita
por 24 horas e 96 a 100% dos tubos, se a incubação proplongar-se por 48 horas, mesmo
que haja crescimento em 24 horas.
b.Os tecidos das ostras, mexilhões e mariscos apresentam atividade natural de
B-
glucoronidase, que pode provocar falsos resultados positivos nos tubos de LST-MUG. No
caso desses alimentos, deve-se tomar todos os tubos de LST com crescimento em 24
horas ou 48 horas e transferir uma alçada da cultura para tubos de caldo EC-MUG (caldo
EC suplementado com 50mg/l de MUG). Incubar todos os tubos de EC-MUG a 44,5 C
por 24 horas e observar fluorescencência sob luz UV. Considerar como E. coli positivos
todos os tubos com fluorescência azulada.
c.Alguns vidros utilizados na manufatura de tubos de ensaio podem apresentar uma
fluorescência natural sob luz UV. Por essa razão, deve-se verificar a ausência de
fluorescência em todos os tubos destinados a testes com MUG.
Análise de água (AMERICAN PUBLIC HEALTH OF WATER AND WASTE WATER,
1985)
A.Preparação da amostra: Misturar bem o conteúdo da amostra, invertendo o frasco 25
vezes, em arco de 30 cm.
B.Inoculação: Limpar a área externa do frasco com etanol 70%, abrir assepticamente e
transferir 10 porções de 10 ml da amostra para tubos com 10 ml de caldo Lauril Sulfato
triptose (LST), em concentração dupla. Opcionalmente, pode-se trabalhar com 5 porções
de 10 ml de amostra. *OBSERVAÇÃO: Se se pretende proceder à contagem de E. coli
pelo método de LST-MUG, deve-se utilizar o caldo LST suplementado com 50 mg/L de
4-metilumbeliferil-beta-D-glucuronídeo (MUG).
C.Incubação: Incubar os tubos de LST ou LST-MUG a 35o.C por 24 horas e observar se
há crescimento com produção de gás. Em caso positivo (crescimento e produção de gás),
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passa por itens subseqüentes. Em caso negativo (crescimento e/ou produção de gás),
reincubar até completar 48 horas e repetir a leitura, passando aos itens subseqüentes com
todos os tubos de LST que positivares em 48 horas.
D.Contagem de coliformes totais, coliformes fecais e E. coli:
Seguir o mesmo
procedimento descrito para alimentos em geral, porém, atenção: a apresentação do
resultado é feita em termos de NMP/100 ml, determinado em uma tabela
de NMP
adequada à inoculação de 5 ou 10 porções de 10ml (Apêndice 2).
*OBSERVAÇÃO: Na análise de amostras de água destinada ao consumo alimentar, para
verificação da conformidade com padrões legais de posibilidade, o procedimento
recomendado é o descrito anteriormente. No caso de amostras destinadas à verificação da
conformidade com padrões legais de potabilidade, a análise pode ser efetuada seguindose o procedimento descrito para alimentos em geral. Neste caso, os diluentes
recomendados para a preparação de diluições seriadas da amostra são a água peptonada
0,1 ou o tampão fosfato pH 7,2, suplementado com MgCl2 .
Análise de refrigerantes/ refrescos/ sucos/ néctares e xaropes
A.Considerar a portaria no 410/74 do Ministério da Agricultura; PADRÕES
MICROBIOLÓGICOS – REGULAMENTO GERAL DE BEBIDAS. DOU 08/10/74.
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REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
EVANGELISTA, J. Tecnologia de Alimentos. 2º edição. Livraria Atheneu Editora. São
Paulo, 1989, 652 p.
FRANCO, B. D. G. M.; LANDGRAF, M. Microbiologia dos Alimentos. Ed. Atheneu, São
Paulo, 1996, 182 p.
GORGAUD, L. Microbiologia prática. Editora Edgard Blucher Ltda, São Paulo, 1975.
SILVA, N.; JUNQUEIRA, V. C. A.; SILVEIRA, N. F. A. Manual de métodos de análise
microbiológica de alimentos. Livraria Varela Ltda, São Paulo, 1997, 295 p.
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Hino Nacional
Hino do Estado do Ceará
Ouviram do Ipiranga as margens plácidas
De um povo heróico o brado retumbante,
E o sol da liberdade, em raios fúlgidos,
Brilhou no céu da pátria nesse instante.
Poesia de Thomaz Lopes
Música de Alberto Nepomuceno
Terra do sol, do amor, terra da luz!
Soa o clarim que tua glória conta!
Terra, o teu nome a fama aos céus remonta
Em clarão que seduz!
Nome que brilha esplêndido luzeiro
Nos fulvos braços de ouro do cruzeiro!
Se o penhor dessa igualdade
Conseguimos conquistar com braço forte,
Em teu seio, ó liberdade,
Desafia o nosso peito a própria morte!
Ó Pátria amada,
Idolatrada,
Salve! Salve!
Brasil, um sonho intenso, um raio vívido
De amor e de esperança à terra desce,
Se em teu formoso céu, risonho e límpido,
A imagem do Cruzeiro resplandece.
Gigante pela própria natureza,
És belo, és forte, impávido colosso,
E o teu futuro espelha essa grandeza.
Terra adorada,
Entre outras mil,
És tu, Brasil,
Ó Pátria amada!
Dos filhos deste solo és mãe gentil,
Pátria amada,Brasil!
Deitado eternamente em berço esplêndido,
Ao som do mar e à luz do céu profundo,
Fulguras, ó Brasil, florão da América,
Iluminado ao sol do Novo Mundo!
Do que a terra, mais garrida,
Teus risonhos, lindos campos têm mais flores;
"Nossos bosques têm mais vida",
"Nossa vida" no teu seio "mais amores."
Ó Pátria amada,
Idolatrada,
Salve! Salve!
Brasil, de amor eterno seja símbolo
O lábaro que ostentas estrelado,
E diga o verde-louro dessa flâmula
- "Paz no futuro e glória no passado."
Mas, se ergues da justiça a clava forte,
Verás que um filho teu não foge à luta,
Nem teme, quem te adora, a própria morte.
Terra adorada,
Entre outras mil,
És tu, Brasil,
Ó Pátria amada!
Dos filhos deste solo és mãe gentil,
Pátria amada, Brasil!
Mudem-se em flor as pedras dos caminhos!
Chuvas de prata rolem das estrelas...
E despertando, deslumbrada, ao vê-las
Ressoa a voz dos ninhos...
Há de florar nas rosas e nos cravos
Rubros o sangue ardente dos escravos.
Seja teu verbo a voz do coração,
Verbo de paz e amor do Sul ao Norte!
Ruja teu peito em luta contra a morte,
Acordando a amplidão.
Peito que deu alívio a quem sofria
E foi o sol iluminando o dia!
Tua jangada afoita enfune o pano!
Vento feliz conduza a vela ousada!
Que importa que no seu barco seja um nada
Na vastidão do oceano,
Se à proa vão heróis e marinheiros
E vão no peito corações guerreiros?
Se, nós te amamos, em aventuras e mágoas!
Porque esse chão que embebe a água dos rios
Há de florar em meses, nos estios
E bosques, pelas águas!
Selvas e rios, serras e florestas
Brotem no solo em rumorosas festas!
Abra-se ao vento o teu pendão natal
Sobre as revoltas águas dos teus mares!
E desfraldado diga aos céus e aos mares
A vitória imortal!
Que foi de sangue, em guerras leais e francas,
E foi na paz da cor das hóstias brancas!