I
UNIVERSIDADE FEDERAL DA BAHIA
FACULDADE DE MEDICINA DA BAHIA
Fundada em 18 de fevereiro de 1808
Monografia
Avaliação da capacidade do immucillin-H em modular
a resposta imune in vitro em indivíduos com
leishmaniose cutânea
Rafael de Castro da Silva
Salvador (Bahia)
2014
II
UFBA/SIBI/Bibliotheca Gonçalo Moniz: Memória da Saúde Brasileira
Da Silva, Rafael de Castro
S586 Avaliação da capacidade do immucillin-H em modular a resposta imune
in vitro em indivíduos com leishmaniose cutânea / Rafael de Castro da Silva.
Salvador: RC, da Silva, 2014.
viii; 31 fls. : il.
Professor orientador: Edgar Marcelino de Carvalho Filho.
Anexos.
Monografia como exigência parcial e obrigatória para Conclusão do Curso
de Medicina da Faculdade de Medicina da Bahia (FMB) da Universidade
Federal da Bahia (UFBA).
1 . Leishmaniose. 2. Células T. 3. Immucillin-H. I. Carvalho Filho, Edgar
Marcelino de. II. Universidade Federal da Bahia. Faculdade de Medicina da Bahia.
III. Título.
CDU: 616.928.5
III
UNIVERSIDADE FEDERAL DA BAHIA
FACULDADE DE MEDICINA DA BAHIA
Fundada em 18 de fevereiro de 1808
Monografia
Avaliação da capacidade do immucillin-H em modular
a resposta imune in vitro em indivíduos com
leishmaniose cutânea
Rafael de Castro da Silva
Professor Orientador: Edgar Marcelino de Carvalho Filho
Monografia de Conclusão do Componente
Curricular MED-B60/2014.2, como pré-requisito
obrigatório e parcial para conclusão do curso
médico da Faculdade de Medicina da Bahia da
Universidade Federal da Bahia, apresentada ao
Colegiado do Curso de Graduação em Medicina
Salvador (Bahia)
2014
IV
Monografia: Avaliação da capacidade do immucillin-H em modular a
resposta imune in vitro em indivíduos com leishmaniose cutânea, de Rafael
de Castro da Silva
Professor Orientador: Edgar Marcelino de Carvalho
Filho
COMISSÃO REVISORA:
 Edgar Marcelino de Carvalho Filho (Professor Orientador), professor do
Departamento de Medicina Interna e Apoio Diagnóstico da Faculdade de
Medicina da Bahia da Universidade Federal da Bahia.

Régis de Albuquerque Campos, professor do Departamento de Medicina
Interna e Apoio Diagnóstico da Faculdade de Medicina da Bahia da
Universidade Federal da Bahia.

Marcus Miranda Lessa, professor do Departamento de Cirurgia
Experimental e Especialidades Cirúrgicas da Faculdade de Medicina da Bahia
da Universidade Federal da Bahia.

Nicolaus Albert Borges Schriefer, professor do Departamento de
Biointeração do Instituto de Ciências da Saúde da Universidade Federal da
Bahia.

Lílian Silva Medina, doutoranda do Programa de Pós-Graduação em Ciências
da Saúde (PPgCS) da Faculdade de Medicina da Bahia da Universidade
Federal da Bahia.
TERMO DE REGISTRO ACADÊMICO: Monografia
avaliada pela Comissão Revisora, e julgada apta à apresentação
pública no VIII Seminário Estudantil de Pesquisa da Faculdade
de Medicina da Bahia/UFBA, com posterior homologação do
conceito final pela coordenação do Núcleo de Formação
Científica e de MED-B60 (Monografia IV). Salvador (Bahia), em
___ de _____________ de 2014.
V
“If I have seen further than others, it is by standing on
the shoulders of giants” (Vivien Thomas)
VI
Aos meus pais, Geraldo Gomes da
Silva e Vera Lúcia de Castro da Silva
VII
EQUIPE
1.
Edgar Marcelino de Carvalho Filho, Faculdade de Medicina da Bahia/UFBA.
[email protected];
2.
Natália Barbosa Carvalho, Complexo Hospitalar Universitário Professor
Edgard Santos/UFBA. [email protected]; e
3.
Nathália Araújo Lisbôa, acadêmica de medicina, Faculdade de Medicina da
Bahia/UFBA. [email protected].
INSTITUIÇÕES PARTICIPANTES
UNIVERSIDADE FEDERAL DA BAHIA
1.
Faculdade de Medicina da Bahia (FMB)
2.
Complexo Hospitalar Universitário Professor Edgard
Santos (COM-HUPES)
POSTO DE SÁUDE DE CORTE DE PEDRA
FONTES DE FINANCIAMENTO
1. National Institute of Health
2. Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq);
3. Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado da Bahia (FAPESB);
4. Programa Institucional de Bolsas de Iniciação Científica (PIBIC); e
5. Recursos próprios.
VIII
AGRADECIMENTOS

Ao meu Professor orientador, Doutor Edgar Marcelino de Carvalho Filho,
pela orientação, conselhos, disponibilidade e estímulos essenciais para o
êxito deste trabalho e para o seguimento da minha vida profissional de
futuro médico.

À pós-doutoranda Natália Barbosa Carvalho, pela paciência em me
instruir nos primeiros passos do manejo das técnicas laboratoriais usadas
na execução deste trabalho, e pela constante assistência às dúvidas que
por ventura surgiam.

Aos Doutores Regis de Albuquerque Campos, Marcus Miranda Lessa,
Nicolaus Albert Borges Schriefer, e à Doutoranda Lilian Silva Medina,
membros da Comissão Revisora desta Monografia, sem os quais muito
deixaria ter aprendido. Meus especiais agradecimentos pela constante
disponibilidade.

À minha colega, Nathália Araújo Lisbôa, pelo apoio constante e
contribuição extensiva nas etapas de revisão bibliográfica e execução
de experimentos.
1
SUMÁRIO
ÍNDICE DE FIGURAS E TABELAS
02
I. RESUMO
03
II. OBJETIVOS
04
III. FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA
05
IV. METODOLOGIA
IV.1. Desenho de estudo
09
IV.2. Local
09
IV.3. Participantes
09
IV.4. Definição de caso
09
IV.5. Metodologia
IV.5.1. Separação e cultura de células mononucleares
09
IV.5.2. Determinação de citocinas
10
IV.6. Análise estatística
10
IV.7. Aspectos éticos
10
V. RESULTADOS
11
VI. DISCUSSÃO
16
VII. CONCLUSÕES
19
VIII. SUMMARY
20
IX. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
21
X. ANEXOS

ANEXO I: Termo de Consentimento Livre e Esclarecido
26

ANEXO II: Parecer Consubstanciado do CEP
29
2
ÍNDICE DE FIGURAS E TABELAS
FIGURAS
FIGURA 1. Teste de padronização da dose do immucillin-H.
12
IFN-γ em pg/mL.
FIGURA 2. Dosagem de IFN-γ, em pg/mL, antes e após a adição
13
de immucillin-H às culturas de CMSPs estimuladas com 1 µg/mL
de SLA.
TABELAS
TABELA 1. Dosagem de IFN-γ, em pg/mL, nos 8 pacientes com
12
leishmaniose cutânea estimulados com SLA 1µg/mL.
TABELA 2. Dosagem de IFN-γ, em pg/mL, nos 5 pacientes com
13
leishmaniose cutânea estimulados com SLA 5µg/mL.
TABELA 3. Dosagem de TNF-α, em pg/mL, nos 8 pacientes com
14
leishmaniose cutânea estimulados com SLA 1µg/mL.
TABELA 4. Dosagem de TNF-α, em pg/mL, nos 5 pacientes com
14
leishmaniose cutânea estimulados com SLA 5µg/mL.
TABELA 5. Dosagem de IL-10, em pg/mL, nos 8 pacientes com
15
leishmaniose cutânea estimulados com SLA 1µg/mL.
TABELA 6. Dosagem de IL-10, em pg/mL, nos 5 pacientes com
leishmaniose cutânea estimulados com SLA 5µg/mL.
15
3
I. RESUMO:
FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA/JUSTIFICATIVA: A leishmaniose cutânea
(LC), causada pela Leishmania braziliensis, tem grande prevalência na população
brasileira. A doença se caracteriza pela presença de úlcera(s) bem delimitadas, com
bordas elevadas. Do ponto de vista imunológico, existe uma ativação exagerada de
células T contra antígenos do parasita, com produção de citocinas pró-inflamatórias,
como IFN-γ e TNF-α. Esta resposta inflamatória não apropriadamente modulada se
relaciona com o desenvolvimento da lesão tecidual. O immucillin-H é um inibidor da
enzima purina nucleosídeo fosforilase (PNP) e reduz a ativação de células T e, neste
contexto, poderá modular a resposta imune na leishmaniose tegumentar.
OBJETIVO: Determinar a capacidade do immucillin-H de modular a exagerada
resposta imune na LC. MÉTODOS: O estudo foi realizado no Serviço de Imunologia
(SIM) do Complexo Hospitalar Universitário Professor Edgard Santos. Participaram
do estudo oito pacientes diagnosticados através de uma reação de PCR positiva ou
isolamento do parasito em cultura de material da lesão. Estes pacientes foram
provenientes da área endêmica de Corte de Pedra, Município de Tancredo Neves,
Bahia, local onde pesquisadores do SIM realizam atividades assistenciais e de
pesquisa. Células mononucleares do sangue periférico foram estimuladas in vitro com
phitohemaglutinina (PHA), antígeno solúvel de Leishmania (SLA) isoladamente ou
associado ao immucillin-H. A produção de citocinas (IFN-γ, TNF-α e IL-10) foi
avaliada pela técnica de ELISA em sobrenadante de cultura de células. A análise
estatística foi feita através de técnicas não paramétricas, utilizando o teste de MannWhitney e teste pareado de Wilcoxon. RESULTADOS: O immucillin-H foi capaz
de inibir de maneira relevante a produção de IFN-γ de amostras estimuladas com
SLA. A inibição da produção de TNF-α e IL-10 não foi significativa. CONCLUSÃO:
O immucillin-H foi capaz de reduzir a ativação de células T em indivíduos com
leishmaniose cutânea.
Palavras chaves: 1. Leishmaniose. 2. Células T. 3. Immucillin-H
4
II. OBJETIVOS
PRINCIPAL
Determinar a capacidade do immucillin-H de modular negativamente a resposta
imune mediada por células em pacientes com leishmaniose cutânea.
SECUNDÁRIOS
1.
Avaliar a capacidade do immucillin-H em modular a resposta imune.
2.
Avaliar a capacidade do immucillin-H em diminuir a produção de citocinas próinflamatórias em pacientes com leishmaniose cutânea.
5
III. FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA
A leishmaniose cutânea é uma morbidade com ampla prevalência na população
mundial. Sua incidência mundial alcança de 0.7 a 1.2 milhões de novos infectados a cada
ano, com regiões endêmicas na América, Ásia Ocidental e bacia Mediterrânea, sendo o
Brasil um dos países com a maior prevalência de casos (Alvar et al., 2012).
A infecção mediada pela Leishmania braziliensis induz uma ativação exagerada
de macrófagos e de células T específicas contra antígenos do parasita que se associa com
o desenvolvimento da úlcera cutânea (Bittencourt AL, Barral A, 1991; Da-Cruz et al.,
2002; Antonelli et al., 2005; Holzmuller et al., 2006; Bittar et al., 2007; Giudice et al.,
2012). Embora a resposta mediada por células tenha papel importante na defesa contra
protozoários, estudos têm mostrado que a depleção de células T CD4+ pode atenuar a
patogênese de lesões nas infecções por Leishmania (Soong et al., 1997; Xin et al., 2007).
Desse modo, infere-se que a busca de novos agentes imunomoduladores poderia trazer,
além de maior esclarecimento a respeito da modulação da resposta imune nesta doença oportunidades terapêuticas para os portadores dessa morbidade, possibilitando o alcance
de melhores prognósticos.
A leishmaniose tegumentar Americana (LTA) é uma infecção parasitária em
expansão, que ocorre desde o sul dos Estados Unidos até o norte da Argentina
(Montenegro J, 1926; Grimaldi
et al., 1989). No Brasil, são seis as espécies de
protozoários do gênero Leishmania associadas à doença no homem (Marzochi MC, 1992;
Gramiccia M, Gradoni L, 2005). A LTA apresenta diversas formas clínicas dependendo
de variados fatores (Rogers et al., 2002) e a sua manifestação mais comum é a forma
cutânea,
causada
principalmente
pela
L.
braziliensis
e
caracterizada
pelo
desenvolvimento de única ou múltiplas lesões dérmicas ulceradas, bem delimitadas e com
bordas elevadas (Furtado T, 1994). Além da leishmaniose cutânea e da leishmaniose
mucosa que atinge principalmente a mucosa nasal, a L. braziliensis causa a leishmaniose
cutânea disseminada, caracterizada por múltiplas lesões papulares, acneiformes e
ulceradas, existindo também formas atípicas da doença (Guimarães et al., 2009; Queiroz
et al., 2012).
A Leishmania é um parasita intracelular obrigatório das células do sistema
fagocítico mononuclear. O parasita possui um ciclo vital digenético, com um estado de
6
desenvolvimento extracelular no tubo digestivo do vetor, insetos flebotomíneos fêmeas,
e um estágio de desenvolvimento em humanos, intracelular. No vetor, o protozoário se
localiza no tubo digestivo em uma conformação flagelada e alongada, denominada
promastigota. No intestino do flebotomíneo, o protozoário sofre um processo de
metaciclogênese, transformando-se na forma infectante de promastigota metacíclica. A
forma infectante é transmitida ao hospedeiro vertebrado através do repasto sanguíneo do
flebótomo. Uma vez dentro do hospedeiro vertebrado, a Leishmania adere e penetra no
macrófago, onde se transforma numa forma aflagelada, denominada amastigota (Da Silva
R, Sacks DL, 1987; Robert MTM, 2006; Brasil, 2010; Mougneau et al., 2011).
A resposta imunológica do hospedeiro à infecção por Leishmania é caracterizada
pela expansão de linfócitos T CD4+ com um perfil de citocinas TH1 e TH2 (Da-Cruz et
al., 2002; Holzmuller et al., 2006; Roberts MTM, 2006; Bittar et al., 2007). A resposta
do tipo TH1 a princípio representa um bom prognóstico para leishmaniose cutânea, uma
vez que citocinas como o IL-2, IL-12, IFN- e TNF- serão produzidas, ativando os
macrófagos e, por consequência, levarão à destruição dos parasitos. Já a resposta do tipo
TH2 culminaria na progressão da doença, uma vez que as células T produzirão IL-4 e IL10, que inibem a ativação dos macrófagos, a resposta TH1, e conseqüente destruição
parasitária (Lohoff et al., 1998; Liew et al., 1999). Em estudo conduzido com
camundongos C3H/He, constatou-se que é necessária uma ativação da resposta TH1
simultânea à uma reduzida ativação do perfil TH2 para gerar proteção contra a
leishmaniose cutânea (Sjölander et al., 1998). Em 2007, Darrah et al. publicaram um
estudo onde correlacionavam a proteção vacinal contra Leishmania major a um
estabelecimento predominante de perfil TH1 em camundongos C57BL/6. O paradigma
TH1/TH2, no entanto, não é totalmente claro em alguns casos quando aplicado ao ser
humano. Por exemplo, nas infecções causadas pela L. braziliensis tanto a evolução da
infecção para a doença como a gravidade da leishmaniose, avaliada pelo tamanho das
úlceras ou pela forma clínica da doença, associam-se com maior ativação de células T
CD4+ e produção exacerbada de citocinas pró-inflamatórias como o IFN- e TNF-
(Sypek et al., 1993; Da-Cruz et al., 1994; Lohoff et al., 1998; Da-Cruz et al., 2002;
Antonelli et al., 2005; Carvalho et al., 2007; Schnorr et al., 2012). Enquanto que em um
outro estudo realizado com pacientes indianos, o perfil TH2, com produção aumentada de
IL-4 e IL-10, foi correlacionado à falha terapêutica e sintomatologia na doença (Sundar
et al., 1997).
7
Mais recentemente tem sido documentado que além das células T, macrófagos,
através da produção de citocinas pró-inflamatórias de TNF-, também contribuem para
a patologia na LTA (Giudice et al., 2012). Células T CD8+ também desempenham um
papel importante no processo de controle da leishmaniose, seja através da produção de
IFN- e ativação de macrófagos ou por um efeito citolítico das células T citotóxicas em
macrófagos parasitados (Da-Cruz et al., 1994; Da-Cruz et al., 2002; Uzonna et al., 2004).
Todavia, na infecção pela L. braziliensis, células T CD8+ tem também sido envolvidas
na patogênese da leishmaniose cutânea tendo sido demonstrado uma associação de
células T CD8+ expressando granzimas com o desenvolvimento da úlcera leishmaniótica
e documentada a destruição de células do hospedeiro infectados por Leishmania (Faria et
al., 2009). Dando apoio ao papel da célula CD8+ na patologia da LTA foi observado que
a citotoxicidade mediada por células T contra macrófagos infectados por L. braziliensis
era maior na leishmaniose mucosa, forma mais grave da doença, do que na leishmaniose
cutânea (Santos et al., 2013).
As drogas de primeira escolha para o tratamento da forma cutânea da LTA, há
mais de 50 anos, são os antimoniais pentavalentes, apesar de outras drogas de segunda
escolha serem usadas com sucesso variável (Sypek et al., 1993; Carvalho et al., 2007;
Brasil, 2010; Oliveira et al., 2011). No Brasil, estudos têm demonstrado ineficácia
terapêutica em até 70% dos pacientes (Mayrink et al., 2006; Okwor et al., 2012), além de
sérios efeitos tóxicos e colaterais (Da-Cruz et al., 2002; Mayrink et al., 2006; Carvalho et
al., 2007; Reis LC, 2007; Oliveira et al., 2011; Esfandiarpour et al., 2012; Okwor et al.,
2012).
Como a resposta imune participa da patogênese da leishmaniose cutânea e da
leishmaniose mucosa causada pela L. braziliensis, e devido ao importante papel do TNF na gênese da úlcera leishmaniótica, estudos têm avaliado a eficácia da associação da
pentoxifilina, droga inibidora do TNF-, associado ao antimonial no tratamento da LTA.
Estes dados têm mostrado que a associação do antimonial com a pentoxifilina é mais
eficaz do que o uso do antimonial isoladamente, acelera a cicatrização da lesão e é eficaz
no tratamento de pacientes com leishmaniose cutânea e mucosa refretários ao antimonial
(Sadeghian G, Nilforoushzadeh MA, 2006; Lessa et al., 2011). Estes dados demonstram
que a associação de uma droga leishmanicida com um agente imunomodulador pode
contribuir para um maior sucesso no tratamento da LTA.
8
Atualmente a busca de novas drogas imunomoduladoras se faz necessária para
que o tratamento da LTA seja aprimorado. Neste cenário, inibidores de PNP podem
representar uma nova classe de agentes imunossupressores a ser utilizada em pacientes
portadores de patologias que acometem a proliferação de linfócitos T, como na psoríase
(Morris PE, Omura GA, 2000), na leucemia linfocítica crônica (Korycha et al., 2007) e
na leishmaniose cutânea. A atividade das células T está fortemente ligada à atividade do
PNP, de tal forma que esta enzima se mostra essencial para a manutenção da função
linfocitária, bem como atua como elemento primordial para o sucesso replicativo
(Bzowksa et al., 2000). É conhecido que indivíduos que apresentam deficiência genética
desta enzima tem uma depleção de linfócitos T (Giblett et al., 1975).
A PNP atua na catálise fosforilativa reversível de nucleosídeos de purina, levando
à produção de suas respectivas bases e de uma pentose fosfatada (Giblett et al., 1975).
Dessa forma, esta reação se torna uma via importante de reciclagem de purinas,
possibilitando – por exemplo - a síntese de compostos essenciais a processos
proliferativos, além de evitar o gasto energético dispendioso de uma síntese de novo de
purina (Bantia S, Kilpatrick JM, 2004). De fato, é notório que as células que exibem altos
níveis de atividade de PNP são particularmente dependentes desta enzima para
sobreviverem (Bantia et al., 2001). Fato que se confirma com a deficiência desta enzima
em crianças, o que acarreta deficiência de linfócitos T em seus organismos (Giblett et al.,
1975).
O immucillin-H (BCX-1777) tem se revelado como o inibidor mais potente, até
então conhecido, da enzima PNP, tendo eficácia de 10 a 100 vezes maior que qualquer
outro inibidor de PNP (Bantia et al., 2001). Seu efeito modulador é secundário a uma
sequência de alterações que culminam com a inibição da síntese de DNA e, portanto,
proliferação celular (Galmarini CM, 2006). Em estudo publicado em 2012 por Deves et
al., o immucillin-H foi capaz de deter a perda óssea mediada por células T CD4+ em
doença periodontal induzida em ratos Wistar, sem efeito direto sobre os osteoclastos. Em
outro estudo, de fase I, publicado em 2012 por Ogura et al., o immucillin-H exibiu
controle total ou parcial de doenças malignas de células T periféricas recidivantes ou
refratárias a outras terapias, demonstrando boa tolerância e segurança. Portanto, o estudo
desta droga pode trazer resultados positivos e desejáveis para o maior esclarecimento da
modulação de patologias linfoproliferativas e inflamatórias, bem como do seu papel em
atenuar a resposta imune de pacientes com LTA.
9
IV. METODOLOGIA
IV.1 Desenho do Estudo:
Estudo de corte transversal com o objetivo de avaliar a modulação exercida pelo
Immucillin-H na resposta imune in vitro em células mononucleares de pacientes com
leishmaniose cutânea em Salvador, Bahia.
IV.2 Local:
O estudo foi realizado no Serviço de Imunologia (SIM) do Hospital Universitário
Professor Edgard Santos, 5º andar.
IV.3 Participantes:
Participaram
deste
estudo
oito
pacientes
com
leishmaniose
cutânea
acompanhados no Posto de Saúde de Corte de Pedra, município de Tancredo Neves,
Bahia.
O Posto de Saúde de Corte de Pedra foi criado em 1986 e desde então
pesquisadores do SIM desenvolvem atividades assistenciais e de pesquisa nessa
importante área endêmica de transmissão de L. braziliensis. Cerca de 2000 novos casos
de LTA são vistos anualmente neste posto de saúde gerido pelo SIM da Faculdade de
Medicina da Universidade Federal da Bahia.
IV.4 Definição de caso:
Pacientes com leishmaniose cutânea: Indivíduos de ambos os sexos com lesão
típica de leishmaniose cutânea com duração da doença entre 15 e 90 dias e com
diagnóstico confirmado pelo isolamento do parasita ou PCR.
IV.5 Metodologia:
Avaliação do efeito do immucillin-H na resposta imune de células mononucleares
de pacientes com leishmaniose cutânea.
IV.5.1 Separação e cultura de células mononucleares.
Sangue total heparinizado (30 mL) foi colhido para obtenção das células
mononucleares. As células mononucleares do sangue periférico (CMSP) foram isoladas
através de um gradiente de densidade utilizando o meio de separação de linfócitos (FicollHypaque). Após centrifugação a 400 g, as células da interface foram lavadas com salina
10
estéril e ajustadas para a concentração desejada na dependência do ensaio utilizado.
CMSP foram cultivadas em placas de 24 poços e mantidas em meio RPMI 1640
suplementado com 5% de soro fetal bovino e com adição de penicilina/estreptomicina.
As células foram mantidas sem estímulo ou estimuladas com fitohemaglutinina
(Phytohemagglutnin – PHA) e antígeno solúvel de leishmania (soluble Leishmania
antigens – SLA). Posteriormente, estas culturas foram incubadas a 37ºC em 5% de CO2
por 72 horas. Os sobrenadantes foram coletados e estocados a -20ºC até a dosagem de
citocinas e avaliação por meio de curva dose-resposta.
IV.5.2 Determinação de citocinas.
A concentração das citocinas IFN-γ, TNF- e IL-10 foram determinadas no
sobrenadante de culturas de CMSP por meio do método de ELISA sandwich. Foram
utilizados reagentes comercialmente disponíveis (Pharmigen, San Diego, CA, USA).
IV.6 Análise Estatística
Considerando que os resultados não obedecem uma curva normal, a análise
estatística foi feita por testes não paramétricos. A comparação das medianas foi realizada
pelo teste de Mann-Whitman. A avaliação das respostas no mesmo paciente antes e após
a adição de immucillin-H foi feita pelo teste pareado de Wilcoxon. Foi considerado
estatisticamente significante quando p<0,05.
IV.7 Aspectos éticos
Os participantes deste projeto assinaram termo de consentimento livre e
esclarecido (anexo I) e o projeto foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da
Faculdade de Medicina da Bahia – FMB - sob parecer consubstanciado número 564.409
(anexo II).
11
V. RESULTADOS
Foram recrutados oito indivíduos portados de leishmaniose cutânea da área
endêmica de Corte de Pedra, Bahia. A média de idade dos pacientes foi de 33,7 ± 8,4
anos, com duração média de doença de 30,1 ± 24,7 dias, do momento do diagnóstico à
data de coleta de sangue. Todos os pacientes possuem lesão única, que variaram de 6 x
4mm a 35 x 20mm, abrangendo áreas como coxa, perna e pé. O teste cutâneo intradérmico
mostrou reação que variou de 7 x 7mm a 28 x 26 mm.
A padronização da dose foi estabelecida a partir da curva dose-resposta
apresentada pela CMSPs de controles sadios estimulados por PHA. O Immucillin-H foi
adicionado a estas culturas nas concentrações de 150 nM, 300 nM e 600 nM. A figura 1
mostra que a droga teve maior inibição quando na concentração de 300 nM (p=0,0488),
não exibindo diferença significativa com o aumento da dose para 600 nM (p=0,9375).
Figura 1. Teste de padronização da dose do
Immucillin-H. IFN-γ em pg/mL.
Com base nos resultados
exibidos
nos
testes
de
padronização da dose in vitro,
ficou estabelecida a utilização
das concentrações de 300 nM de
Immucillin-H. As CMSPs foram
estimuladas com doses de 1
µg/mL e 5 µg/mL de SLA e a
produção de IFN-γ, TNF-α e IL10 no sobrenadante de cultura
das células de oito pacientes foi
determinada
por
meio
do
método de ELISA sandwich.
* p<0,05
** p>0,05
A dosagem do IFN-γ é
exibida na tabela 1 e 2, nas quais
são apontadas as concentrações da citocina nas amostras estimuladas pelo antígeno de
Leishmania, com e sem a adição da droga.
Tabela 1. Dosagem de IFN-γ, em pg/mL, em culturas de 8 pacientes com leishmaniose
cutânea estimulados com SLA 1µg/mL
12
PACIENTES
L1
SLA 1μg/mL
SLA 1μg/mL +
Imm 300 nM
1428
582
% inibição
Valor de p
59,2
-
L2
1698
657
61,3
-
L3
1261
1077
14,6
-
L4
301
174
42,2
-
L5
780
508
34,9
-
L6
668
141
78,9
-
L7
625
520
16,8
-
L8
987
942
4,6
-
MÉDIA
1592
376
39 ± 24,5
0,007
Tabela 2. Dosagem de IFN-γ, em pg/mL, em culturas de 5 pacientes com leishmaniose
cutânea estimulados com SLA 5µg/mL
PACIENTE
SLA 5μg/mL
SLA 5μg/mL +
Imm 300 nM
% inibição
Valor de p
L4
1104
0
100
-
L5
1524
286
81,2
-
L6
997
164
83,6
-
L7
1605
54
96,6
-
L8
1138
1003
11,9
-
MÉDIA
1273
301
74,6 ± 36
0,06
Nota-se que com a adição do imunomodulador, há uma redução da produção do
IFN-γ, que se mostra estatisticamente significante nas culturas estimuladas com 1 µg/mL
de SLA (figura 2). Todas estas amostras apresentaram redução na concentração desta
citocina após a adição da droga (p=0,0078). Apesar de a concentração de IFN-γ nas
amostras estimuladas com SLA a 5 µg/mL não ter exibido significância estatística ao
teste utilizado, é possível verificar que as culturas de CMSPs tiveram um percentual de
inibição altamente relevante, expondo percentuais acima de 80% em quatro das cinco
amostras analisadas, e com média de inibição de 74,6%.
13
Na
tabela
são
Figura 2. Dosagem de IFN-γ, em pg/mL, antes
demonstradas as concentrações de
e após a adição de Immucillin-H às culturas de
que
TNF-α
3
foram
e
4
obtidas
nos
CMSPs estimuladas com 1 µg/mL de SLA.
experimentos. Embora possam ser
constatadas
algumas
diminuições
pontuais absolutas expressivas na
produção de TNF-α, como após a
adição da droga à cultura do
indivíduo #L7 estimulada com SLA à
5µg/mL
(tabela
2),
reduções
pequenas e até mesmo aumentos da
concentração foram verificados em
diversas
outras
amostras.
Desta
forma, infere-se que não houve - de
maneira
geral
-
uma
redução
significativa da concentração desta
citocina quando se utilizou o immucillin-H. Este fato pode ser atestado tanto na
concentração de 1 µg/mL (p=0,8438), como na dose de 5 µg/mL (p=0,3125). O
percentual inibitório reitera os achados do teste estatístico.
Tabela 3. Dosagem de TNF-α, em pg/mL, em culturas de 8 pacientes com leishmaniose
cutânea estimulados com SLA 1µg/mL
PACIENTES
SLA 1μg/mL
SLA 1μg/mL +
Imm 300 nM
% inibição
Valor de p
L1
24
48
-100
-
L2
421
193
54,2
-
L3
2278
2113
7,2
-
L4
25
38
-52
-
L5
234
235
-0,4
-
L6
422
774
-83,4
-
L7
1436
1374
4,3
-
L8
810
800
1,2
-
MÉDIA
706
696
-21,1 ± 52
0,84
14
Tabela 4. Dosagem de TNF-α, em pg/mL, em culturas de 5 pacientes com leishmaniose
cutânea estimulados com SLA 5µg/mL
PACIENTE
SLA 5μg/mL
SLA 5μg/mL +
Imm 300 nM
% inibição
Valor de p
L4
110
134
-21,8
-
L5
355
365
-2,8
-
L6
1145
1036
9,5
-
L7
3790
1968
48,1
-
L8
1551
1307
15,7
-
MÉDIA
1390
962
9,7 ± 25,7
0,31
A IL-10 tem suas concentrações detalhadas na tabela 5 e 6. Registra-se que em
ambas as extrações de SLA utilizadas, o immucillin-H não inibiu de maneira significativa
a produção da citocina. Semelhante ao verificado para o TNF-α, reduções pontuais
puderam ser presenciadas, porém a inibição inexpressiva associada a aumentos da
concentração predominaram. Estes achados foram implicados para as culturas
estimuladas em ambas as doses - SLA à 5 µg/mL (p=0,43) e SLA à 1 µg/mL (p=0,81).
Os percentuais de inibição sumarizam e reafirmam os dados expostos.
Tabela 5. Dosagem de IL-10, em pg/mL, em culturas de 8 pacientes com leishmaniose
cutânea estimulados com SLA 1µg/mL
PACIENTES
SLA 1μg/mL
SLA 1μg/mL +
Imm 300 nM
% inibição
Valor de p
L1
28
20
28,6
-
L2
72
14
80,6
-
L3
210
221
-5,2
-
L4
170
237
-39,4
-
L5
407
371
8,8
-
L6
280
244
12,9
-
L7
258
354
-37,2
-
L8
260
230
11,5
-
MÉDIA
210
211
7,57 ± 38
0,81
15
Tabela 6. Dosagem de IL-10, em pg/mL, em culturas de 5 pacientes com leishmaniose
cutânea estimulados com SLA 5µg/mL.
PACIENTE
SLA 5μg/mL
SLA 5μg/mL +
Imm 300 nM
% inibição
Valor de p
L4
234
225
3,8
-
L5
414
488
-17,8
-
L6
234
212
9,4
-
L7
642
387
39,7
-
L8
338
315
6,8
-
MÉDIA
372
317
8,3 ± 20,5
0,43
16
VI. DISCUSSÃO
A leishmaniose cutânea causada pela L. braziliensis é um exemplo de doença
infecciosa na qual a patogênese, e consequentemente a lesão tecidual e formação da úlcera
cutânea, está associada a uma resposta imune exagerada e não apropriadamente
modulada. O presente estudo mostra que o immucillin-H tem capacidade de reduzir a
produção de IFN-γ em culturas estimuladas com antígeno solúvel de leishmania (SLA),
colocando este fármaco como um candidato em potencial a ser utilizado em associação
com drogas leishmanicidas no tratamento da leishmaniose tegumentar causado por L.
braziliensis.
O immucillin H, pela sua ação inibitória sobre a enzima PNP, tem a capacidade
de reduzir a proliferação dos linfócitos T (Kicska et al., 2001). No homem esta droga foi
utilizada em estudo de fase I, que mostrou boa tolerância e segurança no controle total ou
parcial de doenças malignas de células T periféricas recidivantes ou refratárias a outras
terapias (Ogura et al., 2002). No presente estudo mostra-se que o immucillin-H exerce
também influencia na produção de IFN-γ, documentando-se que tanto em culturas
estimuladas com um mitógeno (PHA) como em culturas estimuladas com um antígeno,
o immucillin-H tem a capacidade de reduzir a produção de IFN-γ.
O presente estudo utilizou amostras de sangue de pacientes com leishmaniose
cutânea, em doença ativa e antes do tratamento. Todos os indivíduos deste trabalho
apresentavam úlcera de aspecto clássico da leishmaniose tegumentar causada pela L.
brazilienisis e tiveram o diagnóstico comprovado pelo isolamento do parasita ou pela
positividade do PCR em biópsia da pele, bem como teste de hipersensibilidade tardia
antígeno de Leishmania positivo.
Com a finalidade de determinar a concentração a ser utilizada no Immucillin-H,
células mononucleares de indivíduos sadios foram estimuladas com o mitógeno PHA.
Observou-se que redução significativa da produção de IFN-γ ocorreu tanto na
concentração de 300nM, como 600nM. Embora esta supressão mediada pelo immucillinH fosse somente da ordem de 20-25%, é conhecida a dificuldade de se modular a resposta
imunológica a um mitógeno.
A capacidade do immucillin-H em modular a resposta imune foi avaliada em
relação à produção das citocinas IFN-γ, TNF-α, IL-10 em culturas CMSPs de pacientes
infectados pela Leishmania, estimuladas com SLA, tendo sido observada inibição
17
significativa somente com o IFN-γ. Esta ação seletiva indica a especificidade do efeito
do immucillin-H sobre células T, uma vez que a IL-10 e TNF-α são citocinas
predominantemente produzidas por monócitos. Embora a análise estatística tenha
mostrado significância somente para a inibição da produção de IFN-γ nas amostras
estimuladas com 1 µg/mL de SLA, esta redução também foi relevante no estímulo de
SLA à 5 µg/mL. Este fato pode ser evidenciado pelo percentual inibitório alcançado por
estas amostras – com média de 74,6% -, além de um valor de p bem próximo da
significância estabelecida (p=0,06). Provavelmente a significância estatística será
alcançada com o aumento do tamanho amostral.
Os dados obtidos neste estudo indicam uma atividade inibitória do immucillin-H
sobre células T de pacientes com leishmaniose cutânea. A importância desses achados
reside no fato da patogênese da leishmaniose tegumentar causada pela L. braziliensis estar
relacionada predominantemente à atividade de células T CD4+ e CD8+ (Da-Cruz et al.,
1994; Da-Cruz et al., 2002; Uzonna et al., 2004). É bem documentada a existência de
correlação entre ativação de células CD4+ e o tamanho da úlcera leishmaniótica
(Antonelli et al., 2005), enquanto que o papel do CD8+ é observado através de uma
correlação entre a frequência de células CD8+ e células CD8+ expressando granzima com
a intensidade da resposta inflamatória tecidual (Da-Cruz et al., 1994). Esta resposta
exacerbada e não modulada na leishmaniose tegumentar deve-se não só à ativação de
células T, como à redução da capacidade dessas células de serem moduladas por citocinas
regulatórias, como a IL-10 e o TGF-β (Bacelar et al., 2002).
Existem evidências de que a modulação da resposta imune associada ao uso de
drogas leishmanicidas é mais eficaz do que o antimonial pentavalente isolado, reduzindo
o tempo de cura, além de aumentar a taxa de sucesso terapêutico em pacientes refratários
ao tratamento da leishmaniose. Estas observações têm sido feitas tanto pela utilização do
fator estimulante de colônias de granulócitos e macrófagos (granulocyte-macrophage
colony-stimulating fator - GM-CSF), como da pentoxifilina (Santos et al., 2004; Almeida
et al., 2005; Sadeghian G, Nilforoushzadeh MA, 2006; Lessa et al., 2011). Todavia, o
GM-CSF deixou de ser fabricado para utilização em humanos e a pentoxifilina associada
ao antimonial - que tem se revelado bastante eficaz no tratamento da leishmaniose mucosa
em um estudo de fase III realizado no serviço de imunologia do COM-HUPES ainda não
publicado - não se mostrou melhor que o antimonial isoladamente para tratamento da
leishmaniose cutânea.
18
A capacidade do immucillin-H em modular a produção de IFN-γ em pacientes
com leishmaniose tegumentar abre perspectivas para a realização de estudos avaliando a
eficácia dessa molécula em combinação com antimonial pentavalente para tratamento da
leishmaniose tegumentar.
19
VII. CONCLUSÕES
1. O immucillin-H exibe ação seletiva sobre a produção de IFN-γ, inibindo a
produção desta citocina nas amostras estimuladas com SLA a 1 µg/mL e a 5
µg/mL.
2. A droga não exibe o mesmo efeito sobre a concentração das demais citocinas
investigadas – TNF-α e IL-10.
3. O immucillin-H apresenta ação imunomoduladora específica sobre as células-T –
principal fonte produtora de IFN-γ -, inibindo sua ativação em pacientes com
leishmaniose cutânea.
20
VIII. SUMMARY
BACKGROUND: Cutaneous leishmaniasis, which is caused by Leishmania
braziliensis, has an extremely high prevalence in the Brazilian population. Welldemarcated cutaneous ulcers with raised edges characterize the disease.
Immunologically, an over activation of T cells occurs in response to parasite’s
antigens, leading to production of pro-inflammatory cytokines such as IFN-γ and
TNF-α. This non-modulated inflammatory response is associated with the
development of tissue lesion. Immucillin-H is a purine nucleoside phosphorylase
(PNP) inhibitor and acts reducing T cell activation. Therefore, Imucillin-H is expected
to modulate the immune response in cutaneous leishmaniasis. OBJECTIVE:
Determine whether Immucillin-H is capable of modulating over activated immune
response in cutaneous leishmaniasis. METHODOLOGY: This study was developed
in Universitary Hospitalar Complex Professor Edgard Santos’ Immunology Service
(SIM). Eight patients, diagnosed by positive PCR reaction or parasite isolation from
lesion’s culture, were evaluated. These patients were from a leishmaniasis endemic
are (Corte de Pedra, city of Tancredo Neves, state of Bahia, Brazil), where SIM’s
researchers develop assistance services and research. Peripheral blood mononuclear
cells were stimulated in vitro with Phitohemagglutinin (PHA) and soluble Leishmania
antigen (SLA) isolated or associated whith Immucillin-H. The production of
cytokines (IFN-γ, TNF-α and IL-10) in supernatant cultures was evaluated by ELISA
technique. Statistical analysis was performed with non-parametric tests: MannWhitney Test and Wilcoxon Paired Test. RESULTS: Immucillin-H was able to
inhibit IFN-γ production in samples stimulated by SLA. TNF-α and IL-10 inhibition
was not significant. CONCLUSION: Immucillin-H was able to reduce cell T
activation in patients with cutaneous leishmaniasis.
Key words: 1. Leishmaniasis. 2. T cells. 3. Immucillin-H
IX. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
21
1. Almeida RP, Brito J, Machado PL, De Jesus AR, Schriefer A, Guimarães LH, et
al. Successful treatment of refractory cutaneous leishmaniasis with GM-CSF and
antimonials. Am J Trop Med Hyg 2005; 73(1):79-81.
2. Alvar J, Vélez I, Bern C, Herrero M, Desjeux P, Cano J, et al. Leishmaniasis
Worldwide and Global Estimates of Its Incidence. PLoS ONE 2012;7(5).
3. Antonelli LR, Dutra WO, Almeida RP, Bacellar O, Carvalho EM, Gollob KJ.
Activated inflammatory T cells correlate with lesion size in human cutaneous
leishmaniasis. Immunol Let 2005;101(2):226-30.
4. Bacelar O, Lessa H, Schriefer A, Machado P, De Jesus AR, Dutra WO, et al. Upregulation of Th1-Type responses in mucosal leishmaniasis patients. Infect Immun
2002;70(12):6734-40.
5. Bantia S, Miller PJ, Parker CD, Ananth SL, Horn LL, Kilpatrick JM, et al. Purine
nucleoside phosphorylase inhibitor BCX-1777 (Immucillin-H) —a novel potent
and orally active immunosuppressive agent. International Immunopharmacology
2001;1(6):1199–210.
6. Bantia S, Kilpatrick JM. Purine nucleoside phosphorylase inhibitors in T-cell
malignancies. Curr Opin Drug Discov Devel 2004;7(2):243-7.
7. Bittar RC, Nogueira RS, Vieira-Gonçalves R, Pinho-Ribeiro V, Mattos MS,
Oliveira-Neto MP, Da-Cruz AM. T-cell responses associated with resistance to
Leishmania infection in individuals from endemic areas for Leishmania (Viannia)
braziliensis. Memórias do Instituto Oswaldo Cruz 2007;102(5):625-30.
8. Bittencourt AL, Barral A. Evaluation of the histopathological classifications of
American cutaneous and mucocutaneous leishmaniasis. Mem Inst Oswaldo Cruz
1991;86(1): 51-6.
9. Brasil. Ministério da Saúde. Secretaria de Vigilância em Saúde. Manual de
Vigilância da Leishmaniose Tegumentar Americana. 2 Ed. Brasília-DF; 2010.
10. Bzowska A, Kulikowska E, Shugar D. Purine nucleoside phosphorylases:
properties, functions, and clinical aspects. Pharmacol Ther 2000;88(3):349-425.
11. Carvalho EM, Machado PRL, Rosa MEA, Jesus AR, Almeida RP.
Immunopathogenesis and Immunotherapy in Tegumentary Leishmaniasis. Curr
Res in Immunology 2007;1:91-126.
22
12. Da-Cruz AM, Conceição-Silva F, Bertho AL, Coutinho SG. Leishmania-Reactive
CD4+ e CD8+ T Cells Associated with Cure of Human Cutaneous Leishmaniasis.
Infect Immun 1994;62(6):2614-18.
13. Da-Cruz AM, Bittar R, Mattos M, Oliveira-Neto MP, Nogueira R, Pinho-Ribeiro
V, Azeredo-Coutinho RB, et al. T-Cell-Mediated Immune Responses in Patients
with Cutaneous or Mucosal Leishmaniasis. Long-Term Evaluation After Therapy.
Clin and Diagn Lab Immunol 2002;9:251-56.
14. Da Silva R, Sacks DL. Metacyclogenesis is a major determinant of Leishmania
promastigote virulence and attenuation. Infection and immunity 1987;55(11),
2802-806.
15. Darrah PA, Patel DT, De Luca PM, Lindsay RWB, Davey FD, et al.
Multifunctional Th1 cells define a correlate of vaccine-mediated protection
against Leishmania major. Nat Med 2007;13(7):843-50.
16. Deves C, de Assunção TM, Ducati RG, Campos MM, Basso LA, Santos DS, et
al. The transition state analog inhibitor of Purine Nucleoside Phosphorylase (PNP)
Immucillin-H arrests bone loss in rat periodontal disease models. Bone
2013;52(1):167–75.
17. Esfandiarpour I, Farajzadeh S, Rahnama Z, Fathabadi EA, Heshmatkhah A.
Adverse effects of intralesional meglumine antimoniate and its influence on
clinical laboratory parameters in the treatment of cutaneous leishmaniasis. Int J
Dermatol 2012;51(10):1221-5.
18. Faria DR, Souza PEA, Duraes FV, Carvalho EM., Gollob KJ, Machado PR, et al.
Recruitment of CD8+ T cells expressing granzyme A is associated with lesion
progression in human cutaneous leishmaniasis. Parasite immunology 2009;31(8):
432-9.
19. Furtado T. Leishmaniose Tegumentar Americana. In: Machado-Pinto J(ed),
Doenças infecciosas com manifestações dermatológicas. Rio de Janeiro, RJ:
Editora Médica e Científica Ltda. 1994, p.319-328.
20. Galmarini CM. Drug evaluation: forodesine - PNP inhibitor for the treatment of
leukemia, lymphoma and solid tumor. IDrugs 2006;9(10):712-22.
21. Giblett ER, Ammann AJ, Wara DW, Sandman R, Diamond LK. Nucleosidephosphorylase deficiency in a child with severely defective T-cell immunity and
normal B-cell immunity. Lancet 1975; 1(7914):1010-3.
23
22. Giudice A, Vendrame C, Bezerra C, Carvalho LP, Delavechia T, Carvalho EM,
Bacellar O. Macrophages participate in host protection and the disease pathology
associated with Leishmania braziliensis infection. MC Infect Dis 2012;12:75.
23. Gramiccia M, Gradoni L. The current status of zoonotic leishmaniases and
approaches to disease control. Int J Parasitol 2005;35:1169–80.
24. Grimaldi GJ, Tesh RB, McMahon-Pratt D. A review of the geographic
distribution and epidemiology of leishmaniasis in the New World. Am J Trop Med
Hyg 1989;41:687–725.
25. Guimarães LH, Machado PR, Lago EL, Morgan DJ, Schriefer A, Bacellar O, et
al. Atypical manifestations of tegumentary leishmaniasis in a transmission area of
Leishmania braziliensis in the state of Bahia, Brazil. Trans R Soc Trop Med Hyg
2009;103(7):712-5.
26. Holzmuller P, Bras-Gonçalves R, Lemesre JL. Phenotypical characteristics,
biochemical pathways, molecular targets and putative role of nitric oxidemediated programmed cell death in Leishmania. Parasitology 2006;132:19-32.
27. Korycha A, Blonski JZ, Robak T. Forodesine (BCX-1777, Immucillin-H) – a new
purine nucleoside analogue: mechanism of action and potential clinical
application. Med Chem 2007;7:976-83.
28. Lessa HA, Machado P, Lima F, Cruz AA, Bacellar O, Guerreiro J, et al.
Successful treatment of refractory mucosal leishmaniasis with pentoxifylline plus
antimony. Am J Trop Med Hyg 2001;65(2):87-9.
29. Liew FY, Xu D, Chan WL. Immune effector mechanism in parasitic infections.
Immunol Lett 1999;65:101-4
30. Lohoff M, Gessner A, Bogdan C, Röllinghoff M. Experimental murine
leishmaniasis and the Th1/Th2 cell concept. Tokai J Exp and Clin Med
1998;23:347-50.
31. Marzochi MC. As leishmanioses no Brasil: as leishmanioses tegumentares. J Bras
Med 1992;63;82-104.
32. Mayrink W, Botelho AC, Magalhães PA, Batista SM, Ade OL, Genaro O, et al.
Immunotherapy, immunochemotherapy and chemotherapy for American
cutaneous leishmaniasis treatment. Rev Soc Bras Med Trop 2006;39(1):14-21.
33. Montenegro J. Cutaneous reactions in leishmaniasis. Arch Derm Syphilol
1926;13:187.
34. Morris PE, Omura GA. Inhibitors of the enzyme purine nucleoside phosphorylase
as potential therapy for psoriasis. Curr Pharm Des 2000;6(9):943-59.
24
35. Mougneau E, Bihl F, Glaichenhaus N. Cell biology and immunology of
Leishmania. Immunol Rev 2011;240(1):286-96.
36. Ogura M, Tsukazaki K, Nagai H, Uchida T, Oyama T, et al. Phase I study of BCX1777 (forodesine) in patients with relapsed or refractory peripheral T/natural
killer-cell malignancies. Cancer Sci 2012;103(7):1290-5.
37. Okwor I, Mou Z, Liu D, Uzonna J. Protective Immunity and Vaccination Against
Cutaneous Leishmaniasis. Front Immunol 2012;3:128.
38. Oliveira LF, Schubach AO, Martins MM, Passos SL, Oliveira RV, Marzochi MC,
et al. Systematic review of the adverse effects of cutaneous leishmaniasis
treatment in the New World. Acta Trop 2011;118(2):87-96.
39. Queiroz A, Sousa R, Heine C, Cardoso M, Guimarães LH, Machado PR, et al.
Association between an emerging disseminated form of leishmaniasis and
Leishmania (Viannia) braziliensis strain polymorphisms. J Clin Microbiol 2012;
50(12):4028-34.
40. Reis LC. Caracterização da Resposta Imune Celular em Portadores de
Leishmaniose Tegumentar Americana Antes e Depois do Tratamento
Quimioterápico [Dissertação de Mestrado em Saúde Pública]. Recife: Centro de
Pesquisas Aggeu Magalhães, Fundação Oswaldo Cruz; 2007.
41. Roberts MTM. Current understandings in the immunology of leishmaniasis and
recent developments in prevention and treatment. Br Med Bull 2006;75:115-30.
42. Rogers KA, DeKrey GK, Mbow ML, Gillespie RD, Brodskyn CI, Titus RG. Type
1 and type 2 responses to Leishmania major. FEMS Microbiol Lett 2002;209(1):17.
43. Sadeghian G, Nilforoushzadeh MA. Effect of combination therapy with systemic
glucantime and pentoxifylline in the treatment of cutaneous leishmaniasis. Int J
Dermatol 2006;45(7):819-21.
44. Santos CD, Boaventura V, Cardoso CR, Tavares N, Lordelo MJ, Noronha A, et
al. CD8(+) Granzyme B(+)-Mediated Tissue Injury Versus CD4(+)IFNγ(+)Mediated Parasite Killing in Human Cutaneous Leishmaniasis. J Invest Dermatol
2013. 133(6):1533-40.
45. Santos JB, De Jesus AR, Machado PR, Magalhães A, Salgado K, Carvalho EM,
et al. J Infect Dis 2004;190:1793-6.
46. Schnorr D, Muniz AC, Passos S, Guimaraes LH, Lago EL, Bacellar O, et al. IFNγ production to leishmania antigen supplements the leishmania skin test in
25
identifying exposure to L. braziliensis infection. PLoS Negl Trop Dis 2012;
6(12):1947.
47. Sjölander A, Baldwin TM, Curtis JM, Handman E. Induction of a Th1 response
and simultaneous lack of activation of a Th2 response are required for generation
of immunity of leishmaniasis. J Immunol 1998;160:3949-57.
48. Soong L, Chang CH, Sun J, Longley BJ Jr, Ruddle NH, Flavell RA, McMahonPratt D. Role of CD4+ T cells in pathogenesis associated with Leishmania
amazonensis infection. J Immunol 1997; 158(11):5374-83.
49. Sundar S, Reed SG, Sharma S, Mehrotra A, Murray HW. Circulating T Helper 1
(Th1) cell- and Th2 cell-associated cytokines in Indian patients with visceral
leishmaniasis. Am J Trop Med Hyg 1997;56(5):522-5.
50. Sypek JP, Chung CL, Mayor SEH, Subramanyam JM, Goldman SJ, Sieburth DS,
et al. Resolution of Cutaneous Leishmaniasis: Interleukin 12 Initiates a Protective
T Helper Type 1 Immune Response. J Exp Med 1993;177:1797-802.
51. Uzonna JE, Joyce KL, Scott P. Low dose Leishmania major promotes a transient
T helper cell type 2 response that is down-regulated by interferon gammaproducing CD8+ T cells. Immunol Rev 2004;201:318-38.
52. Xin L, Li Y, Soong L. Role of Interleukin-1β in Activating the CD11chigh
CD45RB− Dendritic Cell Subset and Priming Leishmania amazonensis- Specific
CD4+ T Cells In Vitro and In Vivo. Infect. Immun 2007;75(10):5018-26.
X. ANEXOS:
ANEXO I: Termo de Consentimento Livre e Esclarecido
TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO
26
Nome do Projeto: Avaliação da Capacidade do Immucillin-H em Modular a Resposta
Imune in vitro em Indivíduos com Leishmaniose Cutânea
Nome do Participante:
Investigador Principal: Edgar Marcelino de Carvalho Filho - Complexo Hospitalar
Professor Edgard Santos (Com-HUPES), Rua João das Botas s/nº, Canela, 40110-160.
Salvador, Bahia, Brasil. Tel.: (71) 3237-7353
CEP/FMB: Praça XV de novembro, s/nº, Largo do Terreiro de Jesus, 40025-010.
Salvador, Bahia, Brasil. Tel.:(71) 3283-5564
No do Projeto:
Convite e Objetivo: O (A) Senhor (a) está sendo convidado (a) a participar de uma
pesquisa. Por favor, leia este documento com bastante atenção antes de assiná-lo. Caso
haja alguma palavra ou frase que o (a) senhor (a) não consiga entender, converse com o
pesquisador responsável pelo estudo ou com um membro da equipe desta pesquisa para
explica-los. Caso o(a) senhor(a) não possa ler este documento, poderá contar com a ajuda
de um familiar ou alguém de sua confiança para leitura do documento.
A proposta deste termo de consentimento livre e esclarecido (TCLE) é explicar tudo sobre
o estudo e solicitar a sua autorização para participar do mesmo.
O objetivo principal deste estudo é determinar a capacidade da droga, chamada de
Immucillin-H, em reduzir o crescimento acelerado de células do sistema de defesa do
organismo em amostras de sangue de pacientes com leishmaniose cutânea. Dentre os
objetivos específicos, este estudo avaliará a capacidade desta mesma droga em reduzir a
produção de substâncias que aumentam o ritmo de crescimento dessas mesmas células.
Participarão do estudo, aproximadamente, 15 pessoas com Leishmaniose Cutânea, e as
análises serão feitas no Serviço de Imunologia do Complexo Hospitalar Universitário
Professor Edgard Santos (COM-HUPES), em Salvador, Bahia.
O (a) Senhor (a) foi escolhido (a) a participar do estudo porque vem sendo acompanhado
no Posto de Saúde de Corte de Pedra, município de Tancredo Neves, Bahia, e possui
ferida típica da leishmaniose cutânea com um a três meses de duração da doença,
confirmada por exame laboratorial.
Além das informações aqui prestadas você pode esclarecer dúvidas sobre o estudo com
seu médico. Caso decida participar, você será solicitado a assinar este formulário de
consentimento.
27
Participação Voluntária: Sua participação é totalmente voluntária, ou seja, você
somente participa se quiser. A não participação no estudo não mudará seu
acompanhamento médico. Você tem total liberdade de sair do estudo a qualquer
momento, sem qualquer prejuízo à continuidade do acompanhamento na instituição.
Finalidade: O estudo procura testar a capacidade da droga Immucillin-H em reduzir a
resposta aumentada das células de defesa, encontrada em pacientes com leishmaniose
cutânea.
Procedimentos: Caso você concorde em participar do estudo, você será solicitado a
fornecer 30 ml de sangue para realizar as avaliações acima citadas. Os resultados destes
exames estarão disponíveis e você poderá consultar seu médico para obter informação
sobre eles.
Duração do estudo: A duração total do estudo é de 2 anos. Durante este período você
será solicitado a fazer apenas uma coleta de sangue.
Confidencialidade: Todas as informações colhidas e os resultados dos testes serão
mantidos em segredo. Os resultados desta pesquisa serão apresentados em reuniões ou
publicações científicas, mas não há por que se preocupar, pois sua identidade (nome e
qualquer outra informação pessoal) jamais será revelada.
Análise de riscos: Os riscos dos procedimentos são mínimos. Uma pequena dor no local
da coleta de sangue poderá ocorrer. Em alguns casos, a coleta de sangue pode ser
acompanhada por pequeno sangramento ou formação de área arroxeada (hematoma).
Manteremos pressionada a área furada pela agulha por alguns minutos para evitá-los.
Caso o paciente apresente algum desconforto ou tontura, deverá permanecer deitado. A
equipe será responsável por providenciar tratamento médico e assegurar o bem estar dos
participantes.
Análise de benefícios: Não há benefício direto para o participante desse estudo. Porém,
os resultados obtidos com este estudo poderão ajudar, no futuro, a desenvolver drogas
que serão aplicadas aos pacientes para diminuir lesões causadas pela leishmaniose.
Custos: Você não terá nenhum gasto e nem receberá qualquer pagamento pela sua
participação.
Em caso de danos relacionados à pesquisa: Em caso de dano pessoal, diretamente
causado pelos procedimentos deste estudo, o participante tem direito a tratamento médico
nas Instituições, bem como às indenizações estabelecidas em lei.
28
Esclarecimentos: Em qualquer etapa do estudo você terá acesso aos profissionais
responsáveis pela pesquisa para esclarecimento de qualquer dúvida. Os responsáveis pelo
estudo são os Dr. Edgar M. Carvalho e Rafael de Castro da Silva que poderão ser
encontrados no Serviço de Imunologia do COM-HUPES, nos respectivos telefones: 71
3283-8114, 71 9101-6658.
Consentimento: Se você leu o consentimento informado ou este lhe foi explicado e você
aceita participar do estudo, favor assinar o nome abaixo. A você será entregue uma cópia
deste formulário para guardar. Em caso de denúncia, o CEP-FMB/UFBA deve ser
contatado através do telefone (71)3283-5575 ou (71)3283-5567 ou no endereço Largo do
Terreiro de Jesus, s/n, Pelourinho – Salvador/BA.
____________________________
Assinatura do participante
____________
____________
Data
Hora
Impressão digital do participante
____________________________
Assinatura do pesquisador
______________________________
Assinatura da testemunha
____________
____________
Data
____________
Hora
____________
Data
ANEXO II. Parecer consubstanciado do CEP
PARECER CONSUBSTANCIADO DO CEP
DADOS DO PROJETO DE PESQUISA
Hora
29
Título da Pesquisa: Avaliação da Capacidade do Immucillin-H em Modular em Resposta Imune In
Vitro em Indivíduos com Leishmaniose Cutânea Pesquisador: Edgar Marcelino de Carvalho Filho Área
Temática:
Versão: 2
CAAE: 24172214.7.0000.5577
Instituição Proponente:FACULDADE DE MEDICINA DA BAHIA
Patrocinador Principal: MINISTERIO DA CIENCIA, TECNOLOGIA E INOVACAO
DADOS DO PARECER
Número do Parecer:
564.409
Data
da
Relatoria: 07/04/2014
Apresentação do Projeto:
A leishmaniose cutânea (LC), causada pela Leishmania braziliensis, tem grande prevalência na população
brasileira. A doença se caracteriza pela presença de úlcera(s) bem delimitadas, com bordas elevadas. Do
ponto de vista imunológico, existe uma ativação exagerada de células T contra antígenos do parasita, com
produção de citocinas pró-inflamatórias, como IFN-¿, TNF-¿ e IL-10. Esta resposta inflamatória não
apropriadamente modulada se relaciona com o desenvolvimento da lesão tecidual. Alguns estudos in vitro,
nos recentes anos, mostraram o efeito da inibição da enzima Purina Nucleosídeo Fosforilase (Purine
nucleoside Phosphorylase - PNP) através do Immucillin-H, com direta ação sobre a proliferação celular,
diminuindo-a acentuadamente. Como os efeitos do Immucillin-H se fazem somente em células T ativadas,
não atingindo, portanto, outras células de defesa do hospedeiro, é importante avaliar a ação deste agente
em atenuar a resposta imune de pacientes com leishmaniose cutânea, considerando o importante papel da
exacerbação da resposta imune celular na patogênese dessa doença.
Objetivo da Pesquisa:
Geral
Determinar a capacidade do Immucillin-H de modular negativamente a resposta imune mediadapor células
em pacientes com leishmaniose cutânea.
Continuação do Parecer: 564.409
Específicos:
30
Avaliar a capacidade do Immucillin-H de diminuir a resposta linfoproliferativa e a produção de citocinas
em pacientes com leishmaniose cutânea.
Avaliar a capacidade do Immucillin-H em diminuir a produção de citocinas pró-inflamatórias em pacientes
com leishmaniose cutânea.
Avaliação dos Riscos e Benefícios:
Riscos:
Os pesquisadores afirmam que os riscos dos procedimentos são mínimos. Uma pequena dor no local da
coleta de sangue poderá ocorrer. Em alguns casos, a coleta de sangue pode ser acompanhada por pequeno
sangramento ou formação de hematoma. A área de punção será pressionada por alguns minutos para evitálos. Caso o paciente apresente algum desconforto ou tontura, deverá permanecer deitado. A equipe será
responsável por providenciar tratamento médico e assegurar o bem estar dos participantes. Benefícios:
Não há benefício direto observado para o participante desse estudo. Porém, os resultados obtidos com este
estudo poderão ajudar, no futuro, a desenvolver drogas que serão aplicadas aos pacientes para diminuir
lesões decorrentes da doença em questão.
Comentários e Considerações sobre a Pesquisa:
Trata-se de pesquisa relevante na área de doenças negligenciadas, seguindo aspectos éticos e preceitos da
Resolução CNS 466/12.
Considerações sobre os Termos de apresentação obrigatória:
Foi anexada a declaração de confidencialidade pelo pesquisador principal e demais pesquisadores. De igual
forma, foi anexada a carta de anuência do Posto de saúde de Corte de Pedra e do HUPES. O calendário da
pesquisa foi adequado para início somente após aprovação pelo CEP. O TCLE foi adequado de acordo com
os preceitos da Resolução 466/12 do CNS.
Recomendações:
Cabe ao pesquisador principal a responsabilidade de enviar relatórios semestrais da pesquisa aprovada.
Em caso de intercorrência o CEP FMB-UFBA deve ser comunicado.
Continuação do Parecer: 564.409
Conclusões ou Pendências e Lista de Inadequações:
31
Não há
Situação do Parecer:
Aprovado
Necessita Apreciação da CONEP:
Não
Considerações Finais a critério do CEP:
SALVADOR, 23 de Março de 2014
Assinador por:
Eduardo Martins Netto
(Coordenador)