UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA CATARINA
CENTRO DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS
DEPARTAMENTO DE AQUICULTURA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM AQUICULTURA
Medidas profiláticas na larvicultura e pré-berçário do camarão
branco do Pacífico
Dissertação submetida ao Programa de
Pós-graduação em Aquicultura da
Universidade Federal de Santa Catarina
para a obtenção do Grau de Mestre em
Aquicultura.
Orientador: Felipe do Nascimento Vieira
Coorientador: José Luiz Pedreira Mouriño
Marcello Mendes dos Santos Junior
Florianópolis,
2014.
Medidas profiláticas na larvicultura e pré-berçário do camarão
branco do Pacífico
Por
MARCELLO MENDES DOS SANTOS JUNIOR
Esta dissertação foi julgada adequada para a obtenção do título de
MESTRE EM AQUICULTURA
e aprovada em sua forma final pelo Programa de
Pós-Graduação em Aqüicultura.
_____________________________________
Prof. Alex Pires de Oliveira Nuñer, Dr.
Coordenador do Programa
Banca Examinadora:
__________________________________________
Dr. Felipe do Nascimento Vieira – Orientador
__________________________________________
Dr. Maurício Laterça Martins
__________________________________________
Dr. Sérgio Winckler da Costa
__________________________________________
Dr. Walter Quadros Seiffert
Todo este trabalho é dedicado a minha
família, que não me deixou a deriva em dias
de vento e mar grosso.
AGRADECIMENTOS
Ao Grande Arquiteto do Universo, pela oportunidade de
experimentar este plano espiritual;
Aos meus pais, Marcelo e Rose, por todo carinho, amor,
compreensão e apoio em todas as fases da minha vida;
Aos meus irmãos, Maurício e Stephanie, por todo apoio e
“impaciência”;
A minha amada Aline, por todo apoio e compreensão por minha
ausência nas horas mais difíceis;
Aos meus amigos Gabriel e Efrayn, a todo apoio, ajuda e
incentivo;
Ao meu primo Ubiraci e sua esposa Rosane, pela estadia e
incentivo;
A toda “velha Guarda” da microbiologia do LCM: Bruno, Gabi,
Gabi Soltes, Norha, Mari, Marysol, Scheila e Marcela por todo o
aprendizado e convívio pacífico;
Ao meu professor orientador, Felipe Vieira, pela oportunidade e
inestimável apoio para realização do trabalho;
Ao meu amigo e professor José Luiz, pela oportunidade, apoio e
parceria nos dias de surf;
Ao professor Walter, pelo empenho na aquisição do material de
estudo;
A Esmeralda, que me auxiliou e documentou os experimentos em
forma de foto;
Aos funcionários e amigos do LCM, em especial David, Ilson,
Carlos, Carlos Biólogo e Dimas, por toda ajuda e diversão na hora do
trabalho duro;
Ao Vitor Pontinha, ao Lucas e ao NEPAQ, pelo auxílio nas
análises histológicas;
Ao LAPMAR, pelo auxílio nas análises morfométricas;
Aos meus amigos de surf, Carlos, Guilherme, Paulo e Daniel, por
me ajudar a cuidar do corpo e da alma nos dias de altas ondas;
A todos meus amigos da graduação, Gustavo, Marco, Denis,
Lucas, Johnson, Nicolas, etc..., pelos almoços no R.U. do CCA;
Ao Carlito, pela prestatividade na secretaria da PGAQI;
A CAPES e CNPQ, pelo apoio financeiro para a realização dos
estudos;
Enfim, a todos que de alguma maneira contribuíram para a
conclusão desta etapa da minha vida.
Resumo
Este trabalho visou avaliar diferentes métodos profiláticos para melhoria
de desempenho em larvicultura e pré-berçário de camarão marinho
Litopenaeus vannamei. Buscando abolir o uso de antibióticos,
pesquisadores estudam métodos bióticos e orgânicos, como o caso de
probiótico e sais orgânicos. Foi estabelecida uma dose segura de
propionato de sódio para ser administrada de forma pontual na água de
cultivo, nas diferentes fases de larvicultura, comparando-o com os
efeitos do antibiótico enrofloxacino 15mg/L e uso diário de probiótico
Lactobacillus plantarum, ao longo de todo cultivo junto à alimentação.
Já no cultivo de pré-berçário, o butirato de sódio na concentração de 2%
suplementado na ração, foi confrontado com probiótico L. plantarum na
dose de 10 mL/g de ração, e a mistura dos dois tratamentos, visando
obter um efeito sinérgico. Nos dois experimentos, além de avaliar
parâmetros zootécnicos, foi avaliado a microbiota da água, larvas e póslarvas de camarão L vannamei ao longo do cultivo e integridade do
intestino médio das pós-larvas 20. No experimento de larvicultura os
tratamentos nas doses utilizadas não apresentaram efeitos e a inserção
do butirato de sódio na ração fornecida para as pós-larvas do préberçário influenciou positivamente na sobrevivência final e não causou
alteração na morfologia intestinal.
Palavras-chave: Litopenaeus vannamei, Sais orgânicos, probiótico,
antibiótico, profilaxia.
ABSTRACT
This study evaluated different prophylactic methods for improving
performance in hatchery and pre-nursery marine shrimp Litopenaeus
vannamei. Seeking to abolish the use of antibiotics, researchers studying
biotic and organic methods, such as the case of probiotics and organic
salts. A safe dose of sodium propionate was established to be
administered in a timely fashion in the pond water at the various stages
of larval rearing, comparing it with the effects of the antibiotic
enrofloxacin 15 mg/L and daily use of probiotic Lactobacillus
plantarum throughout with the growing food. Since the pre-nursery
cultivation, sodium butyrate at a concentration of 2% in the
supplemented diet was confronted with probiotic L. plantarum at doses
of 10 mL/g of feed, and mixing the two treatments in order to obtain a
synergistic effect. In both experiments, in addition to evaluating
performance parameters, was evaluated microbiota water, larvae and
post-larvae shrimp L.vannamei over cultivation and integrity of the
midgut of post-larvae 20. Hatchery in experiment treatments at the doses
used no effects were observed and the insertion of sodium butyrate in
the diet provided for post-larvae of the pre-nursery positively influenced
survival in the final and did not cause changes in intestinal morphology..
Keywords: Litopenaeus
antibiotics, prophilaxis.
vannamei,
organics
salts,
probiotics,
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 Principais rotas de fármacos, destaque para a pequena
contribuição proveniente da aquicultura. .............................................. 24
Figura 2 Método de determinação in vitro de inibição de bactérias
patogênicas por bactérias probióticas (Vieira, 2010). ........................... 25
Figura 3 - Mecanismo de ação de ácidos orgânicos no interior das
bactérias. (1) Atravessam a membrana plasmática, (2) dissociam-se
no citoplasma e (3) obrigam o gasto de energia pela exportação de
prótons. Adaptado de Defoirdt et al. (2009). ......................................... 27
Figura 4 Crescimento em unidades formadoras de colônia por
mililitro (UFC/mL Log10) de bactérias totais e vibrionáceas após 24
horas e ácido-láticas após 48 horas do na água da larvicultura dos
tratamentos com Propionato de sódio 0,5mM/L, Enrofloxacino
15mg/L e Probiótico 10mL/g de ração em três coletas de água de
cultivo após as principais metamorfoses. Letras diferentes indicam
diferença estatística ao teste de Tukey (p<0,05).................................... 40
Figura 5 Crescimento em unidades formadoras de colônia por grama
(UFC/g Log10) de bactérias totais e vibrionáceas após 24 horas e
ácido-láticas após 48 horas do no macerado de pós-larvas 5 tratadas
com os tratamentos com Propionato de sódio 0,5mM/L,
Enrofloxacino 15mg/L nas principais metamorfoses e Probiótico
10mL/g de raçãon ao longo de todo cultivo. Letras diferentes
indicam diferença estatística ao teste de Tukey (p<0,05) ...................... 41
Figura 6 Percentual de sobrevivência ao teste de estresse por
salinidade de pós-larvas 20 de camarão Litopenaeus vannamei
cultivados em pré-berçário e alimentados com ração suplementada
de butirato de sódio 2%, probiótico Lactobacillus plantarum 1x108
UFC/g e butirato de sódio 2%+ probiótico L. plantarum 1x108
UFC/g,. .................................................................................................. 54
Figura 7 Cortes histológicos do intestino médio de pós-larvas 20 de
camarão marinho sob microscopia óptica ao aumento de 100x,
tratados com BUT=tratamento com butirato de sódio 2%;
PRO=tratamento com probiótico Lactobacillus plantarum 1x108
UFC/g de ração; MIX=tratamento com butirato de sódio 2%+
probiótico Lactobacillus plantarum 1x10 8 UFC/g de ração e
CTL=Controle. Epi=Epitélio intestinal e Mcl= Musculo Circular e
Longitudinal com estrutura integra e Lum=Lúmem intestinal
contendo alimento. ................................................................................ 57
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 - Principais ácidos e sais orgânicos e seus efeitos,
utilizados em carcinicultura marinha..................................................... 28
Tabela 2 - Manejo alimentar utilizado noexperimento de larvicultura
de Litopenaeus vannamei. Níveis de Garantia INVE® (SP+=Proteína
Bruta 48%; Estrato etéreo: 3%; Umidade: 8%; Matéria fibrosa: 3%;
Matéria mineral: 13%; Cálcio: 1,1%; Fósforo: 1%; ZM= Proteína
Bruta 48%:;Estrato etéreo: 13%; Umidade: 8% ; Matéria fibrosa:
2,5% ; Matéria mineral: 13%; Cálcio: 0,7%; Fósforo: 1%; MPL=
Proteína Bruta 48%:;Estrato etéreo: 9%; Umidade: 9% ; Matéria
fibrosa: 2,5% ; Matéria mineral: 13%; Cálcio: 1,6%; Fósforo: 1%). .... 37
Tabela 3 - Parâmetros zootécnicos da larvicultura de camarões
marinhos da espécie Litopenaeus vannamei submetida aos
tratamentos propionato de sódio 0,5mM/L, enrofloxacino 15mg/L,
probiótico 10mL/g de ração e controle do estádio de náuplio 5 até
pós-larva 5. ............................................................................................ 42
Tabela 4 - Dados zootécnicos e microbiológicos do cultivo em préberçário experimental de camarões marinhos da espécie Litopeneus
vannamei alimentados com ração suplementada de butirato de sódio
2%, probiótico Lactobacillus plantarum 1x108 UFC/g e butirato de
sódio 2%+ probiótico L. plantarum 1x108 UFC/g. ............................... 56
SUMÁRIO
CAPÍTULO I ......................................................................................... 19
1
INTRODUÇÃO .......................................................................... 19
1.1 Larvicultura ................................................................................. 20
1.2 Pré-berçário ................................................................................. 21
1.3 Mecanismos profiláticos contra bacterioses na carcinicultura
marinha........................................................................................ 22
1.4 Uso de antibióticos na larvicultura e pré-berçário....................... 23
1.5 Uso de probióticos na larvicultura e pré-berçário de camarões
marinhos ...................................................................................... 25
1.6 Ácidos orgânicos e seus sais em cultivo de camarões marinhos . 26
2
JUSTIFICATIVA ........................................................................ 28
3
HIPÓTESE .................................................................................. 29
4
OBJETIVOS ............................................................................... 29
4.1 Objetivo geral .............................................................................. 29
4.2 Objetivos específicos .................................................................. 29
5
FORMATAÇÃO DOS ARTIGOS.............................................. 30
CAPITULO II ... .....................................................................................31
6
Resumo........................................................................................ 32
7
Abstract ....................................................................................... 33
8
Introdução ................................................................................... 34
9
Material e métodos ...................................................................... 35
9.1 Material biológico e estabelecimento da dose do sal orgânico ... 35
9.2 Delineamento experimental ........................................................ 36
9.3 Análise microbiológica ............................................................... 38
9.4 Teste de estresse .......................................................................... 38
9.5 Sobrevivência final e comprimento das larvas ............................ 39
9.6 Análises estatísticas..................................................................... 39
10
Resultados e Discussão ............................................................... 39
11
Conclusão .................................................................................... 43
12
Referências .................................................................................. 43
CAPITULO III . ......................................................................................46
13
Resumo........................................................................................ 47
14
Abstract ....................................................................................... 48
15
Introdução ....................................................................................49
16
Material e Métodos ......................................................................50
16.1 Delineamento experimental .........................................................50
16.2 Análise microbiológica ................................................................52
16.3 Teste de estresse e parâmetros zootécnicos .................................52
16.4 Análise microscópica ...................................................................52
16.5 Análises estatísticas .....................................................................53
17
Resultados e discussão .................................................................53
18
Conclusão ....................................................................................57
19
Referências...................................................................................57
20
considerações finais .....................................................................61
21
Referências da introdução ............................................................62
anexo I:............. ......................................................................................69
Anexo II: .......... ......................................................................................70
Anexo III .......... ......................................................................................71
Anexo iV .......... ......................................................................................72
Anexo V ........... ......................................................................................73
19
CAPÍTULO I
1
INTRODUÇÃO
A carcinicultura é um dos segmentos da aquicultura com grande
crescimento nas últimas décadas. Para que este crescimento seja
uniforme e sustentável, existe a necessidade de tecnificação e aumento
de produção nas fases primárias da cadeia produtiva (ANDREATTA;
BELTRAME, 2004).
O processo de produção de camarões marinhos consiste em:
manutenção do banco de reprodutores, maturação dos reprodutores,
cópula e desova, incubação da desova e eclosão, larvicultura, préberçário, berçário, engorda, despesca e abate.
Quase todas estas etapas sofrem com perdas provenientes de
doenças, que podem ser causadas por vírus, bactérias intracelulares
(rickettsial like bacteria), enterobactérias, fungos e protozoários
(MORALES; CUELLAR-ANJEL, 2008). Porém, nos últimos anos, as
viroses têm sido responsáveis pelas maiores perdas econômicas na
carcinicultura mundial e brasileira.
Como exemplos, a Síndrome de Taura (TSV, do inglês, Taura
Syndrome Virus) que surgiu no Equador e a Síndrome da Mancha
Branca (WSSV, do inglês, White Spot Syndrome Virus) que surgiu na
Ásia, ambas no início dos anos 90 (LIGHTNER et al., 2012a).
Atualmente, a carcinicultura tem enfrentado um novo problema
que têm causado enormes prejuízos na Ásia. Este problema provém de
uma doença conhecida como Síndrome da Mortalidade Precoce (EMS,
do inglês, Early Mortality Syndrome), também caracterizada como
Síndrome da Necrose Hepatopancreática Aguda (AHPNS, do inglês,
Acute Hepatopancreatic Necrosis Syndrome). Sendo primeiramente
relatada na China em 2009, atravessou o oceano e foi identificada em
mortalidades massivas no México (MAGALLÓN-BARAJAS, 2013
apud SILVA, 2014).
Desde sua identificação, a etiologia desta doença era
desconhecida, e, apenas em 2013, foi identificado seu agente patológico;
uma cepa de Vibrio parahaemolyticus altamente patogênico, que libera
toxinas que causam disfunções no hepatopâncreas e consequentemente
as mortalidades de juvenis de Litopenaeus vannamei, 20 a 30 dias após
o povoamento de pós-larvas nos viveiros (LIGHTNER et al., 2012b;
TRAN et al., 2013).
Outras bactérias do gênero Vibrio também são responsáveis por
mortalidades nas larviculturas de camarões (VANDENBERGHE et al.,
20
1999) e na intensificação de mortalidades quando associada às doenças
virais, como a WSSV (PHUOC et al., 2009).
Os víbrios estão presentes em grandes quantidades nos meios
aquáticos e possuem grande representatividade na comunidade
microbiana que coloniza o trato intestinal de camarões marinhos,
podendo constituir cerca de 60% da microbiota bacteriana intestinal
(LIU et al., 2011).
Além dos víbrios, bactérias filamentosas, clamídias e
Pseudomonas também são relatadas como causadores de mortalidade
em larvicultura (MOURIÑO et al. 2008)
Nas fases de larvicultura e pré-berçário, as enfermidades
causadas por bactérias vibrionáceas, são as mais comuns. Para o
controle destas enfermidades, a remediação com antibióticos é uma
estratégia utilizada (BARBIERI JÚNIOR, 2001).
Contudo, o uso de antibióticos na aquicultura tem uma relação de
resistência por agentes patogênicos e podem causar toxidade aos
animais (SOTO-RODRIGUEZ et al, 2006).
Tendo em vista os aspectos negativos do uso de antibióticos, a
indústria tem vislumbrado outros métodos de profilaxia e remediação.
Os probiótico (NEWAJ-FYZUL et al., 2014) e ácidos orgânicos (ou
seus sais) (SILVA et al., 2013) têm sido utilizados em diversas áreas da
aquicultura, apresentando resultados promissores.
Dentro dessa concepção, Gatesoupe (1999) relata que já foram
estudados diversos probióticos com ação comprovada em aquicultura,
inclusive em camarões marinhos, Ringo (1991), em um dos primeiros
estudos com ácidos orgânicos, verificou o aumento do crescimento e
conversão alimentar em salvelino-ártico (Salvelinus alpinus)
alimentados com dieta suplementada com lactato de sódio.
Em cultivo de camarões marinhos ainda são poucos os estudos
realizados com ácidos orgânicos e seus sais, assim como probióticos,
nas fases iniciais de cultivo, sendo necessário avaliar seus efeitos em
larvicultura e pré-berçário.
1.1
Larvicultura
O processo de larvicultura de camarões marinhos consiste no
cultivo inicial dos animais, do estádio de náuplio 3/5 até o estádio de
pós-larvas 5. São usados tanques com volume entre 10 a 30 m³ e fundo
em formato de U para evitar o acúmulo de matéria orgânica. Os tanques
possuem ainda coluna de água alta, baseado no fato de que os animais
até a fase de pós-larva 5 (PL) possuírem hábito planctônico
21
(ANDREATTA; BELTRAME, 2004). A água utilizada nos cultivos é
marinha (pelo menos 30ppt de salinidade), desinfectada, pré-aquecida e
mantida em temperatura média de 28,5 ºC.
O sistema mais utilizado é o autotrófico intensivo com adição
diária de microalgas e a densidade média de 300 náuplios/L. Dentro dos
tanques de larvicultura, as larvas sofrem metamorfoses: náuplio 5,
protozoea 1, 2 e 3; misis 1, 2 e 3 e pós-larva 1, 2, 3, 4 e 5
(ANDREATTA; BELTRAME, 2004).
No estádio de protozoea, as larvas se alimentam basicamente de
microalgas, principalmente diatomáceas, que são repostas diariamente
ao longo da larvicultura, de acordo com o consumo. Á partir disso, as
larvas recebem, além das microalgas, alimentação formulada as
necessidades de cada estádio (BARBIERI JÚNIOR, 2001).
Para o controle da qualidade de água e diminuição de acúmulo de
metabólitos e matéria orgânica, à partir do estádio de misis, são
realizadas renovações de água diárias (com taxa que varia de 25 a 150%,
de acordo com o estádio larval) (ANDREATTA; BELTRAME, 2004).
Durante as metamorfoses, os animais sofrem grande estresse
orgânico, o que os torna mais sensível a patógenos oportunistas. Dentre
as doenças mais comuns estão as vibrioses e as Síndrome de Bolitas e de
protozoea (BARBIERI JÚNIOR, 2001).
Mesmo sem sofrer problemas, um ciclo de larvicultura tem a
média de sobrevivência de 50%, logo qualquer artifício que aumente a
sanidade e, consequentemente, a sobrevivência se torna importante
(ANDREATTA, 2012).
1.2
Pré-berçário
Para garantir uma maior sobrevivência dos animais provenientes
da larvicultura, as pós- larvas (dependendo da região do cultivo podem
ser entre PL5 e PL 10), são transferidas para os tanques de pré-berçário.
Estes tanques usualmente possuem volume entre 10-50 m³, com fundo
plano de grande área, já que as larvas neste estádio adquirem o hábito
bentônico (ANDREATTA, 2012).
No sistema de cultivo tradicional autotrófico, as pós-larvas são
povoadas de modo intensivo. Neste sistema, os tanques são préadicionados com microalgas (diatomáceas ou clorófitas) que podem ser
de uma ou mais espécies. A transparência da água deve ser mantida
entre 30 a 40cm para o sombreamento e conforto das larvas, que são
fotossensíveis. Os tanques são mantidos em constante aeração e com
temperatura controlada acima de 26ºC (SCHVEITZER, 2006).
22
Renovações de água são feitas quando a carga de matéria
orgânica é muito grande ou parâmetros de água estão fora dos
recomendados para a espécie. Normalmente o ciclo de pré-berçário
finaliza quando os animais atingem o estádio de PL 20 (ANDREATTA;
BELTRAME, 2004).
Estudos apontam que entre PL 25 e 35 as larvas do camarão
Farfantepenaeus duorarum atingem a máxima capacidade
osmerregulatória (CRIALES et al., 2011), justificando o uso desse
manejo para aumentar a produtividade na fase de berçário.
1.3
Mecanismos profiláticos
carcinicultura marinha
contra
bacterioses
na
Com o incremento de matéria orgânica ao longo do ciclo de
larvicultura e pré-berçário, a carga bacteriana aumenta
exponencialmente, predispondo ainda mais o desequilíbrio do sistema.
Mesmo mantendo-se medidas de boas práticas de manejo, pequenos
distúrbios alimentares ou na qualidade de água podem beneficiar a
proliferação de microrganismos saprófitas e oportunistas, causando
patologias (MOURIÑO et al., 2008).
Diante dos patógenos de origem bacteriana, a alternativa para
evitar mortalidades é o uso de antibióticos, que aplicados de forma
correta debelam a infecção (LIGHTNER et al., 2012b). Porém o uso
contínuo e inadequado promove a seleção de bactérias resistentes que,
além de afetarem o cultivo, podem transmitir resistência para patógenos
bacterianos humanos.
Seguindo o exemplo da União Europeia, diversos outros países
tem abolido o uso de antibióticos na produção animal, sendo esta uma
ação de tendência mundial (LÜCKSTÄDTS, 2006).
Antibióticos são eficazes na redução de bactérias, porém podem
gerar toxidade para as larvas (SOTO-RODRIGUEZ et al., 2006).
Baticados et al. (1990) responsabilizam o uso de diversos antibióticos
pelo aparecimento de deformidades em fases larvais de Litopenaeus
vannamei, mostrando um dos pontos negativos desta prática.
Adicionalmente, todo fármaco, inclusive antibiótico, tem chance
de atingir o ambiente aquático (Figura 1). Os antibióticos podem se
acumular em diversos organismos primários à cadeia trófica, podendo
intoxicar animais que venham a consumi-los (REGITANO; LEAL,
2010).
Além disso, seus compostos de degradação e frutos de seu
metabolismo contidos nas excretas de humanos e animais de cultivo,
23
também podem ser tóxicos a diversos organismos (RODRIGUESSILVA et al., 2014).
Embora dose e espécie dependente, os antibióticos possuem um
alto fator impactante ao ambiente, podendo gerar resistência pelas
bactérias, inclusive patógenas (HOLMSTRÖM et al., 2003).
Com o intuito de promover sustentabilidade e de minimizar
impactos ambientais, outros métodos profiláticos têm sido
desenvolvidos, como o uso de probiótico, prebiótico (RAMIREZ et al,
2013) e os mais recentes como bacteriófagos (CHRISOLITE et al.
2008), óleos essenciais de origem vegetal (RANDRIANARIVELO et al.
2010) e ácidos orgânicos e seus sais (MINE; BOOPHATY 2011).
1.4
Uso de antibióticos na larvicultura e pré-berçário.
Diversas drogas têm potencial de inibição aos principais
patógenos em larvicultura e pré-berçário de camarão marinho
(BATICADOS et al., 1990). Soto-Rodriguez et al. (2006) observaram
que enrofloxacino e florfenicol diminuíram a carga bacteriana de víbrios
em um ciclo de larvicultura, porém em doses elevadas geravam
toxidade.
O enrofloxacino é um antibiótico de fácil acesso, com custo
relativamente baixo, largamente utilizado em medicina veterinária e
apresenta ação contra diversas bactérias patógenas relacionadas à
aquicultura (SOTO-RODRIGUEZ et al., 2006).
Pertencente ao grupo das quinolonas, o enrofloxacino tem
espectro de ação contra uma extensa classe de bactérias como riquétsias,
clamídias, micoplasmas como também para as bactérias gram-negativas
e gram-positivas, incluindo as resistentes aos antibióticos β-lactâmicos e
sulfonamidas (FRANÇA, 2004). Este antibiótico age inibindo a síntese
da DNA-girase da bactéria, proporcionando a inibição do crescimento
bacteriano (MANDELL; SANDE, 1990).
Contudo, a utilização indiscriminada de antibióticos pode
proporcionar resistência por algumas bactérias, inclusive patogênicas,
dificultando a ação remediativa diante a uma doença (BATICADOS et
al., 1990; KARUNASAGAR et al., 1994).
Um estudo feito por Lima et al. (2006) demonstrou que diferentes
isolados bacterianos em cultivo de tilápias, apresentavam resistência a
pelo menos dois antibióticos.
Além disso, contaminações ambientais com antibióticos
provenientes de diversas vias (Figura 1), podem perpetuar de forma
acumulativa em diversos indivíduos dos primeiros níveis tróficos,
24
causando consequências agudas e em longo prazo (REGITANO; LEAL,
2010).
Outra problemática ao uso de antibióticos é a dificuldade de
estabelecer doses seguras ao cultivo, onde muitas vezes a concentração
letal 50 (CL50) é apenas duas vezes e meia a dose terapêutica (SOTORODRIGUEZ et al., 2006).
Figura 1 Principais rotas ambientais de fármacos. Destaque para a pequena
contribuição proveniente da aquicultura.
Como preconizado pelo MAPA (2010), o único antibiótico
permitido para uso em aquicultura no Brasil é o Florfenicol, porém, o
Aquaflor® está limitado aos cultivos de tilápias e trutas, de acordo com
o seu fabricante.
Logo, para o cumprimento da legislação vigente e o seguimento
da tendência mundial, o desenvolvimento de mecanismos profiláticos
alternativos é necessário, apresentando um desafio para pesquisadores
no mundo todo.
25
1.5
Uso de probióticos na larvicultura e pré-berçário de
camarões marinhos
Os probióticos são usados há muito tempo no cultivo animal,
incluindo a aquicultura. De acordo com a definição de Gatesoupe
(1999), probiótico é qualquer microrganismo vivo que ao ser ministrado,
coloniza o trato digestório dos animais de cultivo com o objetivo de
melhorar a saúde destes animais.
Esta definição ainda é ainda dividida em mais duas classes de
microrganismos que podem beneficiar um cultivo: os biorremediadores
que melhoram a qualidade de água e os biocontroladores que
antagonizam o crescimento de patógenos sem colonizar o trato
(GATESOUPE, 1999).
Figura 2 Método de determinação in vitro de inibição de bactérias patogênicas
por bactérias probióticas (Vieira, 2010).
Dentre as bactérias com potencial probiótico, destacam-se, na
carcinicultura marinha, os Bacillus, os Vibrios e as bactérias ácidoláticas. A inibição contra patógenos por parte de bactérias probióticas
pode ser visualizada em ensaios in vitro (Figura 2), sendo essa uma
excelente ferramenta inicial de seleção de cepas probióticas.
A grande maioria das bactérias com potencial probiótico promove
inibição de microrganismos patogênicos através da produção de diversas
substâncias, entre elas ácidos orgânicos (VÁZQUES et al, 2005),
26
bacteriocinas (GILLOR et al., 2008), reuterim (TALARICO et al.,
1998), peróxido de hidrogênio (SUGITA et al., 2007).
Também são mecanismos a competição por nutrientes e fixação
no substrato, além da produção de diversos outros componentes (VINE
et al., 2006; KESARCODI-WATSON et al, 2008).
Muitos são os efeitos benéficos do uso de probiótico nas fases
iniciais de cultivo de camarões. Vieira et al. (2010) obtiveram, após o
uso de probiótico em larvas de L. vannamei, uma maior sobrevivência à
infecção experimental com Vibrio harveyi, diminuição da contagem de
vibrionáceas e melhoria da atividade natatória.
Também suplementando a dieta com L. plantarum durante 15
dias em L. vannamei, Buglione-Neto et al. (2008) encontraram aumento
de quase 20% na sobrevivência ao teste de estresse e aumento de 14%
após infecção experimental com Vibrio harveyi, em pós-larvas 20.
O uso de Bacillus subtilis como probiótico promoveu diminuição
de Vibrio spp. na água da larvicultura de L. vannamei, além de aumentar
a expressão gênica de proPO (pro-Fenoloxidase) e sobrevivência ao
teste de estresse (LIU et al. 2010).
De acordo com Zhou et al. 2009, a suplementação de Bacillus
coagulans pode aumentar a sobrevivência e a atividade de algumas
enzimas digestivas ao longo da fase de larvicultura de L. vannamei.
Guo et al. 2009, ao testarem três bactérias com potencial
probiótico, observaram que mesmo apresentando forte inibição in vitro
para Streptococcus iniae e Photobacterium damselae subsp. Piscicida,
os tratamentos com aplicação de Bacillus cereus biovar toyoi
apresentaram grande mortalidade em larvicultura de Penaeus monodon.
Isto demonstra que a escolha de um probiótico também depende
da ação sobre o espécime de cultivo, não se restringindo apenas ao
poder de inibição de patógenos.
1.6
Ácidos orgânicos e seus sais em cultivo de camarões
marinhos
O método de ação dos ácidos orgânicos sobre as bactérias,
principalmente Gram-negativas, consiste em penetrar, sob sua forma
não ionizada na membrana citoplasmática e desequilibrar o balanço
ácido básico no interior da célula, causando a morte bacteriana por
exaustão (Figura 3) (LÜCKSTÄDTS, 2008, DEFOIRDT et al., 2009).
Os ácidos orgânicos podem também diminuir a absorção de ferro
pelas bactérias patogênicas por formarem complexos quelantes, inibindo
seu crescimento (JONES, 1998; CARDOSO; NOGUEIRA, 2007).
27
Podem também influenciar na absorção de nutrientes e na ação de
enzimas digestivas, pelo fato de diminuírem o pH da dieta, quando
inclusos na ração, consequentemente diminuindo o pH no trato
gastrointestinal (LÜCKSTÄDTS, 2008; NOLASCO, apud SILVA,
2014).
Figura 3 - Mecanismo de ação de ácidos orgânicos no interior das bactérias. (1)
Atravessam a membrana plasmática, (2) dissociam-se no citoplasma e (3)
obrigam o gasto de energia pela exportação de prótons. Adaptado de Defoirdt et
al. (2009).
Ainda hoje há limitações de estudos e resultados do uso de ácido
orgânico no cultivo de camarões marinhos (Quadro 1). Lückstädts
(2008) relatou a existência de apenas dois trabalhos até o ano de 2008.
Um deles relata a adição de 0,5% de citrato de sódio com
lactobacilos inativados proporcionando o crescimento do camarão
Masurpenaeus japonicus. Outro estudo sugere que uma dose de 0,25%
de formiato de cálcio melhora a sobrevivência do Penaeus monodon em
fazendas de Taiwan. Em estudos mais recentes com L. vannamei, o uso
de potássio diformiato suplementado na dieta de juvenis proporcionou
valores superiores de ganho em peso e sobrevivência, representando um
aumento na produtividade (KÜHLMANN et al., 2011).
Dos sais orgânicos testados por Silva et al. (2013), o butirato de
sódio proporcionou maior atratividade e melhorou o consumo de ração
por junvenis de L. vannamei. Os sais propionato e lactato de sódio
proporcionaram uma redução nas contagens de bactérias vibrionáceas
no intestino dos camarões.
28
Tabela 1 - Principais ácidos e sais orgânicos e seus efeitos, utilizados em
carcinicultura marinha.
Sal orgânico
Espécie
Marsurpenaeus
Citrato de sódio (0,5%)
japonicus
Formiato de cálcio
Penaeus
(0,25%)
monodon
Potássio diformiato
Litopenaeus
(0,5%)
vannamei
Acetato, butirato,
citrato, formiato,
propionato lactato (2%)
L. vannamei
Efeito
Aumento do
crescimento.
Aumento da
sobrevivência.
Aumento na
produtividade.
Mudanças na
atratividade,
consumo e
digestibilidade.
Autor
Lückstädts
(2008).
Lückstädts
(2008).
Kühlmann et al.
(2011).
Silva et al.
(2013).
O propionato de sódio, além de possuir a mínima concentração
inibitória (MIC) contra os microrganismos testados, proporcionou maior
coeficiente de digestibilidade aparente de energia e fósforo em engorda
experimental de camarão em água clara (SILVA, 2014).
Outros dados referentes ao uso de sais orgânicos indicam que
camarões alimentados com as dietas suplementadas com o propionato e
o butirato apresentaram maior peso final e o ganho de peso semanal, e
que a suplementação da dieta com 2% de butirato aumentou a eficiência
alimentar e a sobrevivência dos camarões (SILVA, 2014).
Além disso, Silva (2014) observou que os camarões alimentados
com as dietas contendo 0,5% e 2% de butirato apresentaram maior
produtividade final, retenção de nitrogênio e taxa de eficiência proteica.
Adicionalmente, na análise do DGGE, doses acima de 0,5% de butirato
e 1% de propionato causaram alterações na comunidade bacteriana
intestinal. O butirato de sódio ainda proporcionou o aumento do título
aglutinante do soro, quando comparados com os camarões do controle
antes do desafio com Vibrio spp.
Como o uso de ácidos orgânicos e seus sais ainda é um tema
recente na fase de larvicultura e pré-berçário de camarões marinhos,
ainda não se tem resultados expressivos e publicados, necessitando de
investigações do uso nestas fases de cultivo.
2
JUSTIFICATIVA
O uso inadequado de antibióticos na aquicultura resulta na
seleção de bactérias resistentes, além de serem potenciais poluidores
ambientais. Por conta destes fatores, há a necessidade de buscar
métodos alternativos ao uso curativo e profilático de doenças. Sendo
29
assim, probióticos e sais orgânicos podem ser boas alternativas na
substituição dos antibióticos em aquicultura.
Probióticos já são conhecidos por aumentar sobrevivência em
camarões infectados com diferentes patógenos (CASTEX et al., 2010;
VIEIRA et al., 2010) e por melhorar a resposta imunológica (CHIU et
al., 2007). Os sais orgânicos têm sido usados em aquicultura em
algumas espécies de peixe e de crustáceos, demonstrando uma melhoria
no desempenho dos animais e melhorando crescimento, digestibilidade
de nutrientes ou sobrevivência (BARUAH et al., 2005,2007; RAMLI et
al., 2005; SARKER et al., 2005; HOSSAIN et al., 2007; KÜHLMANN
et al., 2011).
A escolha do antibiótico e dos sais orgânicos teve base em testes
de antibiograma e de mínima concentração inibitória, além de pré-testes
in vivo.
Contudo trabalhos com sais orgânicos em camarão são limitados.
Estes sais poderiam ser utilizados como inibidores de crescimento
bacteriano em larvicultura, ministrados diretamente na água e aspergido
isoladamente ou em conjunto com probiótico na ração de larvas em préberçário, em dose estabelecida por mínima concentração inibitória in
vitro, obtendo efeito semelhante a antibióticos ou melhorando a
digestibilidade, porém sem agressão ambiental.
3
HIPÓTESE
A inserção de sais orgânicos e probiótico influenciarão
positivamente nos índices zootécnicos e concentrações de bactérias na
larvicultura e pré-berçário do camarão Litopenaeus vannamei.
4
OBJETIVOS
4.1
Objetivo geral
Fomentar informações sobre o uso de sais orgânicos nas fases de
larvicultura e pré-berçário do camarão branco do Pacífico, contribuindo
com a saúde do animal e visando diminuir o impacto ambiental causado
por antibióticos sintéticos.
4.2

Objetivos específicos
Avaliar os efeitos do uso de enrofloxacino, probiótico
(Lactobacillus plantarum) e propionato de sódio na fase de
larvicultura do camarão branco do pacífico quanto a:
30

5
o Sobrevivência e peso final das larvas;
o Quantificação da microbiota da água e larvas;
o Sobrevivência ao teste de estresse;
o Comprimento final das larvas;
Comparar os efeitos do uso de probiótico (L. plantarum),
butirato de sódio e sua interação na fase de pré-berçário do
camarão branco do pacífico quanto a:
o Sobrevivência e peso final das larvas;
o Quantificação da microbiota das larvas;
o Qualidade larval e teste de estresse;
o Comprimento final das larvas;
o Morfologia do intestino médio sob microscopia óptica.
FORMATAÇÃO DOS ARTIGOS
A dissertação esta dividida em três capítulos, onde o primeiro se
refere à introdução e revisão de literatura e os demais referentes a dois
artigos, formatados de acordo com a revista “Acta Scientiarum – Animal
Sciences”
31
CAPITULO II
Utilização comparativa de enrofloxacino, probiótico (Lactobacilus
plantarum) e propionato de sódio na larvicultura de camarão
branco do Pacífico.
Marcello Mendes dos Santos Junior1*; José Luiz Pedreira Mouriño1;
Felipe do Nascimento Vieira1
1
Universidade Federal de Santa Catarina, Departamento de Aquicultura,
Laboratório de Camarões Marinhos, Servidão dos Coroas número 503,
Barra da Lagoa, 88061-600, Florianópolis, SC, Brasil.
*[email protected]
*Artigo formatado de acordo com as normas da revista “Acta
Scientiarum- Animal Sciences”
32
6
RESUMO
O objetivo do presente trabalho foi avaliar métodos de controle e
tratamento de bacterioses na larvicultura de Litopenaeus vannamei,
avaliando o uso contínuo de probiótico e o uso pontual de enrofloxacino
15mg/L-1 e propionato de sódio 0,5 mM/L-1 nos momentos de
metamorfose sobre os, parâmetros zootécnicos e microbiológicos das
larvas e da água. Foram utilizadas 16 unidades de 60L, povoadas com
325 náuplios 5 por litro, divididos em três tratamentos: enrofloxacino,
probiótico, propionato de sódio e controle. O enrofloxacino e propionato
foram ministrados em protozoea 3, misis 3 e pós-larva 4 e o probiótico
foi ministrado na ração ao longo de 15 dias. O probiótico aumentou as
contagens de bactérias ácido-láticas em relação a todos tratamentos na
água de cultivo (p=0,00001) e em relação ao enrofloxacino e
proprionato nas larvas (p=0,0048). A água dos animais tratados com
probiótico apresentou menor contagem de víbrios do que a tratada com
enrofloxacino (p=0,0011) e a tratada com probiótico apresentaram
menor contagem de víbrios que o propionato (p=0,0158). Contudo, não
foi observada diferença nos índices zootécnicos. Assim, os aditivos na
dose utilizada não alteram parâmetros zootécnicos da larvicultura de
camarão L. vannamei da fase de náuplio 5 até pós-larva 5.
Palavras-chave: Litopenaeus vannamei, vibriose, ácido orgânico,
profilaxia, antibiótico.
33
7
ABSTRACT
The objective of this study was to evaluate methods of control and
treatment of bacterial diseases in Litopenaeus vannamei, evaluating the
continued use of probiotic and timely use of enrofloxacin 15mg/L-1 and
sodium propionate 0.5 mM/L-1 in moments morph on, zootechnical and
microbiological parameters of larvae and water. enrofloxacin, probiotic,
sodium propionate and control: 16 units 60L, stocked with 5 325 nauplii
per liter, divided into three treatments were used. The enrofloxacin and
propionate were administered into protozoea 3 misis 3 and 4 and the
post probiotic larva was administered in the diet throughout the
experiment. The increased counts of probiotic lactic acid bacteria for all
treatments in culture (p = 0.00001) and water relative to the propionate
larvae and enrofloxacin (p = 0.0048). Water treatment with probiotic
had lower counts of vibrios that enrofloxacin (p = 0.0011) and larvae
treated with probiotic showed lower counts of vibrios that propionate (p
= 0.0158). However, no difference was observed in the evaluated
performance indexes. Thus, the additives in the dose used did not alter
performance parameters of L. vannamei shrimp hatchery phase 5 to
post-nauplius larva 5.
Keywords: Litopenaeus vannamei, organics salts, prophilaxis, vibriosis,
antibiotics.
34
8
INTRODUÇÃO
A larvicultura de camarões marinhos é um importante elo da
cadeia produtiva. Atualmente a produção mundial de camarões
marinhos supera 3 milhões de toneladas (FAO-FISHSTAT, 2014) e
praticamente todo o camarão cultivado provém da produção de larvas
em laboratório.
Após a fase de incubação, as larvas entre náuplio 3 e 5 são
povoadas em tanques com adequada coluna de água com fundo em
formato de U, em sistema intensivo autotrófico, com troca de água e
aeração e aquecimento constante. Até atingirem a fase de pós larva, as
larvas passam pelos estádios de náuplio, protozoea 1, 2 e 3 e misis 1, 2 e
3. A despesca, dependendo da região e época do ano, acontece entre 5 e
10 dias após os animais atingirem o estádio de pós larva (ANDREATA;
BELTRAME, 2004).
Devido à sensibilização orgânica causada pelas diversas fases de
metamorfose, principalmente na troca de estádios de protozoea 3/misis 1
e misis 3/pós-larva 1, as bacterioses são, de forma primária ou
secundária, causadoras das maiores mortalidades na larvicultura. Dentre
estas, bactérias do gênero Vibrio são os principais agentes patogênicos,
como é o caso da síndrome de protozoea e síndrome de bolitas
(VANDENBERGHE et al., 1999).
Os tratamentos a base de antimicrobianos sintéticos, como a
tetraciclina, são eficazes, porém podem agredir o ambiente e selecionar
bactérias resistentes, além de causar efeitos orgânicos adversos, tanto
em animais domésticos como em humanos (SILVA, 1998).
Em Pennaeus monodon o uso de oxitetraciclina, cloranfenicol e
diversos outros antibióticos, resultou em deformidade no rostro,
carapaça e cerdas (BATICADOS et al., 1990). De acordo com SotoRodriguez et al. (2006), doses de 20mg/L de enrofloxacino na água de
cultivo teriam efeito inibitório contra V. campbellii, porém apresentaram
toxidade para os estádios de protozoea 1 e 2 de Litopenaeus vannamei e
ainda uma dose letal 50% (DL 50) com apenas um pouco mais que o
dobro da dose medicamentosa.
Atualmente, formas alternativas de prevenção e tratamento de
bacterioses têm sido desenvolvidas, dentre elas o uso de
imunoestimulantes, probiótico, prebióticos, fitoterápicos, bacteriófagos
e ácidos orgânicos (MINE; BOOPATHY, 2011).
Entre os probióticos, destacam-se as bactérias ácido-láticas. Estas
produzem uma gama de compostos antimicrobianos, entre eles os ácidos
orgânicos (MA, et al., 2009). Estudos com cepas de bactérias ácido-
35
láticas comprovaram que seu potencial de inibição contra bactérias
patogênicas se deve muito pela produção de ácidos orgânicos,
principalmente os ácidos acético e láctico (VAZQUEZ et al., 2005)
Assim, o uso dos ácidos orgânicos poderia ter um efeito benéfico
na larvicultura. Silva et al. (2013), avaliaram seis diferentes sais
orgânicos e observaram que butirato de sódio, propionato de sódio e
acetato de sódio tiveram os melhores resultados para inibição in vitro
contra a V. alginolyticus, V. harveyi e V. anguilarum, com destaque para
o propionato de sódio, que apresentou as menores mínimas
concentrações inibitórias para todos os agentes patógenos testados. Tais
resultados sugerem que o propionato de sódio seja um método de
profilaxia e remediação contra microrganismos patógenos e
oportunistas.
Adicionalmente, além de proporcionar inibição bacteriana,
probiótico, ácidos orgânicos e seus sais em camarões marinhos, podem
melhorar a digestibilidade por meio do aumento ou da melhoria de ação
de enzimas digestivas (ZHOU et al., 2009; NOLASCO apud SILVA et
al., 2013).
Também podem aumentar resistência ao teste de estresse por
alteração de salinidade e ainda podem melhorar a condição imunológica,
visto através do aumento da expressão gênica de profenoloxidase I e II e
lizosima (LIU et al., 2010).
O objetivo deste estudo foi avaliar diferentes mecanismos de
controle e tratamento de bacterioses na larvicultura de L. vannamei,
avaliando o uso contínuo de probiótico e o uso pontual de enrofloxacino
15mg/L-1 e propionato de sódio 0,5 mM/L-1 nos momentos de
metamorfose sobre os parâmetros zootécnicos e microbiológicos das
larvas e da água.
9
MATERIAL E MÉTODOS
9.1
Material biológico e estabelecimento da dose do sal
orgânico
O experimento foi realizado no laboratório de Camarões
Marinhos da Universidade Federal de Santa Catarina – LCM-UFSC, no
período de 11 de Dezembro de 2013 a 24 de Dezembro de 2013.
Para determinar uma dose segura, foi observada a sobrevivência
de larvas nos estádios de protozoea 3, misis 3 e pós-larva 7 expostas ao
sal orgânico propionato de sódio. Cada estádio larval foi exposto por 24
36
horas em triplicata nas concentrações de 0; 0,1; 0,5; 1; 5 e 10 mM/L de
propionato de sódio.
Foram utilizadas unidades cilindrocônicas com 1L de água
marinha povoadas com 50 larvas cada, retiradas de tanques de
larvicultura do LCM-UFSC, e adicionadas da microalga Chaetoceros
mulleri na concentração de 5 x 104 cel/mL.
As unidades continham aeração continua e aquecimento
constante (28±1ºC). Ao longo das 24 horas do experimento, os animais
foram alimentados três vezes com ração microparticulada comercial. Ao
final do experimento, as larvas vivas foram contadas, calculando-se a
sobrevivência final.
9.2
Delineamento experimental
Foram utilizadas 16 unidades experimentais com fundo em U
com capacidade de 60L, providas de aeração e aquecimento (Anexo I)
Cada unidade foi povoada com 19.500 náuplios V de Litopenaeus
vannamei provenientes de linhagem livre de patógenos espcíficos (SPF,
do inglês Specified Pathogen Free) provenientes da Aquatec
Larvicultura de Camarão Marinho – RN, em água previamente
adicionada de microalgas Chaetoceros muelleri na concentração.
O antibiótico enrofloxacino foi escolhido através de teste de
antibiograma com cepas de Vibrio sp. isoladas em surtos de mortalidade
no Laboratório de Camarões Marinhos e o sal orgânico escolhido
através de resultados de testes mínima dose inibitória com cepas de
Vibrio sp. do banco de cepas do setor de microbiologia do LCM-UFSC.
Os tratamentos consistiam em alimentação suplementada com
Lactobacillus plantarum (1x107 UFC/mL) adicionados na ração na
proporção de 10mL/grama de ração, enrofloxacino 15mg/L na água de
cultivo de forma pontual (protozoea 3, misis 3 e pós-larva 4), propionato
de sódio 0,5 mM/L na água de cultivo de forma pontual (protozoea 3,
misis 3 e pós-larva 4) e controle.
As larvas foram alimentadas em quantidade e qualidade
pertinente a cada fase larval (Tabela 2), com dietas comerciais
microencapsuladas INVE® (INVE Aquaculture Inc., Salt Lake City,
UT, USA) (Anexo II).
37
Tabela 2 Manejo alimentar utilizado noexperimento de larvicultura de
Litopenaeus vannamei. Níveis de Garantia INVE® (SP+=Proteína Bruta
48%; Estrato etéreo: 3%; Umidade: 8%; Matéria fibrosa: 3%; Matéria
mineral: 13%; Cálcio: 1,1%; Fósforo: 1%; ZM= Proteína Bruta
48%:;Estrato etéreo: 13%; Umidade: 8% ; Matéria fibrosa: 2,5% ;
Matéria mineral: 13%; Cálcio: 0,7%; Fósforo: 1%; MPL= Proteína
Bruta 48%:;Estrato etéreo: 9%; Umidade: 9% ; Matéria fibrosa: 2,5% ;
Matéria mineral: 13%; Cálcio: 1,6%; Fósforo: 1%).
ARTÊMIA
FITOPLÂNCTON CONGELADA
(x10.000 cel/mL) (Náuplios / PósSUB
larva)
ESTÁDIO
C. muelleri
RAÇÃO
(gramas / milhão de
larva / dia)
Alimento Quantidade
N5
Z1
5
10
SP+
25
Z2
Z23
Z3
10
10
10
SP+
SP+
SP+
30
35
40
Z3/M1
M1
M2
M3
5
6
6
6
ZM
ZM
ZM
ZM
45
55
55
60
M 3 / PL 1
PL 1
PL 2
PL 3
PL 4
PL 5
6
5
5
5
5
5
MPL
MPL
MPL
MPL
MPL
MPL
65
65
70
70
75
75
9
9
9
9
9
9
A renovação de 50% do volume de água foi feita por sifonagem,
e somente a partir da fase de misis, uma vez ao dia até o término do
experimento. As análises de amônia total foram feitas através da técnica
colorimétrica de APHA (1995), aplicada nas amostras de água coletada
de cada tanque experimental no dia do início do experimento e 24 horas
após a aplicação dos tratamentos.
38
A bactéria probiótica Lactobacilus plantarum (Vieira et al. 2013)
foi repicada em dois tubos de ensaio contendo 20 mL de meio de cultura
Man Rogosa e Sharpe (MRS) caldo e incubada a 35°C por 48hs. Em
seguida, os dois tubos foram repicados para um frasco contendo 200 mL
de meio de cultura alternativo para bactérias probióticas (30g/L de soro
de leite, 20g/L sacarose e 30g/L de cloreto de sódio) e incubadas a 35°C
por 24hs.
Após atingir a concentração média de 1x107 UFC/mL através da
leitura da absorbância, o probiótico, em volume de 10 mL/g, foi
incubado por 24hs na ração diariamente, e então administrado para
grupo probiótico.
Para os grupos enrofloxacino e propionato de sódio, as
substâncias foram diluídas em água salgada e administradas nas
unidades em dose referente a concentração desejada nas fases de
principal metamorfose (protozoea 3 e misis 3) e de estresse de
transferência para o pré-berçário (pós-larva 4).
9.3
Análise microbiológica
Em misis 1, pós-larva 1 e pós-larva 5, frações de água foram
coletadas em tubo estéril para analise microbiológica em diluições de
10-1 até 10-5 semeadas em meio de cultura Ágar Marine (contagem total
de bactérias), Ágar Tiossulfato Citrato Bile Sacarose (TCBS, para
Vibrio spp.) e Ágar de Man Rogosa e Sharpe (MRS, para bactérias
ácido-láticas). As placas após serem semeadas foram incubadas a 30ºC.
Quando as os animais atingiram o estádio de pós-larva 5 uma
amostra de larvas foi macerada e também semeada utilizando a mesma
metodologia utilizada nas amostras de água (Anexo III).
As colônias bacterianas crescidas em 24hs (TCBS e Marine) e
48hs (MRS), foram aferidas em unidades formadoras de colônia (UFC)
e ajustadas para UFC/mL no caso da água do cultivo e em UFC/g no
caso do macerado de larvas.
9.4
Teste de estresse
Para o teste de estresse foram recrutadas 50 pós-larvas cinco por
unidade e desafiadas em salinidade 19 ppt por 30 minutos em béqueres
de 1L contendo 500 mL de água, devolvidas à salinidade de 35 ppt por
mais 30 minutos em béqueres de mesmo volume. Após este período, foi
computada a mortalidade.
39
9.5
Sobrevivência final e comprimento das larvas
Na despesca final o volume total de larvas foi pesado, uma
alíquota de 100 larvas retirada para biometria úmida e então extrapolada
a quantidade total de larvas de cada unidade experimental (Anexo V).
Um total de trinta larvas foram medidas através de estereomicroscópio
NIKON® SMZ-745 com lente com escala micrométrica (Anexo IV), e
ao aumento de 1x, no Laboratório de Peixe Marinho – LAPMAR UFSC.
9.6
Análises estatísticas
Os dados de sobrevivência foram transformados em arcoseno e os
dados de contagem bacterianas transformados em Log 10. Todos os
dados foram analisados, após as premissas de normalidade e
homocedasticidade (Levene), por análise de variância (ANOVA),
suplementadas pelo teste de Tukey de separação de médias, ambos ao
nível de significância de 5%.
10
RESULTADOS E DISCUSSÃO
No teste para estabelecimento de dose do sal orgânico, a
mortalidade foi significativa apenas em protozoea 3 com doses de
propionato de sódio a partir de 0,5 mM/L (p=0,0110).
Os parâmetros de qualidade de água se mantiveram com oxigênio
dissolvido acima de 5mg/L, temperatura média de 28±1ºC e amônia
tóxica próximo de zero, ou seja, valores aceitáveis para a espécie
cultivada (BOYD; GAUTIER, 2000).
As contagens de bactérias ácido-láticas na água de cultivo do
tratamento com probiótico foram maiores em relação aos outros
tratamentos (p=0,000015) (Figura 4). Já a contagem presuntiva de
bactérias vibrionáceas foi menor na água dos animais tratados com
probiótico quando comparada com o tratamento com enrofloxacino com
p=0,011503, porém, permanecendo igual aos demais tratamentos
(Figura 4).
Como o probiótico foi fornecido diariamente, as contagens de
bactérias ácido-láticas na água foram possíveis, inclusive porque L.
plantarum é aerotolerante e embora não apresente crescimento
significativo, ainda consegue manter funções fisiológicas básicas
(MADIGAN et al., 2004).
Já o crescimento de bactérias vibrionáceas elevado na água do
tratamento com enrofloxacino, pode ter ocorrido pela eliminação de
40
bactérias sensíveis e, por consequência, diminuição de competição e
crescimento das mais resistentes, no caso, crescimento de vibriões.
Adicionalmente, o enrofloxacino pode ter interferido na
comunicação bacteriana dos vibriões. Isto porque, móleculas
classificadas como quinolonas estão relacionadas com o mecanismo de
quorum sensing (SOLA et al., 2012).
Figura 4 Crescimento em unidades formadoras de colônia em por mililitro
(UFC/mL Log10) de bactérias totais e vibrionáceas após 24 horas e ácido-láticas
após 48 horas do na água da larvicultura dos tratamentos com Propionato de
sódio 0,5mM/L, Enrofloxacino 15mg/L e Probiótico 10mL/g de ração em três
coletas de água de cultivo após as principais metamorfoses. Letras diferentes
indicam diferença estatística ao teste de Tukey (p<0,05)
O enrofloxacino é uma droga antibiótica integrante do grupo das
fluorquinolonas, capaz de interferir na síntese de DNA-girase. De
acordo com Knapp et al. (2005), após exposição de 100% de luz o
enrofloxacino tem meia vida no ambiente aquático de 0,8 dias,
transformando-se em ciprofloxacino que degrada-se também na
presença de luz.
Compostos provenientes da degradação do ciprofloxacino não
são bem conhecidos e difíceis de caracterizar, podendo ser em alguns
casos tóxicos ao ambiente (RODRIGUES-SILVA et al., 2014). Estes
compostos poderiam ser semelhantes ou análogos às quinolonas do
sistema de quorum sensing, promovendo ou facilitando o crescimento
de determinado grupo bacteriano.
41
Tendo em vista que o pH da água de cultivo ficou em média 7,6 e
a ação dos sais orgânicos é mais efetiva em pH ácido, talvez a dose
utilizada não tenha sido efetiva na inibição de crescimento bacteriano, já
que o tratamento com propionato não proporcionou diminuição na
contagem de bactérias vibrionáceas.
Em testes de inibição in vitro, doses de propionato de sódio
quatro vezes menores foram efetivas contra Vibrio anguillarum ATCC
19264, V. alginolyticus BCCM 2068, V. harveyi ATCC 14126 em pH
6,2, porém, doses maiores que 0,5 mM/L são necessárias para causar
efeito inibitório em pH 7,1 (SILVA et al., 2013).
Também foram observadas maiores contagens de bactérias ácidoláticas no macerado de larvas, porém, apenas em relação aos
tratamentos propionato de sódio e enrofloxacino (p=0,00485) (Figura 5).
Maiores contagens de bactérias ácido-láticas proveniente do
macerado de larvas no tratamento contendo probiótico condizem com o
estudo feito por Vieira et al. (2010), que encontraram maiores contagens
de bactérias ácido-láticas em macerado de larvas alimentadas com ração
suplementada de L. plantarum.
No macerado de larvas tradadas com probiótico também foi
visualizado menor crescimento de vibriões, porém, apenas quando
comparado as larvas tratadas com propionato (p=0,0158).
Contudo, o tratamento com probiótico L. plantarum diminuiu a
concentração de víbrio no trato de camarões adultos estando de acordo
com Ramirez et al. (2013) e na água de cultivo de larvicultura, como
observado por Liu et al. (2010). Em nosso estudo isso não foi
visualizado, já que não houve diferença em relação ao controle.
Figura 5 Crescimento em unidades formadoras de colônia em por grama
(UFC/g Log10) de bactérias totais e vibrionáceas após 24 horas e ácido-láticas
após 48 horas do no macerado de pós-larvas 5 tratadas com os tratamentos com
42
Propionato de sódio 0,5mM/L, Enrofloxacino 15mg/L nas principais
metamorfoses e Probiótico 10mL/g de ração ao longo de todo cultivo. Letras
diferentes indicam diferença estatística ao teste de Tukey (p<0,05)
Todos os tratamentos apresentaram contagens de vibrionáceas na
água superiores a 1x104 UFC/mL (Figura 4), porém, não foi observada
diferença na sobrevivência final (Tabela 3). De acordo com Mouriño et
al. (2007) contagens de vibriões acima de 1x104 UFC/mL proporcionam
alterações na qualidade larval e morte larval, o que não foi observado
em nosso trabalho.
Tabela 3 - Parâmetros zootécnicos da larvicultura de camarões
marinhos da espécie Litopenaeus vannamei submetida aos tratamentos
propionato de sódio 0,5mM/L, enrofloxacino 15mg/L, probiótico
10mL/g de ração e controle do estádio de náuplio 5 até pós-larva 5.
Controle
Propionato
Probiótico Enrofloxacino p-valor
de sódio
Sobrevivência
(%)
60,19
±18,14
29,13
±14,34
42,80
±7,92
44,41
±17,90
0,1865
Teste de
estresse (%)
95,00
±1,00ab
94,97
±2,25ab
96,05
±1,63a
91,03
±1,78b
0,0268
Biometria
úmida (mg)
0,59
±0,09a
0,64
±0,12ab
0,63
±0,08ab
0,77
±0,14b
0,0190
Biomassa (g)
6,83
±1,72
3,89±2,17
5,16
±0,47
6,30
±1,59
0,2075
Tamanho da
5,19
5,05
5,04
5,32
0,4571
larva (mm)
±0,28
±0,28
±0,10
±0,21
As letras diferentes indicam diferença significativa nas médias pelo teste Tukey
(p<0,05).
Diversos outros autores demonstram as vantagens do uso de
diversas cepas probióticas em larvicultura. Entre estas vantagens estão o
aumento de produtividade em até 15% em relação ao controle (GUO et
al., 2009), melhora da produção de enzimas digestivas (ZHOU et al.,
2009) e diminuição da carga de vibrionáceas na água (LIU et al., 2010).
Contudo, neste trabalho estes resultados não foram observados.
Ao teste de estresse, o tratamento com probiótico obteve melhor
índice de sobrevivência em relação ao enrofloxacino (Tabela 3), porém
43
nenhuma diferença em relação aos outros tratamentos, inclusive o
controle.
11
CONCLUSÃO
O uso de probiótico, enrofloxacino e propionato de sódio na dose
utilizada não influencia nos parâmetros zootécnicos e na microbiota da
água e do camarão L. vannamei na fase de náuplio 5 a pós-larva 5.
12
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2009.
46
CAPITULO III
Uso de probiótico (Lactobacilus plantarum) e butirato de sódio na
alimentação de camarão branco do pacífico em pré-berçário
Marcello Mendes dos Santos Junior; José Luiz Pedreira Mouriño; Felipe
do Nascimento Vieira
1
Universidade Federal de Santa Catarina, Departamento de Aquicultura,
Laboratório de Camarões Marinhos, Servidão dos Coroas número 503,
Barra da Lagoa, 88061-600, Florianópolis, SC, Brasil.
*[email protected]
*Artigo formatado de acordo com as normas da revista “Acta
Scientiarum- Animal Sciences”.
47
13
RESUMO
Este estudo avaliou o uso suplementar de butirato de sódio, probótico
(Lactobacillus plantarum) e sua interação, na dieta de pós–larvas de
camarão branco do pacífico em fase de pré-berçário. Foram adicionados
nas dietas, durante todo o experimento, os tratamentos: probiótico
10mL/g, butirato de sódio 2% + meio de cultura, probiótico 10mg/g +
butirato de sódio 2% e meio de cultura 10mL/g. Foram utilizadas 16
unidades de 60L cada com fundo em formato U, povoadas com 2.880
pós-larva 5. A dieta adicionada de tratamento foi incubada com os
tratamentos overnight,e ministrada 7 vezes ao dia. Após quinze dias,
indiferentemente da presença ou não do probiótico, os tratamentos com
butirato obtiveram maior sobrevivência (p=0,0039) e menor peso seco
individual (p=0,0043). A suplementação com butirato de sódio na
concentração de 2% aspergido na ração aumenta a sobrevivência no
cultivo de pós-larva 5 até pós-larva 20 do camarão marinho L. vannamei
sem causar alterações morfológicas no intestino médio das pós–larvas
20.
Palavras-chave: sal orgânico, pós-larva, teste de estresse, profilaxia,
vibrio.
48
14
ABSTRACT
This study evaluated the addition of sodium butyrate, probótico
(Lactobacillus plantarum) and their interaction, in the diet of post-larvae
of the Pacific white shrimp in pre-nursery. Probiotic 10mL/g, sodium
butyrate + 2% medium, probiotic 10mg/g + 2% sodium butyrate
medium and 10mL/g culture: The treatments were applied in the diet
throughout the experiment. 16 units 60L each bottom U-shape was used,
populated with 2,880 larvae after 5. Feeding was incubated overnight
with treatments, is administered 7 times a day. Fifteen days later,
regardless of the presence or absence of the probiotic, treatment with
butyrate had higher survival (p = 0.0039) and lowest individual dry
weight (p = 0.0043). No morphological changes were observed in the
gut of post-larvae in any treatment. Supplementation with sodium
butyrate at a concentration of 2% sprinkled in the feed increases the
survival in culture of post-larval 5 to 20 post-larvae of marine shrimp L.
vannamei without causing morphological change in the midgut of 20
post-larvae.
Keywords: post-larvae, stress test, organics salts, vibriosis, prophilaxis
49
15
INTRODUÇÃO
Para a expansão do cultivo de camarões, é necessário que exista o
desenvolvimento de toda cadeia produtiva, desde a maturação e
larvicultura, até as fases finais de engorda. Em regiões mais frias, como
o sul do Brasil, existe a necessidade de adaptação de alguns manejos de
produção.
Uma destas adaptações é a utilização de uma fase intermediária
entre larvicultura (náuplio a pós-larva 5 ou 10) e berçário (pós-larva 20
a ± 1g). Esta fase é denominada pré-berçário, que compreende um
período de 10 a 15 dias para que as formas jovens atinjam a melhor
capacidade de adaptação ao viveiro escavado (ANDREATTA;
BELTRAME, 2004).
Nesta fase é importante a manutenção da transparência entre 30 e
40cm sob o teste de disco de Secci, através da inserção de microalgas,
pois as pós-larvas ainda são fotossensíveis.
A água de cultivo sofre renovações periódicas para que ocorra
diluição dos compostos nitrogenados e matéria orgânica, que em
excesso podem desestabilizar o sistema de cultivo e predispor as póslarvas a doenças (PRABHU et al. 1999).
Tais doenças são, na sua maioria, de origem bacteriana, tendo os
vibriões como os principais patógenos causadores de mortalidade na
fase de pré-berçário.
Com a proposta de aumentar a produtividade, pesquisadores tem
procurado encontrar métodos, principalmente profiláticos, para
diminuir: a mortalidade por doenças, aumentar a sanidade dos animais,
diminuir consumo de água e efluentes, e ainda melhorar a
digestibilidade e conversão alimentar (LIM et al., 2010;
ENCARNAÇÃO, 2010).
Dentre estas novas tecnologias estão, a utilização de
imunoestimulantes, probióticos, fitoterápicos e ácidos orgânicos (MINE;
BOOPATHY, 2011). O uso de probiótico já é bastante difundido em
todos os ramos de produção animal, inclusive em aquicultura
(MOURINÕ et al. 2012; RAMIREZ et al., 2013; BUGLIONE-NETO et
al. 2013).
Na larvicultura de camarão marinho o uso de probiótico
Lactobacillus plantarum tem sido promissor. Em estudo desenvolvido
por Vieira (2010) larvas de Litopenaeus vannamei alimentadas com
dietas suplementadas com a bactéria probiótica apresentaram maior
índice de sobrevivência, maior atividade natatória e menor presença de
necroses durante a larvicultura.
50
O uso dos ácidos orgânicos isolados na alimentação, com o
propósito de manutenção da sanidade intestinal de animais aquáticos, se
justifica pela ação inibitória de ácidos acético e lático produzidos por
uma bactéria do gênero Lactobacillus contra bactérias patogênicas no
trato gastrointestinal de linguado Scophthalmus maximus (VASQUEZ et
al., 2005).
Em avicultura e suinocultura o potássio diformiato (KDF) já é
utilizado com frequência, sendo a primeira substância promotora de
crescimento não-antibiótica aprovada pelo Conselho Europeu (NG et al.,
2009).
Os ácidos orgânicos e seus sais, além da ativa inibição do
crescimento, principalmente de bactérias Gram-negativas (DEFOIRDT
et al., 2009), podem ter efeitos sobre o metabolismo, influenciando na
produção e ação de enzimas digestivas (LÜCKSTÄDTS, 2008) e
melhorando a absorção de minerais pelo intestino (HOSSAIN et al.,
2007).
Silva (2014) comprovou em testes in vitro e in vivo em sistema de
engorda de camarão branco do pacífico Litopenaeus vannamei, a
eficácia de sais orgânicos no aumento de atratividade do alimento, da
produção de enzimas digestivas ou melhoria na ação das mesmas, na
inibição do crescimento de bactérias vibrionáceas e no aumento da
digestibilidade de nutrientes.
Dentre os sais testados na alimentação, o que apresentou
melhores foi o butirato de sódio.
O objetivo do presente estudo foi avaliar os parâmetros
zootécnicos e observar a integridade morfológica do trato intestinal de
pós-larvas de camarões cultivados em sistema convencional de préberçário alimentadas com ração suplementada com probiótico
Lactobacillus plantarum, butirato de sódio e a soma de probiótico e
butirato de sódio.
16
MATERIAL E MÉTODOS
16.1 Delineamento experimental
O experimento foi conduzido na sala de experimentos de
larvicultura e pré-berçário do Laboratório de Camarões Marinhos –
LCM-UFSC, no período entre 06/11/2013 e 20/11/2013.
Foram utilizados 16 tanques com fundo em U e capacidade útil
de 60L, providos de aeração e aquecimento.
51
Cada unidade experimental foi povoada com 2.880 pós-larvas 5,
em água previamente adicionada de microalga Nannochloropsis oculata
na concentração de 10x104 cel/mL.
Os parâmetros de oxigênio e temperatura foram aferidos duas
vezes ao dia com oxímetro (YSI, modelo Pro 20) e potencial
hidrogeniônico (pH) uma vez ao dia com peagâmetro (YSI, modelo
Professional Plus). As renovações foram feitas com água marinha com
volume de 50% nos dias 4, 7 e 10 de cultivo e a amônia total medida
periodicamente pelo método colorimétrico de APHA (1995).
Os parâmetros de qualidade de água ficaram dentro dos níveis
aceitáveis para a espécie, sendo, amônia toxica próximo de zero,
temperatura média 28ºC ±1, pH médio 8±0,5 e oxigênio dissolvido
acima de 5mg/L (BOYD; GAUTIER, 2000).
Os tratamentos consistiam: alimentação suplementada com 2% de
butirato de sódio, alimentação suplementada com L. plantarum 1x108
UFC/g de ração, alimentação suplementada com 1x108 UFC/g de ração
de probiótico + 2% de butirato e alimentação sem suplementação.
A bactéria probiótica Lactobacilus plantarum (Vieira et al. 2013)
foi repicada em tubo de ensaio contendo 9mL de meio de cultura Man
Rogosa e Sharpe (MRS) caldo e incubada a 35°C por 48hs. Em seguida
repicada em frasco com 90mL de meio de cultura alternativo para
bactérias probióticas (30g/L de soro de leite, 20g/L sacarose e 30g/L de
cloreto de sódio) e incubadas a 35°C por 24hs.
Após atingir a concentração média de 1x107 UFC/mL através da
leitura da absorbância o probiótico foi reservado em câmara fria por no
máximo 24 horas para serem utilizados na concepção dos tratamentos.
O butirato de sódio foi diluído em meio de cultura e implantado
na ração com 10mL/g. O tratamento com interação de probiótico e
butirato foi concebido através da diluição do butirato de sódio em
solução de probiótico. A ração controle foi adicionada com 10mL/g de
ração de meio de cultura.
Os tratamentos foram aspergidos na ração que foi seca em
dessecador sem sílica por 4 a 6 horas sob vácuo. Em seguida passou
pelo processo de fermentação, incubada em estufa a 35ºC por 12 horas e
então aspergida com óleo de peixe na concentração de 40mL/Kg de
ração e novamente submetidos a vácuo por 4 a 6 horas.
Todo volume de ração tratada foi armazenada sob refrigeração
em frascos de borosilicato.
As larvas foram alimentadas nove vezes ao dia com ração e dose
pertinente ao tempo larval, preparadas com os tratamentos. Foram feitas
três remessas de ração ao longo do experimento.
52
16.2 Análise microbiológica
Para a análise microbiológica, alíquotas de pós- larvas 20 foram
retiradas, contadas, pesadas, lavadas com água destilada, maceradas e
semeadas em meio de cultura Ágar Marine (contagem total de
bactérias), Ágar Tiossulfato Citrato Bile Sacarose (TCBS, para Vibrio
spp.) e Ágar de Man Rogosa e Sharpe (MRS, para bactérias ácidoláticas).
Após incubadas a 30ºC, as colônias bacterianas crescidas em
TCBS e Marine por 24hs e MRS por 48hs foram contadas em unidades
formadoras de colônia (UFC) e ajustadas para UFC/g de pós-larvas.
Para o teste de viabilidade da bactéria probiótica na ração,
utilizou-se 1gr de ração macerada semeada em meio MRS e incubada a
35ºC por 48 horas.
16.3 Teste de estresse e parâmetros zootécnicos
Para o teste de estresse foram recrutadas 50 pós-larvas por
unidade e desafiadas em salinidade 0 ppt por 45 minutos, devolvidas à
salinidade de 35 ppt por mais 45 minutos e contabilizada a
sobrevivência.
A sobrevivência final foi calculada através de uma biometria
úmida de pelo menos 100 larvas e multiplicada pelo peso total de larvas
despescada de cada tanque, subtraindo da quantidade de larvas povoadas
no início do experimento.
Para o peso seco foram utilizadas placas de Petri previamente
secas e pesadas, onde foram colocadas 100 larvas. Estas larvas foram
secas em estufa de secagem à temperatura de 100º C por uma hora e
pesadas em balança de precisão BEL–SSR 3000 S.
Um total de trinta larvas por unidade experimental foi medido
através de estereomicroscópio NIKON® SMZ-745 com lente reguada
ao aumento de 0,6x, no Laboratório de Peixe Marinho – LAPMAR UFSC.
16.4 Análise microscópica
Os tecidos foram fixados em solução de Davidson marinho por
24-48 h e transferidos para a solução de álcool 70%. A cabeça e os
últimos segmentos abdominais foram seccionados com navalha e então,
foram submetidas ao procedimento padrão de histologia, com
desidratação, diafanização e inclusão em parafina.
53
Os blocos resultantes foram cortados com 5 µm de espessura para
posterior coloração com hematoxilina de Harris e Eosina (HOWARD et
al., 2004; KIM et al., 2006) e observadas em microscópio.
16.5 Análises estatísticas
Os dados de sobrevivência e mortalidade foram transformados
em arco seno e os dados de contagem bacterianas transformados em Log
10. Os dados foram analisados, após as premissas de normalidade e
homocedasticidade, por análise de variância bifatorial, suplementadas
pelo teste de Tukey de separação de médias, ambos ao nível de
significância de 5%.
17
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Embora tenha havido crescimento de bactérias ácido-láticas na
ração, com magnitude de 5,94x106 UFC/g (com butirato) e 4,22x106
UFC/g (sem butirato) após dois dias de armazenamento, não houve
crescimento de bactérias ácido-láticas na cultura de macerado das póslarvas 20 em MRS, em nenhum dos tratamentos.
As contagens de bactérias totais e presuntivas de vibriões não
diferiram entre os tratamentos (Tabela 3). A ausência de crescimento de
bactérias ácido-láticas no macerado de larvas tratadas com probiótico
pode ser a causa de não encontrarmos diferença no crescimento de
vibriões, já que diversos trabalhos indicam a eficácia da suplementação
com probiótico para este fim.
Em juvenis de Farfantepenaeus brasiliensis, três probióticos
comerciais apresentaram menor contagem de vibriões após
administrados na água de cultivo por 30 dias em sistema de troca zero
de água (SOUZA et al., 2012).
Ramirez et al., 2013 comprovaram que o uso de L. plantarum
suplementado na ração por seis semanas em juvenis de L. vannamei,
diminui a contagem de vibriões no trato gastrintestinal e aumenta o
título aglutinante do soro contra Vibrio alginolyticus.
O comprimento entre o ápice do rostro e o ápice do télson não foi
diferente entre os tratamentos. O grupo tratado com a suplementação de
probiótico na ração obteve menores índices de sobrevivência ao teste de
estresse (Figura 7) e não corrobora com os trabalhos já publicados.
Buglione-Neto et al. (2008) demonstraram que, pós–larvas de L
vannamei alimentadas com dieta suplementada com L. plantarum em
pré-berçário, obtiveram melhor sobrevivência ao teste de estresse e a
infecção experimental em relação ao tratamento controle.
54
Em larvicultura de L. vannamei alimentada com dieta
suplementada com L. plantarum, pós-larvas 5 apresentaram melhor
sobrevivência à infecção experimental com Vibrio harveyi (VIEIRA,
2010).
A sobrevivência das larvas foi superior nos grupos alimentados
com ração suplementada com butirato 2%, porém o peso seco médio foi
menor nesse grupo (Tabela.3). Isso pode ser explicado porque havendo
maior densidade, há maior competição pelo alimento, já que as refeições
foram ofertadas em quantidade igual em todas unidades experimentais,
não considerando a mortalidade ao longo do cultivo.
Este resultado corrobora os resultados de Silva et al. (2013), que
demonstraram que dietas suplementadas com sais orgânicos aumentam a
sobrevivência de camarões marinhos na fase de engorda.
Figura 6 Percentual de sobrevivência ao teste de estresse por salinidade de póslarvas 20 de camarão Litopenaeus vannamei cultivados em pré-berçário e
alimentados com ração suplementada de butirato de sódio 2%, probiótico
Lactobacillus plantarum 1x108 UFC/g e butirato de sódio 2%+ probiótico L.
plantarum 1x108 UFC/g. Letras distintas indicam diferença significativa nas médias
pelo teste de Tukey (p<0,05).
Em contrapartida, o uso do probiótico proporcionou a mesma
sobrevivência que o controle, diferente dos resultados de Zeaied-Nejad
et al. (2006), onde a administração de Bacillus spp. melhorou a
55
sobrevivência de pós-larvas de Fenneropenaeus indicus que receberam
o probiótico diretamente na água entre PL30-PL120.
A análise qualitativa dos cortes histológicos da porção média do
trato intestinal das pós-larvas, mostrou que as estruturas encontradas
foram semelhantes às encontradas em animais adultos (BELL e
LIGHTNER, 1988) (Figura 7).
6,08x105
±1,96x105
3,14x107
±3,21x107
12,49±0,99
1,01x106
±1,58x106
2,38x107
±1,12x107
12,28±0,54

Probiótico+
Butirato
11,99±0,44
3,42x107
±1,44x107
8,51x105
±7,28x105
1,51±0,16a
84,11±6,04b
3,05x10
±4,92x105
12,29±0,41
4,38x107
±3,53x107
5
1,37±0,05b
82,99±2,99b
65,05±2,75b 81,03±10,27a
Probiótico
Letras distintas indicam diferenças pelo teste de Tukey de separação de médias (p<0,05).
Contagem de vibriões
(UFC/g)
Contagem de
bactérias totais
(UFC/g)
Tamanho da larva
(mm)
1,34±0,2b
1,52±0,13a
Biometria Seca
Individual (mg)
92,05±1,38a
90,35±1,28a
Teste de estresse (%)
89,30±0,70a
73,30±2,14b
Butirato de
sódio
Sobrevivência (%)
Controle
0,4640
0,0445
0,7826
0,4259
0,0149
0,1040
p do
probiótico
0,4375
0,4112
0,9380
0,0043
0,9105
0,0040
p do
butirato
0,8939
0,2726
0,0306
0,5153
0,5883
0,8836
p da
interação
Tabela 4 - Dados zootécnicos e microbiológicos do cultivo em pré-berçário experimental de camarões marinhos da
espécie Litopenaeus vannamei alimentados com ração suplementada de butirato de sódio 2%, probiótico
Lactobacillus plantarum 1x108 UFC/g e butirato de sódio 2%+ probiótico L. plantarum 1x108 UFC/g.
56
57
Figura 7 Cortes histológicos do intestino médio de PL 20 de camarão marinho sob
microscopia de luz, tratados com BUT=tratamento com butirato de sódio 2%;
PRO=tratamento com probiótico Lactobacillus plantarum 1x108 UFC/g de ração;
MIX=tratamento com butirato de sódio 2%+ probiótico L. plantarum 1x108 UFC/g
de ração e CTL=controle. Epi=Epitélio intestinal e Mcl= Musculo Circular e
Longitudinal com estrutura íntegra e Lum=Lúmem intestinal contendo alimento.
18
CONCLUSÃO
A suplementação com butirato de sódio na concentração de 2%
aspergido na ração aumenta a sobrevivência no cultivo de pós-larva 5
até pós-larva 20 do camarão marinho L. vannamei sem causar alteração
morfológica em intestino médio das pós–larvas 20, não sem apresentar
iteração com o uso de probióticos.
19
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61
20
CONSIDERAÇÕES FINAIS
A dificuldade na padronização de métodos experimentais que
imitem situações reais de cultivo é grande, proporcionando um desafio a
mais nos estudos da ciência animal. Dificuldade essa que se torna maior
quando utilizados animais de pequeno tamanho e técnicas ainda
desconhecidas. Neste trabalho foram reunidas as dificuldades, e buscouse efetua-lo da melhor maneira possível.
Resultados referentes à utilização de ácidos orgânicos e seus sais
em carcinicultura marinha são escassos, principalmente em larvicultura
e pré-berçário, o que dificulta a discussão sobre o assunto. Este trabalho
possui pioneirismo e mais estudos devem ser feitos para responder
perguntas a este novo artifício para o cultivo de camarões marinhos. O
uso do propionato na larvicultura podia ser testado aplicado na dieta,
aumentando sua frequência de administração e diminuindo a quantidade
de propionato a ser usada. Esta ação poderia melhorar a produtividade e
diminuir a contagem de bactérias vibrionáceas no intestino das póslarvas.
Apesar da eficácia de inibição de crescimento de vibriões em
testes in vitro, veículos, doses e forma de aplicação de sais orgânicos
devem ser investigadas, pois estas variáveis podem ser a diferença na
busca do efeito esperado sem causar danos a produção.
O uso de probióticos por sua vez já é sacramentado como
excelente ferramenta de controle de agentes patogênicos e melhoria na
produção, porém, a bactéria probiótica, sua concentração e a forma e a
duração da aplicação não são padrão para todas as regiões e tipos de
cultivo, requerendo também estudos frequentes e intensivos nas fases de
larvicultura e pré-berçário de camarões marinhos.
Em contrapartida, o uso de antibióticos é cada vez menos
recomendado pelos pesquisadores, já que pode trazer danos ao ambiente
e resultados semelhantes ao seu uso podem ser obtidos pelos métodos
supracitados.
62
21
REFERÊNCIAS DA INTRODUÇÃO
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69
ANEXO I:
Sala de experimento e as unidades experimentais com aeração e
aquecimento constante.
70
ANEXO II:
Distribuição da dose diária de alimento para as unidades experimentais.
71
ANEXO III
Maceramento, diluição e plaqueamento das larvas para análise
microbiológica.
72
ANEXO IV
Método de medição de pós-larvas em estereomicroscópio.
73
ANEXO V
Despesca e coleta de dados para análise.