Estrutura Gênica e Definição de Termos
 Gene: toda a seqüência de ácido nucléico que é necessária
para a síntese de um polipeptídeo funcional ou molécula de
RNA.
 Promotor: a seqüência mínima necessária do DNA que é
reconhecida pela RNA polimerase para que a transcrição se
inicie corretamente. Faz parte do gene.
 Elementos Reguladores em Cis: segmentos de DNA que
antecedem a seqüência codificadora e regulam a iniciação da
transcrição. Fazem parte do gene.
 Unidade de Transcrição: segmento de DNA que codifica a
seqüência no transcrito primário.
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Estrutura Gênica e Definição de Termos (2)
 Transcrição: processo de formação de RNA a partir de uma
fita molde de DNA.
 Splicing: Corte seletivo do transcrito primário.
 Transcrito primário: segmento de RNA com os introns e os
exons.
 Exon: segmento do DNA que é transcrito em RNA e traduzido
em proteína.
 Intron: Segmento de DNA que é transcrito para o RNA, mas é
cortado antes da tradução.
 Tradução: processo de formação de uma proteína nos
ribossomos usando o RNAm para determinar a seqüência de
aminoácidos.
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3
EXPRESSÃO GÊNICA
A expressão gênica é o processo em que a informação
contida em um determinado gene é decodificada em
uma proteína.
Regulação da expressão gênica em qualquer uma das
etapas do processo pode levar a uma expressão gênica
diferencial.
Expressão constitutiva ocorre para genes
indispensáveis à sobrevivência, os quais expressam-se
em todas as células, o tempo todo.
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Objetivos da regulação da expressão gênica
Bactérias:
 o controle da expressão gênica serve principalmente para
permitir que as células se ajustem às mudanças
nutricionais no ambiente, de forma que o seu crescimento e
divisão sejam otimizados.
Organismos multicelulares:
 a expressão gênica controlada regula um programa
genético fundamental para o desenvolvimento embrionário
e a diferenciação.
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Expressão gênica em bactérias
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Operon de E. coli
 Operon
 Séries de genes que codificam para produtos
específicos e os elementos reguladores que
controlam esses genes.
 Lac operon
 Segmento de DNA necessário para a
produção de enzimas responsáveis pelo
metabolismo da lactose.
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Lac operon - Definição
Genes estruturais para o metabolismo da lactose
são expressos apenas quando a lactose está
presente no meio de incubação da bactéria.
Como o operon controla a expressão dos
genes?
Repressão
Ativação
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Partes do Lac operon
 Operador (O)
 segmento do DNA no qual se liga uma
proteína inibidora que bloqueia a transcrição.
 Promoter (P)
 segmento do DNA reconhecido pela RNA
polimerase e que promove a transcrição.
 Genes estruturais (z, y, a)
 Genes que codificam para polipeptídeos
específicos.
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Partes do Lac Operon
Seqüência que
codifica a
proteína
repressora (i) e
seu promotor (p)
p = promotor
o = operador
Lac operon
z, y, a = genes
estruturais
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Repressão
 Quando a lactose está ausente:
Um proteína repressora liga-se ao DNA na seqüência do
operador (o) e impede a ligação da RNA polimerase ao
DNA
• Resultado: Não ocorre transcrição dos genes
que codificam para as enzimas que metabolizam
lactose (z, y, a).
 O controle da transcrição é devido ao gene regulador (i) que
codifica para a produção da proteína repressora.
 A seqüência de DNA que codifica a proteína repressora (i)
não faz parte do Lac operon.
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Ativação
 Início da transcrição só ocorre quando a proteína
repressora é retirada.
 Quando a lactose está presente, liga-se à proteína
repressora no operador (o)
Resultado: A proteína repressora desliga-se do DNA e a
RNA polimerase pode iniciar a transcrição dos genes
estruturais (z, y, a).
 Lactose é o indutor da expressão gênica, pois sua
presença resulta na indução da expressão dos genes.
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REPRESSÃO
Ausência de
lactose
Proteína
repressora
ATIVAÇÃO
Presença de
lactose
lactose
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Expressão Gênica em Eucariotos
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Expressão Gênica em Eucariotos
 Genomas são muito maiores em eucariotos do que em
procariotos.
 DNA dos eucariotos está localizado em vários
cromossomos ao invés de um único cromossomos
circular dos procariotos.
 Os eucariotos são geralmente multicelulares,
 Diferentes tipos células precisam produzir diferentes
proteínas;
 Nem todos os genes serão expressos em todas as células.
 Não são encontrados operons nos eucariotos.
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Como uma célula eucariótica controla
quais proteínas que ela fabrica?
Controlando quando e como um determinado gene é
transcrito;
Controlando como um transcrito primário de RNA sofre
o “splicing” ou é processado;
Selecionando quais RNAm são traduzidos;
Ativando ou inativando seletivamente as proteínas
depois da sua síntese.
 Controlando a velocidade de degradação das
proteínas ativas.
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Pontos de controle da expressão
gênica em eucariotos
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Morfogênese: plantas vs. animais
Animais:
 Movimentos de células e tecidos são
necessários no desenvolvimento
embrionário para chegar à forma final
do organismo.
 Continuidade do desenvolvimento
nos adultos restrito à diferenciação
de células continuamente repostas
ao longo da vida.
Plantas:
 Morfogênese e crescimento ao longo
de toda a vida da planta;
 Meristemas apicais mantém-se com
características embrionária,
responsáveis pelo contínuo
crescimento das plantas.
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Expressão gênica diferencial
 As diferenças entre células advém das
diferença na expressão gênica (genes ligados
e desligados), e não da diferença nos
genomas.
Evidências:
 Equivalência Genômica: todas as células de
um organismo tem os mesmos genes.
 Totipotência: células podem manter o
potencial zigótico para formar todas partes do
organismo maduro (células vegetais;
clonagem)
 Determinação: restrição do potencial de
desenvolvimento, resultando na limitação das
possibilidades de desenvolvimento de cada
célula à medida que o embrião se desenvolve;
alteração nos RNAm transcritos.
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Técnicas para detectar
expressão gênica diferencial
Eletroforese
bidimensional
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Determinação  Diferenciação
 Determinação: à medida que o embrião se
desenvolve, o destino possível de cada célula
torna-se mais limitado.
 Diferenciação: especialização das células
depende do controle da expressão gênica.
 Indução: a habilidade de um grupo de células
embrionárias em influenciar o desenvolvimento
de outro; determinantes citoplásmicos que
regulam a expressão gênica. (efeito de
vizinhança)
 Genes homeóticos: genes que controlam o
plano corporal global através do controle do
destino de desenvolvimento de grupos de
células.
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Diferenças na iniciação da transcrição
entre eucariotos e bactérias (1)
RNA-polimerase:
 Bactérias contêm um único tipo de RNA-polimerase,
 Células eucarióticas apresentam três tipos:
• RNA-polimerase I ,
• RNA-polimerase II e
• RNA-polimerase III .
Início da transcrição:
 A RNA-polimerase bacteriana é capaz de iniciar a transcrição
sem o auxílio de proteínas adicionais.
 As RNA-polimerases eucarióticas precisam da ajuda de várias
proteínas: os fatores gerais de transcrição.
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Diferenças na Iniciação da Transcrição
em Eucariotos e Bactérias (2)
Seqüências reguladoras:
 Em eucariotos, tais seqüências podem estar localizadas no
DNA a milhares de pares de nucleotídeos distante do promotor
de um gene;
 Em bactérias, os genes são freqüentemente controlados por
uma única seqüência regulatória, tipicamente localizada
próxima ao promotor.
 A iniciação da transcrição em eucariotos deve levar em
consideração a compactação do DNA nos nucleossomos e
as formas mais compactas da estrutura da cromatina.
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As Três RNA-Polimerases das
Células Eucarióticas
 RNA-polimerase I - transcreve os genes para rRNA.
 RNA-polimerase II - transcreve todos os genes que
codificam proteínas, mais alguns genes que codificam
pequenos RNAs (p.ex., aqueles presentes nos
“spliceossomos”).
 RNA-polimerase III – transcreve os genes de tRNAs,
rRNA 5S e genes para pequenos RNAs estruturais.
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Fatores Gerais de Transcrição
Os fatores gerais de transcrição são proteínas
responsáveis:
 pelo posicionamento correto da RNA-polimerase
no promotor;
 ajudam na separação das fitas de DNA, para
permitir o início da transcrição e
 liberam a RNA-polimerase do promotor quando a
transcrição se inicia.
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Etapas na formação do
complexo de iniciação da
transcrição em eucariotos
 TFIID liga-se a região TATA,
possibilitando a ligação de TFIIB.
 A seguir ligam-se o TFIIF e RNApolimerase II.
 TFIIE, TFIIH e TFIIJ então se juntam
ao complexo.
 TFIIH usa ATP para fosforilar a
RNA-polimerase II, mudando a sua
conformação e liberando a RNApolimerase do complexo e
 Início da transcrição.
Fatores de Transcrição Seletivos
 Os promotores isolados são geralmente ineficientes. Fatores de
transcrição seletivos ligam-se à região “upstream” e a “enhancers” e
aumentam a iniciação da transcrição.
 Proteínas adicionais (mediadores, coativadores) podem ser necessárias
para estimular a transcrição.
 Proteínas que se ligam a seqüências de “enhancer” devem atuar de forma
semelhante àquelas que se ligam próximas ao promotor.
 O DNA entre o “enhancer” e o promotor forma uma alça para permitir que
as proteínas ativadoras ligadas ao “enhancer” façam contato com as
proteínas ligadas ao promotor.
 As proteínas reguladoras da expressão gênica (repressores e ativadores)
podem influenciar a iniciação da transcrição, mesmo quando estão ligadas
no DNA a milhares de pares de nucleotídeos distante do promotor.
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Fatores de Transcrição Seletivos
Fatores de transcrição
seletivos
Fatores de
transcrição
gerais
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Domínios Funcionais dos Fatores de
Transcrição Seletivos
São seqüências de aminoácidos no fator de transcrição:
Domínio de ligação ao DNA - liga a proteína no sítio de ligação
do DNA.
Seqüências de localização nuclear – necessárias para o
transporte da proteína para dentro do núcleo.
Domínio de ativação transcricional - realiza o contato com os
fatores gerais de transcrição.
Região de dimerização – requerido para formar homo- ou
heterodímeros com outras proteínas.
Domínio de ligação de ligante – necessário para ligação de
composto que pode funcionar como ativador do fator.
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Motivos de ligação nos fatores de transcrição
 Homeodomínio – consiste de três -hélices adjacentes. A maior parte do
contato com as bases do DNA é feita pela hélice 3. Exemplos: proteínas
Hox e outras proteínas reguladoras do desenvolvimento.
 Dedo de zinco (Zinc finger) - Esse motivo é constituido de uma -hélice
e uma folha  pregueada unidas por um íon zinco. Exemplos:
receptores de hormônios esteróides, Sp1.
 Região básica e zíper de leucina (ou bZip) – A região básica serve para o
contato com o DNA e o zíper de leucina serve para a formação do dímero.
Exemplos: Fos, Jun (complexos Fos-Jun teriam função central na
mediação de resposta nuclear a sinais na superfície celular)
 Hélice-alça-hélice – Contém um motivo estrutural muito semelhante a bzip, exceto que uma alça não helicoidal separa as duas -hélices em
cada monômero. Exemplo: MyoD (fator regulador importante na
determinação e diferenciação de músculo).
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Zipper de leucina
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Genes Eucarióticos São Regulados por
Combinação de Proteínas
A maioria das proteínas reguladoras de genes atuam
como parte de um “comitê” de proteínas reguladoras,
todas essenciais para a expressão de um determinado
gene na célula correta, em reposta a uma dada condição,
no tempo certo e no nível requerido.
O termo controle combinatorial refere-se a forma como
grupos de proteínas trabalham juntas para determinar a
expressão de um único gene.
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Ação de
fatores de
transcrição
gerais e
seletivos
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Uma única proteína pode coordenar a
expressão de diferentes genes
 Embora o controle da expressão gênica em eucariotos seja
combinatorial, o efeito de uma única proteína reguladora pode
ser decisiva para ligar e desligar, simplesmente completando a
combinação necessária para ativar ou reprimir um gene.
 Exemplo: Em seres humanos, o receptor de glicocorticóide. Para
se ligar aos sítios no DNA, o receptor precisa formar um
complexo com uma molécula de um hormônio esteróide (p.ex.
cortisol). Em resposta aos hormônios glicocorticóides, as
células do fígado aumentam a expressão de vários genes.
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Efeito de uma única proteína reguladora
na diferenciação celular
 Estudos com células musculares em diferenciação, em
meio de cultura, possibilitaram a identificação de
proteínas reguladoras importantes, expressadas
somente em células musculares, que coordenam a
expressão gênica.
 Quando o gene que codifica uma dessas proteínas
reguladoras, MyoD, é introduzido em fibroblastos, eles
passam a se comportar como mioblastos e fundem-se
para formar células semelhantes às musculares.
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Um Único Gene que Codifica uma Proteína Reguladora
Pode Estimular a Formação de um Órgão Inteiro
Estudos sobre o desenvolvimento de olho em Drosophila,
camundongo e humanos mostraram que um único gene
que codifica uma proteína reguladora (Ey em moscas e
Pax6 em vertebrados) é crucial para o desenvolvimento do
olho.
Quando expressado num tipo celular apropriado, Ey pode
desencadear a formação do órgão inteiro (olho), composto
de diferentes tipos de células, todas corretamente
organizadas no espaço tridimensional.
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Influência da Estrutura da Cromatina na
Transcrição em Eucariotos
A maior parte do DNA em uma célula eucariótica está
complexada nos nucleossomos e a estrutura espiralada
dificulta o acesso de fatores de transcrição e da RNApolimerase.
 A iniciação da transcrição depende da remoção dos
nucleossomos da região promotora do gene.
 Durante
a síntese de DNA, quando os nucleossomos são
substituídos, poderia haver competição entre as histonas e os
fatores de transcrição (p.ex. TFIID) pelos sítios promotores.
 A ligação e ruptura dos nucleossomos por ativadores.
37
Empacotamento do DNA e
a expressão gênica
 O empacotamento do DNA ao
redor das histonas pode silenciar
grandes trechos do genoma, às
vezes de maneira não reversível
em determinados tipos celulares.
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Ruptura e Reorganização do Nucleossomo
Complexos poderiam estar envolvidos na ruptura dos
nucleossomos:
 Participação
de fator GAGA e fator de remodelamento de
nucleossomo (nucleosome-remodeling factor, NURF)
 Participação do complexo SW1/SNF
 Existe uma boa correlação entre acetilação de histona e a atividade
transcricional da cromatina.
Competição entre histonas e fatores de transcrição poderia
estar envolvida no controle da expressão gênica.
39
Desmontagem
dos
nucleossomos
 Enquanto o TATA
box está enovelado
no nucleossomo,
não se inicia a
ligação dos fatores
gerais de
transcrição.
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Regiões Controladoras de Lócus (Locus
Control Regions, LCRs)
Regiões controladoras de lócus (LCRs) são seqüências
de DNA essenciais para o estabelecimento de uma
configuração “aberta” da cromatina.
Elas são capazes de inibir a transcrição normal de áreas
relativamente grandes contendo vários genes. Um dos
mais bem estudados é o LCR que controla a expressão
tecido-específica da família de -globin.
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42
Expressão diferencial em função da
etapa do desenvolvimento
Vida intra-uterina
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“Splicing” diferencial do transcrito primário
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Metilação do promotor e
inatividade gênica
 Em células sangüíneas vermelhas de humanos e de galinhas, o
DNA que codifica para a síntese de globina está completamente
(ou quase completamente) não-metilado.
 O gene de ovalbumina de galinha não está metilado nas células
do oviduto, mas metilado nos outros tecidos.
 Nos somitos de camundongo, a demetilação de um “enhancer” de
MyoD antecede a transcrição do gene MyoD e é essencial para a
especificação dessas células como precursoras de músculo.
47
Um pouco de regulação da expressão gênica
nos separa dos ...
Genomas 98,5% idênticos
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