BRUNO DA SILVA BRANDÃO GONÇALVES
Estudo da organização funcional do sistema circadiano por meio de ferramentas
computacionais e matemáticas
Tese apresentada à Universidade
Federal do Rio Grande do Norte,
para obtenção do título de Doutor
em Psicobiologia.
Natal
2013
BRUNO DA SILVA BRANDÃO GONÇALVES
Estudo da organização funcional do sistema circadiano por meio de ferramentas
computacionais e matemáticas
Tese apresentada à Universidade
Federal do Rio Grande do Norte,
para obtenção do título de Doutor
em Psicobiologia.
Orientador:
Araujo
Natal
2013
O
John
Fontenele
Dedico
este
trabalho
à
memória da minha gatinha
Natalina, que me abriu os
olhos
para
o
mundo
fantástico dos gatos e de
todos os animais.
AGRADECIMENTOS
Agradeço ao professor John que aceitou me orientar e com sua experiência me
mostrou o quanto é interessante estudar os ritmos circadianos. Sem seu acolhimento e
amizade não conseguiria terminar esse trabalho.
Aos amigos do Labcrono que me ajudaram na discussão dos trabalhos e a
entender um pouco mais dessa área tão nova pra mim que era a cronobiologia. A
contribuição de todos foi muito importante para a minha formação e a execução desse
trabalho.
A todos os gatos que resgatei e que me possibilitaram conhecer um mundo
diferente e único desses animais, em especial a Natalina, Gabriela, Princesa, Bela,
Rapunzel, Tigrão, Nala, Valente e Linda.
A minha família por ter me acompanhado mesmo de longe torcendo pelo meu
sucesso e me ajudando sempre que preciso.
A minha esposa Rafaela, pois sem ela nada disso teria sentido.
Ao CNPq pelo apoio financeiro.
RESUMO
GONÇALVES, BSB. ESTUDO DA ORGANIZAÇÃO FUNCIONAL DO
SISTEMA CIRCADIANO POR MEIO DE FERRAMENTAS COMPUTACIONAIS E
MATEMÁTICAS. TESE DE DOUTORADO EM PSICOBIOLOGIA, UFRN, 137
PÁGINAS, 2013.
Os ritmos circadianos são variações em processos fisiológicos que auxiliam os
seres vivos na adaptação aos ciclos ambientais. Esses ritmos são gerados e se
sincronizam ao ciclo claro escuro por meio do núcleo supraquiasmático. A integridade
da ritmicidade circadiana tem grande implicação na saúde dos seres humanos.
Atualmente sabe-se que distúrbios nos ritmos circadianos estão relacionados com alguns
problemas da atualidade como a obesidade, propensão a determinados tipos de câncer e
transtornos mentais por exemplo. A ritmicidade circadiana pode ser estudada por meio
de experimentos com modelos animais e diretamente nos seres humanos. Nesse trabalho
utilizamos modelos computacionais para reunir resultados experimentais da literatura e
explicar resultados de nosso laboratório. Outro foco desse trabalho foi na análise de
dados de ritmos de atividade e repouso obtidos experimentalmente. Aqui fizemos uma
revisão sobre o uso de variáveis utilizadas para analisar esses dados e por último
propomos uma atualização na forma de calcular essas variáveis. Os nossos modelos
foram capazes de reproduzir os principais resultados experimentais da literatura e nos
forneceram explicações para resultados de experimentos realizados em nosso
laboratório. As novas variáveis utilizadas para analisar o ritmo de atividade e repouso
em humanos se mostraram mais eficiente para descrever a fragmentação e sincronização
desse ritmo. Assim esse trabalho contribuiu aperfeiçoando as ferramentas existentes
para o estudo da ritmicidade circadiana nos mamíferos.
Palavras chaves: modelos matemáticos, ritmos circadianos, sistema de temporização
circadiano,
actimetria.
ABSTRACT
GONÇALVES, BSB. STUDY OF THE FUNCTIONAL ORGANIZATION OF THE
CIRCADIAN SYSTEM THROUGH COMPUTER MODELING AND ANALYSIS
MATHEMATICS. TESE DE DOUTORADO EM PSICOBIOLOGIA, UFRN, 137
PÁGINAS, 2013.
Circadian rhythms are variations in physiological processes that help
living beings to adapt to environmental cycles. These rhythms are generated and are
synchronized to the dark light cycle through the suprachiasmatic nucleus. The integrity
of circadian rhythmicity has great implication on human health. Currently it is known
that disturbances in circadian rhythms are related to some problems of today such as
obesity, propensity for certain types of cancer and mental disorders for example. The
circadian rhythmicity can be studied through experiments with animal models and in
humans directly. In this work we use computational models to gather experimental
results from the literature and explain the results of our laboratory. Another focus of this
study was to analyze data rhythms of activity and rest obtained experimentally. Here we
made a review on the use of variables used to analyze these data and finally propose an
update on how to calculate these variables. Our models were able to reproduce the main
experimental results in the literature and provided explanations for the results of
experiments performed in our laboratory. The new variables used to analyze the rhythm
of activity and rest in humans were more efficient to describe the fragmentation and
synchronization of this rhythm. Therefore, the work contributed improving existing
tools for the study of circadian rhythms in mammals.
Key words: mathematical models, circadian rhythms, circadian timing
system, actigraphy.
Sumário
Lista de abreviaturas ..........................................................................................................1
Introdução Geral ................................................................................................................2
Objetivos............................................................................................................................ 6
Mathematical model of the interaction between the dorsal and ventral regions of the
suprachiasmatic nucleus of rats ......................................................................................... 8
Efeito da interação do ciclo claro-escuro de 22 horas e o período endógeno na relação
de fase entre os ritmos circadianos de atividade/repouso e temperatura central ............15
Os efeitos da luz no ritmo circadiano: um estudo computacional ..................................35
Um olhar sobre o uso das variáveis não-paramétricas em actimetria ............................. 57
Métodos não-paramétricos em actigrafia: Uma atualização............................................90
Discussão/Conclusão Geral ........................................................................................... 111
Referências .................................................................................................................... 115
Anexos ........................................................................................................................... 119
Lista de abreviaturas
NSQ – Núcleo Supraquiasmático
IS – Interdaily Stability – Estabilidade Interdiária
IV – Intradaily Variability – Variabilitade intradiária
M10 – 10 horas de maior atividade
L5 – 5 horas de menor atividade
STC – Sistema de Temporização Circadiana
CE – Claro/Escuro
EE – Escuro/Escuro ou Escuro Constante
CC – Claro/Claro ou Claro Constante
dm-NSQ – região dorsomedial do Núcleo Supraquiasmático
vl-NSQ – região ventrolateral do Núcleo Supraquiasmático
RHT – Retino-Hypothalamic Tract – Trato retino-hipotalâmico
CV - Coeficiente de Variação
fb - Frequencia de batimento
1
INTRODUÇÃO
Os
ritmos
circadianos
são
oscilações
em
processos
fisiológicos
e
comportamentais que ocorrem num período de 24 h. Essas oscilações estão presentes
em todos os seres vivos desde as cianobactérias até os primatas. Os ritmos circadianos
conferem aos seres vivos a capacidade de se antecipar às mudanças recorrentes que
ocorrem diariamente no ambiente. O surgimento e evolução da ritmicidade circadiana
deve estar relacionados a rotação da Terra. Essa teoria se baseia na alteração dos ritmos
circadianos pelo ciclo claro-escuro.
Experimentos mostram que os ritmos circadianos persistem mesmo quando os
seres vivos são submetidos a condições sem pistas temporais, como por exemplo, com
iluminação e temperatura constantes. Esses ritmos são gerados por um sistema
endógeno que permite uma antecipação às mudanças ambientais como o ciclo claro e
escuro, a disponibilidade de alimento, presença de parceiros, entre outros (Moore,1999).
Esses sistemas são formados por um conjunto de osciladores e no presente trabalho será
chamado de sistema de temporização circadiana (STC). Basicamente o STC é composto
de três componentes: uma via que recebe a informação externa, um ou mais osciladores
capazes de gerar os ritmos circadianos, sendo nos mamíferos o principal o núcleo
supraquiasmático (NSQ) e uma via de saída que permite o controle fisiológico pelos
ritmos circadianos.
O principal agente ambiental capaz de sincronizar o STC é o ciclo claro-escuro e
a via que recebe essa informação externa é formada pela retina e pelo trato retinohipotalâmico (Meijer et.al.,1986; Nakamura et.al.,2004). Sabemos que a iluminação na
retina de ratos, hamster e camundongos altera a frequência dos potenciais de ação em
alguns neurônios do NSQ (Meijer et.al.,1986;Nakamura et.al.,2004). Essa variação é
acompanhada por mudanças na concentração intracelular de Ca2+ que promove ativação
2
de vias metabólicas intracelulares promovendo alterações na expressão de genes
relógios nos neurônios do NSQ (para revisão ver Morse e Sassone-Corsi, 2002).
A primeira evidência de que o NSQ fosse um oscilador circadiano foi por
experimento com lesão, em que a sua lesão leva a uma perda na ritimicidade circadiana
(Moore e Eichler, 1972; Stephan e Zucker, 1972). O transplante de tecido do NSQ em
animais com lesões do NSQ e arrítmico provoca uma recuperação da Ritmicidade.
Além disso, quando o transplante é feito com tecido do NSQ de animais mutantes para
os lesionados, a recuperação na ritmicidade ocorre com um período em livre-curso
semelhante ao do animal doador (Ralph et al., 1990; Sujino et al., 2003). A geração do
ritmo ocorre nos neurônios do NSQ por meio da reação de transcrição e translação de
genes relógios cuja duração é próxima de 24 horas (Reppert e Weaver, 2002). Esses
processos geram mudanças na membrana neuronal variando a frequência de disparo
neuronal, liberação de neurotransmissores e neuromoduladores que atingem regiões
extra-NSQ.
As conexões sinápticas do NSQ com outras regiões do cérebro foram
evidenciadas pela técnica de injeção de traçadores retrógrados e anterógrados (para
revisão ver Dibner et al.,2010). O NSQ tem suas eferências projetadas para: outros
núcleos do hipotálamo, a rafe, o tálamo, a área pré-óptica e a glândula pineal, formando
assim a saída dos ritmos circadianos. Essas estruturas são responsáveis pelo controle do
ritmo de sono-vigilia, ingestão de água e alimento, liberação de hormônios, atenção e
regulação da temperatura central (para revisão ver Saper et.al.,2005).
O estudo da ritmicidade circadiana ocorre basicamente por meio de
experimentos e modelos matemáticos que simulam situações experimentais. O presente
trabalho foi dividido em três partes: (i) construção de modelos computacionais do NSQ
de ratos a partir de resultados experimentais descritos na literatura; (ii) escrita de uma
3
análise crítica sobre o uso de variáveis não-paramétricas no estudo de actimetria em
humanos e (iii) desenvolvimento de uma nova ferramenta de análise de dados de
actimetria utilizando dados do ritmo de atividade/ repouso de humanos, ratos e saguis .
A simulação computacional é uma ferramenta capaz de aglutinar os resultados
experimentais e propor explicações e novas abordagens. Os modelos matemáticos que
simulam oscilações circadianas podem estar associados a variáveis sem correlato
experimental (Schwartz et. al.,2009; Kunz e Achermann,2003; Cardoso et.al.,2009; Oda
e Friesen,2002 e Diez-Noguera,1994 ), a genes relógios fictícios (Scheper et. al.,1999;
Gonze
et.
al.,2005;
Ullner
et.al.,2009)
ou
a
genes
relógios
identificados
experimentalmente como Per,Cry,Bmal e Clock por exemplo (Geier et. al.,2005,
Bernard et. al.,2007). Com esses modelos é possível entender como acontece a interação
da luz com o STC na expressão da ritmicidade circadiana.
O ritmo de atividade e repouso é comumente estudado por meio da actimetria. O
ajuste de uma função cosseno a esses dados fornece parâmetros que são utilizados no
estudo da ritmicidade circadiana. Esses parâmetros descrevem a amplitude, mesor,
acrofase e período do ritmo. Como o ritmo de atividade e repouso não apresenta
exatamente um comportamento de uma função cossenoidal, outras variáveis de
interesses têm sido estudadas e para isso novas metodologias foram desenvolvidas.
Como essas variáveis não são associadas a parâmetros de uma função conhecida, elas
são chamadas não paramétricas.
Witting e colaboradores (1990) propuseram quatro variáveis não paramétricas:
(IV) para medir a fragmentação do ritmo, IS que mede a sincronização ao ciclo claroescuro de 24 horas, (L5) que corresponde ao valor médio das 5 horas de menor
atividade e (M10) que corresponde às 10 horas de maior atividade . A variabilidade
intradiária (IV) é calculada como a razão da média da raiz quadrada da primeira
4
derivada do sinal pela variância populacional dos dados. Essa variável quantifica o nível
de fragmentação do ritmo de atividade e repouso. Altos valores indicam a presença de
despertares noturno e/ou sonolência diurna. A estabilidade interdiária (IS) é o valor para
24 horas do periodograma chi-quadrado normalizado. Essa variável quantifica o grau de
sincronização ao zeitgeber externo de 24 horas. Baixos valores de L5 indicam um
período de repouso eficiente. Altos valores de M10 indicam uma atividade intensa e
regular. Quando comparados aos parâmetros de ajuste ao seno, as análises nãoparamétricos se mostraram mais eficientes para identificar mudanças no ritmo de
atividade e repouso (Witting et.al.,1990; Van Someren et.al.,1997). Por isso
acreditamos que eles devem ser melhores explorados e padronizados para que possamos
avançar no conhecimento do sistema de temporização circadiano em humanos.
5
Objetivos:
Geral
 Estudar a organização funcional do sistema circadiano utilizando ferramentas
matemáticas.
Específicos:
 Estudar a organização funcional do sistema circadiano com simulação
matemática utilizando um modelo de interação entre dois osciladores.
o Gonçalves BSB, Carneiro BTS, Silva CA, Fernandes DAC, Fortes FS,
Ribeiro JMG, Cerqueira RC, Rolim SAM, Araújo JF. Mathematical
model of the interaction between the dorsal and ventral regions of the
suprachiasmatic nucleus of rats. Sleep Sci. 2010;3(1): 40–44.
 Estudar o controle dos ritmos circadianos pelo sistema circadiano durante a
dissociação
com
simulação
matemática
comparando
com
resultados
experimentais.
o Gonçalves BSB, Carneiro BTS, Del Vechio KB, Ribeiro JMG, Araújo
JF. Efeito da interação do ciclo claro-escuro de 22 horas e o período
endógeno na relação de fase entre os ritmos circadianos de
atividade/repouso e temperatura central (em preparação).
 Estudar a organização funcional do sistema circadiano com simulação
matemática utilizando um modelo de dois conjuntos de osciladores.
o Gonçalves BSB, Araújo JF. Os efeitos da luz no ritmo circadiano: um
estudo computacional (em preparação).
6
 Estudar o comportamento das variáveis não paramétricas de análise do ritmo de
atividade e repouso em diferentes condições do sistema circadiano.
o Gonçalves BSB, Adamowicz T, Louzada FM, Moreno CRC, Araujo JF.
Um olhar sobre o uso das variáveis não-paramétricas em actimetria (em
preparação).
 Estudar a organização funcional do sistema circadiano utilizando ferramentas
não paramétricas para análise do ritmo de atividade e repouso.
o Gonçalves BSB, Cavalcanti PRA, Tavares GR, Campos TF, Araújo JF.
Métodos não-paramétricos em actigrafia: Uma atualização (em
preparação).
7
Artigo 1 - Mathematical model of the interaction between the dorsal and ventral
regions of the suprachiasmatic nucleus of rats.
Autores:
Bruno da Silva Brandão Gonçalves
Breno Tercio Santos Carneiro
Crhistiane Andressa da Silva
Diego Alexandre da Cunha Fernandes
Fabiano Santos Fortes
João Miguel Gonçalves Ribeiro
Rafaela Cobuci Cerqueira
Sergio Arthuro Mota Rolim
John Fontenele Araújo
Periódico em que foi publicado: Sleep Science (Qualis B5).
8
9
10
11
12
13
Contribuição dos autores do Artigo 1:
Bruno da Silva Brandão Gonçalves: Construção do modelo, execução das simulações,
escrita do artigo.
Breno Tercio Santos Carneiro: Discussão dos resultados, e escrita do artigo.
Crhistiane Andressa da Silva: Discussão dos resultados, e escrita do artigo.
Diego Alexandre da Cunha Fernandes: Discussão dos resultados, e escrita do artigo.
Fabiano Santos Fortes: Discussão dos resultados, e escrita do artigo.
João Miguel Gonçalves Ribeiro: Discussão dos resultados, e escrita do artigo.
Rafaela Cobuci Cerqueira: Discussão dos resultados, e escrita do artigo.
Sergio Arthuro Mota Rolim: Discussão dos resultados, e escrita do artigo.
John Fontenele Araújo: Discussão dos resultados, e escrita do artigo.
14
Artigo 2 - Efeito da interação entre o ciclo claro-escuro de 22 horas e o período
endógeno: implicações na amplitude e na relação de fase entre os ritmos
circadianos
Autores:
Bruno da Silva Brandão Gonçalves
Breno Tercio Santos Carneiro,
Bruna Del Vechio Koike
João Miguel Gonçalves Ribeiro
John Fontenele Araújo
Periódico ao qual será submetido: Chronobiology International
15
Artigo 2 - Efeito da interação do ciclo claro-escuro de 22 horas e o período
endógeno na relação de fase entre os ritmos circadianos de atividade/repouso e
temperatura central
Autores: Bruno da Silva Brandão Gonçalves1,2, Breno Tercio Santos Carneiro1, Bruna
Del Vechio Koike1, João Miguel Gonçalves Ribeiro1,John Fontenele Araújo1
1 – Departamento de Fisiologia, Centro de Biociências, Universidade Federal do Rio
Grande do Norte –UFRN, Natal (RN), Brasil.
2 – Instituto Federal Sudeste de Minas Gerais – Campus Barbacena, Barbacena (MG),
Brasil
Periódico ao qual será submetido: Chronobiology International
16
RESUMO
Ratos submetidos a ciclos claro-escuro com o período de 22h apresentam dois
componentes rítmicos com períodos diferentes (1320 e maior do que 1440 minutos) na
atividade locomotora. Sugere-se que cada um desses componentes seja gerado por uma
das duas regiões diferentes dos núcleos supraquiasmáticos. E a partir de simulações
computacionais em conjunto com a análise de dados da atividade locomotora têm sido
mostrado que esses componentes podem ser gerados por um único oscilador através de
dois fenômenos: a modulação ou a superposição linear. Na superposição linear ocorre
um fenômeno conhecido como batimento, que é o aparecimento de uma modulação
lenta na amplitude da saída do oscilador. Um comportamento semelhante a esta
modulação foi encontrado nos ritmos da atividade locomotora e de secreção de
melatonina. Aqui nós mostramos essa modulação através da análise da variação na
amplitude da temperatura central. Para isso comparamos o ritmo da temperatura central
de animais submetidos ao ciclo CE de 22 horas com o grupo controle (expostos ao ciclo
CE 24h). Além da variabilidade na amplitude da temperatura decorrente da
superposição linear, nós encontramos uma maior instabilidade no ângulo de fase entre a
atividade e a temperatura no grupo exposto ao ciclo CE de 22 horas. Esses resultados
ajudam a discutir os efeitos da dessincronização interna que ocorre nos seres vivos,
permitindo interpretar que ultrapassar o limite da sincronização pode acarretar diversas
consequências para o organismo, provocando a quebra da ordem temporal interna
levando ao surgimento de doenças.
17
1. INTRODUÇÃO
Os ritmos circadianos são oscilações recorrentes de aproximadamente 24 horas,
observadas desde o nível bioquímico até o cognitivo (Kondo et al., 1993; Campos et al.,
2001; Wright et al., 2012). Esses ritmos são controlados por um sistema de
temporização interno, e sincronizados por pistas ambientais (para revisão ver Schibler et
al., 2003). Entende-se que o sistema de sincronização circadiana em mamíferos é
composto de múltiplos osciladores arranjados de forma hierárquica, sendo o núcleo
supraquiasmático (NSQ) do hipotálamo seu oscilador central (Ralph et. al., 1990,
Schwartz, 2002).
Estudos recentes mostram que os NSQs apresentam pelo menos duas regiões
morfologicamente e funcionalmente distintas: região ventrolateral (vl-NSQ) e região
dorsomedial (dm-NSQ) (4). A região vl-NSQ recebe diretamente a informação
luminosa através do trato retino-hipotalâmico (RHT) (Moore e Lenn, 1972). Entre essas
regiões do NSQ, há uma densa projeção de vl para dm com pouca inervação recíproca
(Leak et. al., 1999), o que sugere que a região vl é sincronizada pelo ciclo claro-escuro e
ajusta a fase de dm (Miyake et. al.,2000).
Sob um regime de ciclo CE próximo ao limite inferior de sincronização, ratos
apresentam dissociação do ritmo de atividade locomotora resultando na apresentação de
dois componentes rítmicos: um deles sincronizado ao ciclo CE imposto e outro não
sincronizado que segue num período maior que 24h (Campuzano e cols., 1998). A
exposição dos animais a diferentes fotofases variando o período entre 22 e 23h gera uma
gama de padrões de atividade locomotora diferentes, desde o arrastamento total do
ritmo (ajustado ao ciclo claro/escuro imposto) até o ritmo em livre curso (expressão do
componente endógeno), o que indica que o processo de sincronização do sistema de
temporização circadiano pode ser gradualmente distribuído entre o componente
18
circadiano dependente de luz e o componente em livre curso, sugerindo que populações
distintas de osciladores podem estar em diferentes níveis de (des) acoplamento
(Cambras et al, 2004). Este mesmo efeito pode ser observado em outros ritmos
circadianos, tais como o de temperatura central e o de sono-vigília (Campuzano et. al.,
1998; Vilaplana et. al., 1997; Cambras et. al., 2007).
Em um trabalho elegante analisando a expressão gênica de Per1 e Bmal1, de la
Iglesia et al. (2004) mostraram a relação entre a expressão dos dois componentes
rítmicos da atividade locomotora e as subdivisões do NSQ – vl e dm. O componente
sincronizado ao CE mostrou-se associado à expressão gênica da região vl-NSQ e o
componente com período maior que 24 h está associado à dm-NSQ. Utilizando um
modelo matemático de dois osciladores acoplados, Schwartz et al. (2009) mostraram
que o oscilador na região dm-NSQ apresenta uma coordenação relativa em ratos
mantidos em CE de 22 h. Além disso, mostraram que a liberação de melatonina
apresenta uma variação na sua amplitude que pode estar associada ao sinal de saída da
região dm-NSQ. Em outras palavras, a atividade ocorre quando o animal deveria estar
em repouso (misaligned phase). A estabilidade da relação de fase entre diferentes ritmos
circadianos está reduzida.
No presente trabalho, investigamos o comportamento da relação de fase entre
dois ritmos dependentes do NSQ, o ritmo de atividade-repouso e o ritmo da temperatura
central. Para isso utilizamos simulações computacionais e registros experimentais de
ratos mantidos em ciclo CE simétricos de 24 e 22 horas.
2. MATERIAL E MÉTODOS
2.1. Modelo computacional
O modelo utilizado nesse trabalho foi descrito anteriormente pelo nosso grupo
(2010) e simula dois osciladores, cada um representando duas regiões do NSQ
19
(Gonçalves et.al.,2010). O oscilador vl-NSQ recebe a informação luminosa e sua saída é
projetada para o oscilador dm-NSQ. A saída utilizada para nossas análises será do
oscilador dm-NSQ que simula a região dorsomedial. O modelo foi submetido ao ciclo
claro-escuro (CE) de 24 horas (T24) e de 22 horas (T22) de forma semelhante aos
experimentos.
Cada oscilador foi descrito pelo modelo de Goodwin (1965) composto por três
variáveis (X, Y e Z). Nesses osciladores a variável X representou a concentração de um
gene relógio fictício, Y a proteína produzida por X e Z um inibidor da produção de X.
No modelo adaptado por Gonçalves et al. (2010) a luz tinha o efeito de aumentar a taxa
de produção do gene relógio X. Os parâmetros foram ajustados para que os períodos
endógenos dos osciladores vl-NSQ e dm-NSQ fossem iguais a 24.25 e 24.4 horas,
respectivamente.
2.2. Procedimentos experimentais
Condições gerais
Foram utilizados 18 ratos Wistar (2-4 meses de idade) no estudo. Os animais
foram mantidos individualmente em gaiolas de polipropileno dentro de módulos de
isolamento com controle do ciclo CE e da temperatura (23 ± 1°C). Água e ração
(Labina, Purina®) foram disponibilizadas à vontade durante todos os experimentos. A
atividade motora foi registrada através de sensores infravermelhos e a temperatura
corporal através de sensores ibutton (Maxim Integrated Products, Inc.). Todos os
protocolos experimentais foram aprovados pelo Comitê de Ética para o Uso de Animais
da Universidade Federal do Rio Grande do Norte (projetos nºs. 026/2009, 021/2010,
038/2010). Este estudo foi realizado de acordo com os princípios éticos da Sociedade
Brasileira de Ciência em Animais de Laboratório (SBCAL).
Procedimentos cirúrgicos
20
Os animais foram anestesiados por meio de injeções intraperitoneais de cetamina
(100 mg/kg) e xilazina (10 mg/kg). Os sensores de temperatura foram inseridos na
cavidade peritoneal através de uma incisão de aproximadamente um cm. Após a
cirurgia, foram administradas gentamicina (0,1 ml) e dexametasona (0,1 ml) e os
animais permaneceram em recuperação por pelo menos 10 dias até o início dos
experimentos. Os mesmos procedimentos foram utilizados para retirar os sensores após
o fim dos experimentos.
Experimentos
Um grupo de 10 ratos foi sincronizado em CE 12:12 por 18 dias (grupo T24)
enquanto outro grupo de oito ratos foi submetido ao protocolo de dessincronização
forçada (T22), que consistiu num ciclo CE 11:11 por 30 dias até apresentarem
dissociação do ritmo de atividade locomotora. Este grupo foi registrado por mais 100
dias consecutivos para registro e avaliação do ritmo em dessincronização forçada.
Análise de dados
Os dados de temperatura foram registrados durante 28 dias, e para a análise
foram filtrados utilizando uma média móvel com uma janela de 10 horas. A amplitude
foi calculada como o valor máximo da temperatura subtraído pelo valor mínimo. Para
cada animal foi calculado o coeficiente de variação (CV), definido como o desvio
padrão das amplitudes diárias da temperatura por sua média. O CV é calculado para
cada animal a partir das N amplitudes. Sendo N o número de dias registrados.
O registro completo da atividade locomotora em T22 foi utilizado para
calcularmos as frequências e períodos presentes no ritmo. Para esse cálculo utilizamos o
periodograma Sokolove-Bushel (Sokolove e Bushel, 1978). O cálculo da frequência de
batimento (fb) foi feito através da fórmula (f1-f2). Sendo f1 a frequência do zeitgeber
(1/79200 Hz) e f2 a frequência do ritmo em livre curso.
21
3. RESULTADOS
Uma inspeção visual dos actogramas e a geração de periodogramas a partir do
registro de atividade e temperatura indicam que todos os animais sincronizaram ao ciclo
CE de 24 horas (Figura 1). Todos os animais submetidos ao ciclo CE de 22
apresentaram dois componentes rítmicos de atividade locomotora:um com período
médio de 1320 min e o outro de 1500±10 min (Figura 2). Avaliando o ritmo circadiano
da temperatura, somente um animal apresentou dois componentes rítmicos e sete
animais apresentaram um único componente rítmico em livre-curso com período de
1498±13.
Figura 1 – Gráficos representativos dos registros experimentais de atividade
locomotora, temperatura corporal e da simulação computacional em T24.
22
Figura 2 – Gráficos representativos dos registros experimentais de atividade
locomotora, temperatura corporal e da simulação computacional em T22.
A temperatura foi filtrada utilizando uma média móvel de 10 horas (figura 3A e
3B). Uma inspeção visual mostra que a variação na amplitude é menor em T24 quando
comparado com T22 (figura 3). Esse resultado foi obtido nos registros experimentais
(figura 3A e 3B) e nas simulações computacionais (figuras 3C e 3D). A partir desses
valores calculamos o CV da amplitude da temperatura nas duas condições de CE. Em
T24 o CV foi igual a 0.15±0.04 e em T22 a média foi igual a 0.30±0.04. O teste T
mostrou que há uma diferença significante entre os dois grupos (p < 0.001).
23
Figura 3. Registros experimentais da temperatura central filtrada pelo método de média
móvel em T24 (A) e em T22(B). Saída do oscilador dm-NSQ simulado em T24 (C) e
em T22 (D). Tanto para os dados experimentais e computacionais a variação na
amplitude da temperatura é menor em T24 (A e C) do que em T22 (B e D).
Calculamos o ângulo de fase entre as acrofases do ritmo circadiano da
temperatura central e do ritmo de atividade-repouso para cada período de 24 horas para
ambos os grupos. A média e o desvio padrão do ângulo de fase foi igual a 1.21±0.36 h e
2.36±0.77 h para os ciclos CE de T24 e T22, respectivamente. O teste T mostrou que há
uma diferença significante entre os dois grupos (p<0.001). A partir dos ângulos de
fases dos animais calculamos a variância desses valores. Encontramos que para T24 a
média das variâncias foi de 2.50±1.28 h e para T22 foi de 5.70± 2.34 h (p = 0.0019).
24
4. DISCUSSÃO
Neste trabalho, pudemos observar que ratos submetidos ao protocolo de
dessincronização forçada em ciclo CE simétrico de 22 horas, apresentam maior variação
na amplitude diária quando comparada aos animais expostos ao ciclo CE de 24 horas,
tanto no ritmo de atividade locomotora quanto do ritmo da temperatura central. O
mesmo resultado foi encontrado na simulação matemática do modelo.
Como acontece experimentalmente, em T24 ambos os osciladores sincronizaram
ao estímulo externo confirmando a sincronização, ou o acoplamento, entre as duas
regiões dos NSQs sob o ciclo CE de 24 horas. Por outro lado, a expressão de genes
relógios durante o protocolo de dessincronização forçada (T22) mostra que o oscilador
vl-NSQ sincroniza ao CE enquanto o dm-NSQ apresenta um período semelhante aos
animais em livre curso. Em nossas simulações, o comportamento do oscilador vl-NSQ
seguiu o achado experimental permanecendo sincronizado a luz. Quanto à região dmNSQ, os dois períodos encontrados na saída deste oscilador não foram encontrados nos
dados de la Iglesia et al. (2004) devido à técnica utilizada. No referido trabalho, a
expressão dos genes relógios foi analisada em um único dia para cada animal. Essa
amostragem impossibilita a detecção de mais de um componente rítmico na expressão
dos genes relógios no oscilador dm-NSQ. Granada et al. (2011) mostraram que um
único oscilador é capaz de gerar diferentes componentes rítmicos e que isso deve ser
uma explicação complementar para a dessincronização forçada. Para os autores um
oscilador pode apresentar dois componentes espectrais independentes através da
superposição linear de duas ondas. A primeira seria referente ao período endógeno do
oscilador e a segunda dependente do ciclo CE. Se pensarmos que o dm-NSQ atua como
principal saída do NSQ, o padrão observado na simulação de T22 seria devido ao seu
período intrínseco somado a saída de vl-NSQ que está sincronizado ao ciclo CE de 22
horas.
25
A superposição linear de dois períodos gera um fenômeno chamado batimento
que é típico de osciladores no limite de sincronização (Granada et al. 2011). O
batimento gera uma modulação lenta na saída do oscilador com uma frequência igual à
composição das frequências do zeitgeber e do oscilador. Os valores encontrados para o
período dessa modulação na atividade foi próximo ao calculado, com um erro de
10+2%. A variação encontrada na amplitude da temperatura em T22 pode ser explicada
por esse efeito de batimento e também ocorre no ritmo de secreção de melatonina
(Schwartz et al., 2009). A compressão e descompressão na amplitude da curva de
secreção de melatonina persistem em escuro constante. Com isso, é possível concluir
que o ritmo de secreção de melatonina é controlado pelo oscilador dm-NSQ, cuja saída
no modelo apresentou uma maior variação na amplitude. Assim foi descartada a
hipótese de que a variação na concentração de melatonina é somente dependente do
mascaramento pela luz.
Figura 4. Influência do NSQ sobre os osciladores centrais e periféricos na construção
dos ritmos circadianos. Em T22 a saída da região dm-NSQ simulada é apresentada em
(A) com uma variação na amplitude tendo o seu máximo em 1 e o mínimo em 2. Essa
variação altera a estabilidade na sincronização que ocorre entre os múltiplos osciladores
26
que formam o sistema de temporização circadiano (B), sendo que em 1 a sincronização
do ritmo do NSQ é maior do que em 2. Quando a saída do dm-NSQ é baixa a diferença
de fase entre os ritmos deve ser maior como demonstrado em (C).
Com o nosso modelo computacional reproduzimos essas condições e
encontramos essa variação na amplitude da saída de dm-NSQ em T22. O modelo
computacional utilizado por Schwartz et al. (2009) apresentou resultados semelhantes
aos nossos e como ambos os modelos não simulam o efeito inibitório da luz, reforçamos
a ideia de que essa variação na amplitude dos ritmos tem uma relação com a saída do
oscilador. A alta variabilidade na amplitude da saída do NSQ em T22 deve gerar uma
instabilidade nas fases dos ritmos circadianos como temperatura central, ciclo sonovigília, liberação de hormônios e outros, dificultando a sincronização, como mostrado
na figura 4. Acreditamos que quando a saída do NSQ é reduzida há uma perda na
capacidade desse marcapasso em sincronizar os osciladores circadianos no regime CE
de 22 horas (figura 4B). Da mesma forma a maior estabilidade na relação de fase dos
ritmos em T24 se deve a pouca variação na amplitude da saída do NSQ, facilitando a
sincronização do oscilador (a geração dos ritmos) com os osciladores periféricos.
O sistema circadiano parece estar envolvido também na regulação de processos
cognitivos (Tapp e Holloway, 1981; Valentinuzzi et al, 2008; Craig e McDonald, 2008;
Loh et al., 2010). Especificamente, mostramos que os animais com dissociação do ritmo
circadiano apresentam déficits de memória em um tipo específico de tarefa, a esquiva
passiva (Neto et al., 2008). Talvez, a dessincronização circadiana ou o desalinhamento
entre ritmos circadianos, ou seja, a desordem temporal interna, prejudique funções
cognitivas e também a saúde numa forma geral, uma vez que várias evidências
mostram
que
a
dessincronização
circadiana
pode
estar
desenvolvimento de doenças (Martino et al., 2008; Preuss et al., 2008)
27
ligada
ao
Consequências da alteração/dessincronização circadiana têm sido reportadas
também em seres humanos (Cho et al., 2000). Além disso, transtornos psiquiátricos, por
exemplo, apresentam uma série de sintomas relacionados a distúrbios de ritmo, como a
dessincronização do ciclo sono-vigília que é observada em praticamente 80% dos
indivíduos acometidos (Maurizi et al., 2000). Os pacientes depressivos apresentam um
avanço da fase do sono e acarretam uma relação de fase anormal com diversos outros
ritmos, quase sempre resultando em um episódio depressivo (Wehr et al., 1979). Esses
estudos, entre outros, mostram a estreita relação entre o sistema de temporização com
graves transtornos como os psiquiátricos, ressaltando assim a relevância da ritmicidade
circadiana na saúde e no bom funcionamento do organismo. Em alguns casos os seres
humanos são submetidos a mudanças no ciclo CE que os colocam em seu limite de
sincronização. As alterações fisiológicas que acontecem podem estar relacionadas à
variação na saída do oscilador principal e na instabilidade de fase entre os ritmos
circadianos.
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33
Contribuição dos autores do Artigo 2:
Bruno da Silva Brandão Gonçalves: execução das simulações, análise dos dados
experimentais e escrita do artigo.
Breno Tercio Santos Carneiro: realização dos experimentos, análise dos dados
experimentais, discussão dos resultados, e escrita do artigo.
Bruna Del Vechio Koike: realização dos experimentos, discussão dos resultados, e
escrita do artigo.
João Miguel Gonçalves Ribeiro: realização dos experimentos, discussão dos resultados,
e escrita do artigo.
John Fontenele Araújo: Discussão dos resultados, e escrita do artigo.
34
Artigo 3: Os efeitos da luz no núcleo supraquiasmático: um estudo computacional
Bruno S. B. Gonçalves 1,2,3 & John F. Araujo 1,2
1. Programa de Pós-Graduação em Psicobiologia, UFRN
2. Laboratório de Neurobiologia e Ritmicidade Biológica, UFRN
3. Instituto Federal Sudeste de Minas Gerais – Campus Barbacena
Correspondence adress: P.o.Box 1506, Natal, RN, Brazil, 59078970
[email protected]
Periódico ao qual será submetido: Journal of Biological Rhythms
Resumo
O ritmo circadiano em roedores é gerado por um sistema de temporização cujo
componente principal é o núcleo supraquiasmático. Essa estrutura funciona como um
grupo de osciladores e sua dinâmica temporal é alterada pela luz. Nesse trabalho
simulamos um sistema de temporização circadiana com ênfase no efeito da luz sobre
esse sistema. A partir das simulações foi possível reproduzir resultados semelhantes aos
obtidos em experimentos com roedores como a regra Aschoff, a arritmicidade em claro
constante de alta intensidade e a dissociação. Apresentamos aqui um modelo capaz de
simular vários resultados experimentais que consideram que a luz altera a expressão de
genes relógios e reduz o acoplamento entre os osciladores do núcleo supraquiasmático.
Palavras chaves: núcleo supraquiasmático, sistema de temporização circadiana, modelo
matemático
35
Introdução
Quando submetidos a um ciclo claro-escuro (CE) com período de 24 horas, ratos
e camundongos apresentam a fase ativa no escuro e essa sincronização ao ambiente
externo permite uma antecipação às mudanças externas. Na condição de escuro
constante os ritmos circadianos apresentam um período maior do que 24 horas e um
pulso de luz pode alterar a expressão dos ritmos dependendo da fase em que for
aplicado (Honma et.al.,1978;Sharma e Chandrashekaran,1997). Em ambientes com
iluminação constante esses animais apresentam um ritmo em livre curso cujo período
varia diretamente com a intensidade luminosa (Summer et.al.,1984, Mrosovsky,2003).
A exposição prolongada a luz induz uma supressão e arritmicidade no ritmo circadiano
da
temperatura
e
atividade
motora
nesses
animais
(ratos:
Depres-Brumer
et.al.,1995,Chiesa et.al.,2010; camundongos: Ohta et. al,2005). Além disso, ratos
mantidos num ciclo CE simétrico de 22 horas apresentam dois períodos na sua atividade
locomotora (Campuzano et.al.,1997). Essas diferentes respostas são melhores
compreendidas quando consideramos os dois efeitos da luz nos neurônios do NSQ:
aumento da expressão de genes relógios e redução no acoplamento neuronal.
Com relação à expressão gênica, o pico da expressão do gene Per1 é maior em
condições de CE simétrico de 24 do que em condições de EE (Yan et. al. 1999). Em
camundongos, um pulso de luz apresentado durante a condição de escuro constante
eleva a concentração do RNA mensageiro de Per1 (mPer1) e altera a fase do oscilador
genético (Shigeyoshi et. al. 1997). Além de alterar a dinâmica da expressão dos genes
relógios a luz atua reduzindo o sincronismo entre os neurônios do NSQ. Ohta e
colaboradores mostraram que os neurônios do NSQ de camundongos arrítmicos
continuam expressando Per1 em luz constante, porém de forma dessincronizada (Ohta
36
et. al,2005). Brown e Piggins mostraram que em fotofases longas há uma maior
diferença de fase entre os neurônios da região ventrolateral do NSQ (Browm e
Piggins,2009). Esses trabalhos experimentais dão suporte para a criação de modelos
matemáticos que considerem os diferentes efeitos da luz no NSQ.
Diversos modelos matemáticos têm sido utilizados como ferramentas para se
estudar as propriedades do sistema de temporização circadiana. Dentre eles destacamos:
modelos cujo ritmo está associado a variáveis sem correlato experimental (Schwartz et.
al.,2009; Kunz e Achermann,2003, Cardoso et.al.,2009, Oda e Friesen,2002 ); modelos
cujas variáveis simulam genes relógios fictícios (Scheper et. al.,1999; Gonze et.
al.,2005; Ullner et.al.,2009) e modelos que simulam genes relógios identificados
experimentalmente como Per, Cry, Bmal e Clock (Geier et. al.,2005, Bernard et.
al.,2007, Jun-Wei e Tian-Shou, 2009). A respeito dos efeitos da luz no mecanismo de
acoplamento dos osciladores do NSQ há, entretanto, poucos trabalhos de modelagem, e
destacamos dois que utilizam essa abordagem computacional. Diez-Noguera,1994
construiu um modelo multioscilatório em que a luz reduzia o acoplamento entre os
neurônios (Diez-Noguera,1994) tornando possível reproduzir a sincronização ao CE, o
livre curso em escuro constante, a arritmicidade em claro constante de alta intensidade e
outros padrões complexos. Outro modelo que segue essa mesma abordagem estudou
como um ruído pode recuperar a perda da ritmicidade resultante do aumento na
luminosidade (Ullner et.al.,2009) e os autores mostraram que a presença de um ruído no
acoplamento entre os osciladores aumentou o sincronismo entre eles. Na literatura não é
do nosso conhecimento a existência de um modelo que simula simultaneamente o efeito
da luz na velocidade dos osciladores e no acoplamento entre eles.
Assim, o presente trabalho objetivou apresentar um modelo do NSQ que
considera o acoplamento entre os neurônios de forma individual e entre as duas regiões
37
do NSQ (dorsomedial e ventrolateral). Aqui nós simulamos o efeito que a luz tem sobre
a geração do ritmo dos osciladores e no acoplamento entre eles e com isso conseguimos
avançar na criação de um modelo capaz de reproduzir os resultados experimentais
mostrados anteriormente.
Metodologia
Modelo Matemático
A entrada da luz no sistema circadiano ocorre através da região ventrolateral e
esta projeta sua saída para os osciladores da região dorsomedial (Leak et.
al.,1999;Morin et. al.,2006). Em nosso modelo nós utilizamos essa topologia (figura 1)
e para representar o ritmo de atividade e repouso foi utilizada a saída da região
dorsomedial (dm-NSQ). A saída da região ventrolateral (vl-NSQ) foi utilizada para
compararmos os nossos resultados com achados experimentais. Cada região foi
composta por 100 osciladores acoplados entre si.
Figura 1 – Estrutura do modelo. O ciclo claro-escuro altera dois parâmetros do modelo,
a expressão do mRNA do gene fictício (jv) nos osciladores da região vl-NSQ e o
acoplamento entre eles (Qv). A saída global da região vl-NSQ sincroniza os osciladores
38
da região dm-NSQ aumentando a expressão do mRNA do gene fictício nos osciladores
dessa região. O acoplamento entre esses osciladores é mantido fixo com o valor de Qd.
A atividade locomotora foi calculada a partir da saída global da região dm-NSQ.
Para simular o mecanismo molecular circadiano, adaptamos o modelo de Ullner
e colaboradores (2009) com quatro variáveis (Ullner et.al.,2009). Nesse trabalho os
autores se basearam no modelo de Goodwin, que é amplamente utilizado para descrever
os osciladores circadianos (Ruoff et.al.,1999, Gonze et.al.,2005, Locke et.al.,2008, Gu
et.al.,2009, Gu et.al.,2011). A variável X representa a concentração do mRNA de um
dado gene relógio fictício; a variável Y representa a concentração da proteína produzida
pelo gene X; Z corresponde a um inibidor da síntese de X no núcleo da célula e V é
uma simplificação do acoplamento global, que no modelo atua de forma difusiva. Essas
equações foram utilizadas para descrever cada oscilador utilizado nas simulações.
Equações representativas das variáveis do modelo – Esse modelo foi utilizado para
descrever o ritmo circadiano dos osciladores nas duas regiões do NSQ. Ullner e
colaboradores definiram que (1) representa um gene fictício X que produz uma proteína
Y descrita pela equação 2. Essa proteína fictícia ativa um fator descrito por (3) que inibe
a produção de X. O acoplamento entre os neurônios é definido por V e é descrito pela
equação (4). Na região vl-NSQ a luz afeta diretamente a concentração de X e
39
inversamente no acoplamento entre os neurônios. No dm-NSQ a expressão de X é
afetada pela saída dos osciladores da região vl-NSQ. O acoplamento entre os neurônios
do dm-NSQ foi mantido fixo.
As constantes ax,y,z,v e bx,y,z,v correspondem respectivamente à produção e
degradação das variáveis de X, Y, Z e V em ambas as regiões simuladas. A constante
‘d’ modula a força da influência do oscilador vl-NSQ sobre o dm-NSQ.
Para
simplificar a simulação, cada oscilador foi conectado de forma aleatória a outro do
grupo distinto.
Foi adicionado à equação 1 original (Ullner et.al., 2009) um termo ‘j’
incrementando o valor da constante de produção da variável X (ax). No caso dos
osciladores da região vl-NSQ, a adição desse termo (jv) foi necessária para simular o
efeito da luz sobre a expressão do gene relógio. Na região dm-NSQ o termo foi utilizado
para acoplá-los aos osciladores da região dm-NSQ e na vl-NSQ esse termo foi
associado à luz (jv = 0.156 para o escuro e jv = 0,27 para iluminação máxima). Na região
dm-NSQ, “jd” foi associado à saída da vl-NSQ (jd = 0,2* Saída vl).
O acoplamento entre os osciladores (‘Q’) de um mesmo grupo foi simulado de
maneira diferente. Nos osciladores da região vl-NSQ, ‘Qv’ estava associado
inversamente a luz, assim, quanto maior a intensidade luminosa menor foi o
acoplamento. Já nos osciladores de dm-NSQ esse valor ‘Qd’ foi mantido fixo. A
variável ‘G’ corresponde a média da variável ‘V’ de todos os osciladores daquela
determinada região.
Os valores das constantes foram ajustados para que o período em escuro
constante do oscilador vl fosse igual a 24,25 h. Nessa condição, o período da saída de
dm-NSQ foi igual a 24,4 h , quando desacoplado de vl-NSQ. Os valores de ‘bx’ foram
40
ajustados em 0,35 e 0,3225 para vl-NSQ e dm-NSQ, respectivamente. As outras
constantes foram iguais, sendo: ax= ay = az = av = 0,7; by= bz= bv = 0,35.
A saída global da região dm-NSQ foi calculada como o somatório de todos os
osciladores cujas saídas foram iguais ou superiores a um limiar (Yth=0.35) dividido pelo
número total de osciladores.
Ciclo Claro-escuro
O ciclo de iluminação utilizado na simulação foi do tipo onda quadrada
simétrica. O período do ciclo variou de acordo com o protocolo e foi identificado por
TXX, sendo XX o valor em horas do período.
Périodo e amplitude da saída
O período foi calculado através do periodograma descrito por Sokolove e
Bushell, 1978. A amplitude foi calculada como a diferença entre o valor máximo e o
mínimo da saída.
Sincronismo entre os osciladores (separar para cada região)
Para o cálculo do sincronismo entre os osciladores (Rsyn) de uma mesma região
foram utilizadas as equações 5 e 6. Esse valor foi definido como a razão da variância da
média da variável Y (síntese de proteína eq. 2) dos osciladores, pela média da variância
de cada oscilador (Yi) da mesma região.
(5)
41
(6)
Equação 5 – O cálculo do sincronismo entre os osciladores de uma região (Rsyn) foi
definido como a razão da variância da média dos osciladores pela média da variância de
cada oscilador
Protocolos de simulação
Os protocolos utilizados nos permitiram reproduzir os resultados experimentais
relatados na literatura. Calculamos a sincronização em T24 com o ciclo simétrico de
claro-escuro com jv=0.156 para o escuro e jv=0.3 para o claro. O livre curso foi estudado
ajustando o valor de jv em 0.3. A curva de resposta de fase foi construída simulando o
escuro constante (jv=0.156) e aplicou-se um pulso de 1 hora de duração com jv=0.3 em
diferentes fases. Para estudar o efeito tônico da luz modificamos a variável jv para
simular desde o escuro constante até o nível máximo de iluminação. Isso nos permitiu
identificar como a luz constante poderia afetar o período (regra de Aschoff), a amplitude
do ritmo e o sincronismo entre os osciladores do NSQ. O limite de sincronização foi
calculado variando o período do ciclo CE simétrico com jv=0.156 para o escuro e jv=0.3
para o claro. Para estudarmos o efeito da fotofase no acoplamento entre os osciladores
da região vl-NSQ submetemos o modelo aos ciclos CE de 8:16 e 16:8.
Resultados
A sincronização do modelo foi estudada com o ciclo simétrico de CE com
período de 24 horas. O escuro foi simulado com jv=0.156 e o claro com jv=0.3. Nessa
condição a saída global da região dm-NSQ apresentou uma sincronização ao estímulo
42
externo (Figura 2). Quando o modelo foi submetido ao escuro constante a saída global
apresentou um livre curso com período igual a 24.8 após o transiente.
Figura 2 – Saída da região dm-NSQ durante um ciclo CE simétrico de 24 horas seguido
da condição de escuro constante.
Na condição de livre curso foi possível estudar a curva de resposta de fase do
modelo. Para isso aplicamos pulsos de luz com 1 hora de duração em diferentes tempos
circadianos (CT). Nós analisamos a mudança de fase da saída global da região dm-NSQ
e calculamos a curva de resposta de fase do NSQ simulado (Figura 3). O CT10
corresponde ao pico da concentração da proteína relógio simulada. Pulsos de luz de uma
hora de duração aplicados entre CT5 e CT15 atrasaram a fase do oscilador, enquanto
nas outras regiões houve um avanço na fase do oscilador.
43
Figura 3 – Curva de resposta de fase da saída da atividade locomotora do NSQ
simulado. Ambas as regiões vl e dm apresentaram a mesma curva de resposta de fase.
Neste trabalho, além do efeito fásico da luz também estudamos o seu efeito
tônico (Figura 4). Durante o escuro constante (jv=0.156) o período foi igual a 24.8 horas
e um aumento na intensidade luminosa para jv=0.2 elevou o período para 24.85 h.
Houve uma arritmicidade quando submetemos o modelo a uma iluminação com alta
intensidade (jv=0.3) por mais de 100 dias de simulação.
44
Figura 4 – Efeito tônico da luz sobre a atividade locomotora simulada. Actograma da
saída da região dm-NSQ durante três condições: escuro constante (jv=0.156), baixa
iluminação (jv=0.2) e máximo de iluminação (jv =0.3).
Avaliamos o comportamento do modelo em diferentes intensidades de luz com jv
variando de 0.156 (escuro constante) até 0.3 (iluminação máxima). Nessa análise
simulamos a regra de Aschoff (figura 5 A e B) e a arritmicidade durante iluminação
constante (figura 5 C).
45
Figura 5 – Efeito quantitativo tônico da luz sobre diferentes características do sistema.
(A) Período do ritmo em livre curso, (B) amplitude e (C) Sincronismo entre os
osciladores da região dm-NSQ.
Simulamos ciclos CE com diferentes períodos e identificamos os limites de
sincronização da região dm-NSQ (figura 6). A sincronização aconteceu quando o
período do ciclo CE estava entre 23 e 29 horas. Dois períodos apareceram quando o
ciclo CE estava a 22 horas e para valores menores observou-se o livre curso com um
único período. A região vl-NSQ se manteve sincronizada a todos os ciclos CE
simulados.
46
Figura 6 – Limite de sincronização das regiões vl-NSQ e dm-NSQ.
Variamos a fotofase do ciclo CE de 24 horas no modelo e verificamos o efeito
sobre os osciladores da região vl-NSQ. Quando a fase de claro foi igual a 8 horas os
osciladores apresentaram uma acrofase mais próxima (figura 7A) e um índice de
sincronização igual a 0.9970. Ao aumentar a fotofase para 16 horas houve uma redução
no acoplamento entre os osciladores (figura 7B) e o índice de sincronização foi igual a
0.9892.
Figura 7 – Variação da fotofase com ciclo CE igual a 24 horas. (A) 8 horas de duração
de claro, cada linha corresponde a saída de um oscilador da região vl-NSQ. (B) 16
horas de duração do claro.
47
Discussão
O modelo apresentado foi capaz de simular a sincronização em T24, o livre
curso em escuro constante, o efeito fásico da luz, os efeitos tônicos da luz como o
descrito pela regra de Aschoff, perda da ritmicidade em claro constante, os limites de
sincronização e o efeito de diferentes fotofases. Além disso, foi possível reproduzir os
achados experimentais referentes aos efeitos de diferentes fotofases sobre a região
ventrolateral do NSQ simulado.
Aqui nós incluímos os múltiplos osciladores existentes em cada região, o
aumento e a diminuição na expressão dos genes e no acoplamento entre os osciladores
pela luz respectivamente. Essas novas características fisiológicas permitiram a
reprodução de mais resultados experimentais em comparação ao nosso modelo proposto
anteriormente (Gonçalves et.al., 2010).
A sincronização em T24 e o livre curso em escuro constante são propriedades
básicas dos osciladores circadianos e foram simulados em nosso modelo.
Experimentalmente essas são as primeiras propriedades estudadas na ritmicidade
circadiana dos seres vivos. Essas propriedades também são simuladas nos modelos
computacionais (Kunz e Achermann,2003, Cardoso et.al.,2009, Oda e Friesen,2002
Scheper et. al.,1999; Gonze et. al.,2005;Geier et. al.,2005, Bernard et. al.,2007, JunWei e Tian-Shou, 2009 Diez-Noguera,1994).
O nosso modelo respondeu com avanços e atrasos para pulsos de luz aplicados
em diferentes fases da oscilação durante a condição de escuro constante. Assim foi
possível construir a curva de resposta de fase do NSQ simulado. A curva de resposta de
fase do modelo proposto não apresentou uma região sem mudança de fase (“deadzone”) durante o dia subjetivo. Esse resultado é encontrado em vários modelos que
simulam o STC simplificado (Geier et. al.,2005,Bodenstein et.al., 2012). Para incluir a
48
“dead-zone” em seu modelo Geier e cols (2005) simularam um filtro na entrada da luz
(Geier et. al.,2005). Segundo esses autores, não se conhece o mecanismo biológico
desse filtro que modifica a sensibilidade do oscilador a entrada luminosa, todavia
podemos supor que este seja um processo realizada na complexas rede neuronal
retiniana. Como o enfoque da nossa proposta foi a funcionalidade do NSQ, nos
limitamos a ignorar o efeito de alguns componentes externos, como a retina, por
exemplo.
Em condição de iluminação constante, os resultados na simulação do nosso
modelo seguiu a regra Aschoff, para animais noturnos, sendo os resultados semelhantes
a achados experimentais (Mrosovsky, 2002). Em nosso modelo a luz aumentou o tempo
necessário para que uma oscilação ocorresse, e com isso a intensidade luminosa estava
diretamente relacionada com o período em livre curso dos osciladores. Como a luz
aumenta a velocidade dos osciladores alguns modelos adicionam a luz como um termo
nas equações diferenciais (Gonze et.al.,2005;Ullner et.al.,2009; Gu et.al.,2012). Ullner
e cols (2009) discutem sobre essa limitação no modelo utilizado pois impossibilita a
simulação da iluminação constante e retira esse termo da equação. Em nosso trabalho a
luz foi incluída como aumentando o valor da variável responsável pela velocidade dos
osciladores. O efeito é semelhante, porém a limitação descrita por Ullner e cols (2009)
desaparece. Schroder e cols (2012) utilizam a mesma abordagem do nosso trabalho e
têm resultados semelhantes conseguindo mostrar que em iluminação constante o
período endógeno é maior do que em escuro constante (Schroder et.al.,2012) .
Durante a iluminação de alta intensidade houve uma perda na ritmicidade e os
osciladores continuaram expressando seu ritmo, porém de forma dessincronizada. Esses
achados corroboram com os resultados experimentais de Eastman e Rechtschaffen,
1983; Depres-Brummer,1995; Ohta et. al,2005 e Chiesa et. al.,2010. Nós observamos
49
uma redução na amplitude da saída da região dm-NSQ que está relacionada a
diminuição no sincronismo entre os osciladores da região vl-NSQ. Essa diminuição
deve dificultar uma saída coerente de elevada amplitude.
Quando simulamos o modelo fazendo uma variação entre 23 e 29 horas no
período do ciclo CE, a saída mostrou um ritmo sincronizado com o ciclo CE externo,
sugerindo que estes seriam os valores para o limite de sincronização do nosso modelo.
Dados experimentais mostram que ratos sincronizam seu ritmo de atividade locomotora
a ciclos diferentes de 24 horas (Cambras et.al.,2000). Quando o período do ciclo CE
externo foi igual a 22 horas, a saída do nosso modelo apresentou dois períodos. O
primeiro igual a 1320 min, ou seja, o mesmo do ciclo externo e o outro igual a 1450
min, próximo ao período da saída do modelo em livre curso. Este resultado da
simulação é semelhante ao observado em ratos que em T22 apresentam dois períodos
em sua atividade locomotora quando colocados em gaiolas menores (Campuzano
et.al.,1997). Este padrão em que dois componentes são detectados é chamado de
dissociação. Na dissociação, além do aparecimento de dois componentes rítmicos com
períodos diferentes, foi demonstrado experimentalmente que também há uma separação
na expressão de genes nas duas regiões do NSQ, vl-NSQ e dm-NSQ (de la Iglesia et.
al.,2004). Foi exatamente esta evidência experimental que mostrou a necessidade de se
simular no mínimo dois osciladores, ou duas regiões multioscilatórias, e que uma, vlNSQ, seria fundamental na sincronização com o ciclo claro-escuro e a outra, dm-NSQ,
responsável pela saída do sistema circadiano. Entretanto, o trabalho computacional de
Granada et al. (2011) mostrou ser possível gerar dois períodos na saída de um único
oscilador.
Cada região do NSQ tem uma função específica na organização funcional do
sistema circadiano. Ao simularmos somente a região vl-NSQ seria necessário reduzir a
50
amplitude da entrada do ciclo CE para podermos reproduzir uma saída com dois
períodos durante o T22. Nesse caso nosso modelo funcional estaria incompleto pois não
teríamos
uma
região
sincronizada
ao
ciclo
CE
externo
como
mostrado
experimentalmente (de la Iglesia et. al.,2004). E da mesma forma teríamos um modelo
incompleto se simulássemos somente a região dm-NSQ. Esses resultados nos indicam
que a região vl-NSQ atua como um filtro do ciclo CE para a região dm-NSQ com uma
função de saída do NSQ.
Na literatura existem modelos que consideram as subdivisões do NSQ (Bernard
et. al.,2007,Schwartz et. al.,2009, Gonçalves et.al.,2010) mas não simulam todos os
resultados experimentais aqui mostrados. Bernard e cols construíram um modelo com
dois grupos de múltiplos osciladores, mas não consideraram o efeito da luz no
acoplamento entre os osciladores (Bernard et. al.,2007). Assim não foi possível simular
a arritmicidade em claro constante. Schwartz e cols, (2009) simularam a dissociação
com um modelo composto por dois osciladores, cada um representando uma subdivisão
do NSQ (Schwartz et. al.,2009). Essa abordagem não permite simular a arritmicidade
em claro constante. De forma semelhante o nosso modelo proposto anteriormente
apresenta a mesma limitação (Gonçalves et.al.,2010).
Noguchi e cols (2004) mostraram que o período do ritmo de liberação de AVP
na região dm-NSQ é menor do que em vl-NSQ (Noguchi et.al.,2004). Essas diferenças
foram incorporadas em nosso modelo alterando os valores da constante bx para ambas
as regiões simuladas. Dessa forma quando dm-NSQ esta desconectado de vl-NSQ os
períodos em livre cursos eram diferentes. A região dm-NSQ apresenta o mesmo período
de vl-NSQ quando estas regiões se encontram conectadas. Experimentalmente foi
encontrado que quando as duas regiões estão conectadas o período delas é o mesmo da
51
região vl-NSQ (Noguchi et.al.,2004). Esse resultado sugere que a região vl-NSQ
sincroniza dm-NSQ da mesma forma que simulamos em nosso modelo.
Nosso modelo foi capaz de simular a redução no acoplamento entre os
osciladores da região vl-NSQ com o aumento na fotofase. A reprodução desse resultado
experimental foi possível pois consideramos as subdivisões principais do NSQ (Leak
et.al.,1999 e Moore et.al.,2002) e o efeito distinto da luz sobre elas (Browm e
Piggins,2009).
Ao nosso conhecimento não existe um modelo computacional capaz de simular
todos
esses
achados
experimentais
simultaneamente.
Acreditamos
que
por
considerarmos o NSQ dividido em duas regiões foi possível simular a dissociação em
T22 de forma semelhante a outros modelos (Bernard et. al.,2007, Schwartz et. al.,2009
e Gonçalves et.al.,2010). Em nosso modelo a luz reduz o acoplamento entre os
osciladores da região vl-NSQ e isso nos permitiu simular a arritmicidade em claro
constante. De forma semelhante Ullner e cols (2009) simularam a arritmicidade ao
considerar a redução no acoplamento pela luz, porém os autores não consideraram o
efeito da luz na velocidade dos osciladores (Ullner et.al., 2009). Esse efeito foi incluído
em nosso modelo e nos permitiu reproduzir a regra Aschoff no NSQ simulado. Dessa
forma propomos que ao simular o NSQ os novos modelos devem considerar a natureza
multioscilatória dessa região e os diferentes efeitos da luz na sua funcionalidade.
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56
Artigo 4: Um olhar sobre o uso das variáveis não-paramétricas em actimetria
Autores:
Bruno S. B. Gonçalves
Taísa Adamowicz
Fernando Mazilli Louzada
Claudia Roberta de Castro Moreno
John F. Araujo
Periódico: Chronobiology International
57
Artigo 4: Um olhar sobre o uso das variáveis não-paramétricas em actimetria
Bruno da Silva Brandão Gonçalves, Taísa Adamowicz, Fernando Mazilli Louzada,
Claudia Roberta de Castro Moreno, John Fontenele Araujo
Resumo
A actimetria é uma técnica e o seu uso tem sido focado na avaliação do sono,
porém os dados obtidos com este método refletem características do ritmo de atividade
e repouso. Variáveis não paramétricas têm sido largamente utilizadas na análise desse
ritmo em substituição a métodos de análises paramétricos como o COSINOR. Com
essas variáveis é possível medir a estabilidade, fragmentação e amplitude do ritmo de
atividade e repouso. Além disso, é possível quantificar a eficiência da vigília e do
repouso de forma separada. Essas variáveis são utilizadas em estudos que analisam o
efeito da idade, de doenças e de seus respectivos tratamentos na ritmicidade circadiana
em humanos. Nesse estudo, fizemos uma análise dos principais resultados dos artigos
publicados e elaboramos um modelo funcional de interação entre os diversos
componentes envolvidos na geração do ritmo circadiano de atividade e repouso. As
variáveis não paramétricas nos possibilitam inferir as principais características dos
ritmos circadianos como sincronização a um zeitgeber, a amplitude e robustez.
Palavras chave: circadiano, homeostático, modelo funcional, sono, fragmentação,
sincronização, amplitude, atividade e repouso.
58
Introdução
Nas últimas duas décadas a actimetria tem se destacado nas áreas de pesquisa do
sono e na Medicina do sono. A proporção de pesquisas publicadas com actimetria em
relação à polissonografia mudou de 1:10 para 1:4 em menos de vinte anos (SADEH,
2011). Além do uso na pesquisa sobre sono a actimetria é utilizada para registrar o ritmo
de atividade e repouso. Existem basicamente dois tipos de variáveis para caracterizar
esse ritmo: as baseadas em parâmetros de uma função conhecida, o cosseno e outras
conhecidas como não paramétricas. O ajuste de uma função cosseno a um registro de
atividade e repouso fornece parâmetros que são utilizados no estudo da ritmicidade
circadiana. Os parâmetros determinados são o MESOR, a amplitude, a acrofase e
significância de um período determinado, sendo o método conhecido como
COSINOR(Nelson et.al.,1979). Como o ritmo de atividade e repouso não apresenta
exatamente um comportamento de uma função senoidal, outras variáveis foram
propostas (Witting et.al.,1990). Por não se relacionarem aos parâmetros obtidos pelo
ajuste à função cosseno essas variáveis foram chamadas de não-paramétricas. São elas:
variabilidade intradiária (IV), estabilidade interdiária (IS), menor atividade durante 5
horas seguidas (L5) e maior atividade durante 10 horas consecutivas (M10). Ao
contrário do COSINOR, esta metodologia não supõe que o ritmo de atividade e repouso
tenha um comportamento semelhante ao de uma onda senoidal.
A variabilidade intradiária (IV) nos informa sobre a fragmentação de um ritmo.
Seu cálculo é baseado na primeira derivada do dado de actimetria amostrado a cada hora
(equação 1). A primeira derivada é formada por meio da diferença do elemento
posterior (i) pelo anterior (i-1) do dado bruto. A partir da primeira derivada é calculada
a média quadrática e o resultado é normalizado pela variância populacional do dado
bruto amostrado a cada hora.
59
(1)
A estabilidade interdiária (IS), que nos informa sobre a sincronização do ritmo
ao ciclo claro-escuro, é calculada a partir do perfil médio de 24 horas (equação 2). N
corresponde ao número total de dados, p é o número de dados por dia (nesse caso igual
a 24), Xm é a média de todos os dados, Xh corresponde a cada hora do perfil médio e
Xi representa cada dado horário do dado bruto.
(2)
Quando comparados aos parâmetros de uma função cosseno ajustada aos dados,
os valores não paramétricos se mostram mais eficientes para identificar alterações no
ritmo de atividade e repouso (Witting et.al.,1990,Van Someren et.al.,1996, ZorzonaMoreno et.al.,2011). Nesta revisão apresentaremos a utilização de variáveis nãoparamétricas utilizando três categorias de estudos: os que comparam pessoas de
diferentes idades e pessoas com doenças neurodegenerativas comparadas a controle
saudáveis (tabela 1); os que fazem associações entre as variáveis não-paramétricas com
outras medidas , como a qualidade de vida (tabela 2); e os que analisam o efeito de
intervenções na rotina dos indivíduos, tais como exposição a luz, atividade física etc
(tabela 3).
Intradaily variability (IV)
Uma das principais deficiências do método de ajuste de uma função cossenoidal,
denominado método COSINOR, é sua incapacidade de detectar a fragmentação do
ritmo de atividade e repouso. Esta fragmentação é decorrente de alterações importantes
60
do ritmo de atividade e repouso, como a sonolência diurna e ou despertares noturnos.
Alterações essas que são marcadores dos efeitos da idade e de doenças do sistema
nervoso central no ciclo sono e vigília (Huang et.al.,2002).
Durante a ontogenese, a consolidação do ritmo de atividade e repouso ocorre
durante os primeiros meses de vida, com uma redução na fragmentação deste ritmo
(Zorzona-Moreno et.al.,2011). Um estudo realizado com actimetria identificou menor
variabilidade intradiária aos seis meses de idade quando comparada aos 15 dias de vida
(Zorzona-Moreno et.al.,2011).
Esta consolidação do ritmo de atividade e repouso é decorrente do
amadurecimento do sistema de temporização circadiano (STC). A funcionalidade do
STC depende da integridade de seus neurônios dos núcleos supra-quiasmáticos (NSQ) e
de suas projeções para regiões hipotalâmicas. Tem sido demonstrado que em pessoas
idosas, o número de neurônios nos NSQs é reduzido (Swaab et.al.,1985, Swaab
et.al.,1994, Zhou et.al., 1995), o que provocaria uma redução no acoplamento entre os
osciladores neurais e uma deficiência no processo de sincronização. Isto reduziria a
coincidência das fases entre os osciladores neurais, reduzindo a força da indução da fase
do sono ou da vigília. Com isso, alguns neurônios ativariam núcleos responsáveis pela
vigília enquanto o organismo está preparado para o sono, gerando despertares noturnos.
Huang e colaboradores estudaram sujeitos entre 20 anos e 92 anos e mostraram que os
mais velhos apresentam valores de IV mais altos, ou seja , maior fragmentação do ritmo
e uma pior eficiência no sono (Huang et.al.,2002).
Além da degeneração neuronal que acontece durante o envelhecimento, os
distúrbios no SNC, tal como o Alzheimer, podem acelerar esse processo em que há uma
redução no número de neurônios nos NSQs e em outras regiões cerebrais (Swaab
et.al.,1985, Zhou et.al., 1995). Isso deve influenciar diretamente na expressão do ritmo
61
de atividade e repouso nesse grupo. Witting e cols encontraram um maior valor de IV
para os pacientes com Alzheimer em relação ao controle. Hatfield e cols dividiram os
pacientes com Alzheimer em dois grupos, leve e moderado. Somente o grupo com
Alzheimer moderado mostrou uma variabilidade intradiária maior do que o grupo
controle (Hatfield et.al., 2004).
Um ritmo fragmentado está relacionado à degeneração do sistema de
temporização circadiano (STC) e isso deve influenciar a qualidade de vida do sujeito.
Um exemplo disso são os achados de correlação negativa entre IV e parâmetros
indicadores de saúde. Por exemplo, maiores valores de IV foram correlacionados com
pior qualidade do sono (Bromundt et.al.,2011), menor amplitude do ciclo sono e vigília,
(Witting et.al., 1990, Van Someren et.al., 1996), e pior desempenho cognitivo e motor,
além de menor interação social (Oosterman et.al., 1995, Carvalho-Bos et.al., 2007).
A variável IV também tem sido utilizada para avaliação de estratégias
terapêuticas, como exposição à luz intensa e programa de exercício físico (Van Someren
et.al., 1997a ,Van Someren et.al., 1997b). O efeito da terapia com luz intensa durante
duas horas por dia na redução da fragmentação do ritmo de atividade e repouso, em
pacientes com demência, foi detectado pela redução nos valores de IV (Van Someren
et.al.,1997a). Já os valores de IV foram reduzidos após a prática de atividade física,
durante três meses em idosos saudáveis, demonstrando uma redução na fragmentação
do ritmo de atividade e repouso (Van Someren et.al., 1997b). Os autores sugerem que
essa redução está relacionada principalmente ao efeito do exercício na estrutura do
sono, e que a redução nos valores de IV representa uma maior consolidação do sono.
Interdaily stability (IS)
Valores elevados de IS indicam que o sujeito está bem sincronizado ao zeitgeber
de 24 horas. Isso deve indicar um bom funcionamento dos componentes do STC ligados
62
à sincronização fótica e não fótica. Essa sincronização pode ser influenciada pela idade,
distúrbios neuronais e no estilo de vida (Campbell et.al., 1988, Oosterman et.al., 2009,
Huang et.al., 2002).
Em relação à idade, a sincronização ao zeitgeber aumenta com o
amadurecimento do sistema de temporização circadiano (Zorzona-Moreno et.al.,2011).
Crianças com seis meses de idade apresentam um IS maior do que aquelas com 15 dias
de vida (Zorzona-Moreno et.al.,2011). Quanto ao envelhecimento não foi possível
encontrar essa diferença quando voluntários foram agrupados de acordo com sua idade
(Huang et.al.,2002).
Pacientes com transtorno bipolar têm seu ritmo atividade e repouso menos
estável (<IS) e mais fragmentado (>IV) que os controles (Jones et.al.,2005). Outro
transtorno mental avaliado – a doença de Parkinson – per si, não foi um fator suficiente
para dessincronizar os pacientes. Entretanto, quando os pacientes foram divididos em
dois grupos, com e sem alucinações, os autores observaram que o grupo controle
apresentou maior IS do que os pacientes com alucinações (Whitehead et.al.,2008).
Pacientes com síndrome de Asperger apresentaram menor sincronização (<IS) com o
ambiente externo (Hare et.al.,2006). Os pesquisadores acreditam que fatores sociais
podem estar relacionados a essa redução.
A exposição à luz e a chegada dessa informação até os NSQs são responsáveis
pela sincronização as pistas fóticas. Pacientes com Alzheimer se expõem menos à luz
natural do que indivíduos controle (24). Além disso, há uma degeneração na retina e no
nervo óptico desses pacientes (25,26). Van Someren e cols (1996) dividiram o grupo de
pacientes com Alzheimer segundo o inicio da doença, antes (pré-senil) ou depois (senil)
dos 65 anos e o local em que vivem, em casa ou institucionalizado (Van Someren
et.al.,1996). Esse estudo mostrou que a sincronização ao claro/escuro natural é menor
63
nos pacientes senis institucionalizados. Hatfield e cols estudaram um grupo de pacientes
vivendo em casa com cuidadores, subdividindo em doença de Alzheimer leve e
moderada (Hatfield et.al.,2004). Comparando a um grupo controle, os pacientes com a
doença moderada apresentaram um ritmo menos sincronizado, ou seja, com valores de
IS mais baixos (Hatfield et.al.,2004). Em indivíduos cegos, as pistas sociais foram
suficientes para que não se encontrasse diferença entre os grupos quanto a variável IS
(Lazreg et.al.,2011).
Um estudo realizado com enfermeiras que trabalhavam em turnos alternantes e
outras em turno fixo diurno demonstrou um baixo nível de sincronização do ritmo de
atividade e repouso ao ciclo claro e escuro nas enfermeiras que trabalham em turnos
alternantes (Rea et.al.,2008). Para aquelas que trabalhavam somente durante o dia, a
média de IS foi de 0.66 enquanto para o outro grupo a média foi muito menor, igual a
0.25.
A estabilidade do ritmo medida por IS parece apresentar uma relação direta com
medidas de qualidade de vida. Pacientes com maior índice de sincronização (IS)
apresentam maior atividade diurna medida por M10 e menor atividade noturna medida
por L5 (Witting et.al.,1990, Van Someren et.al.,1996). Mulheres idosas com demência e
com maior índice de IS apresentam um menor comprometimento no funcionamento
cognitivo (Carvalho-Boss et.al.,2007). Em um estudo com pacientes com esquizofrenia
aqueles com maior IS apresentaram um menor índice de sonolência diurna (Bromundt
et.al.,2011).
Uma melhor sincronização pode ser alcançada com mudanças na rotina diária
como o aumento na intensidade de luz durante o dia. O aumento na intensidade da luz
eleva os valores de IS de pacientes com Alzheimer (Van Someren et.al.,1996). A
64
variável IS se mostrou mais eficiente do que o COSINOR em detectar o aumento na
sincronização após o uso da luz de alta intensidade (Van Someren et.al.,1999).
Como as séries temporais de registro do ritmo de atividade e repouso utilizando
a actimetria apresentam durações diferentes nos diversos estudos publicados, avaliamos
o efeito da duração do registro no cálculo de IS. Para isso, criamos uma função seno
com período igual a 24.5 h e duração de 100 dias. O valor de IS foi calculado em
fragmentos dessa função com duração que variou entre 1 e 100 dias (Figura 1). Para
dois dias de duração o valor de IS foi igual a 0.9854, muito próximo do máximo (igual a
1). Com sete dias de duração o valor calculado foi de 0.7684, e para 14 dias foi de
0.2455. Isso nos mostra a sensibilidade dessa variável à duração do registro.
Figura 1 – Comportamento de IS calculado para duas senoides de 24.5 e 25 horas com
diferentes durações em dias. Há uma queda no valor de IS com o aumento do tamanho
da série temporal. Para a senoide com período de 25 horas essa queda é mais acentuada
do que na função seno com período igual a 24.5 h.
Least active the 5-hour period or night-time activity (L5)
Uma variável não-paramétrica para medida da fase de repouso é a soma da
atividade durante as 5 horas consecutivas menos ativas (L5). Um valor baixo para L5
indica sono com poucos despertares e ritmo menos fragmentado. Como discutido
anteriormente em relação à IV, a degeneração do sistema de temporização circadiano
decorrente do envelhecimento pode aumentar os valores de L5 (Huang et.al.,2002).
65
Uma evidência disso é que existe uma correlação inversa entre L5 e a concentração de
neurotensina no NSQ (Harper et.al.,2008). Pacientes com Alzheimer apresentam uma
atividade noturna mais intensa do que no grupo controle (Harper et.al.,2004). Pacientes
com Parkinson apresentam fragmentação de sono e aqueles que apresentam alucinações
tem o valor de L5 maior do que aqueles que não apresentam (Whitehead et.al.,2008).
A primeira descrição de L5 diz que: “L5 were computed by averaging the ... 5
lowest hourly means” e “L5 represents movement-activity during sleep plus nighttime
arousals” (Witting et.al.,1990). Por não haver uma descrição explícita, acreditamos que
esse valor foi calculado em todo o registro que nesse estudo foi de 3.75 a 7 dias. Nesse
caso, se em um dos dias registrados o individuo estiver sob efeito de algum
medicamento ou privado de sono, o valor de L5 pode ser mascarado. Por essa razão
propomos que esse valor deva ser calculado para cada dia.
Outros estudos calculam o valor de L5 no perfil médio (Van Someren
1997a,Huang et.al.,2002, van Uitert et.al.,2011), dessa forma quanto menor L5 mais
regular é o repouso. Numa situação em que o sujeito tem um repouso eficiente, porém
com episódios de sono irregulares (livre-curso por ex) o seu valor de L5 será alto.
Assim propomos que L5 seja calculado de duas formas: para cada dia (L5m) e no perfil
médio de 24 horas (L5pm). No primeiro caso, a informação será em relação à qualidade
do repouso e no segundo quanto à regularidade desse repouso. Assim teremos duas
novas variáveis distintas.
Most active 10-hour period or daytime activity (M10)
A redução na amplitude do ritmo de atividade e repouso pode se relacionar à
redução na capacidade motora ou na dificuldade do STC em concentrar a atividade
numa fase. Assim, espera-se que baixos valores de M10 estejam relacionados a uma
dificuldade motora, redução da prática de exercícios ou à degeneração do STC.
66
O valor de M10 em pacientes com Alzheimer institucionalizados é menor do que
o grupo controle e pacientes que residem em casa (Van Someren et.al.,1996). Pacientes
em estágio terminal de Alzheimer com corpúsculos de Lewy têm uma atividade diária
reduzida comparados com aqueles que não apresentam (Harper et.al.,2004). Pacientes
em estágio pouco severo da doença não apresentam uma diferença nessa variável
quando comparados ao grupo controle (Hatfield et.al.,2004). Porém, quando a doença é
mais severa, há uma redução significante na atividade diária. Assim espera-se que
valores elevados de M10 estejam relacionados com uma boa qualidade de vida.
Análises de correlação e regressão indicam que há uma associação entre a
amplitude do ritmo e a função cortical (Oosterman et.al.,2008,Carvalho-Boss
et.al.,2007; ver tabela 2). A integridade do córtex frontal influencia o valor de M10
(Oosterman
et.al.,2008).
O
desempenho
em
tarefas
cognitivas,
funcionais,
comportamentais e estados emocionais é menor em pacientes com um ritmo de baixa
amplitude (Carvalho-Boss et.al.,2007).
A discussão feita para L5 quanto ao cálculo diário e ao perfil médio de 24 horas
é válida para M10. Por essa razão também propomos que M10 seja calculado de duas
formas: para cada dia (M10m) e no perfil médio de 24 horas (M10pm). No primeiro
caso a informação será em relação à intensidade da atividade diária e no segundo à
regularidade dessa atividade.
Amplitude do ritmo
Diferentes fórmulas são utilizadas para calcular a amplitude do ritmo a partir das
variáveis M10 e L5. Segundo Witting e colaboradores utilizar a diferença entre M10 e
L5 não acrescentaria mais informações do que o próprio valor de M10 (Witting
et.al.,1990). Por essa razão, o grupo se limitou a utilizar o M10 como uma aproximação
adequada da amplitude.
67
Em outro estudo, essa variável, chamada AMP, foi calculada como a diferença
entre M10 e L5, porém ambas variáveis foram obtidas a partir do perfil médio de 24
horas (Van Someren et.al.,1997a,Huang et.al.,2002,Oosterman et.al.,2009). Nesse caso,
o valor calculado de AMP não era normalizado, assim como M10 e L5. Devido a isso,
outra variável foi criada, a amplitude relativa (RA). Esta foi calculada como a diferença
de M10 e L5 dividida por M10+L5 (Carvalho-Boss et.al.,2007,Zorzona-Moreno
et.al.,2011,Van Someren et.al., 1999,Ortiz-Tudela et.al.,2010). Nesse caso a RA foi
calculada considerando o perfil médio de 24 horas. Outra forma utilizada para
normalizar a amplitude é dividindo a diferença entre M10 e L5 pela média de cada dia
(Anderson et.al.,2009).
A amplitude relativa do ritmo, medida por RA, aumenta com a maturação do
sistema nervoso central (Zorzona-Moreno et.al.,2011). Isso pode estar relacionado ao
aumento das conexões entre os neurônios dos NSQs e a eficiência das sinapses para
outras regiões hipotalâmicas. Em indivíduos idosos, a dificuldade locomotora reduz os
índices de M10 e a menor eficiência no sono aumenta os valores de L5 (Huang
et.al.,2002). Isso leva a uma redução nos valores da amplitude medidos pela variável
AMP definida anteriormente.
Esse índice não-paramétrico merece estudos mais detalhados devido a sua
relação com a qualidade de vida do individuo. Carvalho-Bos et.al., mostrou que a AR se
correlaciona inversamente com a dificuldade funcional, distúrbios do humor e perda de
interações sociais (Carvalho-Boss et.al.,2007). Além disso, em um estudo que avaliou
associações entre doenças cardiovasculares (CVD) e ritmo atividade e repouso foi
verificado que os portadores de CVDs apresentaram valores de amplitude mais baixos
que os indivíduos saudáveis (Paudel et.al., 2011). Indivíduos com valores elevados de
68
AMP apresentam melhor desempenho em testes de função cognitiva (Oosterman
et.al.,2009).
No presente estudo apresentamos basicamente duas formas de se calcular a
amplitude do ritmo, uma normalizada e outra não. A vantagem da normalização é poder
comparar resultados de diferentes modelos de actimetro. Por essa razão o que vamos
discutir a seguir vale para AR. A discussão feita para L5 e M10 quanto ao cálculo diário
ou no perfil médio de 24 horas vale também para AR. Por essa razão também propomos
que AR seja calculado de duas formas: para cada dia (ARm) e no perfil médio de 24
horas (ARpm). No primeiro caso a informação será em relação à amplitude para cada
dia e no segundo quanto à regularidade do ritmo. Em relação à regularidade IS já se
propõe fazer esse tipo de análise, portanto teríamos uma informação redundante.
Sugerimos que testes devem ser feitos para analisar a sensibilidade das variáveis em se
medir a regularidade.
O que as essas variáveis nos dizem?
Valores elevados de IV são encontrados em idosos e em pacientes com doença
de Alzheimer, sugerindo que o IV representa um aumento na fragmentação do ritmo
(Huang et.al.,2002,Swab et.al.,1985,Zhou et.al.,1995), associado a uma degeneração do
sistema de temporização circadiana que pode significar uma redução no número de
neurônios no NSQ (Figura 2). Como consequência, esses indivíduos apresentam um
sono pouco eficiente (Bromundt et.al.,2011) levando a uma redução no desempenho
cognitivo (Oosterman et.al.,2009). Além disso, valores altos de IV estão associados a
uma redução em M10 e menores valores de IS (Figura 3).
69
Figura 2 – Diagrama esquemático da relação do sistema de temporização circadiana do
ritmo de atividade e repouso com as variáveis não-paramétricas. A sincronização com o
mundo externo é medida por IS que está relacionada com as entradas no principal
oscilador circadiano sincronizado pelo ciclo claro-escuro. A degeneração desse
oscilador tem efeito principalmente na fragmentação do ritmo, medida por IV, e na
amplitude de sua saída que controla os ritmos circadianos. Quando esse controle se
perde há uma redução na atividade motora e uma fragmentação no ciclo sono e vigilia.
Com isso há um aumento nos valores de L5, que registra a atividade durante o repouso.
Por outro lado a redução na atividade motora e no controle do NSQ sobre o sistema
motor ocasiona uma redução no valor de M10.
70
Figura 3 – Associações entre os dados não-paramétricos e dados comportamentais. Um
ritmo bem sincronizado ao claro/escuro exterior se associa com bons resultados no
humor, memória e aumento na amplitude do ritmo medido por M10. A fragmentação do
ritmo calculado por IV está associada a uma redução na cognição, memória, eficiência
do sono, sincronização ao claro/escuro externo e atividade motora.
A estabilidade do ritmo medida por IS depende da exposição ao ciclo claro e
escuro, da integridade do sistema retina/trato retinohipotalâmico, da presença de
sincronizadores sociais e da prática de atividade física (Figura 2). Pacientes com
Alzheimer apresentam valores baixos de IS, pois além de se exporem menos à luz
natural, apresentam uma degeneração na retina e no nervo óptico (Campbell
et.al.,1988,Hinton et.al.,1986,Guo et.al.,2010). O tratamento com luz artificial tem um
efeito positivo no aumento da sincronização medida por IS (Van Someren et.al.,1997a).
A redução de IS pode estar ligada à dificuldade na sincronização à pistas sociais como
acontece com pacientes com Parkinson e síndrome de Asperger (Whitehead
71
et.al.,2008,Hare et.al.,2006). Existe uma associação entre a amplitude da atividade
diária com IS (Witting et.al.,1990,Van Someren et.al.,1996).
A variável L5 é uma medida da atividade noturna e também corresponde a
capacidade de se manter um repouso consolidado. Um aumento no valor de L5 significa
a presença de movimentos no período de repouso, indicando um sono fragmentado por
despertares. No idoso e nas doenças neurodegenerativas, em que encontramos altos
valores de L5, a dificuldade em manter um episódio de sono consolidado está
relacionada a uma degeneração dos núcleos reguladores do ciclo sono e vigília, podendo
também ter influência de alterações funcionais no STC (Figura 2).
A intensidade da atividade durante a vigília é decorrente de vários fatores, entre
eles a ativação cortical promovida pelo mesencéfalo (Sistema Ativador Reticular
Ascendente) e também deve estar relacionada à capacidade do STC em concentrar a
atividade motora numa fase, além da integridade do sistema motor (Figura 2).
Indivíduos com Alzheimer, que apresentam uma redução no processo de ativação
cortical e na funcionalidade do STC apresentaram menores valores para M10 (Witting
et.al.,1990,Van Someren et.al.,1996,Hatfield et.al.,2004, Harper et.al.,2004). Já, idosos
com acidente vascular encefálico que tiveram o cortéx motor comprometido
apresentaram também baixos valores de M10 quando comparados ao grupo controle
(dados não publicados).
É sugerido que amplitudes mais baixas do ritmo atividade e repouso podem
alertar para a presença de alguns transtornos mentais, tais como transtorno de déficit de
atenção/hiperatividade (TDAH) e Síndrome de Asperger (Hare et.al.,2006,Van Veen
et.al.,2010). Em doenças degenerativas, tais como Alzheimer e Parkinson os valores de
AMP ou RA devem piorar com o agravamento da doença, achado que evidencia a perda
da consolidação desse ritmo (Hatfield et.al.,2004,Whitehead et.al.,2008). Além disso,
72
Groups
N
Age (mean)./
Days in
register
Ref
Location
Comparision
parece haver uma influência ambiental sobre a amplitude do ritmo de atividade e
repouso, visto que pacientes com a mesma doença, internados em instituições
diferentes, apresentaram valores diferentes de RA (Van Someren et.al.,1996,Song
et.al.,2009).
Em geral, os estudos mostram que quanto menos estável e mais fragmentado o
ritmo atividade e repouso dos indivíduos, pior se encontra sua saúde. Com o intuito de
recuperar a qualidade de vida dos pacientes, alguns estudos buscaram evidenciar efeitos
de terapia com uso de luz intensa ou eletroestimulação transcutânea (TENS), e a
atividade física, entretanto, até o momento poucos efeitos foram mostrados com essas
estratégias
(Van
Someren
et.al.,1997a,Van
Someren
et.al.,1997b,
Scherder
et.al.,1999,Sloane et.al.,2007). Portanto, faz-se necessário desenvolver mais estudos
sobre outros tratamentos que possam auxiliar esses pacientes a ajustarem seu ritmo
atividade e repouso, ainda que parcialmente.
O uso de variáveis baseadas nos parâmetros do COSINOR não responde a
algumas questões referentes ao ritmo de atividade e repouso, como por exemplo, a
fragmentação. Com as variáveis não paramétricas é possível inferir as principais
características dos ritmos circadianos: sincronização a um zeitgeber (IS), amplitude
(M10,L5 e RA) e robustez ou fragmentação (IV).
73
Control (C)
8
72.8 / 3
Massachusetts
Institute of
Technology’s
Clinical
Research
IS
NS
IV
NS
AD < C*
M10
LBD < AD*
Center
Alzheimer
Disease( AD)
23
71.5/ 3
E. N. Rogers
Memorial
Veterans
L5
AD > C*
RA
NS
IS
NS
Harper et.al.,2004
Harvard
Cooperative
Project on
Aging and the
Lewy body
dementia
(LBD)
Young
controls (YC)
9
68.7 / 3
E. N. Rogers
Memorial
Veterans
Hospital in
Bedford, MA
4m
29-55 /
2w
3.75 - 7
Netherlands
Institute for
Brain Research
AD > OC *
IV
2m
71-85 /
11w
3.75 - 7
NU > OC *
AD < OC **
M10
SU < OC *
10 w
71-86 /
AD Nonusers
(NU)
5
3.75 – 7
L5
NS
the Valerius
Klinick in
Amsterdam
RA
NC
IS
SI< all other
groups *
7
72/
Controls (C)
11 m
3.75 – 7
74
1996
AD Sedative
users (SU)
Residing at
[2]
AD patients
(AD)
2m
Witting et.al.,1990
Old controls
(OC)
Friends and
relatives of the
young group
Van
Somere
n
et.al.,19
96
lzheimer disease (AD)
Hospital in
Bedford, MA
Senile in
instituition
(SI)
8w
3.75 – 7
4m
78/
IV
NS
M10
SI< all other
groups *
4w
3.75 – 7
3m
86/
L5
NS
13 w
3.75 – 7
RA
NC
IS
MoAD < C *
IV
MoAD > C*
M10
MoAD < C*
L5
NS
RA
MoAD < C
IS
NS
IV
NS
M10
NS
L5
NS
RA
NC
IS
NS
10 m
71.8 /
9w
28
Control (C)
MRC Cognition
and Brain
Sciences
Unit
67.3/
Mild AD
(MiAD)
13
Moderate AD
(MoAD)
14
28
69.5/
28
10 m
66.8/
1w
28
12 m
63.9 /
1w
28
FTD
FTD with
anormal MRI
(FTDA)
64.4/
6
28
63.3/
7
28
Age
9m
Young (Y)
9w
24/
Ageassociate
d
Frontotemporal dementia (FTD)
Controls (C)
FTD with
normal MRI
(FTDN)
Addenbrooke's
Hospital
Memory Clinic
Hatfield et.al.,2004
(SH)
60/
5
Elderly
volunteers
Addenbrookes
Hospital
memory
clinic who
fulfilled the
National
Institute of
Neurological
and
Communicative
Students of
Anhui Medical
University
75
Anderson et.al.,2009
Senile in
home
2m
Huang
et.al.,200
2
Presenile in
home (PH)
OST > Y ***
Middle-Age
(MA)
7m
42 /
8w
5
Volunteers were
residents in the
city of Hefei
IV
OST > MA
***
O > Y ***
O > MA ***
M10
10 m
68/
10 w
5
Old (O)
Hefei Retired
House, P.R.
China
NC
OST > Y **
OST > MA **
L5
O > Y **
O > MA **
6m
83 /
6w
5
Oldest (OST)
Hefei Retired
House, P.R.
China
RA
NC
6m>3m*
5m
15 days (15d)
0.0411/3
IS
6m>1m*
5w
6m<3m*
5m
1 month (1m)
0.0821/3
5w
5m
3 months (3m)
0.2465/3
5w
Babies from
maternity unit
of the
IV
Virgen de la
Arrixaca
Universitary
Hospital
M10
6m<1m*
6m<15d*
NS
6m>1m*
5m
6 months (6m)
Zorzona-Moreno et.al.,2011
6m>15d*
6m>15d*
0.4931/3
RA
5w
3m>1m*
Bipolar
Disorder
46.89/
5m
IS
C > BD *
IV
BD > C *
Pennine
7
Control (C)
14 w
Care NHS Trust
76
Jones
et.al.,2005
3m>15d*
Bipolar
Disorder (BD)
Control (C)
5m
44.37/
14 w
7
29
70.90/
M10
NC
L5
NC
RA
NS
IS
PDnH > PDH
IV
PD > C
50
23
PD patients
with
hallucinations
(PDH)
27
Adults with
Asperger
Syndrome
(AS)
71.82/
7
Movement
Disorder clinics
in Northwest
England
75.11/
M10
L5
PDnH < PDH
RA
PDnH > PDH
IS
C > AS**
IV
NS
M10
NC
L5
NC
RA
C > AS ***
7
18
10
30.8/ 7
46.89/7
Hare et.al.,2006
Neurotypical
adults (C)
73.36/
7
PD patients
without
hallucinations
(PDnH)
C > D*
12 m
Patients of the
Haukeland
University
Hospital,
Sandviken
20 m
Depression (D)
IS
42.8 / 14
C < S*
C < S+C**
C > D*
IV
C > S*
3w
C > S+C**
77
2010
38.2/14
20 w
[33]
Control (C)
Berle et.al.,2010
Schizophrenia x Depression
Asperger Syndrome
Parkinson
Parkinson’s
Disease (PD)
Whitehead et.al.,2008
7
13 m
NC
46.7 /14
10 w
Schizophrenia
treated with
clozapine
(S+C)
NC
43.3
L5
Schizophrenia
NS
Institution A
48.9
4w
(For profit)
85.6/ 4-7
RA
institutionalized
IS
A<B
older adults with
IV
NS
dementia
Dementia
Institution B
6w
(Not for profit)
ADHD-noSOI 26
boys
8.2 / 7
7
girls
ADHD + SOI (children)
ADHD-SOI
8.8 / 7
21
girls
Control (C)
ADHD + SOI
66
boys
12 m
12 w
29.1 / 7
children by
seven
Community
Mental Health
Institutions,
three pediatric
departments of
non-academic
hospitals and
children who
were recruited
through
advertisements
in magazines in
Program Adult
M10 NS
L5
A>B
RA
A<B
IS
NS
IV
NS
M10 NC
L5
NS
RA
NC
IS
C < AnS**
ADHD patients,
Netherlands
AS < AnS***
IV
78
C < ADHD*
Song et.al.,2009
treated with
other
antipsychotics
(S+OA)
Van der Heijden et.al.,2005
(S)
M10
Van Veen
et.al.,2010
Schizophrenia
ADHD-noSOI 4 m
(AnS)
5w
30.0 / 7
ADHD-SOI
(AS)
28.2 / 7
17 m
M10 NC
L5
NC
AMP C > ADHD***
14 w
C > AS***
AS < AnS**
Tabela 1 – Estudos que utilizam as variáveis não paramétricas da actimetria para
comparar diferentes grupos. m=man, w=woman, (*) p < =0,05, (**) p <= 0,01 e (***)
p<= 0,001.
79
Ref
Age
IS
IV
Age: 29-86
Young and old controls
and old patients with
Alzheimer
Group of 34 patients with
Alzheimer's disease,
including presenile and
senile patients living at
home or in a nursing
home, as well as in 11
healthy controls.
- IV ***
Pearson´s
correlations
+ M10 ***
- M10 ***
- L5 **
+ M10 ***
Backward
stepwise
regression
Pearson
productmoment
correlation
procedure
+ Senile
onset *
- M10 ***
+ MMSE **
+ light
exposure *
- Sleep
efficiency ***
L5
RA
Huang et.al.,2002
N: 31
M10
Witting et.al.,1990
Methods
Van Someren et.al.,
1996
Groups characteristics
- Amplitude
***
+ Nighttime
activity ***
80
+ PSQI*
Age: 28-56
N: 14
Pearson´s
correlations
- Fragmentation
index*
+Mean nap time
**
- PSQI*
- PSQI**
-Mean nap time
**
Bromundt et.al.,2011
+ Sleep
efficiency*
IQ of 98.9 ± 13.4
MMSE of 27.9 ± 1.6.
Pearson´s
correlations
7 days of actigraphy
recording
-Mental speed
***
+Mental speed
**
-Memory ***
+Memory *
-Executive
function ***
+Executive
function ***
Male patients (n = 19)
residing at the
E. N. Rogers Memorial
(ENRM) Veterans
Administration (VA)
- Vasopressin***
Pearson´s
correlations
81
Neurotensin
*
+ Neurotensin
***
Harper et.al., 2008
N: 144
Oosterman et.al.,2009
Age: 69.5 ± 8.5
Eighty-seven women aged
85.5 ± 5.9 years (mean±
standard deviation) were
studied while living in
assisted care facilities at 12
different homes for the
elderly in The Netherlands
Pearson´s
correlations and
Multiple
regression
analysis
- Frontal
DWMH*
(frontal DWMH
was the sole
predictor of IS)*
(Age entered as a
significant
predictor of IV)*
- Frontal
DWMH**
(frontal
DWMH
predicted
M10)**
(frontal DWMH
was the only
significant
predictor of
AMP)*
+ MMSE*
Pearson´s
correlations
+ UPDRS-IV*
+ Age*
- UPDRS-III*
- UPDRS 21*
+ MMSE *
+ FAST*
- FAST***
Pearson´s
correlations
+NI-ADL**
- FAST***
- FAST***
- NIADL***
- NIADL***
- NI-ADL***
- FAST*
- CSDD*
+ CSDD*
- CSDD***
- CSDD***
- CSDD***
- MOSES**
+ MOSES*
- MOSES***
MOSES*** MOSES***
Tabela 2 – Métodos que correlacionam variáveis não paramétricas com outras variáveis obtidas nos respectivos estudos. (*) p < =0,05, (**) p
<= 0,01 e (***) p<= 0,001
82
Whitehead
et.al.,2008
Control participants were
31 healthy older adults and
77 patients diagnosed with
idiopathic PD
-Occiptal PVH*
Carvalho-Boos et.al.,2007
Participants were recruited
in cooperation with the
Sint Lucas Andreas
Hospital in Amsterdam.
N=135. A minimum of 5
days of actigraphy
recording
Oosterman et.al., 2008
-Occiptal PVH*
Groups
Patients description
Age
(mean) / N
/
Treatment duration
(days)/ description
Ref
Comparison
Bright Light treatment
Treatment (T)
Patients with dementia clinically
diagnosed
as
probable
Alzheimer's disease, multi-infarct
dementia,
dementia associated
with alcoholism, or normal
pressure hydrocephalus.
4 / light intensity was
1136+89 lux
IS
T > B1 **
IV
T < B1 **
M10
NC
L5
NC
RA
NC
IS
NS
IV
NS
79/22/5
2 hours/day
Baseline 2
(B2)
Light morning
LM (7–11
a.m.)
Light evening
LE (4–8 p.m.)
Older adults with dementia.
Participants were recruited from
two sites: two units (22 beds) in a
North Carolina (NC) psychiatric
facility and
Not
calculated/
66 / 7
83
21 / Three intervention
lighting patterns were
studied: morning (7–11
a.m.), evening (4–8 p.m.)
and all-day (7 a.m. to 8
p.m.). Light intensity was
Sloane et.al.,2007
Baseline 1
(B1)
Van Someren et.al.,1997
Days in
register
Treatment (T)
Pre
Patients who met the NINCDS–
ADRDA criteria for probable AD,
and the stage 6 criteria of the
Global Deterioration Scale
81.7 /8/
/4
Healthy elderly males were
admitted to a fitness training
program
Post
73 / 10 /
14
Follow-up
84
Experimental group were
treated
with
an
electrostimulator
generating
electrical
impulses in bursts of
trains [9–11] on two
electrodes placed on
patient’s back between
Th1 and Th5
Supervised
indoor
aerobic activities such
as running, jogging, and
ball games for 3 months
(from the end of March
to
the beginning of
June), three times 1.5 h
a week, at around noon.
M10
NS
L5
NS
RA
NS
IS
T > PB **
IV
NS
M10
NC
L5
NC
RA
NS
IS
NS
IV
Pre>Pos
RA
NS
Scherder et.al.,1999
TENS
Pooled
Baseline (PB)
2495+179 lux in NC and
2641+ 259 in OR
Van Someren et.al.,1997b
Light all-day
LAD (7 a.m.
to 8 p.m.)
a self-contained, 24-bed unit in a
dementia-specific residential care
facility in Oregon (OR).
Week 1 (w1)
Week 2 (w2)
Seventeen patients (13 f, 4 m) with
the fall-winter type of SAD and 17
sex- and age-matched healthy
subjects
IS
IV
Seasonal Affective
Week 3 (w3)
WINKLER et.al.,2005
Control (C)
Week 4 (w4)
Seasonal
Affective
36.9/34/28
28 / 10,000lux for 1.5h
between 7:00am-9:00am
M10
L5
Disorder
(SAD)
Week 1 (w1)
Week 2 (w2)
RA
SAD (w1)
< C (w1)
Disorder
Week 3 (w3)
Week 4 (w4)
Tabela 3 – Estudos que utilizam intervenções para alterar a ritmicidade circadiana. p < =0,05, (**) p <= 0,01 e (***) p<= 0,001
85
86
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90
Artigo 5 - Nonparametric Methods in Actigraphy: An Update.
Bruno da Silva Brandão Gonçalves
1,3,4
, Paula R. A. Cavalcanti 2, Gracilene R.
Tavares 2, Tania F. Campos 2 & John F. Araujo 1,2,3
1. Programa de Pós-Graduação em Psicobiologia, UFRN. Natal,RN,Brazil
2. Programa de Pós-Graduação em Fisioterapia, UFRN. Natal,RN,Brazil
3. Laboratório de Neurobiologia e Ritmicidade Biológica, UFRN. Natal,RN,Brazil
Instituto Federal Sudeste de Minas Gerais – Campus Barbacena.
4.
Barbacena,MG,Brazil
Correspondence adress: P.o.Box 1506, Natal, RN, Brazil, 59078970 –
[email protected]
Periódico ao qual será submetido: Plos One.
Resumo
A ritmicidade circadiana em humanos pode ser estudada por meio da actimetria
e este tipo de registro está em constante atualização. A metodologia de análise dos
dados actigráficos deve acompanhar o desenvolvimento tecnológico e novas variáveis
podem ser desenvolvidas. Nosso objetivo foi estudar o comportamento de duas
variáveis utilizadas para descrever dados de actimetria e propor uma atualização na
forma de calcular a fragmentação do ritmo de atividade e repouso. Para isso utilizamos
dados simulados e registros de actimetria em humanos, ratos e saguis utilizando três
sistemas de registro diferentes. Nossos resultados mostraram que o cálculo da
sincronização depende do tamanho da amostra e que a forma proposta de calcular a
fragmentação do ritmo se mostrou mais sensível do que aquela tradicional. Assim
91
propomos uma atualização no modo de calcular a fragmentação do ritmo com mais duas
variáveis que podem ser utilizadas.
Palavras chaves: actimetria, fragmentação, sincronização, amplitude, atividade e
repouso.
Introdução
O ritmo de atividade e repouso em humanos é comumente estudado por meio da
actimetria. O ajuste de uma função cosseno aos dados actigráficos fornece parâmetros
que são utilizados no estudo da ritmicidade circadiana. Esses parâmetros descrevem a
amplitude, mesor, acrofase e período do ritmo. Entretanto, o ritmo de atividade e
repouso não apresenta exatamente um comportamento de uma função cossenoidal,
dessa forma outras variáveis têm sido estudadas e novas metodologias têm sido
desenvolvidas. Como essas variáveis não são associadas a parâmetros de uma função
conhecida, elas são chamadas não-paramétricas.
Em 1990 tais variáveis não-paramétricas foram propostas pela primeira vez por
Witting e colaboradores que estudavam o efeito da idade e da doença de Alzheimer no
ritmo de atividade e repouso (Witting et.al.,1990). Estas variáveis mensuram as
principais características do ritmo circadiano de atividade e repouso: a fragmentação do
ritmo (IV), a sincronização ao ciclo claro-escuro de 24 horas (IS), o valor das 5 horas de
menor atividade, ou atividade noturna (L5) e as 10 horas de maior atividade, ou
atividade diurna (M10).
Desde a criação dessas variáveis não-paramétricas, a fragmentação e
sincronização do ritmo são medidos pelo IV e IS, respectivamente. O IV quantifica a
92
freqüência de transições entre atividade e repouso a cada hora (Witting et.al.,1990, Van
Someren et.al.,1996, Van Someren et.al.,1999). Altos valores de IV indicam
ocorrências de episódios de sonos diurnos e/ou despertares noturnos. Já o IS quantifica
a sincronização do ritmo ao zeitgeiber de 24 horas.
Em diversos distúrbios do sono ocorre uma incapacidade de manter um episódio
de sono ou vigília estável, que é observado por sua fragmentação. Por isso, trabalhos
têm mostrado que a medida do IV é uma excelente variável que serve como marcador
destas alterações no ciclo sono-vigília. Por meio desta medida observou-se que sujeitos
mais idosos apresentam valores elevados de IV, ou seja, um ritmo de atividade e
repouso mais fragmentado (Huang et.al.,2002). Também foi encontrado que em
pacientes com Alzheimer o valor de IV é maior do que o grupo controle (Witting
et.al.,1990,Hatfield et.al.,2004).O envelhecimento e a doença de Alzheimer são fatores
que
contribuem
para
a
degeneração
do
núcleo
supraquiasmático
(Swaab
et.al.,1985,Zhou et.al.,1995) o que deve explicar a fragmentação do ritmo. Além disso,
foi demonstrado que valores elevados de IV, que significam um ritmo fragmentado,
estão associados a uma pior qualidade do sono (Bromundt et.al.,2011), a déficits
cognitivos (Oosterman et.al.,2009) e a uma amplitude reduzida do ritmo (Witting
et.al.,1990,Van Someren et.al.,1996).
Altos valores de IS indicam que o sujeito está bem sincronizado ao zeitgeber de
24 horas. Isso deve indicar um bom funcionamento dos componentes do sistema de
temporização circadiano (STC) ligados às sincronizações fóticas e não fóticas. Essa
sincronização pode ser influenciada pela idade, distúrbios neuronais e estilo de vida. Em
relação à idade, a sincronização ao zeitgeber aumenta com o amadurecimento do STC
(Zorzona-Moreno et.al.,2011). A estabilidade do ritmo medida por IS apresenta uma
relação direta com medidas de qualidade de vida. Estudos mostram que IS se relaciona
93
diretamente com a amplitude do ritmo e exposição à luz (Witting et.al.,1990,Van
Someren et.al.,1996), pontuação no Mini Mental State Examination (Carvalho-Boss
et.al.,2007) e a qualidade do sono (Bromundt et.al.,2011). Um ritmo bem sincronizado
está associado à menor fragmentação, menor atividade noturna e menores índices que
medem
disfunções
cognitiva,
comportamental
e
emocional
(Witting
et.al.,1990,Carvalho-Boss et.al.,2007). Uma melhor sincronização pode ser alcançada
com mudanças na rotina diária.
Nos trabalhos supracitados o método de cálculo da fragmentação e estabilidade
do ritmo utiliza intervalos de uma hora. Entretanto, novos modelos de actímetros vem
sendo desenvolvidos e, com o aumento na capacidade de armazenagem destes
instrumentos, a limitação da taxa de amostragem foi superada, de forma que os atuais
actímetros registram dados a cada minuto ou segundo, podendo calcular a fragmentação
do ritmo em intervalos diferentes de uma hora. Por esta razão, propomos uma nova
forma de quantificar a fragmentação e sincronização do ritmo de atividade e repouso a
partir do comportamento das variáveis IV e IS em intervalos de amostragem de 1 a 60
minutos, estudando séries temporais simuladas com comportamento conhecido e
registros de atividade e repouso de humanos e animais experimentais utilizando três
diferentes equipamentos.
Metodologia
No presente trabalho utilizamos séries temporais criadas artificialmente, com
comportamento conhecido, e dados obtidos experimentalmente. Os dados simulados
foram utilizados para verificar o comportamento e a robustez da nova metodologia. Os
registros de atividade e repouso experimentais foram obtidos utilizando três diferentes
equipamentos e em modelos humanos e animais.
94
Séries simuladas
Utilizamos dois tipos de séries temporais: valores aleatórios com distribuição
normal, média igual a 1 e diferentes variâncias; uma senoide com amplitude igual a 1 e
cujos valores negativos foram substituído por zeros. A duração dessas séries foi de 60
ciclos de 1440 minutos, simulando assim 60 dias com uma taxa de amostragem de 1
minuto.
A partir desses dois tipos de séries temporais foram criados três conjuntos
utilizados em nossas análises. O primeiro foi composto de uma senóide com período
igual a 1440 minutos multiplicada por um ruído com diferentes variâncias. O segundo
foi semelhante ao primeiro porém a média do ruído variou a cada 30 minutos com uma
variação 0.05. O terceiro conjunto foi formado por senoides com período de 480, 1440,
1470 e 1500 minutos.
Dados experimentais
Nossos dados foram obtidos por três sistemas diferentes: (i) um actímetro
Actiwatch®-16, da Mini Mitter que registrou a variação na aceleração nos três eixos
numa frequencia de 32 Hz e armazenou o valor acumulado a cada minuto, (ii) um
actímetro Tempatilumi, da CE eletrônica que registrou a variação na aceleração que
ocorria a cada minuto, (iii) sensores de movimento infravermelho que registrava a
atividade locomotora e armazenava o total de movimentos a cada 5 minutos. Os três
sistemas foram utilizados para verificar o comportamento das variáveis IV e IS com o
método proposto para análise nos dados obtidos por equipamentos diferentes. Além
disso, utilizamos dois modelos animais distintos, o rato e o sagui sendo o primeiro um
animal noturno e polifásico e o segundo um animal diurno e bifásico.
95
O Actiwatch foi utilizado para registrar a atividade locomotora em dois grupos:
(i) 24 idosos saudáveis e (ii) 52 idosos com Acidente Vascular Encefálico (55-75 anos).
Com o Tempatilumi registramos a atividade motora de 26 idosos diagnosticados com
Doença de Parkinson (42-76 anos) e 24 jovens saudáveis (18-23 anos). A atividade
motora de seis ratos e oito saguis foi registrada utilizando o sistema de sensores
enquanto eles permaneciam em gaiolas. A pesquisa foi aprovada pelo Comitê de ética
em pesquisa do Hospital Universitário Onofre Lopes (CEP-HUOL) da Universidade
Federal do Rio Grande do Norte e conduzido de acordo com os critérios estabelecidos
pela resolução 196/96 do Conselho Nacional de Saúde (CNS).
Análise dos dados
Dos dados experimentais de actimetria foram calculadas quatro variáveis nãoparamétricas: IS, IV, M10 e L5 (Witting et.al.,1990). Em nosso trabalho modificamos a
forma de calcular o IV e o IS. A fragmentação (IV) foi calculada como a razão da média
quadrática da primeira derivada do dado e sua variância populacional (Equação 1). O IV
foi calculado para intervalos reamostrados entre 1 e 60 minutos. O IV calculado
tradicionalmente a cada hora foi chamado de IV60. A partir do perfil de IV calculamos
dois parâmetros de interesse: (i) média dos IV para cada intervalo de amostragem
(IVm); (ii) IV para intervalo igual a 60 minutos (IV60). A normalização existente no
calculo de IV pode tornar esse índice insensível a grandes variações na amplitude dos
dados. Para comprovar isso utilizamos as duas séries temporais formadas por ruídos
simples, com variância igual a 0.05 e 0.5.
Calculamos o IS de duas maneiras, a tradicional com os dados amostrados em 60
minutos (IS60) e a média de IS para os intervalos de amostragens divisores de 1440
96
compreendidos
entre
1
e
60
minutos
(ISm).
Os
intervalos
foram:
1,2,3,4,5,6,8,9,10,12,15,16,18,20, 24,30,32,36,40, 45,48 e 60 min.
Nós utilizamos dados simulados de diversos tamanhos para verificar o
comportamento da variável IS. A análise foi realizada em duas funções seno, uma com
período igual a 1470 e outra com 1500 minutos. E nesses dados calculamos o IS
simulando diferentes tamanhos de registros.
Resultados
Dados simulados
A primeira análise foi realizada utilizando dois grupos de dados randômicos com
distribuição normal. Ambos os grupos tinham média igual 1 porém o primeiro com
variância igual a 0.05 e o outro igual a 0.5. O cálculo do IV (figura 1.A) mostrou uma
independência da amplitude do ruído e da taxa de amostragem, pois em nenhuma
amostragem houve diferença estatisticamente significante entre os grupos (n=100).
Para cada grupo de série temporal simulada foi calculado o IV, ou seja para a
função senóide pura retificada, senóide com o ruído simples e a senóide com o ruído
composto (Figura 1.B). Para todos os intervalos de IV calculados, a série temporal com
ruído composto mostrou os maiores valores, enquanto que a série com a senóide pura
mostrou os menores valores de IV. Uma elevação em 30 minutos foi observada no perfil
de IV do ruído composto.
Para avaliarmos o efeito do ruído nos valores de IV, alteramos o valor da
variância de 0 a 2 do ruído modulado pela senóide e calculamos IVm e IVerro. Ao
97
aumentarmos o valor da variância do ruído, também aumentamos o valor do IVmédio e
do IVerro (Figura 1C).
Inserir Figura 1
As variáveis não paramétricas também foram calculadas para as funções seno de
diferentes período, igual a 8, 24 e 24.5 h (tabela 1). O perfil de IV para sin 24 e sin 24,5
apresentaram uma similaridade e diferiram do perfil para o sin8 (figura 2.A). Para
avaliação da estabilidade do ritmo de atividade e repouso, o calculo da variável IS60 e
ISm foi feito para séries de mesma amplitude, mas com diferentes períodos e diferentes
durações. Os valores de IS60 e ISm foi igual a 1 para sin8 e sin24 enquanto as outras
variáveis tiveram valores diferentes, e isto é explicado porque 8 h é multiplo de 24h. As
funções sin24 e sin24.5 tiveram valores de IS diferentes, embora as outras variáveis
tiveram valores próximos. Além disso, o valor de IS60 para sin24.5, sin de 25 reduziu
com o aumento do trecho analisado, sugerindo que o valor de IS60 depende do tamanho
da série temporal analisada (figura 2.B)
Inserir Figura 2
Inserir Tabela 1
Dados experimentais
Os resultados com o Actiwatch mostram que os pacientes com Acidente
Vascular Encefálico (AVE) apresentam uma atividade reduzida quando comparada ao
grupo controle (tabela 2). Analisando o IVm encontramos que o ritmo dos pacientes é
mais fragmentado. Quando utilizamos o IV60 não encontramos diferença significativa
entre os grupos (teste T de Student). O perfil de IV foi calculado para o grupo controle e
pacientes com AVE (Figura 3 A). Em todos os intervalos, a média de IV foi maior para
98
o grupo paciente. Foram encontradas diferenças estatisticamente significantes para
diferentes intervalos (teste T de Student) (Figura 3 B).
Inserir Figura 3
Inserir Tabela 2
Quando analisamos os dados do Tempatilumi verificamos que os idosos com
Parkinson apresentam uma atividade reduzida quando comparados aos jovens (tabela 3).
O ritmo dos idosos foi mais fragmentado quando analisamos as variáveis IVm, IVerror
e IV60. Quanto à sincronização encontramos uma tendência (p=0.0583) entre os grupos,
sendo os jovens mais sincronizados ao zeitgeiber de 24 h. O perfil de IV foi calculado
para os grupos (Figura 4A). Em todos os intervalos, a média de IV foi maior para o
grupo paciente. Foram encontradas diferenças estatisticamente significantes para
diferentes intervalos (Figura 4 B).
Inserir Tabela 3
Inserir Figura 4
Ao analisar os dados dos animais com o sistema de sensores infravermelho
encontramos que o ritmo dos ratos se mostra mais fragmentado somente nos intervalos
15, 20, 25 , 30 e 35 (figura 5A). Os ratos apresentaram valores maiores para M10 e L5
quando comparados aos saguis.
Inserir Tabela 4
Inserir Figura 5
Discussão
99
O principal achado desse trabalho foi tornar as variáveis não-paramétricas mais
eficientes na detecção da fragmentação e sincronização do ciclo sono-vigília. A análise
nos dados simulados mostrou a capacidade dessa metodologia em detectar fragmentação
em intervalos conhecidos. Além disso, o cálculo da estabilidade interdiária utilizando
outras reamostragens torna essa metodologia mais sensível. Quanto ao tamanho da série
temporal, nós mostramos que é preciso ter cuidado ao se utilizar o índice de estabilidade
interdiária.
A proposta clássica para o cálculo do IV com amostragem de 60 minutos não
permitiu detectar a fragmentação do ritmo nos pacientes com AVC. Por meio da nossa
nova proposta de cálculo mostramos que o ritmo desses pacientes são mais
fragmentados do que o grupo controle, quando utilizamos outras taxas de amostragem.
Como em outros trabalhos (Van Someren et.al.,1996), o uso da variável IV60 não foi
eficiente para detectar diferenças na fragmentação do sono nos dois grupos. Ao
utilizarmos somente o IV calculado para 60 minutos perdemos a sensibilidade para
determinarmos a fragmentação do ritmo. O método aqui apresentado se mostra mais
sensível quando a análise é feita em todo o perfil. Além disso, com o cálculo de IVm e
IVerro observamos diferenças estatísticas significativas entre os grupos, com p-value de
IV60 aproximadamente 14 vezes maior do que o calculado para IVm e IVerro. Essa
maior sensibilidade deve encorajar a utilização desses novos parâmetros. Além disso,
não existem relatos mostrando que o IV calculado em dados amostrados a cada hora
seja a melhor forma de se identificar fragmentação no ritmo.
O perfil de IV nos dados obtidos pelo Tempatilumi mostrou uma maior
fragmentação nos intervalos de amostragem de 1-8 minutos. Esse padrão é semelhante
ao que acontece com o perfil do ruído+sin24. Provavelmente isso acontece devido a
metodologia de registro desse equipamento. O Tempatilumi mede a aceleração nos três
100
eixos num instante e um minuto depois repete o procedimento e registra a variação da
aceleração. Assim os movimentos que acontecem entre uma medição e outra são
ignorados. Isso deve criar um tipo de ruído que é modulado pelo ritmo circadiano, como
o dado simulado.
No caso dos registros com os animais a fragmentação calculada hora a hora não
mostrou uma diferença significante entre o ritmo de ratos e saguis. Nem as novas
variáveis IVm não identificaram uma diferença significante na fragmentação, somente
uma tendência (ambos com p-value igual a 0.0628). Porém para os intervalos de
amostragem de 15 a 35 a fragmentação no ritmo dos ratos foi maior do que nos saguis.
Isto talvez seja explicado pela alternância entre as fases de sono do rato, que ocorrem
com períodos de 15 a 35 minutos (Araujo et.al.,1996a, ,Araujo et.al.,1996b).
A análise feita com dados simulados nos mostrou a robustez do método
proposto. Os ruídos, mesmo com amplitudes diferentes, não apresentaram diferenças
estatisticamente significativas. A análise do ruído composto nos mostrou ser possível
identificar um pico diferenciado no intervalo conhecido de 30 minutos. A senóide pura
apresentou os menores valores de IV. Ao aumentarmos a amplitude do ruído modulado
pela senóide houve um acréscimo em IV.
Assim como Van Someren et. al. encontramos valores de IV próximos a dois
para os dados randômicos (Van Someren et.al.,1996). A robustez do método foi
mostrada com as análises feitas nos dados simulados. Os dados randômicos com
amplitudes diferentes apresentaram alto IV em todos os intervalos e sem diferença
estatística. Isso pode ser explicado pela equação de IV onde o denominador é composto
pela variância da população do dado.
101
A senóide pura mostrou o menor IV, pois a variação entre as medidas foi
pequena. Ortiz-Tudela et. al. também encontraram IV60 próximo a zero para a onda
senoidal (Ortiz-Tudela et.al.,2010).
Os valores de IV crescem à medida que
aumentamos o ruído multiplicado à senóide. Ortiz-Tudela et. al. calcularam IV igual a
zero para a onda senoidal que aumenta com a inserção de um ruído (Ortiz-Tudela
et.al.,2010).
Nosso estudo sobre a variável que calcula a sincronização ao ciclo CE de 24 h
mostrou que o valor de IS depende do tamanho da amostra. Em dados simulados
encontramos que essa dependência é maior a medida que o período em livre curso é
mais próximo de 1440 minutos. Esse achado vale para os dados simulados e
experimentais. O IS é calculado dividindo o dado em partes com duração de 1440
minutos (período do ciclo CE externo) e por essa razão utilizamos os valores divisores
de 1440 para o cálculo do IS médio. Nossos dados mostraram que em todos os estudos o
valor do ISm é mais sensível podendo até mostrar uma diferença significante que o IS60
não mostrava.
Propomos aqui utilizar uma ferramenta mais sensível e que pode trazer mais
informações sobre o ritmo da atividade e repouso em humanos. Nos dados
experimentais do grupo com AVE não encontramos diferenças significantes quando
utilizamos o IV60, assim como muitos trabalhos não conseguiram responder suas
perguntas utilizando esse mesmo parâmetro. Com essa nova ferramenta é possível
identificar de forma mais sensível a fragmentação e sincronização do ritmo circadiano.
No presente trabalho utilizamos séries temporais criadas artificialmente, com
comportamento conhecido, e dados obtidos experimentalmente. Os dados simulados nos
permitiram verificar o comportamento e a robustez da nova metodologia. Os registros
102
de atividade e repouso experimentais foram obtidos utilizando três diferentes
equipamentos e em diferentes modelos humanos e animais. Isso nos permitiu verificar a
universalidade e limitações dessa metodologia nos diferentes equipamentos utilizados.
Nossos resultados nos levaram a propor novas variáveis, tais como: média dos
IV para cada intervalo de amostragem (Ivm) e a média de IS para os intervalos de
amostragens divisores de 1440 compreendidos entre 1 e 60 minutos (ISm). E isso pode
representar mais um método para detectar alterações no ritmo circadiano
Referências
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Legendas das figuras
Figura 1 – Cálculo da fragmentação de dados simulados: (A) Perfil do IV calculado para
dados distribuidos randomicamente com variâncias iguais a 0.05 e 0.5; (B) IV calcuado
para três tipos de sinais simulados, senoide pura, senoide com ruído simples e senoide
mais ruído composto; (C) Análise do comportamento dos parâmetros IVerro e IVm para
diferentes intensidades de ruídos modulados por uma senoide e (D) Perfil médio de IV
calculado para um grupo de idosos com AVC e outro grupo controle.
Figura 2 – Cálculo da fragmentação e da estabilidade do ritmo em senoides com
diferentes períodos de dados simulados: (A) Perfil do IV calculado para as três senoides
com período de 8,24 e 24.5 h; (B) Comportamento de IS para duas senoides de 24.5 e
25h com diferentes durações em dias.
Figura 3 – (A) Cálculo do perfil de IV dos dados do grupo controle e de pacientes com
AVC. (B) Nível da diferença estatitisca entre os grupos controle. Para cada
reamostragem foram calculados os valores de IV dos dois grupos e através do teste T
bicaudal foi obtido o valor de P.
105
Figura 4 – (A) Cálculo do perfil de IV dos dados de jovens e idosos com Parkinson. (B)
Nível da diferença estatitisca entre os grupos. Para cada reamostragem foram calculados
os valores de IV dos dois grupos e através do teste T bicaudal foi obtido o valor de p.
Figura 5 – (A) Cálculo do perfil de IV de ratos e saguis. (B) Nível da diferença
estatística entre os grupos. Para cada reamostragem foram calculados os valores de IV
dos dois grupos e através do teste T bicaudal foi obtido o valor de p.
A
B
106
107
Tabelas
Tabela 1 – Valores das variáveis não-paramétricas para as três senóides com
período igual a 24, 24.5 e 8 h.
Variável
T = 24
T=24.5
T=8
IS60
1
0.5517
1
ISm
1
0.5518
1
IV60
0.0680
0.0658
0.5835
IVm
0.0233
0.0225
0.2033
M10
1043.8
1049.7
709.6933
L5
21.2004
20.361
160.3758
Tabela 2 – Valores das variáveis não-paramétricas para o grupo controle e
pacientes com AVC
Control
AVE
p-value
IS60
0.6381(0.0907)
0.6182(0.1442)
0.5361
ISm
0.5267(0.0822)
0.4940(0.1142)
0.2119
IV60
0.8162 (0.2090)
0.9190(0.2649)
0.0983
IVm
0.6648(0.1626)
0.7834(0.1769)
0.0068 *
M10
3.438e5 (1.098e5)
2.466e5(1.203e5)
4.0341e-13 *
108
L5
10805(7769)
10564(833.06)
0.7894
Tabela 3 – Valores das variáveis não-paramétricas para o grupo Jovem e Idosos
com Parkinson
Jovem
Idoso+Parkinson
p-value
IS60
0.5498(0.1287)
0.4871 (0.1053)
0.0647
ISm
0.4254(0.1028)
0.3688(0.0812)
0.0349
IV60
0.6069 (0.6069)
0.7336(0.0435)
<0.0001
IVm
0.5970(0.0683)
0.7182(0.0288)
<0.0001
M10
76148(7015)
68800 (1011)
<0.0001
L5
5781(883.67)
5936 (688.92)
0.4891
Tabela 4 – Valores das variáveis não-paramétricas para ratos e saguis
Sagui
Rato
p-value
IS60
0.6111(0.1529)
0.4455(0.1435)
0.0781
ISm
0.5067(0.1436)
0.3529(0.1061)
0.0643
IV60
0.8571(0.3275)
0.9834(0.3259)
0.5121
IVm
0.6951(0.2052)
0.9198(0.1613)
0.0628
109
IVerror
0.6694(0.2052)
0.8941(0.1613)
0.0628
M10
5041(1737.4)
12132(5463.2)
<0.01
L5
0.6656(0.8381)
823.433(529.5)
<0.01
110
Contribuição dos autores:
Bruno S. B. Gonçalves: Desenvolvimento da metodologia, análise dos dados e escrita
do artigo.
Paula R. A. Cavalcanti: Análise e coleta dos dados e escrita do artigo.
Gracilene R. Tavares: Análise e coleta dos dados e escrita do artigo.
Tania F Campos: Análise e coleta dos dados e escrita do artigo.
John F. Araujo: Análise e coleta dos dados e escrita do artigo.
111
DISCUSSÃO GERAL
Neste trabalho foi possível apresentar dois modelos computacionais e a
utilização de um deles para explicar resultados experimentais do nosso laboratório.
Além disso, foi apresentada uma revisão sobre a utilização das variáveis nãoparamétricas na análise de dados de actimetria e por último uma atualização na forma de
calcular essas variáveis.
O primeiro modelo computacional publicado na revista “Sleep Science”
(Gonçalves et.al.,2010) é limitado pois considera o NSQ composto apenas por dois
osciladores. Outra limitação é ignorar o efeito da luz sobre o acoplamento dos múltiplos
osciladores existentes no NSQ. Mesmo com essa simplificação foi possível reproduzir
dados experimentais da literatura e com esse modelo explicamos nossos dados
experimentais apresentados no segundo artigo.
No segundo artigo mostramos a instabilidade na relação de fase entre os ritmos
circadianos de atividade e repouso e da temperatura central durante a desincronização
forçada em T22. Utilizando nosso modelo simplificado propomos que essa instabilidade
está relacionada a um processo de batimento que ocorre em osciladores no limite de
sincronização (Granada et.al.,2011). O resultado do batimento é uma variabilidade na
amplitude da saída do oscilador (Granada et.al.,2010). Acreditamos que isso deve variar
a sincronização entre os osciladores centrais e periféricos controlados pelo NSQ. Essa
variabilidade na amplitude da saída do oscilador foi encontrada também no ritmo
circadiano de secreção de melatonina (Schwartz et al., 2009). Espera-se que com a
apresentação desse trabalho outros autores reanalisem seus dados para buscar essa
instabilidade de fase entre os ritmos circadianos registrados como no caso da secreção
112
de melatonina (Schwartz et. al., 2009), ciclo sono-vigilia e temperatura central
(Cambras et.al.,2007).
No terceiro artigo apresentamos um outro modelo mais completo que o anterior.
Nesse caso foi possível reproduzir os principais resultados obtidos experimentalmente
com ratos e camundongos. Isso foi possível porque o modelo considerou as duas
subdivisões do NSQ e os dois efeitos da luz sobre os neurônios dessa estrutura. Ao
considerarmos as duas subdivisões do NSQ, a região ventrolateral e a dorsomedial foi
possível simular o efeito da dissociação em ciclos CE menores do que 24 horas.
Granada e colaboradores mostraram ser possível obter uma saída com dois períodos
utilizando somente um oscilador (Granada et.al.,2011). Porém a dissociação é um pouco
mais complexa do que esse efeito, nela as duas regiões atuam de maneira distintas (de la
Iglesia et. al.,2004). Com a simplificação perde-se o efeito que cada região atuando
separadamente tem sobre estruturas distintas.
Além da simplificação estrutural os modelos matemáticos têm utilizado ou
somente o efeito da luz na dinâmica dos osciladores (Scheper et. al.,1999; Oda e
Friesen,2002; Kunz e Achermann,2003; Geier et. al.,2005;Gonze et. al.,2005; Bernard
et. al.,2007;Schwartz et. al.,2009; Cardoso et.al.,2009; Ullner et.al.,2009; Jun-Wei e
Tian-Shou, 2009) ou somente o efeito da luz no acoplamento entre eles (DiezNoguera,1994;Ullner et.al.,2009). Aqui o modelo apresentado utiliza de forma
simultânea os dois efeitos da luz no STC. Com isso conseguimos reproduzir a
sincronização, o livre curso em escuro constante, o efeito fásico da luz, a regra Aschoff
e a arritmicidade em claro constante de longa duração.
Quanto a análise dos dados de actimetria apresentamos aqui uma revisão que
mostra a utilização de variáveis não-paramétricas. Propomos um modelo funcional
113
composto pelos componentes do sistema de temporização circadiano. Nesse modelo
apresentamos como cada variável não-paramétrica é alterada pelos componentes do
STC. A variável que quantifica a fragmentação (IV) se relaciona principalmente com o
componente homeostático apresentado por Borbély em 1982 (Borbély, 1982), e com a
integridade do NSQ. A estabilidade do ritmo medida por IS está ligada principalmente
às entradas para o NSQ e também a integridade da retina e do trato retino-hipotalâmico.
Nessa perspectiva acreditamos que essas variáveis podem ser utilizadas para estudar
melhor o modelo de controle homeostático e circadiano proposto por Borbély (Borbély,
1982). A fragmentação do ciclo atividade e repouso medida por IV deve estar
relacionada com o componente homeostático e a variável IS ao componente circadiano.
No último artigo propomos mudanças na forma de calcular a fragmentação e a
sincronização do ritmo. Isso permitiu encontrar diferenças significantes que não foram
encontradas utilizando as metodologias atuais. Esse trabalho contribui para o avanço no
cálculo da fragmentação do ritmo, pois aproveita o aprimoramento tecnológico dos
novos actimetros. Todos os trabalhos têm utilizado a mesma fórmula a 20 anos que
considera o registro a cada 1 hora (Witting et.al.,1990; Van Someren et.al.,1996; Van
Someren et.al.,1999;Hatfield et.al.,2004;Bromundt et.al.,2011). Ao consideramos a
amostragem a cada minuto feita pelos actímetros atuais podemos calcular com mais
sensibilidade a fragmentação do ritmo utilizando a variabilidade intradiária (do inglês,
intradaily variability ou IV).
Nessa perspectiva o presente trabalho se insere na Cronobiologia atualizando a
forma de construir modelos matemáticos do NSQ de roedores e na análise de dados de
actimetria. Com essa proposta de simulação computacional diferenciada poderão surgir
modelos mais completos contribuindo com novas interpretações para resultados
experimentais. E com essa nova metodologia de análise pode ser possível através de
114
uma revisão dos dados ser encontradas diferenças estatísticas que antes eram somente
tendências.
115
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Iglesia HO. Dissociation of circadian and light inhibition of melatonin
release through forced desynchronization in the rat. Proc Natl Acad Sci U S
A 2009;1-6.
118
27. Stephan FK, Zucker I. Circadian rhythms in drinking behavior and
locomotor activity of rats are eliminated by hypothalamic lesions. Proc Natl
Acad Sci U S A. 1972;69(6):1583-1586.
28. Sujino M, Masumoto KH, Yamaguchi S, van der Horst GT, Okamura H,
Inouye ST. Suprachiasmatic nucleus grafts restore circadian behavioral
rhythms of genetically arrhythmic mice. Curr Biol. 2003;13(8):664-668.
29. Ullner E, Buceta J, Dıez-Noguera A, Garcıa-Ojalvo J. Noise-induced
coherence in multicellular circadian clocks. Biophysical Journal. 2009;96:
3573–3581
30. Van Someren EJ, Hagebeuk EE, Lijzenga C, et al. Circadian rest-activity
rhythm disturbances in Alzheimer's disease. Biol Psychiatry 1996;40:259-70.
31. Van Someren EJ, Kessler A, Mirmiran M, Swaab DF. Indirect bright light
improves circadian rest-activity rhythm disturbances in demented patients.
Biol Psychiatry. 1997;41(9):955-63.
32. Van Someren EJ, Swaab DF, Colenda CC, Cohen W, McCall WV,
Rosenquist PB. Bright light therapy: improved sensitivity to its effects on
rest activity rhythms in Alzheimer patients by application of nonparametric
methods. Chronobiol Int. 1999;16(4):505-18.
33. Witting W, Kwa IH, Eikelenboom P, Mirmiran M, Swaab DF. Alterations in
the circadian rest-activity rhythm in aging and Alzheimer's disease. Biol
Psychiatry 1990;27:563-72.
119
ANEXOS
ANEXO 1 – Regras do Chronobiology International
Regras
do
periódico
(retirado
de
http://informahealthcare.com/userimages/ContentEditor/1326229501902/CBIIFAS
.pdf )
Manuscript Preparation
The following article types are considered for publication in Chronobiology
International:
• Original articles
• Review articles
• Short Communications
• Letters to the Editor
• Commentaries
Manuscripts are preferred in double-spaced Microsoft Word format (.doc or .docx files)
with 1 inch (2.5 cm) margins on all sides. Tables and figures should not appear in the
main text; specific instructions for their submission are given below. Only Englishlanguage manuscripts are considered.
Manuscripts should be compiled in the following order: Title page containing running
head, Abstract with keywords; Main text; Acknowledgments (if applicable);
Declaration of Interest statement (mandatory); References; Appendices (if applicable);
Tables with captions; Figures; and Figure captions.
Title Page
Provide a title page with your submission, including in it the manuscript title and names
(first and last) and affiliations of all authors. Authors’ names should be spelled out
without their degrees. Clearly designate the corresponding author and his/her full
contact information, including postal address, phone number, and email address. Please
include the running head of no more than 50 characters.
Authors may provide names, addresses, and email addresses of up to 4 referees for the
review of their manuscript. Those referees should not have published any paper in the
last three (3) years with any of the co-authors. Authors may also submit a list of up to
two (2) scientists not to be solicited to peer review their manuscript due to perceived
potential bias or competition.
Abstract with keywords
All articles should start with an abstract of no more than 500 words as a single
continuous paragraph. The abstract should not contain any subtitle, e.g., aim, methods
etc.). The abstract must be factual and sufficiently comprehensive. Abbreviations,
unless first defined, and general statements (e.g., the significance of the results is
discussed) should be avoided.
At least 5 keywords not included in the title should be included with the abstract to
assist indexers in cross-indexing the article. Separate keywords with commas.
Main Text
Original articles
The body of original articles should include the following distinct sections:
120
Introduction: This section should state the background and purpose, including
hypotheses tested, of the study plus references to relevant published works.
Materials and Methods: The methods, mechanisms, and procedures must be specified in
sufficient detail to allow others to reproduce the results. Statistical methods should be
described in appropriate detail to enable a knowledgeable reader with access to the
original data to verify the reported results. Chronobiology International requires that
studies involving animals/humans be approved by an institutional review board, in
accordance with approved published guidelines, prior to conducting the research and
publishing the findings. This approval should be explicitly stated in the methods
section. Please also see the section on Ethics and Consent.
Results: Results should be presented concisely and accurately and on the basis of their
statistical significance.
Discussion: This section should discuss the findings in relation to the background
literature as well as their implications, including possibilities for future research. The
limitations of the study methods in relation to the findings and generalizations also
should be discussed.
Review Articles
The body of a review article should be a comprehensive, scholarly evidence-based
review of the literature, accompanied by critical analysis and leading to reasonable
conclusions. Wherever appropriate, details of the literature search methodology should
be provided, i.e., the databases searched, the search terms and inclusive dates, and any
selectivity criteria imposed. Wherever possible, use primary resources, avoiding “Data
on File”, “Poster”, or other unpublished references. Authors of review articles are
expected to address the basic tenets for quality chronobiology research, including
subject synchronizer schedules, time or season of year of studies, time (circadian or
other biological period) of treatment, etc., as well as the nature of the analysis of the
time series data of the investigations reviewed.
Short Communications
Short Communications are brief and preliminary reports of significant new findings.
They, including title, short abstract of 100 words or less, keywords, and references,
must not exceed 5000 words. Because Short Communications are brief by definition,
figures and tables, though not prohibited, should be used sparingly. Please note that the
average figure or table will take up at least 1/8 page space in print.
Letters to the Editor
Letters to the Editor will be considered for publication subject to editor approval,
providing that the content relates to articles published in the journal. Letters should be
received less than six months after publication of the original work in question. Pending
editor approval, letters will be submitted to the author of the original paper in order that
a reply be published simultaneously. Letters to the Editor should be fewer than 1000
words.
Commentaries
All commentary topics must be checked with the editor prior to submission.
Commentaries should be knowledge-based or consensus-type articles (e.g., working
group statement) of short length, generally less than 5000 words, expressing objective
121
opinions, experiences or perspectives on an important area related to Chronobiology
International.
Acknowledgments section
Please see here under Ethics and Consent for information about this section. In short,
the Acknowledgments section details special thanks, personal assistance, and
dedications. Acknowledgments should be included in a separate headed section at the
end of the manuscript, preceding the Declaration of Interest Section.
Declaration of Interest section
Please see here under Ethics and Consent for expectations regarding this section. The
Declaration of Interest section should disclose any financial, consulting, and personal
relationships with people or organizations that could be perceived by readers as
influencing (biasing) the author’s work. Within this section also belongs disclosure of
scientific writing assistance (use of an agency or freelance writer), grant support and
numbers (including NIH/Wellcome-funded papers), and statements of employment.
All declarations of interest must be outlined under the heading “Declaration of Interest”
in a section before the references (and, if there is an Acknowledgments section,
following that).
Citations and References
Citation in the text should follow the “(Name, Year)” style. If different works are cited
of the same first author, without co-workers, published in the same year, they should be
separately designated by a, b, c, etc., after the year of publication. The same
consideration applies to publications of the same year cited by the same first and same
second authors, or the same first author with more than 2 additional authors, cited in the
text as et al. and published in the same year. Variations in the (Name, Year) citation
format to accommodate more complex situations can be found below:
Citation with 2 authors:
(Williams & Pilditch, 1997)
Citation with 3 or more authors:
(Gracey et al., 2008)
2 or more works cited:
(Gracey et al., 2008; Kim at al., 2003; Saurel et al., 2007)
Citation to multiple works by same single author published in different years:
(Smith, 1998, 2010)
Citation to multiple works by same first author with two or more additional, whether the
same or different, co-authors published in the same and different years:
(Portaluppi et al., 2001a, 2001b, 2008)
All references should be gathered and placed at the end of the text. References are to be
listed in alphabetical order in the Reference section by surname in the case of single and
dual authored publications. Publications with more than two authors, as et al, are to be
ordered by the surname of the first author according to the year of publication, starting
with the earliest date. Each reference must list every author, et al is not acceptable. For
all references, a period is placed at the end of the author list, with the year of publication
shown in parentheses and placement of a period thereafter. Under ordinary
circumstance, only the first word only of title is capitalized; the end of the title is
punctuated by a period.
Examples:
Chapter in a book:
Monk TH. (1992). Chronobiology of mental performance. In Touitou Y, Haus E (Eds).
Biological rhythms in clinical and laboratory medicine. Berlin: Springer Verlag, pp.
280-213.
122
Book:
Reinberg A, Labrecque G, Smolensky MH. (1991). Chronobiologie et
chronothérapeutique [Chronobiology and Chronotherapeutics]. Paris: Flammarion.
Journal article:
When referencing a journal, use the accepted abbreviated title in italics, followed by a
period. State the volume, but not the issue number, followed the first and last pages,
followed by a period.
Cajochen C, Munch M, Knoblauch V, Blatter K, Wirz-Justice A. (2006). Age-related
changes in the circadian and homeostatic regulation of human sleep. Chronobiol Int.
23:461-474.
Journal article in press:
Martinez-Nicolas A, Ortiz-Tudela E, Madrid JA, Rol, MA. (Year). Crosstalk between
environmental light and internal time in humans. Chronobiol Int. (in press)
Supplement:
American Diabetes Association. (2010). Standards of medical care in diabetes – 2010.
Diabetes Care. 33(Suppl 1): S11-S61.
Journal article published online ahead of print:
Sakima A, Ohshiro K, Nakada S, Yamazoto M, Kohagura K, Nakamoto M, Tana T,
Ohya Y. (2011). Switching Therapy from Variable-Dose Multiple Pill to Fixed-Dose
Single-Pill Combinations of Angiotensin II Receptor Blockers and Thiazides for
Hypertension. Clin Exp Hypertens. Advance online publication. doi:
10.3109/10641963.2010.549260.
Appendices
Supplementary material can be made available by the publisher as online only content,
linked to the online article. Please query the editor regarding the possibility of including
online-only supplementary material with the article.
Supplementary material is defined as supporting material that cannot be included in the
printed version for reasons of space, and that is not essential for inclusion in the full text
of the manuscript, but would nevertheless benefit the reader. It should not be essential
to understanding the conclusions of the paper, but should contain data that are
additional or complementary and directly relevant to the article content. Examples of
supplementary material may include more detailed methods, extended data sets/data
analysis, tables, or additional figures.
All supplementary material should be submitted with the article through Scholar One’s
Manuscript Central portal, and clearly labelled “Supplementary Material”. Ensure that
reference is made to the supplementary material in the submitted article’s text.
Tables
Lines of data should not be numbered. Tables should be grouped at the end of the
manuscript on separate pages. When referring to tables in the text, please use Arabic
numbers (rather than Roman numerals). If the tables are in Microsoft Word format, they
can be submitted at the end of the text in the same file as the text. However, if they are
in formats other than Microsoft Word, such as in Excel, the tables should be submitted
separately.
Footnotes to tables should be typed directly below the table and be indicated by the
following symbols: * (asterisk or star), † (dagger), ‡ (double dagger), ¶ (paragraph
mark), § (section mark), || (parallels), # (number sign).
Figures and Illustrations
Illustrations (line drawings, halftones, photos, photomicrographs, etc.) should be
submitted as digital files for highest quality reproduction and should follow these
guidelines:
123
300 dpi or higher
EPS, JPG, TIFF, PowerPoint, or PSD format only
All illustrations should be submitted as separate files, not embedded in the text
Legends or captions for figures should be listed on a separate page, double spaced
For information on submitting animations, movie files, and sound files, or for any
additional information including indexes and calendars, please click here.
For information on color figure charges, please see Production and Proofs.
Statistical Notes
All articles reporting on clinical trials should conform to the CONSORT statement.
Details can be found by visiting http://www.consort-statement.org/.These studies should
contain details of the study population and setting; subject selection
(inclusion/exclusion criteria); methods of randomization and blinding; and efficacy and
safety measures.
In the Methods section of the paper, the study design and statistical analyses should be
described, along with justification for the choice of analysis and sample size given.
Statistical methods used to compare groups for primary outcomes should specify what
type of confidence interval was employed, and any additional methods for analyses
(subgroup, adjusted) should be reflected as well. In the Results section, the sample size
of each data point should be shown in figures or provided in figure captions and/or
tables, with p-values and confidence intervals quoted for both significant and nonsignificant findings.
124
ANEXO 2 - REGRAS DO PERÍODICO JOURNAL OF BIOLOGICAL RHYTHMS
Regras
do
periodic
(retirado
de
http://www.sagepub.com/journalsProdDesc.nav?prodId=Journal200933#tabview=
manuscriptSubmission):
One electronic copy of each paper should be submitted to the Editor as an attachment to
an e-mail. The text and each figure or table should be in separate files. Manuscript
pages should be 6.5 inches wide, 9 inches long, and double spaced throughout. Hard
copies of text and/or illustrations may be used in special circumstances. There are no
publication charges except for circumstances requiring special printing, color
reproduction, or unusual length and number of illustrations; in these cases, the publisher
will
provide
cost
information
before
the
paper
is
accepted.
Manuscripts should be written clearly and concisely and should conform generally to
the Council of Science Editors Style Manual (Scientific Style and Format: The CSE
Manual
for
Authors,
Editors,
and
Publishers,
7th ed.).
“Letters” should be limited to a total of 2000 words and a few figure panels or
equivalent-sized tables. Their format differs from those of regular papers. Consult
previously published Letters or the Editor for further information.
Supplementary Online Material may be submitted for ancillary but necessary
information. It should be submitted as a pdf file, with the article title, authors, and
"Supplementary Online Material" on the first page, followed by text, figures, and tables
along with captions. Number figures and tables S1, S2, etc. Supplementary material will
appear
online
exactly
as
submitted
and
can
be
viewed
at
http://jbr.sagepub.com/supplemental.
Regular manuscripts should consist of the following:

A Title page, including the authors' names, the title and a short running title, and
the institution(s) (with all words spelled out in full) from which the paper emanates. If
current addresses are different, then these should be indicated in a footnote. Also
include the name, mailing address, phone and fax numbers, and e-mail address of the
person to whom correspondence and proofs should be sent. Number the pages,
illustrations, and tables.

A succinct Abstract, not exceeding 350 words, in a form acceptable to most
abstracting services, followed by six to eight key words.

An Introduction that provides a brief review of relevant background material
and indicates the purpose of the study.

A Materials and Methods section that provides sufficient information for
qualified investigators to reproduce the work in similar fashion. Reference to published
procedures by appropriate succinct summary and citation is encouraged but should not
replace adequate methodological description. The Journal of Biological Rhythms
endorses the Declaration of Helsinki and the U.S. National Institutes of Health Guide
for the Care and Use of Laboratory Animals. It will be assumed that authors have
conscientiously followed principles and practices in accord with these documents in
experiments involving human subjects and experimental animals.

A Results section that provides a concise description of the findings with
appropriate reference to illustrations and tables.

A Discussion section that includes a summary of the main findings (not data),
their relation to other published work, and a statement of their significance.
125

References should be double spaced and listed sequentially in alphabetical order
according to the name of the first author with (a) a full list of authors, (b) date, (c) full
title of the paper, (d) journal titles abbreviated as per Index Medicus, (e) volume
number, and (f) first and last pages. Only papers published or in press may be included
in the reference list. Papers should be cited in the text by author(s) and date.
o
Examples
Aschoff J (1965) Response curves in circadian periodicity. In Circadian Clocks, J
Aschoff,
ed,
pp
95-111,
North-Holland,
Amsterdam.
Pittendrigh CS and Daan S (1976) A functional analysis of circadian pacemakers in
nocturnal rodents. I. The stability and liability of spontaneous frequency. J Comp
Physiol
A
106:223-252.
Richter CP (1965) Biological Clocks in Medicine and Psychiatry, Charles C Thomas,
Springfield, IL.
Aschoff J (1965) Response curves in circadian periodicity. In , J Aschoff, ed, pp 95111, North-Holland, Amsterdam.Pittendrigh CS and Daan S (1976) A functional
analysis of circadian pacemakers in nocturnal rodents. I. The stability and liability of
spontaneous frequency. J Comp Physiol A 106:223-252.Richter CP (1965), Charles C
Thomas, Springfield, IL.

Tables and illustrations should be submitted in a form suitable for direct
reproduction when possible, with all labels, axes, and inserts proportionately large
enough to remain readily legible upon reduction in size. Place each numbered
figure and table in a separate file. Charges for color figures are $800.00 for the
first figure and $200.00 for each additional page.

A list of figure legends should follow the references and be the last section
in the text. A brief title and description of each illustration should be included.
These should be typed consecutively on the same page(s).

Abbreviations should be introduced in parentheses after the first
occurrence of the term being abbreviated. Use standard metric units wherever
possible.
should be submitted in a form suitable for direct reproduction when possible, with all
labels, axes, and inserts proportionately large enough to remain readily legible upon
reduction in size. Place each numbered figure and table in a separate file. Charges for
color figures are $800.00 for the first figure and $200.00 for each additional page.
Submission of a manuscript implies concurrence of all listed authors and assurance that
no similar paper has been submitted for publication elsewhere. Manuscripts are
evaluated on their merit and suitability for publication by the editors with the assistance
of
selected
referees.
126
ANEXO 3 : REGRAS PERIÓDICO PLOSONE
Regras do periódico (retirado de http://www.plosone.org/static/guidelines.action) :
1. Format Requirements
PLOS ONE does not consider presubmission inquiries. All submissions should be
prepared with the following files:

Cover letter

Manuscript, including tables and figure legends

Figures (guidelines for preparing figures can be found at the Figure and Table
Guidelines)
Prior to submission, authors who believe their manuscripts would benefit from
professional editing are encouraged to use language-editing and copyediting services.
Obtaining this service is the responsibility of the author, and should be done before
initial submission. These services can be found on the web using search terms like
"scientific editing service" or "manuscript editing service." Submissions are not
copyedited before publication.
Submissions that do not meet the PLOS ONE Publication Criterion for language
standards may be rejected.
Cover Letter
You should supply an approximately one page cover letter that:

Concisely summarizes why your paper is a valuable addition to the scientific
literature

Briefly relates your study to previously published work

Specifies the type of article you are submitting (for example, research article,
systematic review, meta-analysis, clinical trial)

Describes any prior interactions with PLOS regarding the submitted manuscript

Suggests appropriate PLOS ONE Academic Editors to handle your manuscript
(view a complete listing of our academic editors)

Lists any recommended or opposed reviewers
Your cover letter should not include requests to reduce or waive publication fees.
Should your manuscript be accepted, you will have the opportunity to include your
requests at that time. See PLOS ONE Editorial Policy for more information regarding
publication fees.
Manuscript Organization
PLOS ONE considers manuscripts of any length. There are no explicit restrictions for
the number of words, figures, or the length of the supporting information, although we
encourage a concise and accessible writing style. We will not consider monographs.
All manuscripts should include line numbers and page numbers.
Manuscripts should begin with the ordered sections:

Title

Authors

Affiliations

Abstract

Introduction
and end with the sections of:

Acknowledgments

References

Figure Legends

Tables
127
Figures should not be included in the main manuscript file. Each figure must be
prepared and submitted as an individual file. Find more information about preparing
figures here.
The title, authors, and affiliations should all be included on a title page as the first page
of the manuscript file.
There are no explicit requirements for section organization between these beginning and
ending sections. Articles may be organized in different ways and with different section
titles, according to the authors' preference. In most cases, internal sections include:

Materials and Methods

Results

Discussion

Conclusions (optional)
PLOS ONE has no specific requirements for the order of these sections, and in some
cases it may be appropriate to combine sections. Guidelines for individual sections can
be found below.
Abbreviations should be kept to a minimum and defined upon first use in the text. Nonstandard abbreviations should not be used unless they appear at least three times in the
text.
Standardized nomenclature should be used as appropriate, including appropriate usage
of species names and SI units.
Manuscript File Type Requirements
Authors may submit their manuscript files in Word (as .doc or .docx), LaTeX (as .pdf),
or RTF format. Only RTF and .doc files can be used during the production process.
LaTeX Submissions. If you would like to submit your manuscript using LaTeX, you
must author your article using the PLOS ONE LaTeX template and BibTeX style sheet.
Articles prepared in LaTeX may be submitted in PDF format for use during the review
process. After acceptance, however, .tex files and formatting information will be
required as a zipped file. Please consult our LaTeX guidelines for a list of what will be
required.
Submissions with equations. If your manuscript is or will be in .docx format and
contains equations, you must follow the instructions below to make sure that your
equations are editable when the file enters production.
If you have not yet composed your article, you can ensure that the equations in your
.docx file remain editable in .doc by enabling "Compatibility Mode" before you begin.
To do this, open a new document and save as Word 97-2003 (*.doc). Several features of
Word 2007/10 will now be inactive, including the built-in equation editing tool. You
can insert equations in one of the two ways listed below.
If you have already composed your article as .docx and used its built-in equation editing
tool, your equations will become images when the file is saved down to .doc. To resolve
this problem, re-key your equations in one of the two following ways.
1.
Use
MathType
to
create
the
equation
(recommended)
2. Go to Insert > Object > Microsoft Equation 3.0 and create the equation
If, when saving your final document, you see a message saying "Equations will be
converted to images," your equations are no longer editable and PLoS will not be able
to accept your file.
2. Guidelines for Standard Sections
Title
Manuscripts must be submitted with both a full title and a short title, which will appear
at the top of the PDF upon publication if accepted. Only the full title should be included
128
in the manuscript file; the short title will be entered during the online submission
process.
The full title must be 150 characters or fewer. It should be specific, descriptive, concise,
and comprehensible to readers outside the subject field. Avoid abbreviations if possible.
Where appropriate, authors should include the species or model system used (for
biological papers) or type of study design (for clinical papers).
Examples:

Impact of Cigarette Smoke Exposure on Innate Immunity: A Caenorhabditis
elegans Model

Solar Drinking Water Disinfection (SODIS) to Reduce Childhood Diarrhoea in
Rural Bolivia: A Cluster-Randomized, Controlled Trial
The short title must be 50 characters or fewer and should state the topic of the paper.
Authors and Affiliations
All author names should be listed in the following order:

First names (or initials, if used),

Middle names (or initials, if used), and

Last names (surname, family name)
Each author should list an associated department, university, or organizational
affiliation and its location, including city, state/province (if applicable), and country. If
the article has been submitted on behalf of a consortium, all author names and
affiliations should be listed at the end of the article.
This information cannot be changed after initial submission, so please ensure that
it is correct.
To qualify for authorship, a researcher should contribute to all of the following:
1.
Conception and design of the work, acquisition of data, or analysis and
interpretation of data
2.
Drafting the article or revising it critically for important intellectual content
3.
Final approval of the version to be published
All persons designated as authors should qualify for authorship, and all those who
qualify should be listed. Each author must have participated sufficiently in the work to
take public responsibility for appropriate portions of the content. Those who contributed
to the work but do not qualify for authorship should be listed in the acknowledgements.
When a large group or center has conducted the work, the author list should include the
individuals whose contributions meet the criteria defined above, as well as the group
name.
One author should be designated as the corresponding author, and his or her email
address or other contact information should be included on the manuscript cover page.
This information will be published with the article if accepted.
See the PLOS ONE Editorial Policy regarding authorship criteria for more information.
Abstract
The abstract should:

Describe the main objective(s) of the study

Explain how the study was done, including any model organisms used, without
methodological detail

Summarize the most important results and their significance

Not exceed 300 words
Abstracts should not include:

Citations

Abbreviations, if possible
129
Introduction
The introduction should:

Provide background that puts the manuscript into context and allows readers
outside the field to understand the purpose and significance of the study

Define the problem addressed and why it is important

Include a brief review of the key literature

Note any relevant controversies or disagreements in the field

Conclude with a brief statement of the overall aim of the work and a comment
about whether that aim was achieved
Materials and Methods
This section should provide enough detail to allow suitably skilled investigators to fully
replicate your study. Specific information and/or protocols for new methods should be
included in detail. If materials, methods, and protocols are well established, authors may
cite articles where those protocols are described in detail, but the submission should
include sufficient information to be understood independent of these references.
We encourage authors to submit detailed protocols for newer or less well-established
methods as Supporting Information. These are published online only, but are linked to
the article and are fully searchable. Further information about formatting Supporting
Information files, can be found here.
Methods sections of papers on research using human or animal subjects and/or tissue
or field sampling must include required ethics statements. See the Reporting
Guidelines for human research, clinical trials, animal research, and observational and
field studies for more information.
Methods sections of papers with data that should be deposited in a publicly available
database should specify where the data have been deposited and provide the relevant
accession numbers and version numbers, if appropriate. Accession numbers should be
provided in parentheses after the entity on first use. If the accession numbers have not
yet been obtained at the time of submission, please state that they will be provided
during review. They must be provided prior to publication.
Methods sections of papers using cell lines must state the origin of the cell lines used.
See the Reporting Guidelines for cell line research for more information.
Methods sections of papers adding new taxon names to the literature must follow the
Reporting Guidelines below for a new zoological taxon, botanical taxon, or fungal
taxon.
Results, Discussion, and Conclusions
These sections may all be separate, or may be combined to create a mixed
Results/Discussion section (commonly labeled "Results and Discussion") or a mixed
Discussion/Conclusions section (commonly labeled "Discussion"). These sections may
be further divided into subsections, each with a concise subheading, as appropriate.
These sections have no word limit, but the language should be clear and concise.
Together, these sections should describe the results of the experiments, the
interpretation of these results, and the conclusions that can be drawn. Authors should
explain how the results relate to the hypothesis presented as the basis of the study and
provide a succinct explanation of the implications of the findings, particularly in
relation to previous related studies and potential future directions for research.
PLOS ONE editorial decisions do not rely on perceived significance or impact, so
authors should avoid overstating their conclusions. See the PLOS ONE Publication
Criteria for more information.
130
Acknowledgements
People who contributed to the work but do not fit the PLOS ONE authorship criteria
should be listed in the acknowledgments, along with their contributions. You must
ensure that anyone named in the acknowledgments agrees to being so named.
Funding sources should not be included in the acknowledgments, or anywhere in the
manuscript file. You will provide this information during the manuscript submission
process.
References
Only published or accepted manuscripts should be included in the reference list.
Manuscripts that have been submitted but not yet accepted should not be cited. Limited
citation of unpublished work should be included in the body of the text only as
“unpublished data.”
References must be listed at the end of the manuscript and numbered in the order that
they appear in the text. In the text, citations should be indicated by the reference number
in brackets. Journal name abbreviations should be those found in the NCBI databases. A
number of reference software companies supply PLOS style files (e.g., Reference
Manager, EndNote). Proper formatting of the references is crucial; some examples are
shown below.

Published papers. Hou WR, Hou YL, Wu GF, Song Y, Su XL, et al. (2011)
cDNA, genomic sequence cloning and overexpression of ribosomal protein gene L9
(rpL9) of the giant panda (Ailuropoda melanoleuca). Genet Mol Res 10: 1576-1588.
Note: Use of a DOI number for the full-text article is acceptable as an alternative to or
in addition to traditional volume and page numbers.

Accepted, unpublished papers. Same as above, but “In press” appears instead
of the page numbers.

Electronic journal articles. Huynen MMTE, Martens P, Hilderlink HBM
(2005) The health impacts of globalisation: a conceptual framework. Global Health 1:
14. Available: http://www.globalizationandhealth.com/content/1/1/14. Accessed 25
January 2012.

Books. Bates B (1992) Bargaining for life: A social history of tuberculosis.
Philadelphia: University of Pennsylvania Press. 435 p.

Book chapters Hansen B (1991) New York City epidemics and history for the
public. In: Harden VA, Risse GB, editors. AIDS and the historian. Bethesda: National
Institutes of Health. pp. 21-28.
Tables
Tables should be included at the end of the manuscript. All tables should have a concise
title. Footnotes can be used to explain abbreviations. Citations should be indicated using
the same style as outlined above. Tables occupying more than one printed page should
be avoided, if possible. Larger tables can be published as Supporting Information.
Please ensure that table formatting conforms to our Guidelines for table preparation.
Figure Legends
Figures should not be included in the manuscript file, but figure legends should be.
Guidelines for preparing figures can be found here.Figure legends should describe the
key messages of a figure. Legends should have a short title of 15 words or less. The full
legend should have a description of the figure and allow readers to understand the figure
without referring to the text. The legend itself should be succinct, avoid lengthy
descriptions of methods, and define all non-standard symbols and abbreviations. Further
information about figure legends can be found in the Figure Guidelines.
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