UNIVERSIDADE DE RIBEIRÃO PRETO
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ODONTOLOGIA
Análise da expressão imunoistoquímica da proteína p63,
receptor do fator de crescimento epidérmico (EGFR) e Notch 1
em cistos radiculares, cistos dentígeros e tumores
odontogênicos queratocísticos
Claudia Kallás Gonçalves
Orientador: Prof. Dr. Danyel Elias da Cruz Perez
Ribeirão Preto
2009
Claudia Kallás Gonçalves
Análise da expressão imunoistoquímica da proteína p63,
receptor do fator de crescimento epidérmico (EGFR) e Notch 1
em cistos radiculares, cistos dentígeros e tumores
odontogênicos queratocísticos
Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em
Odontologia da Universidade de Ribeirão Preto, como
parte dos requisitos para obtenção do título de Doutor
em Odontologia – área de concentração Endodontia.
Orientador: Prof. Dr. Danyel Elias da Cruz Perez
Ribeirão Preto
2009
Ficha catalográfica preparada pelo Centro de Processamento Técnico da Biblioteca
Central da UNAERP
Universidade de Ribeirão Preto –
G635a
Gonçalves, Claudia Kallas, 1973 Análise da expressão imunoistoquimica da proteína p63,
receptor do fator de crescimento epidérmico (EGFR) e Notch 1
em cistos radiculares, cistos dentígeros e tumores
odontogênicos queratocísticos / Claudia Kallas Gonçalves. - Ribeirão Preto, 2009.
80 f.: il. color.
Orientador: Prof. Dr. Danyel Elias da Cruz Perez.
Tese (doutorado) - Universidade de Ribeirão Preto,
UNAERP, Odontologia, área de concentração: Endodontia.
Ribeirão Preto, 2009.
1. Odontologia. 2. Endodontia. 3. Cisto radicular. 4.
Imunoistoquimica. Tumor odontogênico. I. Título.
CDD: 617.6342
Este trabalho foi realizado no Laboratório de Pesquisas em Odontologia e no
Laboratório de Patologia Bucal da Universidade de Ribeirão Preto- UNAERP.
“Sábio é aquele que conhece os limites da própria ignorância.”
Sócrates
Dedicatórias
Dedico mais esta etapa da minha vida a Deus, que me faz entender como a
vida se torna simples e mais bela quando tudo está em suas mãos. Obrigada por me
dar paciência e me fazer compreender que tudo tem a sua hora, que nem sempre é a
que eu gostaria, mas é a hora certa para que tudo aconteça na minha vida.
Aos meus pais Roberto Gonçalves de Pádua e Elza Kallás Gonçalves
pelo amor incondicional e pelo exemplo a cada dia. Obrigada por estarem sempre
presentes em todos os momentos. Vocês são o que de melhor existe na minha vida.
Obrigada por compreenderem as minhas ausências e o meu silêncio, mas mesmo
nestes momentos vocês me amaram exatamente como sou.
Aos meus irmãos Marcelo Kallás Gonçalves e Rodrigo Kallás Gonçalves,
aos quais me orgulho pelo jeito amoroso, carinhoso e companheiro de ser. Obrigada
meus irmãos!
A tia Ionne Kallás pelo amor, preocupação e exemplo em todos as etapas da
minha vida. Obrigada tia, o seu amor me impulsionou a ser sempre melhor.
Agradecimentos
Ao meu orientador Prof. Dr. Danyel Elias da Cruz Perez pela sua atenção e
disposição. A sua competência se tornou um exemplo em minha vida e levarei no
decorrer da minha vida profissional. Sem a sua orientação não seria possível a
realização deste trabalho. Obrigada por confiar em mim.
Ao programa de Pós-Graduação em Odontologia da Universidade de Ribeirão
Preto – UNAERP, representado pela Magnífica Reitora Profa. Dra. Elmara Lúcia
de Oliveira Bonini Corauci.
À Profa. Dra. Yara Terezinha Corrêa Silva Sousa, coordenadora do curso
de Pós-Graduação em Odontologia da Universidade de Ribeirão Preto, área de
concentração Endodontia, obrigada pelo apoio, amizade e paciência. Muitas vezes
que não sabia como recomeçar a sua presença foi imprescindível. O meu Muito
Obrigada é pouco neste momento.
Ao Prof. Dr. Manoel D. Sousa Neto, pela sua competência e dedicação.
Obrigada por contribuir para minha vida profissional.
Aos professores do Curso de Doutorado em Odontologia, área de concentração
Endodontia, da Universidade de Ribeirão Preto, Profa. Dra. Neide Aparecida de
Souza Lehfeld, Profa. Dra. Cristina Paschoalato, Prof. Dr. Lucélio Bernardes
Couto, Prof. Dr. Lucas de Souza Lehfeld, Prof. Dr. Luis Pascoal Vansan,
Prof. Manoel Henrique Gabarra, Profa. Dra. Silvana Maria Paulino, Prof. Dr.
Ricardo Gariba Silva, Prof. Dr. Sílvio Rocha Corrêa Silva, Profa. Dra.
Rosemary Cristina Linhares R. Pietro, pelos ensinamentos durante o curso.
Aos amigos e companheiros de turma de doutorado, Prof. Dr. Álvaro
Henrique Borges, Profa. Dra. Ângela Delfina Bittencourt Garrido, Prof. Dr.
Bráulio Pasternak Júnior, Profa. Dra. Cleonice da Silveira Teixeira, Prof. Dr.
Edson Alfredo, Prof. Dr. José Antônio Saadi Salomão, Prof. Dr. Marcos Pôrto
Arruda, Profa. Dra. Melissa Andréia Marchesan e Profa. Dra. Michele Regina
Nadalin pelos laços de amizade criados no decorrer do curso. Obrigada por me
incentivarem sempre e contribuírem com o meu crescimento profissional. Com o
nosso convívio pude ser uma pessoa melhor.
À Cecília Maria Zanferdini, secretária da Pós-Graduação, pela atenção e
disponibilidade. Sua amizade foi essencial neste momento. Muito obrigada.
À Rosemary Alexandre, pelo apoio, carinho e disponibilidade. Obrigada por
me transmitir tanta tranqüilidade em todos os momentos.
Aos meus familiares e amigos que sempre estiveram ao meu lado torcendo
para que este estudo fosse, além de uma pesquisa científica, o meu crescimento
como pessoa. Obrigada por entender as minhas ausências e mesmo assim fazer
questão da minha presença.
Resumo
_____________________________________________________________________________Resumo
O objetivo deste estudo foi analisar e comparar as características histopatológicas e
expressão imunoistoquímica da proteína p63, receptor do fator de crescimento
epidérmico (EGFR) e Notch 1 no revestimento epitelial de cistos radiculares, cistos
dentígeros e tumores odontogênicos queratocísticos. Para tanto, foram analisados 35
casos de cisto radicular, 22 de cisto dentígero e 17 de tumor odontogênico
queratocístico, todos oriundos dos arquivos do Laboratório de Patologia Bucal da
Universidade de Ribeirão Preto. Os dados clínicos e epidemiólogicos foram coletados
dos formulários de registro das lesões enviadas ao Laboratório. Cortes histológicos de
3 µm de espessura foram obtidos de blocos de parafina, nos quais foram realizadas
reações imunoistoquímicas, utilizando o método estreptavidina-biotina-peroxidase.
Para determinar a porcentagem de células positivas, as lâminas foram avaliadas por 2
examinadores de forma independente, em aumento de 400x, adotando os seguintes
critérios: negativo - <5% de células positivas, expressão fraca - 5%-50% de células
positivas e expressão forte - >50% de células positivas. Além disso, a intensidade da
expressão de EGFR e Notch 1 também foi avaliada, considerando-a como fraca (+)
ou forte (++). Para análise estatística, utilizou-se o teste exato de Fisher e a
correlação de coeficientes de Spearman, adotando significância de 5%. Comparando
a expressão e intensidade de expressão de EGFR no epitélio cístico das 3 lesões
estudadas, não se observou diferença estatística significante (p=0,2; p=0,1), o
mesmo observado quanto a expressão e intensidade de expressão de Notch 1
(p=0,1; p=0,08). Entretanto, a expressão de p63 foi significativamente maior no
revestimento epitelial dos tumores odontogênicos queratocísticos (p<0,001). Em
todas as lesões houve correlação positiva entre os imunomarcadores. Com esses
achados, parece que o receptor Notch 1 participa da manutenção da integridade do
epitélio de revestimento cístico, contribuindo para a persistência da lesão.
Adicionalmente, a alta expressão da proteína p63, alta intensidade de expressão de
EGFR e a correlação existente entre elas, sugere a participação dessas proteínas no
desenvolvimento das lesões.
Summary
____________________________________________________________________________Summary
The aim of this study was analyze the comparative immunohistochemical expression
of the p63 protein, epidermal growth factor receptor (EGFR) and Notch 1 in the
epithelial lining of radicular cysts, dentigerous cysts and keratocystic odontogenic
tumor. For the study, it was analyzed 35 cases of radicular cyst, 22 dentigerous cysts
and 17 keratocystic odontogenic, all from the files of the Oral Pathology Laboratory,
University of Ribeirao Preto. The clinical and epidemiological data were retrieved of
the register forms of the lesions sent to Laboratory. Histological sections of 3 µm
were
obtained
from
paraffin-embedded
tissue
blocks,
in
which
the
immunohistochemical reactions were carried out, using the streptavidin-biotinperoxidase method. In order to determine the percentage of positive cells, the slides
were independently evaluated by 2 observers, in high power fields (400x), according
to following criteria: negative - < 5% of positive cells, low expression – 5%-50% of
positive cells and high expression - > 50% of positive cells. Moreover, the intensity of
EGFR and Notch 1 expressions was also evaluated, classifying as weak (+) or strong
(++). For statistical analysis, it was used Fisher exact test and the Spearman
correlation coefficients, considering a significance of 5%. Comparing the EGFR
expression and intensity in the epithelial lining from the 3 studied lesions, no
significant statistical difference was observed (p=0.2; p=0.1); the same finding was
observed regarding to Notch 1 expression and intensity (p=0.1; p=0.08). However,
the p63 expression in the epithelial lining was significantly higher in the keratocystic
odontogenic tumors (p<0.001). Positive correlation between the immunomarkers was
observed in all lesions. According to these findings, Notch 1 receptor seems to
participate of maintenance and integrity of epithelial lining, favoring the lesion
persistence. In addition, the high expression of p63 protein, strong intensity of
expression of EGFR and the correlation between the immunomarkers, suggests an
important role in the development of these lesions.
Sumário
____________________________________________________________________________Sumário
RESUMO
SUMMARY
INTRODUÇÃO .......................................................................................... 01
REVISTA DA LITERATURA ......................................................................... 10
PROPOSIÇÃO ........................................................................................... 37
MATERIAL E MÉTODOS ............................................................................ 39
RESULTADOS ........................................................................................... 48
DISCUSSÃO ............................................................................................. 64
CONCLUSÕES .......................................................................................... 71
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ................................................................ 73
ANEXOS
Introdução
_______________________________________________________________________Introdução 2
Lesões císticas odontogênicas são formadas a partir de remanescentes
embrionários de epitélio odontogênico, entretanto, apresentam características
clínicas, histológicas, radiográficas e comportamento biológico distintos. Essa
diferença pode ser atribuída às características específicas que o tecido epitelial
adquire nas diferentes lesões císticas odontogênicas, provavelmente devido a
diferentes taxas de proliferação celular e expressão normal ou alterada de proteínas
envolvidas na diferenciação e ciclo celular, além de fatores associados ao potencial de
reabsorção óssea. Esses mesmos fatores podem também ser diferencialmente
expressos na cápsula cística dessas lesões, além de citocinas inflamatórias
importantes na indução de reabsorção óssea, o que pode contribuir para origem e
progressão das lesões. Entre as lesões císticas odontogênicas, destacam-se o cisto
radicular, de origem inflamatória, os de desenvolvimento o cisto dentígero e o
queratocisto odontogênico (AGARAM et al., 2004; BARNES et al., 2005; KICHI et al.,
2005; MALCIC et al., 2008). A Organização Mundial da Saúde publicou em 2005 uma
nova classificação para os tumores odontogênicos, na qual o queratocisto
odontogênico foi considerado uma neoplasia odontogênica benigna cística, sendo
denominado tumor odontogênico queratocístico (BARNES et al., 2005).
O desenvolvimento do cisto radicular ocorre devido a uma reação inflamatória
no periodonto apical em resposta a infecção localizada no interior do canal radicular,
o qual apresenta tecido pulpar necrótico. Essa reação inflamatória juntamente com
produtos bacterianos oriundos do canal radicular estimula os restos epiteliais de
Malassez a se proliferarem, causando consequente degeneração desse epitélio reativo
_______________________________________________________________________Introdução 3
e finalmente formando a cavidade cística (BROWNE, 1975; MAIN, 1985; SHEAR;
SPEIGHT, 2007). Os cistos dentígeros estão sempre associados à coroa de dentes
não erupcionados, localizados na junção cemento-esmalte e são formados pela
expansão dos folículos dentários resultante do acúmulo de fluidos entre a coroa do
dente e componentes epiteliais. O epitélio do cisto dentígero origina-se do epitélio
reduzido do órgão dentário, o qual recobre completamente a coroa de um dente não
erupcionado (GROSSMANN et al., 2007; SHEAR; SPEIGHT, 2007). Já os tumores
odontogênicos queratocísticos originam-se dos resíduos da lâmina dental (BROWNE,
1975; KICHI et al., 2005; SHEAR; SPEIGHT, 2007).
Radiograficamente essas lesões apresentam características peculiares, mas
não patognomônicas. O cisto radicular apresenta-se como lesão radiolúcida,
circunscrita, localizada no periápice ou lateralmente à raiz de um dente com necrose
pulpar. Por outro lado, o cisto dentígero caracteriza-se por uma imagem radiolúcida
unilocular, a qual apresenta margens escleróticas bem definidas, sempre associada à
coroa de um dente não erupcionado (SHEAR; SPEIGHT, 2007). Os tumores
odontogênicos queratocísticos são lesões radiolúcidas, uni ou multiloculares,
circunscritas e com delgada cortical radiopaca. Quando múltiplas não é raro a
presença bilateral e o envolvimento com a síndrome do carcinoma nevóide
basocelular (síndrome de Gorlin-Goltz) (TSUKAMOTO et al., 2002).
Na análise histopatológica, o cisto radicular caracteriza-se por uma cavidade
revestida internamente por epitélio escamoso estratificado com número variável de
camadas celulares e uma cápsula de tecido conjuntivo fibroso que o reveste
_______________________________________________________________________Introdução 4
externamente, a qual frequentemente apresenta infiltrado inflamatório crônico de
intensidade variável. Além dessas características histopatológicas comuns, a lesão
pode ainda apresentar células mucosas, ciliadas ou com capacidade de formar
queratina, todas elas produto de uma metaplasia sem causa determinada. O
conteúdo cístico é formado por células epiteliais descamadas, células inflamatórias,
cristais de colesterol, ácido hialurônico e proteínas (BROWNE, 1975; NAIR et al.,
2002; NAIR, 2004; SHEAR; SPEIGHT, 2007).
Os aspectos morfológicos do tecido epitelial podem ser considerados um
reflexo da atividade funcional do cisto radicular. Lesões com epitélio escamoso
estratificado atrófico, de espessura regular e contendo até 10 camadas celulares, na
maioria das vezes exibia infiltrado inflamatório leve a moderado no tecido conjuntivo
e são considerados cistos quiescentes. Entretanto, nos cistos com epitélio escamoso
estratificado hiperplásico, com espessura irregular, geralmente são encontrados arcos
proliferativos e infiltrado inflamatório intenso na cápsula, caracterizando lesões ativas
(SHEAR; SPEIGHT, 2007).
Histologicamente, o cisto dentígero é caracterizado por uma cavidade revestida
por tecido epitelial, constituído por 2 a 4 camadas celulares, onde a camada basal é
formada por células cubóides e a superficial, por células poliédricas. Apresenta
também uma cápsula de tecido conjuntivo frouxo, que pode apresentar vários ninhos
de epitélio odontogênico. Entretanto, se houver uma reação inflamatória associada, o
revestimento epitelial pode se apresentar hiperplásico e com metaplasia escamosa
(BROWNE, 1975; STOLL et al., 2005). Devido às suas características clínico-
_______________________________________________________________________Introdução 5
radiográficas e microscópicas próprias, o diagnóstico definitivo de cisto dentígero é
dado pela análise desses achados em conjunto.
As características histopatológicas de um tumor odontogênico queratocístico
intacto são patognomônicas. Consiste em uma cavidade cística revestida por uma fina
camada de tecido epitelial escamoso estratificado, de 5 a 10 camadas celulares, onde
as células da camada basal são colunares e os núcleos se dispõem em paliçada, com
frequente desprendimento do revestimento epitelial da cápsula de tecido conjuntivo
fibroso, que se apresenta delgada e raramente com infiltrado inflamatório. Além
disso, o corrugamento da camada de paraqueratina superficial é comumente
observado.
O
conteúdo
cístico
é
geralmente
semi-sólido,
composto
predominantemente por queratina e células epiteliais descamadas, e em menor
quantidade pode-se observar albuminas e globulinas (BROWNE, 1975; KICHI et al.,
2005; SHEAR; SPEIGHT, 2007).
Da mesma forma, o comportamento biológico e a evolução dessas lesões
também são distintos. O tumor odontogênico queratocístico é localmente mais
agressivo,
apresentando
características
mais
infiltrativas,
o
que
representa
clinicamente lesões maiores e com maiores taxas de recidiva (KICHI et al., 2005;
SHEAR; SPEIGHT, 2007). Vários estudos observaram no tumor odontogênico
queratocístico, uma maior taxa de proliferação epitelial e expressões diferenciais de
fatores de crescimento e genes supressores de tumor (PIATTELLI et al., 2004; KICHI
et al., 2005; MALCIC et al., 2008), quando comparado às outras lesões císticas
odontogênicas mais comuns, o cisto radicular e o cisto dentígero. Esses achados
_______________________________________________________________________Introdução 6
podem explicar, pelo menos parcialmente, o comportamento biológico diferente
dessas lesões.
Pesquisas recentes têm se preocupado em estudar diferentes proteínas,
receptores, fatores de crescimento e citocinas inflamatórias, na tentativa de elucidar
os mecanismos envolvidos no início, manutenção e progressão das lesões císticas
odontogênicas (PIATTELLI et al., 2004; KICHI et al., 2005; LO MUZIO et al., 2005;
MALCIC et al., 2008).
O gene p63 pertence à família do gene supressor de tumor TP53 e codifica
uma proteína de mesmo nome, a proteína p63. O p63 é fundamental no
desenvolvimento do tecido epitelial, membros e estrutura craniofacial. Animais
knockout para o gene p63 apresentam severa deformação dos membros e
significativos defeitos no desenvolvimento craniofacial, assim como na diferenciação
de tecidos com epitélio estratificado, como pele, mucosa bucal, esôfago, mama,
urotélio e próstata. Além disso, esses animais não apresentam dentes, folículos
pilosos e glândulas salivares, lacrimais e mamárias
(CHEN et al., 2003).
Recentemente o p63 tem despertado interesse considerável devido à sua expressão
quase restrita ao tecido epitelial, à sua mutação infrequente e a superexpressão em
várias neoplasias sólidas, o que indica um papel oncogênico na regulação da
proliferação e diferenciação em lesões epiteliais malignizáveis e malignas (LO MUZIO
et al., 2005). Além disso, como as lesões císticas odontogênicas são essencialmente
epiteliais, o p63 pode ser importante na manutenção e na progressão dessas lesões.
Entretanto, apenas 1 estudo avaliou a expressão da proteína p63 em lesões císticas
_______________________________________________________________________Introdução 7
odontogênicas, o qual detectou positividade mais intensa e difusa no revestimento
epitelial dos tumores odontogênicos queratocísticos quando comparado aos cistos
dentígero e radicular (LO MUZIO et al., 2005).
Fatores de crescimento e os seus respectivos receptores são fundamentais
para o crescimento dos tecidos normais, além do desenvolvimento e progressão de
neoplasias. O fator de crescimento epidérmico (EGF) é um peptídeo presente em
vários tecidos, o qual regula a proliferação tanto de células normais quanto de células
neoplásicas (SHRESTHA et al., 1992; VERED et al., 2003). As atividades desse fator
são mediadas pela união ao domínio externo do seu receptor transmembrana
específico, denominado receptor do fator de crescimento epidérmico (EGFR). A
expressão de EGFR foi observada em epitélio normal, incluindo a mucosa bucal, além
de tecidos envolvidos no desenvolvimento dentário, sugerindo que EGF e EGFR
participam na diferenciação de células epiteliais odontogênicas e no controle de suas
funções celulares (HEIKINHEIMO et al., 1993; TANIKAWA; BAWDEN, 1999). LI et al.
(1997) observaram que EGFR foi mais expresso em ameloblastomas, tumores
odontogênicos queratocísticos e cistos dentígeros do que em cistos radiculares. EGFR
também pode ser um indicador do potencial de ninhos epiteliais remanescentes da
odontogênese desenvolverem cistos e tumores odontogênicos (BAUMGART et al.,
2007).
O sistema Notch foi inicialmente descrito em Drosophilas e o primeiro gene
homólogo de Notch em mamíferos foi observado em um subgrupo de leucemias de
células T em humanos. A ativação do sistema Notch é essencial na modulação das
_______________________________________________________________________Introdução 8
decisões e na determinação do destino celular (ARTAVANIS-TSAKONAS et al., 1999;
KUMAMOTO et al., 2008). Os receptores Notch (Notch 1, Notch 2, Notch 3 e Notch 4)
são clivados por proteinases quando há união com seus ligantes (Delta 1, Delta 3,
Delta 4, Jagged 1 e Jagged 2), que são expressos por células adjacentes,
caracterizando a ativação do sistema Notch. Após a ativação, o domínio intracelular
livre do receptor entra no núcleo e interage com uma proteína ligada ao DNA para
ativar a transcrição de genes alvos selecionados. A atividade de Notch afeta a
diferenciação, proliferação e a apoptose, que são mecanismos importantes no
controle de vários processos de desenvolvimento, como neurogênese, somitogênese,
hematopoiese, vasculogênese diferenciação e crescimento de queratinócitos, além de
desenvolvimento dentário (MITSIADIS et al., 1995; ARTAVANIS-TSAKONAS et al.,
1999; RANGARAJAN et al., 2001; HARPER et al., 2003). Distúrbios na função de
Notch tem sido associados a neoplasias, incluindo malignidades hematológicas e
tumores sólidos (KUMAMOTO; OHKI, 2008).
A ativação do sistema Notch pode agir tanto como um supressor quanto como
um promotor de tumor, dependendo do tipo celular, do contexto tecidual, nível de
expressão e potencial de se interagir com outras cascatas de ativação (MIELE et al.,
2006). No melanoma cutâneo, a ativação do sistema Notch representa um evento
precoce no crescimento tumoral e a manutenção da sua ativação sustenta a
progressão tumoral (MASSI et al., 2006). A ativação aberrante do sistema Notch é
frequentemente oncogênica, com os receptores Notch agindo como oncogenes. Alta
expressão de receptores Notch e seus ligantes foram observados em linfoma de
_______________________________________________________________________Introdução 9
Hodgkin, leucemia linfóide crônica, mieloma múltiplo e leucemia mielóide aguda.
Além disso, expressão desregulada do sistema Notch também foi observada em
carcinomas de mama, próstata, pâncreas, rins, gliomas e meduloblastomas (MIELE et
al., 2006).
Recentemente, ZHANG et al. (2008) observaram que a ativação do sistema
Notch é crucial para a manutenção de células tronco pulpares no seu estado
indiferenciado. Além disso, a expressão dos receptores Notch 1, Notch 2 e Notch 3 foi
largamente
observada
em
ameloblastomas,
predominantemente
nas
células
neoplásicas centrais das ilhas tumorais, sugerindo que essas moléculas ativadas
podem contribuir para o controle da diferenciação das células neoplásicas e
supressão da proliferação celular em tumores odontogênicos (KUMAMOTO; OHKI,
2008). Entretanto, não há estudos que avaliem a expressão de receptores Notch em
lesões císticas odontogênicas.
A preservação da integridade física e metabólica das células epiteliais que
formam o revestimento cístico são essenciais para a manutenção das lesões císticas
odontogênicas. Além disso, diferenças na expressão de fatores de crescimento, genes
supressores de tumor, receptores de fatores de crescimento e proteínas envolvidas
na diferenciação celular podem explicar o comportamento biológico distinto das
lesões císticas odontogênicas. Assim, o estudo da expressão concomitante da
proteína p63, EGFR e receptor Notch 1 ou a expressão isolada de cada uma dessas
proteínas é relevante nesse grupo de lesões.
Revista da Literatura
________________________________________________________________Revista da Literatura 11
BROWNE (1975) discutiu a patogênese dos 3 cistos odontogênicos mais
comuns. Ele postula que o cisto radicular surge da proliferação dos restos epiteliais
de Malassez, devido a um foco de inflamação estimulada por necrose pulpar dos
dentes associados. A lesão progride pela expansão unicêntrica da pressão hidrostática
de seu conteúdo. O cisto dentígero surge a partir do exsudato inflamatório, que é
derivado das veias foliculares obstruídas por um dente retido e acumula entre o
epitélio reduzido do órgão dentário e a coroa do dente, também progredindo pela
expansão unicêntrica da pressão hidrostática do seu conteúdo. Já o queratocisto
odontogênico surge da proliferação dos resíduos da lâmina dental, possivelmente
como uma anormalidade hamartomatosa. O crescimento da lesão é dado pela
expansão multicêntrica devido à proliferação de grupos de células epiteliais
localizadas no revestimento cístico e por expansão unicêntrica da pressão hidrostática
do seu conteúdo.
SHRESTHA et al. (1992) avaliaram a expressão imunoistoquímica do receptor
do fator de crescimento epidérmico (EGFR) em 67 casos de cistos odontogênicos e 35
casos de tumores odontogênicos. Com relação aos cistos odontogênicos, observou-se
que 60% dos casos de queratocisto odontogênicos, 35% dos cistos radiculares e
47,4% dos cistos dentígeros apresentaram epitélio de revestimento cístico positivo
para EGFR. Caracterização citoquímica de EGFR no epitélio cístico foi do tipo
membranosa, como ocorre no epitélio normal. Nos tumores odontogênicos não foi
observada expressão de EGFR. Os autores concluem que devido a diversidade de
________________________________________________________________Revista da Literatura 12
expressão de EGFR sugere que não há ativação de EGFR pela ligação de EGF nas
lesões odontogênicas estudadas.
HEIKINHEIMO et al. (1993) avaliaram a expressão do fator de crescimento
epidérmico (EGF), fator de crescimento transformante (TGF)-alfa e receptor do fator
de crescimento epidérmico (EGFR) em dentes fetais humanos (da fase de capuz até a
formação inicial de tecido duro) e em vários tumores odontogênicos. RNAm de EGFR
e células positivas para EGFR foram localizadas principalmente no epitélio
odontogênico. A expressão de EGFR esteve sujeita à variação no tempo das
diferentes fases do desenvolvimento dentário. RNAm de EGF e TGF-alfa foram
detectados em dentes fetal apenas pela transcrição reversa da reação em cadeia da
polimerase (RT-PCR). No entanto, células positivas para EGF e TGF-alfa foram
observadas em elementos epiteliais do germe dental, sugerindo que os peptídeos
parcialmente provêm de fontes não-odontogênicas. Nos tumores odontogênicos,
RNAm de EGFR e células positivas para EGFR foram confinados ao epitélio
neoplásico. Transcritos de TGF-alfa, foram detectados em tumores odontogênicos
originados do epitélio odontogênico, epitélio e ectomesênquima odontogênico e do
exclusivamente do ectomesênquima odontogênico. Os autores concluíram que a
regulação do EGFR é importante na odontogênese humana. Além disso, o epitélio
odontogênico
é
o
principal
tecido-alvo
para
EGF
e
TGF-alfa
durante
o
desenvolvimento do dente. TGF-alfa e seus receptores também podem estar
envolvidos na tumorigênese odontogênica.
________________________________________________________________Revista da Literatura 13
LI et al. (1994) determinaram o padrão imunoistoquímico da expressão do
fator de crescimento transformante (TGF)-α, fator de crescimento epidérmico (EGF) e
TGF-β em tumores odontogênicos queratocísticos (n=27), cistos dentígeros (n=10) e
radiculares (n=10). O revestimento epitelial de todos os casos se mostrou positivo
para TGF-α, o qual estava localizado principalmente nas camadas basal e suprabasal.
O epitélio dos tumores odontogênicos queratocísticos expressou altos níveis de TGFα, quando comparado aos níveis apresentados pelos cistos radicular e dentígero. A
expressão de EGF foi similar em todos os grupos, mais fraca que aquela de TGF-α e
predominantemente suprabasal. TGF- α e EGF foram também observados em células
endoteliais, fibroblastos e células inflamatórias localizadas nas cápsulas císticas. A
expressão mais intensa de TGF-β foi nas cápsulas fibrosas, independente da lesão. A
expressão diferencial de TGF- α e EGF nos diferentes tipos de cistos odontogênicos
indica que esses fatores de crescimento podem estar envolvidos na patogênese
dessas lesões, por via autócrina e/ou parácrina.
FORMIGLI et al. (1995) avaliaram a natureza dos processos de reabsorção
óssea em cistos radiculares. Para o estudo, fragmentos de cistos associados ao tecido
ósseo adjacente foram analisados por métodos histoquímicos e ultraestruturais. Além
disso, o conteúdo cístico foi avaliado quanto à presença de citocinas com atividade
osteolítica. As cápsulas císticas frequentemente apresentavam extensões, as quais
infiltravam o tecido ósseo adjacente. Várias células positivas para a fosfatase ácida
resistente ao tartrato foram observadas nas extensões intra-ósseas da cápsula cística
e em contato direto com o tecido ósseo. Adicionalmente, células mononucleares
________________________________________________________________Revista da Literatura 14
positivas para TRAP também estavam presentes na cápsula cística. Altos níveis de
prostaglandina E2 (PGE2) e interleucina-6 (IL-6) foram detectados nos fluidos
císticos. Os autores concluíram que a reabsorção óssea ativa pode contribuir
significativamente para o crescimento dessas lesões no complexo maxilo-mandibular.
MITSIADIS et al. (1995) avaliaram a expressão de Notch 1, Notch 2, e Notch 3
em germes dentários de ratos. Os genes Notch 1, 2 e 3 mostram padrões de
expressão distintos de acordo com o tipo de célula. A expressão de Notch é ausente
em células que estão em íntimo contato como o mesênquima, fato que pode ser
importante para aquisição da diferenciação dos ameloblastos, sugerindo que o
mesênquima regula negativamente a expressão de Notch no epitélio. Além disso, os
resultados revelam que a expressão de Notch foi inibida nas células epiteliais
odontogênicas adjacentes ao mesênquima, indicando que o epitélio odontogênico
necessita de um sinal derivado do mesênquima para manter a inibição da expressão
de Notch. Houve super expressão de Notch no mesênquima odontogênico numa
região embebida em ácido retinóico (50-100 microgramas/ml), mas não no fator de
crescimento fibroblástico-2 (100-250 microgramas/ml). Estes dados sugerem que os
genes Notch podem estar envolvidos na mediação de alguns efeitos biológicos do
ácido retinóico durante o desenvolvimento normal e após a exposição teratogênica.
MEGHJI et al. (1996) avaliaram a atividade biológica de citocinas osteolíticas
potentes em 6 tumores odontogênicos queratocísticos. Fragmentos das lesões
obtidos de remoção cirúrgica foram mantidos em culturas e os meios de cultura
foram avaliados com relação à atividade e capacidade de reabsorção óssea das
________________________________________________________________Revista da Literatura 15
citocinas – interleucina-1 (IL-1), interleucina-6 (IL-6) e fator de necrose tumoral
(TNF). Todas as lesões avaliadas apresentaram bioatividade de IL-1 e IL-6;
entretanto, a bioatividade de TNF foi imensurável. Os meios contendo os fragmentos
de cistos dialisados estimularam a reabsorção óssea e este processo foi
completamente inibido por um anticorpo monoclonal que neutralizava IL-1 alfa e IL-1
beta.
As
células
epiteliais
do
revestimento
cístico
apresentaram
também
imunoexpressão de IL-1 alfa e IL-6, mas não expressaram IL-1 beta e TNF. Desta
forma, os autores propuseram que IL-1 alfa é a principal citocina osteolítica produzida
por tumores odontogênicos queratocísticos e que IL-6 e IL-1 podem contribuir para o
crescimento da lesão promovendo proliferação das células epiteliais e reabsorção
óssea, respectivamente.
LI et al. (1997) estudaram a expressão imunoistoquímica do fator de
crescimento transformante alfa (TGF-alfa), fator de crescimento epidérmico (EGF) e
TGF-beta em cistos radiculares, cistos dentígeros e tumores odontogênicos
queratocísticos. Para avaliar os fatores de crescimento propostos, foram realizadas
reações imunoistoquímicas em 27 tumores odontogênicos queratocísticos, 10 cistos
dentígeros e 10 cistos radiculares, utilizando a técnica de estreptavidina-biotina
peroxidase com anticorpos monoclonais contra TGF-alfa (clone 213-4,4) e TGF-beta
(clone TB21), e um anticorpo policlonal dirigido contra EGF (Z-12). Os epitélios de
revestimento de todos os cistos epiteliais apresentaram positividade para TGF-alfa, a
qual foi localizada principalmente nas camadas basal e suprabasal. O revestimento
epitelial dos tumores odontogênicos queratocísticos expressou os níveis mais altos de
________________________________________________________________Revista da Literatura 16
TGF-alfa, quando comparado ao epitélio dos cistos dentígeros e radiculares. A
positividade para EGF foi semelhante em todos os grupos de cistos, sendo mais fraca
do que a expressão de TGF-alfa e predominantemente na camada suprabasal. TGFalfa e EGF também foram detectados em células endoteliais, fibroblastos e células
inflamatórias na cápsula fibrosa das lesões císticas. TGF-beta foi o fator de
crescimento que apresentou maior positividade na cápsula fibrosa, independente do
cisto estudado. Com esses resultados, os autores sugerem que TGF-alfa, EGF e TGFbeta possam estar envolvidos na patogênese dessas lesões, por via autócrina e/ou
parácrina.
ARTAVANIS-TSAKONAS et al. (1999) em revisão de literatura, postularam que
o estabelecimento de sinais externos entre células vizinhas por meio de receptores
Notch pode amplificar e consolidar diferenças moleculares, os quais eventualmente
determinam o destino celular. Assim, a ativação de Notch controla como as células
respondem a estímulos de desenvolvimento intrínsecos e extrínsecos que são
necessários para programas de desenvolvimento específico. A ativação de Notch
afeta a implementação da diferenciação, proliferação e programas apoptóticos,
proporcionando uma ferramenta de desenvolvimento geral para influenciar a
morfogênese e a formação de órgãos.
TANIKAWA; BAWDEN (1999) avaliaram a expressão imunoistoquímica de
fosfolipase PLCgamma, fator de crescimento epidérmico (EGF), fator de crescimento
derivado de plaquetas (PDGF) e receptores de fatores de crescimento fibroblástico
(FGF) nas células odontogênicas do órgão do esmalte durante os eventos
________________________________________________________________Revista da Literatura 17
diretamente relacionados à formação do esmalte em primeiros molares de rato.
Houve co-expressão imunoistoquímica de PLCgamma, EGF, PDGF e receptores de
FGF nos pré-ameloblastos da alça cervical, adjacente às células mesenquimais
indiferenciadas da polpa dentária. Esta expressão desapareceu logo após o início da
mineralização
dentinária.
Todos
os
quatro
anticorpos
foram
expressos
na
extremidade proximal da diferenciação pré-secretora de ameloblastos ao nível do
início de deposição da matriz de pré-dentina e continuou nos ameloblastos
secretores. Com esses resultados, parece que EGF, PDGF e FGF têm papéis na
diferenciação dos ameloblastos e no controle das funções celulares na pré-secreção e
secreção dos ameloblastos.
AGARAM et al. (2000) avaliaram a perda de heterozigosidade de genes
supressores de tumor em tumores odontogênicos queratocísticos. Foram estudados
10 tumores odontogênicos queratocísticos, utilizando um microdissecador e análise
da genotipagem semi-quantitativa. A análise incluiu 10 genes supressores de tumor
comuns, bem como o gene PTCH que está mutado na síndrome do carcinoma
nevóide basocelular. A perda de heterozigosidade foi observada em 7 de 10 casos,
com uma freqüência entre 11% e 80% dos genes estudados. Os genes que
apresentaram a frequência mais alta de perda de heterozigosidade foram os genes
p16, p53, PTCH, e MCC (75%, 66%, 60% e 60%, respectivamente). Cistos satélites
foram associados com uma maior freqüência de perda alélica (p=0,02). Os autores
concluíram que um número significativo de tumores odontogênicos queratocísticos
mostrou a perda clonal de heterozigotos comuns de genes supressores de tumor. A
________________________________________________________________Revista da Literatura 18
detecção de mutações clonais no DNA genômico destes cistos suporta a hipótese de
que eles são neoplásicos e não lesões císticas de desenvolvimento.
GÜLKESEN et al. (2001) avaliaram a expressão imunoistoquímica do antígeno
nuclear de proliferação celular (PCNA), receptor do fator de crescimento epidérmico
(EGFR) e proteína p53 em 12 casos de adenoma da paratireóide. Correlações entre
os índices de PCNA, expressão de EGFR, proteína p53, idade, níveis séricos de
paratormônio, Ca e P, e diâmetro tumoral foram analisados. Índice de PCNA foi 45,8
+/-33,1 (média +/- desvio padrão). Cinco casos (41,67%) foram positivos para EGFR.
Todos os casos foram p53 negativos. Houve uma correlação entre índice de PCNA e
nível sérico do paratormônio (p=0,036). De acordo com estes resultados, a síntese
do paratormônio é elevada quando a atividade proliferativa dos adenomas
paratireoidianos é elevada. Quatro dos cinco pacientes EGFR-positivos tinham menos
de 35 anos de idade. Estes dados podem indicar que a formação do adenoma da
paratireóide em pacientes jovens está relacionada com um mecanismo envolvendo
EGFR. Ausência da expressão p53 sugere que a mutação p53 não é um componente
comum dos adenomas da paratireóide.
NAIR et al. (2002) descreveram 3 casos de cistos radiculares com
revestimento cístico formado por células epiteliais ciliadas, além de 1 caso de cisto
radicular infectado com Actinomyces. Entre 256 casos de cistos radiculares, 3 casos
apresentavam epitélio ciliado, os quais foram avaliados em microscópio eletrônico de
transmissão para determinar a estrutura das células ciliadas. Duas das lesões
continham epitélio escamoso estratificado. Todas as 3 lesões afetavam os premolares
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superiores. A luz de 1 destes cistos também revelou a presença de colônias típicas de
Actinomyces, as quais se apresentavam tipicamente com aspecto de raios de sol. À
microscopia de luz, as células ciliadas se dispunham em epitélio pseudo-estratificado.
A microscopia eletrônica de transmissão revelou células ciliadas com núcleo basal,
rico em eucromatina e citoplasma contendo numerosas mitocôndrias e retículo
endoplasmático rugoso. A borda luminal das células ciliadas apresentava cílios bem
organizados e distintos, e se apresentavam em várias direções. Além disso, vários
neutrófilos eram observados entre os espaços intercelulares das células ciliadas.
Embora o componente estratificado escamoso dos epitélios de cistos radiculares
relatados possa ser derivado dos restos de Malassez, as células epiteliais ciliadas
podem ser de origem sinusal. Agentes microbianos presentes nos canais radiculares
podem avançar para cistos radiculares, particularmente nos cistos em bolsa, podendo
acometer o seio maxilar.
TSUKAMOTO et al. (2002) compararam tumores odontogênicos queratocísticos
associados ou não
a terceiros molares
inferiores impactados. Radiografias
panorâmicas de tumores odontogênicos queratocísticos associados com terceiros
molares inferiores foram comparados a radiografias de tumores odontogênicos
queratocísticos não associados a terceiros molares inferiores impactados. A média de
idade dos pacientes das lesões associadas a dentes foi menor que a dos pacientes
com lesões não associadas a dentes. A área média dos cistos associados a dentes era
maior que aqueles não associados. Os autores concluíram que os tumores
________________________________________________________________Revista da Literatura 20
odontogênicos queratocísticos associados a dentes não erupcionados apresentam
tendência de crescimento mais rápido.
HARPER et al. (2003) em pertinente revisão da literatura, comentaram que o
primeiro gene homólogo de Notch em mamíferos foi descoberto em translocações
cromossômicas em um subgrupo de leucemias de células T humanas. Estudos
posteriores em humanos e animais mostraram que a sinalização de Notch tem papel
fundamental
em
vários
estágios
da
hematopoiese
e
também
regula
o
desenvolvimento ou homeostase de células em vários tecidos e órgãos. Assim, a
ocorrência de mutações que provocam uma ruptura na sinalização de Notch causa
uma grande quantidade de cânceres e distúrbios do desenvolvimento.
VERED et al. (2003) investigaram a presença de EGFR em uma série de
ameloblastomas. Para o estudo, foram utilizados 58 espécimes de ameloblastoma,
previamente fixados em formol e embebidos em parafina. Foram obtidos cortes, os
quais foram incubados com o anticorpo monoclonal anti-EGFR, clone 31G7. Controles
positivos e negativos determinaram a especificidade do anticorpo. A análise
imunoistoquímica se baseou na intensidade da expressão e na proporção de células
positivas, estabelecendo escores que variaram entre 0 e 2. Todos os espécimes foram
EGFR positivos, sendo que 8 (14%) casos apresentam o escore máximo de 2 e 19
(33%) apresentaram escore entre 1 e 2. Os autores concluíram que os
ameloblastomas são tumores EGFR positivos, e que agentes anti-EGFR podem reduzir
o tamanho dos tumores grandes e irressecáveis, permitindo intervenção cirúrgica
posterior.
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NAIR (2004) realizou uma revisão dos fatores relacionados a etiopatogênese
da periodontite apical e as causas relacionadas às falhas no tratamento endodôntico,
com persistência da lesão periapical. O autor postulou que a periodontite apical é
uma sequela originada de uma infecção endodôntica e manifesta como uma resposta
de defesa própria do hospedeiro a microrganismos patogênicos. Considerou essas
lesões como uma reação dinâmica entre fatores relacionados aos microrganismos e a
resposta de defesa do hospedeiro na interface entre a polpa radicular infectada e o
ligamento periodontal, resultando em inflamação local, reabsorção de tecidos duros,
destruição de outros tecidos periapicais e eventual formação de lesões periapicais. O
tratamento da periodontite apical, caracterizada como uma doença proveniente de
um canal radicular infectado consiste na eliminação ou redução significativa dos
microrganismos, e obturação do canal radicular para evitar reinfecção. Embora o
tratamento endodôntico tenha altas taxas de sucesso, ele pode falhar. A maioria das
falhas no tratamento é de natureza técnica, não conseguindo controlar e eliminar a
infecção no canal radicular. Além disso, outros fatores também podem contribuir para
a persistência da periodontite apical, como a formação de uma reação inflamatória
granulomatosa de corpo estranho associada a cristais de colesterol ou a materiais ou
substâncias exógenas.
PIATTELLI et al. (2004) avaliaram a expressão imunoistoquímica do fator de
crescimento transformante (TGF)-β1 em 30 cistos radiculares, 27 cistos dentígeros e
28 tumores odontogênicos queratocísticos. TGF-β1 foi avaliado em vasos sanguineos,
fibroblastos e epitélio escamoso do revestimento cístico. A expressão de TGF-β1 foi
________________________________________________________________Revista da Literatura 22
determinada, em cada espécime, pela avaliação de 1.000 células no revestimento
epitelial e 500 células na cápsula fibrosa, contando as células positivas. O número de
vasos positivos foi avaliado em 10 campos de maior aumento. Uma expressão
estatisticamente superior foi observada nas camadas basal e suprabasal (p=0,0011),
epitélio
superficial
odontogênicos
(p=0,05)
e
células
queratocísticos, quando
estromais
(p=0,0002)
comparada com cistos
de
tumores
radiculares
e
dentígeros. Essas diferenças sugerem que o controle do ciclo celular pode ser
anormal em tumores odontogênicos queratocísticos. Essas lesões podem ter um
potencial de crescimento intríseco, não apresentando pelas outras lesões císticas.
KICHI et al. (2005) avaliaram a expressão imunoistoquímica da proteína p53,
Ki-67 e bcl-2, além da técnica TUNEL no revestimento epitelial de tumores
odontogênicos queratocísticos e cistos dentígeros. Células TUNEL-positivas foram
observadas na camada superficial e em células basais e intermediárias dos tumores
odontogênicos queratocísticos e cistos dentígeros. Nos tumores odontogênicos
queratocísticos, as células da camada intermediária foram significativamente mais
positivas para Ki67 e proteína p53. Bcl-2 foi positivo somente nas células da camada
basal de tumores odontogênicos queratocísticos. Estes resultados sugerem que a
proliferação e morte celular são reguladas em associação com as proteínas
relacionadas a apoptose no revestimento epitelial de tumores odontogênicos
queratocísticos. Assim, eles se apresentam como lesões císticas e não como massas
tumorais.
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LO MUZIO et al. (2005) avaliaram a expressão imunoistoquímica da proteína
p63 em 123 casos de cistos odontogênicos, sendo 30 cistos foliculares, 35 cistos
radiculares, 53 queratocistos, 4 cistos odontogênicos calcificantes e 1 cisto
odontogênico glandular. Nos cistos radiculares, a p63 mostrou-se positiva não só na
camada basal e parabasal, mas também na camada intermediária. Aproximadamente
um terço dos casos apresentou uma percentagem entre 0% e 5% de células positivas
entre 0 e <5%, e os outros dois terços entre 6% e 50%. A proteína p63 mostrou
positividade restrita às camadas basal e parabasal do epitélio dos cistos dentígeros,
com a maioria dos casos apresentando entre 0% e 5% de células positivas. Por outro
lado, os queratocistos odontogênicos apresentaram uma imunoexpressão de p63
mais intensa e difusa, quando comparado aos outros cistos estudados. Esses achados
sugerem que a expressão p63 pode ser útil para identificar tipos de cistos com
fenótipos mais agressivos e invasivos, suportando a hipótese de uma proliferação
mais acentuada na camada suprabasal dos queratocistos odontogênicos.
STOLL et al. (2005) avaliaram o perfil da expressão de citoqueratinas em cistos
radiculares, dentígeros e tumores odontogênicos queratocísticos. Trinta casos de
cistos dentígeros e radiculares, respectivamente, bem como 15 casos de tumores
odontogênicos queratocísticos foram estudados. Expressão das citoqueratinas 5/6, 7,
10, 13, 17, 19 e 20 foi avaliada, além da expressão imunoistoquímica de Ki-67. A
expressão da citoqueratina 17 foi observada em 93,3% dos tumores odontogênicos
queratocísticos, mas foi observada em apenas 35,0% dos cistos dentígeros e
radiculares (p<0,001). Citoqueratina 19 foi detectada em 48,3% dos cistos
________________________________________________________________Revista da Literatura 24
dentígeros e radiculares e todos os casos de tumores odontogênicos queratocísticos
foram negativos (p<0,002). Os autores concluíram que a detecção imunohistoquímica
das citoqueratinas 17 e 19 parece ser um parâmetro adicional valioso na distinção
entre os tumores odontogênicos queratocísticos e os outros cistos odontogênicos,
especialmente os cistos dentígeros e radiculares.
TAKEDA et al. (2005) avaliaram a prevalência de células ciliadas e mucosas no
revestimento epitelial de cistos radiculares, dentígeros e tumores odontogênicos
queratocísticos. As células mucosas foram encontradas em 20,8% de todos os cistos
examinados, enquanto as células ciliadas foram encontradas em 11,4% dos casos. As
células ciliadas foram quase sempre acompanhadas por células mucosas. A
prevalência de células mucosas nos cistos radicular e dentígero, e de células ciliadas
no cisto radicular foram maiores na maxila do que na mandíbula. Por outro lado, a
prevalência de células mucosas e ciliadas nos tumores odontogênicos queratocísticos
e de células ciliadas nos cistos dentígeros foram maiores na mandíbula que na
maxila. Os resultados do presente estudo indicam uma origem metaplásica das
células mucosas e cilidadas no revestimento epitelial das lesões císticas estudadas,
mas a causa e o significado biológico deste fenômeno ainda são desconhecidos.
CLARK et al. (2006) avaliaram as características morfológicas e a expressão
imunoistoquímica da proteína p53, Ki-67 e receptor do fator de crescimento
epidérmico (EGFR) em 16 casos de tumores odontogênicos queratocísticos antes e
após o tratamento por descompressão. As expressões de p53 e Ki-67 não se
mostraram diferentes antes e após a descompressão. Não foi observada correlação
________________________________________________________________Revista da Literatura 25
entre inflamação ou tempo de descompressão e as expressões de EGFR, p53 e Ki-67.
O grau de modificação morfológica do revestimento epitelial cístico foi variável e a
redução do tamanho dos cistos foi considerável (média de 47,6%). Os autores
concluíram que as alterações morfológicas do revestimento epitelial não pode ser
correlacionada com as expressões de p53, Ki-67 e EGFR, nem com a redução do
tamanhos das lesões ou com o tempo de descompressão.
MENEZES et al. (2006) determinaram a expressão imunoistoquímica de RANKL
e osteoprotegerina (OPG) associada à destruição óssea em cistos e granulomas
periapicais. Os autores utilizaram 20 lesões periapicais crônicas (10 granulomas
periapicais e 10 cistos radiculares), as quais foram coletadas após cirurgia apical,
fixadas em formol 10% e processadas histologicamente. Em seguida, as reações
imunoistoquímicas foram realizadas. Em ambas as lesões, neutrófilos, macrógafos,
células endoteliais e linfócitos expressaram RANKL e OPG. Células epiteliais também
foram positivas para RANKL e OPG nos cistos radiculares. Foi realizada também
análise quantitativa, estabelecendo uma relação entre o número de células positivas e
o número total de células no campo microscópico. A relação de células RANKL
positivas/total de células foi maior que a relação de célula OPG positivas/número total
de células nos granulomas (p<0,0012) e cistos periapicais (p<0,0001). As relações de
células OPG positivas/número total de células (p<0,0001) e células RANKL
positivas/número total de células (p<0,03) foi maior nos granulomas do que nos
cistos. Entretanto, a diferença na relação células RANKL positivas/células OPG
positivas nos granulomas e cistos periapicais não foi estatisticamente significante. De
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acordo com os autores, esses achados indicam que a presença de RANKL e OPG em
cistos e granulomas periapicais sugerem o envolvimento dessas proteínas no
desenvolvimento de lesões periapicais.
MIELE et al. (2006) realizaram uma extensa revisão sobre os achados mais
recentes sobre a ativação ou sinalização de Notch em câncer e discute as suas
implicações clínicas potenciais. Os autores comentaram que as funções e os papéis
do sistema Notch na patologia e fisiologia humana são estudados por um grande
número de investigadores. Enquanto a via de sinalização canônica é simples, as
consequências da ativação de Notch sobre a diferenciação e o destino das células são
complexas e dependem do contexto e local onde ocorrem. Há um crescente interesse
em modular a sinalização de Notch com objetivos terapêuticos, visto que esse
sistema tem papel importante em vários tipos de neoplasias malignas, benignas,
desordens imunes e neurológicas. Algumas drogas que modular a ativação de Notch
já são utilizadas em ensaios clínicos e outras estão ainda em desenvolvimento. Além
disso, o papel da sinalização de Notch em células tronco normais e transformadas
tem sido intensamente investigado.
VARINAUSKAS et al. (2006) avaliaram a prevalência de cistos maxilomandibulares dos arquivos da Universidade de Kaunas durante o período de 19862004, e outros aspectos de interesse clínico e terapêutico, tais como suas
características clínicas, mudanças que causaram nas estruturas faciais e os dentes
que tinham causado a patologia. Um total de 850 casos foi estudado, sendo 455
homens e 395 mulheres. A idade dos pacientes variou de 4 a 87 anos, com uma
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média de 35,8. Mais da metade dos cistos diagnosticados (63%) localizavam na
maxila e restante (37%) deles na mandíbula. As queixas comuns dos pacientes eram
aumento de volume, dor, presença de fistula, mobilidade aumentada dos dentes e
parestesia. As lesões foram mais frequentemente observadas na região dos dentes
anteriores inferiores, seguida da região superior anterior, pré-molares superiores,
pré-molares inferiores, molares superiores e molares inferiores. Foi observado que os
cistos odontogênicos podem se apresentar em ambos os gêneros; os cistos maxilares
são 1.5 vezes mais freqüentes que os cistos mandibulares. Essa patologia pode
igualmente afetar ambos os lados das maxilas, mas a maioria dos cistos que são
diagnosticados são da região anterior da maxila. O tratamento para cistos é cirúrgico.
BAUMGART et al. (2007) avaliaram a expressão imunoistoquímica do receptor
do fator de crescimento epidérmico (EGFR) em folículos pericoronários, como um
possível fator preditivo de progressão para cistos e tumores odontogênicos. A
expressão de EGFR foi analisada no epitélio reduzido do órgão dentário e em ninhos
de epitélio odontogênico associados a folículos de molares impactados. Amostras de
mucosa bucal normal foram utilizadas para comparação. A co-expressão de EGFR na
membrana plasmática e citoplasma foi observada na mucosa bucal normal
principalmente nas camadas celulares proliferativas (basal e suprabasal), diminuindo
a expressão nas células das camadas mais superficiais. Sete ninhos de epitélio
odontogênico apresentaram positividade apenas na membrana e a maioria
apresentou tanto expressão restrita ao citoplasma quanto a expressão combinada
citoplasma/membrana. Os padrões observados no epitélio reduzido do órgão dentário
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foram o combinado (citoplasma/membrana) e apenas citoplasmático. De acordo com
esses achados, os autores sugerem que a expressão de EGFR restrita à membrana
plasmática em ninhos de epitélio odontogênico pode ser um indicador potencial para
o início da formação de cistos e tumores odontogênicos .
GROSSMANN et al. (2007) determinaram o perfil demográfico de cistos
odontogênicos e não odontogênicos em uma população brasileira, diagnosticados
histologicamente num período de 50 anos. As informações clínicas foram obtidas dos
prontuários dos pacientes, arquivados no Serviço de Patologia Oral da Faculdade de
Odontologia da Universidade Federal de Minas Gerais (UFMG), Belo Horizonte, Brasil,
durante o período de 1953-2003. Entre 19.064 biopsias orais, 2.905 (15.2%)
apresentaram critérios histopatológicos de cistos odontogênicos (CO) e nãoodontogênicos (NCO). Destes, 2.812 espécimes (14.7%) foram diagnosticados como
CO e 93 (0.5%) representaram NCO. Os 3 CO mais frequentemente diagnosticados
foram o cisto radicular (61.0%), cisto dentígero (25.3%), e o queratocisto
odontogênico (7.2%). O NCO mais freqüente foi o cisto do ducto nasopalatino
(2.2%). Os resultados demonstram que há uma larga escala de CO e de NCO, com
alguns cistos que têm uma predileção por idade, o gênero, e a localização. Também
foram apresentados aspectos demográficos e características clínicas destes cistos.
LEFORT et al. (2007) avaliaram a expressão gênica de Notch 1 e p53 em
queratinócitos normais, tumorais e células em cultura de carcinomas epidermóides.
Os autores observaram que a supressão da sinalização de Notch em queratinócitos
humanos, associada com o gene ras ativado, é suficiente para causar a formação de
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carcinoma epidermóide agressivo. Além disso, demonstraram que a expressão e
atividade do gene Notch 1 são substancialmente inibidas em cultura de células de
queratinócitos neoplásicos e em carcinomas epidermóides, com a expressão deste
gene estando sob controle do gene p53. Assim, o gene Notch 1 é um alvo de p53
com um papel na supressão tumoral em queratinócitos neoplásicos.
KUMAMOTO; OHKI (2008) avaliaram a expressão dos receptores Notch 1, 2 e
3 e seus ligantes Delta 1 e Jagged 1 em ameloblastomas e germes dentários normais.
Amostras teciduais de 9 germes dentários e 32 ameloblastomas foram avaliados por
RT-PCR e por hibridização in situ para determinar a expressão das proteínas
estudadas. A expressão do RNAm de Notch1, Notch2, Notch3, Delta1 e Jagged1 foi
detectada em todas as amostras de tecidos odontogênicos normais e neoplásicos.
Nos germes dentários, os receptores Notch foram expressos no epitélio odontogênico
(exceto no epitélio interno do esmalte), e a expressão dos ligantes de Notch foi
menor no epitélio interno do esmalte do que nos outros componentes epiteliais.
Componentes odontogênicos mesenquimais foram fracamente positivos para todas as
proteínas analisadas. Os ameloblastomas apresentaram positividade para os
receptores Notch e seus ligantes nas células neoplásicas poliédricas centrais. Notch 2,
Delta 1 e Jagged 1 foram expressos em algumas células neoplásicas vizinhas à
membrana basal. A expressão dos receptores Notch e seus ligantes não foi observada
nas células escamosas e granulares nos diversos subtipos histológicos do
ameloblastoma. Células do estroma foram fracamente positivas para as moléculas
sinalizadoras de Notch. Os autores concluíram que a expressão dos receptores Notch
________________________________________________________________Revista da Literatura 30
e seus ligantes em germes dentários e ameloblastomas sugerem que a sinalização de
Notch pode controlar a diferenciação e a proliferação celular do epitélio odontogênico
normal e neoplásico.
MALCIC et al. (2008) avaliaram a expressão da tríade da histidina frágil (FHIT)
e da proteína p53 em tumores odontogênicos queratocísticos, cistos radicular e
dentígero. Para o estudo, foram utilizadas a técnica de imunoistoquímica e genética
molecular, incluindo a perda de heterozigosidade (LOH) e sequenciamento genético.
a expressão da proteina FHIT foi diferente entre os grupos. A intensidade de
expressão aberrante (negativa) da proteína FHIT foi diferente entre as lesões
(p=0,00078), sendo maior nos tumores odontogênicos queratocísticos do que nos
cistos radiculares e cistos dentígeros. Embora a maioria dos casos tenha sido
negativa para a proteína FHIT, nos casos positivos a expressão foi citoplasmática,
localizada principalmente na camada suprabasal dos tumores odontogênicos
queratocísticos e na camada basal dos cistos radiculares e cistos dentígeros. A
intensidade da imunoexpressão da proteína p53 foi fraca, sendo maior no tumor
odontogênico queratocístico; entretanto, a análise estatística não mostrou diferença
entre as lesões (p=0,9344). Perda de heterozigosidade foi detectada em 22,6% e
12,9% das lesões para FHIT e p53, respectivamente. Mutação do gene p53 no códon
237 foi observada em apenas dois espécimes (1 tumor odontogênico queratocístico e
1 cisto dentígero). Das seis amostras congeladas, três apresentaram perda de
heterozigosidade do gene FHIT (2 cistos radiculares e 1 tumor odontogênico
queratocístico). Tumores odontogênicos queratocísticos apresentaram perda dos
________________________________________________________________Revista da Literatura 31
exons 6-7 no locus FHIT e mutação no códon 237 no locus p53. Com esses dados, os
autores concluírem que aberrações dos genes p53 e FHIT poderiam ser consideradas
marcadores responsáveis para o desenvolvimento de lesões odontogênicas.
NADALIN (2008) avaliou a expressão imunoistoquímica de syndecan-1
(CD138), Ki-67, p53, α-actina de músculo liso e MMP-2 em cistos radiculares (CR),
cistos dentígeros (CD) e tumores odontogênicos queratocísticos (TOQ). Além disso,
avaliou também a intensidade de expressão de syndecan-1. O tumor odontogênico
queratocístico apresentou positividade estatisticamente superior para Ki-67 na
camada suprabasal (p<0,001) em relação às outras lesões estudadas. Nos cistos
radiculares, observou-se correlação positiva entre a expressão da proteína p53 e Ki67 basal (p=0,03), expressão (p=0,02) e intensidade (p=0,0001) de syndecan-1,
além de correlação positiva entre a expressão de Ki-67 e intensidade de syndecan-1
(p=0,01) e entre a expressão e intensidade de syndecan-1 (p<0,001). Diferente do
que ocorreu nos cistos radiculares, nos tumores odontogênicos queratocísticos a
positividade de Ki-67 na camada suprabasal correlacionou positivamente com
expressão (p=0,01) e intensidade (p=0,01) de syndecan-1. A expressão de α-actina
de músculo liso foi observada em 34,2% dos cistos radiculares, 36,3% dos cistos
dentígeros e 46,9% dos tumores odontogênicos queratocísticos, enquanto a
expressão de MMP-2 foi positiva em praticamente todos dos casos, sendo 97% dos
CRs, 90,9% dos CDs e 94% dos TOQs. A expressão de MMP-2 foi significativamente
mais forte nos CRs (p=0,009). O autor concluiu que nos cistos radiculares e tumores
________________________________________________________________Revista da Literatura 32
odontogênicos queratocísticos, syndecan-1, miofibroblastos e MMP-2 parecem ter
papel importante na progressão das lesões.
NG et al. (2008) investigaram a expressão de receptores Notch, in vivo e in
vitro, em células epiteliais do cordão umbilical humano. Secções de cordão umbilical
foram analisadas com anticorpos específicos para Notch 1, 2, 3 e 4. Expressão dos
receptores Notch in vitro foi determinada por RT-PCR e a expressão protéica foi
avaliada pela técnica de Western Blot. Usando um sistema da cultura tridimensional
organotipico que promove a diferenciação epidérmica terminal, a expressão de Notch
foi analisada e mudanças no nível da expressão foram analisadas por meio da PCR
quantitativa em tempo real. Imunocoloração dos tecidos epiteliais do cordão umbilical
revelou a expressão de todos os quatro receptores Notch, com distribuição espacial
diferencial. A expressão de RNAm de Notch e sua proteína codificada foi observada
no cordão umbilical in vitro. Especificamente, Western Blot revelou a presença de
unidade transmembrana do receptor Notch 1 heterodimérico ativado células do
cordão umbilical e queratinócitos epidérmicos. Em cultura organotipica, o RNAm de
Notch foi expresso nas células do cordão umbilical e na superfície das camadas
epiteliais diferenciadas. Os autores concluíram que as células do cordão umbilical
expressam receptores Notch, assim como queratinócitos epidérmicos. A presença de
Notch tem implicações para o seu envolvimento na diferenciação programada de
tecido epitelial estratificado.
PANELOS et al. (2008) avaliaram a expressão imunistoquímica de Notch 1 e
seus ligantes, Jagged 1, Jagged 2 e Delta-like 1, em uma série de carcinomas
________________________________________________________________Revista da Literatura 33
cutâneos pré-invasivos e invasivos, incluindo
4 queratoses solares, 5 casos de
doença de Bowen, 5 carcinomas epidermóides de pele exposta ao sol, 6 carcinomas
epidermóides de pele protegida do sol e 14 carcinomas basocelulares de diferentes
tipos histológico (nodular, tipo superficial, esclerodermiforme/infiltrativo e basoescamoso). Expressão do Notch 1 foi diminuída em queratoses solares e carcinomas
epidermóides invasivos localizados na pele exposta ao sol. Em contraste, marcação
do Notch 1 foi observada nos casos de doença de Bowen extragenitais, assim como
nos órgãos genitais (pênis), onde o papiloma vírus humano está relacionado à sua
patogênese e carcinomas epidermóides invasivos de áreas não expostas ao sol. A
expressão de Notch 1 foi detectada em carcinomas basocelulares superficiais e
nodulares, enquanto os tipos esclerodermiforme/infiltrativo e baso-escamoso
mostraram uma baixa ou ausente expressão de Notch 1. As proteinas Jagged 1,
Jagged 2 e Delta-1 foram expressas em todos os tecidos examinados. Esses achados
mostram expressão divergente de Notch 1 em cânceres de pele, dependendo da
localização anatômica e do tipo histológico do tumor. Assim, como a expressão de
Notch 1 foi diminuída em lesões associadas a fotocarcinogênese pela radiação UV,
Notch 1 pode desempenhar um papel de supressor de tumor. Adicionalmente, a
expressão de Notch 1 foi mínima em subtipos de carcinoma basocelular com maior
risco
de
recorrência
(esclerodermiforme/infiltrativo
e
baso-escamoso),
em
comparação com os tipos nodulares e superficiais.
SHI et al. (2008) avaliaram a expressão de receptores Notch e seus ligantes no
epitélio de transição normal da bexiga e no carcinoma de células transicionais da
________________________________________________________________Revista da Literatura 34
bexiga, correlacionando sua expressão com suas características clínicas e patológicas.
Para o estudo, os autores avaliaram a expressão imunoistoquímica de Notch 1, 2, 3 e
seus ligantes Jagged 1 e Delta 1 em 70 casos de carcinoma de bexiga, 10 amostras
de urotélio normal e em 2 linhagens celulares. RT-PCR e Western Blot também foram
utilizados para análise da expressão de Notch 1 e Jagged 1. Todos os 5 tipos de
fatores de Notch foram intensamente positivos no epitélio de transição normal da
bexiga, mas a expressão foi significativamente diminuída nos tecidos tumorais. Além
disso, a expressão de 5 genes em tumores papilares foi menor do que em tumores
invasivos, mas apenas o Notch 1 e Jagged 1 mostrou uma diferença estatisticamente
significativa. Análise de regressão de Cox identificou a expressão de Jagged1 como
um fator independente para o prognóstico de pacientes com carcinoma de células
transicionais (RR 3,09, p=0,011). Concluiu-se que o padrão de expressão da família
Notch em carcinoma papilar de transição da bexiga é diferente daquele em carcinoma
invasivo de células transicionais da bexiga. Baixa expressão do Notch 1, bem como
Jagged 1 é potencialmente um marcador útil para sobrevida em pacientes com
carcinoma papilar de células transicionais da bexiga.
ZHANG et al. (2008) avaliaram o quanto o sistema Notch regula a
diferenciação de células tronco pulpares humanas em odontoblastos. Os autores
observaram que a super-expressão do ligante de Notch, Jagged 1, ativou a via de
sinalização de Notch em células tronco pulpares. Jagged 1 inibiu, in vitro, a
diferenciação das células tronco pulpares em odontoblastos. Células tronco pulpares
expressando Jagged 1 não conseguiram formar tecido mineralizado in vivo. Além
________________________________________________________________Revista da Literatura 35
disso, a super-expressão do domínio intra-celular ativado Notch 1 também inibiu a
diferenciação de células tronco pulpares em odontoblastos. Dessa forma, os autores
concluíram que a ativação do sistema Notch pode inibir a diferenciação de células
tronco pulpares em odontoblastos.
LIMA (2009) avaliou a expressão imunoistoquímica comparativa de PTHrP e
seu receptor PTH/PTHrP tipo I no revestimento epitelial e na cápsula fibrosa de 35
cistos radiculares, 22 cistos dentígeros e 17 tumores odontogênicos queratocísticos.
Comparando a expressão de PTHrP no epitélio cístico das 3 lesões estudadas, não se
observou diferença estatística significante (p=0,9), o mesmo observado quanto a
expressão do receptor PTH/PTHrP (p=0,3). Entretanto, as intensidades de expressões
de PTHrP (p=0,01) e receptor de PTH/PTHrP (p=0,007) no epitélio cístico foram
significativamente mais fracas nos cistos radiculares, quando comparadas aos cistos
dentígeros e tumores odontogênicos queratocísticos. Na cápsula fibrosa, as
diferenças na expressão (p=0,1) e intensidade da expressão (p=0,9) de PTHrP entre
as lesões não foram estatisticamente significantes, o mesmo sendo observado na
intensidade de expressão do receptor PTH/PTHrP (p=0,7). A expressão do receptor
PTH/PTHrP na cápsula fibrosa dos cistos radiculares foi significativamente mais forte
(p=0,04), quando comparada à expressão nos cistos dentígeros e tumores
odontogênicos queratocísticos. Com esses achados, concluiu-se que a intensidade de
expressão de PTHrP e do seu receptor PTH/PTHrP-1R é significativamente mais fraca
no revestimento epitelial do cisto radicular, quando comparada ao cisto dentígero e
tumor odontogênico queratocístico. Além disso, a co-expressão de PTHrP e seu
________________________________________________________________Revista da Literatura 36
receptor PTH/PTHrP-1R em quase todos os casos analisados sugere um papel
importante dessas proteínas no desenvolvimento e crescimento dessas lesões.
YAN et al. (IN PRESS) identificaram o perfil genético relacionado ao Notch em
células de leucemia mielóide aguda resistentes a quimioterápicos e propor estratégias
para terapia dessas células droga-resistentes. Células droga-resistentes foram 65
vezes mais resistentes a adriamicina, quando comparadas às células não resistentes.
Nas células droga-resistentes, cDNA mostrou marcado aumento de colágeno e união
de genes relacionados à proliferação e diminuição dos genes relacionados à
transdução de sinal e fatores de transcrição, entre eles Notch. Os autores concluíram
que os genes relacionados à via de sinalização de Notch podem contribuir para
resistência de células de leucemia mielóide aguda a agentes quimioterápicos.
Proposição
___________________________________________________________________Proposição 38
O objetivo deste estudo foi analisar a expressão imunoistoquímica comparativa
da proteína p63, receptor do fator de crescimento epidérmico (EGFR) e Notch 1 no
revestimento
epitelial
de
odontogênicos queratocísticos.
cistos
radiculares,
cistos
dentígeros
e
tumores
Material e Métodos
_______________________________________________________________Material e Métodos 40
Seleção da Amostra
Foi realizado um estudo retrospectivo, cujos dados clínicos e epidemiológicos
foram obtidos dos formulários clínicos de encaminhamento das lesões ao Laboratório
de Patologia Bucal da Universidade de Ribeirão Preto. O estudo foi aprovado sem
restrições pelo Comitê de Ética em Pesquisa da Universidade de Ribeirão Preto,
registrado sob o ComÉt 085/06 (Anexo).
Para o estudo, foram selecionados 35 casos de cisto radicular, 22 de cisto
dentígero e 17 de tumor odontogênico queratocístico, pertencentes ao arquivo do
Laboratório de Patologia Bucal, Universidade de Ribeirão Preto, São Paulo,
diagnosticados entre 1994 e 2006, totalizando 74 casos. Consideraram-se como
critérios de inclusão no estudo: 1 - os casos de cisto radicular que apresentaram
cavidade cística bem formada, com tecido epitelial de revestimento se mostrando
bem diferenciado, pavimentoso e estratificado; 2 – os casos de cisto dentígero que
apresentavam informações clínicas e radiográficas confiáveis, proporcionando
diagnóstico inequívoco da lesão; 3 – disponibilidade de material arquivado em
parafina suficiente para confirmação histopatológica e para novos cortes histológicos,
os quais foram utilizados nas reações de imunoistoquímica.
Análise Histopatológica
A partir do material existente nos blocos de parafina, realizaram-se 2 novos
cortes com 5 µm de espessura, os quais foram corados com hematoxilina-eosina
(HE), e posteriormente analisados para descrição morfológica e confirmação do
_______________________________________________________________Material e Métodos 41
diagnóstico. Na descrição microscópica, foram avaliados diferentes aspectos nas
lesões císticas estudadas:
1. Característica do epitélio de revestimento cístico – hiperplásico ou nãohiperplásico. No cisto radicular, foram classificados com epitélio não-hiperplásico
aqueles com até 10 camadas celulares; no cisto dentígero até 6 camadas celulares e
no tumor odontogênico queratocístico, foi considerado epitélio normal o que
apresentava as características típicas da lesão, com paraqueratina superficial
corrugada, células da camada basal dispostas em paliçada e com cerca de 6 camadas
celulares.
2. Intensidade da reação inflamatória na cápsula cística foi classificada em leve
(escassas células inflamatórias focais ou dispersas no tecido conjuntivo) ou intensa
(grande quantidade de células inflamatórias difusas ou dispersas no tecido conjuntivo
adjacente ao revestimento epitelial).
Reações imunoistoquímicas
Após a revisão histopatológica e confirmação do diagnóstico, selecionou-se os
casos de cistos radiculares e dentígeros, além daqueles que apresentavam
quantidade de material suficiente para as fases subsequentes do experimento. Assim,
para o preparo do material que foi submetido às reações de imunoistoquímica, foram
realizados cortes histológicos de 3 μm de espessura, os quais foram colocados sobre
lâminas devidamente revestidas com organo-silano (Sigma-Aldrich, St Louis, MO,
EUA)
_______________________________________________________________Material e Métodos 42
Os cortes obtidos foram submetidos à técnica imunoistoquímica, pelo método
da estreptavidina-biotina-peroxidase. Os cortes foram desparafinados deixando-os
por 24 horas em estufa 60ºC, xilol a 60ºC por 20 minutos, xilol à temperatura
ambiente por 20 minutos e, em seguida, hidratados em etanol 100%, 95%, 70% e
água corrente e destilada. A recuperação antigênica foi realizada fervendo-se a
solução tampão de citrato 10 mM pH 6,0, em panela de pressão (Eterna®, Nigro,
Araraquara, São Paulo, Brasil) destampada. Após isso, mergulharam-se as lâminas e
lacrou-se a panela com a válvula de segurança aberta. Ocorrendo a saída do vapor
saturado, abaixou-se a válvula de segurança e aguardou-se a pressurização total.
Transcorridos 4 minutos, a panela ainda fechada ficou sob água corrente até a
despressurização total, seguido por sua abertura e lavagem das lâminas em água
destilada.
O bloqueio da peroxidase endógena foi realizado com H2O2 3%, com 4 trocas
de 5 minutos cada e por lavagem em água destilada e com solução salina tamponada
com fosfatos (PBS-phosphate buffered saline) 10 mM, pH 7,4 por 5 minutos.
Posteriormente, realizou-se incubação com anticorpos primários diluídos em títulos
previamente estabelecidos (Tabela I) em tampão PBS contendo albumina sérica
bovina (BSA) 1% (Sigma-Aldrich, cat # A9647, St Louis, MO, EUA) e azida sódica
0,1%, por 18 horas a 4ºC em câmara úmida. Foram realizadas três lavagens em
tampão PBS com 3 trocas de 3 minutos cada.
_______________________________________________________________Material e Métodos 43
Tabela I - Lista de anticorpos primários utilizados no estudo.
Anticorpos
Clones
Títulos
Anti-p63
4A4
1:2000
Anti-EGFR
EGFR-25
1:100
Anti-Notch 1
A6 (Ab-1)
1:100
Fabricantes
Dako
Novocastra
Thermo Scientific
Seguiu-se a técnica com o sistema de amplificação, onde as lâminas foram
incubadas por 30 minutos a 37° C com Post Primary Block (NovoLink Max Polymer cat
# RE7260-k, Newcastle Upon Tyne, Reino Unido), seguido por três lavagens com
tampão PBS com 3 trocas de 3 minutos cada. Posteriormente, foram incubadas com o
NovoLink Polymer por 30 minutos a 37°C e, novamente levados a lavagens em
tampão PBS com 3 trocas de 3 minutos cada.
As lâminas foram então reveladas em solução substrato contendo 60 mg de
3,3’ tetrahidrocloreto de diaminobenzidino (DAB) (Sigma-Aldrich, cat # D-5637, St
Louis, MO, EUA), 1 mL de Dimetilsulfóxido (DMSO) e
1 mL de H 2O2 6% (água
oxigenada 20 vol) em 100 mL de PBS incubadas por 5 minutos a 37ºC, ao abrigo da
luz.
Em seguida, as mesmas foram lavadas em água destilada, sendo contracoradas com Hematoxilina de Harris por um minuto. Posteriormente, foram lavadas
em água destilada e imersas duas vezes em água amoniacal (hidróxido de amônio
0,5%), lavando em seguida em água corrente e destilada. Os cortes foram então
desidratados em banhos de etanol 80%, 95% e 100% por duas vezes de 30
segundos cada, 2 banhos de xilol (5 minutos cada) e procedeu-se a montagem das
lâminas com Entellan neu (Merck, cat #1.07961, Darmstald, Alemanha) e lamínulas.
Controles positivos, que consistiram de espécimes de pele normal para p63 (Figura
_______________________________________________________________Material e Métodos 44
1), glândulas mucosas do intestino grosso para EGFR (Figura 2) e placenta normal
para Notch 1 (Figura 3), e negativos (controles positivos com supressão do anticorpo
primário) foram incluídos em todas as reações.
Figura 1 – Controle positivo para a proteína p63. Queratinócitos da epiderme
positivos para p63 (setas) (estreptavidina-biotina-peroxidase, 200x).
_______________________________________________________________Material e Métodos 45
Figura 2 – Controle positivo de EGFR. Células mucosas presentes no intestino
grosso apresentam intensa positividade citoplasmática e membranosa de EGFR
(setas) (estreptavidina-biotina-peroxidase, 200x).
Figura 3 – Controle positivo de Notch 1. Células normais da placenta
apresentam positividade citoplasmática de Notch 1 (setas) (estreptavidinabiotina-peroxidase, 200x).
_______________________________________________________________Material e Métodos 46
Análise das reações imunoistoquímicas
Para avaliação da reação imunoistoquímica foi utilizado microscópio óptico
modelo Eclipse E600 (Nikon, Tóquio, Japão), com as objetivas de 20 e 40x. A leitura
das reações foi realizada de forma semi-quantitativa por dois observadores
calibrados, que fizeram as avaliações de forma separada e independente,
considerando a expressão e a intensidade de expressão de EGFR e Notch 1, e
expressão de p63, de acordo com os critérios que serão descritos a seguir. Nos casos
em que a marcação imunoistoquímica foi inespecífica ou não foi possível avaliar
fragmento representativo da lesão, o caso foi considerado não avaliável. Considerouse célula positiva aquela que apresentava coloração acastanhada, conferida pelo
cromógeno DAB.
A expressão de p63, EGFR e Notch 1 foi analisada nas células epiteliais do
revestimento cístico. Para EGFR, foram consideradas células positivas aquelas que
tiveram a membrana e/ou citoplasma marcados; para Notch 1 foi considerada
positividade citoplasmática e/ou nuclear e para 63 considerou-se uma célula positiva
aquela que mostrava apenas marcação nuclear. A porcentagem de células positivas
em 10 campos de maior aumento (400x) foi utilizada para classificar cada lesão
cística, utilizando os seguintes valores: negativo: <5% de células positivas; expressão
baixa: 5%-50% de células positivas; expressão alta: >50% de células positivas. Além
disso, analisou-se a intensidade da expressão de EGFR e Notch 1 nas células epiteliais
(+: fraca intensidade; ++: forte intensidade). Considerou-se como fraca intensidade
de expressão os casos que apresentavam a maioria das células positivas (>50%) com
_______________________________________________________________Material e Métodos 47
pálida coloração marrom/dourada e como forte intensidade de expressão, os casos
que apresentavam a maioria das células positivas (>50%) com densa coloração
marrom/dourada no citoplasma e/ou membrana para EGFR e citoplasmática e/ou
nuclear para Notch 1.
Análise Estatística
Inicialmente foi feita análise descritiva dos marcadores, identificando a
freqüência absoluta e relativa das respostas obtidas. Depois foi comparada a
expressão dos marcadores entre as lesões pelo teste exato de Fisher e a correlação
entre as proteínas estudadas em cada uma das lesões císticas, por meio da
correlação de coeficiente de Spearman, adotando significância de 5%, por meio do
software SAS (Cary, Carolina do Norte, EUA).
Resultados
_______________________________________________________________________Resultados 49
Dos 35 casos de cistos radiculares, 21 (60%) ocorreram em homens e 14
(40%) em mulheres. A idade média dos pacientes foi de 42,2 anos (variando de 19 a
78 anos) e a maxila mais acometida (57,1%) que a mandíbula (42,9%). Os dados
referentes às características demográficas estão dispostos na Tabela II.
Microscopicamente, observou-se tecido epitelial estratificado, pavimentoso,
não queratinizado e com espessura variável. Dezoito casos (51,4%) se apresentavam
com epitélio de revestimento não-hiperplásico e 17 (48,6%) mostravam hiperplasia
epitelial. Vinte e três casos (65,7%) apresentaram cápsula fibrosa com reação
inflamatória crônica intensa (difusa) e 12 (34,3%) com inflamação leve (focal).
Nos 22 casos de cisto dentígero, os pacientes apresentavam idade média de
29 anos (variando de 7 a 68 anos), onde 13 casos (59,1%) ocorreram em homens. A
maxila foi acometida em 17 casos (77,3%) e a mandíbula em 5 casos (22,7%)
(Tabela II).
Histologicamente, em 15 casos (68,2%) se observou epitélio de revestimento
formado por duas a quatro camadas celulares, constituídas frequentemente por
células epiteliais cúbicas. Entretanto, em 7 casos (31,8%) o epitélio cístico se
apresentava hiperplásico. Na cápsula conjuntiva, reação inflamatória crônica foi
observada em 13 casos (59,1%), sendo classificada como leve em 11 (84,6%) e
intensa em 2 (15,4%).
Entre os tumores odontogênicos queratocísticos, dez casos (58,8%) ocorreram
em homens, com uma média de idade de 45,8 anos (variando de 13 a 78 anos).
Doze casos (70,6%) ocorreram na mandíbula e 5 (29,4%) na maxila (Tabela II).
_______________________________________________________________________Resultados 50
Microscopicamente, observou-se em todos os casos epitélio de revestimento
composto por 6 a 8 camadas celulares, com paraqueratina superficial corrugada,
além de camada basal composta por células polarizadas e dispostas em paliçada.
Todos os casos apresentavam superfície de paraqueratina. Entretanto, em 7 casos
(41,2%) que apresentavam infiltrado inflamatório crônico leve, o tecido epitelial se
apresentava hiperplásico nessas regiões, com perda de sua arquitetura convencional.
Além disso, cistos satélites foram observados em 2 casos (11,7%).
Tabela II – Dados epidemiológicos das lesões císticas estudadas
Características
epidemiológicas
Cisto radicular
n=35
Lesões
Cisto dentígero
n=22
Tumor odontogênico
queratocístico n=17
Gênero
Masculino
21 (60,0%)
13 (59,1%)
10 (58,8%)
Feminino
14 (40,0%)
9 (40,9%)
7 (41,2%)
42,2 (19-78 anos)
29 (7-68 anos)
45,8 (13-78 anos)
Maxila
20 (57,1%)
17 (77,3%)
5 (29,4%)
Mandíbula
15 (42,9%)
5 (22,7%)
Idade média
Local
12
(70,6%)
Expressão imunoistoquímica de p63, EGFR e Notch 1
A análise imunoistoquímica revelou que 32 casos (91,43%) de cisto radicular
apresentaram alta positividade para a proteína p63 em todas as camadas celulares do
revestimento cístico (Figura 4) e 3 casos (8,57%) foram negativos. Em 2 casos
(6,25%) que apresentaram epitélio hiperplásico associado a inflamação intensa na
cápsula conjuntiva, observou-se diminuição da expressão de p63 (Figura 4).
_______________________________________________________________________Resultados 51
Figura 4 – Expressão da proteína p63 em cistos radiculares. A, B – Alta positividade de p63 nas
células epiteliais do revestimento cístico (setas). C – Alta positividade de p63 nas células epiteliais do
revestimento cístico hiperplásico (setas), com reação inflamatória crônica intensa no tecido conjuntivo
adjacente. D – Diminuição da expressão de p63 no revestimento epitelial hiperplásico, associada à
intensa reação inflamatória na cápsula conjuntiva (estreptavidina-biotina-peroxidase, 200x).
Todos os casos de cisto radicular apresentaram alta expressão de EGFR em
todas as camadas celulares do epitélio cístico, sendo 21 casos (60%) apresentando
forte intensidade de expressão e 14 (40%) fraca intensidade (Figura 5). A reação
inflamatória presente na cápsula conjuntiva não influenciou a expressão de EGFR.
_______________________________________________________________________Resultados 52
Figura 5 – Expressão de EGFR em cistos radiculares. A – Alta expressão e forte intensidade de
expressão citoplasmática de EGFR nas células epiteliais do revestimento cístico (setas) (estreptavidinabiotina-peroxidase, 100x). B – Alta expressão e intensa positividade de expressão membranosa de
EGFR no revestimento de cisto radicular (setas) (estreptavidina-biotina-peroxidase, 200x). C – Detalhe
em maior aumento da fotomicrografia anterior (estreptavidina-biotina-peroxidase, 400x). D – Alta
expressão e fraca intensidade de expressão de EGFR no revestimento epitelial de cisto radicular
(setas) (estreptavidina-biotina-peroxidase, 200x).
Todos os casos avaliados apresentaram o epitélio cístico positivo para Notch 1,
com 28 casos (82,35%) apresentando alta positividade e 6 (17,65%) baixa
positividade. Com relação à intensidade de expressão de Notch 1, 17 casos (50%)
apresentaram forte intensidade de expressão e 17 casos (50%) fraca intensidade de
expressão de Notch 1 (Figura 6). Em 1 caso de cisto radicular, significativa expressão
inespecífica de Notch 1 foi observada e portanto, o mesmo não foi avaliado.
_______________________________________________________________________Resultados 53
Figura 6 – Expressão de Notch 1 em cistos radiculares. A – Alta expressão e forte intensidade de
expressão citoplasmática e nuclear de Notch 1 nas células epiteliais do revestimento cístico (setas)
(estreptavidina-biotina-peroxidase, 200x). B – Alta expressão e intensa positividade de expressão
citoplasmática e nuclear de Notch 1 no revestimento de cisto radicular (setas) (estreptavidina-biotinaperoxidase, 400x). C – Alta expressão e fraca intensidade de expressão citoplasmática de Notch 1 no
revestimento epitelial de cisto radicular (setas) (estreptavidina-biotina-peroxidase, 200x). D – Baixa
expressão e fraca intensidade de expressão citoplasmática e membranosa de Notch 1 no revestimento
epitelial de cisto radicular (setas) (estreptavidina-biotina-peroxidase, 200x).
Todos os casos de cisto dentígero apresentaram expressão de p63 em todas
as camadas celulares do revestimento epitelial, onde em 16 casos (72,73%) havia
alta positividade e em 6 casos (27,27%) baixa positividade (Figura 7).
_______________________________________________________________________Resultados 54
Figura 7 – Expressão da proteína p63 em cistos dentígeros. A – Alta
expressão da proteína p63 nas células epiteliais do revestimento
cístico (setas) (estreptavidina-biotina-peroxidase, 200x). B – Baixa
expressão da proteína p63 no revestimento epitelial de cisto dentígero
(setas) (estreptavidina-biotina-peroxidase, 400x).
_______________________________________________________________________Resultados 55
Assim como na expressão de p63, todos os casos avaliados foram positivos
para EGFR em todas as camadas celulares, com 20 casos (95,24%) apresentando
alta positividade e 1 caso (4,76%) baixa positividade. Com relação à intensidade da
expressão de EGFR, 16 casos (76,19%) apresentaram forte intensidade de
expressão, enquanto 5 casos (23,81%) mostraram fraca intensidade (Figura 8). Após
a reação imunoistoquímica, um caso de cisto dentígero não apresentava material
suficiente para análise.
_______________________________________________________________________Resultados 56
Figura 8 – Expressão imunoistoquímica de EGFR em cistos dentígeros. A –
Alta expressão e forte intensidade de expressão membranosa de EGFR nas
células epiteliais do revestimento cístico (setas) (estreptavidina-biotinaperoxidase, 400x). B – Alta expressão e fraca intensidade de expressão
citoplasmática de EGFR no revestimento epitelial de cisto dentígero (setas)
(estreptavidina-biotina-peroxidase, 200x).
_______________________________________________________________________Resultados 57
Vinte e dois casos (100%) de cisto dentígero apresentaram alta positividade
para Notch 1 em todas as camadas celulares, onde em 17 (77,27%) deles havia forte
intensidade de expressão e em 5 casos (22,73%) fraca intensidade (Figura 9).
Figura 9 – Expressão imunoistoquímica de Notch 1 em cistos
dentígeros. A – Alta expressão e forte intensidade de expressão
citoplasmática de Notch 1 no revestimento cístico (setas). B – Alta
expressão e fraca intensidade de expressão citoplasmática de Notch 1 no
revestimento epitelial de cisto dentígero (setas) (estreptavidina-biotinaperoxidase, 400x).
_______________________________________________________________________Resultados 58
Todos os casos de tumor odontogênico queratocístico avaliados apresentaram
alta expressão de p63 em todas as camadas celulares do revestimento epitelial
(Figura 10). Em 1 caso, após a reação imunoistoquímica, o material se soltou e não
foi possível realizar a análise.
Figura 10 – Alta expressão da proteína p63 em células epiteliais do revestimento
de tumor odontogênico queratocístico (estreptavidina-biotina-peroxidase, 400x).
A análise da expressão de EGFR revelou que 16 casos (94,12%) de tumor
odontogênico queratocístico foram positivos e 1 caso (5,88%) foi negativo. Com
relação a intensidade de expressão de EGFR, 12 casos (75%) apresentaram forte
intensidade de expressão e 4 casos (25%) fraca intensidade (Figura 11).
_______________________________________________________________________Resultados 59
Figura 11 – Expressão imunoistoquímica de EGFR em tumores odontogênicos
queratocísticos. A – Alta expressão e forte intensidade de expressão
membranosa de EGFR nas células epiteliais do revestimento cístico (setas)
(estreptavidina-biotina-peroxidase, 200x). B – Alta expressão e fraca
intensidade de expressão citoplasmática e membranosa de EGFR no
revestimento epitelial de tumor odontogênico queratocístico (setas)
(estreptavidina-biotina-peroxidase, 200x).
_______________________________________________________________________Resultados 60
Todos os casos de tumor odontogênico queratocístico avaliados foram
positivos para Notch 1, com 12 casos (75%) apresentando alta positividade e 4 casos
(25%) baixa positividade. Avaliando a intensidade de expressão de Notch 1,
observou-se que 14 casos (87,5%) apresentaram forte intensidade de expressão,
enquanto 2 casos (12,5%) mostraram fraca intensidade. Em 1 caso de tumor
odontogênico queratocístico houve reação inespecífica significativa, inviabilizando a
análise correta e segura desse espécime.
_______________________________________________________________________Resultados 61
Figura 12 – Expressão imunoistoquímica de Notch 1 em tumores
odontogênicos queratocísticos. A – Alta expressão e forte intensidade de
expressão citoplasmática e nuclear de Notch 1 nas células epiteliais do
revestimento cístico (setas) (estreptavidina-biotina-peroxidase, 200x). B – Baixa
expressão e fraca intensidade de expressão citoplasmática e nuclear de Notch 1
no revestimento epitelial de tumor odontogênico queratocístico (setas)
(estreptavidina-biotina-peroxidase, 200x).
_______________________________________________________________________Resultados 62
Análise Estatística
Comparando a expressão de p63 no epitélio cístico das 3 lesões estudadas,
observou-se que o tumor odontogênico queratocístico apresentou positividade para
p63 significativamente maior (p<0,001) que os cistos radicular e dentigero.
Entretanto, não se observou diferença estatística significante na expressão (p=0,1) e
intensidade de expressão de EGFR (p=0,2), o mesmo foi observado quanto a
expressão (p=0,1) e intensidade de expressão de Notch 1 (p=0,08) (Tabela III).
Tabela III – Análise comparativa da expressão e intensidade da expressão de EGFR e Notch 1, e da
expressão de p63 no revestimento epitelial de cistos radiculares (CR), cistos dentígeros (CD) e tumores
odontogênicos queratocísticos (TOQ).
Variáveis
RC
n=35 (%)
Expressão de p63
Negativa
Baixa
Alta
Expressão de EGFR
Negativa
Baixa
Alta
Intensidade de expressão de
EGFR
Fraca
Forte
Expressão de Notch 1
Negativa
Baixa
Alta
Intensidade de expressão de
Notch 1
Fraca
Forte
*Estatisticamente significante
** Um (1) caso não foi analisado
Lesões
CD
n=22 (%)
p
TOQ
n=17 (%)
3 (8,57)
0 (0,0)
32 (91,43)
0 (0,0)
6 (27,27)
16 (72,73)
0 (0,0)
0 (0,0)
16 (100,0)**
<0,001*
0 (0,0)
0 (5,7)
35 (100,0)
0 (0,0)
1 (4,76)
20 (95,24)**
1 (5,88)
0 (0,0)
16 (94,12)
0,1
14 (40,0)
21 (60,0)
5 (23,81)
16 (76,19)
4 (25)
12 (75)
0,2
0 (0,0)
6 (17,65)
28 (82,35)**
0 (0,0)
0 (0,0)
22 (100,0)
0 (0,0)
2 (12,5)
14 (87,5)**
17 (50,0)
17 (50,0)
5 (22,73)
17 (77,27)
4 (25)
12 (75)
0,1
0,08
_______________________________________________________________________Resultados 63
Nos cistos radiculares, observou-se correlação positiva entre a expressão de
EGFR e intensidade de expressão de EGFR (p<0,001), expressão e intensidade de
expressão de Notch 1 (p<0,001) e expressão de p63 (p<0,001). Além disso,
correlação positiva foi observada entre a expressão e intensidade de Notch 1
(p=0,005).
Nos cistos dentígeros, observou-se correlação positiva entre a expressão de
Notch 1 e intensidade de expressão de Notch 1 (p<0,001), expressão e intensidade
de expressão de EGFR (p<0,001) e expressão de p63 (p<0,001).
Nos tumores odontogênicos queratocísticos foi observada correlação positiva
entre a expressão de p63 e expressão e intensidade de EGFR (p<0,001), e expressão
e intensidade de expressão de
Notch 1 (p<0,001). Observou-se ainda correlação
entre a expressão e intensidade de EGFR (p=0,03) e entre a expressão e intensidade
de expressão de Notch 1 (p=0,005).
Discussão
________________________________________________________________________Discussão 65
Estudos recentes relacionados à etiopatogênese das periapicopatias têm
utilizado a imunoistoquímica para investigar o papel de citocinas, fatores de
crescimento, fatores de diferenciação celular, genes supressores de tumor e
oncogenes no início, desenvolvimento e progressão dessas lesões (LI et al., 1997;
PIATELLI et al., 2004; MENEZES et al., 2006; NADALIN, 2008; LIMA, 2009).
A técnica de imunoistoquímica baseia-se no princípio da reação antígenoanticorpo, na qual se processa em cortes histológicos, associada a métodos de
coloração para evidenciar tal reação. Essa técnica detecta os antígenos (proteínas)
localizados no núcleo, citoplasma ou membrana da célula a ser estudada,
constituindo numa ferramenta útil no diagnóstico histopatológico, sobretudo nas
neoplasias indiferenciadas e fusocelulares, e na investigação científica (LI et al.,
1997; PIATTELLI et al., 2004; MENEZES et al., 2006; NADALIN, 2008; LIMA, 2009),
como foi realizado neste estudo. Atualmente, vários anticorpos estão disponíveis para
serem utilizados em tecidos fixados em formol e embebidos em parafina, o que
representa uma grande vantagem, visto que é possível utilizar essa técnica
importante em material biológico (tecidos) arquivado, como foi executado neste
experimento.
Dessa maneira, um arquivo bem conservado de tecidos embebidos em
parafina é uma fonte importante de material biológico para o desenvolvimento de
estudos morfológicos, imunoistoquímicos e eventualmente moleculares, das mais
diversas
patologias,
de
diferentes
locais,
neoplásicas
ou
não-neoplásicas,
inflamatórias ou de desenvolvimento. Achados importantes podem ser obtidos de tais
________________________________________________________________________Discussão 66
estudos, como determinar as características histopatológicas usuais e não usuais de
uma determinada lesão, compreender eventos biológicos, determinar fatores
prognósticos ou instituir novas terapias. O fato da Universidade de Ribeirão Preto
manter o Laboratório de Patologia Bucal por vários anos e propiciar o correto
arquivamento dos espécimes recebidos ao longo do tempo, permitiu a realização
deste estudo, o qual analisou 74 lesões císticas odontogênicas, utilizando a
imunoistoquímica como ferramenta principal de investigação.
Neste estudo, praticamente metade dos casos apresentava revestimento
cístico hiperplásico e em todos os cistos radiculares havia reação inflamatória crônica
na cápsula de tecido conjuntivo, onde em 65,7% dos casos era intensa. Esses
achados se justificam, visto que o cisto radicular se origina a partir de uma
inflamação e consequente necrose do tecido pulpar, que estimula restos epiteliais
odontogênicos localizados no ligamento periodontal apical, denominados restos de
Malassez (SHEAR; SPEIGHT, 2007). Após a formação cística, a persistência de
agentes irritantes no periápice contribui para a manutenção de uma cápsula fibrosa
com reação inflamatória de intensidade variável predominantemente formada por
linfócitos, embora plasmócitos, macrófagos, neutrófilos e raramente eosinófilos e
mastócitos possam também ser observados (TAKEDA et al., 2005). Além disso, a
inflamação presente na cápsula cística estimula o epitélio cístico a proliferar,
tornando-o hiperplásico (TAKEDA et al., 2005; SHEAR; SPEIGHT, 2007).
O estudo de fatores de crescimento, receptores de fatores de crescimento,
genes supressores de tumor, oncogenes, antígenos de proliferação celular e citocinas,
________________________________________________________________________Discussão 67
certamente contribui para o melhor entendimento da patogênese dos cistos
odontogênicos. Como os diferentes tipos de cistos odontogênicos originam-se de
restos epiteliais formados em diferentes estágios do desenvolvimento do órgão
dental, presume-se que o início e desenvolvimento dessas lesões estejam associados
a eventos celulares e moleculares, os quais estão relacionados às características do
tipo de resto epitelial odontogênico associado à gênese de cada lesão cística (LI et
al., 1997).
No presente estudo, a maioria dos cistos radiculares e dentígeros, e todos os
casos de tumor odontogênico queratocístico apresentaram alta positividade para
proteína p63 em todas as camadas celulares. LO MUZIO et al. (2005), no entanto,
observaram que a positividade para proteína p63 em cistos radiculares e dentígeros
estava restrita às camadas basal e parabasal do revestimento cístico epitelial,
enquanto no tumor odontogênico queratocístico a positividade era mais evidente nas
camadas intermediária e superficial, seguindo o perfil de expressão do antígeno de
proliferação celular Ki-67 (NADALIN, 2008). Avaliando cuidadosamente o estudo de
LO MUZIO et al. (2005) e considerando que no cisto dentígero o revestimento
epitelial é formado por poucas camadas celulares, assim como em vários casos de
cistos radiculares com revestimento não hiperplásico, o qual se restringe
praticamente à camada basal e parabasal, esses resultados são similares ao do
presente estudo.
Por outro lado, este estudo observou uma positividade significativamente mais
alta da proteína p63 nos tumores odontogênicos queratocísticos quando comparado
________________________________________________________________________Discussão 68
aos cistos radiculares e dentígeros, como também foi observado por LO MUZIO et al.,
2005. Esse achado pode eventualmente estar associado a um distúrbio no controle
do ciclo celular, levando a um maior potencial de crescimento intrínseco, que poderia
explicar o crescimento mais infiltrativo e agressivo, além de maiores taxas de recidiva
observado no tumor odontogênico queratocístico.
A proliferação celular tem sido associada a fatores de crescimento, como o
fator de crescimento epidérmico (EGF), fator de crescimento transformante (TGF) e
seus respectivos receptores, os quais podem desencadear o processo de proliferação
celular por meio de uma cascata de fosforilação protéica que permite os sinais de
proliferação sejam recebidos, traduzidos e transmitidos ao núcleo celular (BAUMGART
et al., 2007). Considerando todas as lesões estudadas, no presente estudo apenas 1
caso de tumor odontogênico queratocístico foi negativo para EGFR, semelhante ao
que foi observado por CLARK et al. (2006). Da mesma forma, avaliando a intensidade
de expressão de EGFR, a porcentagem de lesões que apresentaram forte intensidade
também foi semelhante entre elas. Assim, presume-se que o epitélio cístico das
lesões estudadas é capaz de proliferação mediada por EGFR e que este é importante
para a manutenção do revestimento epitelial cístico.
A maioria dos casos apresentou positividade membranosa e citoplasmática
para EGFR. A imunolocalização desse receptor parece ser importante na velocidade
da resposta celular ao estímulo de proliferação. Nos casos em que EGFR está restrito
à membrana plasmática, a resposta na presença de um ligante é mais rápida. Caso
contrário, se o EGFR for internalizado para o citoplasma, a resposta ao estímulo
________________________________________________________________________Discussão 69
proliferativo é diminuída. Caso EGFR seja observado concomitantemente na
membrana plasmática e citoplasma, como no presente estudo, alguns estudos
evidenciaram que a resposta da célula a um estímulo proliferativo é similar a uma
resposta tipo fisiológica (GULKESEN et al., 2001).
No presente estudo, todos os casos avaliados, incluindo as 3 lesões císticas
estudadas, foram positivos para Notch 1. Adicionalmente, houve maior intensidade de
expressão de Notch 1 nos cistos dentígeros e nos tumores odontogênicos
queratocísticos quando comparados ao cisto radicular, embora a diferença tenha sido
apenas marginalmente significativa. O sistema Notch parece ser importante na
manutenção do tecido epitelial normal. Notch 1 desencadeia a diferenciação e inibe o
crescimento de queratinócitos humanos in vitro. Deleção genética do sistema Notch
em queratinócitos humanos é suficiente, junto com a ativação do gene ras, para
causar carcinomas espinocelulares agressivos (LEFORT et al., 2007). KUMAMOTO;
OHKI (2008) observaram níveis semelhantes de expressão de Notch 1 em germes
dentários e células neoplásicas do ameloblastoma. Ainda com relação aos tecidos
odontogênicos, a ativação do sistema Notch pode inibir a diferenciação de células
tronco pulpares em odontoblastos (ZHANG et al., 2008). Associando esses dados com
os do presente estudo, parece que o sistema Notch não é importante para o
desenvolvimento das lesões císticas odontogênicas, mas pode contribuir para
diferenciação das células do revestimento epitelial, contribuindo para a manutenção
da lesão e consequentemente para a sua progressão.
________________________________________________________________________Discussão 70
A correlação positiva e a co-expressão da proteína p63, EGFR e Notch 1 em
todas as lesões é mais um dado que sugere a importância dessas proteínas no
desenvolvimento e persistência das lesões císticas odontogênicas, visto que todas
essas moléculas são essenciais na diferenciação, homeostase e manutenção do tecido
epitelial. Assim, a expressão concomitante indica que elas podem se interagir e atuar
de forma sinérgica a fim de manter a estrutura do revestimento epitelial cístico.
O presente estudo acrescenta novas informações com relação à expressão de
fatores de crescimento e proteínas envolvidas na diferenciação celular, e suas
possíveis funções nas lesões císticas odontogênicas estudadas. A identificação de
Notch 1, não estudada anteriormente em lesões císticas odontogênicas, sugere que o
sistema Notch participa da manutenção da integridade do epitélio de revestimento
cístico, contribuindo para a persistência da lesão. Drogas que modulam a ativação do
sistema Notch podem eventualmente ser úteis no tratamento dessas lesões,
sobretudo os cistos radiculares refratários ao tratamento endodôntico conservador e
tumores odontogênicos queratocísticos extensos. Adicionalmente, a alta expressão da
proteína p63, alta intensidade de expressão de EGFR e a correlação existente entre
elas, indicam participação importante dessas proteínas no desenvolvimento das
lesões.
Conclusões
_______________________________________________________________________Conclusões 72
Nas condições experimentais deste estudo, e com base nos resultados obtidos,
foi possível concluir que:
1. A maioria dos cistos radiculares, dentígeros e todos os tumores
odontogênicos queratocísticos apresentaram alta expressão imunoistoquímica de
proteína p63.
2. Os tumores odontogênicos queratocísticos apresentaram uma expressão
significativamente maior de proteína p63 quando comparado aos cistos radiculares e
dentígeros.
3. A maioria dos cistos radiculares e tumores odontogênicos queratocístico e
todos os cistos dentígeros apresentaram alta expressão de Notch 1.
4. A expressão de Notch 1 pode ser importante na manutenção do epitélio
cístico, contribuindo para a persistência das lesões.
5. A alta expressão e forte intensidade de expressão de EGFR sugerem que
este receptor participe dos processos proliferativos do epitélio cístico.
6. Em todas as lesões, houve co-expressão e correlação positiva entre as
proteínas estudadas.
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