UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARÁ
INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
FACULDADE DE BIOMEDICINA
CÉSAR AUGUSTO RAIOL FÔRO
ENVELHECIMENTO, AMBIENTE, DECLÍNIO COGNITIVO E
PLASTICIDADE ASTROGLIAL NO GIRO DENTEADO
BELÉM
2011
CÉSAR AUGUSTO RAIOL FÔRO
ENVELHECIMENTO, AMBIENTE, DECLÍNIO COGNITIVO E
PLASTICIDADE ASTROGLIAL NO GIRO DENTEADO
Trabalho de Conclusão de
Curso
apresentado
à
Faculdade de Biomedicina da
Universidade Federal do Pará,
como requisito parcial para a
obtenção do grau de Bacharel
em Biomedicina.
Orientador: Prof. Dr. Cristovam Wanderley Picanço Diniz
BELÉM
2011
CÉSAR AUGUSTO RAIOL FÔRO
ENVELHECIMENTO, AMBIENTE, DECLÍNIO COGNITIVO E
PLASTICIDADE ASTROGLIAL NO GIRO DENTEADO
Trabalho de Conclusão de
Curso
apresentado
à
Faculdade de Biomedicina da
Universidade Federal do Pará,
como requisito parcial para a
obtenção do grau de Bacharel
em Biomedicina, aprovado com
o conceito 9,5 (EXCELENTE)
Belém (PA), 14 de dezembro de 2011.
Banca Examinadora:
______________________________________
Prof. Dr. Cristovam Wanderley Picanço Diniz
ICB – UFPA
(orientador)
______________________________________
Profa. Dra. Márcia Kronka Cosentino Sóstenes
(ICB - UFPA)
______________________________________
Prof. Msc. Carlos Santos Filho
(ICB - UFPA)
______________________________________
M-sc. Daniel Guerreiro Diniz – suplente
(ICB - UFPA)
i
“O homem erudito é um
descobridor de fatos que já
existem - mas o homem sábio é
um criador de valores que não
existem e que ele faz existir.”
Albert Einstein
ii
Agradecimento
Agradeço a Deus pela condição que tive durante toda essa jornada e principalmente
até ela.
Agradeço grandemente a todos meus familiares, ao meu pai Expedito, minha mãe
Geralda, a minha irmã Jéssica, ao meu irmão Felipe e ao meu primo Arisson e sua
mãe Carmem e aos meus primos que amo muito, cujos sempre me deram todo
apoio e segurança para as minhas buscas.
A Ester, que foi como uma MÃE para mim. De coração, sou grato.
Ao meu orientador professor doutor Cristovam Waderley Picanço Diniz, pela sua
constante presença e cuidado em meu trabalho.
Aos mestres, mestrandos e doutorandos: Daniel Guerreiro Diniz, ao Carlos Santos
Filho, a Renata Rodrigues dos Reis, a Camila Lima, Nonata Trévis, a Lane Coelho, e
ainda a tantos outros que juntamente a estes formam uma agradável “família de
laboratório” que sempre me incentivaram durante os momentos difíceis que passei.
E agradeço a todos que me formaram academicamente, passando suas
experiências tão bem recebidas por mim.
E aos demais que me ajudaram de forma qualquer durante a vida acadêmica.
Muito grato!
iii
Sumário
LISTA DE FIGURAS E TABELAS..........................................................................
LISTA DE ABREVIATURAS...................................................................................
RESUMO..................................................................................................................
ABSTRACT..............................................................................................................
1. INTRODUÇÃO......................................................................................................
1.1 ANATOMIA DO HIPOCAMPO..................................................................
1.2 PLASTICIDADE CEREBRAL, ENVELHECIMENTO E AMBIENTE.........
1.3 ASTRÓCITOS HIPOCAMPAIS, PLASTICIDADE SINÁPTICA,
ENVELHECIMENTO E DECLÍNIO COGNITIVO.............................................
2. OBJETIVOS.........................................................................................................
2.1 GERAL......................................................................................................
2.2 ESPECÍFICOS..........................................................................................
3. MATERIAL E MÉTODOS.....................................................................................
3.1 ANIMAIS E GRUPOS EXPERIMENTAIS.................................................
3.2 PROCEDIMENTOS COMPORTAMENTAIS.............................................
3.3 PERFUSÃO E PROCEDIMENTOS HISTOLÓGICOS.............................
3.4 ANÁLISE ESTEREOLÓGICA.............................................................
3.5 ANÁLISE MORFOLÓGICA.................................................................
3.6 ANÁLISE ESTATÍSTICA...........................................................................
4. RESULTADOS.....................................................................................................
4.1 DESEMPENHO NOS TESTES DE MEMÓRIA EPISÓDICA E
ESPACIAL.......................................................................................................
4.2 ESTTIMATIVA ESTEREOLÓGICA DE ASTRÓCITOS............................
4.3 AVALIAÇÃO MORFOMÉTRICA DOS ASTRÓCITOS ATRAVÉS DE
RECONSTRUÇÃO TRI-DIMENSIONAL.........................................................
5. DISCUSSÃO.........................................................................................................
5.1 IDADE, AMBIENTE E MEMÓRIA ESPACIAL E EPISÓDICA..................
5.2 ASTRÓCITOS DO GIRO DENTEADO, EMPOBRECIMENTO,
ENVELHECIMENTO E DECLÍNIO COGNITIVO.............................................
5.3 LIMITAÇÕES TÉCNICAS NÃO ESTEREOLÓGICAS..............................
5.4 HORMÔNIOS E ASTRÓCITOS DO GIRO DENTEADO..........................
6. CONCLUSÃO.......................................................................................................
REFERÊNCIA BIBLIOGRÁFICA.....................................................................
ANEXO I: TERMO DE APROVAÇÃO DO COMITER DE ÉTICA............................
ANEXO II: CAPÍTULO DE LIVRO COM STATUS ACEITO....................................
ANEXO III: ARTIGO PUBLICADO...........................................................................
IV
V
VI
VII
1
2
4
5
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10
10
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39
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49
58
59
60
iv
LISTA DE FIGURAS E TABELAS
FIGURA 1 – Hipocampo e giro denteado......................................................................
FIGURA 2 – Ambiente enriquecido e ambiente empobrecido (padrão)........................
FIGURA 3 – Contexto e memória semelhante à episódica...........................................
FIGURA 4 – Piscina do labirinto aquático de Morris.....................................................
FIGURA 5 – Página do protocolo do programa utilizado para registrar os dados dos
testes comportamentais................................................................................................
FIGURA 6 – Contorno da camada granular do giro denteado......................................
FIGURA 7 – Reconstrução tri-dimensional mostrada em ângulos de 30 em 30 graus.
FIGURA 8 – Resultados dos testes integrados de reconhecimento de objeto.............
FIGURA 9 – Representação gráfica do aprendizado no teste do labirinto aquático.....
FIGURA 10 – Fotomicrografias de secções horizontais do giro denteado
imunomarcadas para GFAP, para ilustrar os astrócitos (os objetos) e as regiões
(camadas) de interesse.................................................................................................
FIGURA 11 – Estimativas para o número de astrócitos para as camadas molecular e
polimórfica......................................................................................................................
FIGURA 12 - Fotomicrografias de astrócitos da camada molecular do GD e
reconstruções tridimensionais equivalentes representando o grupo AE jovem............
FIGURA 13 - Fotomicrografias de astrócitos da camada molecular do GD e
reconstruções tridimensionais equivalentes representando o grupo AP jovem............
FIGURA 14 - Fotomicrografias de astrócitos da camada molecular do GD e
reconstruções tridimensionais equivalentes representando o grupo AE velho.............
FIGURA 15 - Fotomicrografias de astrócitos da camada molecular do GD e
reconstruções tridimensionais equivalentes representando o grupo AP velho.............
FIGURA 16 – Representação da reconstrução de astrócitos médios de cada grupo e
seus respectivos dendrogramas....................................................................................
FIGURA 17 – Gráficos das análises demonstrando diferenças fenotípicas dos
astrócitos da camada molecular do GD sob influência do envelhecimento..................
TABELA 1 - Parâmetros experimentais e resultados das contagens de astrócitos
pelo fracionador óptico na camada molecular...............................................................
TABELA 2 - Parâmetros experimentais e resultados das contagens de astrócitos
pelo fracionador óptico na camada granular.................................................................
TABELA 3 - Parâmetros experimentais e resultados das contagens de astrócitos
pelo fracionador óptico na camada polimórfica.............................................................
TABELA 4 - Estimativa individual do número (N) de astrócitos com respectivos
Coeficientes de Erro (CE) para a camada molecular do Giro Denteado.......................
TABELA 5 - Estimativa individual do número (N) de astrócitos com respectivos
Coeficientes de Erro (CE) para a camada granular do Giro Denteado.........................
TABELA 6 - Estimativa individual do número (N) de astrócitos com respectivos
Coeficientes de Erro (CE) para a camada polimórfica do Giro Denteado.....................
3
11
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15
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36
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37
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21
22
23
30
31
32
v
LISTA DE ABREVIATURAS
ABC: AVIDINA-BIOTINA-PEROXIDASE
AE: AMBIENTE ENRIQUECIDO
AEE: ADULTOS ENVELHECIDOS DO AMBIENTE ENRIQUECIDO
AEP: ADULTOS ENVELHECIDOS DO AMBIENTE EMPOBRECIDO
AMPA: ÁCIDO α-AMINO-3-HIDROXI-5-METIL-4-ISOXAZOL PROPIÔNICO
ANOVA: ANÁLISE DE VARIÂNCIA
AP: AMBIENTE EMPOBRECIDO (PADRÃO)
ATP: TRIFOSFATO DE ADENOSINA
JAE: JOVENS ADULTOS DO AMBIENTE ENRIQUECIDO
JAP: JOVENS ADULTOS DO AMBIENTE EMPOBRECIDO
CA: CORNO DE AMON
CE: COEFICIENTE DE ERRO
CV: COEFICIENTE DE VARIAÇÃO
CVB: COEFICIENTE DE VARIAÇÃO BIOLÓGICA
DP: DESVIO PADRÃO
GD: GIRO DENTEADO
GFAP: PROTEÍNA ÁCIDA FIBRILAR GLIAL
NMDA: N-METIL-D-ASPARTATO
pH: POTENCIAL HIDROGENIÔNICO
PBS: SALINA TAMPONADA COM FOSFATO
vi
RESUMO
A aquisição e recuperação de informações espaciais são tarefas hipocampodependentes, que podem ser prejudicadas por mudanças estruturais e funcionais
induzidas pelo envelhecimento. As memórias semelhante à episódica e espacial são
seletivamente interrompidas por lesões no fórnix, por lesões do hipocampo dorsal e
ventral, pela ruptura da rede de CA3, ou por infusão no hipocampo de antagonistas
dos receptores AMPA e NMDA. No presente trabalho pretendemos revisar a
literatura disponível em modelos murinos em que o reconhecimento objeto foi
avaliado e correlacionado com alterações astrocitárias no giro denteado. Nossos
achados incluem avaliações comportamentais e a morfologia e distribuição laminar
de astrócitos no giro dentado em camundongos idosos e jovens, alojados desde o
desmame, em gaiolas padrão (ambiente pobre) ou enriquecidas. Dos resultados do
presente trabalho aprendemos que as estimativas de número e a morfologia de
astrócitos no giro denteado sofrem alterações que são dependentes da camada,
induzidas tanto pelo envelhecimento quanto pelo ambiente, de forma que a condição
empobrecida está associada com o desenvolvimento cognitivo anormal e distribuição
laminar de astrócitos alterada. A análise quantitativa da distribuição laminar dos
astrócitos no giro dentado revelou que a camada molecular desenvolveu astrocitose
em resposta ao enriquecimento ambiental e ao envelhecimento, a camada
polimórfica foi alterada apenas pelo envelhecimento e a camada granular não
mudou o número de astrócitos. Especula-se que estas duas condições
(envelhecimento e enriquecimento) podem induzir a proliferação de diferentes
fenótipos morfológicos de astrócitos. Paradoxalmente, em comparação aos animais
jovens, os camundongos velhos do ambiente enriquecido apresentaram um maior
grau de retração em seus astrócitos do que animais de mesma idade do ambiente
empobrecido. Tomados em conjunto, nossos resultados são consistentes com
relatos anteriores mostrando que os ambientes empobrecido ou enriquecido
poderiam impedir ou preservar, respectivamente, o desenvolvimento cognitivo
normal. Sugerimos que a plasticidade astroglial possa representar, pelo menos parte
das mudanças na circuitaria cerebral responsável por melhorias no desempenho
comportamental tanto nos animais jovens quanto nos idosos.
Palavras-chave: Ambiente, envelhecimento, memória semelhante à episódica,
memória espacial, camundongo Suíço Albino, astrócitos, estereologia, morfometria.
vii
ABSTRACT
Acquisition and retrieval of spatial information are hippocampal-dependent tasks that
can be impaired by structural/functional changes induced by aging. Episodic-like and
spatial memory are selectively disrupted by fornix lesions, by lesions of the dorsal
and/or ventral hippocampus, by disruption of the CA3 network, or by hippocampal
infusion of NMDA and AMPA receptor antagonists. In the present work we intend to
review the available literature in murine models where object recognition was
assessed and correlated with astrocyte changes in the hippocampal formation. We
correlated behavioral assessments with morphology and laminar distribution of
astrocytes in dentate gyrus in both aged and young mice housed from weaning,
either in impoverished or enriched environments. From our previous and present
results we have learned that in the dentate gyrus the number and morphology of
astrocytes change with both aging and enriched environment in a layer-dependent
fashion and the impoverished condition is associated with abnormal cognitive
development and an altered laminar distribution of astrocytes. A quantitative analysis
of the laminar distribution of the astrocytes in the dentate gyrus revealed that the
molecular layer developed astrocytosis in response to both environmental enrichment
and aging, the polymorphic layer was altered only by aging and granular layer did not
change de number of astrocytes. Because aging and enriched environment induced
astrocytosis in the molecular layer of the dentate gyrus, the main target of the
entorhinal-to-dentate projection, we speculate that those two conditions may induce
the proliferation of different astrocyte morphological phenotypes. Paradoxically, as
compared with young subjects, aged mice from enriched environment showed a
higher degree of astrocytes shrinkage than age-matched subjects from impoverished
environment. Taken together, our results are consistent with previous reports
showing that impoverished or enriched environments could prevent or preserve
respectively, normal cognitive development. We suggest that astroglial plasticity may
represent at least part of the brain circuitry groundwork for improvements in
behavioral performance in both young and aged mice.
Key words: Environment, aging, episodic-like memory, spatial learning and memory,
Albino Swiss mice, astrocytes, stereology, morphometry.
1
1.
INTRODUÇÃO
O envelhecimento é um processo combinado de vários fatores onde as
idades biológicas dos diferentes tecidos variam amplamente no mesmo indivíduo
(Wick G., 2000). Embora ainda se desconheça muito da neurobiologia do
envelhecimento e dos mecanismos que comprometem o desempenho cognitivo
nesse período da vida, pesquisa recente baseada nas diferenças individuais está
ajudando a distinguir os limites entre o normal e patológico (Hedden et al., 2004).
Por outro lado, independentemente da idade, a estimulação ambiental provoca
profundas mudanças comportamentais, neuroanatômicas e neuroquímicas na
maioria das espécies animais (van Praag et al., 2000; Mohammed et al., 2002). A
riqueza de estímulos disponíveis no ambiente, incluindo brinquedos que favorecem a
atividade
física
e
a
interação
social,
promove
mudanças
biológicas
e
comportamentais em pequenos roedores que crescem nesses ambientes, que são
benéficas e que parecem proteger dos déficits no aprendizado relacionados à idade
(Gardner et al., 1975; Sanchez et al., 2001; Williams et al., 2001). Esses dados
sugerem
que
a
estimulação
sensoriomotora
e
social
contribui
para
o
desenvolvimento cognitivo e emocional adequados (Spangler et al., 1994; Winocur,
1998; van der Staay, 2002).
Em roedores de um modo geral, há um conjunto de dados interessantes
que apóiam a hipótese de que o exercício pode melhorar aspectos cognitivos e
desempenho discriminativo em testes de aprendizado e memória espacial, tempo de
resposta de fuga, assim como, contribui para redução do declínio da atividade física
espontânea observada durante o envelhecimento desses animais (Spirduso et al.,
1981; Fordyce et al., 1991; Fordyce et al., 1993; Ingram et al., 1994; Skalicky et al.,
1996).
Outra face do problema ainda não completamente explorada é a
investigação das alterações sensoriais e motoras primárias. Em 2002, Godde e
colaboradores revisaram um conjunto de trabalhos interessantes utilizando registro
eletrofisiológico e registro óptico no sistema somatossensorial que consolidam a
hipótese de que fenômenos neurodegenerativos e regenerativos podem coexistir
durante
o
envelhecimento
e
que
o
processo
regenerativo
depende
fundamentalmente de um ambiente rico em estímulos relacionados ao déficit
sensorial já instalado (Godde et al., 2002). Por extensão levantaram a hipótese de
2
que os déficits cognitivos possam igualmente ser causados pelas alterações nas
áreas sensoriais primárias e que o déficit sensorial não degenerativo pode ser
corrigido, contribuindo para evitar o agravamento do déficit cognitivo a ele
relacionado. Mais especificamente os autores se referem aos déficits regionais
identificados nos mapas sensoriais, tais como propriedades de campo receptor,
intensidade das respostas, reorganização de mapas topográficos, etc., que são
afetados pela redução dos inputs sensoriais decorrentes do desuso na idade
avançada. Consistente com isso é o fato de que as perdas somatomotoras em ratos
idosos (Rattus norvegicus albinus) se instalam de forma dramática na região de
representação das patas posteriores, sendo preservada a região de representação
das patas anteriores que desenvolvem um padrão de atividade motora mais intensa
e diversificada ao longo da vida (Godde et al. 2002).
Tendo
em
vista
que
as
alterações
cognitivas
associadas
ao
envelhecimento e à inatividade física envolvem o hipocampo e o giro denteado,
regiões de interesse do presente trabalho, é útil rever sua anatomia regional.
1.1
ANATOMIA DO HIPOCAMPO E DO GIRO DENTEADO
O hipocampo e o córtex entorrinal, são estruturas cerebrais chave nos
processos cognitivos envolvendo memória de objeto, espaço e tempo. O hipocampo
é dividido em Corno de Amon (CA) 1, 2, 3 e 4 e região superior e inferior (Brown et
al., 1990 ) ou região septal (dorsal) e região temporal (ventral) (Blackstad, 1956; van
Groen et al., 2003). CA1 e CA3 formam o hipocampo propriamente dito, e como CA2
é pequeno e indistinto em algumas espécies ele é freqüentemente incluído em CA1
nas análises (Amaral et al., 2007). O giro denteado (GD), o subiculum, o Córtex
Entorrinal (CE) e CA4 são incluídos no termo “formação hipocampal”, e a área entre
o GD e o stratum granulosum de CA3 é chamada de Polimórfica ou região hilar ou
simplesmente hilus (Brown et al., 1990; Amaral et al., 2007). O hipocampo apresenta
fundamentalmente três camadas, a camada polimórfica (stratum oriens), camada
piramidal (stratum pyramidale) e camada molecular (stratum radiatum e stratum
lacunosum-moleculare). O GD consiste em camada polimórfica (hilus), camada
granular (stratum granulosum) e a camada molecular (stratum moleculare) que é
continua com o hipocampo (Brown et al., 1990 ). Figura 1.
3
Os principais neurônios do hipocampo são os neurônios piramidais de
CA1, CA2 e CA3 e do GD são as células granulares. As conexões sinápticas no
hipocampo são geralmente axodendríticas e axosomáticas e os principais
neurotransmissores são, GABA, norepinefrina e aceltilcolina (Brown et al., 1990 ;
Amaral et al., 2007). As aferências mais densas do hipocampo provêm do córtex
entorrinal e a propagação da informação entorrinal aferente no interior do hipocampo
se dá através de uma seqüência de sinapses excitatórias que de uma forma
simplificada é referida como circuito trisináptico. A primeira sinapse desse circuito se
dá na camada molecular, entre as fibras do córtex entorrinal, que constituem a via
perfurante, e as células granulares do giro denteado. A segunda ocorre no stratum
lúcido e no radiatum entre os axônios das células granulares do giro denteado (fibras
musgosas) e os neurônios piramidais de CA3, de onde partem os axônios (colaterais
de Shafferd) para formar a terceira sinapse com as células piramidais de CA1
(Amaral et al., 2007).
Figura 1 - Circuito tri-sináptico simplificado do hipocampo. CA1, CA2, CA3, CA4, Corno de Amon 1, 2
, 3 e 4. O giro denteado recebe as projeções do córtex entorrinal através da via perfurante (1º
sinapse) e projeta através dos axônios das células granulares para CA3 (2º sinapse). Este último
projeta para CA1 (3º sinapse) através dos axônios das células piramidais. Fonte: www.unileipzig.de/.../graphic_hippo_farbig.html
4
1.2
PLASTICIDADE CEREBRAL, ENVELHECIMENTO E AMBIENTE
Embora os estudos de plasticidade associados aos efeitos ambientais
demonstrem uma morfologia neuronal alterada, foi igualmente descrito que intensas
mudanças morfológicas também acontecem em células gliais (Sirevaag et al., 1987;
Komitova et al., 2002). Os astrócitos são as células gliais mais numerosas do
hipocampo de camundongos e a eles tem se associado a uma variedade de papéis
funcionais contribuindo para a formação, adaptação, e operação dos circuitos
neurais. Em uma única frase, os astrócitos permitem que os neurônios funcionem
fornecendo energia e substratos para a neurotransmissão contribuindo diretamente
para a formação e modulação das sinapses através de mecanismo bidirecional de
comunicação com os neurônios (Allen et al., 2009). Além disso, contribuem para o
controle do fluxo sanguíneo cerebral, para constituição da barreira hematoencefálica e para a resposta imune aos agentes agressores (Wang et al., 2008).
Durante o envelhecimento, entretanto os astrócitos sofrem mudanças e
vários estudos revelaram aumento do número deles e da microglia (Pilegaard et al.,
1996; Long et al., 1998; Mouton et al., 2002).
Estudos integrados envolvendo envelhecimento, ambiente e mudanças
gliais tornaram-se mais freqüentes porque os astrócitos são implicados em vários
processos de regulação hipocampal local que afetam aprendizagem e memória
(Junjaud et al., 2006; Magistretti 2006; Mothet et al., 2006; Todd et al., 2006; Perea
et al., 2007). Por exemplo, no hipocampo de ratos envelhecidos que cresceram em
ambiente enriquecido foi previamente descrito que, na fase de envelhecimento, os
astrócitos hipocampais eram menores em tamanho e em número quando
comparados aos dos animais que cresceram em ambiente padrão (Soffie et al.,
1999). Por outro, lado os astrócitos de CA1 do camundongo adulto alojado em
gaiolas enriquecidas apresentaram-se em número, semelhante aos de animais
alojados em gaiola padrão com a diferença de que os astrócitos do ambiente
enriquecido apresentaram-se com ramificações mais numerosas e longas (Viola et
al., 2009). Entretanto, outros autores não encontraram correlações de longo prazo
entre plasticidade astrocitária e ambiente sugerindo a hipótese de que os astrócitos
podem exibir respostas transitórias associadas à história de stress de cada rato, em
vez de respostas adaptativas de longo prazo como conseqüência dos ambientes
complexos das gaiolas enriquecidas (Sirevaag et al., 1991). Aqueles e outros
5
estudos e.g. (Chadashvili et al., 2006), entretanto, demonstram a presença
irrefutável de plasticidade não-neuronal associada ao ambiente e ao envelhecimento
que permanece por ser investigada em detalhe (Markham et al., 2004).
1.3
ASTRÓCITOS
HIPOCAMPAIS,
PLASTICIDADE
SINÁPTICA,
ENVELHECIMENTO E DECLÍNIO COGNITIVO
Astrócitos são células gliais especializadas, presentes em todo o SNC,
exercendo várias funções essenciais complexas no SNC saudável. No SNC
lesionado, atuam através de resposta conhecida como astrogliose reativa,
patognomônica em lesões estruturais (Sofroniew & Vinters, 2010). Os astrócitos
podem ser divididos em dois subgrupos: astrócitos protoplasmáticos e fibrosos. Os
astrócitos protoplasmáticos estão presentes em toda a substância cinzenta,
possuem vários ramos proximais, que originam muitos processos ramificados
distribuídos uniformemente em forma globóide. O tipo fibroso é encontrado na
substância branca e possui muitos processos longos com aparência de fibra. Ambos
os tipos contatam vasos sanguíneos e formam junções em fenda (do inglês gap
junctions)
entre
processos
distais
de
astrócitos
vizinhos.
Enquanto
os
prolongamentos do subtipo protoplasmático envolvem sinapses, os do tipo fibroso
contatam nodos de Ranvier (Sofroniew & Vinters, 2010).
Uma das funções astrocitárias conhecidas há mais tempo é o suprimento
de substratos de energia para neurônios; para isso, os astrócitos ocupam posições
estratégicas entre os neurônios e capilares sanguíneos, tendo papel fundamental na
relação entre atividade neuronal e consumo cerebral de glicose (Magistretti, 2006).
Atuam no fornecimento de substratos metabólicos para neurônios glutamatérgicos
quando a atividade neuronal indica aumento na demanda energética; tal mecanismo
envolve a recaptação de glutamato acoplado ao Na+ pelos astrócitos, ativação da
ATPase Na+/K+, com consequente captação de glicose do sangue e glicólise,
resultando na liberação astrocitária de lactato, suprindo a demanda energética
neuronal (Magistretti, 2006).
Na década passada houve uma explosão nos programas de investigação
dedicados à compreensão do papel das interações neuroastrocitárias no controle da
função cerebral. Mais especificamente, reconheceu-se um novo elemento nas
sinapses que passou a ser referida como estrutura sináptica tripartite consistindo dos
6
elementos pré e pós-sinápticos associados aos processos astrocíticos. Reconheceuse de forma definitiva que os astrócitos respondiam à atividade neural ativando
receptores metabotrópicos liberando gliotransmissores, como o trifosfato de
adenosina (ATP), D-serina e glutamato, que por sua vez agem sobre os neurônios
(Halassa & Haydon, 2010).
Mais recentemente emergiu o conceito de redes astrogliais para
comunicação a longa distância associando os astrócitos à redes de conexão
organizadas que permitem a troca de informações reguladas por sinais intra e
extracelulares, através de canais que atravessam junções em fenda (do inglês “gap
junctions”). Essa comunicação a longa distância entre células da glia modulando a
atividade sináptica neuronal e contribuindo diretamente para a plasticidade sináptica
adicionou nova dimensão de complexidade a análise das funções cerebrais (Giaume
et al., 2010). Como referido anteriormente, os astrócitos participam do controle da
excitabilidade neuronal e transmissão sináptica através da liberação de moléculas
neuroativas, como glutamato, a D-serina e o ATP (Halassa et al., 2007; Lee &
Haydon, 2007). Além disso, realizam recaptação do glutamato, regulando os níveis
do neurotransmissor (Lee & Haydon, 2007). Além disso, os astrócitos também
secretam fatores solúveis como trombospondinas e colesterol, que influenciam a
formação das espinhas dendríticas e maturação sináptica (Ullian, Christopherson &
Barres, 2004, Christopherson et al., 2005). Importante lembrar do ponto de vista
quantitativo que no hipocampo, mais de 50% das sinapses excitatórias são
associadas, em graus variados, com processos astrocitários; um único astrócito
pode estar relacionado a aproximadamente 100.000 contatos sinápticos, sugerindo
sua participação na dinâmica das sinapses e das redes neuronais (Ventura & Harris,
1999, Bushong et al., 2002).
Em 1991 se descreveu pela primeira vez a influência da potenciação de
longo prazo induzida por estimulação repetida e de alta frequência da via perfurante
sobre a distribuição espacial dos processos astrocíticos na neurópila da camada
molecular do giro denteado que continha as sinapses potenciadas. Foram
encontradas mudanças significativas na ramificação dos processos astrocíticos tanto
quanto na sua relação topográfica com os complexos sinápticos (Wenzel et al.,
1991). Mais recentemente demonstrou-se a presença em astrócitos da camada
molecular do giro denteado de potencial de longa duração semelhante à potenciação
de longo prazo neuronal, sucedendo à estimulação de alta freqüência da via
7
perfurante (Zhang & Chen, 2009) confirmando-se que esse processo era
dependente da exocitose de glutamato (Jourdain et al., 2007).
Em uma única frase, os astrócitos permitem que os neurônios funcionem
fornecendo energia e substratos para a neurotransmissão contribuindo diretamente
para a formação e modulação das sinapses através de mecanismo bidirecional de
comunicação com os neurônios (Allen & Barres, 2009).
Conversamente os astrócitos parecem se alterar com o envelhecimento
em forma, número, distribuição laminar (Diniz, 2010, Almeida et al., 2011, Diniz et
al., 2011) e perfil imunológico (Godbbout & Johnson, 2009, Jinno, 2011, Salminen et
al., 2011) e essas alterações parecem estar relacionadas com o declínio cognitivo
associado à neuroinflamação que acompanha a senescência (Albayram et al.,
2011).
Qualquer que seja a idade, animais da mesma variedade genética exibem
disfunções cognitivas hipocampais semelhantes depois de viverem em ambientes
empobrecidos, apresentando déficits de aprendizado e memória espacial (Teather et
al., 2002; Teather et al., 2005; 2006; Iso et al., 2007). Entretanto, estudos recentes
em camundongos de mesma variedade demonstraram que mecanismos moleculares
associados ao declínio cognitivo durante o envelhecimento envolvem processos
fisiológicos que não são replicados completamente em camundongos jovens (Han et
al., 2006; Ju et al., 2006; Murphy et al., 2006; Droge et al., 2007). Esse conjunto de
dados aponta para a ocorrência de muitas questões abertas associando ambiente,
envelhecimento e outros fatores que impactam funções cognitivas, com distintos
processos celulares e moleculares em variedades e idades diferentes de
camundongos.
Em um trabalho prévio foi demonstrado que diferentes modalidades de
exercício melhoraram a memória espacial em animais jovens de dois meses de
idade, que cresceram isoladamente em gaiolas padrão (Torres et al., 2006). No
presente trabalho, nós examinamos se camundongos adultos jovens (nove meses
de idade) e velhos (23 meses de idade) que cresceram em grandes grupos em
ambientes enriquecidos ou empobrecidos são capazes de recordar-se de objetos
apresentados em determinado contexto espaço-temporal. Escolhemos o paradigma
de reconhecimento de objetos baseado na tendência natural de roedores de explorar
objetos novos (Dix et al., 1999; Dere et al., 2005; Dere et al., 2006). Esses testes
seguem o modelo de teste integrado de memória episódica (Dere et al., 2007).
8
Embora em trabalhos anteriores a função cognitiva tenha sido avaliada com testes
de memória em animais envelhecidos e jovens que cresceram em ambientes
empobrecidos ou enriquecidos, a memória episódica nunca (memória integrada para
objeto, lugar e contexto) foi analisada antes em camundongos jovens e envelhecidos
que cresceram em ambientes enriquecidos.
Com o intuito de comparar o componente espacial do teste de memória
episódica com outro teste largamente utilizado na avaliação de déficits cognitivos
espaciais tanto em animais jovens quanto envelhecidos, avaliamos igualmente as
possíveis mudanças na memória espacial de outro grupo de camundongos velhos e
jovens de mesma idade dos utilizados nos testes de memória episódica, com um
procedimento de aprendizagem de longo prazo utilizando o teste do labirinto
aquático (Morris, 1984).
Tendo em conta de que já havia sido descrita a participação dos
astrócitos na potenciação de longo prazo na via perfurante (Allen & Barres, 2009,
Ben Menachem-Zidon et al., 2011) investigamos em trabalho prévio, possíveis
relações entre o declínio cognitivo associado ao envelhecimento e mudanças na
distribuição laminar (Diniz et al., 2010) e na morfologia (Diniz et al., 2011) dos
astrócitos do giro denteado. Para isso, comparamos animais que foram mantidos em
diferentes ambientes (enriquecido ou empobrecido) desde o 21º dia pós-natal até o
sacrifício. No presente trabalho de conclusão de curso reunimos os nossos
resultados prévios de modo a permitir uma análise conjunta do esforço empreendido.
Nesses trabalhos escolhemos a proteína ácida fibrilar (GFAP) como um
marcador de astrócitos, em detrimento da proteína glutamina sintetase ou S100 beta
porque a GFAP parece ser mais sensível e mais específica quando relacionado aos
déficits de aprendizagem e memória (Wu, Zhang & Yew, 2005).
Para quantificar o número de astrócitos utilizamos o fracionador óptico,
um método estereológico sem viés baseado em amostragem aleatória e sistemática
dos objetos de interesse nas áreas de interesse. Nossa escolha pelo fracionador
óptico se deu porque é o que tem sido usado com mais frequência, combinando as
propriedades da sonda tri-dimensional para contagem dos elementos de interesse (o
dissector óptico) com o sistema de amostragem sistemática e aleatória (o
fracionador) removendo a necessidade de pressuposições acerca dos objetos de
interesse (West, Slomianka & Gundersen, 1991). A combinação do dissector óptico
com o fracionador de amostras, conhecida na literatura como Fracionador Óptico
9
(West, Slomianka & Gundersen, 1991), tem numerosas vantagens práticas; sendo a
principal, o fato de não ser afetado pela retração do tecido e não requerer definições
rigorosas de fronteiras estruturais que podem ser feitas em objetivas de baixo
aumento.
O fracionador óptico envolve a contagem de objetos, utilizando sondas de
dissectores ópticos, em uma amostra sistemática uniforme que constitui uma fração
conhecida do volume da região em análise. Na prática, isso é feito através de
amostragem sistemática de uma fração conhecida da espessura da secção, “TSF”
(iniciais de “thickness sample fraction”), da área seccional “ASF” (iniciais de “area
sample fraction”) e do número de secções que incluem a região de interesse, “SSF”
(iniciais de “section sample fraction”) (West, Slomianka & Gundersen, 1991).
Essa escolha é feita para contornar a impossibilidade de contar todas as
células dentro da região de interesse e obter estimativas próximas dos valores reais.
Para isso, é necessário a utilização de coleta sistemática e aleatória de dados,
incluindo a terceira dimensão (Schmitz & Hof, 2005).
Além dos estudos estereológicos, reunimos no presente trabalho os
efeitos do envelhecimento sobre o possível declínio cognitivo associado ao
envelhecimento e ao empobrecimento documentado seus efeitos através de testes
de memória de reconhecimento de objeto nos quais a integridade da formação
hipocampal é essencial para o bom desempenho. O pressuposto é de que a
formação hipocampal dos animais com desempenho comprometido estaria alterada
enquanto que a dos animais cognitivamente íntegros, não. Escolhemos o paradigma
de reconhecimento de objetos baseado na tendência natural de roedores de explorar
objetos novos (Dix & Aggleton, 1999, Dere, Huston & De Souza Silva, 2005b, a,
Dere et al., 2006). Esses testes seguiram o integrado de memória semelhante à
episódica descrito anteriormente (Dere, Huston & De Souza Silva, 2007). As tarefas
selecionadas envolvem o reconhecimento da forma, localização espacial e momento
em que objetos selecionados são apresentados aos animais comparando-se o
desempenho de animais jovens e idosos de diferentes ambientes. Essas tarefas
representam respostas a três perguntas acerca dos objetos selecionados (o quê?
onde? e quando?) as quais do ponto de vista experimental são medidas de forma
indireta computando-se o tempo dedicado por cada animal à exploração de cada
objeto em valores percentuais do tempo total de exploração.
10
2.
OBJETIVOS
Uns poucos trabalhos anteriores utilizaram camundongos Suíços albinos
(variedade de interesse para o presente trabalho) como modelo experimental para
estudos de envelhecimento cerebral e.g. (Enesco et al., 1986; Valzelli et al., 1987;
Sturrock 1989; Alper et al., 1999; Chintala et al., 2009). Nenhum deles, entretanto
dedicou-se a investigar os efeitos do ambiente e do envelhecimento sobre a
plasticidade glial. Como o camundongo albino Suíço é utilizado como modelo para
instalação da doença neurodegenerativa crônica produzida pelo agente príon ME7
em nosso laboratório, em animais que envelhecem praticando exercícios em
ambientes enriquecidos, é importante reunir em um único manuscrito as alterações
cognitivas e neuropatológicas associadas ao envelhecimento e ao empobrecimento
ambiental nesse modelo, sendo esse o objetivo geral do presente trabalho
2.1
GERAL
Investigar o impacto do ambiente empobrecido e do envelhecimento
sobre a memória de objeto avaliada num contexto espaço-temporal e sobre a
plasticidade astroglial no giro denteado do camundongo Suíço albino.
2.2
ESPECÍFICOS
Em fêmeas de nove ou 23 meses de idade da variedade Suíça albina
investigar o impacto do ambiente empobrecido e do envelhecimento:
1) sobre a memória de objeto em teste para a memória semelhante à
episódica e para o aprendizado e a memória espacial no labirinto aquático de Morris.
2) sobre o número e a distribuição laminar e regional dos astrócitos do
giro denteado.
3) sobre a morfologia de astrócitos na camada molecular do giro
denteado.
11
3.
MATERIAL E MÉTODOS
3.1
ANIMAIS E GRUPOS EXPERIMENTAIS
Foram utilizados 40 camundongos albinos Suíços fêmeas, de nove
(jovens) e de 23 meses (velhos) de idade, que cresceram em ambiente enriquecido
(AE, n=20) ou em ambiente empobrecido (padrão) (AP, n=20) a partir dos dois
meses de idade (Figura 2). Após se completarem dois meses de vida quatro grupos
experimentais foram formados: jovens adultos que cresceram em ambiente
enriquecido (JAE n=10), jovens adultos que cresceram em ambientes empobrecidos
(JAP, n=10), adultos envelhecidos que cresceram em ambientes enriquecidos (AEE,
n=10), e adultos envelhecidos que cresceram em ambientes empobrecidos (AEP,
n=10). A rigor um camundongo de nove meses já é um adulto maduro enquanto que
um animal de 23 se aproxima do final da vida tendo em conta que a duração média
da vida é de 24 meses nessa espécie. As condições enriquecidas correspondem às
gaiolas (100x50x100cm) com dois andares, equipadas com cordas, pontes de
madeira, túneis, rodas de correr e brinquedos feitos de plásticos, madeira e metal
com diferentes formas e cores, que eram trocados semanalmente. Água e comida
foram oferecidas no primeiro e segundo andar respectivamente, obrigando os
camundongos a se deslocarem na gaiola para obter comida e água. Gaiolas de
plástico do ambiente empobrecido (32x39x100cm) não continham equipamentos ou
brinquedos. Todos os indivíduos tinham livre acesso à comida e água e 12 horas de
ciclo claro e escuro. Os testes ocorreram durante o ciclo claro.
Figura 2 – Imagem lado esquerdo: Ambiente enriquecido; Imagem lado direito: Ambiente
empobrecido (padrão).
12
3.2
PROCEDIMENTOS COMPORTAMENTAIS
A análise de aprendizagem mais comumente empregada não usa
métodos dinâmicos e requer muitas tentativas com muitos animais para avaliar
diferenças de aprendizado significantes. Além disso, não há consenso acerca de
como melhor identificar quando o aprendizado ocorreu (Smith et al., 2000). No
presente trabalho, nós utilizamos testes com uma única tentativa para avaliar o
reconhecimento dos objetos através do teste de memória semelhante à episódica
que exige a integração de informações acerca da forma, espaço e momento em que
um determinado grupo de objetos foi apresentado ao camundongo (Dere et al.,
2005a), e o teste de labirinto aquático de Morris para avaliar aprendizagem e
memória espacial (Morris, 1984).
O aparato para o teste de reconhecimento de objeto consiste de um
ensaio em uma caixa aberta (30x30x40cm) feita de madeira pintada de branco. O
chão é pintado com linhas para formar nove quadrados (10x10cm) e a luminância
medida no centro da arena foi constante e igual a 2,4 cd/m2.
Detalhes do protocolo e a razão da escolha desse teste podem ser
encontrados em publicações prévias (Dere et al., 2005a, 2005b). Os ensaios
comportamentais, do presente trabalho, foram feitos em treze dias, sendo sete dias
para manuseio, três dias para habituação ao campo aberto, dois dias para
habituação aos objetos e um dia para o teste propriamente dito.
Manuseio: o manuseio foi feito em cada um dos sete dias com o
camundongo sendo colocado no centro da arena por um minuto após o que era
removido da gaiola. Habituação ao campo aberto: cada dia o camundongo era
colocado na arena, livre de objetos, por cinco minutos para explorar o campo aberto.
Habituação ao objeto: cada dia o camundongo era exposto a quatro objetos
idênticos colocados nos cantos da arena por cinco minutos, três vezes, com 50
minutos de intervalo de cada vez. Estes objetos não foram usados nos dias de teste.
Para minimizar a influência de preferências naturais por objetos
particulares ou por materiais, foram utilizados objetos sempre do mesmo material e
formas diferentes que podem ser discriminadas facilmente, mas com possibilidades
semelhantes de interação (Dere et al., 2005a). Todos os objetos eram de plástico,
com formas, altura e cores diferentes. Antes de cada camundongo entrar na arena, a
caixa e os objetos eram limpos com solução de etanol a 75% para minimizar a
13
distinção olfativa dos camundongos. Os diagramas ilustrando os testes podem ser
visualizados na Figura 3.
O teste de reconhecimento de objetos consistiu de três tentativas: duas
sessões de exposição aos objetos, de cinco minutos de duração com intervalos de
50 minutos entre elas e uma sessão de teste. Na primeira sessão, quatro objetos
idênticos foram apresentados. Na segunda sessão, mais quatro objetos idênticos,
mas diferentes dos da primeira sessão foram apresentados. Na sessão de teste,
dois objetos da primeira sessão (objetos “antigos”) e dois objetos da segunda sessão
(objetos “recentes”) foram apresentados. Além disso, um objeto da primeira sessão
foi deslocado para uma nova posição (objetos “deslocados”), porém os objetos da
segunda sessão permaneceram nos lugares originais (objetos “estacionários”) no
teste propriamente dito. Era esperado que os camundongos explorassem por mais
tempo os objetos da primeira sessão (objetos “antigos”) do que os da segunda
sessão (objetos “recentes”) com maior preferência pelos objetos “antigos” e
“deslocados”, seguida da preferência por objetos “antigos” e “estacionários” e
finalmente por objetos idênticos “recentes”.
Figura 3 - Diagrama do experimento utilizado para o reconhecimento de objeto para testes
integrados de memória semelhante à episódica (O quê? Onde? e Quando?) Figura
baseada em (Dere, Huston, & De Souza Silva, 2007).
14
Teste do labirinto aquático: A piscina e plataforma do Labirinto Aquático
de Morris foram adaptadas em suas dimensões para o camundongo (94 cm de
largura e 14 cm de altura). A plataforma permanecia escondida a 1 cm da superfície
da água. A piscina continha água tingida com anilina escura líquida comestível, para
evitar a visualização da plataforma. A temperatura da água era mantida constante
em torno de 22±2 °C. Em cada tentativa, os animais tinham um minuto e meio para
encontrar a plataforma escondida. Entre cada tentativa havia um intervalo de 90 s. A
tarefa era considerada completa quando os animais encontravam a plataforma e
permaneciam na mesma durante 5 segundos. O primeiro dia de treinamento era
dedicado à adaptação do camundongo ao labirinto aquático e nos dias
subseqüentes até o quinto dia, era registrada a latência de fuga, a distância
percorrida e a velocidade de natação para cada camundongo. O teste durou de 7 a
10 dias dependendo do grupo experimental. A Figura 4 ilustra um camundongo
durante o teste do labirinto aquático.
Figura 4 – Piscina do labirinto aquático de Morris.
Todos os testes foram registrados através de vídeos com uma câmera de
captura de imagens, os vídeos foram analisados utilizando um programa de
computador (Figura 5) que registrava o tempo de interação com os objetos (do teste
da memória episódica) e os desempenhos dos animais no labirinto aquático
(ANYMAZE Tracking system, Stöelting). A análise de dados foi realizada a partir das
gravações. A contagem do tempo de interação e o número de interações com os
objetos foram iniciados toda vez que o camundongo se aproximava do objeto e
posicionava a cabeça a uma distância de no máximo 3 cm do objeto de interesse.
15
Essa definição requer que os objetos permanecessem fixos no chão do aparato, e
para isso escolhemos objetos pesados que satisfizessem essa condição. O
desempenho foi definido através dos valores percentuais em função do tempo total
gasto com a exploração dos objetos.
A taxa de aprendizado para o labirinto aquático foi avaliada medindo as
latências de fuga (L) do primeiro e quinto dias, seguindo a equação: C=(L1L5)/(L1+L5), onde L1 e L5 são as latências de fuga medidas respectivamente no 1° e
5° dia e C o índice de contraste. O índice de contr aste foi utilizado para normalizar a
curva de aprendizagem de todos os indivíduos (Torres et al., 2006).
Figura5 – Página do protocolo do programa utilizado para registrar os dados dos testes
comportamentais (ANYMAZE tracking system, Stöelting).
16
3.3
PERFUSÃO E PROCEDIMENTOS HISTOLÓGICOS
Ao fim dos testes comportamentais, todos os indivíduos do grupo jovem
(com nove meses de vida) e do grupo velho (com 23 meses) foram pesados e
sacrificados com overdose de cetamina (100 mg/Kg) e xilazina (10 mg/Kg) (Konig
Laboratories). Em seguida foram imediatamente perfundidos por via transcardíarca
com solução salina 0,9% heparinizada por 10 minutos, seguido de paraformaldeido a
4 % em tampão fosfato, (pH 7,2-7,4) por 30 minutos. A craniotomia era feita em
seguida para a retirada do encéfalo e seccionamento em vibrátomo a 70 µm de
espessura, sendo os cortes coletados serialmente. Uma em cada cinco secções era
utilizada para imunomarcação para proteína ácida fibrilar glial (GFAP). As secções
foram então lavadas em tampão fosfato 0,1 M pH 7,2-7,4, e incubadas durante uma
hora em ácido bórico 0,2 M pH 9,0 aquecido entre 65-70°. Após três lavagens de
cinco minutos em PBST (5 %) incubávamos as secções em solução a 1 % de
peróxido de hidrogênio em metanol durante 10 minutos, a seguir eram lavadas em
tampão fosfato salina (PBS) 0,1 M, pH 7,2-7,4, duas vezes por dois minutos. As
secções eram então bloqueadas com imunoglobulina por uma hora, de acordo com
as instruções de Mouse-on-Mouse Immunodetection kit (M.O.M kit, Vector
Laboratories, USA), seguida de três lavagens em PBS, durante dois minutos cada.
Em seguida, eram incubadas em concentrado de proteína (M.O.M kit) por cinco
minutos e imersas na solução contendo o anticorpo primário (mouse anti-GFAP
monoclonal antibody MAB360, CHEMICON int, USA), numa diluição 1:800 em
solução de proteína concentrada (M.O.M kit), a 4 °C, durante 3 dias, com agitação
contínua suave. As secções foram então lavadas três vezes em PBS durante dois
minutos cada, e incubadas durante a noite na solução contendo o anticorpo
secundário biotinilado de cavalo anti-camundongo (secondary antibody M.O.M kit)
diluída 1:100 em PBS. Depois de serem lavadas três vezes em PBS durante dois
minutos cada, foram transferidas para a solução com o complexo avidina-biotinaperoxidase (ABC, Vector Laboratories, USA, 1:200) por 1 h e 30 minutos, lavadas
novamente três vezes em PBS 0,1 M, dois minutos cada e processadas para a
histoquímica de peroxidase com o método que utiliza a glicose oxidase e DAB-nickel
(Shu, Ju and Fan, 1988).
A reação era interrompida depois que os astrócitos eram detectados ao
microscópio. As secções foram lavadas quatro vezes a seguir, durante cinco minutos
17
cada, em PBS 0,1 M pH 7,2-7,4, e em seguida montadas em lâminas gelatinizadas e
desidratadas por uma bateria à álcool e xileno e seladas com lamínula e meio de
inclusão (Entelan Merck®).
3.4
ANÁLISE ESTEREOLÓGICA
Em todas as secções histológicas analisadas foi realizada a delimitação
das camadas de interesse com uma objetiva de pequeno aumento, 4× em um
microscópio óptico (NIKON, Eclipse 80i) (Nikon, Japan) equipado com uma platina
motorizada (MAC200, Ludl Electronic Products, Hawthorne, NY, USA). Esse sistema
era acoplado a microprocessador que controlava os movimentos da platina com
auxílio de programa especializado (Stereoinvestigator, MicroBrightField, Williston,
VT, USA) e que estocava as coordenadas dos pontos de interesse. O computador
era igualmente usado para armazenar e analisar as coordenadas dos eixos x, y, e z
de pontos digitalizados.
Utilizamos para as contagens microscopia de campo claro com objetiva
PLANFLUOR, 100X (NA 1,3; DF = 0,2 µm; Nikon, Japan), com vídeo-câmera
(Microfire, Optronics), que permitiu o registro e transporte dos arquivos de imagem
para o microcomputador onde softwares residentes realizaram o processamento. O
programa estimou o número total de células baseado na probabilidade amostral
obtida através de contagens aleatórias e sistemáticas previamente mencionadas.
O procedimento de contagem foi iniciado com a geração automática de
caixas de contagem virtuais pelo programa Stereo Investigator em cada um dos
pontos da matriz de contagem que representam intersecções da sonda
estereológica com o plano onde estava situada a fatia. Para isso, o experimentador
alimenta o programa definindo as dimensões da caixa, da matriz de contagem e da
fração amostral de secções. A escolha dessas dimensões e da fração amostral foi
feita em ensaio preliminar (por tentativa e erro) até que o coeficiente de erro de uma
fatia individual fosse adequado para obter resultados médios para o conjunto de
secções e tivesse um baixo coeficiente de erro (<0,05).
Em cada caixa de contagem foram marcados os objetos de interesse
(astrócitos), esses objetos marcados em cada caixa geraram informações para o
programa acerca do número e da posição dos elementos contidos em cada caixa. A
partir dessas informações colhidas sistematicamente na fração de secções eleitas
18
para contagem, o programa estimou o número esperado de objetos de interesse na
estrutura inteira.
Em cada local de contagem, a espessura da secção foi cuidadosamente
avaliada com a objetiva de grande aumento e o foco fino do microscópio foi usado
para definir a posição no eixo z de cada célula marcada. Devido à variação de
espessura e da distribuição de células em cada secção, o número total de objetos de
interesse foi contado em todas as camadas celulares que entraram em foco em cada
local de contagem, portanto a estimativa do número de células foi ponderada
tomando em consideração a espessura do corte em cada local.
Foram contados todos os objetos que entraram em foco dentro da caixa
de contagem e adicionados ao número total de objetos marcados, desde que se
encontrassem inteiramente dentro da sonda estereológica de contagem ou cruzando
o plano permitido, sem tocar o plano proibido (Gundersen & Jensen, 1987). Neste
protocolo, cuidado especial foi tomado para evitar contagens repetidas do mesmo
objeto nos diferentes planos de foco. Para isso repetiu-se o procedimento de
focalização várias vezes, avançando e recuando nos diferentes planos ao longo do
eixo Z em cada caixa, particularmente quando co-existiam muitos elementos na
mesma caixa.
O programa se encarrega de distribuir cada caixa de contagem de forma
aleatória e sistematicamente, dentro de uma grade definida pelo experimentador. As
grades de contagem foram adaptadas para atingirem um coeficiente de erro
aceitável (CE). Para isso foi adotado o coeficiente de Scheaffer previamente utilizado
e validado por outros autores (Glaser & Wilson, 1998).
A estimativa do número de astrócitos foi feita através da distribuição
sistemática e aleatória de blocos de contagem, dentro de uma série de secções que
continham a região de interesse, como é possível visualizar na Figura 6. O
experimentador definia os limites da região de interesse indicando para o programa
as três dimensões da caixa de contagem (largura, comprimento e altura), o
espaçamento entre elas, e as zonas de guarda, preenchendo um protocolo definido
pelo programa. Após o preenchimento, o programa exibia a disposição espacial das
caixas em relação ao contorno da secção a partir dos parâmetros preenchidos e
muda automaticamente a posição da lâmina para iniciar uma nova contagem em
uma nova caixa toda vez que o experimentador dava por encerrada a contagem da
caixa anterior. Ao final da contagem de todas as caixas de cada secção, o programa
19
estima o número total de astrócitos naquela secção e gera uma série de dados
estatísticos que incluem o número total de astrócitos marcados pelo experimentador
e a estimativa total esperada para a secção com o respectivo coeficiente de erro.
Este último é usado como indicador para avaliarmos se as dimensões e o número de
caixas são adequados para obtermos valores médios representativos do total do
número de astrócitos da estrutura que estamos analisando. Valores de coeficientes
de erro maiores que 0,05 indicam na maioria dos casos a necessidade de mudanças
nos parâmetros escolhidos.
Figura 6 - Trecho do contorno da secção da camada granular do giro denteado ilustrando a
disposição das caixas de contagem e suas dimensões. Neste caso a largura e o comprimento da
caixa equivalem a 30 µm e o espaçamento entre elas é igual 45 µm. A profundidade da caixa
escolhida para esta estimativa foi de 12 µm.
O programa permite a definição de zonas de guarda superpostas às
regiões de corte da fatia onde os procedimentos de microtomia produzem variações
indesejáveis (ou seja, nas superfícies de corte). Com motivo de se evitar coleta de
dados duvidosos na superfície de cada área de interesse, a zonas de guarda
permite apenas a coleta a partir alguns micrômetros adentro no eixo Z da área, no
nosso trabalho estabelecemos 2 µm de zonas de guarda.
A estimativa do número total de astrócitos dentro da região de interesse
foi obtida através do método do fracionador óptico, multiplicando-se o número de
astrócitos contados dentro de cada bloco pelos valores de probabilidade da amostra.
Esses valores dependem: 1) do número de secções investigadas comparadas com o
número total de secções que contem a região de interesse (“section sampling
fraction”); 2) da área dos blocos de contagem comparada com a área da matriz de
contagem (“area sampling fraction”); e 3) da altura do bloco de contagem comparada
20
com a média da espessura da secção após os procedimentos histológicos
(“thickness sampling fraction”).
N = ΣQ * 1/ssf * 1/asf * 1/tsf
Onde,
N – número total de astrócitos
ΣQ – número de astrócitos contados
ssf – “section sampling fraction” = secções contadas/total de secções
asf – “area sampling fraction” = área bloco/área matriz (x,y)
tsf – “thickness sampling fraction” = altura bloco/ média da espessura da
secção
Adotamos os seguintes parâmetros estereológicos (Bonthius et al., 2004):
- Método: Fracionador Óptico
- Intervalo de contagem entre as secções: 1:5
- Matriz de contagem: variável de acordo com a camada
- Zona de guarda: 2 µm
- Altura do bloco de contagem: 12 µm
O cálculo do coeficiente de erro para cada sujeito adotou o procedimento
sistemático amostral de um estágio (Coeficiente de Scheaffer, CE), previamente
validado por outros (Glaser et al., 1998). O coeficiente de Scheaffer expressa a
precisão da metodologia aplicada na coleta de dados para as estimativas e um valor
de CE ≤ 0,05, é julgado apropriado na maioria dos casos porque a variância
introduzida pelo procedimento com esse valor de CE contribui pouco para a
variância observada para cada grupo. A razão entre o coeficiente de erro intrínseco
à metodologia CE e o coeficiente de variação para as estimativas (CV) não deve
ultrapassar 0,5 (Slomianka et al., 2005). Os parâmetros experimentais para cada
camada do giro denteado foram estabelecidos em experimentos piloto e
uniformemente aplicados a todos os animais.
As tabelas 1 a 3 apresentam os parâmetros experimentais e os resultados
médios de contagens dos astrócitos de cada lâmina de interesse (molecular,
granular e polimórfica) do giro denteado para cada grupo experimental.
21
Tabela 1. Parâmetros experimentais e resultados das contagens de astrócitos pelo fracionador óptico
para a camada molecular do giro denteado de fêmeas adultas da variedade Suíça albina.
a(caixa)
2
(µm )
A(x,y
grade)
2
(µm )
asf
23M 1
60 x 60
90 x 90
0,44
23M 4
60 x 60
90 x 90
0,44
23M 5
60 x 60
90 x 90
23M 6
60 x 60
90 x 90
23M 7
60 x 60
9M 7
(a)
Sujeitos
ssf
No. de
caixas
No. de
secções
ΣQ
0,71 ± 0,007
1/5
235
5
1049
0,65 ± 0,015
1/5
233
5
965
0,44
0,46 ± 0,024
1/5
254
5
799
0,44
0,47 ± 0,011
1/5
243
5
1136
90 x 90
0,44
0,48 ± 0,013
1/5
241
5
906
60 x 60
90 x 90
0,44
0,46 ± 0,012
1/5
197
5
709
9M 8
60 x 60
90 x 90
0,44
0,46 ± 0,011
1/5
222
5
642
9M 9
60 x 60
90 x 90
0,44
0,46 ± 0,005
1/5
193
5
643
9M 10
60 x 60
90 x 90
0,44
0,39 ± 0,014
1/5
170
5
513
9M 11
60 x 60
90 x 90
0,44
0,43 ± 0,014
1/5
187
5
661
tsf
-
Enriquecido/Velho
Enriquecido/Jovem
Empobrecido/Velho
23M 5
60 x 60
90 x 90
0,44
0,59 ± 0,007
1/5
232
5
684
23M 6
60 x 60
90 x 90
0,44
0,56 ± 0,048
1/5
176
5
596
23M 1
60 x 60
90 x 90
0,44
0,60 ± 0,012
1/5
205
5
801
23M 4
60 x 60
90 x 90
0,44
0,62 ± 0,017
1/5
167
5
674
23M 8
60 x 60
90 x 90
0,44
0,55 ± 0,009
1/5
212
5
920
9M 1
60 x 60
90 x 90
0,44
0,73 ± 0,007
1/5
197
5
703
Empobrecido/Jovem
(a)
9M 7
60 x 60
90 x 90
0,44
0,66 ± 0,015
1/5
200
5
579
9M 11
60 x 60
90 x 90
0,44
0,71 ± 0,015
1/5
228
5
785
9M 12
60 x 60
90 x 90
0,44
0,55 ± 0,010
1/5
216
5
614
9M 13
60 x 60
90 x 90
0,44
0,53 ± 0,008
1/5
185
5
505
Todas as avaliações foram feitas usando uma objetiva de 60x a óleo (N.A. 1.4; D.F. 0.75 µm).
a(grade), área do dissetor óptico de contagem; A(x,y grade), valores de x e y da grade; asf, fração
amostral da área = (a(caixa)/A(x,y da grade); tsf, fração amostral da espessura = altura da caixa
h/espessura da secção; ssf, fração amostral das secções = intervalo de contagem; ∑Q , astrócitos
contados.
22
Tabela 2. Parâmetros experimentais e resultados das contagens de astrócitos pelo fracionador óptico
para a camada granular do giro denteado de fêmeas adultas da variedade Suíça albina.
a(caixa)
2
(µm )
A(x,y
grade)
2
(µm )
asf
23M 1
30 x 30
60 x 60
0,25
23M 4
30 x 30
60 x 60
23M 5
30 x 30
60 x 60
23M 6
30 x 30
23M 7
30 x 30
(a)
Sujeitos
ssf
No. de
caixas
No. de
secções
ΣQ
0,81 ± 0,003
1/5
185
5
315
0,25
0,77 ± 0,015
1/5
187
5
365
0,25
0,61 ± 0,030
1/5
182
5
265
60 x 60
0,25
0,60 ± 0,012
1/5
193
5
300
60 x 60
0,25
0,65 ± 0,013
1/5
267
5
267
tsf
-
Enriquecido/Velho
Enriquecido/Jovem
9M 7
30 x 30
60 x 60
0,25
0,60 ± 0,018
1/5
154
5
214
9M 8
30 x 30
60 x 60
0,25
0,59 ± 0,023
1/5
166
5
188
9M 9
30 x 30
60 x 60
0,25
0,50 ± 0,004
1/5
169
5
313
9M 10
30 x 30
60 x 60
0,25
0,42 ± 0,011
1/5
162
5
247
9M 11
30 x 30
60 x 60
0,25
0,45 ± 0,014
1/5
181
5
276
23M 5
30 x 30
60 x 60
0,25
0,67 ± 0,012
1/5
180
5
309
23M 6
30 x 30
60 x 60
0,25
0,58 ± 0,041
1/5
150
5
176
23M 1
30 x 30
60 x 60
0,25
0,62 ± 0,027
1/5
164
5
314
23M 4
30 x 30
60 x 60
0,25
0,74 ± 0,013
1/5
155
5
295
23M 8
30 x 30
60 x 60
0,25
0,68 ± 0,021
1/5
171
5
258
Empobrecido/Velho
Empobrecido/Jovem
(a)
9M 1
30 x 30
60 x 60
0,25
0,70 ± 0,035
1/5
184
5
309
9M 7
30 x 30
60 x 60
0,25
0,65 ± 0,011
1/5
173
5
171
9M 11
30 x 30
60 x 60
0,25
0,55 ± 0,006
1/5
167
5
268
9M 12
30 x 30
60 x 60
0,25
0,69 ± 0,019
1/5
207
5
363
9M 13
30 x 30
60 x 60
0,25
0,61 ± 0,045
1/5
220
5
376
Todas as avaliações foram feitas usando uma objetiva de 60x a óleo (N.A. 1.4; D.F. 0.75 µm).
a(grade), área do dissetor óptico de contagem; A(x,y grade), valores de x e y da grade; asf, fração
amostral da área = (a(caixa)/A(x,y da grade); tsf, fração amostral da espessura = altura da caixa
h/espessura da secção; ssf, fração amostral das secções = intervalo de contagem; ∑Q , astrócitos
contados.
23
Tabela 3. Parâmetros experimentais e resultados das contagens de astrócitos pelo fracionador óptico
para a camada polimórfica do giro denteado de fêmeas adultas da variedade Suíça albina.
a
Sujeitos
a(caixa)
2
(µm )
A(x,y grade)
2
(µm )
asf
ssf
No. de
caixas
No. de
secções
ΣQ
23M 1
40 x 40
50 x 50
0,64
0,77 ± 0,005
1/5
235
5
465
23M 4
40 x 40
50 x 50
23M 5
40 x 40
50 x 50
0,64
0,66 ± 0,021
1/5
211
5
516
0,64
0,50 ± 0,021
1/5
237
5
441
23M 6
40 x 40
23M 7
40 x 40
50 x 50
0,64
0,47 ± 0,011
1/5
241
5
770
50 x 50
0,64
0,49 ± 0,013
1/5
225
5
639
9M 7
40 x 40
50 x 50
0,64
0,54 ± 0,011
1/5
211
5
519
9M 8
40 x 40
50 x 50
0,64
0,53 ± 0,022
1/5
215
5
412
tsf
-
Enriquecido/Velho
Enriquecido/Jovem
9M 9
40 x 40
50 x 50
0,64
0,47 ± 0,008
1/5
165
5
517
9M 10
40 x 40
50 x 50
0,64
0,43 ± 0,014
1/5
188
5
497
9M 11
40 x 40
50 x 50
0,64
0,47 ± 0,010
1/5
195
5
476
23M 5
40 x 40
50 x 50
0,64
0,79 ± 0,009
1/5
238
5
1133
23M 6
40 x 40
50 x 50
0,64
0,73 ± 0,261
1/5
173
5
763
23M 1
40 x 40
50 x 50
0,64
0,73 ± 0,012
1/5
212
5
962
23M 4
40 x 40
50 x 50
0,64
0,61 ± 0,017
1/5
191
5
705
23M 8
40 x 40
50 x 50
0,64
0,54 ± 0,316
1/5
210
5
777
9M 1
40 x 40
50 x 50
0,64
0,71 ± 0,013
1/5
212
5
586
9M 7
40 x 40
50 x 50
0,64
0,58 ± 0,011
1/5
222
5
592
9M 11
40 x 40
50 x 50
0,64
0,58 ± 0,012
1/5
195
5
382
9M 12
40 x 40
50 x 50
0,64
0,70 ± 0,016
1/5
231
5
544
9M 13
40 x 40
50 x 50
0,64
0,72 ± 0,022
1/5
233
5
575
Empobrecido/Velho
Empobrecido/Jovem
(a)
Todas as avaliações foram feitas usando uma objetiva de 60x a óleo (N.A. 1.4; D.F. 0.75 µm).
a(grade), área do dissetor óptico de contagem; A(x,y grade), valores de x e y da grade; asf, fração
amostral da área = (a(caixa)/A(x,y da grade); tsf, fração amostral da espessura = altura da caixa
h/espessura da secção; ssf, fração amostral das secções = intervalo de contagem; ∑Q , astrócitos
contados.
24
3.5
ANÁLISE MORFOLÓGICA
Para a reconstrução tridimensional dos astrócitos utilizamos o microscópio
óptico (Optiphot2, NIKON) com platina motorizada e conversores análogo-digitais
(MAC200, Ludl Electronic Products, Hawthorne, NY, USA) para conversão digital da
informação relativa às coordenadas espaciais (X, Y, Z) de cada ponto digitalizado.
Esse sistema é acoplado a microprocessador que controla os movimentos da platina
com auxílio de programa especializado (Neurolucida, MicroBrightField, Williston, VT,
USA) e estoca as coordenadas dos pontos de interesse. No sentido de se evitar
ambigüidades na identificação dos objetos de interesse e garantir maior precisão
nas reconstruções, a objetiva de 4,0 x era substituída por outra PLANFLUOR, 100X
(NA 1.3; DF = 0.2 µm; Nikon, Japan) utilizada para as reconstruções tridimensionais
realizadas.
O estudo morfológico fornece dados para uma análise qualitativa e
quantitativa e permite também a determinação da distribuição dos objetos de
interesse (Acsady, et al., 1998).
As reconstruções dos astrócitos foram feitas com critérios estabelecidos
para evitar viés, portanto foram escolhidos astrócitos cuja morfologia era mais
freqüente utilizando-se regiões semelhantes da camada molecular de cada grupo
experimental dentro de cinco secções contendo a região de interesse, utilizando
sempre o terço médio da camada.
Ao final a seleção do astrócito a ser reconstruído permitiu garantir que
apenas astrócitos completos (íntegros) foram utilizados para análise. Astrócitos
seccionados durante a vibratomia foram excluídos. A figura 7 ilustra uma das
escolhas sistemáticas.
Nós não aplicamos correção para retração induzida pelo processamento
histológico nos dados da morfometria. Em todos os grupos foram reconstruídos 5 a
15 astrócitos. Estes astrócitos foram submetidos à análise morfométrica realizada
com o software Neuroexplorer (MicroBrightField, Williston, VT, USA). Analisamos o
número de pontos de ramificação, o número de pontas por astrócito, o comprimento
total de ramos, o comprimento médio de segmentos, a área de superfície, a área de
segmento, o volume total e dos segmentos em particular, também analisamos área
do corpo celular, dimensão fractal e dendrogramas. A média aritmética e o desvio
padrão foram calculados para cada variável morfológica para todos os grupos
25
experimentais. Em raras ocasiões valores extremos foram detectados e excluídos de
todas as amostras com base em análises de quartis para detectar valores extremos
em amostras com distribuição normal. Esse teste de normalidade foi feito com
auxílio do software Bioestat.
Figura 7 – Reconstrução tri-dimensional mostrada em ângulos de 30 em 30 graus, Escala 10 µm.
3.6
ANÁLISE ESTATÍSTICA
Procedimentos estatísticos detalhados para os testes de memória similar
à episódica e o labirinto aquático foram descritos em Dere et al., 2005 e Torres et al.,
2006. Foram aplicados testes para verificar a distribuição normal dos dados e
identificação dos possíveis valores extremos baseados nos desvios. Quando
encontrados (fato muito raro) foram eliminados do conjunto de dados. Nos testes de
reconhecimento de objeto, os valores das médias eram obtidos a partir dos registros
feitos pelos vídeos, de onde se extraiam os tempos gastos com a exploração de
cada objeto durante a sessão de teste. O reconhecimento da identidade do objeto
(novos vs familiares), do lugar onde estavam (deslocados vs estacionários), do
momento em que foram apresentados (recente vs antigo) baseava-se no tempo de
exploração de cada um deles registrado para cada camundongo. Assim, no teste de
memória semelhante à episódica, vídeos registraram o tempo da exploração dos
objetos “antigos”, “recentes”, “deslocados” e “estacionários” durante a fase de teste.
O tempo de exploração para cada objeto foi expresso em proporção (porcentagem)
do total do tempo de exploração e possíveis diferenças eram detectadas com o
teste-t bicaudal para amostras interdependentes (Dix & Aggleton, 1999). Em todos
os testes estatísticos, o limiar para a significância foi definido para uma densidade de
probabilidade p<0,05.
26
4.
RESULTADOS
4.1
DESEMPENHO NOS TESTES DE MEMÓRIA EPISÓDICA E ESPACIAL
Memória semelhante à episódica: Somente os animais do ambiente
enriquecido, (nove meses e 23 meses) tiveram habilidade para integrar
reconhecimento de objetos em um contexto espaço-temporal. Os animais do
ambiente empobrecido foram incapazes de fazer as distinções apropriadas (Figura
8).
Memória espacial no labirinto aquático: O teste do labirinto aquático
avaliou o impacto do ambiente enriquecido na habilidade dos animais para aprender
e recordar a posição da plataforma escondida sob a água (Figura 9). Os resultados
ilustram o desempenho de cada grupo experimental pela redução da distância total
de nado (distância média entre o 1° e 5° dias), sen do baseada na distância total
percorrida e distância percorrida no quadrante oposto, este último não mostrado na
figura. Camundongos adultos que cresceram em ambiente empobrecido, mas não os
velhos que cresceram nesse ambiente, assim como, todos os animais que
cresceram em ambiente enriquecido, aprenderam e conseguiram se lembrar da
posição da plataforma escondida. Não existiu nenhum impacto significante do
ambiente ou do envelhecimento na velocidade natatória, sugerindo que a maioria
dos efeitos negativos se deu pelo prejuízo cognitivo afetando a memória espacial. O
traçado da trajetória do nado revelou que o enriquecimento aumentou a habilidade
de encontrar mais rapidamente a plataforma com trajetória mais curta nos animais
adultos jovens que foram alojados em ambiente enriquecido em comparação aos
outros.
27
Figura 8 - Representações gráficas dos resultados dos testes integrados de reconhecimento de
objeto. Desempenhos em valores percentuais são indicados no eixo Y e os grupos experimentais são
indicados no eixo X. As colunas à esquerda e à direita correspondem respectivamente a grupos de
nove meses e 23 meses. AE velho, camundongos envelhecidos que cresceram em ambiente
enriquecido; AP velho, camundongos envelhecidos que cresceram em ambiente empobrecido; AE
jovem, camundongos jovens que cresceram em ambiente enriquecido; AP jovem, camundongos
jovens que cresceram em ambiente empobrecido. (*ANOVA; p < 0,05).
28
Figura 9 - Representação gráfica do aprendizado no teste do labirinto aquático. Redução da distância
total de nado do AE e AP jovens. Observe a estratégia de nado da trajetória que um indivíduo com
desempenho próximo ao da média de cada grupo experimental. Notar que o grupo AP Velho
corresponde à maior distância percorrida para encontrar a plataforma. D: dia de teste. (D1 = primeiro
dia, por exemplo) (*ANOVA; p < 0,05).
4.2
ESTIMATIVA ESTEREOLÓGICA DE ASTRÓCITOS.
Utilizando os princípios do fracionador óptico aplicados às secções
imunomarcadas para GFAP, estimamos o número total de astrócitos na camada
molecular, granular e polimórfica do giro denteado.
A figura 10 ilustra com fotomicrografias de secções horizontais
imunomarcadas para GFAP, em baixo e grande aumento, os astrócitos das
diferentes camadas e objetos de interesse da contagem. O grande aumento está
representado a visibilidade dos astrócitos nas diferentes camadas. A camada
granular está representada pela banda clara de baixa concentração de astrócitos
localizada entre as camadas molecular e polimórfica.
Essa camada de baixa densidade astrocítica foi perfeitamente distinguida
das camadas adjacentes em todas as secções reagidas para GFAP em todos os
sujeitos de todos os grupos experimentais. O limite da camada polimórfica com CA3
foi arbitrariamente definido nas secções horizontais por uma linha reta que liga a
ponta da camada de células piramidais de CA3 com cada uma das pontas da
camada granular do GD que aparecem como zonas claras nas secções
imunomarcadas, facilmente distinguíveis da camada polimórfica. A linha reta foi
29
usada para distinguir os astrócitos de CA3 daqueles da camada polimórfica do giro
denteado.
Fotomicrografias em grande aumento ilustram a diversidade morfológica
dos astrócitos nas três camadas do giro denteado do camundongo adulto fêmea da
variedade albino Suíça.
Figura 10 - Fotomicrografias de secções horizontais do giro denteado imunomarcadas para GFAP
para ilustrar os objetos (astrócitos) e as regiões (camadas) de interesse do giro denteado do
camundongo albino Suíço fêmea de nove meses de idade do ambiente empobrecido. Note a
diferença na morfologia dos astrócitos das diferentes camadas. MOL, GR e POL indicam as camadas
molecular, granular e polimórfica do giro denteado, respectivamente. Escalas: baixo aumento = 100
µm, grande aumento = 25 µm.
As tabelas 4, 5 e 6 contêm as estimativas pelo fracionador óptico do
número total de astrócitos das camadas molecular, granular e polimórfica
respectivamente, para cada grupo experimental.
30
Tabela 4. Estimativa individual unilateral do número (N) de astrócitos com respectivos Coeficientes de
Erro (CE) para a camada molecular do Giro Denteado do Camundongo Albino Suíço.
Camada Molecular
Enriquecido/Velho
Espessura
CE
N
(µm)
(Scheaffer)
Sujeitos
Sujeitos
Enriquecido/Jovem
Espessura
CE
N
(µm)
(Scheaffer)
23M 1
16811
16,86 ± 0,14
0,03
9M 7
18019
27,32 ± 1,08
0,09
23M 4
16924
18,53 ± 0,44
0,03
9M 8
15797
26,05 ± 0,63
0,03
23M 5
20095
26,56 ± 1,54
0,03
9M 9
15843
26,18 ± 0,33
0,03
23M 6
28186
25,93 ± 0,63
0,03
9M 10
14465
30,43 ± 1,16
0,04
23M 7
21747
25,41 ± 0,76
0,03
9M 11
17101
27,77 ± 0,85
0,03
Média
20752
22,65 ± 2,05
0,03
Média
16245
27,55 ± 0,79
0,04
DP
4660
DP
± 1361
CV2
0,0504
CV2
0,0070
0,0009
CE
2
0,0178
2
CE
2
2
CE /CV
CVB
2
2
CE /CV
0,0495
2
2
CVB (%CV )
CVB
0,0016
2
0,0054
2
98,21%
0,2279
2
2
CVB (%CV )
Empobrecido/Velho
77,20%
Empobrecido/Jovem
23M 5
13292
20,42 ± 0,21
0,03
9M 1
10918
16,63 ± 0,22
0,03
23M 6
12762
21,82 ± 1,44
0,04
9M 7
10076
18,19 ± 0,42
0,03
23M 1
15300
20,21 ± 0,44
0,03
9M 11
12576
16,94 ± 0,38
0,03
23M 4
12504
19,58 ± 0,53
0,04
9M 12
12742
21,88 ± 0,38
0,03
23M 8
19017
21,81 ± 0,37
0,03
9M 13
10820
22,54 ± 0,35
0,03
Média
14575
20,76 ± 0,44
0,03
Média
11426
19,23 ± 1,24
0,03
DP
± 2714
DP
± 1172
CV
2
CE
2
2
CE /CV
CVB
2
0,0009
CE
2
0,0259
2
0,0346
2
2
0,0337
2
CVB (%CV )
2
CV
2
97,40%
2
2
CE /CV
CVB
2
0,0105
0,0009
2
0,0855
2
0,0096
2
CVB (%CV )
91,44%
CVB = CV – CE (CV coeficiente de variação; CVB, coeficiente de variação biológica). Média, N:
número de astrócitos por grupo; DP, desvio padrão.
31
Tabela 5. Estimativa individual unilateral do número (N) de astrócitos com respectivos Coeficientes de
Erro (CE) para a camada granular do Giro Denteado do camundongo Albino Suíço.
Camada Granular
Enriquecido/Velho
Espessura
CE
N
(µm)
(Scheaffer)
Sujeitos
Sujeitos
Enriquecido/Jovem
Espessura
CE
N
(µm)
(Scheaffer)
23M 1
7766
14,71 ± 0,07
0,04
9M 7
8113
20,45 ± 0,55
0,05
23M 4
9537
15,58 ± 0,32
0,04
9M 8
6350
27,55 ± 0,76
0,05
23M 5
8802
19,93 ± 1,09
0,05
9M 9
12266
23,67 ± 0,19
0,03
23M 6
10385
20,20 ± 0,41
0,05
9M 10
11506
28,25 ± 0,80
0,04
23M 7
8463
18,67 ± 0,39
0,04
9M 11
12133
26,79 ± 0,84
0,04
Média
8990
17,81 ± 1,12
0,04
Média
10073
26,77 ± 2,43
0,04
DP
±1007
DP
± 2683
CV
2
CE
2
0,0709
0,0016
CE
2
0,0016
0,1275
CE2/CV2
0,0125
CE2/CV2
CVB
CV
2
2
0,0109
2
2
CVB (%CV )
CVB
0,0693
2
87,24%
0,0225
2
2
CVB (%CV )
Empobrecido/Velho
97,74%
Empobrecido/Jovem
23M 5
9329
17,95 ± 0,33
0,04
9M 1
8797
17,46 ± 1,01
0,04
23M 6
6174
21,11 ± 1,53
0,05
9M 7
5467
18,65 ± 0,32
0,06
23M 1
10154
19,50 ± 0,86
0,03
9M 11
9779
21,85 ± 0,30
0,05
23M 4
8023
16,19 ± 0,30
0,03
9M 12
10625
17,61 ± 0,51
0,04
23M 8
7537
17,69 ± 0,58
0,04
9M 13
12519
20,33 ± 1,62
0,03
Média
8243
18,48 ± 0,84
0,03
Média
9437
19,18 ± 0,84
0,04
DP
± 1553
DP
± 2607
CV
2
CE
2
2
CE /CV
CVB
2
0,0009
CE
2
0,0253
2
0,0354
2
2
0,0345
2
CVB (%CV )
2
CV
2
97,46%
2
2
CE /CV
CVB
2
0,0763
0,0016
2
0,0209
2
0,0747
2
CVB (%CV )
97,90%
CVB = CV – CE (CV coeficiente de variação; CVB, coeficiente de variação biológica). Média, N:
número de astrócitos por grupo; DP, desvio padrão.
32
Tabela 6. Estimativa individual unilateral do número (N) com respectivos Coeficientes de Erro (CE)
para a camada polimórfica do Giro Denteado do camundongo Albino Suíço.
Camada Polimórfica
Enriquecido/Velho
Espessura
CE
N
(µm)
(Scheaffer)
Sujeitos
Sujeitos
Enriquecido/Jovem
Espessura
CE
N
(µm)
(Scheaffer)
23M 1
4788
15,56 ± 0,12
0,04
9M 7
7527
22,13 ± 0,47
0,04
23M 4
6383
18,68 ± 0,61
0,04
9M 8
5974
22,51 ± 0,91
0,04
23M 5
7181
24,63 ± 1,15
0,04
9M 9
8616
25,57 ± 0,44
0,04
23M 6
12969
25,46 ± 0,51
0,03
9M 10
8857
27,76 ± 0,97
0,04
23M 7
10467
24,63 ± 0,59
0,03
9M 11
7810
25,31 ± 0,53
0,04
Média
8357
21,79 ± 1,97
0,03
Média
7756
24,65 ± 1,04
0,04
DP
3306
DP
±1138
CV
2
CE
2
2
CE /CV
CV
2
0,0009
CE
2
0,0057
2
CE /CV
0,1555
CVB2
0,1564
2
CVB2
2
2
CVB (%CV )
0,0215
0,0016
2
0,0199
2
99,42%
0,0743
2
CVB (%CV )
Empobrecido/Velho
92,56%
Empobrecido/Jovem
23M 5
11281
15,13 ± 0,19
0,03
9M 1
6448
16,88 ± 0,34
0,03
23M 6
8457
16,51 ± 0,55
0,03
9M 7
8144
20,88 ± 0,39
0,04
23M 1
10470
16,47 ± 0,29
0,03
9M 11
5139
20,52 ± 0,44
0,05
23M 4
9311
19,71 ± 0,60
0,03
9M 12
6108
17,11 ± 0,39
0,03
23M 8
11625
22,77 ± 1,27
0,03
9M 13
6361
16,85 ± 0,59
0,03
Média
10232
18,11 ± 1,38
0,03
Média
6440
18,44 ± 0,92
0,03
DP
1325
DP
± 1085
CV2
0,0167
CV2
0,0283
0,0009
CE
2
0,0536
2
CE
2
2
CE /CV
CVB
2
2
2
CE /CV
0,0158
2
CVB (%CV )
2
CVB
2
94,63%
2
0,0009
2
0,0317
2
0,0274
2
CVB (%CV )
96,82%
2
CVB = CV – CE (CV coeficiente de variação; CVB, coeficiente de variação biológica). Média, N:
número de astrócitos por grupo; DP, desvio padrão.
As análises comparadas dos valores médios das estimativas indicam que
a camada molecular é afetada tanto pelo ambiente quanto pelo envelhecimento, com
valores
maiores
para
as
estimativas
induzidas
pela
combinação
enriquecimento/envelhecimento.
As tabelas 4 a 6 realmente confirmam as diferenças no número de
astrócitos
induzidas
(Enriquecido/Jovem
pelas
x
mudanças
ambientais
Empobrecido/Jovem
ou
e
envelhecimento:
Enriquecido/Velho
x
33
Empobrecido/Velho). Para a camada molecular as diferenças foram de 4819 (16245
± 1361 x 11426 ± 1172) para o primeiro caso e de 6177 (20752 ± 4660 x 14575 ±
2714) para o segundo caso, o que representa um acréscimo no número de astrócitos
induzido pelas mudanças ambientais de cerca de 30% em ambos os casos, sendo
ambas maiores do que aquela induzida isoladamente pelo envelhecimento que foi
de 3149 (Empobrecido/Velho x Empobrecido/Jovem, 14575 ± 2714 x 11426 ± 1172).
Importante realçar que neste último caso embora o teste t bi-caudal tenha revelado
significância estatística (p<0,049) para a diferença encontrada, a análise de
variância para os quatro grupos (ANOVA Bonferroni a priori) não revelou
significância para essa combinação.
Diferente da camada molecular, a camada polimórfica só foi afetada pelo
envelhecimento
com
diferença
significativa
apenas
para
a
comparação
Empobrecido/Velho x Empobrecido/Jovem, 10232 ± 1325 x 6440 ± 1085) com cerca
de 37% a mais no grupo de 23 meses em comparação com o de nove meses.
Diferente das outras duas, o número de astrócitos da camada granular não foi
afetado pelas mudanças ambientais nem pela idade.
A figura 11 contém representações gráficas dos valores médios e barras
de erro padrão respectivas para o número total de astrócitos das camadas molecular
e polimórfica. Envelhecimento e enriquecimento parecem promover hiperplasia
astrocítica aditiva na camada molecular enquanto que a camada polimórfica não
demonstra esse efeito aditivo.
A comparação entre os grupos foi feita empregando-se ANOVA,
Bonferroni a priori estabelecendo-se o limite para diferença significante entre os
grupos em p<0.05. Os valores para o coeficiente de variação biológica se situaram
entre 77% e 99,6% garantindo precisão na coleta de dados ao microscópio.
Somente na camada granular não ocorreram alterações significativas,
cujos dados retratados na tabela 5.
34
Figura 11 - Estimativas para o número de astrócitos nas camadas: molecular (acima) e polimórfica
(abaixo) empregando o fracionador óptico nos diferentes grupos experimentais. AE 9M = Ambiente
Enriquecido de nove meses; AE 23M = Ambiente Enriquecido de 23 meses; AP 9M = Ambiente
Padrão (Empobrecido) de nove meses; AP 23M = Ambiente Padrão (Empobrecido) de 23 meses; (*)
= diferença significante para p<0,05.
4.3
AVALIAÇÃO
MORFOMÉTRICA
DOS
ASTRÓCITOS
ATRAVÉS
DE
RECONSTRUÇÃO TRI-DIMENSIONAL.
Correlacionamos os dados comportamentais realizados com morfologia e
distribuição laminar de astrócitos no giro dentado em camundongos idosos e jovens
tanto em ambiente empobrecido quanto em enriquecido.
Em média, os camundongos jovens e velhos aprenderam e se lembraram
da posição da plataforma escondida no dia 3 e 5, respectivamente. A morfologia e o
número de astrócitos da camada molecular do giro denteado foi influenciada pelo
envelhecimento. Em média, os astrócitos de camundongos jovens, em comparação
35
com camundongos velhos apresentaram maiores quantidade de terminais
verdadeiros (85,05 ± 8.83995 vs 62.66665 ± 7.63715), maior dimensão fractal (1.181
± 0.0095 vs 1.144 ± 0.015) e maior área de superfície (152,71 ± 35,2 vs 117.96 ±
30,83 mm² x10-5) respectivamente; demonstrando que o envelhecimento induz o
encolhimento significativo dos ramos dos astrócitos da camada molecular (Figuras
16 e 17). Com base nessas observações sugerimos que a redução da plasticidade
glial pode representar, pelo menos parte das alterações associadas ao declínio de
memória espacial durante o envelhecimento de animais que cresceram em ambiente
empobrecido, enquanto que os déficits durante o envelhecimento dos animais de
ambiente enriquecido foram minimizados (Figuras 8 e 9). Isso nos permite sugerir
que os astrócitos dos animais mantidos em ambiente enriquecido por longos
períodos são do ponto de vista morfológico distintos daqueles dos animais do
ambiente pobre.
As Figuras 12 - 15 expõem fotomicrografias de astrócitos da camada
molecular do GD e suas reconstruções tridimensionais respectivas. As fotos foram
obtidas a cada 1 µm ao longo do eixo z de cada secção. As reconstruções permitem
distinguir através das diferentes cores as ordens dos segmentos e corpos celulares.
Os astrócitos selecionados para ilustração tem características morfométricas
próximas aos valores médios de cada grupo.
A
Figura 12 - Fotomicrografia de um astrócitotípico da camada molecular do GD e reconstrução
tridimensional equivalente representando o astrócito médio do grupo AE jovem. Escala 25 µm.
36
B
Figura 13 - Fotomicrografias de astrócito da camada molecular do GD e reconstrução tridimensional
equivalente representando um astrócito típico do grupo AP jovem. Escala 25 µm.
C
Figura 14 - Fotomicrografia de um astrócito típico da camada molecular do DG e reconstrução
tridimensional equivalente representando o astrócito médio do grupo AE velho. Escala 25 µm.
37
D
Figura 15 - Fotomicrografia de um astrócito típico da camada molecular do GD e reconstrução
tridimensional equivalente do astrócito médio do grupo AP velho. Escala 25 µm.
A Figura 16 ilustra os dendrogramas equivalentes das reconstruções
tridimensionais dos mesmos astrócitos mostrados anteriormente nas Figuras 13 - 15.
Camundongos velhos de ambos os grupos empobrecidos e enriquecidos, em
comparação com os jovens apresentam uma significativa de retração ao longo de
seus segmentos. Camundongos velhos que viveram em ambiente enriquecido,
paradoxalmente, apresentam maior grau de encolhimento do que os de ambiente
empobrecido de mesma idade (Figura 17 - C e D) e uma redução significativa no
número de pontos de ramificação (Figura 17 - A).
Figura 16 – Representação da reconstrução de astrócitos médios de cada grupo e seus respectivos
dendrogramas mostrando o padrão esquemático de arborização de cada reconstrução equivalente.
Escalas: 12,5 µm (reconstruções); 25 µm para cada uma das três barras verticais (dendrogramas).
38
Associado ao envelhecimento, os astrócitos revelaram menor comprimento, menor
área de superfície e menor volume dos seus segmentos (Figura 17 D, F e H), em
comparação aos astrócitos dos grupos jovens em condições de alojamento
equivalentes.
Figura 17 – Gráficos das análises demonstrando diferenças fenotípicas dos astrócitos da camada
molecular do GD sob influência do envelhecimento.
39
5.
DISCUSSÃO
Os resultados do presente trabalho demonstram que o enriquecimento
ambiental de longo prazo, 24h por dia, afeta de forma distinta o número de astrócitos
das diferentes camadas do giro denteado assim como o desempenho nos testes
comportamentais que avaliaram as memórias espacial no labirinto aquático de
Morris e semelhante à episódica em camundongos albino Suíço fêmeas de nove e
23 meses de idade. As fêmeas velhas alojadas em gaiolas padrão (ambiente
empobrecido) apresentaram disfunções cognitivas reveladas pelos dois testes
realizados. Da mesma forma, embora em proporções menores, mas significativas,
as fêmeas adultas de nove meses alojadas no ambiente empobrecido também
apresentaram as mesmas disfunções enquanto que as fêmeas de ambas as idades
mantidas em ambiente enriquecido a partir do 2º mês de vida preservaram a
memória episódica revelando menor déficit no aprendizado e memória espacial
quando medidas pelo labirinto aquático de Morris.
5.1
IDADE, AMBIENTE E MEMÓRIA ESPACIAL E EPISÓDICA
A aquisição e recuperação da informação sobre a posição de um objeto
no espaço é uma tarefa hipocampo-dependente que é afetada pelas mudanças
estruturais e funcionais induzidas pelo envelhecimento (Riedel et al., 1999; D'Hooge
et al., 2001). Camundongos adultos da variedade albina Suíça foram previamente
objeto de investigação para aprendizado e memória espacial (Koopmans et al.,
2003; Rao et al., 2005; Prediger et al., 2007), mas até então, essa linhagem não
tinha sido submetida a testes integrados de memória tal como o teste de memória
episódica empregado no presente trabalho. Portanto, os dados presentes constituem
a primeira evidência experimental em camundongos adultos fêmeas da variedade
Suíça albina de que a memória episódica e em menor extensão o aprendizado e a
memória espacial no labirinto aquático de Morris, são especialmente suscetíveis à
deterioração após aproximadamente seis meses de alojamento no ambiente
empobrecido das gaiolas padrão. O declínio no aprendizado e na memória espacial
associada ao envelhecimento parece estar relacionado às mudanças estruturais e
funcionais na formação hipocampal de cuja integridade depende de tais funções
(Teather et al., 2002; Frick et al., 2003; Rosenzweig et al., 2003). Neste trabalho, os
40
testes no labirinto aquático de Morris mostraram que os animais velhos mantidos no
ambiente pobre das gaiolas padrão perdem a capacidade de aprender e lembrar a
posição da plataforma escondida, enquanto que os indivíduos velhos do ambiente
enriquecido, assim como, os jovens de ambos os ambientes, retém essa
capacidade, mesmo que em diferentes transições. Como não se encontrou diferença
nas velocidades de nado entre os grupos sugere-se que os déficits encontrados na
capacidade de aprender e lembrar sejam representativos do declínio cognitivo
associado às mudanças no ambiente e ao envelhecimento.
Já está descrito que a formação de memória episódica depende da
integridade do hipocampo podendo ser seletivamente comprometida por lesões do
fórnix, do hipocampo dorsal ou ventral, da lesão seletiva de CA3 ou por infusão de
antagonistas de NMDA ou AMPA (Daumas et al., 2004; Eacott et al., 2004; Ergorul
et al., 2004; Bast et al., 2005; Li et al., 2008). Uma vez tendo sido detectado no
presente trabalho comprometimento da memória episódica nos animais mantidos no
ambiente pobre das gaiolas padrão é aceitável supor que o giro denteado pode ser
um dos alvos afetados por mudanças estruturais e funcionais associadas à elevada
redução de estímulos somatomotores e cognitivos da gaiola padrão ou ao declínio
cognitivo associado ao envelhecimento. Como cada região hipocampal contém uma
população distinta de neurônios que expressam perfis moleculares únicos (Zhao et
al., 2001) e o giro denteado parece ser particularmente sensível às mudanças
relacionadas ao envelhecimento (Small et al., 2004), sugere-se que os déficits de
memória espacial no adulto e no velho possam ter diferentes mecanismos
fisiopatológicos e que as influências aditivas do ambiente pobre e do envelhecimento
podem acelerar o declínio cognitivo. Realmente quando os camundongos adultos de
9 e 23 meses alojados no ambiente empobrecido foram testados para aprendizado e
memória espacial empregando o paradigma do labirinto aquático de Morris, os
primeiros, mas não os velhos foram capazes de aprender e lembrar a posição da
plataforma escondida após cinco dias de testes. Esses resultados sugerem que após
seis meses de alojamento em condições empobrecidas, o substrato morfofisiológico
hipocampal para o aprendizado espacial ainda está preservado e pode ser ativado
após o treinamento. Como esperado, as capacidades mnemônicas deterioraram-se
mais intensamente quando a idade avançada foi combinada com o ambiente
empobrecido e nessa condição a memória espacial e todos os tipos de memória
episódica foram prejudicados. Coerentemente, os animais velhos que foram alojados
41
no ambiente enriquecido revelaram aprendizado e memória preservados em todos
os testes sugerindo que os mecanismos de consolidação e de recuperação para tais
tipos de memória foram mantidos pela estimulação somatomotora e cognitiva
aumentadas da condição enriquecida.
5.2
ASTRÓCITOS
DO
GIRO
DENTEADO,
EMPOBRECIMENTO,
ENVELHECIMENTO E DECLÍNIO COGNITIVO
Enquanto as bases fisiológicas para os déficits de memória não foram
ainda completamente elucidados, é interessante discutir possíveis conexões entre a
proteção cognitiva associada ao enriquecimento ambiental e as diferenças
encontradas no número e na morfologia de astrócitos da camada molecular e no
número daqueles na camada polimórfica do giro denteado em animais jovens e
idosos. Os valores estereológicos deste trabalho revelaram que as estimativas do
número de astrócitos nos animais velhos do ambiente empobrecido foram
significativamente maiores do que as estimativas para os animais de nove meses
alojados no mesmo ambiente e essas diferenças foram associadas a um expressivo
declínio cognitivo nos testes de memória semelhante à episódica e espacial. Por
outro lado as estimativas do número de astrócitos da camada molecular do giro
denteado dos animais velhos que cresceram em ambiente enriquecido foram
significativamente maiores do que aquelas dos animais velhos que cresceram em
ambiente empobrecido. Como os animais do ambiente enriquecido preservaram sua
habilidade de integrar informações no contexto espaço-temporal e foram capazes de
aprender e lembrar a posição da plataforma escondida no teste do labirinto aquático
de Morris é razoável levantar a hipótese de que a astrocitose induzida pelo
enriquecimento e aquela associada ao envelhecimento podem ter diferentes papéis
funcionais. Concordantemente, as análises dos vídeos da trajetória de nado
revelaram um gradiente entre os diferentes grupos experimentais com o melhor
desempenho associado aos animais do grupo de nove meses do ambiente
enriquecido e o pior ao grupo velho do ambiente pobre que não conseguiu completar
o teste. Entre os extremos obtiveram desempenho intermediário os animais de nove
meses do ambiente pobre seguido dos animais velhos do ambiente enriquecido.
A
noção
de
que
envelhecimento
e
a
redução
de
estímulos
sensoriomotores e cognitivos podem causar alterações celulares e moleculares
42
semelhantes é sugerida por evidências de que a adição de suplementos nutricionais
ricos em fosfatidilcolina (CDP) e monofosfato de uridina (UMP) em ratos jovens e
velhos da linhagem Sprague-Dawley submetidos ao empobrecimento ambiental
(Teather et al., 2005; 2006) minimizam os déficits cognitivos associados à idade e à
pobreza de estímulos. No presente trabalho entretanto detectou-se efeitos distintos
da diminuição de estímulos sensoriomotores e cognitivos sobre os astrócitos do giro
denteado de camundongos jovens e velhos com ocorrência de hiperplasia associada
ao enriquecimento e ao envelhecimento na camada molecular, hiperplasia associada
ao envelhecimento na camada polimórfica e nenhum efeito sobre as estimativas do
número de astrócitos feitas na camada granular, sugerindo que a plasticidade
astroglial induzida por estimulação depende da circuitaria laminar. Paradoxalmente a
análise morfométrica revelou hipotrofia dos astrócitos da camada molecular durante
o envelhecimento com maior intensidade nos animais velhos do ambiente
enriquecido.
Sugerimos, portanto, que a redução da plasticidade glial pode
representar, pelo menos, parte das alterações associadas ao declínio de memória
espacial durante o envelhecimento de animais mantidos em ambiente empobrecido,
enquanto que os déficitis dos animais de ambiente enriquecido durante o
envelhecimento foram minimizados. Isso nos reforça a pensar que os fenótipos dos
atrócitos
pertencentes
aos
animais
mantidos
em
ambiente
enriquecido
numericamente distintos dos animais do ambiente empobrecido podem ter mais
perfís astrocíticos neuroprotetores do que neuroinflamatórios. Não temos entretanto
explicação razoável para o efeito paradoxal da ocorrência de maior retração nos
astrócitos dos animais velhos do ambiente enriquecido. Precisamos portanto
investigar a hipótese de que o déficit dos animais velhos do ambiente enriquecido
pode ter sido minimizado pela elevação do número dos astrócitos com fenótipos
diferentes daqueles associados à neuroinflamação esperada para essa idade
(Salminen, et al. 2011). Nós sugerimos igualmente que essa neuroproteção está
associada
ao
desenvolvimento
de
plasticidade
dependente
da
expriência
multisensorial e cognitiva mais densa do ambiente enriquecido mantida durante a
vida toda (Willie K. Dong e William T. Greenough, 2004).
Uma extensão natural do presente estudo seria a investigação de
possíveis correlações quantitativas entre as mudanças astrocíticas em outras
43
regiões da formação hipocampal e respectivas alterações comportamentais em
estudos longitudinais na mesma ou em outras espécies de roedores.
5.3
LIMITAÇÕES TÉCNICAS NÃO ESTEREOLÓGICAS
Um dos alvos do presente trabalho foi estimar o número de astrócitos
dentro de um determinado volume de tecido equivalente às camadas do giro
denteado afetadas pelas mudanças ambientais e pelo envelhecimento usando
investigação estereológica sem viés. Como em todos os casos onde se utiliza
microscopia para realizar tais estimativas, não é possível contar todas as células
dentro da região de interesse. Para contornar essa limitação e obter estimativas que
se aproximem dos valores reais a partir de frações amostrais mínimas, é necessário
a utilização de contagem sistemática e aleatória dos objetos de interesse incluindo a
terceira dimensão. Essa alternativa assegura a estimativa adequada do número total
de células dentro da área de interesse a partir do número de células detectadas em
cada caixa de contagem da amostra e da probabilidade amostral (Schmitz et al.,
2005). Ainda assim, o máximo que se pode pretender com esse procedimento é
realizar estimativas que se aproximam ao máximo do valor esperado (Cruz-Orive
1994; Schmitz 1998).
Seguindo esses princípios, existem dois métodos estereológicos: o
fracionador óptico já descrito e o método que estima o número total de células
multiplicando a densidade média de células pelo volume da região de interesse
(Schmitz et al., 2000). Em estudo recente, entretanto, ficou evidente que as
estimativas do número total de objetos de interesse obtidos a partir do fracionador
óptico, são do ponto de vista estatístico e do ponto de vista do esforço empreendido,
mais eficientes do que as estimativas a partir da densidade e volume (Schmitz et al.,
2000). Além disso, avaliaram-se igualmente várias maneiras de se estimar o erro em
amostras simuladas por computador de modo a encontrar uma maneira de calcular o
coeficiente de erro que mais se aproximasse do erro verdadeiro. Comparando o
coeficiente de erro verdadeiro para grandes amostras simuladas por computação,
com o calculado por diferentes métodos, encontrou-se que o coeficiente de
Scheaffer é o que mais se aproxima do erro verdadeiro (Glaser et al., 1998).
Por conta do fato de que o coeficiente de erro de Scheaffer representa a
variação devida à incerteza metodológica intrínseca, é esperado e desejável que ele
sempre contribua menos para a variação total do que a variação biológica. Isso é
44
alcançado respeitando a relação: CE2/CV2<0,5, onde CE é o coeficiente de erro
devido à incerteza metodológica intrínseca e CV = Desvio Padrão / Média. No
presente trabalho a relação CE2/CV2 esteve sempre abaixo de 0,5, minimizando a
probabilidade de erros procedimentais durante as contagens (Slomianka et al.,
2005). A outra maneira que se empregou para se avaliar os erros relacionados à
escolha da matriz amostral foi o cálculo da variação biológica definida como: CVB2 =
CV2 – CE2 (onde CE, coeficiente de erro; CV coeficiente de variação; CVB,
coeficiente de variação biológica) expresso em valor percentual do coeficiente de
variação. Considera-se que o coeficiente de erro é adequado sempre que ele
contribui menos do que a variação biológica para o coeficiente global de variação.
Entretanto mesmo com todos esses cuidados, a incerteza nas estimativas
ainda permanece e é decorrente de outras fontes de erro possíveis como aqueles
introduzidos pelos pré-supostos do observador acerca dos grupos experimentais,
pelas alterações induzidas nas secções pelo processamento do tecido, pela
ambigüidade no reconhecimento de áreas ou dos objetos de interesse e pela
definição dos planos de foco superior e inferior da secção.
Corroborando essa última afirmação tem sido encontrado um número
expressivo de trabalhos com diferenças significativas entre as estimativas
estereológicas no hipocampo de roedores.
Seriam as diferenças encontradas
conseqüência de diferentes metodologias? Simples variação biológica? Ou
ambigüidade na definição da região e dos objetos de interesse? No caso específico
do giro denteado do rato diferenças importantes nas estimativas têm sido
frequentemente detectadas e.g. (Nishimura et al., 1995; Pilegaard et al., 1996; Grady
et al., 2003). Esses resultados contraditórios, tal como indicado anteriormente
podem resultar de diferenças nas metodologias aplicadas, de variações nos
procedimentos histológicos, de protocolos de estereologia diferentes e de
ambigüidades na definição dos objetos e das áreas de interesse (West 1999;
Mandarim-de-Lacerda 2003; Schmitz et al., 2005). O elemento comum entre os
diferentes trabalhos que demonstram discrepâncias é a adoção da técnica de Nissl,
uma técnica de coloração que cora indistintamente neurônios e glias, propiciando
ambigüidade na definição dos objetos de interesse.
Infelizmente, o número de estudos estereológicos dedicados aos
astrócitos do giro denteado do camundongo é muito limitado para permitir um ensaio
comparativo. De fato, apenas três trabalhos empregam metodologias sem viés
45
baseadas em procedimentos estereológicos para estimar o número de astrócitos no
giro denteado de camundongos velhos (Long et al., 1998; Mouton et al., 2002; Lei et
al., 2003). Esses trabalhos, entretanto, utilizaram outra variedade de camundongo,
fazem estimativas do número total de astrócitos do giro como um todo, não se
detendo na análise laminar detalhada, o que torna difícil sua comparação com os
resultados do presente trabalho. De qualquer modo, para reduzir as possíveis fontes
de erro, todos os dados do presente trabalho foram obtidos com o mesmo protocolo
de
processamento
histológico
(perfusão,
imunomarcação,
desidratação,
contracoloração e diafanização) adotando o mesmo método estereológico, hardware
e software. Para detectar possíveis variações no critério de identificação dos objetos
de interesse, empregou-se um único tipo de anticorpo monoclonal para GFAP e
realizou-se procedimentos de verificação dos resultados de contagem repetindo
eventualmente a avaliação de uma mesma região por diferentes investigadores.
Como resultado desses procedimentos as fontes não biológicas de variação foram
minimizadas. Ver tabelas 4 a 6 e para análise dessas questões consultar (Mouton et
al., 2002; Slomianka et al., 2005).
5.4
HORMÔNIOS E ASTRÓCITOS DO GIRO DENTEADO
Além do envelhecimento e das mudanças ambientais, hormônios sexuais
podem alterar o número de células da glia no giro denteado. De interesse para
comparação com o presente trabalho, dados estereológicos recentes dedicados à
comparação entre camundongos machos e fêmeas revelaram que o envelhecimento
não afetou o número de astrócitos dos camundongos machos enquanto que o
número de astrócitos nas fêmeas foi maior em 22% no grupo jovem (2-3 meses),
22% no grupo adulto (13-14 meses) e 35% no grupo senil (20-24 meses)
comparados aos machos de mesma idade (Mouton et al., 2002). Em concordância,
efeitos de hormônios femininos no perfil de células gliais em fêmeas (B6) entre 20 e
24 meses ovariectomisadas e submetidas a um tratamento prolongado com
hormônio 17β-estradiol e raloxifeno (agonista de receptor de estrógeno) provocou
redução do número de astrócitos no GD e CA1 quando comparadas ao grupo
ovariectomizado tratado com placebo (Lei et al., 2003). Essa é uma forte evidência
de que a proliferação da célula glial é alvo dos efeitos mediados por hormônios
gonadais femininos (estrógeno). No presente trabalho, não houve comparações
46
entre machos e fêmeas, mas encontramos em concordância aumento significativo
no número de astrócitos nas fêmeas velhas, não havendo, portanto, como excluir a
hipótese de que a estropausa possa estar contribuindo para esse aumento na
variedade de camundongos que estudamos. Uma vez que fêmeas de 20 meses têm
grande possibilidade de estarem sem a proteção estrogênica é razoável propor que
pelo menos parte da astrocitose encontrada esteja associada ao déficit hormonal.
Seria interessante, portanto, realizar a reposição hormonal em grupo de fêmeas
senis e avaliar pelo método estereológico o impacto do tratamento sobre o número
de astrócitos.
Empregando
metodologia
sem
viés,
baseada
em
estereologia
demonstrou-se que a presença de adrenocorticóides também é necessária para
manutenção da integridade estrutural do giro denteado. A adrenalectomia
seletivamente reduziu o número de neurônios na camada granular. No entanto, o
número de astrócitos do GD não foi alterado pela adrenalectomia, mas o conteúdo
de GFAP estava aumentado, caracterizando um estado de ativação astrocitária
normalmente associado à lesão cerebral (Sousa et al., 1997). Em concordância, a
plasticidade astrocitária em resposta as lesões no sistema nervoso pode sofrer
influência de drogas neuroprotetoras e anti-inflamatórias, como a metilprednisolona
(glicocorticóide sintético) tendo se constatado que o efeito neuroprotetor da
metilprednisolona não se restringia a redução geral da inflamação, mas também por
ação direta nos astrócitos inibindo sua ativação mas não o seu número (Liu et al.,
2008). No presente trabalho, poderia se argüir que a manipulação dos animais e a
própria submissão aos testes comportamentais poderia ter papel estressor
aumentando os níveis plasmáticos de corticosteróides, entretanto, como esses
níveis não foram mensurados é difícil garantir que isso tenha ocorrido. De qualquer
modo, como todos os grupos experimentais foram submetidos aos mesmos testes
comportamentais e o estudo de Sousa et al. (1997) revela que o número de
astrócitos permanece inalterado em animais adultos adrenalectomizados, teria que
se argüir para explicar os resultados que os níveis de cortisol após os testes teriam
que ser diferentes em jovens e velhos ou que a plasticidade astrocítica no velho em
resposta ao cortisol estaria diminuída, impedindo a redução do número de astrócitos.
Alternativamente poderia se pensar em uma diminuição do número de receptores
para corticosteróides no giro denteado dos animais velhos com redução do impacto
dos corticosteróides sobre o giro denteado. Esse mesmo racional pode ser aplicado
47
às diferenças entre os ambientes. Para investigar essas hipóteses seria interessante
medir o cortisol plasmático e seus receptores nos astrócitos do giro denteado em
todos os grupos experimentais.
Tomados
observações
em
anteriores
conjunto,
de
que
nossos
achados
o alojamento de
são
consistentes
animais
em
com
condições
empobrecidas a partir do final do período de aleitamento pode impedir o
desenvolvimento cognitivo normal (Spangler et al., 1994; Winocur 1998; van der
Staay 2002) e que o ambiente enriquecido preserva-o (Petrosini et al., 2009). Esses
achados parecem estar relacionados à plasticidade astroglial observada na camada
molecular do Giro Denteado, dependente de atividade sensoriomotora e cognitiva,
sugerindo que tais mudanças seletivas façam parte dos circuitos que garantem a
melhora e a manutenção do desempenho em tarefas de aprendizado e memória no
cérebro de fêmeas de camundongos velhos da variedade Suíça albina. Em conexão
com essa hipótese, recentemente foi se acumulando evidência de que as células
astrogliais participam ativamente na transmissão sináptica neuronal e potenciação
de longa duração (do inglês “long term potentiation”, LTP), tendo sido demonstrado
que uma resposta semelhante à LTP foi detectada nos astrócitos associados às
sinapses astrocíticas da via perfurante. Essa resposta foi obtida subseqüente à
estimulação de alta freqüência em fatias hipocampais requerendo como condição a
ativação do receptor do NMDA dos astrócitos para sua indução. A presença desses
receptores nos astrócitos foi confirmada pelo registro de correntes seletivas em
canais a ele associados, assim como, pela identificação de RNA mensageiro
envolvido com sua síntese (Zhang et al., 2009). Assim, o fato de termos encontrado
a camada molecular como sítio preferencial da plasticidade astroglial dependente de
experiência, sendo essa camada ao mesmo tempo um dos alvos mais densos da via
perfurante (van Groen et al., 2002) corrobora a hipótese de que os astrócitos podem
estar desempenhando papel importante na modulação dos circuitos locais daquela
camada e que sua contribuição pode ser importante para a consolidação da
memória semelhante à episódica.
48
6.
CONCLUSÃO
O objetivo do presente trabalho era de investigar em fêmeas de nove ou
23 meses de idade da variedade Suíça albina o impacto do ambiente empobrecido e
do envelhecimento:
1) sobre a memória de objeto realizando o teste para a memória
semelhante à episódica e para o aprendizado e a memória espacial no labirinto
aquático de Morris.
2) sobre o número e a distribuição laminar e regional dos astrócitos do
giro denteado.
3) sobre a morfologia de astrócitos na camada molecular do giro
denteado.
Os resultados do presente estudo demonstram pela primeira vez que a
estimulação sensoriomotora e cognitiva de longa duração e mantida durante toda a
vida preserva a capacidade de camundongos fêmeas da linhagem Suíça albina de
integrar e lembrar de informações acerca do lugar, da forma e do momento em que
um determinado objeto lhe é apresentado.
Confirmam igualmente descrições anteriores de que o ambiente
enriquecido melhora a capacidade de aprender e lembrar a posição de uma
plataforma escondida no teste do labirinto aquático de Morris.
Sugerem que o aumento do número de astrócitos na camada molecular
do giro denteado parece estar associado, pelo menos em parte, aos efeitos
induzidos pela estimulação sensoriomotora e cognitiva aumentadas e permanentes
do ambiente enriquecido, enquanto que na camada polimórfica esse efeito parece
estar associado ao envelhecimento exclusivamente. Como a astrocitose foi o
elemento comum entre as estimativas numéricas realizadas nos animais velhos do
ambiente enriquecido e do empobrecido e que houve um efeito aditivo na camada
molecular dos animais do grupo enriquecido/velho, sugerimos, portanto, que a
redução da plasticidade glial pode responder, pelo menos em parte, pelas alterações
associadas ao declínio de memória espacial durante o envelhecimento de animais
mantidos em ambiente empobrecido. Finalmente não temos como explicar o
paradoxo da maior retração dos processos astrocíticos dos animais mantidos em
ambiente enriquecido o que vai requerer estudos complementares detalhados.
49
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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ZHAO, X., LEIN, E. S., HE, A., SMITH, S. C., ASTON, C. & GAGE, F. H.
Transcriptional
profiling
reveals
strict
boundaries
subregions. J Comp Neurol, 441: 187-196. 2001.
between
hippocampal
58
ANEXO I
59
ANEXO II
European Journal of Neuroscience
European Journal of Neuroscience, pp. 1–11, 2010
doi:10.1111/j.1460-9568.2010.07296.x
Environmental impoverishment and aging alter object
recognition, spatial learning, and dentate gyrus
astrocytes
Daniel G. Diniz,1 Cé sar A. R. Foro,1 Carla M. D. Rego,1 David A. Gloria,2 Fabio R. R. de Oliveira,1 Juliana M. P. Paes,1
Aline A. de Sousa,1 Tatyana P. Tokuhashi,1 Lucas S. Trindade,3 Maı́ra C. P. Turiel,1 Erick G. R. Vasconcelos,2
Joã o B. Torres,1 Colm Cunnigham,4 Victor H. Perry,5 Pedro F. da Costa Vasconcelos6 and Cristovam W. P. Diniz1
1
Universidade Federal do Pará -UFPA, Instituto de Ciê ncias Biológicas, Laboratório de Investigações em Neurodegeneração e
Infecç ã o, Hospital Universitá rio Joã o de Barros Barreto, Brazil
2
Universidade Federal do Pará -UFPA, Curso de Licenciatura em Ciê ncias Biológicas, Instituto de Estudos Costeiros, Campus de
Bragança, Brazil
3
Universidade do Estado do Pará -UEPA, Centro de Ciê ncias Biológicas e da Saú de CCBS, Belé m, Pará , Brazil
4
Department of Biochemistry, Trinity College I n s t i t u t e of Neuroscience, Trinity College, Dublin 2, Ireland
5
Southampton Neuroscience Group, S c h o o l of Biological Sciences, University of Southampton, Southampton SO16 7PX, UK
6
Instituto Evandro Chagas, IEC, Departamento de Arbovirologia e Febres Hemorrá gicas, Ananindeua, Pará , Brazil
Keywords: albino Swiss mice, enriched environment, impoverished environment, memory
Abstract
Environmental and age-related effects o n learning and memory were analysed and compared with changes observed in astrocyte
laminar distribution in the dentate gyrus. Aged (20 months) and young (6 months) adult female albino Swiss mice were housed from
weaning either in impoverished conditions or in enriched conditions, and tested for episodic-like and water maze spatial memories. After
these behavioral tests, brain hippocampal sections were immunolabeled for glial fibrillary acid protein to identify astrocytes. The
effects of environmental enrichment on episodic-like memory were not dependent on age, and may protect water m a z e spatial learning
and memory from declines induced b y aging or impoverished environment. In the dentate gyrus, the number of astrocytes increased
with both aging and enriched environment in the molecular layer, increased only with aging in the polymorphic layer, and was
unchanged in the granular l a y e r . We suggest that long-term experience-induced glial plasticity by enriched environment may
represent at least part of the circuitry groundwork for improvements in behavioral performance in the aged mice brain.
Introduction
The environmental conditions under which animals are reared affect
subsequent cognitive performance (Kempermann et al., 1997; Duffy
et al., 2001; Teather et al., 2002). An enriched environment has been
defined as that which offers social interactions with conspecifics and
stimulation of exploratory and motor behavior with periodic changes
in the variety of toys, ladders, tunnels, ropes, bridges and running
wheels for voluntary physical exercise. In contrast, an impoverished
environment offers standard cages with reduced sensorial, motor and
cognitive stimulation (van Praag et al., 2000). Compared with those
reared in impoverished environments, rodents reared in enriched
environments exhibit increases in brain size and weight, the number of
neurons in the dentate gyrus, the number and area of synapses,
the number and density of dendritic branches, and the
production of neurotrophic factors (Rosenzweig & Bennett, 1996;
Kolb & Whishaw,
1998; van Praag et al., 2000; Rampon & Tsien, 2000).
Correspondence: Dr C. Wanderley Picanç o Diniz, as above.
E-mail: [email protected]
Studies of environmental effects on brain plasticity have focused on
altered neuronal morphology; however, substantial morphological
changes have also been shown to occur in glial cells (Sirevaag &
Greenough, 1991; Komitova et al., 2002), and the first report to
describe glial multiplication associated with enriched environment
was published in 1964 using autoradiography (Altman & Das, 1964).
Integrated studies involving aging, environment and glial changes
have recently become popular because astrocytes are implicated in a
number of local hippocampal regulatory processes that affect learning
and memory (Junjaud et al., 2006; Magistretti, 2006; Mothet et al.,
2006; Todd et al., 2006; Perea & Araque, 2007). Indeed, in the murine
hippocampus, astrocytes are by far the most numerous of glial cells,
and several studies have revealed age-related increases in astrocytes
(Pilegaard & Ladefoged, 1996; Long et al., 1998b; Mouton et al.,
2002). In the rat hippocampus, it was shown that astrocytes were
smaller in size and number in aged rats raised in enriched environments compared with age-matched controls (Soffie et al., 1999). On
the other hand, astrocytes in the CA1 region of adult mice raised in an
enriched environment presented similar numbers, but longer and more
ramified branches, than the controls housed in standard cages (Viola
Received 28 January 2010, revised 8 April 2010, accepted 26 April 2010
The Authors (2010). Journal Compilation ª Federation of European Neuroscience Societies and Blackwell Publishing Ltd
2 D. G. Diniz et al.
et al., 2009). It has been previously suggested that astrocytes exhibit
transient responses to the individual’s stress history rather than longterm adaptive responses to differential effects of rearing in complex or
laboratory cage environments (Sirevaag & Greenough, 1991). These
and other data (Chadashvili & Peterson, 2006; Billard & Rouaud,
2007) demonstrate that we lack understanding regarding associations
between non-neuronal plasticity and the effects of environment and
aging (Markham & G r e e n o u g h , 2004). Many q u e s t i o n s
r e m a i n unresolved, including the quantitative relationships
between changes in morphology and behavior and between changes in
astrocyte number and environment and aging-related factors. Indeed,
no studies have reported simultaneous (unbiased) measurements of
the number of dentate gyrus astrocytes and assessments of behavior
in murine models of aging raised in different environments.
In the present report, we assessed the integrated memories of young
adult (6 months) and aged (20 months) mice raised in either enriched
or impoverished environments, and we investigated whether affected
memories were correlated with changes in the number of astrocytes in
the dentate gyrus.
Open field habituation
Each day, mice were placed in the arena, free of objects, for 5 min to
explore the open field.
Object habituation
Each day, mice were exposed to two identical objects placed at the
corners of the arena for 5 min, three times, with 50 min in between.
These objects were not used on the test days.
Testing
The episodic-like memory test was administered once for each mouse.
In order to minimize the influence of natural preferences for particular
objects or materials, we chose objects of the same material, with
different geometries that could be easily discriminated, and similar
access for interaction (Dere et al., 2005a). All objects were made
of plastic with different shapes, heights and colors. Before each mouse
entered the arena, the box and objects were cleaned with 75% ethanol
to minimize distinguishing olfactory cues.
Episodic-like memory test
Materials and methods
Subjects and experimental groups
Seventy-one albino Swiss female young adult (6 months) and aged
(20 months) mice were housed from weaning in enriched conditions
(EC, n = 27) or impoverished conditions (IC, n = 29). These formed
four experimental groups: enriched environment, young adults (EY,
n = 12); impoverished environment, young a d u l t s ( IY, n = 13);
enriched environment, aged adults (EA, n = 15); and impoverished
environment, aged adults (IA, n = 16). EC comprised two-level wire
cages (100 50 100 cm), equipped w i t h r o p e s , r o d
b r i d g e s , tunnels, running wheels and toys. Toys were made of
different forms of plastic, wood and metal of different colors, and
were changed periodically. Each EC cage housed 12–15 young and
aged mice. Water and food were delivered to the top and bottom
levels, respectively. This obliged mice to move from one
compartment to another for drinking and eating.
IC comprised plastic cages (32X39X100 cm) without equipment
or toys. Each IC cage housed 12–13 young and aged mice. All mice had
free access to water and food. In addition, 12-h dark and light cycles were
maintained. Behavioral tests were given during the light cycle.
Behavioral procedures
We used the episodic-like memory test to assess integrative memories
(Dere et al., 2005a), and a long-term water maze test to assess learning
and spatial memory (Morris, 1984). All young adult (EY and IY) and
aged (EA and IA) mice were used in both tests.
The apparatus for the episodic-like memory test consisted of an open
box (30X30X40 cm) made of painted white wood. The floor was
painted with black lines to form nine squares (10X10 cm), and the
luminance at the center of the cage floor was 2.4 cd ⁄ m2. Detailed
protocols and the rationale for test choices were discussed elsewhere
(Dere et al., 2005a, b). In brief, behavioral assays were performed after
12 days: 7 days to become accustomed to handling, 3 days for open field
habituation, 2 days for object habituation, and then 1 day of testing.
Handling
Each day, mice were placed in the center of the arena for 1 min and
then removed to their cages.
A diagram of the episodic-like memory test is shown in Fig. 1. This
test consisted of three trials: two 5-min sample trials and one 5-min
test trial, with 50-min intervals between trials. In the first sample trial,
four identical objects were presented. In the second sample trial, four
different identical objects were presented. In the test trial, two objects
from sample trial 1 (‘old’ objects) and two objects from sample trial 2
(‘recent’ objects) were presented. In addition, one object from the first
sample trial was shifted to a new location (‘displaced’ object), but the
objects from the second sample trial remained in the same places
(‘stationary’ objects). It was expected that mice would spend more
time with objects from the first sample trial (old objects) than those
from the second sample trial (recent objects), and would show a
preference for the ‘old, displaced’ object, a second preference for the
‘old, stationary’ object, and finally equal preferences for the ‘recent
stationary’ objects. In the episodic-like memory test the exploration of
an object was assumed when a mouse approached an object, the head
was directed towards it, and the head was placed within 0–3 cm from
the object. This definition required that each object be fixed to the
apparatus floor, thus we chose heavy objects for interaction. The
performance was defined as the percentage of time spent exploring
one o b j e c t . To a c c o u n t f o r i n d i v i d u a l variab ilit y in
e x p l o r a t o r y activity, the time spent with each object was
normalized by the total exploration time for each individual.
Detailed s t a t i s t i c a l procedures for episodic-like memory tests
protocol were described elsewhere (Dere et al., 2005a). In brief, for
the episodic-like memory test, the basic measure obtained from videoimages was the time a mouse spent during the test trial in explorations
of the ‘old’, ‘recent’, ‘displaced’ and ‘stationary’ objects. The
performance was the time of exploration for each object, expressed
as a proportion (percentage) of the total time of exploration. Possible
significant differences were also detected with the two-tailed t-test for
dependent groups (Dix & Aggleton, 1999).
Water maze test
A different set of young (EY, n = 12; IY, n = 13) and aged (EA,
n = 15; IA, n = 11) adult mice groups were trained in the water maze
adapted for mouse dimensions. The circular pool and platform were 94
and 14 cm in diameter, respectively, and the platform was 1 cm below
the water surface. To occlude the platform, the pool was filled with
dark-blue water (22 ± 2 C) colored with a non-toxic dye. In each trial
The Authors (2010). Journal Compilation ª Federation of European Neuroscience Societies and Blackwell Publishing Ltd
European Journal of Neuroscience, 1–11
Environment, aging, astrocytes and memory 3
Fig. 1. Top: diagram of the experimental designs for integrated tests (episodic-like memory). In the first sample (left panel), mice explored four identical objects
(open circles) placed in the configuration shown. In the second sample (middle panel), mice explored four different identical objects (filled squares) placed in a
different configuration. In the test trial (right panel), mice explored two objects from trial 1 (‘old’ objects; open circles), one placed in its former position (stationary)
and one in a new position (displaced); and two objects from trial 2 (‘recent’ objects; filled squares), both placed in their former positions (stationary; modified from
Dere et al., 2005a). Bottom: results from episodic-like memory tests. Values on the y-axes represent the time of exploration for each object as a percentage of the
total time of exploration. Labels on the x-axes indicate experimental groups. Bars indicate average values ± SEM for the indicated groups. Filled and open bars
represent different types of objects (displaced vs. stationary; old vs. recent). *Two-tailed t-test; P < 0.05. EC, enriched conditions; IC, impoverished conditions.
the subjects were allowed 1.5 min to find the hidden platform; trials
were separated by intervals of 90 s; the task was considered complete
when animals found and remained on the platform for 5 s. The first day
of water maze training was dedicated to adapting the animal to the
aquatic labyrinth. In the remaining 7 days, animals were tested once
per day in four trials. The learning rate ‘C ’ for the water maze was
assessed by measuring four trials of escape latency and comparing
results measured on the 1st and 5th test days. The ratio was denoted as
C, the contrast index, calculated with the following equation:
C = (L1 - L5)
;
(L1 + L5)
where L1 and L5 are the escape latencies or total distance traveled to
find the platform measured on the 1st and 5th test days, respectively.
The contrast index was used to normalize the learning curve to each
individual’s performance, t h u s accounting f o r t h e variation in
performances between individuals (Torres et al., 2006). Raw data
were also included to illustrate individual performances in the water
maze tests and compare with contrast values.
We recorded escape latency, distance traveled, average swimming
speed and trajectories for each mouse. All groups were compared
using one-way anova, Bonferroni a priori test or two-way anova
followed by Bonferroni post hoc tests, with differences between
groups accepted as significant at a 95% confidence level (P < 0.05).
All tests were recorded with a webcam, and images were analysed
with a computer program to score the time spent interacting with
objects and performance in the water maze (ANYMAZE tracking
system, Stöelting). Computer analysis was performed off- line.
Perfusion and histological procedures
At the end of the water behavioral tests, all subjects were weighed and
killed with an o verd ose of k e t a min e (100 mg ⁄ kg) a nd
x yl a z in e (10 mg ⁄ kg; Konig Laboratories). They were then
perfused transcar- dially with heparinized saline for 10 min,
followed by an aldehyde fixative (4% paraformaldehyde in 0.1 m
phosphate buffer, pH 7.2–7.4) for 30 min. All chemicals were
purchased from Sigma (São Paulo, Brazil). After perfusion and
craniotomy, the brains were removed and cut on a vibratome at a 70
lm thickness. One out of each five sections was used to detect glial
fibrillary acid protein (GFAP) by free-floating immunohistochemistry.
Free-floating sections were rinsed once in 0.1 m phosphate buffer,
transferred to 0.2 m boric acid pH 9.0, heated to 65–70 C for 1 h, and
then washed three times, 5 min each, in PBST (5%). The sections
were incubated under constant shaking in a 1% hydrogen peroxide
solution in methanol for 10 min, then rinsed twice, 2 min each, in
0.1 m PBS. The sections were then blocked with immunoglobulin
for 1 h, according to the instructions for the Mouse- on-Mouse
Immunodetection kit (M.O.M. kit, Vector Laboratories,
The Authors (2010). Journal Compilation ª Federation of European Neuroscience Societies and Blackwell Publishing Ltd
European Journal of Neuroscience, 1–11
4 D. G. Diniz et al.
USA). Blocking was followed by three washes, 2 min each, in PBS.
Sections were incubated in a working solution of protein concentrate
for 5 min, then incubated with monoclonal mouse anti-GFAP primary
antibody (MAB360, CHEMICON Int, USA), diluted 1 : 800 in
protein concentrate solution (M.O.M. kit), at 4 C for 3 days with
continuous, gentle agitation. Next, the sections were washed three
times, 2 min each, in PBS and incubated for 20 h with the biotinylated
horse anti-mouse secondary antibody (M.O.M. kit), diluted 1 : 100 in
PBS. After three washes, 2 min each, in PBS, sections were
transferred to an avidin-biotin-peroxidase complex solution (ABC,
Vector Laboratories, USA; 1 : 200) for 1.5 h, washed three times,
2 min each, in 0.1 m PBS, and processed with the glucose oxidase–
diaminobenzidine–nickel method and peroxidase histochemistry (Shu
et al., 1988).
The reaction was interrupted after fine astrocytic branches were
detected under the microscope. Sections were rinsed fo u r times,
5 min each, in 0.1 m PBS, mounted on gelatinized slides, dehydrated
in alcohol and xylene, and coverslipped with Enthelan (Merck).
Results Behavioral
assays Episodic-like
memory test
Only young adult and aged mice from the enriched environment were
able to integrate object recognition in a spatio-temporal context. The
subjects from impoverished environments were unable to make the
appropriate distinctions (Fig. 1). In the spatial memory component of
episodic-like memory, young and aged subjects housed in EC spent,
respectively, more time in the displaced than stationary objects (EY,
26.96 ± 2.37 vs. 12.37 ± 2.96, t11 = 3.98, P = 0.003; EA, 29.65 ±
3.81 vs. 18.33 ± 2.07, t13 = 2.29, P = 0.039). In the identity and
temporal memory components, young and aged subjects housed in EC
spent, respectively, more time in the old than recent objects (EY,
3 0 . 3 3 ± 1.96 v s . 12.37 ± 2.96, t 1 1 = 3.84, P = 0.004; E A ,
26.00 ± 1.81 vs. 18.33 ± 2.07, t13 = 2.55, P = 0.024).
Water maze spatial memory tests
Photomicrographic documentation and processing
Digital photomicrographs were taken with a digital camera (Microfire,
Optronics, CA, USA) coupled to a Nikon microscope (Optiphot-2,
NY, USA). Digital photomicrographs were processed with Adobe
Photoshop 7.0.1 C.S.2 software (San Jose, CA, USA) for scaling and
adjusting the levels of brightness and contrast applied to the whole
image.
The selected micrographs display representative sections from each
experimental group in which the astrocyte number in each region of
interest was closest to the mean value for that region.
Microscopy and optical fractionator
Details of the optical fractionator methodology, experimental parameters and results for each subject are described in online supplementary material (Tables S1–S6).
In brief, we delineated at all levels in the histological sections the
region and layers of dentate gyrus, digitizing directly from sections
using low-power 3.2 objective on a Optiphot-2 microscope (Nikon,
Japan) equipped with a motorized stage (MAC200, Ludl Electronic
Products, Hawthorne, NY, USA). This system was coupled to a
computer running Stereoinvestigator software (MicroBrightField,
Williston, VT, USA) used to store and analyze x, y and z coordinates
of digitized points. In order to detect and count unambiguously the
objects of interest in the dissector probe, low-power objective was
replaced by a 60· oil immersion planapochromatic objective (NIKON,
NA 1.4) to count astrocytes.
Area and objects of interest.
The border between the polymorphic layer and the CA3 region was
arbitrarily defined in horizontal sections with a straight line that
connected the tip of the pyramidal cell layer of the CA3 with the two
tips of the granular cell layer. CA3 pyramidal and dentate gyrus
granular layers appeared as darker bands that were easily distinguished from the polymorphic layer. The straight line was used to
distinguish the astrocytes of the CA3 from the astrocytes of the
polymorphic l a y e r . All o t h e r layers of the dentate gyrus were
conspicuously distinguished from each other, and individual astrocytes were promptly identified on the sections immunoreacted for
GFAP.
The water maze tested the impact of the environment and aging on the
ability of an animal to learn and remember the position of a hidden
platform. Figure 2A illustrates the results for the water maze
performance in each experimental group, and the learning rate
(contrast index) was based on escape latencies. The IY, EY and EA
groups were able to learn and remember the position of the hidden
platform, but the IA group did not learn the position of the platform.
The tracking of the swimming trajectories at the 5th day in Fig. 2B
revealed that an enriched environment improved the ability to devise a
strategy for reaching the hidden platform in both young and aged
groups. Figure 2C represents individual absolute values (black circles)
and the average of daily distance (m) for each group (squares). Note
that, related to the 1st day, IY and EY reduced significantly the
traveled distance on the 3rd day (IY mean diff. = 2.28, P ≤ 0.01; EY
mean diff. = 1.27, P ≤ 0.05), whereas EA and IA only in the 5th
(mean diff. = 1.49, P ≤ 0.05) and 7th (mean diff. = 1.27, P ≤ 0.05)
days, respectively.
Two-way anova applied to the learning rate revealed that age
(F1,45 = 14.71, P = 0.0004) and environment (F1,45 = 4.61, P = 0.037)
affected the performances in the water maze, with no interaction
between those variables (F1,45 = 0.12, P = 0.73; Bonfer- roni post
hoc tests, P > 0.05).
Regions and object of interest: stereological assessment
The optical fractionator principles were applied to immunolabeled
sections to quantify the GFAP astrocytic marker; thus, we estimated
the total number of astrocytes in the molecular, granular and
polymorphic layers of the dentate gyrus.
Figure 3 i s a p h o to mi c ro gr ap h to illu strate objects of
i n t e r e s t (GFAP-labeled astrocytes) of molecular, granular and
polymorphic layer of dentate gyrus. Note the different morphologies of
astrocytes in the different layers.
Figure 4 shows low- and medium-magnification photomicrographs
of representative horizontal sections from the dentate gyrus and
hippocampus of all experimental groups. Pictures are inverted to
negative contrast to improve t h e v i s u a l i z a t i o n o f t h e
a s t r o c y t e distribution in the layers of interest. The dentate gyrus
granular layer and pyramidal cell layer of CA1 and CA3 (boxed
areas) appear as dark bands of low astrocytic density located
between the molecular and the polymorphic layers of the dentate
gyrus, and between the oriens and radiatum of CA1 and CA3
layers, respectively. All layers
The Authors (2010). Journal Compilation ª Federation of European Neuroscience Societies and Blackwell Publishing Ltd
European Journal of Neuroscience, 1–11
Environment, aging, astrocytes and memory 5
Fig. 2. Results from the water maze test. (A) The y-axes indicate the learning rate [C = (L1) L5) ⁄ (L1 + L5)] between the 1st and 5th test days for escape latency.
Note that IA did not reduce escape latency whereas all other groups presented significant learning. Overall, EY showed a higher learning rate than all other groups.
(B) Swimming trajectory tracks based on the average for each experimental group; the small circles in the upper left-hand quadrants represent the hidden platform.
(C) Absolute values (black circles) of daily distance (m) traveled of each subject; white squares represent the average of the experimental group. Significant
reductions of total traveled distance were observed on the 3rd, 5th and 7th days for young (EY, IY), EA and IA, respectively. * and # indicate significant differences
in comparison to all other groups (two-way anova, P < 0.05) (one-way anova, P < 0.05, Bonferroni a priori test). IA, impoverished environment, aged mice;
EA, enriched environment, aged mice; IY, impoverished environment, young mice; EY, enriched environment, young mice.
Fig. 3. Low- and high-magnification photomicrographs of a horizontal section from the hippocampal dentate gyrus immunolabeled for GFAP (astrocytic marker) to
indicate the object of interest (in black). The layers of interest are labeled in the figure as Gr, granular layer; Mol, molecular layer; Pol, polymorphic layer. The boxed
areas in the low-magnification panel (bottom) are shown at higher resolution in the insets (top). Note the different morphologies of astrocytes in the different layers.
Scale bar: 100 lm (low magnification); 50 lm (high magnification).
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6 D. G. Diniz et al.
Fig. 4. Low- and medium-magnification photomicrographs from hippocampus and dentate gyrus of representative horizontal sections of each experimental group
immunolabeled for GFAP. GFAP-labeled cells appear white in negative contrast. The objects of interest were the astrocytes of dentate gyrus layers indicated as Gr,
granular; Mol, molecular; Pol, polymorphic. In the boxed areas the dentate gyrus (DG), CA1 and CA3 are indicated. Note that the lacunosum molecular layers of
CA1 and CA3 near the hippocampal fissure show higher expression of GFAP in IA, EY and EA groups, whereas the polymorphic layers show higher expression of
GFAP in the IA group. LMol, lacunosum molecular layers; Or, oriens; Rad, radiatum. IA, impoverished environment, aged mice; EA, enriched environment, aged
mice; IY, impoverished environment, young mice; EY, enriched environment, young mice. Scale bars: 250 lm.
of the dentate gyrus, regions of interest to the stereology assessment,
were easily distinguished in all counted sections of all experimental
groups. Thus, we established the limits o f in t er e st between the
counted layers with no ambiguity. The medium-magnification pictures
illustrate typical astrocytes of different layers and give a small
sample of the morphological diversity among these cells in the
dentate gyrus of albino Swiss mice. Note that the lacunosum
molecular layer of CA1 and CA3 near the hippocampal fissure
(boxed areas) revealed the higher expression of GFAP in IA, EY and
EA groups, whereas the polymorphic layer present the higher
expression of GFAP in the IA group. Although to a lesser extent, EC
subjects, in comparison with IC, present higher expression of GFAP
in the stratum lucidum of CA3.
Supporting Tables S4–S6 in the online supplementary material
contain the estimations of the total numbers of astrocytes of the
molecular, granular and polymorphic layers of the dentate gyrus for
each experimental group. Direct comparative analysis of those values
indicated that the molecular layer was affected by both long-term
environmental and aging conditions. A higher number of astrocytes
was induced by an enriched environment compared with those
induced with aging. Indeed, the average differences induced by
environmental changes in groups EY vs. IY or EA vs. IA were 4819
and 6177 astrocytes, respectively. In contrast, the differences induced
by aging in groups EA vs. EY or IA vs. IY were 4507 and 3149
astrocytes, respectively. However, in the polymorphic layer, only
aging induced environmental changes (IA vs. IY), with an average of
37% more astrocytes in the aged group compared with the young
group. Finally, in the granular layer, neither environmental nor aging
induced significant differences among groups.
Figure 5 gives graphic representations of the total numbers of
astrocytes in the molecular and polymorphic layers of the dentate
gyrus; this facilitates a comparison of significant results. On average,
aged mice from the enriched environment exhibited higher numbers of
astrocytes in the molecular layer than young mice housed in a similar
environment. Aging and enriched environment seem to promote an
additive hyperplasia of astrocytes in this layer (Fig. 5A). Indeed, the
estimations of the astrocytes number in the molecular layer of the
dentate gyrus r e v e a l e d significant d i f f e r e n c e s i n d u c e d
by age (F1,16 = 9.24, P = 0.0071) and environmental (F1,16 = 12.04, P
= 0.0027) changes, but no interactions among these variables (F1,16 =
0.45, P = 0.51). In contrast, the polymorphic layer was only affected
by a g i n g with a higher number of astrocytes in a g e d compared with
young subjects ( one-way a n o v a , F 3 , 1 9 = 3.26, P ≤ 0.05; Fig.
5B).
When two-way anova was applied to the total number of
astrocytes of the dentate gyrus, it was found that enrichment affected
significantly the results (F1,16 = 6.22, P = 0.024), whereas aging
revealed only a tendency in the same direction (F1,16 = 4.24, P =
0.056). Although a significant increase in the total number of
dentate gyrus astrocytes was only affected by environment, two-tailed
t-test revealed significant differences (t8 = 2.54, P = 0.035) between the
estimations of IA and IY subjects.
In all cases, the variance introduced by methodological procedures
was less than 50% of the observed group variance, giving a ratio of
CE2 ⁄ CV2 < 0.5 (Slomianka & West, 2005). The biological variation
represented 77–99.6% of the total variation.
Figure 6 illustrates average behavioral performances in the episodic-like memory test and the number of astrocytes in the molecular
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Environment, aging, astrocytes and memory 7
Fig. 5. Graphic representation of the average values of the estimations of astrocyte number in (A) the molecular layer and (B) the polymorphic layer of the dentate
gyrus. Note the additive effects of enriched environment and aging on the number of astrocytes in the molecular layer, and the effect of aging, but not environment,
on the number of astrocytes in the polymorphic layer. * and # indicate significant differences in comparison to all other groups, two-way anova,
Bonferroni, P < 0.05. * in brackets indicates significant difference between IY and IA, two-way anova, Bonferroni P < 0.05. IA, impoverished environment, aged
mice; EA, enriched environment, aged mice; IY, impoverished environment, young mice; EY, enriched environment, young mice.
Layer of the dentate gyrus of the same subjects from different
experimental groups. We defined as 70% the minimal acceptable
difference in the time of exploration between the objects to indicate
that the object recognition had occurred. The dotted line in the figure
points to this level, indicating that on average IA subjects did not
reach the criteria. Note that the average values of discrimination index
reproduced in the selected subjects for counting, the same tendencies
observed in the water maze and episodic-like memory tests. However,
we did not find a simple correlation between the astrocytes numbers
and episodic-like memory performances.
Discussion
The results of the present study demonstrated that a 24 h ⁄ day complex
environmental enrichment had differential effects on the number of
astrocytes in the dentate gyrus and on the performances in episodiclike and water maze memory tests among young and aged female
albino Swiss mice. After 20 months, mice reared under IC exhibited
cognitive dysfunctions in both tests. After 6 months, mice reared
under IC also exhibited changes in the performances in episodic-like
memory and water maze tests. In contrast, continuous environmental
enrichment, beginning early in life (21st postnatal day), induced
astrocyte hyperplasia in the molecular layer, preserved episodic-like
memory and reduced the impact of aging on the Morris water maze
spatial memory. Taken together the results suggested that different
degrees of laminar astrocytosis were induced in the murine dentate
gyrus by environmental and aging conditions. It also suggests that an
enriched environment may protect against abnormal cognitive development and cognitive decline due to aging. Because aged subjects
raised in EC had improved memories compared with those raised in
IC, we speculate that the astrocytosis detected in these conditions may
arise from different astrocytic phenotypes.
Cognitive performances of adult C57Bl ⁄ 6 mice were previously
assessed with an integrative episodic-like memory test (Dere et al.,
2006). Ad ult, but not aged, albino Swiss mice were p r e v io u s l y
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8 D. G. Diniz et al.
Fig. 6. Graphic representation of the average values of episodic memory-like test (right y-axis) and number of astrocytes in the molecular layer of the dentate gyrus
(left y-axis) of five subjects of each experimental group. Points above 70% (dotted line) indicate the experimental group that completed the object recognition task.
Note that there is no simple correlation between the number of astrocytes and behavioral performances. IA, impoverished environment, aged mice; EA, enriched
environment, aged mice; IY, impoverished environment, young mice; EY, enriched environment, young mice.
investigated for spatial memory and learning (Koopmans et al., 2003;
Rao et al., 2005; Prediger et al., 2007), but not for episodic-like
memory. Thus, the present report is the first evidence in young adult
albino Swiss mice that integrative episodic-like memories and, to a
lesser extent, water maze learning and memory (Morris, 1984) are
especially susceptible to deterioration after living in an impoverished
environment for 6 months or more. In addition to the behavioral
studies, we analysed the effects of environment and aging on
astroglial plasticity in the hippocampal dentate gyrus with an optical
fractionator.
Acquisition and retrieval of spatial information are hippocampaldependent tasks that can be impaired by structural ⁄ functional changes
induced by aging (Riedel et al., 1999; D’Hooge & De Deyn, 2001).
Spatial memory decline has been associated with age-related changes
in the brain regions involved with spatial l e a r n i n g , e.g. the
hippocampal formation (Teather et al., 2002; Frick & Fernandez,
2003; Rosenzweig & Barnes, 2003). In the present report, the water
maze tests revealed that IA subjects did not exhibit an ability to learn
and remember the position of a hidden platform; in contrast, IY, EY
and EA individuals did exhibit these abilities, albeit to different
extents. We did not find any significant differences in swimming
speeds between young and aged mice in either the IC or the EC
groups; this suggested that cognitive decline, rather than physical
differences, was more likely to explain the differences in performance
in the water maze task. Another way to interpret these results could be
that the differences in the performances of the young group (EY and
IY) in comparison with the aged group (EA and IA) were due to the
fact that they started out with different distances traveled (Fig. 2B).
However, when a normalized relative scale expressed as an index of
learning rate (see Materials and methods) is applied to each animal
(Fig. 2A), it becomes evident that on average the learning rate is
higher in EY and IY in comparison with EA and IA. Indeed, EY and
IY presented significant differences in the escape latency at the 3rd
day, whereas EA and IA only at the 5th and 7th day, respectively. In
agreement, two-way anova confirmed that both environment and
aging affected MWM performances.
It has previously been confirmed that episodic-like memory in rats
and mice is a hippocampal-dependent task, as it is selectively
disrupted by fornix lesions, by lesions of the dorsal and ⁄ or ventral
hippocampus, by disruption of the CA3 network, or by hippocampal
infusion of N-methyl-d-aspartate (NMDA) and a-amino-3-hydroxy5-methyl-4-isoxazolepropionic acid (AMPA) receptor antagonists
(Daumas et al., 2004; Eacott & Norman, 2004; Ergorul & Eichenbaum, 2004; Bast et al., 2005; Li & Chao, 2008). We detected
episodic-like memory impairments in both young adult and aged
mice raised in IC; thus, we reasoned that the hippocampus could be
an important target for the pathophysiological changes associated
with IC in female albino Swiss mice. Each hippocampal region
contains a distinct population of neurons that express unique
molecular profiles (Zhao et al., 2001), and the dentate gyrus seems
to be particularly sensitive to age-related changes (Small et al., 2004).
Therefore, we speculate that spatial memory deficits in young adult
mice may have different pathophysiological mechanisms than those
in aged mice, and that both are additive to the influences of an
impoverished environment. Indeed, when young adult and aged mice
raised in IC were tested for spatial memory and learning with the
water maze paradigm, the young adults were able to learn and
remember the position of the hidden platform after five training days,
but the aged mice were unable to complete the test at this time point.
These results suggested that, after 6 months of IC, the hippocampal
requirements for spatial learning in young mice could be reactivated
with training. As expected, memory capabilities became worse when
advanced age was combined with an impoverished environment;
under these conditions, learning and memory at the Morris water
maze took 7 days to become significant, but all types of episodic-like
memories d e t e r i o r a t e d . In c o n t r a s t , a g e d mice t h a t g r e w
u p i n enriched environments exhibited relatively unimpaired
learning and memory in all memory tests. This suggested that the
consolidation and retrieval mechanisms for these memories were
spared under enriched environmental conditions.
Dentate gyrus astrocytes, impoverishment, aging and cognitive
decline
The pathophysiological bases for memory impairments have not yet
been completely elucidated, but the impact of enriched environment on
glial cells has been previously described (Altman & Das, 1964). In
this context the main novelty of the present work is the inclusion of
aged mice and the description of how regional gliogenesis changes
with aging.
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European Journal of Neuroscience, 1–11
Environment, aging, astrocytes and memory 9
In that light, it is interesting to discuss possible connections between
the q u a n t i t a t i v e astrocytic response and t h e cognitive
p rotection observed with environmental enrichment in the present
report. Our stereological analysis of hippocampal sections from IC
aged mice revealed hyperplasia of astrocytes compared with
equivalent sections from IC young adults. These differences were
associated with a striking cognitive decline in IC aged mice. In
contrast, EC aged mice exhibited a h i g h e r n u mb e r of a s t r o c y t e s
in the m o l e c u l a r layer compared with IC aged mice. Interestingly,
EA subjects exhibited the ability to form integrated memories in the
spatio-temporal context and learned to find and remember the position
of the hidden platform in the water maze test. Accordingly, the analysis
of the water maze test video revealed that there was a gradient between
the EY (who exhibited the best learning rate) and IA (who exhibited no
learning) mice. This was evidenced by the intermediate performances
of IY and EA individuals. However, the molecular layer of the
dentate gyrus was additively affected by both environment and
aging; thus, we speculate that astrocytosis induced by environmental
enrichment may have a different functional role than that induced by
aging. Indeed, it has been demonstrated more recently that astroglia
induces neurogenesis from adult neural stem cells (Song et al.,
2002), and that astrocytes regulate synapse formation (Mauch et al.,
2001; Ullian et al., 2001) and modulation (Haydon, 2001),
confirming an active rather than supportive role for astrocytes in
adult brains. In addition regional specificity to these cells with
distinct subtypes regulating different functions in different regions has
been described. For example, Song et al. (2002) found regional
differences in astrocytes in neurogenic (dentate gyrus) vs. nonneurogenic (spinal cord) areas. In this context we may interpret that it
is possible that different phenotypes of astrocytes in different layers
of dentate gyrus may increase selectively as a consequence of
enrichment and aging.
In line with this view, the presence of synaptic potentiation via
astrocytic glutamate exocytosis at the entorhinal-to-dentate granular
cells (perforant pathway) has been described in the dentate molecular
layer. By this mechanism astrocytes participate in synaptic tuning in
circuits involved in cognitive processing and the control of the mossy
fiber-to-CA3 synaptic input (Jourdain et al., 2007). This interpretation
would predict more conspicuous changes in the lacunosum molecular
layers of CA1 and CA3, target of dense bilateral projections from
entorhinal cortex through perforant pathways (van Groen et al., 2003).
Indeed, semi-quantitative analysis of astrocyte distribution in CA1 and
CA3 of enriched and aging experimental groups (boxed areas of
Fig. 5) revealed a much higher expression of GFAP in the stratum
lacunosum molecular layer of CA1 and CA3. These data are consistent
with the hypothesis that the lacunosum molecular astrocytes may have
an important role in synaptic plasticity, and that the experiencedependent GFAP increasing induced by enrichment may be contributing through enhancing this plasticity.
Conversely, even in the absence of neurological disease, a more
reactive phenotype of astrocyte is expressed during aging as part of an
increased a n d m a i n t a i n e d p r o -inflammatory profile t h a t m a y
b e associated with cognitive dysfunction; for review, see Godbout
& Johnson (2009). We suggested that IC aged subjects may
express higher n u m b e r s o f pro-inflammatory phenotypes t h a n
t h e a g e d subjects housed in EC. Morphological 3D reconstructions
of astro- cytes presently on course in our lab will try to investigate
possible morphometric distinctions between enrichment- and aginginduced astrocytes changes.
The notion that aging and impoverished environments may cause
similar cellular and molecular alterations in the hippocampus is
supported by another study that showed that two nutritional supplements, CDP-choline and uridine monophosphate, prevented spatial
memory impairments in both young IC and aged control Sprague–
Dawley rats (Teather & Wurtman, 2005, 2006). In the present report,
we detected differential effects of impoverished environments on the
memories of young adult and aged mice. Furthermore, different effects
were observed in different layers of the dentate gyrus; in the molecular
layer, aging and impoverished environment induced additive astrocytic hyperplasia; in the polymorphic layer, aging induced hyperplasia; and, in the granular layer, neither aging nor environment affected
the number of astrocytes. Thus, non-neuronal plasticity was differentially associated with experience in different parts of the laminar
circuitry.
However, because we did not find any simple correlation between
the estimations of astrocytes and behavioral performances, quantitative connections between those variables remain open for further
investigations. Indeed, the stereological data of the present report are
based on five subjects, making it difficult to correlate the behavioral
performances with astrocytic changes.
Although a significant increase in the total number of dentate gyrus
astrocytes was only observed in young mice raised in EC vs. IC,
statistical analysis revealed a tendency of a higher number of
astrocytes in IA in comparison to IY subjects (two-way anova, F =
4.24, DFn = 1, DFd = 16, P = 0.056). This fact is coherent and
reproduces p r e v i o u s reports t h a t demonstrated the presence o f
astrocytosis in the dentate gyrus in aged mice (Mouton et al., 2002;
Lei et al., 2003).
A future e x t e n s i o n o f t h i s s t u d y c o u l d b e t o
establish, in longitudinal studies, quantitative correlations between
pathophysio- logical changes in astrocytes of other regions of the
hippocampus and behavioral performance. This would allow better
resolution of the mechanisms of cognitive decline and brain
plasticity related to aging.
Non-stereological technical limitations
Estimations of the number of astrocytes in the dentate gyrus of rats
and mice have varied among studies (Nishimura et al., 1995;
Pilegaard & Ladefoged, 1996; Long et al., 1998a; Mouton et al.,
2002; Grady et al., 2003; Lei et al., 2003). These contradictions may
result f r o m d i f f e r e n c e s i n e s t i m a t i o n methods, different
animal lineages, variations in histological procedures, different
stereological protocols, and ambiguities in the definition of the objects
and areas of interest. To reduce these possible sources of error
when comparing animal groups in the present report, all samples were
obtained with the same tissue-processing protocols (perfusion,
immunoreaction, dehy- dration, counterstaining and clearing), and all
data were collected and analysed with the same stereological method,
software and hardware. To detect possible variations in the criteria for
identifying the objects of interest, we underwent checking procedures
of the results by having different investigators count the same regions
using the same monoclonal GFAP antibody as a selective marker for
astrocytes.
As a result, possible variations associated with non-biological
sources were reduced to acceptable levels in the present report
(Mouton et al., 2002; Slomianka & West, 2005).
Hormones and astrocytes
Apart from aging and environment, sexual hormones may change the
number of glial cells in the dentate gyrus. In fact, aged C57Bl6J female
mice presented 35% more astrocytes than age-matched males (Mouton
et al., 2002). In the present report, aged females may have been depleted
of estrogenic protection; thus, we reasoned that at least part of the
astrocytosis might be related to estropause. In support of this reasoning,
The Authors (2010). Journal Compilation ª Federation of European Neuroscience Societies and Blackwell Publishing Ltd
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10 D. G. Diniz et al.
ovariectomized female mice given an estrogenic replacement showed a
reduced number of astrocytes in the dentate gyrus compared with an
ovariectomized placebo group (Lei et al., 2003).
Finally, astrocytic plasticity may be affected by corticosteroids,
which inhibit astrocytic activation (Liu et al., 2008). In the present
report, it could be argued that manipulation-induced stress during the
behavioral tests might have altered the plasma corticosteroid levels,
and this affected astrocytic plasticity. We did not measure plasma
corticosteroid levels; therefore, we cannot exclude the possibility that
different levels of corticosteroids might explain the results. However,
behavioral tests were applied to all subjects of all experimental groups;
thus, we can exclude the possibility that manipulation-induced stress
might explain the results.
Please note: As a service to our authors and readers, this journal
provides s u p p o r t i n g i n f o r m a t i o n s u p p l i e d b y t h e
authors. Such materials are peer-reviewed and may be re-organized
for online delivery, but are not copy-edited or typeset by WileyBlackwell. Technical support issues arising from supporting
information (other than missing files) should be addressed to the
authors.
Conclusion
Abbreviations
The results of the present study demonstrate for the first time within a
single report that the effects of environmental enrichment on episodiclike memory are not dependent on age in female albino Swiss mice.
Indeed, in the integrative tests, the performances of both young adult
and aged mice were improved by enriched environments. Moreover,
the water maze test revealed that early onset and long-term environmental enrichment may protect spatial learning and memory from
declines i n d u c e d b y a g i n g o r environmental impoverishment. A
quantitative analysis of the laminar distribution of the astrocytes in
the d e n t a t e gyrus revealed that the molecular layer developed
astrocytosis in response to both environmental enrichment and aging,
but the polymorphic layer was altered only by aging. Because aging
and enriched environment induced astrocytosis in the molecular layer
of the dentate gyrus, it is a temptation to speculate that those two
conditions may induce the proliferation of different astrocyte phenotypes. Finally, our work is consistent with previous reports that showed
impoverished or enriched environments could prevent (Spangler et al.,
1994; Winocur, 1998; van der Staay, 2002) or preserve (Petrosini et al.,
2009), respectively, normal cognitive development. Taken together, our
findings showed that early onset and extended environmental enrichment, with enhanced sensorimotor, cognitive and social stimulations,
induced experience-dependent astrocytic plasticity in the molecular
layer of the dentate gyrus. This glial plasticity may represent at least
part of the circuitry groundwork for improvements in behavioral
performance and maintenance of performance in the aged brain.
Acknowledgements
This project was sponsored by Brazilian Government research funds. Grant
sponsor: Brazilian Research Council – CNPq; Grant number: 307749 ⁄ 2004-5
and 471077 ⁄ 2007-0 for C.W.P.D. and FINEP, Instituto Brasileiro de Neurociências – IBNnet.
EC, enriched conditions; GFAP, glial fibrillary acidic protein; IC, impoverished
conditions.
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