UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA MARIA CENTRO DE CIÊNCIAS NATURAIS E EXATAS CURSO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS Caderno Didático de Biologia Celular (BLG 138) Élgion Loreto Departamento de Biologia -2005 Sumário: Página Introdução 3 Primeira Parte Uma breve revisão de Biologia Celular 4 A lógica da composição molecular dos seres vivos 4 Estruturas supra-moleculares e a emergência de novas propriedades 12 A organização celular: o conceito de célula mínima 16 Da célula procariótica para a célula eucariótica 24 Segunda Parte Recomendações de ordem geral a serem observadas no uso do Laboratório. 27 O uso do microscópio óptico (mo) 29 Observando células de epitélio de escamas de cebola 40 Propriedades físico-químicas dos componentes da membrana plasmática. 41 Comparando células procariotas e eucariotas. 42 Um pouco de físico-química: pH 44 Estudando a passagem de solutos e solventes pela membrana plasmática. 47 Fracionamento celular : centrifugação. 49 cromatografia 51 eletroforese 53 Observação de ciclose e cloroplastos em células de Elodea 54 Observando cílios e sistema de endomembranas 57 Preparação de lâminas permanentes 59 Observação de complexo de Golgi em lâminas permanentes de epidídimo 60 Observação de células musculares estriadas 61 Observação de mitose em ponta de raiz de cebola 62 Atividades de práticas de biologia como componente de formação pedagógica. atividade 1 – Biologia na cozinha. 65 atividade 2 - O uso de modelos didáticos e simulações 65 2 INTRODUÇÃO Biologia Celular (BLG 138) é uma disciplina do primeiro semestre, e ministrada com duas horas/aula (h/a) teóricas e duas h/a práticas semanais. Os principais objetivos da disciplina são o dar ao aluno: - uma visão atual da organização e funcionamento celular, assim como o domínio dos conceitos básicos dessa área do conhecimento; - uma visão histórica sobre as principais descobertas que levaram aos paradigmas atuais dessas ciências; - instrumentalização para busca de informação e atualização, de forma autônoma nessa área do conhecimento; - instrumentalização para o desenvolvimento de atividades didáticas de Biologia Celular, para todos os níveis de ensino, incluindo as atividades práticas. O presente Caderno Didático foi escrito para auxiliar a atingir os objetivos descritos acima. Para tal, ele consta de duas parte: 1a) Uma breve revisão teórica atualizada, porém escrita em nível de ensino médio. Este texto servirá de base para as primeiras semanas de aula teórica que consistirá de uma revisão geral de Biologia Celular. 2a) Protocolos das aulas práticas. Estas atividades serão executadas durante as aulas práticas e cabe ao aluno fazer o registro solicitado nos protocolos. Pensamos ser este material uma posterior fonte de consulta para a execução de atividades didáticas. O aprofundamento teórico, que se seguirá à revisão apresentada na primeira parte deste Caderno Didático será feito a partir da seguinte bibliografia: CARVALHO, H.F. e RECCO-PIMENTEL, S.M. A célula 2001. Barueri,SP, Ed. Manole, 2001. JUNQUEIRA , L.C. e CARNEIRO, J. Biologia Celular e Molecular. 7a Ed. Rio de Janeiro, Guanabara-Koogan, 2000. DeROBERTIS, E.D.P. e DeROBERTIS, E.M.F. Bases da Biologia Celular e Molecular. 14 ed, Rio de Janeiro, Guanabara-Koogan, 2003. COOPER, G.M. A célula, uma abordagem molecular. 2 ed P. Alegre, Artes Médicas, 2001. ALBERTS, B. e colaboradores. Fundamentos da Biologia Celular. P. Alegre, Artes Médicas, 1999. ALBERTS, B. e colaboradores. Biologia Molecular da Célula. 4 ed. P. Alegre, Artes Médicas, 2004. 3 Uma breve revisão de Biologia Celular Unidade I A lógica da composição molecular dos seres vivos: entendimento dos seres vivos são aqueles relacionados aos tipos de moléculas que os compõem. Os seres vivos são formados por células e todas as células são constituídas componentes químicos, organizados em uma “lógica” muito simples: átomos se agrupam para formar moléculas, estas, nos seres vivos são as vezes muito grandes, e por isto chamadas de macromoléculas, que se associam para formar as organelas e demais partes da célula. (Figura 1). nos sistemas vivos e perfaz 70%, ou mais, do admitimos a água como um líquido inerte, Os conceitos primordiais para o mesmos A água é a molécula mais abundante peso da maioria das formas de vida. Sempre DE QUE SÃO FEITAS AS CÉLULAS? pelos 1. A água e suas propriedades especiais suave, conveniente para muitos propósitos práticos. Embora seja quimicamente estável, ela é uma substância com propriedades incomuns. Na verdade, a água e seus produtos de ionização, os íons H+ e OH-, influenciam profundamente nas propriedades de muitos componentes importantes das células, como as enzimas, as proteínas, os ácidos nucléicos e os lipídios. A molécula da água é eletricamente neutra, mas o arranjo dos átomos de hidrogênio e oxigênio em forma de V torna essa molécula um dipolo elétrico. Pela presença dos dois pólos (+ e -) a água é dita um solvente polar. A água é melhor solvente do que a maioria dos líquidos comuns. Quase todos os sais minerais, podem ser dissolvidos na água sob forma de íons, como por exemplo, os íons de Na+, Cl -, K+, Mg++ . Estes íons, em especial, são de fundamental importância no controle da quantidade de água nas células (pressão osmótica), e atuam também no funcionamento de muitas enzimas e na Figura 1. Organização das estruturas celulares a partir dos átomos. excitabilidade das células. As moléculas orgânicas, que são as moléculas mais importantes na constituição e 4 funcionamento dos seres vivos, podem que as moléculas biológicas podem ser apresentar três diferentes comportamentos organizadas em apenas 4 classes. Além com relação a água: a) são solúveis (se disso, deve-se levar em conta que as solubilizam totalmente na água, como a moléculas orgânicas são formadas por, maioria dos glicídios); b) são insolúveis (por aproximadamente, 30 componentes básicos. exemplo, as gorduras neutras), ou c) são Entender esta classificação é fundamental anfipáticos, isto é, possuem uma parte da para a compreensão da química da vida. molécula que se dissolve na água e outra que é insolúvel. Temos,como exemplo desse último tipo, os lipídios e proteínas que compõem as membranas. As quatro classes de moléculas orgânicas que estão presentes nas células são as seguintes: A) A forma e propriedades funcionais que as macromoléculas vão apresentar são profundamente influenciadas pelo modo com que elas interagem com a água. Sendo desempenha, no funcionamento celular, um papel muito importante. uma chamados de B) Ácidos nucléicos C) Proteínas D) Lipídios (gorduras) As três primeiras classes formam MOLÉCULAS POLIMÉRICAS, isto é , são moléculas compostas por “unidades que se repetem”, denominadas MONÔMEROS. 2. As moléculas orgânicas Em (também açúcares ou carboidratos) assim, esse líquido “inodoro, incolor e sem gosto” Glicídios primeira observação, podemos constatar que os seres vivos são quimicamente moléculas muito orgânicas complexos. são Suas “gigantescas” quando comparadas as moléculas “dos seres brutos” e, além disso, são extremamente variáveis. Por exemplo, um organismo bem simples como uma bactéria, pode ter mais de 2.000 proteínas diferentes. Um ser humano deve ter em torno de 100.000 tipos de Figura 2. Formação de polímeros proteínas. Como poderemos estudar quimicamente estes seres, se, considerando somente as proteínas, temos uma diversidade tão grande ? Esta tarefa, que aparentemente é impossível, torna-se facilitada pelo fato de Podemos resumir a composição das macromoléculas orgânicas dos seres vivos na Figura 3, em que encontramos os átomos que compõem cada classe de macromolécula, os monômeros de cada classe e o polímero formado. 5 Devemos lembrar que na Figura 3 as No grupo dos glicídios, o principal moléculas poliméricas aparecem formadas monômero é a glicose. Nas proteínas, os por poucos monômeros, mas na realidade, monômeros são 20 diferentes aminoácidos geralmente, elas são formadas por milhares e, nos ácidos nucléicos, são “basicamente” deles. 8 nucleotídeos. Somando-se a estes alguns tipos predominantes de lipídeos, teremos então, aproximadamente os 30- 40 componentes químicos básicos, e suas variações, que são predominantes nos seres vivos. 2.1 PROTEÍNAS As proteínas são as moléculas responsáveis pelo funcionamento da célula. Praticamente todas as atividades da célula e, portanto, de um organismo são executadas por proteínas. O transporte de substâncias é realizado por proteínas, como por exemplo, a HEMOGLOBINA que transporta oxigênio. O movimento das organelas no interior da célula, e mesmo o movimento proporcionado pelos músculos, como um todo, é resultado da interação de proteínas como a TUBULINA e DINEIRA; a ACTINA e a MIOSINA. A proteção Figura 3. Classes de moléculas presentes nas células Como podemos ver na Figura 3, seis principais tipos de átomos vão formar todas as moléculas orgânicas dos seres vivos. Estes seis elementos se organizam em aproximadamente 30 –40 tipos de moléculas (os monômeros) que podem ser classificados por sua estrutura química em 4 grupos. do nosso corpo contra os microrganismos que causam doenças é dada pela ação de ANTICORPOS, que são proteínas. Todas as reações químicas que, constantemente, estão ocorrendo em nosso organismo, são realizadas por proteínas especiais chamadas de ENZIMAS. Enfim, todo o funcionamento do nosso organismo se dá graças à atividade das PROTEíNAS. Cada uma dessas funções é realizada por uma proteína diferente. Existe, 6 no corpo humano, cerca de 100.000 tipos estrutura primária . A substituição de um diferentes de proteínas, cada uma sendo único aminoácido em uma cadeia protéica, especialista em uma função. provoca uma alteração na estrutura primária As proteínas são construídas a partir dessa proteína. A conseqüência da de 20 tipos de aminoácidos, que diferem modificação pode ser grave, resultando em entre si através de uma parte da molécula, uma chamada de radical. corretamente dentro da célula. nova proteína que não funcione Chamamos de estrutura secundária a interação entre os aminoácidos vizinhos um uma cadeia polipeptídica. A interação entre radicais + e – ou hidrofóbicos e hidrofílicos fazem com que parte da cadeia se organize em α hélice ou pregas (folhas) β. Na Figura 5, está representada a estrutura primária da ribonuclease bovina, que é uma enzima que degrada o RNA. Na estrutura primária, está explícito apenas qual é a ordem dos aminoácidos que compõem uma proteína, ou seja, qual é o primeiro, o segundo, o terceiro... até o último aminoácido. Figura 4 - Os 20 aminoácidos que compõe as proteínas As proteínas são formadas pela união de 100 ou mais aminoácidos. O que vai diferenciar uma proteína de outra é a seqüência dos aminoácidos que a compõem. Como existem 20 diferentes tipos desses aminoácidos e as várias proteínas podem ter comprimentos diferentes, temos uma diversidade muito grande nessa classe de Figura 5. Estrutura primária da ribonuclease bovina macromoléculas (figura 4). Por exemplo, a A enzima ribonuclease bovina é formada por proteína, 124 aminoácidos, já a albumina do soro representa humano é formada por 528 aminoácidos. tridimensional. O formato da mioglobina, ou estrutura por sua como terciária vez, é é a de aquela sua uma que forma A seqüência de aminoácidos que seja, sua estrutura terciária é representada compõe uma proteína, recebe o nome de na da Figura 6. A estrutura terciária das 7 proteínas depende da seqüência O modo como uma proteína irá de desempenhar a sua atividade dependerá de aminoácidos (estrutura primária). sua forma tridimensional, ou seja, depende de sua estrutura terciária, que em última análise depende aminoácidos que da seqüência compõe a de proteína (estrutura primária). A troca, acréscimo ou retirada de um aminoácido PODE ocasionar alterações na estrutura dessa proteína, alterando sua forma e, portanto, sua função. A troca de um aminoácido na proteína ribonuclease, por exemplo, a aminoácido Figura 6. Estrutura secundária terciária da mioglobina. e Forma e Função das Proteínas Para todo o lado que olhamos, podemos observar que a forma dos objetos é que ditam a sua função. Na Figura 7, temos a representação de uma tesoura e de uma colher. É muito difícil cortar um pano com uma colher, ou comer sopa com uma tesoura. A forma desses objetos é que permite sua função. substituição (treonina) por do terceiro uma glicina resultará em uma proteína com outra forma tridimensional e incapaz de executar sua função. Somos formados por aproximadamente 100 trilhões de células. As células são estruturas muito organizadas cujo funcionamento é, essencialmente, realizado por uma classe de moléculas, as proteínas. São as proteínas que irão dar forma as estruturas celulares, transportar substâncias, realizar as reações químicas necessárias a sobrevivência e crescimento da célula, enfim são elas que irão pôr as células a funcionar. Existem milhares de proteínas diferentes em cada célula. Cada proteína está envolvida em uma função ou atividade específica. Diferentes células apresentam proteínas diferentes, o que explica as variações nas formas e funções observadas em cada tipo celular Portanto, para entender o funcionamento celular temos que olhar com Figura 7- Relação entre forma e função atenção para as proteínas. As proteínas são cadeias de aminoácidos. Imagine uma 8 proteína como um colar de pérolas, cada um deles está relacionada à sua forma. aminoácido sendo uma pérola. Existem 20 É a estrutura tridimensional que permitirá diferentes tipos de aminoácidos, o que a uma enzima (proteína que ativa poderia ser representado em nosso colar por pérolas de 20 cores diferentes. O número de pérolas e a seqüência nas cores das pérolas (aminoácidos) variam de proteína para proteína, como nos dois "colares" vistos na reações químicas) encaixar-se perfeitamente ao seu substrato e alterálo. Vamos a um exemplo: o fator VIII é uma proteína de 2.531 aminoácidos e está envolvida na coagulação sanguínea. Figura 8. A ausência ou a redução da atividade dessa proteína no sangue causa a hemofilia clássica (hemofilia A), condição em que a pessoa pode morrer devido à hemorragia intensa e de longa duração, desencadeada por qualquer pequeno ferimento. Há casos em que os hemofílicos Figura 8: Diferentes proteínas podem possuir diferentes números de aminoácidos (como no exemplo aqui temos um "colar" com 11 e outro com 9 contas). As proteínas diferem também com relação a seqüência de cores das contas do colar (seqüência de aminoácidos). têm o fator VIII no sangue, porém, essa proteína apresenta alguns dos seus aminoácidos trocados ou faltando, e isso causa uma alteração no formato tridimensional dessa proteína, impedindo que ela se ligue com as outras proteínas O número de aminoácidos varia de uma proteína para outra, as menores envolvidas na coagulação sanguínea, ou dificultando essa ligação. tem em torno de 50 aminoácidos e as maiores perto de 20.000. As proteínas se dobram formando tridimensional típica, uma ou estrutura seja cada proteína tem uma forma definida que depende da seqüência de aminoácidos que possui. É essa forma que vai ser responsável pela função da proteína. Observe a sua volta diferentes Sabe-se também que algumas substituições de aminoácidos na proteína podem ter provocando efeitos apenas menos drásticos, uma pequena alteração de forma do fator VIII, sem comprometer o funcionamento de modo muito intenso. Neste caso, a pessoa pode ter um tempo de coagulação um pouco maior do que a maioria dos objetos e veja como a função de cada 9 indivíduos, sendo, no entanto, normal e As Proteínas na Nossa Dieta não hemofílica. As proteínas, enquanto macromoléculas, não são essenciais na dieta humana. Alguns monômeros que formam as proteínas é que são considerados essenciais Enzimas As enzimas formam uma classe especial de proteínas que tem como função Cada enzima é especializada em uma reação específica. amido e o degrada até glicose. O amido, que é a substância que vai ser alterada durante a química, recebe o nome produzir. As proteínas presentes nos alimentos Por exemplo, a enzima amilase age sobre o reação Os aminoácidos chamados de essenciais são aqueles que nossas células não conseguem catalisar (acelerar) as reações químicas. acelerar para nutrição humana. de são degradadas no aparelho digestivo. Essa degradação corresponde à separação da cadeia polipeptídica em monômeros. Os aminoácidos liberados são, então, levados através do sangue para todas as células do SUBSTRATO. Na enzima, existe uma região que se liga especificamente ao substrato e a esta região chamamos de SÍTIO ATIVO. Assim, após a interação do substrato com o sítio nosso corpo. Uma vez no interior de nossas células, esses aminoácidos serão utilizados para compor as nossas proteínas e fazer funcionar o nosso organismo. As ativo, ocorre a reação química, sendo liberado o PRODUTO da reação, que no As enzimas não se alteram com a química que promovem, importantes no de um bife eram músculo da vaca. As proteínas do ovo seriam importantes para o caso da amilase, é a glicose. reação proteínas saindo intactas do processo, podendo ir localizar mais substrato para catalisar nova reação (Ver Figura 9). pintinho que iria se desenvolver naquele ovo. Se essas proteínas entrassem intactas em nossa circulação, de nada adiantaria, pois não estariam aptas a desempenhar as funções que as nossas células devem executar. Além do mais, como sabemos, toda proteína estranha serve como antígeno, e provavelmente, a absorção de uma proteína de vaca ou de galinha provocaria uma reação alérgica. Nosso sistema imune reconheceria essas Figura 9 Esquema de uma reação enzimática proteínas como estranhas ao organismo e criaria anticorpos contra elas. As proteínas são moléculas muito grandes. composto Por por exemplo, o colágeno aproximadamente é 3.000 10 aminoácidos. Essa proteína fibrosa é o principal componente da matriz extracelular e Resumindo o que foi apresentado sobre proteínas, podemos dizer que: do tecido conjuntivo. Se considerarmos que a molécula da água (que é bem menor que a O funcionamento de um organismo depende de suas proteínas. de um aminoácido) tem dificuldade de atravessar a pele, absorvida uma como poderia molécula de ser 3.000 O funcionamento de cada proteína depende de sua forma. aminoácidos? Mas muitos cremes “vendem” a idéia de que podemos “repor” o colágeno que está faltando em nossa derme, usando colágeno de galinha. Na verdade essa A forma de uma proteína depende da seqüência dos aminoácidos que a compõem. proteína não consegue atravessar a pele e chegar na derme, onde normalmente está depositada. Caso isso acontecesse, provocaria uma reação alérgica (seria um A questão agora é explicar: Como o organismo estabelece seqüência de aminoácidos que deve estar presente em cada proteína? antígeno). Os aminoácidos são divididos em A seqüência de aminoácidos das essenciais, isto é, aqueles que precisam proteínas “está escrita” (codificada) nos fazer parte de nossa dieta, pois não temos a genes. Os genes são compostos de outro capacidade de sintetizá-los e não essenciais tipo (aqueles que podemos sintetizar). nucléicos. A quantidade de de molécula orgânica, os ácidos proteínas necessárias na dieta varia conforme a idade 2.2.ÁCIDOS NUCLÉICOS e o estado fisiológico. Crianças, gestantes e Os ácidos nucléicos também são lactantes necessitam mais proteínas do que macromoléculas poliméricas, formadas por adultos. Um adulto jovem, com intensa monômeros chamados de nucleotídeos. atividade física, deve consumir em torno de Cada nucleotídeo é formado por uma base 56g diária de proteínas. Os alimentos de nitrogenada, origem animal, como carne, leite e ovos são desoxirribose) e fosfato (Figura 10): um açúcar (ribose ou ricos em proteínas. Os vegetais também têm proteínas porém em quantidades menores. Por exemplo, uma fatia de pão de trigo integral possui 2 gramas de proteína, mas como essa é uma proteína de baixa qualidade, um adulto jovem precisaria comer 72 fatias diárias para obter as 56 g de proteínas. Figura 10. Nucleotídeo 11 Estes monômeros se unem para 1) Capacidade de replicação. Com o auxílio formar dois tipos de polímeros, o DNA (ácido de enzimas, a dupla hélice de DNA se abre, desoxirribonucléico) formando fita simples e pode ser duplicada, e o RNA (ácido ribucléico). originando Os ácidos nucléicos são formados pela união de nucleotídeos (Figura 11). cópias exatamente iguais a molécula original. 2) Capacidade de conter a informação da seqüência de aminoácidos que compõe as proteínas. As seqüências de nucleotídeos do DNA determinam a estrutura primária das proteínas. Figura 11- Molécula de ácido nucléico Na molécula de DNA encontramos as seguintes bases: adenina (A); citosina (C); guanina (G) e timina (T) e são chamados de desoxiribonucleotídeos, porque o açucar é a desoxiribose. A molécula de DNA é formada por uma cadeia dupla, tendo algumas características importantes. Sempre que existir uma adenina em um lado da cadeia, Figura 13- Replicação da molécula de DNA teremos uma timina no outro e sempre que ocorrer uma citosina em um lado da cadeia, O RNA é uma molécula formada por uma teremos uma guanina no outro. Chamamos única cadeia, ou seja, é fita simples. Os isto de complementariedade das bases, ou nucleotídeos do RNA são chamados de seja, as timinas sempre fazem par com as Ribonucleotídeos porque o açúcar é a ribose. adeninas e as citosinas sempre pareiam com No RNA a base uracila (U) substitui a Timina as guaninas. do DNA. Os diferentes tipos de RNAs são extremamente importantes para fazer com que a informação genética contida no DNA seja traduzida em uma seqüência de aminoácidos, originando as proteínas (será Figura 12. Estrutura da molécula de DNA mostrando a complementariedade das bases A=T; C=G. visto adiante). 2.3. GLICÍDIOS Duas propriedades resultam da estrutura do DNA: importantes Os glicídios, também chamados de carboidratos ou açúcares são polióis de aldeídos ou cetonas, divididos em: 12 a) Monossacarídeos - como por exemplo a glicose e a frutose. Os monossacarídeos podem unir-se formando dissacarídeos. Por exemplo, a sacarose (açúcar de cana) é a união de uma frutose e uma glicose. A maltose é formada pela união de duas moléculas de glicose e a lactose (açúcar do As principais funções desempenhadas pelos glicídios são: -ENERGÉTICA: são fonte de energia para a célula (ou reserva de energia) - ESTRUTURAL: formam as paredes das células vegetais -RECONHECIMENTO: estão leite) é formada pela união de galactose e envolvidos no processo de reconhecimento glicose. célula-célula nos tecidos dos animais pluricelulares, através do glicocalix. 2.4. LIPÍDIOS Os lipídios ou gorduras desempenham importante papel na estrutura e função celular. Há várias classes de lipídios e cada uma possui funções biológicas específicas. Os ácidos graxos são a unidade fundamental da maioria dos lipídios e junto com os triglicerídios constituem as principais gorduras neutras que funcionam como reservas energéticas. Figura 14 -Exemplo de alguns monossacarídeos b) Polissacarídeos - são formados pela união de vários POLÍMEROS DE monossacarídeos (são GLICOSE) três Os Fig 15 - Exemplos de ácidos graxos. polissacarídeos mais importantes são o AMIDO (reserva de energia dos vegetais), o GLICOGÊNIO (reserva de energia dos Já os fosfolipídios e os esfingolipídios são lipídios derivados dos animais) e a CELULOSE (constituinte da triglicerídios. parede das células vegetais). A diferença cadeias de ácido graxo é substituída por uma entre esses polissacarídeos está na ligação estrutura química POLAR. Desta forma, Nesses lipídios, uma das química que une as glicoses. 13 estas moléculas terão uma parte polar muito específica, a amilase desdobra o (hidrofílica) e uma parte apolar (hidrofóbica) amido em glicose. Os fosfolipídios e esfingolipídios são Se ao invés de acrescentar saliva na componentes fundamentais das membranas mistura, acrescentássemos os aminoácidos biológicas (será visto adiante). que compõem a amilase, iria ocorrer a Outra classe de lipídio é a dos reação de degradação do amido? É claro que esteróides que podem ter função estrutural, não. Uma pilha de tijolos não é o mesmo que como o colesterol que é um componente da uma casa. Uma mistura de aminoácidos membrana função isolados, não possui as propriedades da desempenhada pelos esteróis é a hormonal, proteína que poderia ser formada pela união como desses aminoácidos. plasmática. por exemplo Outra a testosterona, progesterona. Para que uma proteína desempenhe uma função definida, é necessário que ela tenha uma forma específica. A estrutura ESTRUTURAS SUPRA-MOLECULARES E A EMERGÊNCIA DE NOVAS PROPRIEDADES Um conceito importante para o entendimento dos seres vivos é o de “propriedades emergentes”. Vejamos um exemplo bem simples: um professor demonstra a ação enzimática da amilase salivar, através de um experimento muito comum, que pode (e deve) ser realizado em sala de aula. Nesse experimento, uma solução de Maizena é fervida e distribuída em dois frascos. Em apenas um dos frascos adiciona-se um pouco de saliva e ,depois, uma gota de lugol (ou solução de iodo) é acrescentada em ambos os frascos. Neste caso, a alteração de cor que se observa no frasco é explicada pelo fato da enzima presente na saliva ter a PROPRIEDADE de degradar o amido da Maizena. Essa é uma propriedade catalítica tridimensional de uma proteína é resultado da união de aminoácidos em uma seqüência também específica. Portanto, é a ligação sucessiva de um aminoácido ao outro que irá determinar a forma final de uma proteína e sua capacidade funcional. As macromoléculas apresentam propriedades novas que não estão presentes nos seus componentes isolados. A amilase, por exemplo, tem a capacidade de degradar o amido, porém esta propriedade não está presente em nenhum dos aminoácidos que compõem a amilase. Quando, pela união de aminoácidos em uma seqüência específica, a macromolécula amilase se forma, EMERGE uma nova propriedade (capacidade de degradar a amido) que não está presente nos seus componentes. As propriedades emergentes são um atributo da forma esterioquímica da macromolécula. Do mesmo modo que a forma da tesoura confere a esse instrumento uma propriedade nova (capacidade de 14 Os cortar), a forma da proteína amilase lhe permite catalisar a reação amido➜glicose. ribossomos são estruturas capazes de auto-montagem, isto é, basta celular colocarmos todos os componentes juntos e, depende das propriedade emergentes de em condições físico-químicas apropriadas, suas macromoléculas. Mas as células não automaticamente são formadas apenas de macromoléculas, ribossomo montam-se. É possível, portanto, elas desmontar e remontar os ribossomos em Muito do possuem funcionamento também ESTRUTURAS estruturas supramoleculares formadas sub-unidades do tubos de ensaio. E sempre, após a auto- SUPRAMOLECULARES. Estruturas as por são várias macromoléculas. Um exemplo de estrutura montagem, uma PROPRIEDADE nova EMERGE : “os ribossomos são capazes de fazer síntese de proteínas”. Todas as organelas intracelulares supramolecular é o ribossomo (Figura 16). Cada sub-unidade do ribossomo é formada são por várias macromoléculas. A sub-unidade mitocôndria, por exemplo, é formada por um maior é formada por 3 diferentes RNAs grande número de proteínas, lipídios, DNA, ribossômicos: um com 120 nucleotídeos RNA... que formam suas membranas, os (nts), outro com 160 nts e o terceiro com seus ribossomos, corpúsculos elementares, 4700 nts. Além dos RNAs a sub-unidade etc... maior apresenta 49 diferentes proteínas associarem, (denominadas L1, L2, L3, ... até L49). Na possui propriedades novas que não estão sub-unidade menor temos apenas um rRNA presentes nos componentes isolados. Por de 1900 nts associado a 33 proteínas exemplo, a síntese quimiosmótica do ATP só (denominadas S1, S2, ..até S33). é possível graças à estrutura da mitocôndria que estruturas Estas é supramoleculares. macromoléculas, formam dada pela a A ao se mitocôndria que totalidade de seus componentes associados, e não pode ser realizada apenas por um ou outro componente da mitocôndria. Este é outro exemplo de uma propriedade emergente, que só se manifesta a partir do surgimento de uma estrutura com organização supramolecular. Figura 16 .Ribossomo dos eucariontes 15 UNIDADE II dependia exclusivamente do microscópio óptico e de alguns corantes. Neste período, o que mais chamava a atenção, quando se A ORGANIZAÇÃO CELULAR observava uma célula, era a presença do O tema de estudo da Biologia, a núcleo. Posteriormente, verificou-se que, no VIDA é uma propriedade emergente de uma núcleo, estavam os cromossomos e inferiu- supraestrutura: a célula. A Vida originou-se se que estes eram depositários dos genes. na Terra a +/- 3.5 bilhões de anos atrás Assim, a idéia de que, no núcleo, quando “montaram-se” as primeiras células. estava o controle do funcionamento celular é O CONCEITO DE CÉLULA MÍNIMA relativamente antiga, porém por muito tempo A definição mais comum para célula é: “unidade morfo-fisiológica dos seres não foi possível saber exatamente como esse controle era exercido. vivos”. Mas o que caracteriza uma célula? Quais são os componentes MÍNIMOS para que uma estrutura possa ser considerada uma célula? De uma forma geral, quando perguntamos como é constituída e como funciona uma célula, a resposta mais comum é: “...formada por membrana, citoplasma e Figura 17. Aspecto geral da organização núcleo. A membrana reveste a célula, celular de um procarionte. fazendo as trocas citoplasma contém responsáveis célula e com pelo o o as meio, organelas funcionamento núcleo o controla CARACTERÍSTICAS BÁSICAS DE UMA da CÉLULA (uma concepção atual) este Se a descrição de uma célula como funcionamento.” um conjunto de membrana, citoplasma e Devemos considerar, entretanto, dois núcleo é uma visão originária do fim do aspectos importantes: século 1) As bactérias e demais procariontes são características da organização celular em organismos celulares e não possuem núcleo; uma visão contemporânea? 2) Quando dizemos que o núcleo “controla” o funcionamento celular, não fornecemos nenhuma idéia de como isto ocorre. Esta visão da e século passado e, nessa época, o estudo da e do funcionamento quais seriam as Para responder essa questão temos que pensar em características que sejam comuns a todas as células, sejam elas constituição funcionamento celular é originária do fim do estrutura passado, procarióticas e eucarióticas. São quatro as partes essenciais que podemos encontrar em toda célula: celular 16 ① Membrana - delimita a célula, separando ambiente. Estas trocas são controladas pela os demais elementos celulares do meio membrana plasmática. Por isto a principal ambiente e regulando as trocas da característica célula com o meio; PERMEABILIDADE SELETIVA. da membrana é a ② Maquinaria metabólica – conjunto de Assim, a membrana é permeável enzimas e proteínas capazes de utilizar porque deixa passar substâncias através a matéria e energia do meio ambiente dela, porém, faz isso seletivamente, ou seja, para realizar as funções celulares; escolhendo o que deve entrar e sair da Informação genética - célula. ③ como, quando e informação de onde montar as Para se entender como a membrana proteínas da máquina metabólica e realiza demais proteínas estruturais da célula seletiva, ④ Maquinaria de síntese protéica – é constituída por ribossomos, mRNAs e tRNAs capazes informação de genética transformar em metabólica. função temos de que permeabilidade estudar como a membrana é constituída quimicamente e como estes componentes atuam. a maquinaria esta Os lipídios da membrana são diferentes dos lipídios que são usados como reserva de energia (ácidos graxos e Estes componentes celulares podem triglicerídios). facilmente nos energéticos são insolúveis em água, os Mycoplasma, um tipo de bactéria, que são os lipídios que compõe a membrana (chamados seres celulares estruturalmente mais simples de fosfolipídios, esfingolipídios e outros) são que conhecemos (Ver Figura 17). ANFIPÁTICOS, ou seja, têm uma parte da ser reconhecidos Enquanto os lipídios molécula que é eletricamente carregada e Vamos, a seguir, tratar de cada uma hidrofílica (solúvel em água), e outra parte dessas partes que compõem o que podemos que é hidrofóbica (insolúvel em água) - chamar de uma célula mínima. Figura 18. MEMBRANA CELULAR O que delimita a célula do resto do universo é uma fina membrana LIPO- Figura 18- .Estrutura de um PROTÉICA chamada membrana plasmática Fosfolipídio ou membrana celular. A célula não pode se isolar do meio Tendo esta característica anfipática, em que se encontra, precisando manter uma os fosfolipídios, quando colocados em água, constante troca de matéria e energia com o vão ter uma organização típica, formando 17 finas membranas em BICAMADAS, conforme proteínas da membrana também terão uma representado na Figura 19. parte hidrofílica e uma parte hidrofóbica. Figura 19 – Formação de bicamadas lipídicas quando os fosfolipídios são colocados em água. Desta forma, sempre que colocarmos lipídios anfipáticos em água, formar-se-ão Figura 20. Estrutura das proteínas “bolhas” e a água estará tanto do lado de da membrana dentro da “bolha”, quanto do lado de fora (Figura 19). A água e todas as substâncias hidrossolúveis, como os açúcares, aminoácidos, nucleotídeos, por não serem solúveis em lipídios, não podem passar pela camada hidrofóbica da membrana. Por terem tanto regiões hidrofóbicas como regiões hidrofílicas, as proteínas anfipáticas vão se intercalar entre os fosfolipídios. (figura 20 e 21) O Modelo do MOSAICO FLUÍDO das membranas biológicas explica Como, então, a membrana realiza a sua função de permeabilidade seletiva? membranas. Segundo este modelo, temos Só existe permeabilidade seletiva graças à ação do outro componente das membranas: as PROTEÍNAS. organismos estão relacionadas às proteínas. proteínas das membranas também são ANFIPÁTICAS, ou seja, elas têm uma parte formada por aminoácidos polares (com carga elétrica) e outra parte constituída aminoácidos preponderantemente apolares. Desta uma bicamada de lipídios com proteínas intercaladas nesta bicamada. Como sempre, as atividades de funcionamento dos As como se organizam e funcionam essas forma, As partes hidrofílicas dos fosfolipídios e das proteínas ficam voltadas para as superfícies interna e externa da membrana em contato com a água. As partes hidrofóbicas proteínas dos ficam na fosfolipídios região e interior das da membrana (figura 21) com as 18 TRANSPORTE DE SUBSTÂNCIAS PELA MEMBRANA As substâncias passam pela membrana de três formas diferentes: 1) Difusão simples: Algumas substâncias como o O2, CO2, álcool e éter, por serem solúveis tanto em água como em gorduras, podem passar fosfolipídios. Figura 21- Modelo do MOSAICO FLUIDO da membrana biológica diretamente Para estas pelos substâncias, a membrana não constitui uma barreira, e suas moléculas vão difundir de onde elas estão mais concentradas para aonde estão menos Este modelo é chamado de concentradas (1 na Figura 22). MOSAICO, porque os componentes da membrana se organizam como um mosaico (associação de pequenas peças que se encaixam ou sobrepõe para formar uma estrutura). A denominação de Mosaico FLUÍDO é justificada pelo fato de seus componentes (fosfolipídios e proteínas) não serem fixos na membrana, podendo apresentar movimentos laterais. Podemos resumir a atuação dos componentes da membrana da seguinte Figura 22 – Passagem de substâncias através da membrana forma: a) OS FOSFOLIPÍDIOS atuam como uma A maioria das substâncias não pode barreira, impedindo que as substâncias que atravessar livremente pela membrana e estão dentro da célula saiam e evitando que precisam as substâncias que estão fora da célula passagem pode ocorrer de duas maneiras: entrem. 2) b) AS “portões” PROTEÍNAS (tecnicamente funcionam chamados como de passar Transporte pelas proteínas. passivo ou Essa difusão facilitada. O transporte passivo ocorre, quando uma substância está mais CARREADORES ou POROS), por onde concentrada de um lado da membrana do passam as moléculas; são as elas que que do outro, e há interesse da célula que reconhecem as substâncias que devem esta substância passe pela membrana. entrar ou sair da célula. Proteínas específicas, CARREADORES, chamadas permitem que de essas 19 substâncias atravessem (geralmente através de aberturas ou canais nas próprias proteínas). NA INTERNET: Entenda melhor a membrana celular comparando- No caso do transporte passivo, não há gasto de energia, porque é a favor do a com bolhas de sabão: www.sbbq.org.br/revista/artigo.php?artigoid=41 gradiente de concentração ( 2 na Figura 22). 3) Transporte Ativo: Quando é do interesse da célula transportar substâncias contra um gradiente de concentração, (ou seja, de onde tem pouco de uma substância para aonde já existe bastante dessas mesmas moléculas) a célula precisa gastar energia para fazer esse transporte (3 na Figura 22). Como podemos ver, somente moléculas não muito grandes podem entrar e sair da célula pelos carreadores. Moléculas grandes como as proteínas, ácidos nucléicos ou polissacarídeos, somente em condições muito especiais podem passar BRINCAR COM BOLHAS DE SABÃO PODE AJUDAR A ENTEDER A pela membrana. Moléculas grandes (macromoléculas), assim como estruturas ainda maiores como vírus ou células não passam diretamente pela membrana celular, e só entram na célula através de mecanismos de TRANSPORTE DE MASSA, chamado endocitose (fagocitose e pinocitose). Mas vale ressaltar que através da fagocitose e pinocitose as substâncias ou estruturas entram “passam a na célula, membrana” envolvidas em membrana. mas pois não entram MEMBRANA SEGUNDO O MODELO MOSAICO-FLUIDO 20 MAQUINARIA METABÓLICA os em energia ou em outras moléculas estruturais da célula; as proteínas motoras O que permite que uma lactobactéria (bactéria do iogurte) se desenvolva que produzem movimento dos componentes celulares, etc... No caso específico do exemplo que tão bem no leite, transformando-o em iogurte procrie estamos trabalhando, a aceto-bactéria terá maravilhosamente no vinho, transformando-o as proteínas de membrana para retirar do em vinagre? Se colocarmos a bactéria do vinho os “nutrientes” apropriados. No interior vinho no leite, ela não vai se desenvolver, o da célula, enzimas transformarão estes mesmo acontecendo com a bactéria do nutrientes em mais macromoléculas de iogurte, quando colocada no vinho. Por que aceto-bactéria. Enfim, possibilitam o “sonho isto acontece? primordial” de toda aceto-bactéria: “tornar-se e uma aceto-bactéria se Cada célula, mesmo simples como duas aceto-bactérias...” uma bactéria, possui enzimas e outras proteínas que a capacita a desempenhar as INFORMAÇÃO GENÉTICA funções para as quais está adaptada. A lacto-bactéria possui enzimas para quebrar a Porque uma aceto-bactéria colocada lactose e as proteínas do leite. Já a aceto- no leite não produz as enzimas necessárias bactéria possui enzimas para transformar o para usar o açúcar e as proteínas do leite álcool em ácido acético e usar outros como nutrientes? Ou, colocando a mesma nutrientes encontrados no vinho. Estas duas questão em um outro exemplo: sabemos que bactérias possuem diferentes maquinarias a celulose é um polissacarídeo formado de metabólicas que as tornam adaptadas para moléculas de glicose. No entanto, se por um explorar recursos diversos. motivo As diferenças que ocorrem no qualquer (celulose) para só tivéssemos comer, papel acabaríamos funcionamento entre células são explicadas morrendo de inanição por falta de energia, pela variação nas proteínas existentes nelas. embora estivéssemos ingerindo um polímero Chamamos de maquinaria construído com “glicose”. Outros organismos, e como cavalos, vacas ou baratas são capazes proteínas que vão ser responsáveis pelo de aproveitar a glicose presente na celulose funcionamento da célula (ou seja, pelo do papel. Nos dois exemplos, o que falta é a metabolismo as informação genética de como fazer as captam enzimas necessárias para aproveitar uma metabólica proteínas o conjunto celular). da de Por membrana enzimas exemplo, que nutrientes do meio externo e os transportam determinada para o interior da célula; as enzimas que vão nutriente. transformar estes nutrientes, através de A complexas rotas bioquímicas, transformando- molécula informação como fonte genética de está armazenada nas células sob forma de ácidos 21 nucléicos. Para (procarióticas todas ou macromolécula as células eucarióticas), informacional é o a DNA. seqüência de DNA que é essencial para uma função específica. Três tipos de genes são reconhecidos: Somente alguns vírus apresentam suas informações armazenadas sob forma de RNA. 1) genes proteínas. A informação genética total, carregada por um organismo ou célula, é São que codificam transcritos para para RNA mensageiro (mRNA) e subseqüentemente traduzidos, nos ribossomos, para proteínas. denominada de GENOMA. Por exemplo, na nossa espécie, o genoma das células somáticas é constituído por 46 moléculas de 2) genes que especificam RNAs DNA. Cada uma dessas moléculas se funcionais, organiza sob forma de um cromossomo, ou (rRNA); RNAs transportadores (tRNA) e seja, cada cromossomo contém uma única RNAs molécula regulatórias na célula como os snoRNA e de começando DNA em cromossomo e que uma é contínua, extremidade prolongando-se do como os RNAs ribossômicos que desempenham funções miRNA. sem interrupção até a outra extremidade. Temos também uma 47a molécula de DNA que é o cromossomo mitocondrial. 3) genes não transcritos. São seqüências de DNA que, embora não sejam O genoma de células mais simples, transcritas, desempenham alguma função. como as bactérias, está organizado em um Por exemplo, os genes de replicação, único cromossomo circular. Em torno de envolvidos na duplicação do DNA; genes de 2000 genes estão presentes no genoma de recombinação, uma bactéria, como a Escherichia coli. envolvidas no processo de crossing-over; O cromossomo bacteriano como de E. coli possui aproximadamente 4,2x 10 6 pares de bases. Ou seja, se contássemos o número de diferentes que são seqüências teloméricas, proteção das seqüências envolvidas extremidades na dos cromossomos... nucleotídeos ATCCGGTAACC... em uma das fitas do DNA, este de, Assim, o genoma contém um grande aproximadamente, 4.200.000 nucleotídeos. É número de genes que, quando necessários, na são ativados, ou seja, são copiados em RNA seqüência de número bases seria desta imensa molécula de DNA que “está escrito” a informação genética, nos genes (ver Figura 23). dessa bactéria. Estudos moleculares recentes tem ampliado o conceito de gene: é uma 22 Figura 23) Exemplo hipotético do genoma de um procarionte O genoma contém muitos genes. Alguns são genes para tRNA, outros para rRNA e outros ainda codificam para polipeptídios (mRNA). A transcrição de um gene depende da região regulatória desse gene. Um dos principais elementos da região regulatória do gene é o sítio ou região promotora que corresponde ao local de entrada da RNA Figura 24) Processo de transcrição dos genes ribossômicos (rRNA); dos RNAs transportadores tRNA e dos RNAs mensageiros mRNAs. È mostrado também, a união de todos estes componentes no processo de TRADUÇÃO, que é a síntese de proteínas. polimerase. Essa enzima, responsável pela transcrição de DNA em RNA, reconhece a região promotora do gene, se associa a esse conjunto de bases e passa a se deslocar pela fita molde de DNA, fazendo a ligação entre os ribonucleotídios complementares à fita de DNA. No fim do processo de transcrição temos uma fita de RNA que,após passar por algumas modificações (processamento do RNA), torna-se funcional e poderá executar as diferentes funções necessárias à síntese de proteínas. Figura 25 – Fluxo da informação genética dentro da célula. O DNA se duplica pelo processo chamado de transcrição. A informação nele contida é copia em moléculas de RNA em um processo chamado de transcrição. Os RNAs participam do processo de síntese de proteínas (tradução) 23 MAQUINARIA DA SÍNTESE PROTÉICA tenha No citoplasma existem todos os elementos necessários polipeptídios, que à síntese chamamos uma trinca de bases que seja complementar as três bases do mRNA que de estão naquele momento no sítio A. A região de do tRNA que entra em contado com as bases do MAQUINARIA DE SÍNTESE PROTÉICA: mRNA dentro do ribossomo é denominada de anticódon. De um modo simplificado, as moléculas de tRNAs são > ribossomos representadas >RNAs transportadores como tendo em uma extremidade a região do códon e na outra a > RNA mensageiro região de ligação com o aminoácido. Os tRNAs que possuem o mesmo anticódon A seqüência de eventos que resulta transportam o mesmo aminoácido. Por na síntese de uma proteína pode ser exemplo, se o anticódon for AAA, esse tRNA resumida da seguinte forma : estará c Transcrição do DNA em RNA (nos 1, 2 e 3 na Figura 21). transportando para dentro do ribossomo o aminoácido fenilalanina. Alguns aminoácidos são transportados por mais de d Processamento do RNA para que se torne funcional (ocorre em eucariontes). um tipo de tRNAs. Por exemplo, os tRNAs que possuem anticódons GCA, GCG, GCU Montagem do ribossomo - a ou GCC transportam (ver tabela do código subunidade menor do ribossomo reconhece genético) para o ribossomo arginina. Desse o início da fita de mRNA e se liga ao mRNA . modo, as três bases do mRNA (códon) que Essa ligação permite que a subunidade maior ocupam o sítio A, ao selecionar qual o tRNA se associe à subunidade menor, formando-se que permanecerá dentro do ribossomo, assim um ribossomo capaz de realizar a determinam qual o aminoácido que será síntese de proteínas. adicionado à cadeia polipeptídica. O primeiro e f Primeira ligação Peptídica - o ribossomo se desloca sobre a fita de mRNA e quando encontra nessa fita a seqüência de base AUG, cria no seu interior, dois sítios, um destinado a receber os tRNAs que trazem os aminoácidos para serem ligados à cadeia polipeptídica (sítio A) e outro que será ocupado pelo transportador que mantém a cadeia polipeptídica nascente (sítio P). tRNA a ocupar o sítio A, deve ter anticódon complementar à trinca AUG. Esses tRNAs sempre transportam uma metionina, portanto esse é o primeiro aminoácido de toda a síntese de proteínas. A metionina inicial pode ser removida depois, o que significa que nem todas as proteínas funcionais terão esse aminoácido presente no início da cadeia. g Crescimento da cadeia Qualquer tRNA pode entrar no ribossomo e polipeptídica - quando os sítios A e P estão ocupar o sítio A, porém para que o tRNA ocupados por tRNAs, que tenham anticodons permaneça nesse sítio é necessário que ele complementares ao mRNA, na parte superior 24 da subunidade maior do ribossomo, ocorre a polipeptídica. ligação entre os aminoácidos que esses citoplasma, vários ribossomos realizando tRNAs transportam. Quando essa ligação tradução a partir da mesma fita de mRNA. ocorre, o ribossomo se desloca sobre a fita Desse modo, a célula pode originar várias de mRNA e esse deslocamento corresponde moléculas da mesma proteína com um único exatamente a três nucleotídios. Assim, a RNA mensageiro. É comum encontrar, no cada ligação entre dois aminoácidos, um h Final da síntese - os ribossomos novo códon ocupa o sítio A e determina a seguem se deslocando na fita de mRNA e entrada de um novo tRNA que trará o quando o sítio A é ocupado por uma trinca próximo aminoácido a ser ligado. Com o UAA, ou UAG ou UGA o crescimento da deslocamento do ribossomo, o tRNA que cadeia polipeptídica é interrompido. Nenhum trouxe o último aminoácido adicionado passa tRNA possui anticodons complementares a a ocupar o sítio P e o tRNA, que antes estava essas trincas e por isso esses codon são nesse sítio, é liberado pelo ribossomo, chamados “sem sentido” e sinalizam o fim da podendo voltar a participar da síntese de tradução. Depois que o ribossomo atinge um proteínas quando estiver de novo ligado a um desses codon, as subunidades se separam. aminoácido específico. Por exemplo, na A Figura 26, no início da tradução, o sítio P associar novamente com a parte inicial de está ocupado pelo códon AUG e pelo tRNA um da metionina, e o sítio A está ocupado com o processo de tradução. subunidade mRNA, menor iniciando pode, então, se novamente um mecanismos de códon UUU e o tRNA da fenilalanina. Após a ligação entre os dois primeiros aminoácidos (metionina e fenilalanina), com o Através dos deslocamento do ribossomo, o tRNA da transcrição e tradução, a informação genética metionina perde sua ligação com esse “se transforma” em maquinaria metabólica. aminoácido e sai do ribossomo. O tRNA da Assim, em uma célula simples como uma fenilalanina passa, então, a ocupar o sítio P lacto-bactéria, e se mantém ligado à fenilalanina, que por genoma é traduzida, isto é, esta informação é sua vez está ligada à metiona. À medida que capaz de conduzir a síntese de um bom o cadeia número de proteína que estarão aptas a polipeptídica vai crescendo, sempre ligada ao utilizar os “nutrientes” presentes no leite, para tRNA que acabou de fornecer o último manter a estrutura celular e ainda criar mais aminoácido. macromoléculas e permitir o crescimento ribossomo se desloca, a Deve-se ressaltar que, logo após o a informação contida no desta bactéria e posterior reprodução. primeiro deslocamento do ribossomo, o códon de iniciação AUG fica liberado e outro ribossomo pode se associar ao mRNA e iniciar a síntese de uma segunda cadeia 25 Unidade III DA CÉLULA PROCARIÓTICA PARA A CÉLULA EUCARIÓTICA. Podemos dizer que uma bactéria é um bom exemplo de uma célula “mínima”. Vimos anteriormente membrana, a como maquinaria atuam a metabólica, a informação genética e a maquinaria da síntese protéica, para fazer uma bactéria funcionar. Mas se as bactérias são ditas Figura 26) Processo de tradução de uma proteína. A) montagem do ribossomo B) “células mínimas”, é porque existem células muito mais complexas, as eucarióticas. O que elas possuem que não está iniciação do processo de tradução C e D) elongação da cadeia de aminoácidos. Cada presente nas células bacterianas? ªc Um sistema de membranas que tRNA que se liga ao ribossomo, deixa um aminoácido. compartimentaliza as diversas funções da célula, A TABELA DO CÓDIGO GENÉTICO chamado de SISTEMA DE ENDOMEMBRANAS; ªd Uma rede de proteínas filamentosas que dão forma e mobilidade para a célula, chamada de CITOESQUELETO. A INFORMAÇÃO GENÉTICA NOS EUCARIONTES A eucariontes informação genética apresenta dos algumas peculiaridades. Nas células eucariontes o DNA está sempre complexado com proteínas. As proteínas que se associam ao DNA são de dois tipos: as histonas ou Diga que proteína resulta do seguinte mRNA: UUAUGGUUAGUCGUAGAUAUUGA proteínas básicas e as proteínas ácidas. Quando a célula não está em divisão (durante a interfase), a molécula de DNA 26 apresenta seu grau mínimo de enrolamento, constituindo a Cromatina. Em (C) a fibra de nucleossomos se Conforme enrola sobre si mesma, originando a fibra em podemos ver na Figura 27, a cromatina solenóide, em um formato de “fio de apresenta vários graus de compactação: em telefone”; é nesse formato de solenóide que (A) temos a molécula de DNA com seu a cromatina se encontra no núcleo na diâmetro de 2 namômetros (nm = 10 –9 m) interfase. não associado a nenhum tipo de proteína. A Algumas proteínas ácidas unem as dupla hélice sem proteínas associadas não é encontrada no núcleo das células, pois em seu estado funcional o DNA eucariótico sempre está ligado a proteínas. Em (B) a molécula de DNA apresenta-se enrolada nas histonas, formando as fibras dos nucleossomos com 11 nm. Quando a célula inicia o processo de divisão, pode-se notar uma mudança no aspecto do núcleo. A medida que a célula avança na fase de prófase, é possível visualizar, no núcleo, uma fibras da cromatina formando às alças de cromatina (letra D na figura). As alças vão sendo unidas em grupos cada vez mais condensados, no centro da cromátide. No fim desse processo, o cromossomo atinge seu grau máximo de dobramento, que corresponde ao cromossomo metafásico, ou seja, ele é observável na fase de metáfase da divisão celular. (letras E e F na figura abaixo). condensação progressiva da cromatina. Para dar uma idéia de como é longo os fios de cromatina, apresentamos, na Figura 28, a cromátide de um cromossomo mitótico que teve as proteínas ácidas removidas. Esse tratamento permitiu que as alças constituídas pela fibra de cromatina se desprendessem do centro da cromátide. A informação genética está “escrita” na seqüência de bases que o DNA apresenta. O genoma nuclear de uma célula humana contém, aproximadamente, 6.000.000.000 pares de bases, compondo as 46 moléculas de DNA dos cromossomos. O menor cromossomo humano, o de número Figura 27- ver texto 21, possui 50.000.000 pares de bases. Você pode imaginar isso? 27 Ter genomas característica dos organismos grandes é uma eucariotes. apresentam Esses grandes As principais vantagens da compartimentalização celular são:  Permitir a separação e a associação dos quantidades de DNA em suas células, mas sistemas enzimáticos; boa parte desse DNA não é considerado  Aumentar a superfície interna da célula, gene, pois não é transcrito, e não apresenta função para a célula. aumentando o campo de ação enzimática e facilitando as reações químicas, principalmente as que ocorrem em cadeia;  Permitir diferentes valores do pH intracelular. Componentes do sistema de endomembranas ª Retículo endoplasmático: O retículo endoplasmático é constituído por endomembranas que limitam túbulos (pequenos tubos) e cisternas (cavidades em forma de sacos achatados). O retículo endoplasmático é dividido em: cReticulo endoplasmático liso- Figura 28 – visualização de uma cromátide em um cromossomo forma células todo eucarióticas dividido em são estruturas membranosas. Cada compartimento tem a sua função específica. As membranas que delimitam estas organelas são do tipo mosaico fluído. Assim, os lipídios destas membranas isolam os conteúdos destes compartimentos e as proteínas controlam o que deve entrar ou sair de cada compartimento. enzimas especificas reações químicas Além disso, proporcionam características funcionamento de cada organela. está envolvido em síntese de lipídios e desintoxicação celular; compartimentalizadas, isto é, possuem o citoplasma túbulos, transporte e armazenamento de substâncias, SISTEMA DE ENDOMEMBRANAS As de tem a as do dRetículo endoplasmático rugoso- possui ribossomos aderidos a sua superfície citoplasmática; como os ribossomos fazem a síntese protéica, o retículo endoplasmático rugoso está envolvido na síntese protéica, além de transporte e armazenamento de substâncias (principalmente proteínas). ª Complexo de Golgi: É formado por várias vesículas ou cisternas achatadas em forma de discos. Nestas vesículas ocorre a maturação (modificações químicas) de substâncias (principalmente proteínas ribossomos rugoso). que do foram sintetizadas retículo pelos endoplasmático Após esta maturação, essas 28 proteínas terão dois destinos: c podem ser temos as células glandulares. As células do enviadas para fora da célula (secreção);d pâncreas produzem insulina, que é uma podem ser enviadas para outra organela (lisossomo) para participar da digestão proteína importante para todas as células do organismo. A esta exportação de substância chamamos SECREÇÃO CELULAR. intracelular. A secreção celular tem várias FASES. Vamos ver o exemplo da secreção da insulina para entendermos estas fases. A insulina é uma proteína, portanto, tem uma seqüência específica de aminoácidos. Esta seqüência está codificada no gene da insulina que está no núcleo da célula. n A primeira fase da secreção celular ocorre então, no núcleo da célula, onde o gene é transcrito em RNA mensageiro (mRNA). o Este mRNA é então processado e sai do núcleo. No citoplasma, ele irá se ligar aos ribossomos no retículo endoplasmático rugoso (RER) e, lá, ocorre a síntese da proteína (insulina) que entra no RER.p A insulina é transportada do RER até o Figura 29- -Sistema endomembranas da célula eucariótica Complexo de Golgi, onde sofrerá algumas modificações (amadurecimento) e será A Figura 29 apresenta o esquema de uma empacotada em vesículas.q As vesículas célula eucariótica: produzidas pelo mp=memb. plasmática; ri= ribossomos; mi= chamadas vesículas mitocôndrias; REG= retículo endoplasmático levedas para fora da célula. Neste caso, a granular (rugoso); REA= ret. end. agranular insulina cairá na corrente sanguínea e será (liso); c= centríolo; G= golgi; Li= lisossomos; levada para todas as células do organismo. Complexo de Golgi, secretoras, serão Pe= peroxissomos; vs= vesícula secretora; ve= vesícula endocítica; mv= microvilosidade. ª Lisossomos: São vesículas que contém hidrolases ácidas (enzimas digestivas que atuam em pH Secreção celular: ácido) e estão envolvidas no processo de Muitas células produzem substâncias digestão intracelular. de exportação, isto é, são substâncias que vão atuar fora da célula. Como exemplo, 29 às Digestão intracelular: vezes o lisossomo primário Chamamos de digestão intracelular a quebra envolve partes da própria célula, que por de macromoléculas como proteínas, ácidos algum motivo não estão mais funcionais, nucléicos seus formando o AUTOFAGOSSOMO, que é um no lisossomo que digere uma parte da célula interior da célula. Para fazer estas quebras, (AUTOFAGIA - auto= por si próprio / fagos= são necessárias enzimas (PROTEASES, comer ). e respectivos polissacarídeos monômeros, em ocorrendo DNAses, etc...). Estas enzimas não podem ficar soltas no interior da célula, pois Como podemos notar, tanto na digestão quebrariam as proteínas, DNA.... da própria celular como na secreção celular, nenhuma célula. Por isso elas são isoladas no interior parte do sistema de endomembranas atua de um compartimento, os lisossomos aonde sozinha, ao contrário, são processos em que ocorre a digestão intracelular. várias partes do sistema de endomembranas A digestão intracelular também atuam em conjunto. ocorre em FASES: nop as três primeiras fases da digestão são idênticas a secreção ª Peroxissomas: celular, uma vez que para fazer digestão, Os precisamos pequenas enzimas que quebrem peroxissomas ou vesículas microssomas de forma são esférica, macromoléculas, e enzimas são proteínas, e semelhantes aos lisossomos, porém as a mensagem de como fazer as proteínas enzimas que carregam são muito diferentes. estão nos genes; q na quarta fase, ocorre a Os internalização do que vai ser digerido através (peroxidases, da vesícula fagocitose ou internalizar o endocítica, carregam catalases e OXIDASES superoxido ou seja, por dismutase) que são enzimas que quebram as a célula vai formas dentro de pinocitose, alimento peroxissomas ativas do oxigênio (RADICAIS uma LIVRES). Como exemplo de radicais livres vesícula (vesícula endocítica) e r ocorre a podemos citar a água oxigenada (H2O2). A união da vesicula endocítica com o lisossoma água primário (produzido no complexo de golgi, peróxido de hidrogênio é uma molécula muito contendo as enzimas já prontas para atuar reativa, podendo reagir com as proteínas e na digestão). Da união da vesícula endocítica outras macromoléculas quebrando-as. Por com o lisossomo primário formar-se-á o isso muitas pessoas usam água oxigenada lisossoma a para “branquear” os cabelos, pois a molécula digestão. Após a digestão, os monômeros de H2O2 quebra a melanina que é uma serão lançados para o hialoplasma (líquido proteína que dá a cor ao cabelo. secundário, onde ocorrerá que envolve todos os compartimento do oxigenada, No interior de chamada de reações também nossas químicas de células, sistema de endomembrana), onde servirão milhares estão para a célula montar novos polímeros. continuamente sendo realizadas, a estas 30 reações chamamos METABOLISMO. Muitas reações metabólicas produzem, normalmente, muitas formas reativas de oxigênio do tipo da água oxigenada, ou mesmo alguns mais (O2-). superoxido reativos, como o Para impedir que estes radicais livres degradem as nossas própria proteínas e DNAs, as nossas células produzem algumas enzimas (oxidases) que degradam estes enzimas radicais são livres. Estas armazenadas nos PEROXISSOMAS. Crianças que nascem com um defeito genético em que estas enzimas não Figura 30- Esquema trimensional do sistema de endomembranas. Podemos ver o REG na forma de cisternas (sacos achatados) e o REL na forma de túbulos. O golgi também apresenta a forma de cisternas, porém são menores e não possui ribossomos aderidos. são produzidas, morrem nos primeiros dois anos de vida (Síndrome de Zellsweger). CITOESQUELETO ª Mitocôndria: Um compartimento citoplasmático mitocôndria, muito uma (organela) importante vez que é a este A habilidade da célula eucariótica em adotar variedades de formas, assim como promover movimentos coordenados dos compartimento está envolvido no processo componentes de seu interior, depende de de transdução de energia (transferência de uma energia filamentosas provinda dos alimentos, principalmente de moléculas de glicídios e complexa rede de proteínas chamadas de CITOESQUELETO (Figura 31). lipídios para a molécula de ATP - Adenosina Tri-Fosfato. Citoesqueleto: rede de proteínas filamentosas que dão ª Núcleo: forma e movimento à célula Este que é o maior compartimento do sistema de endomembranas contém a informação genética, conforme já descrito anteriormente. Diferente de um esqueleto feito de ossos, a rede de proteínas do citoesqueleto é muito dinâmica, reorganizando-se continuamente. De fato, o citoesqueleto poderia bem “citomusculatura”, ser chamado de já que é responsável pelas mudanças de forma das células, pelos 31 movimentos das células sobre um substrato (movimento amebóide), atua na contração muscular, assim movimentos como em todos os intracelulares, tais como transporte de organelas, segregação dos cromossomos, etc... Figura 32- Microtúbulos Os microtúbulos se distribuem pelo interior da célula, a partir de uma região central chamado centro celular, aonde nas células animais encontra-se o centríolo. Estes microtúbulos citoplasmáticos são importantes em estabelecer a forma da célula, pois, ao se irradiarem a partir do centro da célula, atuam como se fossem Figura 31. Célula vista ao microscópio, evidenciando a rede de proteínas do citoesqueleto “estacas ou colunas”. Os ªDIVISÕES DO CITOESQUELETO: microtúbulos citoplasmáticos também estão envolvidos em movimento dos O citoesqueleto pode ser dividido em componentes internos das células. Existem classes os proteínas enzimáticas, como a dineína e a os cinesina que quebram ATP e usam a classes energia liberada para promover movimento. diferem em relação ao tipo de proteína que Estas proteínas ligam-se às “organelas” que as compõe, ao padrão de distribuição no precisam ser transportadas no interior da célula e quanto às funções célula, e usam os microtúbulos como se desempenhadas na célula. fossem “trilhos”, transportando as organelas três microtúbulos, filamentos de os componentes: microfilamentos intermediários. Essas e interior da até seu destino. ªMICROTÚBULOS Além citoplasmática, São tubos ocos, de 25 nm, formados formar de os constituir uma microtúbulos rede podem ORGANELAS MICROTUBULARES. por uma proteína globular, a TUBULINA. Neste caso, muitos microtúbulos e proteínas Milhares destas proteínas irão se unir motoras se unem para formar uma estrutura (polimerizar) formando os microtúbulos. com uma finalidade específica. Por exemplo, 32 durante a divisão celular, um feixe de são microtúbulos se estende de um pólo da intracelulares (ex.: ciclose e movimentos célula amebóides). até o outro, estes microtúbulos responsáveis Essa por função movimentos é executada servirão como “trilhos” por onde as proteínas principalmente por uma proteína motora, a motoras levarão os cromossomos para os MIOSINA, que também usa o ATP como pólos da célula. fonte de energia e produz movimentos ao se Cílios e flagelos (ex.: flagelo da ligar e “puxar” as fibras de actina. “cauda” do espermatozóide), são formados por muitos microtúbulos e proteínas motoras. As proteínas motoras fazem com que os ªFILAMENTOS INTERMEDIÁRIOS movimentos Os filamentos intermediários são rítmicos, dando capacidade de deslocamento filamentos com um diâmetro em torno de 10 para a célula. Cílios e flagelos têm uma nm, formado por vários tipos de proteínas, organização sendo microtúbulos apresentem peculiar: nove pares de microtúbulos formarão um feixe em volta de um par central. ªMICROFILAMENTOS a mais importante delas a QUERATINA. Os filamentos filamentos associam-se intermediários a proteínas da Os microfilamentos são formados, membrana plasmática e formam ligações principalmente por uma proteína chamada entre células vizinhas, mantendo-as unidas. ACTINA. Esta, é uma proteína globular, mas Nas células epiteliais, por exemplo, os ao polimerizar-se formará longos filamentos filamentos de 5 a 9 nm. Estes filamentos formam uma abundantes pois a união entre as células rede logo abaixo da membrana plasmática, deve ser mais forte. intermediários são mais servindo de sustentação para essa estrutura que é muito fina e frágil. Figura 33 – Microfilamentos DO UNICELULAR AO PLURICELULAR Durante o processo evolutivo, alguns organismos tomaram o caminho de formar colônias de muitas células. Posteriormente, cada célula foi se especializando em uma determinada função. Este caminho levou ao surgimento de seres pluricelulares. A rigor, pluricelulares todas as contém células a dos MESMA INFORMAÇÃO GENÉTICA. Como então a Além de serem importantes para dar maquinaria metabólica de uma célula forma à célula, os microfilamentos também 33 muscular é tão diferente daquele de um neurônio? A medida desenvolvimento pluricelulares, que ocorre dos organismos diferentes genes o serão ativados. ( VER FIGURA 34) As células vão sofrer um diferenciação, processo chamado de tomando as suas várias funções. Embora todos os genes estejam presentes em todas as células, nas células musculares apenas alguns genes são ativos (são transcritos) e então só as proteínas codificadas pelos genes transcritos estão presente nessas células. Já em uma célula nervosa, embora possua os mesmos genes da célula muscular, outros genes estão ativos, resultando a tradução de outras proteínas. FIGURA 34 – Diferenciação celular que corre no desenvolvimento de organismos pluricelulares. 34 PRÁTICAS DE BIOLOGIA CELULAR* Recomendações de ordem geral a serem observadas no uso do Laboratório** 1 A manutenção do material colocado a sua disposição depende de sua boa vontade e do seu senso de responsabilidade pessoal. O microscópio que você usa custou elevado preço, cuida dele como se fosse seu. Dedique 3 minutos finais de cada aula para limpar as objetivas com lenço de papel (se foi usado óleo de imersão), assim como a sua bancada. Freqüentemente você deverá fazer desenhos ilustrativos das preparações observadas. Para tal, traga folhas de papel ofício, ou um caderno de desenho. Exatidão nos detalhes, limpeza e capricho serão levados em conta mais do que habilidade para a arte de desenhar. Nunca desenhe algo incógnito que veja sob o microscópio. Compare aquilo que é visto sob o microscópio com ilustrações de livros, quadros ou outras fontes. Não se limite apenas a copiar figuras, examine o material colocado a sua disposição. Os roteiros de aulas práticas que estão incluídos neste caderno devem ser lidos CUIDADOSAMENTE antes que qualquer trabalho seja iniciado. Discuta suas dúvidas com o professor. Procure estar sempre em dia com os trabalhos das aulas práticas. PONTOS A SEREM OBSERVADOS AO DESENHAR: Porque se exige um bom desenho: 1) para obrigar a observar. 2) para que a observação possa ser corrigida por outra pessoa. 3) para que fique um registro da observação efetuada que possa ser consultada posteriormente. **Copia parcial da introdução de MANARA, N.T.F.(mimeografado, sem data). FORMA CORRETA DE REALIZAR OS DESENHOS EXIGIDOS NAS AULAS PRÁTICAS. 1) Todos os desenhos e as anotações deverão ser feitos com lápis HB, ou similar, com a ponta fina. Tenha a mão uma borracha macia. 2) Não esqueça a data e o aumento usado. 3) Guarde as folhas arquivadas, junto ao caderno didático. 4) Escreva sempre com letras de imprensa. 5) Não encha o campo de desenhos. Os espaços em branco facilitam a compreensão e posterior estudo do tema. 6) Os desenhos devem ser proporcionais ao observado. Não faça desenhos muito pequenos. 7) As setas indicadoras dos elementos desenhados deverão ser linhas suaves, feitas com régua e paralelas ao borde inferior da folha. 8) A utilização de formas geométricas (Figura 2.1) é artifício para facilitar a representação do objeto. Sobre esta base se 1 Mais detalhes de algumas das práticas aqui descritas podem ser encontradas no livro: LORETO, E.L.S. & SEPEL, L. M.N. Atividades experimentais e didáticas de Biologia Molecular e Celular. Ribeirão Preto, SBG. 2003. 2a ed. www.sbg.org.br 35 trabalhará, até obter a maior semelhança possível com o observado. 9) Na Figura 2.2, encontrará um exemplo de proporção, formas, espaços, distâncias e grossuras dos traços. 10) Antes de começar a desenhar o contorno dos objetos: a) observe bem o preparado. Estude-o e interprete-o; b) determine exatamente o espaço que vai ocupar o desenho, marcando com linha suave; c) observe a relação que guardam entre si os elemento a desenhar, isto é, sua proporção, tamanho e forma, fixe-os com linhas auxiliares dentro do contorno geral (Figura 2.2). Figura 2.1 – Observação da linha e forma na hora de desenhar Figura 2.2 – Cuidados no fazer o desenho quanto à proporção, forma, e espaço. 36 1a Aula O USO DO MICROSCÓPIO ÓPTICO (MO) O mundo microscópico é fascinante. O microscópio foi um aparelho que muito contribuiu para o desenvolvimento da Biologia Celular. Por esse motivo iniciamos as atividades práticas dessa disciplina descrevendo um microscópio óptico e dando algumas dicas para o seu uso adequado. Uma célula animal típica tem 10 a 20 µm de diâmetro, ou ao redor de 5 vezes menos do que a menor partícula visível ao olho nu. Portanto, a descoberta de que os animais e vegetais eram compostos por agregados de células individuais, ou a existência de pequenos seres unicelulares, não foi possível até que bons microscópios fossem fabricados, no início do século XIX. As células animais não são apenas pequenas, mas são descoloridas e translúcidas; conseqüentemente, a descoberta de sua organização interna dependeu, também, do desenvolvimento, na última metade do século XIX, de uma variedade de corantes que tornaram várias partes da célula visíveis. O microscópio tem por objetivo produzir imagens aumentadas de objetos tão pequenos que, ao exame da vista desarmada, não poderiam ser vistos. Tem ainda como escopo, revelar detalhes texturais imperceptíveis a olho nu. Devemos lembrar que os objetos são vistos por duas razões fundamentais: 1) porque absorvem a luz; 2) por causa da diferença entre o seu índice de refração e o do meio que os envolve. Quanto maior a diferença, mais facilmente o objeto será visto. Assim, as células e seus componentes, para serem observados ao microscópio devem ser tratados por reagentes especiais, do que resulta sua coloração, isto é, os componentes celulares passam a absorver luz diferentemente, tornando-se bem visíveis. Chamamos de limite de resolução (LR) a capacidade máxima de ver dois objetos como distintos. O LR depende do comprimento de luz usado e da abertura numérica do sistema de lentes. Dentro da faixa de luz visível o LR é de 0,4 µm para o violeta e 0,7 µm para o vermelho. Em termos práticos, bactérias e mitocôndrias (+/- 0,5 µm) são geralmente os menores objetos vistos ao M.O. Na Figura 2.3 temos um microscópio, em que são indicadas as suas principais partes. Um microscópio compõe-se de um sistema óptico (condensador, objetivas e oculares), corpo do microscópio (mesa, tubo, platina...) e fonte de iluminação (que nos microscópios mais antigos não fazem parte do microscópio). O condensador tem por objetivo prover uma iluminação uniforme. Geralmente é dotado de um diafragma que permite controlar a quantidade de luz que incidirá sobre a preparação a ser 37 observada. Em muitos aparelhos, a intensidade e “qualidade” da luz também pode ser controlada através de um parafuso que permite subir ou baixar o condensador. Duas lentes ou conjuntos de lentes permitem o aumento da imagem da preparação, são as lentes oculares e as objetivas. As oculares, como o próprio nome diz, ficam próximas ao olho do observador. Já as objetivas ficam próximas ao objeto a ser observado. As objetivas são afixadas em um sistema rotativo, o revólver, que permite que sejam trocadas com facilidade. Quanto maior o tamanho da objetiva, maior o aumento que ele proporciona. As objetivas e oculares, trazem escrito no seu corpo, várias informações e entre elas o seu valor de aumento. O aumento final dado por um conjunto de lentes é obtido multiplicando o aumento da objetiva pelo aumento da ocular. Assim, se o aumento da objetiva é de 10X e a ocular também é de 10X o aumento final é de 100 vezes. Como proceder para focalizar no microscópio: 1) Mova o revolver de modo a deixar a objetiva panorâmica (menor aumento) na posição de observação, e abaixe totalmente a mesa. 2) Coloque a lâmina na mesa (platina), fixando-as com as garras do charriot (obs: a lamínula deve estar voltada para cima). 3) Ligue o sistema de iluminação e ajuste o charriot de modo a centrar o material a ser observado na região iluminada do orifício da platina. 4) Olhe pela ocular ao mesmo tempo em que a mesa é lentamente elevada, girando o parafuso macrométrico, até que a preparação esteja focalizada. Use o micrométrico para fazer o ajuste fino do foco. 5) Mova a lâmina usando o charriot de forma a encontrar campos interessantes a serem observados. Interprete o que estas vendo, registre e se necessário desenhe. 6) Quando mais detalhes de uma região da lâmina são necessários, utilize as objetivas de maior aumento (10X; 40X). Para tal, basta girar o revólver e fazer um ajuste fino do foco com o micrométrico. PARA USAR A OBJETIVA DE 100X, se faz necessário colocar uma gota de óleo de imersão entre a lamínula e a lente. Focalize mexendo somente o micrométrico. Após o uso da lente de imersão não esqueça de retirar o óleo da objetiva e também da preparação. Outros lembretes importantes: Cada pessoa tem uma distância entre os seus olhos. Para que possamos olhar em microscópios binoculares (com duas oculares), estes possuem um sistema de regulagem da distância interorbital, ou seja, um mecanismo que permite movimentar os dois canhões para a medida exata da distância entre os olhos de cada usuário. Além disso, ao menos uma das oculares tem uma regulagem de foco independente. Assim, ao começar a observação em um microscópio binocular, primeiro focalize olhando somente a ocular que não tem regulagem, posteriormente, focalize com a outra ocular, girando o controle de foco da ocular. A iluminação, é de fundamental importância na visualização ao microscópio óptico. Após a focalização, movimente o condensador e o diafragma deste, até encontrar a iluminação ideal. 38 Ao encerrar as observações ao microscópio não esqueça de deixa-lo com a platina abaixada, com a objetiva panorâmica, e desligado. Procedimento: 1) Corte um pedaço de jornal que contenha algumas letras, coloque sobre uma lâmina e leve ao microscópio. 2) Focalize algumas letras. O que acontece? Desenhe. 3) Mude as objetivas. O que acontece? Desenhe. 4) Pegue um fio de cabelo, coloque entre lâmina e lamínula. Leve ao microscópio, observe e desenhe. Questões a serem respondidas: 1) Como se calcula a aumento final que estamos vendo em um microscópio? 2) Porque a imagem vista em um microscópio é invertida? 3) O que é microscopia de fluorescência? Para que serve? 4) O que é microscopia de contraste-de-fase? Para que serve? 5) Descreva o processo de focalização de Köhler 6) O que é um estereomicroscópio? 7) O que é microscopia eletrônica? Descreva o funcionamento de um microscópio eletrônico e compare o seu funcionamento com o do microscópio óptico. Figura 2.3 – Partes do microscópio 39 2a aula observando células de epitélio de escamas de cebola Um dos materiais mais apropriados para um primeiro contato com as células é uma preparação “a fresco” de epitélio de escamas de cebola. É uma prática extremamente simples e as células desse material são grandes de tal forma que com qualquer microscópio mesmo rudimentar permite a visualização dessas células. Com um microscópio de uma boa óptica é possível observar o núcleo, nucléolo, plasmólise, parede celular, e plasmodesmos. OBSERVANDO OSMOSE EM CÉLULAS VEGETAIS 1) Retire a epiderme de uma escama de cebola e coloque sobre uma lâmina com uma gota de azul de metileno (0,3%). Preste atenção para retirar o epitélio exterior da escama, pois este tem uma única camada de células enquanto o da camada inferior tem várias camadas o que dificultará a observação. Espere 1 minuto para corar e depois retire o excesso de corante com uma gota de água. 2) Cubra com uma lamínula. Cuide para não ficar bolhas de ar e que fique líquido entre a lâmina e a lamínula. Seque a lâmina principalmente a face de baixo (sem a lamínula) pois se esta ficar úmida, vai grudar na mesa do microscópio dificultando o movimento do “charriot”. 2) Observe e desenhe as células de epiderme de cebola, indicando a parede celular, o núcleo e o nucléolo. 3) Coloque em um dos lados da lamínula uma gota de uma solução saturada de NaCl ou sacarose (ou glicerina). Observe, descreva e desenhe o que aconteceu. 4) Identifique os plasmodesmos, e a parede celular. Responda as seguintes questões: 1) Faça um desenho com todas as partes observadas.Não esqueça as legendas, aumentos e a data. 2) Qual o formato das células observadas? 3) Para que serve o azul de metileno? 4) O que aconteceu quando colocamos as células em uma solução hipertônica? Por que? 5) O que é plasmólise? 6) O que são plasmodesmos? 7) O que é a parede celular? No que ela difere da membrana plasmática? 40 PARA FAZER EM CASA (As questões e desenhos dessa atividade deve ser entregue junto com as questões e desenhos da segunda aula) PROPRIEDADES FÍSICO-QUÍMICAS DOS COMPONENTES DA MEMBRANA PLASMÁTICA. Material necessário: 3 recipientes (copo, vidro de remédio...); 1 colher; azeite; água; detergente colorido (azul, verde ou vermelho); solvente orgânico (acetona, gasolina, éter ou águaraz); açúcar e sal. As macromoléculas que compõe os seres vivos podem ser classificadas em 2 tipos: polares, sendo solúveis em água (hidrossolúveis) e as apolares que são insolúveis em água, mas solúveis em solventes orgânicos como éter, clorofórmio, cetonas... (lipossolúveis). Procedimento: 1) Em um recipiente com um pouco de azeite de cozinha (que é um lipídio- portanto apolar), coloque uma pitada de açúcar (que é um glicídio). Mexa bem. O que aconteceu? Por que? - Repita com sal de cozinha, o que aconteceu? Por que? 2) Em um recipiente, coloque um pouco de acetona ou éter ou água-raz ou gasolina (todos estes são solventes apolares). Coloque uma colher de açúcar. Agite. O que aconteceu? Por que? - Repita com uma gota de azeite. O que aconteceu? Por que? 3) Em 3 recipientes, coloque: no 1o: 1/2 de água, 1/2 de azeite no 2o: 1/2 de azeite, metade de detergente colorido (azul ou vermelho) no 3o: 1/3 de água, 1/3 de azeite e 1/3 de detergente colorido. Agite os líquidos com uma colher e observe por 5 minutos ou mais. Descreva o que aconteceu? As membranas biológicas são formadas, principalmente, por lipídios e proteínas anfipáticas, ou seja, moléculas com uma parte apolar (lipossolúveis) e uma parte polar (hidrossolúvel) como os detergentes. Portanto são, hidrossolúveis e lipossolúveis ao mesmo tempo. 41 Responda: a) Faça um desenho de como são organizadas as moléculas anfipáticas de detergentes em uma bolha de sabão. b) Faça um desenho de como são organizadas as moléculas de lipídios e proteínas nas membranas plasmáticas (Consulte os modelos nos livros de Biologia Celular). c) Que propriedades podemos esperar da Membrana Biológica segundo o modelo do Mosaico Fluído ? d) Qual a função dos lipídios (fosfolipídios) nas membranas biológicas segundo o modelo do M-F ? e) Qual a função das proteínas nas membranas biológicas segundo o modelo M-F? 3a Aula: COMPARANDO CÉLULAS PROCARIOTAS E EUCARIOTAS. Os seres vivos podem ser classificados em dois grandes grupos: os procariontes e os eucariontes, conforme a organização da célula que os compõe. O objetivo desta prática é de comparar células procariotas e eucariotas, suas semelhanças e diferenças. Ao microscópio óptico, o que mais chama a atenção, é a grande diferença de tamanho que existe entre as células procariontes e eucariotes típicas. É claro que podemos encontrar células procariontes, como algumas algas cianofícias, que possuem tamanho próximo ou mesmo maior que algumas células eucariontes. Entretanto, a regra é que os procariontes geralmente têm células bem menores que os eucariontes. Outra diferença bem marcante é a presença do núcleo nos eucariontes e a sua ausência nos procariontes. Internamente, não só a presença do núcleo difere os procariontes dos eucariontes, mas sim uma intensa compartimentalização das diversas funções celulares em organelas envoltas por membranas, o sistema de endomembranas que caracteriza as células eucariontes. Porém, via de regra, o sistema de endomembranas é de difícil visualização ao microscópio óptico, sendo mais bem observado ao microscópio eletrônico. Nesta atividade, vamos colocar lado-a-lado células bacterianas (uma típica célula procarionte) e células da mucosa da bochecha (representando uma típica célula eucarionte). 42 Material necessário: Lâmina, lamínula, palito de fósforo, placa com bactérias, alça de platina, lamparina, álcool 70%, corante azul de metileno 0,05%, papel filtro, copo Becker 250 ml (ou vidro de Nescafé), microscópio. Procedimento: 1) Com uma alça de platina, encoste levemente em uma colônia de bactérias na placa de Petri. 2) Esfregue a alça na lâmina até espalhar bem as bactérias. 3) Fixe as bactérias pelo calor, passando a lâmina na chama de uma lamparina, com as bactérias voltadas para cima, tomando o cuidado para a lâmina não aquecer demais (controle nas costas da mão). 4) Com um palito de fósforo, raspe a bochecha, posteriormente,esfregue o palito em cima da região da lâmina em que previamente foram colocadas as bactérias. 5) Fixe as células em álcool 70% por 1 minuto. 6) Coloque uma gota de corante (azul de metileno 0,3%) e espere 1 minutos. 7) Tire o corante, deixando passar um pequeno fluxo de água, sob a torneira. 9) Cubra com lamínula, seque os lados da lâmina e observe ao microscópio. Questões a serem respondidas: 1) Compare as células procariotas e eucariotas (observe e desenhe): a) Quanto ao tamanho - Faça um desenho com as relações de tamanho, não esquecendo de anotar o aumento usado. b) Quanto à forma. c) Quanto à presença de núcleo. d) Porque fixamos as bactérias na chama ? e) Qual a função da fixação em álcool ? f) Qual a função de cada um dos componentes do corante? 2) Quais seres vivos chamamos de procariontes? Quais os que representam os eucariontes? 3) Que outras diferenças existem entre as células procariotas e as eucariotas, mas que não puderam ser vistas ao microscópio óptico? O que precisamos fazer para poder detectar estas diferenças? 43 Para fazer na cozinha (2) UM POUCO DE FÍSICO-QUÍMICA: (as questões dessa atividade devem ser respondidas e entregues junto com as da 3a aula) O que é pH ? INFORMAÇÕES TEÓRICAS: Muitas moléculas estão continuamente formando íons. A água, por exemplo, forma os íons H+ e OH-, que permanecem por algum tempo nesta forma iônica e voltam a se associar para formar nova molécula de água. A molécula de água ao se dissociar, forma quantidades iguais de íons H+ e OH- . Algumas moléculas formam quantidades desiguais de íons H+ ou OH-. Por exemplo: a) HCl (ácido clorídrico) forma os íons H+ e Cl - . Sempre que a dissociação de uma molécula em seus íons forma prótons H+, ela é um ÁCIDO. b) NaOH (hidróxido de sódio) forma os íons Na+ e OH-. Sempre que a dissociação de uma molécula em seus íons forma hidroxilas OH-, ela é uma BASE. O pH (potencial de Hidrogênio) é uma medida da quantidade de prótons H+ presentes em uma solução. Quanto mais prótons H+, mais ácida é a solução. Quanto mais hidroxilas (OH-) mais básica, ou alcalina é a solução. A água, como tem igual quantidade de H+ e OH- é dita NEUTRA. Chamamos de ESCALA DE pH as variações na quantidades de prótons H+, que varia de 1 a 14. As soluções com pH abaixo de 7 são ditas ácidas e as acima de 7 são as básicas (alcalinas). A água tem pH 7,0. Ácido pH 1 2 3 4 5 6 Neutro Base 7 8 9 10 11 12 13 14 Quando, em uma solução ácida, vamos gradativamente acrescentando uma base, forma-se Sal e Água e o pH da solução vai subindo até ficar neutro e posteriormente continua subindo tornando-se básica. 44 Agora, se começarmos a adicionar um ácido em uma solução básica, o pH vai diminuindo, torna-se neutro e passa a ácido. EXPERIMENTOS PARA DEMONSTRAR ALTERAÇÃO DE pH Algumas substâncias podem mudar de coloração dependendo do pH da solução. Podemos usar esta propriedade para demonstrar alterações de pH. 45 I . Preparando a atividade: Material Necessário para Execução do Experimento: - Folhas de Repolho Roxo, - Ácido acético (3%) ou vinagre - Hidróxido de sódio (0,1 M), ou uma solução feita com umas escamas de soda cáustica (2 ou 3) em 10 ml de água (+/- 3 colheres); em último caso pode se usar leite de magnésia. - Frascos incolores / transparentes para a visualizar as alterações de coloração - Conta-gotas ou pipetas (no mínimo um para cada solução) Preparo das SoluçõesA) Infusão de repolho roxo: Picar bem 2 a 3 folhas de repolho roxo (correspondente a uma xícara), colocar em água fervente e esperar alguns minutos, para que a água torne-se colorida. PROCEDIMENTO: 1. Colocar, em quatro frascos transparentes um pouco da solução de repolho roxo 2. Acrescentar algumas gotas de vinagre. Observe o que acontece. 3. Acrescente agora algumas gotas de solução de NaOH (ou solução de soda cáustica). Acrescente tanta gotas até que não mude mais de cor. 4. Volte a adicionar gotas de vinagre. 5. Volte a adicionar NaOH. 6. Comparar e registrar as colorações obtidas. OBS.: O fenômeno de alteração de cores é reversível portanto, ocorrendo toda vez que o pH ultrapassa o ponto de viragem do indicador. Responda as questões: 1) Quais são os pHs que encontramos no sangue, na urina e no estomago humano? 2) O pH do sangue sofre variações? Existe algum mecanismo de controle do pH no sangue? 3) E dentro da célula, as diferentes organelas têm o mesmo pH? Dê exemplos. 4) O que acontece com as proteínas quando temos pequenas alterações de pH ? E quanto as proteínas são submetidas a grandes alterações de pHs, como quando colocadas em um meio com pH muito ácido ou muito alcalino? 5) Localize 5 propriedades biológicas associadas com pH? 46 4 a Aula ESTUDANDO A PASSAGEM DE SOLUTOS E SOLVENTES PELA MEMBRANA PLASMÁTICA. As células de qualquer organismo estão cobertas pela membrana celular. A constituição dessa membrana promove a passagem controlada de substâncias e o conseqüente equilíbrio dinâmico dentro do organismo. A água e outros íons pequenos podem passar sem gasto de energia (transporte passivo) pelas membranas biológicas (M.B). Uma das formas de transporte passivo é a osmose, que vem a ser a passagem do solvente de uma solução menos concentrada para a solução mais concentrada, através de uma membrana semi-permeável. Observação importante: O uso de sangue em aulas práticas, deve ser feito com muita cautela, principalmente depois do aparecimento da AIDS. Mas pensamos que isto, ao invés de ser um obstáculo, deve ser um componente a mais para a formação dos alunos. Devemos fazer uso de agulhas estéreis, o chamar a atenção para que todos evitem, de toda maneira, usar a lâmina dos colegas, ficando restrito a manipulação do seu próprio sangue. O professor, e todos os que vão manipular sangue, devem, sem exceção, usar luvas descartáveis. Após a atividade, todo o material deve ser desinfectado com álcool. Material necessário: Lâmina, lamínula, agulha hipodérmica descartável, lâmina de barbear, conta gotas, água destilada, soro fisiológico (NaCl 0,9%), solução hipertônica (solução saturada de NaCl e/ou açúcar); papel filtro, MO, luvas descartáveis, água sanitária, algodão, glicerina. Procedimento: 1) Coloque uma gota de soro fisiológico em duas lâminas limpas (o uso de soro fisiológico e opcional, se a gota de sangue for de um volume razoável -uma gota grande- não se faz necessário o uso de soro fisiológico). 2) Fazer um pequeno furo na ponta de um dedo, com uma agulha descartável estéril e colocar uma gota de sangue sobre cada lâmina (todas as agulhas devem ser dispensadas em um frasco com uma solução 20% de água sanitária). 3) Cubra com lamínula e observe ao MO. Descreva e desenhe as hemácias. 47 4) Em uma das lâminas, com um conta-gotas coloque uma gota de uma solução hipertônica em um dos lados da lamínula e encoste um papel filtro do outro lado para substituir o soro da lâmina. Dessa forma, o papel filtro puxará um pouco do sangue da lâmina e no outro lado, um pouco da solução hipertônica entrará em contato com as células sanguíneas. 5) Observe ao MO, principalmente na região da lâmina onde as hemácias mais entraram em contato com a solução hipertônica que as hemácias “murcharam”, ficando crenadas. 6) Na outra lâmina, repita o mesmo procedimento anterior, só que em vez de solução saturada, use água destilada. Observe na região da lâmina onde as hemácias mais entraram em contato com a solução hipotônica que as células estão túrgidas, quase estourando (e as vezes realmente “estouram”). Terminada esta parte da prática, as lâminas devem ser mergulhadas em uma solução de água sanitária 20% (ou álcool 96 GL) por no mínimo 1/2 hora, para depois ser limpo e reaproveitadas. Cada aluno deve passar um algodão com álcool, na mesa e demais partes manuseadas do microscópio. 1) O que é osmose? quando ocorre? 2) Porque ocorre hemólise (as hemácias estouram) quando as colocamos em água destilada? 3) Porque as hemácias ficam crenadas na presença de uma solução hipertônica? 48 5a aula FRACIONAMENTO CELULAR O emprego do microscópio, seja o microscópio óptico ou eletrônico, geralmente fica restrito à descrição das estruturas celulares. Para o estudo da composição química dos componentes celulares e interpretação das interações entre estes componentes para explicar o funcionamento celular, se faz necessário o emprego de outras metodologias que não o uso do microscópio. O estudo bioquímico dos componentes celulares requer a separação e o isolamento cuidadoso das várias organelas e macromoléculas celulares. As 3 principais técnicas usadas para isto são a centrifugação, cromatografia e eletroforese. 1) ORGANELAS E MACROMOLECULAS PODEM SEM SEPARADAS POR CENTRIFUGAÇÃO. As células podem ser rompidas de várias maneiras, como por choque osmótico, vibrações ultrasônicas, forçadas a passar por um pequeno orifício ou homogeneizadas por força mecânica. Quando cuidadosamente aplicadas, estes procedimentos deixam as organelas como núcleo, mitocôndrias, complexo de Golgi, peroxissomos... intactos. Assim como muitas vesículas derivadas do retículo endoplasmático, chamadas microssomos, mantém muito de suas propriedades bioquímicas originais. Como todos estes componentes tem grandes diferenças de tamanho, eles podem ser separadas por centrifugação. Postos em um tubo a girar em altas rotações, os vários componentes vão sofrer a ação da força centrífuga. Os componentes maiores como células intactas e núcleos vão sedimentar primeiro no fundo do tubo (p/ ex: 1000 rpm por 5'); rotações medianas em maior tempo farão sedimentar componentes um pouco menores como mitocôndrias, lisossomas e peroxissomas (20.000 rpm por 10'). Altas rotações em tempos ainda maiores (80.000 rpm por 3 horas) sedimentam ribossomos e grandes macromoléculas. Ver esquema de fracionamento por centrifugação em Junqueira e Carneiro (2000). Material Necessário: Folhas de Tradescantia; gral e pistilo; tubos de centrífuga; pipetas Pasteur; centrífuga; soro fisiológico; SDS 10% (sódio-duodecil-sulfato) ou detergente, água destilada. lâmina, lamínula e microscópio. 49 Procedimento: Primeira parte: Observação de um corte transversal de folha de Tradescantia 1) com uma gilete afiada, corte transversalmente uma folha de Tradescantia, o mais fino possível. 2) Coloque o corte em uma lâmina com uma gota de água, cubra com lamínula e leve ao microscópio. 3) Observe: a) que células tem pigmento roxo. Desenhe b) Que células tem cloroplastos. Identifique os cloroplastos e desenhe. Segunda Parte: Fracionamento por centrifugação. 1) Coloque 3 ml de soro fisiológico em um gral; 2) Esmague nesta solução 3 a 4 folhas de Tradescantia com um pistilo; 3) Coloque o líquido em um tubo de centrífuga e centrifugue rapidamente (15 seg) para retirar fibras de celulose e restos de tecidos; 4) Transfira o sobrenadante para um novo tubo, e centrifugue por 5 minutos a 7.000 rpm. 6) Desenhe e descreva o que encontramos no tubo após a centrifugação. 7) Passe o sobrenadante para um novo tubo. 8) Ressuspenda o precipitado com dois ml de soro fisiológico. 9) Faça uma lâmina com o sobrenadante e com o precipitado, observe ao microscópio e desenhe. 10) Acrescente uma gota de SDS 1% ou detergente no tubo com líquido verde, agite por um minuto. 11) Centrifigue os tubos, sobrenadante e o precipitado (agora ressuspenso) por 5 mim a 7.000. 12) Observe e desenhe o que encontramos nos tubos 13) Faça uma lâmina com o precipitado do tubo verde. Responda as questões: 1) Que método usamos para romper as células, nesta prática? 2) Porque usamos soro fisiológico e não água? 3) O que encontramos no sobrenadante após a primeira centrifugação? E no precipitado? 4) Por que usamos o SDS? 5) Por que o sobrenadante agora é verde e o precipitado incolor? 6) o que é uma ultracentrífuga? 7) Faça um esquema de fracionamento celular, que você poderia fazer se tivesse uma ultracentrífuga, e desejasse fracionar hepatócitos nos seus vários componentes. 6a aula 50 FRACIONAMENTO MOLECULAR POR CROMATOGRAFIA Como podemos isolar uma proteína ou uma outra molécula da célula? Para o desenvolvimento da Biologia Celular, foi crucial obter as moléculas que compõe a célula, como as proteínas, em seu estado puro, isto é, isolado das outras moléculas da célula. Mas mesmo uma bactéria bem simples possui mais de 2000 tipos de proteínas, como podemos isolar só uma enzima que nos interesse? Um dos métodos mais utilizados para este fim é a cromatografia de coluna, na qual uma mistura de moléculas em solução é aplicada na parte superior de uma coluna, que contém uma matriz sólida, porosa. Posteriormente, um grande volume do solvente passa pela coluna e é coletado em tubos separados, à medida que emerge na parte inferior da coluna. As diferentes moléculas são retardadas diferencialmente, pela sua interação com a matriz, moléculas diversas atravessam a coluna com velocidades diferentes e são então fracionados em uma série de tubos. Depois de passar em algumas dessas colunas, a enzima de nosso interesse estará isolada de todas as outras moléculas, em um dos diferentes tubos que foram coletados. Atividade experimental: 1- Coloque um pequeno pedaço de esponja na ponta de uma pipeta Pasteur. 51 2- Faça uma solução de Sílica gel em um copo volumétrico ou becker, usando água de torneira levemente acidulada com 1 gota de vinagre para cada 10 ml. Com um conta-gotas, coloque a resina (sílica gel) na coluna. A este procedimento chamamos empacotamento da coluna. 3- Em um gral, coloque uma folha de manto-de-viuva (Tradescantia), com umas gotas de águaacidulada e esmague com o pistilo. 4- Colocar aproximadamente um ml desse líquido na coluna 5- Com uma pipeta de Pasteur coloque água na ponta superior da coluna e observe que um líquido roxo começa a descer, enquanto uma camada verde se deposita na ponta superior da coluna. Após algum tempo começa a pingar uma solução roxa (antocianina). Colete amostra desta fase. 6- Substitua o líquido que passa pela coluna, coloque etanol na parte superior da coluna e observe que o pigmento verde começa a descer 7- Quando começar a pingar o pigmento verde, colete uma amostra deste. Responda: 1) Faça um desenho esquemático representando o experimento e explique-o. 2) Porque o pigmento roxo é diluído primeiro na coluna? 3) Por que o pigmento verde fica retido não coluna enquanto estava passando água pela coluna? 4) Por que ele desceu na presença de álcool? 5) Qual a localização intracelular das antocianinas? 6) Qual a localização intracelular das clorofilas? 7) Qual a solubilidade desses pigmentos? ISOLAMENTO DE DNA NA COZINHA Em um laboratório de Biologia Molecular, o primeiro passo para se estudar um gene é o isolamento do DNA. Você também pode fazer isto na sala de aula ou em sua cozinha. Procedimento: 1) Pique uma cebola grande (250g) em pequenos pedaços (ou rale com um ralador). Faça uma solução misturando 10 ml de detergente de louça, 1/2 colher de sopa de sal e complete com água até 100 ml. Aqueça a solução até +/- 60oC e adicione esta mistura ao picadinho de cebola, deixando 10 minutos em banho-maria a 60oC. 52 2) Resfrie rapidamente a mistura colocando o recipiente em uma bacia contendo água e gelo. Coe a mistura em um filtro de papel para café, aparando o filtrado em um vidro. 3) Adicione delicadamente álcool (gelado) no filtrado de cebola, deixando o etanol escorrer pela parede do vidro. Observe a formação de fios esbranquiçados que sobem para onde está o álcool. Estes fios correspondem aos ácidos nucléicos - DNA e RNA. 4) Você pode retirar o DNA da solução enrolando em um bastão. 5) Deixe o bastão secar ao ar e coloque o bastão em um tubo com água para re-dissolver o DNA. Aplique este DNA no processo de eletroforese explicado a seguir. Atividades Propostas e Perguntas 1) Faça um desenho esquemático com todas as fases do experimento. - Em detalhe, mostre o que vai acontecendo com as células e com as macromoléculas. 2) Porque usamos detergente? 3) Qual a função do sal e da água quente? 4) Por que baixamos a temperatura, aplicando gelo? 5) Por que coamos em um filtro de café? 6) Qual a finalidade de acrescentarmos o álcool? 7a aula ELETROFORESE Moléculas que possuem carga elétrica, como as proteínas e os ácidos nucléicos, podem ser separadas por eletroforese. Eletroforese é o movimento de moléculas eletricamente carregadas em um campo elétrico. Geralmente, em um processo eletroforético, as proteínas ou ácidos nucléicos são colocadas a migrar sob um campo elétrico, no interior de um suporte gelatinoso (um gel) de poliacrilamida, agarose ou amido. A seguir será apresentado o processo de eletroforese vertical para separação de proteínas. O que você virá em aula será eletroforese horizontal de ácidos nucléicos, preste atenção na aula e faça as devidas observações das diferenças entre a técnica descrita para proteínas e a feita em aula para DNA. 53 As amostras contendo uma mistura de proteínas são aplicadas em um gel. Posteriormente uma corrente elétrica é aplicada neste gel por algumas horas, as proteínas mais negativas e menores migrarão mais rapidamente que as positivas e maiores. Posterior a migração, o gel é colocado em uma solução contendo corantes específicos para proteínas (A). Após a coloração, podemos visualizar diferentes bandas que correspondem a proteínas que possuem cargas ou tamanhos diferentes (B). Alguns processos de eletroforese podem revelar mais de 1000 diferentes proteínas em um único gel. Esta grande sensibilidade torna esta técnica muito útil para identificar quais as proteínas são responsáveis por diferenças genéticas ou fisiológicas em qualquer organismo. Atividade experimental: 1) Montar um gel de agarose 0,8% da seguinte forma: Ferver em microondas 0,8 gramas de agarose, em 100 ml de uma solução tampão (TAE) e após fundir a agarose, acrescentar 25 microlitros de Brometo de etídio. (usar luvas sempre que usar esta droga, pois ela é cancerígena). Colocar a agarose ainda quente em uma placa com um pente 54 Esperar esfriar e colocar o gel na cuba eletroforética de gel horizontal 2) Misturar 5µl de uma solução de DNA com 5µl de uma solução de tampão de amostra (Glicerina e azul de bromofenol) . Aplicar com uma micropipeta em um dos pocinhos do gel. 3) Ligar a fonte de eletroforese a 100 volts e deixar o azul de bromofenol migrar aproximadamente 3 cm 4) Observar o gel no transluminador ultravioleta (UV). RESPONDA e Faça os desenhos do que foi visto em aula. 1) Quantas diferentes bandas foi possível ver em cada aplicação? 2) Quem migrou mais rápido o DNA ou o RNA? Porquê? 3) Por que os ácidos nucléicos migram em direção ao pólo positivo? 4) Qual a função do azul de bromofenol? 5) O que é uma solução tampão? 6) Por que colocamos brometo de etídio no gel? 7) Quais as semelhanças e diferenças dos processos de eletroforese horizontal de ácidos nucléicos e o sistema de eletroforese vertical de proteínas descrito? 8a Aula OBSERVAÇÃO DE CICLOSE E CLOROPLASTOS EM CÉLULAS DE Elodea Elodea é uma planta usada como ornamental em aquários, facilmente adquirida em lojas que vendem produtos para aquariofilia. É uma monocotiledônea pertencente à família Hydrocharitaceae. As folhas dessa planta são ótimas para observação de ciclose que é o movimento contínuo do citoplasma no interior da célula, assim como de cloroplastos. Geralmente, os componentes das células são incolores. Por isso, ao se observar direto ao microscópio, pouco se pode observar de seus constituintes. Para se superar este problema, geralmente fazemos uso de corantes que vão evidenciar alguma parte da célula. Os cloroplastos, organela presente somente nas células vegetais e responsáveis pela fotossíntese, são naturalmente corados. Em virtude disto, e também por serem organelas bastante grandes, os cloroplastos podem ser facilmente visualizados ao microscópio. As folhas de Elodea apresentam apenas duas camadas de células, em que se pode observar com facilidade os cloroplastos. As células eucariontes possuem um citoesqueleto que promove o movimento dos componentes no interior da célula. Às vezes estes movimentos são correntes citoplasmáticas que chamamos CICLOSE. Se todos os componentes do interior da célula são incolores, é muito difícil se observar os movimentos citoplasmáticos. A presença dos cloroplastos que são naturalmente 55 corados torna possível a visualização da ciclose. Devemos lembrar que a ciclose é o movimento do citoplasma causado pela ação do citoesqueleto. Os cloroplastos são levados por essa corrente do citoplasma. Procedimento 1) Com o auxílio de uma pinça ou gilete, retire uma folha de Elodea. 2) Em uma lâmina para microscopia com uma gota de água, coloque a folha de Elodea, por sobre a gota. 3) Cubra com lamínula, e leve ao microscópio para observação. 4) Observe o tamanho e forma dos cloroplastos. Geralmente após alguns minutos de observação, podemos ver a ciclose. Descreva como é a ciclose. Observação de ciclose em células do pêlo estaminal de Tradescantia (mantode-viuva). As células do pêlo estaminal de manto-de-viúva (trapoeraba) também apresentam ciclose bastante ativa. Vale salientar que nessas células existe a presença de um grande vacúolo. O citoplasma da célula fica restrito a alguns canais internos da célula, o restante é ocupado pelo vacúolo. Procedimento: 1) Com uma pinça, retire um pêlo do estame de uma flor de manto-de-viúva. 2) Coloque sobre a lâmina com uma gota de água e cubra com uma lamínula. 3) Observe ao microscópio, desenhe e descreva a ciclose. 56 Responda as questões: 1) Por que podemos ver facilmente os cloroplastos, mas não outros componentes do sistema de endomembranas como o complexo de Golgi, retículo endoplasmático ou mitocôndrias? 2) Que parte do citoesqueleto está envolvida na ciclose? De que forma? 3) Por que a ciclose nas células da Elodea ocorrem no interior de toda a célula enquanto na célula da Tradeschantia ocorre apenas dentro de estruturas que lembram “canais”? 9a Aula OBSERVANDO CÍLIOS E SISTEMA DE ENDOMEMBRANAS Podemos observar com facilidade a atuação do citoesqueleto, através dos cílios e dos pseudópodes em protozoários de vida livre. Nos Paramecium podemos ver os cílios e em Amoeba os pseudópodes. Além disso, vários componentes do sistema de endomembranas, como vacúolos digestivos (e pulsátil em Paramecium) são também facilmente observáveis. Paramecium é o nome genérico de um protozoário ciliado muito comum em mananciais de água como os açudes e riachos. Estes protozoários são de fácil cultivo, se alimentando principalmente de bactérias, pequenas algas e outros protozoários menores. Podem ser mantidos em recipientes com um pouco de água e uma pequena pitada de leite em pó (+/- 60mg para cada 100 ml de água). Como a qualidade da água é importante para este protozoário, devemos trocar um pouco da cultura velha (mais ou menos a metade) por água nova com leite, a cada semana. Assim, podemos manter infinitamente o Paramecium. Outro meio de cultivar este ciliado é colocar um pouco de gérmen de trigo na água a cada semana, e sempre trocando a metade do volume da cultura por água nova a cada semana. Por ser de fácil cultivo e apresentar cílios e o sistema de endomembranas facilmente observável, além de ter uma taxa de reprodução assexual bem alta, este protozoário é um excelente recurso para atividades práticas de Biologia Celular. Antes, porém, de descrever estas 57 práticas, vamos mencionar alguns aspectos importantes sobre a biologia e estrutura dos Paramecium. As espécies mais comuns de Paramecium possuem em torno de 0,5 mm de comprimento. Os ciliados são excepcionais entre os eucariontes, uma vez que possuem no mínimo dois núcleos com funções distintas. O macronúcleo participa das atividades do dia a dia como crescimento, metabolismo e reprodução. O micronúcleo permanece relativamente dormente até que a célula entre em reprodução sexuada. Os Paramecium possuem dois tipos de reprodução; a) divisão binária: em condições favoráveis a célula se divide em duas. As duas novas células, geneticamente idênticas, crescem rapidamente e voltam a se dividir. Mantendo as condições favoráveis estes organismos podem se dividir duas a três vezes em um dia; b) conjugação: em condições ambientais desfavoráveis, dois indivíduos de sexos diferentes entram em contato e formam uma ponte citoplasmática temporária, por meio da qual trocam micronúcleos. Observando os cílios e o sistema de endomembranas: Nos Paramecium podemos observar com facilidade a atuação do citoesqueleto, através dos cílios, assim como o movimento intracelular dos vacúolos digestivos e contrátil. Além disso, vários componentes do sistema de endomembranas, como vacúolos digestivos e pulsátil são também facilmente observáveis. Material necessário: Cultura de Paramecium; microscópio, lâmina – lamínula; infusão de cigarro. Procedimento: 1) Encher um tubo de centrífuga com uma cultura de Paramecium. Centrifugar por 60 segundos. 2) Retirar o sobrenadante, deixando apenas uma pequena gota de meio líquido. 3) Acrescentar, na gota que restou no tubo em que os Paramecium foram centrifugados, uma gota de uma solução de “narcótico” feito da seguinte maneira: ( deixar um cigarro em infusão em 30 ml de água por 12 horas). A finalidade desta infusão de cigarro e diminuir a atividade dos Paramecium , uma vez que estes protozoários são muito rápidos e sem este narcótico é muito difícil segui-los ao microscópio. Outra opção é colocar alguns fios de algodão entre a lâmina e a lamínula. Os Paramecium não podem nadar tão livremente entre os fios de algodão, facilitando a sua observação. 4) Faça um desenho com as principais partes de um Paramecium. 5) Observe o batimento dos cílios e desenhe (observe e descreva os tricocistos) 6) Identifique e observe a contração dos vacúolos contráteis. 7) Identifique os vacúolo digestivo. 58 8) Identifique e desenhe o citostoma e a citofaringe. (O que são fagossomas e onde estes se formam nos Paramecium ? 9) Faça um desenho comparando a ultra-estrutura de um cílio e de um centríolo. 10a Aula PREPARAÇÃO DE LÂMINAS PERMANENTES (aula demonstrativa). Estruturas biológicas grandes não podem ser vistas diretamente ao microscópio, por que a luz não pode atravessá-las. Precisamos, então, fazer cortes o mais fino possível, para que a luz possa passar pelas estruturas, e assim ser visto ao microscópio. Para sofrer tais cortes, o material deve ser fixado, emblocado em parafina ou outra resina e, imerso neste suporte, cortado em pequenas "fatias", através de um aparelho chamado micrótomo. Posteriormente este material é corado e a lâmina é montada. Nesta prática, vamos visitar os laboratórios de anatomia vegetal do Dep. de Biologia, em que lâminas permanentes de vegetais são preparadas. Preste atenção as explicações (e faça as perguntas que achar necessário) e posteriormente responda as seguintes questões: 1) O que é a fixação do material? Qual a função da fixação? 2) Álcool etílico, clorofórmio, formol, ácido acético, ácido pícrico, e ácido ósmico são as principais substâncias usadas como fixadores. Quais são as principais características de cada um destas quanto a sua capacidade de fixação? 59 3) As substâncias citadas na pergunta anterior, geralmente não são usadas em conjunto, constituindo fluídos fixadores. Alguns destes fluídos são muito usados, como o Fluido de Carnoy; o F.A.A; o Bouin. Diga qual a composição destes fixadores e suas características. 4) Porque desidratamos o material em uma série alcoólica antes de emblocar em parafina? 5) Para que emblocar em parafina? 6) Que outros suportes ou estratégias podem sem usadas no lugar do emblocamento em parafina? 7) O que é orientação do corte? 8) Para que re-hidratar o material antes de cora-lo? 9) Qual a importância do uso de corantes na preparação de lâminas? 10) O que significam: coloração vital; corante acidófilo; corante basófilo? 11) Entre os principais corantes podemos citar: Carmim; hematoxilina; azul de metileno; Cristal violeta (violeta genciana); Eosina; Fast Green; Fucsina ácida, safranina; Sudan black; diga quais as características principais destes corantes (que estruturas eles coram, solubilidade, concentrações usadas...) 11a Aula OBSERVAÇÃO DE COMPLEXO DE GOLGI EM LÂMINAS PERMANENTES DE EPIDÍDIMO. Material fornecido: lâminas permanentes de epidídimo de rato. Procedimento: 1) Localize e desenhe as células nos túbulos de epidídimo. 2) Observe e desenhe a posição do núcleo. 3) Observe e desenhe a posição e a forma do complexo de Golgi. Responda as questões: 1) Por que foi escolhido o epidídimo para observar o complexo de Golgi? Que outro tipo de célula poderia ser usada? 2) Que método de coloração foi usada e por que? 3) Como se forma o Complexo de Golgi? 60 Observação de neurônios em cerebelo de camundongo. Material fornecido: lâminas permanentes de cerebelo de camundongo. Procedimento: Observe ao microscópio a região entre as substâncias branca e cinzenta, nela existem alguns neurônios gigantes em que podemos ver perfeitamente o corpo celular (com núcleo), o axônio e dendritos. Responda: 1)Observe e desenhe estas células, suas partes, e descubra como são chamadas estas células. 2)Qual a relação existente entre forma e função nestas células? 12a Aula OBSERVAÇÃO DE CÉLULAS MUSCULARES ESTRIADAS O desenho esquemáticos de células presente nos livros são muito comuns e úteis. Porém, muitas vezes os alunos tem dificuldade de reconhecer que em um ser pluricelular, a diferenciação celular é a regra. Muitas células acabam com formatos muito diferentes. As células musculares estriadas esqueléticas são um exemplo. Células musculares estriadas são células muito longas, polinucleadas apresentando os núcleos na periferia da célula. O citoesqueleto é hipertrofiado, sendo que os microfilamentos de actina e miosina, vão ocupar a maior parte da fibra muscular, constituindo estruturas específicas das células musculares estriadas, que são os sarcômeros. Essas estruturas é que dão uma aparência estriada a essas células quando vistas ao microscópio. Material necessário: Lâmina, lamínula, agulha histológica e lâmina de barbear, abelhas (ou outro inseto grande), solução de verde Janus (0,7% em etanol 70%). 61 Procedimento: 1) Com uma gilete, abra o tórax de uma abelha, vespa ou outro inseto voador grande (previamente morta em vapores de éter). 2) Com uma agulha histológica retire algumas fibras musculares e transfira para uma lâmina com uma gota de corante. 3) Cubra com lamínula, deixe corar por 3 minutos, e observe ao microscópio. Alguns questionamentos : a) Como estão organizados os sarcômeros e como estes funcionam? (faça um desenho). b) Quais as fases da contração muscular? c) Como está organizado o citoesqueleto em uma célula muscular lisa? d) Relacione as regiões estriadas que podemos ver nas fibras musculares com o sarcômero. e) Qual a função do Verde Janus? 13 a aula OBSERVAÇÃO DE MITOSE EM PONTA DE RAIZ DE CEBOLA, Allium cepa (2n = 16). COLETA E FIXAÇÃO DAS PONTAS DE RAÍZES DE CEBOLA O procedimento mais fácil é encher um frasco com água colocar a cebola com a parte das raízes imersa na água (figura abaixo) e esperar até que as raízes comecem a crescer. Dependendo da época isso pode ocorrer em 24 horas ou em alguns dias. 62 Quando as raízes tiverem atingido pelo menos cinco milímetros poderão ser facilmente destacadas do bulbo, com auxílio de uma lâmina de barbear, estilete ou mesmo agulha. Não é necessário deixar as raízes crescerem mais do que os cinco milímetros, pois o material que nos interessa está na ponta. As pontas de raiz devem ser imediatamente fixadas em solução de álcool e ácido acético (3:1). Essa solução não dever ser estocada, recomenda-se que seja preparada no momento em que vai ser usada. O tempo mínimo que as pontas de raiz devem ficar no fixador é duas horas, as vezes, se o material fica muito tempo no fixador ocorre um amolecimento excessivo do tecido dificultando a preparação da lâmina. Após o tempo de imersão no fixador as pontas de raiz podem ser estocadas em álcool 70% (de preferência em refrigerador) ou então preparadas para a observação das mitoses. 2. HIDRÓLISE DO MATERIAL FIXADO Transferir as pontas de raiz de cebola para uma solução de ácido clorídrico 1N e deixar em imersão por 15 minutos. Depois disso lavar em água (imersão por um ou dois minutos); remover o excesso de água com um papel absorvente e transferir para uma lâmina de microscopia. 3. COLORAÇÃO Antes de adicionar o corante sobre a ponta de raiz, pode-se remover (ou simplesmente romper com uma agulha) a parte mais extrema do material (correspondente à região da coifa), pois isso facilitará a coloração e a observação ao microscópio. Para coloração um dos corantes mais usados é a orceína acética 2% (outros corantes produzem o mesmo efeito e podem substituir a orceína). Uma gota desse corante é suficiente para 63 uma boa coloração, desde que se espere no mínimo vinte minutos, antes de “bater” ou “esmagar” o tecido. Ao colocar a lamínula deve-se cuidar para deixar o menor número possível de bolhas de ar para que a observação do material não seja prejudicada. Depois que o corante atuou sobre o tecido pode-se envolver a lâmina com um papel filtro e pressionar com o dedo polegar a região onde está a lamínula. Esse movimento fará com que o tecido se espalhe pela lâmina e seja possível observar camadas de células isoladas. Nesses grupos de células é que será possível observa as mitoses. Não se deve colocar uma quantidade muito grande de tecido na lâmina pois isso ira dificultar o espalhamento. Dois milímetros de ponta de raiz produz material suficiente para observação. Outra forma de realizar o espalhamento é segurar a região da lamínula com um papel absorvente e bater com um lápis borracha ou com a ponta da tampa de uma caneta. Após o esmagamento do material, a lâmina deve ser observada inicialmente em menor aumento (x10), para que se localize rapidamente onde estão as células em divisão. 5. LAMINAS SEMI-PERMANENTES As lâminas que estiverem boas podem ser temporariamente conservadas (uma semana) se forem vedadas com esmalte para unhas ou cola para câmera de pneu de bicicleta. 6. LÂMINAS PERMANENTES As lâminas semi permanentes podem ser transformadas em permanentes, para isso basta remover o vedante (esmalte ou cola) e colocar as lâminas no freezer até que seja possível soltar a lamínula. Após a remoção da lamínula, mergulhar rapidamente as lâminas em alcool absoluto e deixar secar. Colocar uma gota de Resina para microscopia (Permonte; Entelan ou Balsamo do Canadá) na região onde está o material. Fechar com uma lamínula e deixar secar. Procedimento: 1) Pegue uma raiz já fixada 2) Hidrólise: coloque as pontas de raiz em uma solução 1N de HCl por 5 min. 3) Lavagem: deixe as raÍzes em água por 5 min. 4)Corte com uma gilete +/- 3mm da ponta da raiz, logo após os 2 primeiros mm (coifa). 5) Coloque este material em uma lâmina com uma gota de orceina acética, deixe corar por 5 minutos. 6) Cubra com uma lamínula, colocando a lâmina entre papel higiênico e aperte fortemente para espalhar o material ( com o polegar). 7) Vede as bordas da lamínula com luto (ou esmalte de unha). 8) Observe ao microscópio. 64 Questões: a) Descreva e desenhe o que ocorre na: interfase; prófase; metáfase; anáfase; telófase. b) O que é uma célula 2n=16? c) O que é centrômero e qual sua função? d) O que são cromátides? o que representam? Vvvvvvvvvvvvvvvvvvvvvvvvvvvvvvvvvvvvvvvvvvvvvvvvvvvvvvvvvvvvvvvvvvvvvvvvvvvvvvvv Atividades de Práticas de Biologia como componente de formação pedagógica. Atividade 1 – Biologia na cozinha. A cozinha de nossa casa pode ser um excelente laboratório. As “experiências” feitas nas 2a e 3a aula são exemplos disso. Em grupos, a turma elaborará um experimento relacionado ao programa de biologia celular e apresentará em aula em data a ser marcada. Atividade 2: O USO DE MODELOS DIDÁTICOS E SIMULAÇÕES. (com marcação da data para apresentação dos modelos) Simulações e modelos didáticos são excelentes recursos didáticos, principalmente se conseguimos colocar os alunos a construir os modelos ou montar as simulações. Os modelos didáticos, por representarem bidimensionalmente ou tridimensionalmente de modo macroscópico estruturas e/ou funções, permitem um entendimento mais fácil de fenômenos microscópicos que de outra forma são apresentados e entendidos apenas de forma abstrata. Os modelos permitem uma “visualização” das estruturas, tornando o assunto “mais concreto”. Desta forma os modelos facilitam o aprendizado e a discussão sobre o tema em estudo. As simulações correspondem à representação dinâmica de processos, com ajuda de materiais e dos alunos. Nas simulações, podemos, por exemplo imprimir uma longa seqüência de DNA em 65 papel e com a participação dos alunos pedir que eles encontrem uma seqüência correspondente ao sítio de clivagem de uma enzima de restrição. Podemos pedir que os alunos cortem com tesoura este sítio e posteriormente o mesmo sítio de um plasmídeo. Posteriormente podemos simular como seria uma reação de ligação de todos esses fragmentos, e uma transformação bacteriana com os plasmídeos gerados. Por fim podemos discutir conceitos como clonagem de genes e bancos genômicos. Apresentamos exemplos de alguns dos modelos que podem ser construído na página www.ufsm.br/auladebio BIBLIOGRAFIA COMPLEMENTAR PARA A PARTE PRÁTICA: LORETO, E.L.S. & SEPEL, L. M.N. Atividades experimentais e didáticas de Biologia Molecular e Celular. Ribeirão Preto, ed. Da Sociedade Brasileira de Genética. 2003. 2a ed. www.sbg.org.br DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA, UFPR. Bioquímica: aulas práticas. 5 ed.Curitiba, Ed. da UFPR, 1997. JORDÃO, B.Q e colaboradores. Práticas de Biologia Celular. Londrina, Editora UEL, 1998. JUNQUEIRA, L.C.U e JUNQUEIRA, L.M.M.S. Técnicas Básicas de Citologia e Histologia. São Paulo, Ed. Santos, 1983. MANARA, N.T.F. Roteiro de aulas práticas de citologia vegetal. Santa Maria, Faculdade de Agronomia-UFSM, (mimeografado-sem data). MELLO, M.L.S. e VIDAL, B.C.; Práticas de Biologia Celular. São Paulo, Edgar Blücher, 1980. POLIZELI, M.L.T.M., Manual Prático de Biologia Celular. Ribeirão Preto, Holos editora, 1999. QUESADO, H.L.C. e colaboradores. Biologia: Práticas. Fortaleza, Edições UFC, 1996. SLATER, J. Experiments in molecular biology. Clifton, N.J., The Humana Press, 1986. VALLE, F.C., Práticas de citologia e genética. Rio de Janeiro, MEDSI, 2001. 66