JULIANA DA SILVA LEITE
AVALIAÇÃO DA RESPOSTA INFLAMATÓRIA GASTRODUODENAL
PELA IMUNO-HISTOQUÍMICA ASSOCIADA À INVESTIGAÇÃO DE
Helicobacter spp. EM CAVALOS DE CORRIDA
Niterói
2009
UFF
Juliana da Silva Leite
2009
JULIANA DA SILVA LEITE
AVALIAÇÃO DA RESPOSTA INFLAMATÓRIA
GASTRODUODENAL PELA IMUNO-HISTOQUÍMICA
ASSOCIADA À INVESTIGAÇÃO DE Helicobacter spp. EM
CAVALOS DE CORRIDA
Tese apresentada ao Curso de Pós-Graduação em
Patologia da Universidade Federal Fluminense, como
requisito parcial para obtenção do Grau de Doutor.
Área de concentração: Anatomia Patológica
Veterinária.
Orientadora: Profª. Drª. Ana Maria Reis Ferreira
Niterói
2009
UFF
Juliana da Silva Leite
2009
L
Leite, Juliana da Silva
Avaliação da resposta inflamatória
gastroduodenal pela imuno-histoquímica associada
a investigação de Helicobacter spp. em cavalos de
corrida / Juliana da Silva Leite. – Niterói, 2009.
186f.
Tese de Doutorado (Anatomia Patológica
Veterinária – Programa de Pós-Graduação em
Patologia) – Universidade Federal Fluminense
Orientador: Ana Maria Reis Ferreira
Bibliografia: f. 162-183
1.GASTRODUODENITE 2.EQÜINO
3. Helicobacter spp. I. Universidade Federal
Fluminense. II. Título.
UFF
Juliana da Silva Leite
2009
JULIANA DA SILVA LEITE
AVALIAÇÃO DA RESPOSTA INFLAMATÓRIA GASTRODUODENAL PELA
IMUNO-HISTOQUÍMICA ASSOCIADA À INVESTIGAÇÃO DE HELICOBACTER
SPP. EM CAVALOS DE CORRIDA
Tese apresentada ao Curso de Pós-Graduação
em Patologia da Universidade Federal
Fluminense, como requisito parcial para
obtenção do Grau de Doutor.
Área de concentração: Anatomia Patológica
Veterinária
Aprovado em 05 de outubro de 2009.
BANCA EXAMINADORA
Profª. Drª. Gisele Braziliano de Andrade (examinador prévio)
Universidade Católica Dom Bosco
Profª. Drª. Terezinha de Jesus Sirotheau Corrêa
(examinador prévio)
Universidade Federal Fluminense
Prof. Dr. Fernando Queiroz de Almeida
Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro
Drª. Ana Paula Delgado da Costa
Universidade Estadual Norte Fluminense
Prof. Drª. Marcela Freire Vallim de Mello
Universidade Federal Fluminense
UFF
Juliana da Silva Leite
2009
AGRADECIMENTOS
À Profª Drª Ana Maria Reis Ferreira, pelo modelo profissional que é para mim,
pelo acolhimento em seu grupo de pesquisa, por ser parte imprescindível de minha
formação profissional, pelo apoio e pela amizade ao longo desses anos de
convivência. Principalmente, não posso deixar de agradecer por ter confiado na
minha capacidade de executar este trabalho, e por ter apoiado meus sonhos.
Ao Prof. Leopoldo José Cury, pelo total apoio na realização do trabalho.
Ao médico veterinário Ricardo Summa, pela oportunidade de pesquisar nos
eqüinos do Jockey Club do Rio de Janeiro.
Ao Prof. Fernando Queiroz de Almeida e sua equipe de alunos, pela
colaboração no trabalho.
Ao Prof. Aloysio de Mello Figueiredo Cerqueira, por ter aberto as portas de
seu laboratório e pelo apoio na realização do trabalho e à sua equipe de alunos, pela
colaboração.
UFF
Juliana da Silva Leite
2009
À Profª Eliene Carvalho Fonseca, técnicas e funcionários do laboratório de
Imuno-histoquímica do Hospital Universitário Antônio Pedro, pela colaboração e
auxílios indispensáveis prestados.
Ao técnico Antônio Carlos dos Santos pela paciente disponibilidade, apoio, e
pelo brilhantismo na arte do processamento das amostras e confecção das lâminas.
Aos técnicos e funcionários da técnica histológica, pelo auxílio no
processamento das amostras.
Aos funcionários, estagiários, residentes e médicos veterinários do Hospital
do Jockey Club do Rio de Janeiro, por todo auxílio prestado.
À coordenadora do Programa de Pós-graduação em Patologia da UFF, Profª
Drª Eliane Pedra Dias e à secretária Thereza Christina Fontana, por todo o apoio e
particular atenção.
Aos professores, funcionários e colegas do Programa de Pós-graduação em
Patologia da UFF, pela colaboração e auxílio.
À Profª Ana Beatriz Soares Monteiro, do Departamento de Estatística do
Instituto de Matemática da UFF, pelo auxílio com a análise estatística dos dados
pesquisados.
À Profª Marcela Freire Vallim de Mello, pela amizade, auxílio em minha
formação profissional e apoio.
Á Profª Elan Cardoso Paes de Almeida e Profª Daniela de Carvalho Martins,
pela amizade e auxílio em minha formação profissional.
A Isabel Meschesi Pinheiro, Rodrigo de Macedo Couto e Natacha Rosa
Barreto, por todo o apoio prestado.
Ao CNPq, pelo apoio financeiro.
UFF
Juliana da Silva Leite
2009
Aos amigos e colegas do grupo de pesquisa da Profª Ana Ferreira, que
acompanharam e compuseram a minha formação profissional e pessoal e que, sem
dúvidas, foram essenciais na realização deste trabalho.
Aos meus amigos, meus avós, tios, tias, padrinhos, e primos pelo amor e
incentivo ao longo da vida.
Ao meu namorado, pelo seu amor e por ter me acompanhado bravamente ao
longo desta caminhada.
Aos meus pais e meu irmão por todo o amor, apoio incondicional, incentivo,
oportunidades ao longo da vida e principalmente por terem me permitido sonhar.
À Deus por me dar a vida, inspiração, oportunidades de crescimento e por ter
me permitido a realização de muitos sonhos.
UFF
Juliana da Silva Leite
2009
RESUMO
As gastroduodenites e a úlcera gastroduodenal são enfermidades
extremamente comuns em cavalos de corrida. Elas trazem desconforto para o
animal e perdas econômicas significativas devido à queda de desempenho.
Especula-se que tanto o treinamento de corrida quanto à presença de Helicobacter
spp. podem exercer um importante papel nessa patogênese. Além disso, não
existem relatos sobre a infecção pelo Helicobacter spp. em eqüinos no Brasil e muito
pouco se estudou no mundo. O objetivo desse trabalho foi avaliar pela imunohistoquímica a reação inflamatória gastroduodenal e investigar a presença de
Helicobacter spp. na mucosa gástrica de eqüinos sob treinamento de corrida. Foram
necropsiados 15 eqüinos e coletadas amostras da mucosa gástrica das regiões do
fundo glandular, fundo aglandular, margo plicatus, antro, piloro e duodeno para a
realização do teste rápido da uréase (TRU), exame bacterioscópico direto (EBD),
histopatologia com as colorações hematoxilina-eosina (HE) e Warthin-Starry (WS), e
imuno-histoquímica (IHQ) com os anticorpos anti- H.pylori, anti mieloperoxidase
(MPO), anti-CD3 e anti-CD20. As alterações macroscópicas encontradas nesses
animais foram muco, exsudato fibrinoso, sangue, edema, eritema, hiperqueratose e
hemorragia. A histopatologia revelou infiltrado inflamatório linfoplasmocitário leve a
acentuado difuso ao longo da mucosa, com algumas áreas de infiltração de
polimorfonucleares, demonstrando atividade. Além disso, todos os animais
apresentavam algum grau de acantose e hiperqueratose na região aglandular do
estômago. Foram observadas erosões e úlceras com freqüência de 64,3% e 19,6%
das amostras respectivamente. No TRU, 5 dos 9 eqüinos avaliados apresentaram
positividade. O EBD revelou a presença de cocos e bacilos em 10 animais. A
coloração WS mostrou impregnação pela prata de cocos e/ou bacilos em forma de
vírgula ou ligeiramente espiralados em todos os animais estudados. A imunohistoquímica revelou a presença de Helicobacter spp. no estômago de 14 eqüinos
tanto na região aglandular quanto na região glandular. WS e IHQ foram
estatisticamente semelhantes em seus resultados.O Antro foi a região mais
colonizada pela bactéria.A região gastroduodenal com maior número de
polimorfonucleares (MPO+) por campo foi a margo plicatus. Já o duodeno foi a
região gastroduodenal com maior número de linfócitos T (CD3+) e B (CD20+) por
campo. Um maior número células CD3 positivas infiltrando a mucosa foi relacionado
a presença de Helicobacter spp. Portanto, os eqüinos são susceptíveis à infecção
natural por Helicobacter spp.. A infiltração de células inflamatórias está intimamente
ligada ao tipo de alteração histopatológica presente, como por exemplo, erosão e
depósito de fibrina estão associados a um aumento na infiltração de células CD3 e
CD20 positivas, enquanto que úlceras, elevam o número de células MPO- positivas.
Já a presença de Helicobacter spp. esta associada a infiltração de linfócitos T. Por
outro lado, diversos fatores podem estar relacionados ao desenvolvimento de lesões
gástricas, sendo necessários mais estudos sobre a relação entre Helicobacter spp. e
enfermidades gástricas, e a atuação das células inflamatórias nessa patogênese.
Palavras-chave:
histoquímica.
UFF
Helicobacter,
Gastroduodenite,
Juliana da Silva Leite
cavalo
de
corrida,
imuno-
2009
ABSTRACT
Gastroduodenites and gastroduodenal ulceration are frequent diseases of
Thoroughbred racehorses. They bring discomfort to the animal and economical
losses due to a drop in performance. It is speculated that both the training race and
Helicobacter spp. infection can play an important role in the pathogenesis of
gastroduodenal disease. In addition, in Brazil, there are no reports of Helicobacter
spp. infection of the horse gastric mucosa and there are very few researches about it
around the world. The aim of this study was to evaluate by immunohistochemistry the
inflammatory gastroduodenal reaction and investigate Helicobacter spp. in the
gastroduodenal mucosa of Thoroughbred racehorses. Necropsy was performed in 15
horses and samples of the gastric regions (aglandular fundus, glandular fundus,
margo plicatus, antrum, pylorus and duodenum) were obtained. Urease rapid test,
direct bacterioscopic exam, histopathology (H&E and Warthin-Starry stains), and
Immunohistochemistry (anti- H.pylori, anti-Myeloperoxidase, anti CD3 and anti-CD20
antibodies) were performed. The macroscopic changes found in these animals were
mucus, fibrin exudate, blood, edema, erythema, hyperkeratosis and hemorrhage.
Histopathology revealed mild to severe diffuse lymphoplasmacytic infiltrate
throughout the mucosa sometimes accompanied by areas of polymorphonuclear
infiltration, a feature that shows activity. In addition, all animals showed some degree
of acanthosis and hyperkeratosis in the glandular stomach. Erosions and ulcers
frequencies were 64.3% and 19.6% respectively. Urease activity was detected in five
of the nine tested animals. Rods or even round coccoid-shaped organisms were
detected in 10 animals. Warthin-Starry stain showed silver impregnated coccus and
curved rods in all horses. Immunohistochemistry detected Helicobacter spp. in the
glandular and squamous mucosa of 14 horses. The antrum was the most colonized
region. Warthin Starry and Immunohistochemistry had statistically similar results. The
gastroduodenal region with the highest number of polymorphonuclear cells (MPO +)
per field was the margo plicatus. And the duodenum was the gastroduodenal region
with the highest number of T (CD3 +) and B (CD20 +) lymphocytes per field.
Helicobacter spp. infection was associated with higher numbers of CD3 positive cells
infiltrating the gastroduodenal mucosa. Therefore, the horses are susceptible to
natural infection with Helicobacter spp.. The inflammatory cell infiltration is closely
linked to the kind of histopathologic changes, for example, erosion and deposition of
fibrin are associated to an increased infiltration of CD3 and CD20 positive cells, while
ulcers, increase the number of MPO-positive cells . Helicobacter spp. colonization is
associated with T lymphocytes infiltration. Moreover, several factors may be related
to the development of gastroduodenal lesions. Further studies on that matter are
necessary in order to establish the relationship between Helicobacter spp.,
gastroduodenal disorders and inflammatory cells in this pathogenesis.
Key words: Helicobacter, gastroduodenitis, racehorse, immunohistochemistry.
UFF
Juliana da Silva Leite
2009
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 – Fatores que afetam o desenvolvimento de ulceras .............................34
Tabela 2 - Principais dados dos cavalos de corrida Puro Sangue Inglês avaliados
(n=15), Niterói, 2009. ........................................................................77
Tabela 3 - Freqüência dos graus de gastrite e enterite dos cavalos de corrida
avaliados (n=15) com base nos parâmetros de avaliação da divisão
endoscópica do Sistema Sidney Atualizado, Niterói, 2009 ...............82
Tabela 4 – Freqüência dos graus observados na mucosa gástrica dos cavalos de
corrida estudado (n=15) de acordo com a classificação proposta pelo
Conselho da Síndrome da Ulcera Gástrica Eqüina (SUGE), Niterói,
2009 ..................................................................................................84
Tabela 5– Resultados do teste rápido da urease e regiões da mucosa
gastroduodenal positivas por eqüinos sob treinamento de corrida
avaliado (n=9).Niterói, 2009 ...............................................................85
Tabela 6 – Freqüência dos resultados do exame bacterioscópico direto em amostras
gastroduodenais dos eqüinos submetidos a treinamento de corrida
avaliados (n=14). Niterói, 2009. .........................................................86
Tabela 7 – Freqüência dos resultados da coloração especial de Warthin-Starry para
a pesquisa de Helicobacter spp. em amostras gastroduodenais dos
eqüinos submetidos a treinamento de corrida avaliados (n=14). Niterói,
2009. ..................................................................................................87
Tabela 8 – Freqüência dos resultados da imuno-histoquímica com anticorpo antiHelicobacter pylori. em amostras gastroduodenais dos eqüinos
UFF
Juliana da Silva Leite
2009
submetidos a treinamento de corrida avaliados (n=15). Niterói, 2009.
..............................................................................................................88
Tabela 9 – Resultados dos testes para detecção de Helicobacter spp. e status final
de infecção por eqüino submetido a treinamento de corrida avaliado
(n=15). Niterói, 2009. ........................................................................90
Tabela 10 – Freqüência das alterações histopatológicas observadas nas 112
amostras da mucosa gastroduodenal dos cavalos de corrida estudados
(n=15), Niterói, 2009............................................................................94
Tabela 11 – Freqüência em percentual de amostras das regiões da porção
aglandular do estômago dos eqüinos submetidos a treinamento de
corrida avaliados (n=15) quanto aos parâmetros histopatológicos da
camada basal, queratose e edema. Niterói, 2009. ...........................96
Tabela 12 – Resultados da avaliação de amostras das regiões da porção aglandular
do estômago dos eqüinos submetidos a treinamento de corrida
avaliados (n=15) quanto aos parâmetros do infiltrado inflamatório.
Niterói, 2009 .....................................................................................98
Tabela 13 – Resultados da avaliação de amostras das regiões da porção glandular
do estômago dos eqüinos submetidos a treinamento de corrida
avaliados (n=15) quanto aos parâmetros do infiltrado inflamatório.
Niterói, 2009 ......................................................................................99
Tabela 14 – Resultados da avaliação de amostras de duodeno dos eqüinos
submetidos a treinamento de corrida avaliados (n=15) quanto aos
parâmetros do infiltrado inflamatório. Niterói, 2009 .........................100
UFF
Juliana da Silva Leite
2009
Tabela 15 – Freqüência em percentual dos parâmetros histopatológicos do infiltrado
inflamatório obtidas da avaliação de amostras gastroduodenais dos
eqüinos submetidos a treinamento de corrida avaliados (n=15). Niterói,
2009 .................................................................................................101
Tabela 16 – Diagnóstico final após avaliação histopatológica das amostras
gastroduodenais dos eqüinos submetidos a treinamento de corrida
avaliados (n=15). Niterói, 2009 .......................................................102
Tabela 17 – Média do número células marcadas por campo pela imuno-marcação
com
anticorpo
anti-mieloperoxidase
em
amostras
gástricas
e
duodenais de cavalos PSI sob treinamento de corrida (n=15), Niterói,
2009 ................................................................................................104
Tabela 18 – Média do número células marcadas por campo pela imunorreação com
anticorpo anti-CD3 em amostras gástricas e duodenais de cavalos PSI
sob treinamento de corrida (n=15), Niterói, 2009 ...........................107
Tabela 19 – Média do número células marcadas por campo pela imunorreação com
anticorpo anti-CD20 em amostras gástricas e duodenais de cavalos
PSI sob treinamento de corrida (n=15), Niterói, 2009 ....................109
Tabela 20 – Freqüência das amostras positivas para os diferentes testes
diagnósticos para Helicobacter spp. por região analisada da mucosa
gastroduodenal dos eqüinos submetidos a treinamento de corrida
avaliados. Niterói, 2009 ...................................................................116
UFF
Juliana da Silva Leite
2009
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Gráfico 1 - Conteúdo luminal dos estômagos dos eqüinos submetidos a treinamento
de corrida avaliados (n=15), Niterói, 2009. ..........................................78
Gráfico 2 - Freqüência dos graus de exudato fibrinoso nos estômagos dos cavalos
de corrida avaliados (n=15). A lesão foi classificada em 0 = ausente; 1 =
leve; 2 = moderado; 3 = grave. Niterói, 2009. ..................................... 79
Gráfico 3 - Graduação das lesões da mucosa gástrica encontradas nos cavalos de
corrida avaliados (n=15). As lesões foram classificadas em 0 =
ausente; 1 = leve; 2 = moderado; 3 = grave. Niterói, 2009. ...............80
Gráfico 4 – Grau de inflamação da mucosa gastroduodenal dos cavalos de corrida
avaliados (n=15 para mucosa gástrica e n=11 para duodeno). A
inflamação foi graduada em 0= ausente; 1 = leve; 2 = moderado; 3 =
grave. Niterói, 2009. ...........................................................................81
Gráfico 5 – Avaliação da mucosa gástrica dos cavalos de corrida avaliados (n=15)
utilizando a graduação proposta pelo Conselho da Síndrome da Ulcera
Gástrica Eqüina (SUGE), na qual: 0-mucosa intacta; 1-mucosa com
áreas de hiperemia e/ou hiperqueratose (espessamento do epitélio
aglandular); 2- erosões ou úlceras pequenas (menores de 3 cm),
solitárias ou multifocais; 3- úlceras grandes (maiores de 3 cm), solitárias
ou multifocais, ou extensa erosão e sangramento; 4- úlceras extensas
(mais de 7 cm de diâmetro), com áreas de penetração submucosa
profunda (mais de 3 mm de profundidade). Niterói, 2009. ..................83
Gráfico 6 – Regiões gastroduodenais que apresentam erosão da mucosa em
cavalos de corrida (para DU n= 10; PI n = 11; FUA n=14 e para as
demais regiões n=15). Entende-se por PI = piloro; A.N. = antro; MP =
UFF
Juliana da Silva Leite
2009
margo plicatus; FUA = fundo aglandular; DU = duodeno. Niterói, 2009.
.............................................................................................................92
Gráfico 7 – Regiões gastroduodenais ulceradas de cavalos de corrida (para DU n=
10; PI n = 11; FUA n=14 e para as demais regiões n=15). Entende-se por
PI = piloro; A.N. = antro; MP = margo plicatus; FUA = fundo aglandular;
DU = duodeno. Niterói, 2009. ...............................................................93
Gráfico 8 – Média da contagem de células imunomarcadas pelo anticorpo antimieloperoxidase em amostras da mucosa gastroduodenal dos cavalos
de corrida avaliados que foram distribuídas em dois grupos de lesão e de
coleta padrão. Niterói, 2009. ..............................................................105
Gráfico 9 – Número de amostras da mucosa gastroduodenal dos cavalos de corrida
avaliados que foram distribuídas nos grupos do padrão de coleta e lesão.
FUA = fundo aglandular, MP = margo plicatus, FUG = fundo aglandular,
AN = antro, PI = piloro, DU=duodeno. Niterói, 2009. ........................111
Gráfico 10 – Média do números de células marcadas por campo pelo anticorpo antimieloperoxidase em amostras da mucosa gastroduodenal dos cavalos
de corrida avaliados que foram distribuídas de acordo com a região
estudada. FUA = fundo aglandular, MP = margo plicatus, FUG = fundo
aglandular, AN = antro, PI = piloro, DU=duodeno. Niterói, 2009. .......113
Gráfico 11 – Média do números de células marcadas por campo pelo anticorpo antiCD3 em amostras da mucosa gastroduodenal dos cavalos de corrida
avaliados que foram distribuídas de acordo com a região estudada. FUA
= fundo aglandular, MP = margo plicatus, FUG = fundo aglandular, AN =
antro, PI = piloro, DU=duodeno. Niterói, 2009.. .................................114
UFF
Juliana da Silva Leite
2009
Gráfico 12 – Média do números de células marcadas por campo pelo anticorpo antiCD20 em amostras da mucosa gastroduodenal dos cavalos de corrida
avaliados que foram distribuídas de acordo com a região estudada. FUA
= fundo aglandular, MP = margo plicatus, FUG = fundo aglandular, AN =
antro, PI = piloro, DU=duodeno. Niterói, 2009. .................................115
Gráfico 13 – Freqüência de amostras de cada região da mucosa gastroduodenal
dos cavalos de corrida avaliados que foram distribuídas de acordo com
os resultados da coloração Warthin-Starry para a detecção de
Helicobacter spp.. FUA = fundo aglandular, MP = margo plicatus, FUG =
fundo aglandular, AN = antro, PI = piloro, DU=duodeno. Niterói, 2009.
...............................................................................................................117
Gráfico 14 – Freqüência de amostras de cada região da mucosa gastroduodenal
dos cavalos de corrida avaliados que foram distribuídas de acordo com
os resultados da reação imuno-histoquímica com o anticorpo antiHelicobacter pylori. FUA = fundo aglandular, MP = margo plicatus, FUG
= fundo aglandular, AN = antro, PI = piloro, DU=duodeno. Niterói, 2009.
...............................................................................................................118
Gráfico 15 – Freqüência de amostras de cada região da mucosa gastroduodenal
dos cavalos de corrida avaliados que foram distribuídas de acordo com o
status final de infecção por Helicobacter spp.. FUA = fundo aglandular,
MP = margo plicatus, FUG = fundo aglandular, AN = antro, PI = piloro,
DU=duodeno. Niterói, 2009. ..............................................................119
Gráfico 16 – Média da contagem de células imunomarcadas pelo anticorpo antimieloperoxidase em amostras da mucosa gastroduodenal dos cavalos
de corrida avaliados que foram distribuídas nos parâmetros observados
do epitélio . Niterói, 2009. ..................................................................121
UFF
Juliana da Silva Leite
2009
Gráfico 17 – Média da contagem de células imunomarcadas pelo anticorpo anti-CD3
em amostras da mucosa gastroduodenal dos cavalos de corrida
avaliados que foram distribuídas nos parâmetros observados do epitélio.
Niterói, 2009. ......................................................................................122
Gráfico 18 – Média da contagem de células imunomarcadas pelo anticorpo antiMieloperoxidase em amostras da mucosa gastroduodenal dos cavalos
de corrida avaliados que foram distribuídas nos tipos de infiltrado
inflamatório. Niterói, 20. ......................................................................123
Gráfico 19 – Média da contagem de células imunomarcadas pelo anticorpo antiMieloperoxidase em amostras da mucosa gastroduodenal dos cavalos
de corrida avaliados que foram distribuídas quanto à localização de
infiltrado inflamatório. Niterói, 2009. ...................................................124
Gráfico 20 – Média da contagem de células imunomarcadas pelo anticorpo antiMieloperoxidase em amostras da mucosa gastroduodenal dos cavalos
de corrida avaliados que foram distribuídas quanto ao grau de infiltrado
inflamatório. Niterói, 2009. ..................................................................125
Gráfico 21 – Média da contagem de células imunomarcadas pelo anticorpo anti-CD3
em amostras da mucosa gastroduodenal dos cavalos de corrida
avaliados que foram distribuídas quanto ao grau de infiltrado
inflamatório. Niterói, 2009. .................................................................126
Gráfico 22 – Média da contagem de células imunomarcadas pelo anticorpo antimieloperoxidase em amostras da mucosa gastroduodenal dos cavalos
de corrida avaliados que foram distribuídas quanto aos tipos de edema.
Niterói, 2009. .....................................................................................127
UFF
Juliana da Silva Leite
2009
Gráfico 23 – Média da contagem de células imunomarcadas pelo anticorpo antiCD20 em amostras da mucosa gastroduodenal dos cavalos de corrida
avaliados que foram distribuídas quanto aos tipos de edema. Niterói,
2009. ................................................................................................128
Gráfico 24 – Média da contagem de células imunomarcadas pelo anticorpo anti-CD3
em amostras da mucosa gastroduodenal dos cavalos de corrida
avaliados que foram distribuídas quanto à presença de erosão. Niterói,
2009.
.............................................................................................................129
Gráfico 25 – Média da contagem de células imunomarcadas pelo anticorpo antiCD20 em amostras da mucosa gastroduodenal dos cavalos de corrida
avaliados que foram distribuídas quanto à presença de erosão. Niterói,
2009. ..................................................................................................130
Gráfico 26 – Média da contagem de células imunomarcadas pelo anticorpo antimieloperoxidase em amostras da mucosa gastroduodenal dos cavalos
de corrida avaliados que foram distribuídas quanto à presença de
úlceras. Niterói, 2009. .........................................................................131
Gráfico 27 – Média da contagem de células imunomarcadas pelo anticorpo anti-CD3
em amostras da mucosa gastroduodenal dos cavalos de corrida
avaliados que foram distribuídas quanto aos tipos de gastrite. Niterói,
2009. ..................................................................................................132
Gráfico 28 – Distribuição dos achados das glândulas gástricas de acordo com o
status final de infecção de Helicobacter spp. em amostras da mucosa
gastroduodenal dos cavalos de corrida avaliados. Niterói, 2009.
...............................................................................................................133
UFF
Juliana da Silva Leite
2009
Gráfico 29 – Distribuição dos graus de hemorragia de acordo com o status final de
infecção para Helicobacter spp. em amostras da mucosa gastroduodenal
dos cavalos de corrida avaliados. Niterói, 2009. ................................134
Gráfico 30 – Distribuição da contagem de CD3 de acordo com o status final de
infecção para Helicobacter spp. em amostras da mucosa gastroduodenal
dos cavalos de corrida avaliados. Niterói, 2009. ................................135
Gráfico 31 – Comparação entre os testes de Imuno-histoquímica com anticorpo antiHelicobacter pylori e Warthin-Starry para identificação de Helicobacter
spp. em amostras da mucosa gastroduodenal dos cavalos de corrida
avaliados. Niterói, 2009. .....................................................................136
Gráfico 32 – Comparação entre os testes de Imuno-histoquímica com anticorpo antiHelicobacter pylori e Teste rápido da urease para identificação de
Helicobacter spp. em amostras da mucosa gastroduodenal dos cavalos
de corrida avaliados. Niterói, 2009. ...................................................137
UFF
Juliana da Silva Leite
2009
Figura 1 – Organização do complexo receptor da Célula T (TCR-CD3). Subunidades
de ligação (TCRα and TCRβ) e subunidades de transdução de sinais
(CD3γ,CD3δ,CD3ε
and
CD3ζ).
Fonte:
http://pathmicro.med.sc.edu/bowers/ cd3.jpg. ......................................58
Figura 2 - A molécula CD20 humana. Fonte: van Meerten, Neth J Med. 67(7):251-9,
2009. ....................................................................................................60
Figura 3 - Expressão de CD20 no desenvolvimento da célula B. O antígeno CD20 é
expressado primeiramente durante o desenvolvimento precoce do prélinfócito B e é perdido durante a diferenciação terminal em plasmócito.
Adaptado de van Meerten, Neth J Med. 67(7):251-9, 2009. ...............61
Figura 4 - Estômago eqüino: padrão de coleta das amostras - três fragmentos do
fundo aglandular (FUA), três fragmentos da margo plicatus (MP), dois
fragmentos do fundo glandular (FUG), dois do antro (A.N.), um do piloro
(PI) e um do duodeno (DU). Niterói, 2009.. ..........................................68
Figura 5A - Aspecto macroscópico do estômago e porção anterior do duodeno de
cavalos de corrida Puro Sangue Inglês. Cavalo 6: Região de margo
plicatus com ulceração recente onde coágulo sanguíneo pode ser
observado na superfície da úlcera (seta verde) ..............................138
Figura 5B - Aspecto macroscópico do estômago e porção anterior do duodeno de
cavalos de corrida Puro Sangue Inglês. Cavalo 8: região do fundo
glandular com espessamento de rugas gástricas recobertas por
exudato fibrinoso (seta preta vazada) e exudato fibrinoso recobrindo a
mucosa associado a
erosão (seta verde); fundo aglandular (FUA)
apresentando úlcera extensa e profunda (seta preta). ...................138
UFF
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2009
Figura 5C - Aspecto macroscópico do estômago e porção anterior do duodeno de
cavalos
de
corrida
Puro
Sangue
Inglês.
Cavalo
14:
Focos
hemorrágicos na região do fundo glandular (seta preta), espessamento
do epitélio escamoso (seta verde) e duodeno (DU) com mucosa
hiperêmica irregular .........................................................................138
Figura 5D - Aspecto macroscópico do estômago e porção anterior do duodeno de
cavalos de corrida Puro Sangue Inglês. Cavalo 12: Região de margo
plicatus com área de ulceração crônica (setas) e espessamento do
epitélio escamoso ao redor da úlcera. ..............................................138
Figura 5E - Fotomicrografia de esfregaço da mucosa gástrica - exame bacteriológico
direto - de cavalos de corrida Puro Sangue Inglês. Região do fundo
aglandular do cavalo 3: notar bacilo e célula epitelial escamosa corados
em rosa. (fuccina fenicada, barra = 10 µm) .......................................138
Figura 5F - Fotomicrografia de esfregaço da mucosa gástrica - exame bacteriológico
direto - de cavalos de corrida Puro Sangue Inglês. Região de margo
plicatus do cavalo 10: notar bacilo curvo (fuccina fenicada, barra = 10
µm).. ...................................................................................................138
Figura 6A - Fotomicrografia do estômago de cavalos de corrida Puro Sangue Inglês.
Região de antro do cavalo 12: bacilos curvos impregnados pela prata na
luz de glândulas gástricas (Warthin-Starry; barra = 10µm). ...............139
Figura 6B - Fotomicrografia do estômago de cavalos de corrida Puro Sangue Inglês.
Região de fundo glandular do cavalo 12: bacilos curvos impregnados
pela prata na luz de glândulas gástricas. (Warthin-Starry; barra = 10µm).
..............................................................................................................139
Figura 6C - Fotomicrografia do estômago de cavalos de corrida Puro Sangue Inglês.
Região da prega margo plicatus do cavalo 9: impregnação pela prata de
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2009
bacilo em forma de vírgula na superfície do epitélio escamoso (seta).
(Warthin-Starry; barra = 10µm). .........................................................139
Figura 6D - Fotomicrografia do estômago de cavalos de corrida Puro Sangue Inglês.
Região da prega margo plicatus do cavalo 12: bacilos curvos corados em
vermelho
no
muco protetor e na superfície da célula foveolar.
(Marcação imuno-histoquímica pelo anticorpo anti-H. pylori, cromógeno
fast red, barra = 10 µm). ....................................................................139
Figura 6E - Fotomicrografia do estômago de cavalos de corrida Puro Sangue Inglês.
Região do fundo glandular do cavalo 4: bacilos corados em vermelho no
citoplasma de células parietais (seta). (Marcação imuno-histoquímica
pelo anticorpo anti-H. pylori, cromógeno fast red, barra = 10 µm). ....139
Figura 6F - Fotomicrografia do estômago de cavalos de corrida Puro Sangue Inglês.
Região da prega margo plicatus do cavalo 4: ausência de marcação em
cocos que se apresentavam na superfície do epitélio escamoso e
marcação em vermelho de bacilo espiralado. (Marcação imunohistoquímica pelo anticorpo anti-H. pylori, cromógeno fast red, barra = 10
µm). ....................................................................................................139
Figura 7A - Fotomicrografia da mucosa gastroduodenal de cavalos de corrida Puro
Sangue Inglês. Região da prega margo plicatus do cavalo 10: úlcera no
epitélio escamoso; hiperparaqueratose e acantose nos bordos da úlcera
(seta - A-F - HE, barra = 100 µm) .....................................................140
Figura 7B - Fotomicrografia da mucosa gastroduodenal de cavalos de corrida Puro
Sangue Inglês. Região de margo plicatus do cavalo 13: aglomerado
linfóide na união entre a mucosa glandular e o epitélio pavimentoso
estratificado. (seta - A-F - HE, barra = 100 µm) ................................140
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2009
Figura 7C – Fotomicrografia da mucosa gastroduodenal de cavalos de corrida Puro
Sangue Inglês. Região de antro do cavalo 13: foliculo linfóide próximo ao
epitélio de revestimento (seta - A-F - HE, barra = 100 µm) ...............140
Figura 7D - Fotomicrografia da mucosa gastroduodenal de cavalos de corrida Puro
Sangue Inglês. Região de fundo glandular do cavalo 12: atrofia leve de
glândulas gástricas e infiltrado inflamatório difuso. (seta - A-F - HE, barra
= 100 µm) ...........................................................................................140
Figura 7E - Fotomicrografia da mucosa gastroduodenal de cavalos de corrida Puro
Sangue Inglês. Duodeno do cavalo 14: Duodenite mononuclear grave,
notar folículo linfóide (FL) e infiltrado inflamatório grave. (seta - A-F - HE,
barra = 100 µm) .................................................................................140
Figura 7F - Fotomicrografia da mucosa gastroduodenal de cavalos de corrida Puro
Sangue Inglês. Duodeno do cavalo 14: infiltrado inflamatório grave
composto de linfócitos, plasmócitos, e eosinófilos (seta - A-F - HE, barra
= 100 µm) ...........................................................................................140
Figura 8A – Fotomicrografia do estômago de cavalos de corrida Puro Sangue
Inglês. Região do antro do cavalo 12: polimorfonucleares com marcação
citoplasmática em marrom infiltrando tecido conjuntivo que entremeia as
glandulas gástricas. (Marcação imuno-histoquímica pelo anticorpo antiMieloperoxidase, cromógeno diaminobenzidina, barra = 100 µm) .....141
Figura 8B - Fotomicrografia do estômago de cavalos de corrida Puro Sangue Inglês.
Região da prega margo plicatus do cavalo 12: polimorfonucleares com
marcação citoplasmática em marrom infiltrando tecido conjuntivo sub
epitelial. Notar epitélio escamoso (EE) (Marcação imuno-histoquímica
pelo anticorpo anti-Mieloperoxidase, cromógeno diaminobenzidina, barra
= 100 µm). ..........................................................................................141
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2009
Figura 8C - Fotomicrografia do estômago de cavalos de corrida Puro Sangue Inglês.
Duodeno do cavalo 13: linfócitos T imunomarcados em marrom
infiltrando a mucosa duodenal e posicionados na periferia de um folículo
linfóide
(Marcação
imuno-histoquímica
pelo
anticorpo
anti-CD3,
cromógeno diaminobenzidina, barra = 100 µm) .................................141
Figura 8D - Fotomicrografia do estômago de cavalos de corrida Puro Sangue Inglês.
Duodeno do cavalo 13: linfócitos T imunomarcados em marrom na
membrana em sua porção intracitoplasmática. (Marcação imunohistoquímica pelo anticorpo anti-CD3, cromógeno diaminobenzidina,
barra = 100 µm) ..................................................................................141
Figura 8E - Fotomicrografia do estômago de cavalos de corrida Puro Sangue Inglês.
Duodeno do cavalo 13: infócitos B imunomarcados em marrom
compondo o centro germinativo de um folículo linfóide. (Marcação
imuno-histoquímica
pelo
anticorpo
anti-CD20,
cromógeno
diaminobenzidina, barra = 100 µm) ....................................................141
Figura 8F - Fotomicrografia do estômago de cavalos de corrida Puro Sangue Inglês.
Duodeno do cavalo 13: F - Duodeno do cavalo 13: linfócitos B
imunomarcados em marrom no lado citoplasmático da membrana
celular.
(Marcação
imuno-histoquímica
pelo
anticorpo
anti-CD20,
cromógeno diaminobenzidina, barra = 100 µm) ................................141
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2009
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
AINEs = Antiinflamatórios não esteróides
°C = graus Celsius
CO2 = dióxido de carbono
DNA = ácido desoxiribonucléico
EBD = Exame Bacterioscópico direto
IgG = imunoglobulina G
IHQ = Imuno-Histoquímica
H2 = hidrogênio
HCL = ácidoclorídrico
HE = Hematoxilina-eosina
MHC = major histocompatibility complex
mm = milímetro
MPO = mieloperoxidase
µg/l = microgramas por litro
N2 = nitrogênio
PCR = Polymerase Chain Reaction
PSI = Puro Sangue Inglês
RNA = ácido ribonucléico
rRNA = ácido ribonucléico ribossomal
spp = (species) espécies
SUGE = Síndrome da úlcera gástrica eqüina
TCR = T-cell receptor : receptor da célula T
Th1 = célula T auxiliar 1
TRU = teste rápido da uréase
TTC = cloreto 2,3,5-trifeniil tetrazolium
UreI = canal de uréia I específico para Helicobacter gástrico
WS = Warthin-Starry
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2009
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO ................................................................................................... 6
2. REVISÃO DE LITERATURA ........................................................................... 29
2.1 O ESTÔMAGO EQUINO ................................................................................. 29
2.2 GASTRODUODENITE E ÚLCERA .................................................................. 31
2.2.1 Conceito e Ocorrência ................................................................................ 31
2.2.2 Etiologia, Fatores Predisponentes e Patogênese ................................... 33
2.3 Helicobacter spp................................................................................................ 39
2.3.1 Mecanismo de Adaptação ao Hospedeiro e Fatores de Virulência ....... 43
2.3.2 Diagnóstico e Tratamento .......................................................................... 46
2.3.3 Epidemiologia ............................................................................................. 50
2.3.4 Helicobacter spp. nos Animais de Grande Porte ..................................... 51
2.4 A IMUNIDADE DA MUCOSA ........................................................................... 54
2.5 MIELOPEROXIDASE ...................................................................................... 55
2.6 CD3 .................................................................................................................. 57
2.7 CD20 ................................................................................................................ 59
3 OBJETIVOS ....................................................................................................... 64
3.1 OBJETIVO GERAL .......................................................................................... 64
3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ............................................................................ 64
4 MATERIAL E MÉTODOS ................................................................................... 66
4.1 MATERIAL ....................................................................................................... 66
4.2 MÉTODOS ....................................................................................................... 67
4.2.1 Macroscopia e Coleta das Amostras ........................................................ 67
4.2.2 Teste Rápido da Urease ............................................................................. 68
4.2.3 Exame Bacteriológico Direto ...................................................................... 69
4.2.4 Exame Histopatológico .............................................................................. 69
4.2.5 Imuno-Histoquímica ................................................................................... 69
4.2.5.1 Helicobacter spp. ....................................................................................... 69
4.2.5.2 Mieloperoxidase ......................................................................................... 70
4.2.5.3 CD3 ............................................................................................................ 71
4.2.5.3 CD20 .......................................................................................................... 71
4.2.6 Análise de Resultados ............................................................................... 72
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2009
4.2.7 Análise Estatística ...................................................................................... 75
5 RESULTADOS ................................................................................................... 76
5.1 DADOS DOS CAVALOS AVALIADOS ............................................................ 76
5.2 ANÁLISE MACROSCÓPICA ........................................................................... 77
5.3 PADRÃO DE COLETA DE FRAGMENTOS .................................................... 84
5.4 INVESTIGAÇÂO DE HELICOBACTER SPP. .................................................. 85
5.4.1 Teste Rápido da Uréase ............................................................................. 85
5.4.2 Exame Bacterioscópico Direto .................................................................. 86
5.4.3 Coloração Especial de Warthin-Starry .................................................... 87
5.4.4 Imuno-histoquímica ................................................................................... 88
5.4.5 Status Final ................................................................................................. 89
5.5 ANÁLISE HISTOPATOLÓGICA: HEMATOXILINA -EOSINA .......................... 91
5.6 O INFILTRADO INFLAMATÓRIO PELA IMUNO – HISTOQUÍMICA ............. 103
5.6.1 Mieloperoxidase ......................................................................................... 103
5.6.2 CD3 .............................................................................................................. 106
5.6.3 CD20 ............................................................................................................ 108
5.7 ALTERAÇÕES HISTOPATOLÓGICAS X REGIÕES ...................................... 110
5.8 QUANTIFICAÇÃO DO INFILTRADO INFLAMATÓRIO X REGIÕES .............. 112
5.9 DETECÇÃO DE Helicobacter spp X REGIÕES .............................................. 115
5.10 ALTERAÇÕES HISTOPATOLÓGICAS X QUANTIFICAÇÃO DO INFILTRADO
INFLAMATÓRIO .................................................................................................... 120
5.11 Helicobacter spp. X ALTERAÇÕES HISTOPATOLÓGICAS ......................... 132
5.12 O Helicobacter spp. X QUANTIFICAÇÃO DO INFILTRADO INFLAMATÓRIO
................................................................................................................................ 135
5.13 AVALIAÇÃO DOS MÉTODOS DE DIAGNÓSTICO DE Helicobacter spp. ... 136
6 DISCUSSÃO ....................................................................................................... 142
7 CONCLUSÃO ..................................................................................................... 158
8 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .................................................................. 162
9 ANEXO ............................................................................................................... 184
9.1 PRODUÇÃO BIBLIOGRÁFICA ........................................................................ 184
9.1.1 Periódicos .................................................................................................... 184
9.1.2 Apresentação Oral ...................................................................................... 185
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2009
1
INTRODUÇÃO
O cavalo (Equus caballus) foi domesticado há mais de cinco mil anos, mas
a sua utilização no campo esportivo é mais recente, inclusive com o
desenvolvimento de uma raça exclusiva para a corrida no século XVII, a raça Puro
Sangue Inglês. Os animais desta raça têm como características principais a
velocidade, o equilíbrio e a resistência.
Para que essas características se convertam em um bom desempenho
esportivo, o cavalo deve estar hígido, mas geralmente o tipo de treinamento a que o
animal será submetido, assim como o sistema de criação e a alimentação interferem
no estado de saúde do animal e podem gerar uma susceptibilidade maior a
determinadas enfermidades.
27
Enfermidades extremamente comuns em cavalos de corrida são as
gastroduodenites e a úlcera gástrica. Uma ligação direta entre a Síndrome da úlcera
gástrica eqüina (SUGE) e a queda de performance vem sendo sugerida (Franklin et
al, 2008) e busca-se, dessa forma, uma comprovação científica para aquilo que já
vem sendo observado há anos. Uma vez que esta enfermidade traz desconforto
para o animal e perdas econômicas significativas devido à queda de performance,
ela pode ser considerada uma afecção extremamente importante para a Medicina
Veterinária voltada para eqüinos atletas.
Os mecanismos patogênicos da SUGE ainda precisam ser mais bem
esclarecidos pela comunidade científica. Apesar disso, se especula que tanto o
treinamento de corrida quanto à presença de Helicobacter spp. podem exercer um
importante papel nessa patogênese.
Já é sabido que Helicobacter spp. coloniza a mucosa gástrica de humanos
e animais silvestres e domésticos como cães, gatos, macacos, camundongos,
guepardos, furões, bovinos e suínos. A infecção pelo H. pylori em humanos é
intensamente estudada devido a sua associação com as diversas afecções
gástricas, como úlcera gástrica e duodenal, gastrite crônica ativa. Também,
predispõe ao adenocarcinoma gástrico e linfoma associado à mucosa gástrica. Em
eqüinos, foi recentemente encontrado na mucosa gástrica gene de Helicobacter
spp., apesar deste nunca ter sido isolado. O estudo da infecção pelo Helicobacter
spp. nesta espécie é praticamente nulo, e gerou dados favoráveis a sua presença
somente em 2001, não tendo sido estabelecida relação com as afecções gástricas.
UFF
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2009
28
Para um melhor entendimento dos mecanismos pelos quais H. pylori
causa gastrite e úlcera péptica no homem, os pesquisadores vêm estudando os
componentes do infiltrado inflamatório na mucosa gastroduodenal e a sua resposta
imune frente ao agente. Esta é uma tendência também na Medicina Veterinária e
estudos deste tipo vêm sendo realizados em cães, gatos e animais de laboratório. A
dificuldade para a realização destes estudos em animais é a falta de parâmetros de
normalidade para o sistema imune difuso na mucosa. Somente recentemente os
primeiros trabalhos de quantificação de células do sistema imune no trato
gastrintestinal vêm sendo desenvolvidos em cães, e em eqüinos apenas os
eosinófilos foram devidamente quantificados em eqüinos normais (Rötting et al,
2008).
Em virtude da importância clínica, científica e econômica das úlceras
gástricas e gastroduodenites em cavalos atletas, pretende-se neste estudo abordar
estas enfermidades nos cavalos de corrida do Rio de Janeiro, estudando a resposta
inflamatória da mucosa através da imuno-histoquímica associada à investigação da
presença de Helicobacter spp. no trato gastroduodenal desses animais. A
abordagem da resposta inflamatória gastroduodenal pela imuno-histoquímica é
inédita, principalmente no que diz respeito a essas afecções, podendo gerar
conhecimento imprescindível para esclarecimentos sobre sua patogenia. Além disso,
não existem relatos sobre a infecção pelo Helicobacter spp. em eqüinos no Brasil, e
pouco se pesquisou sobre o assunto no mundo, sendo necessária à realização
destes estudos para que se estabeleça um perfil desta realidade, uma vez que a
infecção pelo Helicobacter spp. pode ter papel importante na patogenia de úlceras
gástricas
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em
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cavalos.
2009
2
REVISÃO DE LITERATURA
2.1
O ESTÔMAGO EQUINO
O estômago dos equinos posssui uma parede composta de quatro túnicas
– a serosa, a muscular, a submucosa e a mucosa. A túnica serosa recobre o órgão e
adere firmemente à túnica muscular. Esta consiste de três camadas, uma externa de
fibras longitudinais, uma média de fibras circulares e uma interna de fibras oblíquas.
A túnica submucosa é uma camada de tecido conjuntivo frouxo que liga as túnicas
muscular e mucosa; nela os vasos e nervos se ramificam antes de penetrarem a
mucosa (Sisson, 1986).
A túnica mucosa é claramente dividida em duas partes: uma glandular subdividida em três zonas de acordo com o tipo glandular que contém - e uma
aglandular (Sisson, 1986). Portanto, o estômago eqüino é dividido em quatro áreas
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2009
principais: o epitélio escamoso estratificado, dorsalmente, e as mucosas do corpo glândulas cárdicas -, do fundo - glândulas do fundo e do piloro – glândulas pilóricas-,
ventralmente (Murray, 1998a; Brashier & Geor, 1995, Sisson, 1986). O epitélio
estratificado escamoso não contém glândulas ou células muco-produtoras (Brashier
& Geor, 1995). A margo plicatus é uma prega presente na junção entre a mucosa
gástrica epitelial escamosa e a glandular (Murray, 1997b). A mucosa da região do
corpo contém principalmente glândulas cárdicas produtoras de muco e bicarbonato,
enquanto que as glândulas fúndicas produzem acido clorídrico (HCl) e pepsina. Já a
região do piloro, é rica em glândulas produtoras de muco com uma menor produção
de bicarbonato e protease (Brashier & Geor, 1995). Fundamentalmente, a secreção
ácida estomacal é estimulada pela gastrina, histamina e acetilcolina produzida pelo
nervo vago (Reese & Andrews, 2009). A região glandular do estômago eqüino
possui muitos mecanismos protetores contra a ação do suco gástrico como a
camada de muco rica em bicarbonato, uma extensa rede de capilares, e uma
habilidade rápida em regenerar ou cicatrizar (Andrews et al, 2005b).
O estômago glandular é responsável pela digestão enzimática e hidrolítica
das substâncias ingeridas através da alimentação (Gelberg, 2007) Ainda não se
sabe a função da área aglandular mas acredita-se ser um local no qual pequenas
quantidades de digestão fermentativa possam ocorrer (Cunningham, 1993).
Histologicamente, a mucosa escamosa aglandular consiste de quarto
zonas distintas ou camadas celulares. A camada mais externa (extrato córneo)
funciona como uma barreira à difusão de eletrólitos como sódio e HCl. As células da
camada média – estrato transicional e da camada mais profunda – estrato espinhoso
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2009
- possuem uma ATPase sódio-potássio que funciona no transporte transcelular de
sódio (Argenzio, 1999). A principal barreira para a difusão de ácidos fortes nas
camadas mais profundas consiste em substancias glico-conjugadas contendo
bicarbonato que são secretadas pelas células superficiais do estrato espinhoso. Uma
barreira mínima de junções intercelulares firmes está presente no estrato córneo. A
última camada é o estrato basal, que possui uma célula de espessura e não
apresenta barreira alguma para a difusão. Essas camadas epiteliais apresentam
uma barreira física mínima à difusão ácida (HCl e ácidos orgânicos) quando
comparadas à mucosa glandular (Andrews et al, 2005b). Apesar de uma função de
barreira mínima, um estudo demonstrou que uma concentração de HCl a 30 mmol/L
(pH 1.5) durante 60 minutos foi necessária para romper a função de barreira da
mucosa escamosa do cavalo (Nadeau et al., 2003a,b). Apesar dessa resistência
relativa da mucosa aos danos do HCl, outros ácidos podem agir sinergicamente com
o HCl para a ruptura desta barreira física (Andrews et al, 2005b).
2.2
GASTRODUODENITE E ÚLCERA
2.2.1 Conceito e Ocorrência
Ulceração ou inflamação da mucosa gástrica e duodenal podem ocorrer
sempre que a barreira mucosa glicoproteica e a integridade das células epiteliais
forem rompidas, permitindo a autodigestão da mucosa pela pepsina e ácido gástrico
(Wilson, 1987). A ulcera gástrica é definida histologicamente como uma solução de
UFF
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2009
continuidade na mucosa do trato gastrintestinal que se estende através da muscular
mucosa até a submucosa ou mais profundamente (Liu & Crawford, 2004).
A úlcera gástrica é uma enfermidade prevalente e importante na clínica de
eqüinos, e um dos principais problemas a afetar o bem-estar e a desempenho dos
cavalos. Seus mecanismos patogênicos estão sendo esclarecidos pela comunidade
científica. (Murray 2003). Recentemente, fortes evidências foram apresentadas
sugerindo uma ligação direta entre a Síndrome da úlcera gástrica equina (SUGE) e a
queda de desempenho (Franklin et al, 2008), e buscando-se comi sso uma
comprovação científica do que já vem sendo observado há anos.
A ulceração gástrica afeta grande número de potros, sobreanos e cavalos
adultos (Bullimore et al, 2001; Murray, 1998b, 1997a,1993; Bertone, 1995). Está
presente em até 50% dos potros assintomáticos examinados endoscopicamente
(Fenger, 1998; Murray, 1997b, Bertone, 1995) e em 50 % dos animais adultos
brasileiros não submetidos a treinamento de corrida (Fernandes et al, 2003). Já os
animais em treinamento de corrida são os de maior risco podendo chegar a 90% de
prevalência de úlceras gástricas (Murray, 1997a).
Como demonstrado no item anterior, o estômago eqüino tem uma
anatomia singular que o predispõe a ulceração gástrica (Buchanan & Andrews,
2003). O terço proximal do estômago é recoberto por epitélio escamoso estratificado
e este não possui capacidade protetora nem de tamponamento que pode ser
observada na mucosa glandular devido ao muco rico em bicarbonato, e por isso, é a
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2009
região mais acometida por úlceras (Buchanan & Andrews, 2003; Andrews et al,
1999).
Dessa forma, as úlceras são mais freqüentemente observadas na porção
aglandular do estômago, ao longo da margo plicatus (Fernandes et al, 2003;
Brashier & Geor, 1995). Úlceras na mucosa gástrica glandular também podem
ocorrer, mas não são tão freqüentes (Murray, 1997a). Já a gastrite leve ou moderada
apenas na mucosa glandular parece ser um achado comum em eqüinos normais
(Fernandes et al, 2003). Em humanos, as úlceras pépticas são lesões crônicas e na
maior parte das vezes, solitárias, que ocorrem em qualquer porção do trato
gastrintestinal exposto a ação agressiva de ácido/suco gástrico. Geralmente, estão
presentes na primeira porção do duodeno ou no antro estomacal ou ao longo da
curvatura menor (Liu & Crawford, 2004). A ulceração duodenal ocorre principalmente
em potros sendo um achado raro em cavalos adultos (Murray, 1997a).
2.2.2 Etiologia, Fatores Predisponentes e Patogênese
Para que ocorra ulceração péptica humana deve haver um desequilíbrio
entre os fatores agressivos (particularmente o ácido gástrico e pepsina) e os fatores
de proteção do órgão que incluem secreção do muco de superfície, secreção do
bicarbonato do muco, o fluxo sanguíneo da mucosa, o transporte de membrana da
superfície
apical,
a
capacidade
regenerativa
epitelial
e
a
produção
de
prostaglandinas (Liu & Crawford, 2004). Esse conceito também é aplicado no
entendimento das síndromes das úlceras gastrintestinais dos eqüinos, incluindo a
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Juliana da Silva Leite
2009
motilidade gastroduodenal (Murray, 2003, 1998b, 1997a). Os fatores fisiológicos que
afetam o desenvolvimento de úlceras em equinos estão descritos na tabela 1.
Tabela 1 – Fatores que afetam o desenvolvimento de ulceras gástricas
Fatores de agressão á
Fatores de proteção da
Fatores de proteção da
mucosa
mucosa aglandular
mucosa glandular
Secreção de ácido clorídrico
Restituição epitelial
Restituição epitelial
Produção de ácido orgânico
Fluxo sanguíneo da mucosa
Fluxo sanguíneo da mucosa
Conversão de pepsinogênio
Secreção de camada de
em pepsina
muco e bicarbonato
Refluxo duodenal de ácidos
Produção de
biliares
Prostaglandina E
Fonte: Buchanan & Andrews, 2003 ; Reese & Andrews, 2009
São consideradas causas de ulceração péptica no homem o uso de
antiinflamatórios não esteróides (AINEs) como a aspirina, cigarro, ingestão de álcool,
hiperacidez gástrica, refluxo gastroduodenal, queda no fluxo sanguíneo da mucosa,
choque, esvaziamento gástrico retardado, reparo epitelial deficiente, fatores do
hospedeiro e o H. pylori (Liu & Crawford, 2004).
Os fatores de risco para a Síndrome da Úlcera Gástrica Equina (SUGE)
são, o transporte, dietas ricas em concentrado, estabulação, alimentação
intermitente, exercício intenso, treinamento de corrida, doença, estresse e uso de
AINEs (Andrews, 2005a; Murray, 2003). Durante o transporte, o consumo de água e
de alimento é diminuído o que pode causar um aumento na incidência de SUGE
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2009
(Buchanan & Andrews, 2003), inclusive úlceras na mucosa gástrica escamosa
podem se desenvolver em cinco dias dentro dessas condições (McClure et al, 2005).
O aumento da gravidade das úlceras gástricas em eqüinos transportados também já
foi relatado (MacAllister & Sangiah, 1993).
Para o estudo da patogênese das desordens pépticas eqüinas deve-se
levar em consideração a localização anatômica da lesão. As lesões na mucosa
gástrica escamosa resultam principalmente da acidez excessiva, enquanto que as
lesões gástricas glandulares resultam da proteção mucosa defeituosa. Erosões
podem ocorrer na mucosa aglandular dentro de 24 horas de exposição à acidez
excessiva (Murray, 2003). Os eqüinos secretam ácido hidroclorídrico em um padrão
contínuo porém com variações de intensidade, de forma que a secreção ocorra na
ausência de ingestão de alimento (Murray, 1998b), e essa exposição é tida como a
causa primária de úlceras gástricas em cavalos (Andrews et al, 2005b). Apesar
disso, diversos ácidos como os ácidos graxos voláteis, ácido clorídrico e ácidos
biliares podem causar dano à região aglandular do estômago eqüino (Nadeau et al.,
2003a,b).
Foi demonstrado que cavalos correndo em esteira de alta velocidade têm
um aumento da pressão abdominal e redução do volume estomacal. E especula-se
que essa contração do estômago permita o refluxo do ácido da mucosa glandular
para a mucosa aglandular, levando à lesão ácida (Lorenzo-Figueras & Merritt, 2002;
Murray, 2003). Sendo assim, o exercício diário pode aumentar a exposição da
mucosa aglandular ao ácido, explicando o aumento da prevalência de úlceras em
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2009
gástricas nos cavalos em treinamento (Buchanan & Andrews, 2003; White et al,
2007).
Cavalos atletas de alto desempenho são geralmente alimentados com
dietas com relativo baixo teor de volumosos e alto teor de carboidratos hidrolizáveis
e têm maior prevalência de úlceras gástricas do que os cavalos mantidos a pasto.
Dietas com alto teor de carboidratos hidrolizáveis promovem substrato para a
fermentação gástrica por bactérias residentes. Os subprodutos da fermentação
gástrica, como ácidos graxos voláteis, álcool, e ácido lático, podem danificar a
mucosa escamosa (Andrews et al, 2005b). Algumas espécies de Lactobacillus foram
isoladas do estômago de cavalos, o que dá credibilidade à teoria da fermentação
gástrica (Al Jassim et al, 2005; Scott et al., 20031 apud Andrews et al, 2005b), mas
Lactobacillus podem contribuir para o acumulo da ácido lático no estômago (Al
Jassim et al, 2005). Apesar disso, recentemente, um estudo demonstrou que o HCl
induziu alteração das propriedades bioelétricas da mucosa aglandular, mas a adição
do ácido lático não demonstrou nenhuma outra alteração, a não ser aquela causada
pelo HCl somente (Andrews et al, 2008).
Os cavalos que pastam têm menor prevalência de SUGE. Isso porque
durante o pastejo, existe um fluxo contínuo de saliva e ingesta que tampona o ácido
estomacal e o pH estomacal fica em torno de 4 ou mais alto (Buchanan & Andrews,
2003; Reese & Andrews, 2009). Por outro lado, a alimentação intermitente tem
mostrado causar e aumentar a gravidade das úlceras gástricas em cavalos, e
1
SCOTT, P. T.; TREBBIN, A. L ; AL JASSIM, R. A. M. L- and D-Lactic acid producing bacteria of the
equine gastrointestinal tract: Identification and molecular characterization. Proc. 14th Recent Adv.
Anim. Nutr., Australia. Armidale, New South Wales, Austrália p. 24A, 2003.
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inclusive, esta técnica foi desenvolvida como modelo para a produção de SUGE
(Murray, 1994).
Outros fatores importantes são a presença de ácidos graxos voláteis
(ácidos butírico, propiônico e valérico) e o pH baixo do estômago que podem
predizer a gravidade das lesões da mucosa gástrica escamosa (Nadeau et al.,
2000), indicando que a combinação dessas substâncias pode ser a principal causa
de ulceração nesta região gástrica. Em estudos in vitro mais recentes, HCl somente
e em combinação com ácidos graxos voláteis causaram inibição do transporte
celular de sódio, e alterações histológicas de edema celular com eventual ulceração
quando o pH da mucosa escamosa aglandular era menor ou igual a 4, 0 (Nadeau et
al., 2003a,b). Um estudo mais recente confirmou que os ácidos graxos voláteis,
especialmente o ácido acético, na presença de HCl e um pH igual ou menor que 4,0,
parece ser importante na patogênese das úlceras da mucosa aglandular em cavalos
(Andrews et al, 2006).
Além disso, o pepsinogênio, que é clivado em pepsina em pH menor que
4, tem um papel no desenvolvimento de Síndrome da Úlcera Gástrica Equina. Essa
enzima proteolítica pode agir com o HCl e ácidos orgânicos resultando em dano
ácido (Andrews et al, 2005b). Porém, isso ainda não pôde ser comprovado já que a
redução da resistência tissular da mucosa aglandular ocorre sempre que há a
acidificação da mucosa independente da presença concomitante de pepsina ou não
(Widenhouse et al, 2002).
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2009
Por último, cogita-se que os sais biliares tenham ação ulcerogênica por
mostrarem aumento da permeabilidade celular da mucosa aglandular aos íons
hidrogênio. Porém, seus efeitos são questionáveis uma vez que os ácidos biliares
são provenientes de refluxo duodenal que é menos ácido e não são ulcerogênicos
em pH maior do que 4 (Argenzio, 1999; Berschneider et al, 1999).
Já a patofisiologia das lesões da mucosa glandular eqüina é bem menos
entendida do que a das lesões da mucosa aglandular. Os fatores considerados
promotores de lesão da mucosa glandular incluem dosagens excessivas de AINEs,
liberação de cortisol endógeno induzido por estresse, alterações no fluxo sanguíneo
da mucosa, rompimento da proteção da mucosa, refluxo retrógrado periódico de
conteúdo duodenal, e ainda deve-se considerar a participação de Helicobacter spp.
nessas lesões (Andrews et al, 2005b; Buchanan & Andrews, 2003; Murray 2003).
O estresse psicológico também é considerado um importante fator
contribuidor para o desenvolvimento de úlceras em humanos (Liu & Crawford, 2004).
Em potros, o estresse é tido como contribuidor ou até causador de úlceras
gastroduodenais (Murray, 1998b). Estresse relacionado ao ambiente como calor
excessivo ou uma súbita queda na pressão barométrica também são fatores
implicados na formação de úlceras em potros (Wilson, 1987). Sabe-se que o
estresse diminui os mecanismos de defesa da mucosa gástrica contra a ulceração
induzida pelo ácido gástrico e pela pepsina (Lewis, 2000), pois a liberação de
cortisol endógeno induzida pelo estresse causa redução nas prostaglandinas que
são importantes para a manutenção de muco, do fluxo sanguíneo e da secreção de
bicarbonato na mucosa (Andrews et al, 2005b).
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A administração de altas dosagens de AINEs pode levar a formação de
úlceras (Murray, 2003, 1997a), mas os AINEs causariam úlceras mais severas na
mucosa glandular pelo seu efeito intenso de inibição da prostaglandina. A inibição da
prostaglandina por AINEs resulta na diminuição do fluxo sanguíneo da mucosa,
diminuição da produção de muco e da secreção de bicarbonato e aumento na
secreção de HCl (Buchanan & Andrews, 2003; Andrews et al, 2005b). Um fluxo
sanguíneo adequado é necessário para a remoção dos íons hidrogênio que
difundem na camada de muco da mucosa glandular. A isquemia da mucosa gástrica
pode levar a acidose celular induzida por hipoxia, liberação de radicais livres
derivados do oxigênio, fosfolipases, e proteases que danificam a membrana celular
levando à necrose (Andrews et al, 2005b).
Helicobacter pylori é o principal fator na patogênese das úlceras pépticas
humanas (Ruzsovics et al, 2002; Liu & Crawford, 2004) e sua infecção persistente
resulta em atraso no reparo e recorrência da úlcera (Ruzsovics et al, 2002). Então,
nos casos em que a úlcera gástrica está presente, o tratamento anti-Helicobacter
deve ser considerado (Veldhuyzen van Zanten & Lee, 1999). Em equinos, mais
estudos são necessários para definir o papel de Helicobacter spp. na SUGE, porém
alguns autores afirmam que indivíduos com úlceras gástricas crônicas podem se
beneficiar do tratamento com antibióticos e antiácidos semelhante àquele usado em
pessoas com infecção pelo H. pylori (Buchanan & Andrews, 2003).
2.3
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Helicobacter spp.
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2009
Helicobacter é um gênero de bactérias gram negativas, curvas a
espiraladas, flageladas, microaerófilas e urease positivas, que colonizam animais e
seres humanos (Jenkins & Bassett, 1997; Jonkers et al., 1997;
Farthing, 1998;
Jalava et al., 1998; Neiger & Simpson, 2000; Simpson et al., 1999, 2000a,b;
Lehours, 2003). Distingue-se dois grandes grupos de Helicobacter em função do seu
nicho ecológico: o das espécies gástricas e o das espécies extra gástricas, também
chamadas enterohepáticas (Lehours, 2003). As espécies enterohepáticas já foram
encontradas em diversos órgãos como intestino delgado, intestino grosso, fígado, e
ducto biliar (Harbour & Sutton, 2008). Já as espécies gástricas de Helicobacter spp.
são amplamente distribuídas e foram descritas em animais selvagens e domésticos
de diferentes hábitos alimentares como cães, gatos, macacos, camundongos,
cheetahs, furões, bovinos e suínos (Gueneau et al, 2002).
Atualmente, cerca de 38 espécies são membros do gênero Helicobacter
nomeadas formalmente, e numerosas outras espécies ainda estão sob investigação
(Harbour & Sutton, 2008).
Aparentemente, Rappin foi quem primeiro descreveu a existência de
bactérias espiraladas no estômago de cães, em 1881 (Weber et al, 1958). Em 1893,
Bizzozero também relatou o achado de bactérias espiraladas colonizando o
estômago de cães. Três anos depois, em 1896, Salomon detectou organismo similar
ao descrito por Bizzozero no estômago de gatos e ratos. Hoje, sabe-se que a
bactéria descrita era o Helicobacter heilmannii (Weber et al, 1958; Fox & Lee, 1997;
Jenkins & Bassett, 1997; Buckley & O’Morain, 1998; Owen, 1998; Meining et al.,
1998; Simpson et al, 1999).
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Em seres humanos, Marshall e Warren (1983 e 1984) descreveram a
associação de uma bactéria espiralada na mucosa gástrica, com gastrite tipo B e
úlcera gástrica e duodenal. Sua descoberta revolucionou os conceitos tradicionais,
segundo os quais apenas o estresse, alimentos picantes e ácidos estariam
envolvidos na patogênese dessas enfermidades (Hellström, 2006). Esta bactéria foi
inicialmente
classificada
no
gênero
Campylobacter,
sendo,
desde
então,
intensamente estudada. Ao ser cultivada, observaram a presença de flagelos e
lipopolissacarídio distinto, características não pertencentes a este gênero. Com isso
e baseado na análise do RNA ribossomal, pela seqüência 16S rRNA, em 1989,
criou-se um novo gênero, o Helicobacter. Esta bactéria em questão foi classificada
como Helicobacter pylori. H. pylori é a mais bem estudada bactéria do gênero e
possui morfologia discretamente curvada (Lee et al., 1993; Buckley & O’Morain,
1998).
Além de H. pylori, outras espécies de Helicobacter com uma morfologia
espiral típica também foram associadas à gastrite no homem. Essas estão presentes
na mucosa gástrica do cão e do gato e inicialmente foram chamadas de
Gastrospirillum hominis, depois Helicobacter heilmanii (Debongnie et al, 1995; Van
den Bulk et al, 2005). Diferenças marcantes de tamanho e morfologia entre H. pylori
e as espécies de Helicobacter presentes na mucosa gástrica de cães e gatos,
podem ser notadas (Camargo et al, 2003). Atualmente, recomenda-se o uso do
termo Helicobacters Não-H. pylori para designá-las para evitar confusão já que
Helicobacter heilmanii não pode ser usado como o nome de uma espécie de acordo
com as normas taxonômicas (Baele et al , 2009).
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As espécies gástricas de Helicobacter colonizam o muco superficial, as
glândulas gástricas e o citoplasma das células parietais nas regiões do antro, corpo
e fundo gástricos (Barker et al., 1993; Fox, 1997; Owen, 1998; Yamasaki et al., 1998;
Simpson et al., 2000a,b). A distribuição destes microrganismos na mucosa gástrica
pode ser esparsa e irregular, com áreas de colonização maciça adjacentes a áreas
sem nenhum microrganismo (Crawford, 2000; Simpson et al., 2000a).
A presença do H. pylori na mucosa gástrica de humanos causa gastrite
crônica ativa, úlcera péptica, adenocarcinoma gástrico e linfoma do tecido linfóide
associado à mucosa gástrica (Warren & Marshall, 1984; Tokunaga et al., 1998;
Veldhuyzen van Zanten & Lee, 1999; Crawford, 2000).
Existem muitos mecanismos pelos quais H pylori pode produzir sintomas
de dispepsia (exemplo: dor abdominal alta ou desconforto, náusea, satisfação
precoce). Isso inclui o efeito da inflamação relacionada com H.pylori nos receptores,
perturbações de motilidade e sensibilidade à acidez (Fennerty, 2005), mas, a
gravidade da inflamação da mucosa gástrica depende da espécie do gênero
Helicobacter presente e da resposta do hospedeiro (Buckley & O’Morain, 1998).
O H. pylori foi classificado pela Organização Mundial de Saúde como um
carcinógeno tipo I para eclosão do câncer gástrico humano. O papel exato do H.
pylori nas neoplasias gástricas não está bem estabelecido, porém estudos
epidemiológicos e experimentais verificaram que há correlação etiológica entre H.
pylori e essa neoplasia (Jenkins & Bassett, 1997; Stone, 1999). Correa (2004)
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propõe o modelo da carcinogênese gástrica que reconhece a resposta inflamatória
crônica ativa à infecção por H. pylori como um primeiro passo. Isto resulta em atrofia
da mucosa e metaplasia intestinal; a fase mais avançada caracteriza-se por eventos
mutacionais progressivos, que levam ao câncer gástrico. Segundo Tatematsu et al
(2005), H. pylori não é um iniciador, e sim, um forte promotor de carcinogênese
gástrica, cuja erradicação, aliada a diminuição da ingesta de sal, pode ser efetivo na
prevenção do desenvolvimento do câncer gástrico.
2.3.1
Mecanismo de Adaptação ao Hospedeiro e Fatores de
Virulência
É sabido que, inicialmente, as adesinas de H. pylori interagem com
receptores celulares, mas, H.pylori precisa driblar a ação do sistema imune, evitando
o reconhecimento do hospedeiro. Para isso, produz fatores bacterianos específicos
que estimulam a expressão seletiva de genes do hospedeiro e induz uma resposta
T-celular ineficaz. A diversidade genética de H. pylori também exerce um papel
significativo na sua persistência (Israel & Peek, 2006).
Alem disso, estas bactérias espiraladas pertencentes ao gênero
Helicobacter desenvolveram mecanismos de adaptação à acidez gástrica, como
motilidade, microaerofilismo, produção de urease e fosfolipases (Lee, 1991; Lee at
al., 1993; Crawford, 2000). Acredita-se que a patogenicidade do Helicobacter spp.
esteja relacionada com esta adaptação, alterando a fisiologia gástrica, induzindo a
inflamação da mucosa gástrica e predispondo a ulceração (Buckley & O’Morain,
1998; Crawford, 2000).
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A produção de urease é um fator importante para que o Helicobacter spp.
consiga colonizar a mucosa gástrica. A urease degrada a uréia em amônia e íons
bicarbonato. A amônia reage com a água produzindo íons amônio, aumentando o
pH ao redor do Helicobacter spp. Alguns estudos sugerem que a elaboração de
amônia pelo Helicobacter spp. estimule a liberação de gastrina, aumentando a
liberação de ácido gástrico (Fox & Lee, 1997; Buckley & O’Morain, 1998; Crawford,
2000).
Além da produção de enzimas, o Helicobacter pylori possui antígenos,
como o lipopolissacarídio, que atraem células inflamatórias para a mucosa gástrica.
(Strauss-Ayali & Simpson, 1999; Crawford, 2000), gerando gastrite. A gastrite
crônica ativa é definida pela presença de um infiltrado inflamatório com linfócitos,
plasmócitos e neutrófilos, resultando em atrofia da mucosa e metaplasia intestinal,
geralmente sem erosões. As alterações epiteliais podem tornar-se displásicas,
constituindo uma base para o desenvolvimento de neoplasias como o carcinoma
(Strauss-Ayali & Simpson, 1999; Crawford, 2000; Simpson et al., 2000b). A mucosa
cronicamente inflamada, também, torna-se mais suscetível à ulceração (StraussAyali & Simpson, 1999; Crawford, 2000).
Apesar da associação entre a infecção por H.pylori e gastrite crônica estar
clara, o desenvolvimento de gastrite grave é raro. Essas variações nas
conseqüências clínicas ocorrem devido a fatores como a duração da infecção, a
resposta inflamatória do paciente, a virulência das cepas de H. pylori, etc. As
infecções com cepas menos virulentas estão associadas a sintomas brandos,
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enquanto que infecções com cepas mais virulentas parecem estar associadas a uma
inflamação gástrica mais grave e eventualmente, úlcera péptica, adenoma gástrico e
linfoma do tecido linfóide associado à mucosa (Umit et al, 2009).
Portanto, diversas doenças estão associadas à infecção por H. pylori e
hoje se estuda a heterogenicidade da população desta bactéria para o
estabelecimento da relação entre a bagagem genética bacteriana e uma
determinada doença. A diversidade genética é adquirida por diferentes mecanismos,
dentre eles, a mutação pontual ganha destaque por representar a mudança em um
único par de bases. A aquisição de DNA exógeno, também, pode ter contribuído
para essa diversidade assim como rearranjo genômico múltiplo (Marais et al, 1999).
O locus cag (“citotoxin-associated gene” - gene associado à citotoxina) é
uma extraordinária ilustração dos diversos mecanismos pelo qual a diversidade pode
ocorrer (Marais et al, 1999) e pode ter um papel na virulência de H. pylori..
Hatakeyama (2006) relatou que o Cag A, produto do gene cag A, é liberado pela
bactéria no citoplasma da célula epitelial gástrica na qual a bactéria aderiu e interage
com proteínas do hospedeiro envolvidas na sinalização celular, além de alterar o
contato célula a célula, caracterizando disfunções celulares que promovem o
acúmulo de múltiplas alterações genéticas envolvidas na transformação maligna.
Este fator de virulância também está fortemente associado a uma maior atividade
neutrofílica e atrofia glandular no antro e maior gravidade de inflamação crônica
tanto no corpo quanto no antro gástricos (Umit et al , 2009).
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Outro importante fator de virulência é a citotoxina vacuolizante
(“vacuolating citotoxin” – VacA) que parece estar relacionada à vacuolização das
células epiteliais gástricas primárias. A presença de diferentes alelos vacA poderia
levar potencialmente a
formas
antigênicamente
variáveis
de
VacA,
mas,
provavelmente identifica cepas que tem a habilidade de processar adequadamente e
secretar uma citotoxina ativa (McGee & Mobley, 1999). Este fator de virulência
também está envolvido em uma maior atividade neutrofílica no corpo gástrico (Umit
et al, 2009) Miehlke (2000) sugere uma associação significativa entre vacA, atividade
citotóxica, cagA e câncer gástrico.
2.3.4
Diagnóstico e Tratamento
A infecção pelo Helicobacter spp. tem sido diagnosticada por meio de
testes invasivos e não invasivos. Os testes invasivos incluem o teste rápido da
urease, citologia, histopatologia, cultura e PCR, necessitando da realização de
endoscopia para obtenção de amostras da mucosa gástrica. Os testes não invasivos
são a sorologia e o teste respiratório da uréia marcada, não necessitando da
endoscopia, detectando a infecção indiretamente (Cartun et al., 1991; Onders et al.,
1997; Buckley & O’Morain, 1998; Marzio et al., 1998; Tokunaga et al., 1998; Esteves
et al, 2000).
A realização do teste da urease é bastante simples. As amostras da
mucosa gástrica são colocadas em tubos de ensaio contendo uréia diluída a 10%
em água destilada estéril com vermelho de fenol como indicador de pH (Fabre et al.,
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1994; Morais et al., 1997; Onders et al., 1997; Yamasaki et al., 1998). A mudança de
cor, do amarelo para o róseo avermelhado, indica a presença do Helicobacter spp..
Esta reação tem que ocorrer em um período máximo de 24 horas, a relação do
tempo com a mudança de cor é proporcional com a densidade de microrganismos
presentes na mucosa gástrica. A principal vantagem deste método é a rapidez na
obtenção dos resultados. Este teste é freqüentemente associado com o exame
histopatológico (Fabre et al., 1994; Morais et al., 1997; Onders et al., 1997;
Yamasaki et al., 1998).
A cultura é um método mais específico, porém menos sensível para o
diagnóstico da infecção, pois o Helicobacter spp. é pouco resistente, necessitando
de condições ideais para o seu crescimento (Jonkers et al., 1997; Morais et al.,
1997; Onders et al., 1997; Metz et al., 1998; Esteves et al., 2000). Em um dos
métodos propostos, amostras gástricas são semeadas em placas com meio seletivo,
que é baseado no agar sangue com BHI, porém suplementado (Onders et al., 1997;
Yamasaki et al., 1998; Esteves et al, 2000). As placas são colocadas em jarras de
microaerofilia contendo uma mistura de gases N 2, H2 e CO2, numa proporção de
80:10:10, respectivamente. Estas jarras são encubadas a 37°C por sete dias com
verificação do crescimento a partir do terceiro dia. A identificação é feita pela
coloração de Gram, morfologia, reações da catalase, oxidase, urease, resistência ao
ácido naxilico e suscetibilidade a cefalotina (Jonkers et al., 1997; Morais et al., 1997;
Yamasaki et al., 1998; Esteves et al., 2000).
Para realização do exame histopatológico, as amostras gástricas são
fixadas por 24 horas no formol tamponado a 10%, clivadas e processadas pela
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técnica de inclusão em parafina, coradas pela Hematoxilina - eosina, Warthin Starry
e Genta (Negrini et al, 1989 Marzio et al, 1998; Metz et al, 1998; Strauss-Ayali &
Simpson, 1999; Esteves et al, 2000). A histopatologia é um teste sensível, porém
resultados falso-negativos podem ocorrer devido à distribuição do Helicobacter spp.
na mucosa gástrica. Para minimizar este fato indica-se a realização de biópsias
múltiplas com pelo menos dois fragmentos de cada região (Jenkins & Bassett, 1997;
Morais et al, 1997; Yamasaki et al, 1998; Metz et al, 1998). A maior vantagem do
exame histopatológico é a avaliação do tecido, determinando a extensão e
gravidade do processo inflamatório (Jenkins & Bassett, 1997; Morais et al, 1997;
Metz et al, 1998; Yamasaki et al, 1998).
O teste da uréia expiratória é altamente específico e sensível, fácil de ser
realizado e fornece resultado rápido, sendo muito utilizado no monitoramento dos
pacientes humanos que estão sendo submetidos à terapia de erradicação do H.
pylori, porém na medicina veterinária este teste não tem sido utilizado (Jenkins &
Bassett, 1997; Stone, 1999).
A sorologia detecta títulos de anticorpos IgG para o Helicobacter spp., no
soro. Esta é um teste de alta especificidade e sensibilidade, todavia não revela o
grau de severidade das alterações patológicas. Este teste não é utilizado no
monitoramento da resposta ao tratamento, pois os níveis de IgG continuam altos por
um período mínimo de seis meses após a erradicação da infecção (Jenkins &
Bassett, 1997; Onders et al, 1997; Cutler, 1998).
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DNA de biopsias gástricas pode ser submetido a reação em cadeia da
polimerase ou Polymerase Chain Reaction (PCR) com promotores (primers) gênero
específicos e primers espécie específicos para Helicobacter. Primers são derivados
de tanto 16S rRNA quanto genes de urease ou adesina (Strauss-Ayali & Simpson,
1999). Os produtos de PCR podem ser subseqüentemente clonados e seqüenciados
ou analisados pelo polimorfismo do comprimento dos fragmentos de restrição para a
identificação das espécies e da cepa (Neiger & Simpson, 2000). PCR seguido por
sequenciamento é o método preferido para a identificação conclusiva das espécies.
(Baele et al, 2009). No entanto, a escolha do gene alvo é de extrema importância já
que os gene codificadores de r-RNA 16S e 23S não podem distinguir entre H. felis,
H. bizzozeronii, H. salomonis e ‘Candidatus H. heilmanii’ (Dewhirst et al, 2005).
Recomenda-se detecção por primers gênero Helicobacter -específicos e posterior
sequenciamento dos amplicons o que dá maiores informações sobre a espécie
envolvida (Baele et al, 2009).
A coloração imuno-histoquímica de fragmentos de biópsia fixados por
formol e incluídos em parafina tem sido usada como método padrão para
identificação de indivíduos positivos para H. pylori em pesquisa (Tokunaga et al,
1998). Esse método oferece estudo específico e sensível da infecção por
Helicobacter spp. (Loffeld et al, 1991). Em estudo que comparou os diversos
métodos de diagnóstico de H.pylori em humanos, Enroth e colaboradores (2002)
relataram que existe 91% de concordância entre a imuno-histoquímica e a cultura,
sendo esta considerada o teste ouro. Segundo Toulaymat e colaboradores (1999),
em pacientes já tratados para H pylori, o uso da imuno-histoquímica com um
anticorpo especifico tem mostrado melhora da acurácia diagnóstica da infecção
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residual pós-terapia. A imuno-histoquímica representa um confiável diagnóstico
semiquantitativo da infecção por H. pylori, e sua principal serventia é a identificação
das formas cocóides, as quais não produzem urease, e são difíceis de serem
reconhecidas na histologia(Toulaymat et al, 1999).
Numerosos regimes terapêuticos têm sido utilizados para erradicar o H.
pylori e tratar úlceras e gastrite em humanos, a mais utilizada atualmente é a tripla
terapia, que consiste em uma combinação de bismuto com metronidazol e
amoxicilina ou tetraciclina (Jenkins & Bassett, 1997). Porém, o II Consenso Brasileiro
sobre H. pylori preconiza a combinação de um inibidor de bomba protônica com
amoxicilina e claritromicina ou claritromicina e furazolidona ou furazolidana e
tetraciclina (Coelho & Zaterka, 2005).
2.3.5
Epidemiologia
A infecção pelo Helicobacter pylori no homem tem distribuição mundial,
acometendo mais de 60% da população mundial, todavia existem variações na
distribuição geográfica (Cave, 1997; Crawford, 2000; Mégraud, 2003).
Nos países em desenvolvimento esta infecção acomete aproximadamente
90% da população humana e é adquirida durante a infância, porém as taxas de
infecção aumentam com a idade. Acredita-se que o modo de transmissão mais
importante nesses países seja o fecal-oral (Cave, 1997; Buckley & O’Morain,1998;
Crawford, 2000). Outro modo de infecção sugerido é o consumo de água e alimentos
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contaminados (Herrera, 2004) e a ingestão leite contaminado com fezes que
contenham H. pylori (Dore et al, 1999)
Já nos países desenvolvidos, a incidência é menor, acometendo 50% da
população humana adulta e o modo de transmissão principal é o oral-oral (Cave,
1997; Buckley & O’Morain, 1998; Crawford, 2000, Mégraud, 2003). Esse modo de
transmissão pode ocorrer por meio de aerossóis de saliva, vômito ou através do
beijo (Herrera, 2004). Existem relatos de que a transmissão possa ocorrer de forma
iatrogênica devido à utilização de utensílios como endoscópios e sondas, já que
mesmo desinfetados podem apresentar DNA de H. pylori (Nürnberg et al, 2003).
Estas evidências indicam que as condições sócio-econômicas da
população influenciam diretamente na disseminação da infecção (Cave, 1997;
Buckley & O’Morain, 1998; Crawford, 2000). Segundo Fennerty (2005) a prevalência
de H.pylori varia de acordo com a localização geográfica, etnia, condições sócioeconômicas e idade. Ele ainda relata que a prevalência de H.pylori vem declinando
em países desenvolvidos e naqueles com rápido desenvolvimento sócio-econômico.
Outro ponto importante que deve ser destacado é o risco de infecção
zoonótica em indivíduos expostos aos animais, como veterinários, tratadores e
donos de cães e gatos. Atualmente, já foram descritas cerca de 11 espécies de
Helicobacter
infectando
seres
humanos
sendo
a
maioria
comumente
ou
potencialmente patogênicas e provavelmente transmitidas por infecção zoonóticas a
partir de animais de companhia ou animais de produção (Harbour & Sutton, 2008).
UFF
Juliana da Silva Leite
2009
2.3.4
Helicobacter spp. nos Animais de Grande Porte
Em ruminantes domésticos, somente a espécie bovina Candidatus H.
bovis foi descrita (De Groote et al., 1999), mas existem indícios de que o abomaso
de ovinos também pode estar infectado com uma espécie de Helicobacter (Doré et
al., 1999). Em outro estudo, não foi encontrada evidência de infecção por
Helicobacter spp. em nenhum dos 70 caprinos avaliados por meio de PCR, apesar
do estudo ter encontrado que 85% dos bovinos estavam infectados com Candidatus
H. bovis e 45% dos suínos com Candidatus H. suis (Gueneau et al, 2002). Uma
pesquisa anterior realizada em 85 suínos de abate na Itália, verificou bactérias
espiraladas em apenas oito animais (Grasso et al, 1996). Infecções por Helicobacter
em suínos já foram associadas a úlceras gástricas (Szeredi et al, 2005) e gastrite
(Hellemans et al, 2007; Krakowka et al, 2005), mas o papel exato do H. suis nas
enfermidades gástricas suínas ainda não está claro (Baeli et al, 2009). Apenas
recentemente o Helicobacter foi cultivado de suínos e formalmente caracterizou-se
Helicobacter suis como uma espécie (Baeli et al, 2008).
Há alguns anos afirmava-se não haver evidências da infecção de H. pylori
ou outra espécie de Helicobacter em cavalos, e que maioria das lesões gástricas
eqüinas ocorre na mucosa escamosa e esta bactéria não coloniza o epitélio
alimentar escamoso. Também acreditava-se que a maioria das lesões na mucosa
glandular de potros e cavalos adultos não está associada com uma resposta
inflamatória significante como a que ocorre com a infecção de H. pylori em humanos
(Murray 1997a). Recentemente, pesquisadores admitiram que a participação de
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Juliana da Silva Leite
2009
Helicobacter spp. deve ser considerada em lesões ulceradas (Andrews, 2005b;
Buchanan & Andrews, 2003; Murray, 2003).
Na verdade, o posicionamento dos autores diante da possibilidade de
infecção por Helicobacter spp. em eqüinos só mudou depois que pesquisadores
identificaram produtos de PCR do UreI (um canal de uréia prolongado específico
para Helicobacter spp. gástricos) no epitélio escamoso de três cavalos, dois dos
quais tinham erosões neste epitélio (Scott et al, 2001 2apud Reed et al, 2004). Outro
estudo três anos mais tarde, também, identificou pela PCR a presença de material
genético específico para Helicobacter em 12 eqüinos, além de atividade de urease
após administração intragástrica de 13C-urea (Hepburn, 2004).
Mais recentemente, Moyaert et al (2007a) isolaram bactérias curvas gramnegativas de amostras fecais de dois eqüinos clinicamente saudáveis e classificaram
–nas como uma nova espécie extragástrica para a qual se propôs o nome de
Helicobacter equorum sp. nov.. Estudos se seguiram para revelar a prevalência
desse microorganismos em eqüinos e seres humanos. Foi relatada prevalência de
0,8% em cavalos adultos de propriedade privada e de 7,9 % em cavalos adultos
hospitalizados, e nenhuma das amostras humanas analisadas apresentou a bactéria
(Moyaert et al, 2007b). Já em potros, a prevalência é maior, sendo de 28,6% em
animais com menos de um mês de idade e de 67,8% em animais entre um e seis
meses (Moyaert et al, 2009). A significância patogênica do micro-organismo
permanece obscura, pois tanto potros com diarréia quanto potros saudáveis
eliminam a bactéria (Moyaert et al, 2009). Quando cavalos adultos foram infectados
2
SCOTT, D.R. et al. Evidence of Helicobacter Infection in the Horse. In Proceedings. Am Soc
Microbiologists:287, 2001.
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2009
experimentalmente com H. equorum, estes não apresentaram sintomas de doença
(Moyaert, 2007c). Outro sítio onde também foi detectado DNA de bactérias do
gênero Helicobacter é o estômago (Contreras et al, 2007). Diante dos relatos, fica
clara a necessidade de mais estudos sobre a presença da bactéria no trato
gastrintestinal eqüino, e de estudos com a finalidade de determinar o potencial
patogênico desta bactéria nesses animais.
2.4
A IMUNIDADE DA MUCOSA
O sistema imune dos mamíferos consiste de imunidade inata (não
específica e presente antes da infecção) e imunidade adaptativa (específica e
estimulada por antígenos) e mecanismos de defesa humoral, mediado por célula B,
e celular, mediado por célula T (Abbas, 2004; Niemiałtowski et al, 2005). O sistema
imune da mucosa, junto com o sistema imune da pele, desempenha um papel
importante e crítico para uma proteção eficiente contra agentes infecciosos e
também
no
desenvolvimento
de
tolerância
aos
antígenos
dos
alimentos
(Niemiałtowski et al, 2005).
O sistema imune da mucosa possui propriedades distintas do sistema
imune sistêmico. O sistema imune da mucosa possui um sistema imune organizado,
como as placas de Peyer e os linfonodos mesentéricos, e um sistema imune difuso
no tecido epitelial e conjuntivo que funciona em conjunto para ativar respostas
UFF
Juliana da Silva Leite
2009
apropriadas, mas diferentes para os diferentes tipos de antígeno (Bailey e Haverson,
2006).
O tecido linfóide associado à mucosa forma uma rede com integridade
funcional que é alcançada pela comunicação entre as células por meio de citocinas/
quimiocinas e pelo tráfego de células imunes entre as diferentes mucosas
(Niemiałtowski et al, 2005).
As placas de Peyer e os linfonodos mesentéricos atuam como sítios de
indução da resposta imune da mucosa, mas podem atuar como órgãos linfóides
primários gerando células B (Bailey e Haverson, 2006).
O tecido linfóide difuso associado à mucosa contém grande número de
leucócitos e pode ser dividido em três compartimentos imunológicos difusos
identificados ao longo da mucosa (Bailey e Haverson, 2006). No epitélio
gastrintestinal das espécies domésticas, a população predominante é de células T
com potente capacidade citolítica e regulatória usada para preservar a integridade
da mucosa (Hayday et al, 2001).
De forma similar, a lamina própria abaixo do
epitélio também possui grande quantidade de leucócitos de população heterogenia
e, aparentemente, com distribuição aleatória. Células apresentadoras de antígeno
que expressam MHC (Major Histocompatibility Complex) classe II estão presentes
em grande número na lamina própria de muitas espécies e co-habitam com células T
com co-receptor para CD4 (Bailey e Haverson, 2006). Também, o endotélio do plexo
capilar abaixo da membrana basal do epitélio expressa MHC classe II, portanto,
UFF
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2009
aglomerados de células T, células apresentadoras de antígenos e endotélio MHC II
+ podem ocorrer (Wilson et al, 1996).
2.5
MIELOPEROXIDASE
A infiltração do tecido por células polimorfonucleares é o primeiro passo da
resposta imune contra um patógeno. Essas células são o principal componente da
resposta imune inata. Elas são dedicadas a fagocitose de partículas antigênicas e
microorganismos antes que uma resposta imune específica seja iniciada (Beauvillain
et al, 2008). Após cruzar o endotélio, as células polimorfonucleares podem modular
a resposta imune adaptativa pela liberação de quimiocinas e defensinas capazes de
atrair para o sítio inflamatório os linfócitos e as células dendríticas (Witko-Sarsat et
al, 2009).
A Mieloperoxidase (MPO), uma proteína expressada de forma abundante
pelos leucócitos polimorfonucleares, é uma das principais enzimas liberadas durante
a fagocitose pelos grânulos azurófilos dos neutrófilos (Klebanoff, 1999). Monócitos
humanos possuem grânulos de MPO em menor quantidade e estes freqüentemente
desaparecem quando os monócitos se diferenciam em macrófagos no tecido
(Klebanoff, 2005).
Alguns trabalhos que avaliaram bioquimicamente a atividade de MPO
tecidual associada à avaliação histopatológica por hematoxilina-eosina no cólon
eqüino relatam que existe correlação entre a atividade de MPO e a infiltração
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2009
mucosa de eosinófilos (McConnico et al, 1999, 2002). Já os trabalhos de avaliação
da atividade de MPO nos tecidos de ratos e hamsters afirmam que a atividade de
mieloperoxidase é uma função dos neutrófilos e está diretamente relacionada à
presença deles nos tecidos. Diante disso, se poderia pensar em uma particularidade
eqüina na qual os eosinófilos estariam envolvidos na atividade de MPO. Por outro
lado, a MPO purificada de polimorfonucleares eqüinos é bastante similar a MPO
humana e foi evidenciada em neutrófilos e monócitos, não tendo sido encontrada
nos eosinófilos, sugerindo uma diferença entre a estrutura protéica da peroxidase
eosinofílica e a mieloperoxidase neutrofílica (Deby-Dupont, 1998).
A determinação da atividade de MPO, em humanos e animais de
laboratório tem sido usada para descrever quantitativamente a inflamação em
diversos tecidos, como a pele (Bradley et al., 1982), o intestino (Krawisz et al 1984), e
o globo ocular (Graff et al, 1998). A atividade de mieloperoxidase tem se mostrado
diretamente proporcional à quantidade de neutrófilos no tecido (Krawisz et al, 1984;
Grisham & Granger, 1988).
Em eqüinos, a determinação da atividade de MPO tem sido usada para
quantificar a inflamação da mucosa intestinal, na qual foi relatado envolvimento de
neutrófilos e eosinófilos (McConnico et al, 1999, 2005).
A detecção imuno-histoquímica de mieloperoxidase intracelular já foi
realizada em tecido humano normal e em diferentes tipos de distúrbios
mieloproliferativos nos quais as células mielóides neutrofílicas e eosinofílicas, em
todos os estágios de maturação, demonstraram forte reatividade citoplasmática para
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2009
mieloperoxidase (Pinkus & Pinkus, 1991). A imunorreatividade para MPO também
vem sendo usada para estudo da resposta inflamatória frente a um estímulo danoso
na cóclea (Watanabe et al, 2001) e no cérebro (Maier et al, 2004).
2.6
CD3
CD3 é uma proteína específica para a diferenciação em células T (Gocke,
2002) que consiste de cinco cadeias polipeptídicas (designadas gama, delta,
epsilon, zeta e eta) com massas moleculares que variam de 16-28 kD (DAKO
Catalog, 2008). A proteína CD3 compõe o complexo receptor da célula T (TCR) que
é constituído por subunidades de ligação (TCRα and TCRβ) e subunidades de
transdução de sinais (CD3γ,CD3δ,CD3ε and CD3ζ [CD247]) (figura 1) (Werlen &
Palmer, 2002).
UFF
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2009
Figura 1 - Organização do complexo receptor da Célula T (TCR-CD3).
Subunidades de ligação (TCRα and TCRβ) e subunidades de
transdução de
sinais
(CD3γ,CD3δ,CD3ε and CD3ζ).
Fonte:
http://pathmicro.med.sc.edu/bowers/cd3.jpg.
O ligante do TCR consiste de um peptídeo antigênico ligado à molécula do
complexo principal de histocomptibilidade (MHC) classe I ou classe II (Risueño et al,
2008). A sinalização TCR/CD3 é central para a iniciação das respostas antigeno
específicas das células T a patógenos e vacinas, assim como tecidos
transplantados, tumores e auto antígenos (Kuhn set al, 2006).
UFF
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2009
O anticorpo policlonal anti-CD3 humano comercializado reage com a
porção intracitoplasmática do antígeno CD3 (especificamente a cadeia CD3 ε)
expressado pelas células T (Dako, 2004). A demonstração intracitoplasmática desse
antígeno pode representar um dos primeiros sinais de comprometimento com a
linhagem de células T. Portanto, o antigeno CD3 é primeiramente detectado em
timócitos primordiais (Campana et al, 1987).
2.7
CD20
A molécula CD20 é uma proteína transmenbrana não glicosilada
encontrada somente em células da linhagem B (figura 2) (van Meerten, 2009; Bubien
et al, 1993). Acredita-se que a molécula CD20 tenha um papel na ativação,
proliferação e diferenciação dos linfócitos B (Bubien et al, 1993).
UFF
Juliana da Silva Leite
2009
Figura 2 - A molécula CD20 humana. Fonte: van Meerten, Neth J Med.
67(7):251-9, 2009.
O epitopo CD20 é adquirido tardiamente no estágio de maturação de précélula B e permanesce nas células em quase toda a sua diferenciação, apesar de
ser perdida no estágio de plasmócito (Figura 3 -van Meerten, 2009; Gocke, 2002).
Figura 3 - Expressão de CD20 no desenvolvimento da célula B. O antígeno
CD20 é expressado primeiramente durante o desenvolvimento
precoce do pré-linfócito B e é perdido durante a diferenciação
terminal em plasmócito. Adaptado de van Meerten, Neth J Med.
67(7):251-9, 2009.
O anticorpo monoclonal anti-CD20 humana clone L26 comercializado é
direcionado contra um antígeno presente na maioria das células T. O anticorpo
UFF
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2009
reage predominantemente com um polipeptídeo de 33 kD presente nas células B e
também com um componente menor de 30 kD. A maioria das células B presentes no
sangue periférico, e tecido linfóide, blastos centrogerminais e imunoblastos B são
fortemente marcados (Dako, 2001a).
Por causa de suas características, este anticorpo é utilizado não só para
identificação de linfomas de células B (Wobser et al, 2007), mas também para a
avaliação da infiltração de células B nos tecidos e, assim, para a quantificação
resposta inflamatória (Lins et al, 2008; Hubeau et al, 2001). A expressão das células
CD20+, indicativas de células B, é predominantemente focal e não difusa nos
tecidos inflamados. Uma explicação para isso é que essas células mimetizam a
formação de centros germinativos (Lins et al, 2008).
UFF
Juliana da Silva Leite
2009
Sendo assim, foram desenvolvidas as seguintes hipóteses:
•
Nas gastroduodenites os leucócitos mais comumente encontrados na
mucosa em cavalos de corrida colonizados por Helicobacter spp. são os
linfócitos T e os polimorfonucleares.
•
A margo plicatus é a região gástrica com maior infiltração de células
inflamatórias ao longo da sua mucosa em cavalos de corrida.
UFF
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2009
3
OBJETIVOS
3.1
OBJETIVO GERAL
Avaliar pela imuno-histoquímica a reação inflamatória gastroduodenal e
investigar a presença de Helicobacter spp. na mucosa gastroduodenal de eqüinos
sob treinamento de corrida.
3.2
•
OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Identificar e avaliar a ocorrência e gravidade das gastroduodenites e úlceras
gastroduodenais em cavalos sob treinamento de corrida, descrevendo os
achados macro e microscópicos da mucosa.
UFF
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2009
65
•
Identificar a ocorrência e distribuição de Helicobacter spp. nas regiões da mucosa
gástrica e duodenal de eqüinos, utilizando métodos invasivos de diagnóstico,
como: teste rápido da urease; exame bacterioscópico direto; histopatologia e
imuno-histoquímica.
•
Relacionar a colonização da mucosa gástrica por Helicobacter spp. com os
achados macro e microscópicos em cavalos sob treinamento de corrida
•
Avaliar e relacionar os diversos métodos de diagnóstico utilizados para detectar a
infecção por Helicobacter spp, como: teste rápido da urease; exame
bacterioscópico direto; histopatologia e imuno-histoquímica.
•
Avaliar a ocorrência e distribuição de polimorfonucleares, linfócitos T e B na
mucosa das diferentes regiões gastroduodenais de cavalos sob treinamento de
corrida.
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2009
4 MATERIAL E MÉTODOS
4.1 MATERIAL
Foram coletados estômago e duodeno de 15 eqüinos, em treinamento de
corrida da raça Puro Sangue Inglês, que vieram a óbito no Hospital Veterinário do
Jockey Club do Rio de Janeiro.
A amostra é aleatória e homogênea e os critérios de inclusão da amostra são: ser
cavalo submetido a treinamento de corrida, vir a óbito e ter sua necropsia realizada no
Hospital Veterinário do Jockey Club do Rio de Janeiro. Os animais com tempo de óbito
avançado, com afecção gastrintestinal, com estado adiantado de autólise, como, por exemplo,
acima de 12 horas no momento da necropsia, foram excluídos do trabalho.
UFF
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2009
67
4.2 MÉTODOS
O presente trabalho foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da
Faculdade de Medicina/Hospital Universitário Antônio Pedro sob protocolo nº 032/06.
4.2.1 Macroscopia e Coleta das Amostras
Os estômagos foram abertos ao longo da curvatura maior e o conteúdo
removido.
Foi realizado exame macroscópico da mucosa gástrica e duodenal,
bem como a documentação por fotografia do estômago e parte anterior do duodeno
e de todas as alterações encontradas; utilizando máquina fotográfica SonyCybershot® DSC-W7. O estômago foi dividido macroscopicamente em regiões: fundo
aglandular, margo plicatus, fundo glandular, antro e piloro. Para a coleta de
amostras, as regiões de fundo aglandular e margo plicatus ainda foram divididas em
três áreas e as regiões de fundo glandular e antro em duas áreas (Figura 4). Foram
coletados dois fragmentos de cada uma dessas áreas, da região de piloro e do
duodeno. Um dos dois fragmentos foi destinado à análise por meio do teste rápido
da urease, o outro ao exame histopatológico incluindo a imuno-histoquímica. Além
da coleta padrão, descrita acima, as áreas com alterações morfológicas
macroscópicas da mucosa também foram coletadas para análise histopatológica e
imuno-histoquímica.
UFF
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2009
68
Figura 4 –Estômago eqüino: padrão de coleta das amostras - três fragmentos
do fundo aglandular (FUA1,2,3), três fragmentos da margo plicatus
(MP1,2,3), dois fragmentos do fundo glandular (FUG1,2), dois do
antro (A.N.1,2), um do piloro (PI) e um do duodeno (DU). Niterói,
2009.
4.2.2 Teste Rápido da Urease
Os fragmentos coletados de cada região gástrica e duodeno foram
colocados em tubos de ensaio contendo 2 ml de uréia diluída a 10% em água
destilada estéril com vermelho de fenol como indicador de pH.
UFF
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2009
69
4.2.3 Exame Bacterioscópico Direto
O exame bacterioscópico direto foi realizado através de esfregaço das
mucosas gástricas coletadas de todas as regiões, os quais foram fixados a seco e
pelo calor e corados pela Fuccina Fenicada.
4.2.4 Exame Histopatológico
As amostras gástricas e de duodeno submetidas ao exame
histopatológico foram colocadas em pedaços de papel filtro com a serosa voltada
para baixo e a mucosa para cima, identificadas, fixadas por formol tamponado a
10%, clivadas, processada rotineiramente pela técnica de inclusão em parafina.
POsteriormente os cortes obtidos foram corados pela Hematóxilina-eosina (HE) e
pela técnica de “Warthin-Starry” (WS).
4.2.5 Imuno-histoquímica
4.2.5.1 Helicobacter spp.
Para a realização da técnica de imuno-histoquímica os cortes de tecido
obtidos pelo processamento histopatológico foram desparafinizados, re-hidratados e
tratados com solução de peroxido de hidrogênio a 6% (para inibição da peroxidase
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2009
70
endógena), antes da recuperação antigênica induzida pelo calor (banho-maria a
96°C, em solução de recuperação - Target Retrieval Solution 10X concentrated).
Após a recuperação antigênica, as secções foram incubadas com uma solução de
leite e albumina bovina (37°C), para inibição de li gações inespecíficas, seguido por
tratamento com anticorpo policlonal anti-H. pylori de coelho (código nº B0471,
DAKO), diluição de 1:400, overnight (anticorpo primário). As secções foram lavadas
três vezes com tampão TBS, antes do tratamento com Labeled Polymer AP antimouse and anti-rabbit, DAKO 5, code nº K1395 (DAKO Corporation, Carpinteria, CA,
USA) à temperatura ambiente (anticorpo secundário). Depois de nova lavagem com
tampão TBS, as secções foram tratadas com solução Substrate-Chromogen, Fast
Red 2470B46 (DAKO Corporation, Carpinteria, CA, USA) para a coloração vermelha
dos microrganismos (etapa de revelação). Todas as secções foram contra-coradas
com hematoxilina de Harris. Secções histológicas de cinco gatos e de uma biopsia
gástrica humana Helicobacter sp.-positivas foram usadas como controles positivos
para a técnica de IHQ. Para controles negativos, o anticorpo primário foi omitido.
4.2.5.2 Mieloperoxidase
Para a reação imuno-histoquímica de identificação da mieloperoxidase, as
técnicas
de
desidratação,
recuperação
antigênica
e
inibição
de
ligações
inespecíficas, são as mesmas já descritas. Porém, utiliza-se como anticorpo primário
o anticorpo policlonal de coelho anti-mieloperoxidase humana (código nº A0398,
DAKO, diluição de 1:500), como anticorpo secundário, o Envision + HRP anti-coelho
(DAKO),
UFF
e como cromógeno o 3,3’-diaminobenzidina (DAB
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- DAKO). Secções
2009
71
histológicas de medula óssea humana foram utilizadas como controle positivo e para
o controle negativo o anticorpo primário foi omitido.
Foi realizado estudo piloto para a adequação do protocolo de imunohistoquímica utilizando o anticorpo anti-mieloperoxidase humana em amostras
gastrintestinais eqüinas.
4.2.5.3 CD3
Para a reação imuno-histoquímica de identificação da molécula CD3, as
técnicas
de
desidratação,
recuperação
antigênica
e
inibição
de
ligações
inespecíficas, são as mesmas já descritas. Porém, utiliza-se como anticorpo primário
o anticorpo policlonal de coelho anti-CD3 humana (código nº A0452, DAKO, diluição
de 1:200), como anticorpo secundário, o Envision + HRP anti-coelho (DAKO), e
como cromógeno, o DAB (DAKO). Secções histológicas de linfonodo ou amídala
humana foram utilizadas como controle positivo e para o controle negativo o
anticorpo primário foi omitido.
Foi realizado estudo piloto para a adequação do protocolo de imunohistoquímica utilizando o anticorpo anti-CD3 humana em amostras gastrintestinais
eqüinas.
4.2.5.3 CD20
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2009
72
Para a reação imuno-histoquímica de identificação da molécula CD20, as
técnicas
de
desidratação,
recuperação
antigênica
e
inibição
de
ligações
inespecíficas, são as mesmas já descritas. Porém, utiliza-se como anticorpo primário
o anticorpo monoclonal de coelho anti-CD20 humana (código nº M0755, DAKO,
diluição de 1:300), como anticorpo secundário, o Envision + HRP anti-camundongo
(DAKO), e como cromógeno, o DAB (DAKO). Secções histológicas de linfonodo ou
amídala humana foram utilizadas como controle positivo e para o controle negativo o
anticorpo primário foi omitido.
Foi realizado estudo piloto para a adequação do protocolo de imunohistoquímica utilizando o anticorpo anti-CD20 humana em amostras gastrintestinais
eqüinas.
4.2.6 Análise dos Resultados
A macroscopia do estômago foi descritiva. As úlceras e erosões foram
classificadas macroscopicamente de acordo com o sistema de graduação adaptado
do proposto pelo Conselho SUGE (Síndrome da Úlcera Gástrica Eqüina) (Andrews
et al, 1999) nos seguintes graus: 0-mucosa intacta; 1-mucosa com áreas de
hiperemia e/ou hiperqueratose (espessamento do epitélio aglandular); 2- erosões ou
úlceras pequenas (menores de 3 cm), solitárias ou multifocais; 3- úlceras grandes
(maiores de 3 cm), solitárias ou multifocais, ou extensa erosão e sangramento; 4úlceras extensas (mais de 7 cm de diâmetro), com áreas de penetração submucosa
profunda (mais de 3 mm de profundidade).
UFF
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2009
73
O estudo de gastrite foi realizado utilizando como base os conceitos e
classificações morfológicas macro e microscópicas das divisões endoscópica e
histopatológica do Sistema Sydney (Castro et al, 1993; Dixon et al, 1996). A
classificação macroscópica foi realizada com base nos parâmetros de avaliação do
lúmen que serão presença ou não de muco, fluido, corpo estranho, parasitas,
estenoses e massas. Já na mucosa, as alterações edema, eritema, hemorragia,
friabilidade,
granularidade
e
hiperqueratose
foram
graduadas
em
leve(1),
moderado(2), severo (3) ou ausente(0); as rugas gástricas classificadas em normais,
hipertóficas e atróficas e as veias da submucosa em visualizadas ou não. Também
foi observada presença ou não de úlceras e erosões, indicando a região acometida.
O teste rápido de urease foi considerado positivo quando houve
mudança de coloração do amarelo-alaranjado para o rosa avermelhado, em um
período máximo de 24 horas.
No exame bacterioscópico direto, foi considerada negativa a amostra
com ausência de bactéria detectáveis. Nas amostras com presença de bactérias, foi
indicada a morfologia bacteriana visualizada, por exemplo, cocos, bacilos, bactérias
espiraladas.
Quanto ao exame histopatológico na coloração pela Hematoxilinaeosina, baseando-se Sistema Sydney (Dixon et al, 1996), a morfologia da mucosa
gástrica normal foi descrita, assim como quaisquer alterações observadas,
associadas ou não à presença de Helicobacter spp. O epitélio, sua camada basal e
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Juliana da Silva Leite
2009
74
queratinização foram avaliados e a presença de úlceras e erosões foi relatada. As
glândulas gástricas foram avaliadas e classificadas em normais, atróficas,
hiperplásicas e degeneradas. Na avaliação morfológica da mucosa gástrica, as
células inflamatórias foram graduadas em aumento de 400x obtendo-se a média de
cinco campos aleatoriamente escolhidos. Os seguintes graus foram estabelecidos:
ausente = nenhuma célula, leve = 1 a 50; moderado = 51 a 150; acentuado >151
células/campo, aproximadamente. O tipo e a distribuição deste infiltrado inflamatório
também foi descrito.
As amostras coradas com “Warthin-Starry” foram avaliadas quanto à
presença
de
microorganismos
impregnados
pela
prata
(enegrecidos)
morfologicamente compatíveis com Helicobacter spp, nas formas bacilar e cocóide,
sendo designadas positivas ou negativas.
As secções histológicas submetidas à imuno-histoquímica com
anticorpo anti-H. pylori foram analisadas para determinação da presença de
Helicobacter spp. e nomeadas positivas quando a bactéria, nas formas bacilar e
cocóide, corou em vermelho ou negativas, quando não houve marcação. Também a
densidade bacteriana observada nos cortes foi classificada como leve, moderada ou
acentuada.
Todas as amostra(s) positiva(s) em pelo menos dois métodos de diagnóstico
incluindo ou Warthin-Starry ou Imuno-histoquímica foram considerados positivas
para Helicobacter spp. Quando apenas a imuno-histoquímica foi positiva, a amostra
era considerada positiva.
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Juliana da Silva Leite
2009
75
A análise das secções histológicas submetidas à imuno-histoquímica
com anticorpo anti-mieloperoxidase foi realizada com o objetivo de determinar o grau
de infiltração polimorfonuclear e por conseqüência o grau de gastrite aguda. A
imunorreatividade foi classificada em graus de 0 a 4 de acordo com o número de
células marcadas. Foi feita contagem de células marcadas em 5 campos em
aumento de 400x para obtenção dos graus: 0 – ausência de células marcadas; 1 –
de 1 a 10 células por campo; 2 – de 11 a 50 células por campo; 3 - de 51 a 100
células por campo; 4 – >100 células por campo.
Com a finalidade de avaliar a infiltração da mucosa gastroduodenal por
linfócito T e por linfócito B, as secções histológicas submetidas à imuno-histoquímica
com anticorpo anti-CD3 e CD20, respectivamente, foram classificadas em graus de
acordo com o número de células marcadas conforme já descrito para o anticorpo
anti-mieloperoxidase.
4.2.7 Análise Estatística
Os dados obtidos foram avaliados estatisticamente por meio de uma
análise estatística descritiva utilizando nível de significância 5%, com auxílio do
programa SPSS, versão 11. Além disso foram utilizados os testes estatísticos do
sinal, qui-quadrado, Mann-Whitney, Kruskal-Wallis, Friedman e Wilcoxon.
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Juliana da Silva Leite
2009
76
UFF
Juliana da Silva Leite
2009
5
RESULTADOS
5.1
DADOS DOS CAVALOS AVALIADOS
Os cavalos de corrida Puro Sangue Inglês avaliados tinham idades que
variavam de 22 a 120 meses. Sete cavalos eram machos e oito, fêmeas. Onze
animais apresentavam histórico de administração de antiinflamatórios, dentre eles,
em 10, pelo menos a fenilbutazona foi administrada. Os dados clínicos descritos
acima podem ser mais bem apreciados na tabela 2.
UFF
Juliana da Silva Leite
2009
77
Tabela 2 – Principais dados dos cavalos de corrida Puro Sangue Inglês
avaliados (n=15), Niterói, 2009.
Animal
Sexo
Idade (meses)
Antiinflamatório
1
M
48
fenilbutazona
2
M
42
-
3
F
57
-
4
F
44
fenilbutazona
5
M
120
fenilbutazona
6
F
22
-
7
M
23
fenilbutazona + flunixin meglumine +
dexametasona
8
M
49
9
F
36
fenilbutazona +
flunixin meglumine
fenilbutazona
10
F
48
-
11
M
38
antiinflamatório
12
F
67
fenilbutazona, flunixin meglumine +
dexametasona
13
F
32
fenilbutazona, flunixin meglumine
14
F
48
fenilbutazona
15
M
36
fenilbutazona
F = fêmea
5.2
M = macho.
ANÁLISE MACROSCÓPICA
Pela avaliação macroscópica foi descrito o conteúdo luminal dos
estômagos dos cavalos de corrida estudados (n=15), e este resultado foi
demonstrado no gráfico 1. A maior freqüência de achados no lúmen estomacal dos
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Juliana da Silva Leite
2009
78
animais do estudo foi de fluido (14 - 93,33%) seguida de muco (8 – 53,33%), fibrina
(4 – 26,67%) e sangue (2 – 13,33%) (figuras 5 A, B e C). Não foram observados
corpos estranhos, parasitas, massas ou estenoses no lúmen gástrico desses
animais.
Fibrina
Sangue
Fluido
Muco
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10 11 12 13 14 15
Anim al
Gráfico 1 – Conteúdo luminal dos estômagos dos eqüinos submetidos a
treinamento de corrida avaliados (n=15), Niterói, 2009.
O exudato fibrinoso presente em quatro animais foi graduado em 0 =
ausente; 1 = leve; 2 = moderado; 3 = grave obtendo-se as freqüências observadas
no gráfico 2.
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Juliana da Silva Leite
2009
79
Gráfico 2 – Freqüência dos graus de exudato fibrinoso nos estômagos dos
cavalos de corrida avaliados (n=15). A lesão foi classificada em 0 =
ausente; 1 = leve; 2 = moderado; 3 = grave. Niterói, 2009.
As lesões macroscópicas da mucosa gástrica dos 15 eqüinos submetidos
a treinamento de corrida foram descritas e graduadas conforme observado no
gráfico 3. A alteração que apresentou maior freqüência foi edema (14 – 93,33%)
seguida de eritema (13 – 86,67%), hemorragia (12 – 80,00%), espessamento (11 73,33%), granularidade (8 – 53,33%) e friabilidade (5 – 33,33%) (figuras 5A, B, C e
D).
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Juliana da Silva Leite
2009
80
3
Grau
2
1
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10 11 12 13 14 15
Edema
2
1
2
2
0
2
1
2
2
2
2
1
1
2
1
Eritema
3
1
2
2
1
3
0
2
3
2
2
2
1
2
0
Hemorragia
0
1
3
2
0
3
1
1
2
0
1
2
2
2
3
Friabilidade
0
0
0
0
0
0
2
2
0
2
0
0
2
1
0
Granularidade
0
0
1
0
0
0
1
2
3
3
0
0
2
1
1
Espessamento
1
2
1
2
1
0
0
0
2
2
1
3
0
2
1
Animal
Gráfico 3 – Graduação das lesões da mucosa gástrica encontradas nos
cavalos de corrida avaliados (n=15). As lesões foram classificadas
em 0 = ausente; 1 = leve; 2 = moderado; 3 = grave. Niterói, 2009.
Baseado nos parâmetros de avaliação da divisão endoscópica do Sistema
Sidney Atualizado, a mucosa gastroduodenal foi avaliada macroscopicamente
obtendo-se que os 11 animais que tiveram o duodeno avaliado apresentavam,
dentre outras características, algum grau de hiperemia o que foi caracterizada como
uma enterite. Gastrite enantematosa foi observada em 46,67% (7/15), gastrite
hemorrágica em 33,33% (5/15) e gastrite erosiva em 20,00% dos cavalos do
trabalho. Duodenite (enterite) foi observada em todos os cavalos avaliados (n = 11).
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Juliana da Silva Leite
2009
81
No gráfico 4 pode ser observado o grau de inflamação da mucosa gastroduodenal
por cavalo estudado.
3
2,5
2
1,5
1
0,5
0
1
2
3
4
Gastrite Enantematosa
5
6
7
8
Gastrite Erosiva
9
10
11
12
13
Gastrite Hemorrágica
14
15
Enterite
Gráfico 4 - Grau de inflamação da mucosa gastroduodenal dos cavalos de
corrida avaliados (n=15 para mucosa gástrica e n=11 para duodeno).
A inflamação foi graduada em 0= ausente; 1 = leve; 2 = moderado; 3 =
grave. Niterói, 2009.
A tabela 3 demonstra as freqüências dos graus de gastrite e enterite nos
animais estudados.
UFF
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2009
82
Tabela 3 – Freqüência dos graus de gastrite e enterite dos cavalos de corrida
avaliados (n=15) com base nos parâmetros de avaliação da divisão
endoscópica do Sistema Sidney Atualizado, Niterói, 2009.
Tipo
Grau
Freqüência
Porcentagem
Gastrite
0
8
53,34%
Enantematosa
1
3
20,00%
2
2
13,33%
3
2
13,33%
0
12
80,00%
1
0
0,00%
2
2
13,33%
3
1
6,67%
0
10
66,67%
1
1
6,67%
2
2
13,33%
3
2
13,33%
0
0
0,00%
1
1
9,09%
2
3
27,27%
3
7
63,64%
Gastrite Erosiva
Gastrite Hemorrágica
Enterite (n =11)
Com base na classificação proposta pelo Conselho SUGE o revestimento
estomacal dos animais estudados (n=15) foi graduado e os graus obtidos ilustrados
no gráfico 5.
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2009
83
4
3
2
1
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10 11 12 13 14 15
Gráfico 5 – Avaliação da mucosa gástrica dos cavalos de corrida avaliados
(n=15) utilizando a graduação proposta pelo Conselho da Síndrome
da Ulcera Gástrica Eqüina (SUGE), na qual: 0-mucosa intacta; 1mucosa com áreas de hiperemia e/ou hiperqueratose (espessamento
do epitélio aglandular); 2- erosões ou úlceras pequenas (menores de
3 cm), solitárias ou multifocais; 3- úlceras grandes (maiores de 3 cm),
solitárias ou multifocais, ou extensa erosão e sangramento; 4úlceras extensas (mais de 7 cm de diâmetro), com áreas de
penetração submucosa profunda (mais de 3 mm de profundidade).
Niterói, 2009.
Nenhum dos animais apresentou a mucosa intacta (grau 0). Em um animal
(6,67%) a mucosa tinha áreas de hiperemia e/ou espessamento do epitélio
aglandular apenas. Erosões ou úlceras pequenas (menores de 3 cm), solitárias ou
multifocais foram observadas em oito animais (53,33%). Úlceras grandes (maiores
de 3 cm), solitárias ou multifocais, ou extensa erosão e sangramento foram
identificadas em cinco cavalos (33,33%). Já úlceras extensas (mais de 7 cm de
diâmetro), com áreas de penetração submucosa profunda (mais de 3 mm de
UFF
Juliana da Silva Leite
2009
84
profundidade) foram evidenciadas em um cavalo (6,67%) somente. Os dados de
freqüência do grau SUGE podem ser examinados na tabela 4.
Tabela 4 – Freqüência dos graus observados na mucosa gástrica dos cavalos
de corrida estudado (n=15) de acordo com a classificação proposta
pelo Conselho da Síndrome da Ulcera Gástrica Eqüina (SUGE),
Niterói, 2009.
Grau SUGE
Freqüência
Porcentagem
0
0
0,00%
1
1
6,67%
2
8
53,33%
3
5
33,33%
4
1
6,67%
0-mucosa intacta 1- áreas de hiperemia/espessamento 2- erosões ou úlceras pequenas 3- úlceras grandes 4- úlceras extensas
5.3
PADRÃO DE COLETA DE FRAGMENTOS
Foi obtido um total de 131 amostras para o processamento histológico de
rotina de 15 cavalos de corrida estudados. Dessas amostras, 106 foram coletadas
segundo o padrão de coleta usual descrito na seção de Material e Métodos, e como
lá relatado, toda alteração macroscópica presente que por ventura não fosse
coletada pelo padrão de coleta usual, seria coletada a parte. Essa coleta fora do
padrão usual gerou mais 23 amostras totalizando as 131 amostras.
UFF
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2009
85
5.4
INVESTIGAÇÂO DE Helicobacter spp.
5.4.1 Teste Rápido da Urease
O teste rápido da urease foi realizado em 9 animais, totalizando 47
amostras avaliadas. Foram consideradas positivas 34,00% das amostras (16/47), e
negativas 66,00% das amostras (31/47). Na tabela 5 os resultados do teste rápido
da uréase por animal são especificados.
Tabela 5– Resultados do teste rápido da urease e regiões da mucosa
gastroduodenal positivas por eqüinos sob treinamento de corrida
avaliado (n=9).Niterói, 2009.
Teste Rápido da Urease
Cavalo
Resultado
Região positiva
1
positivo
FUA, FUG
2
positivo
FUA, FUG
5
positivo
FUA, MP, FUG, A.N., PI
6
negativo
-
7
negativo
-
10
negativo
-
11
negativo
-
12
positivo
FUA, MP, FUG, AN
14
positivo
AN
FUA = fundo aglandular; MP = margo plicatus; FUG = fundo glandular; A.N. = antro; PI = piloro; DU = duodeno.
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Juliana da Silva Leite
2009
86
5.4.2 Exame Bacterioscópico Direto
Foram avaliadas, pelo exame bacterioscópico direto, 88 amostras de 14
animais. A freqüência dos resultados observados foi demonstrada na tabela 6.
Tabela 6 – Freqüência dos resultados do exame bacterioscópico direto em
amostras gastroduodenais dos eqüinos submetidos a treinamento
de corrida avaliados (n=14). Niterói, 2009.
Exame Bacterioscópico Direto
Resultado
Freqüência
Porcentagem
Bacilos
33
37,50%
Cocos + bacilos
20
22,70%
Negativo
6
6,80%
29
33,00%
88
100,00%
Contaminação (outras
bactérias)
Total
O exame bacterioscópico direto (Figuras 5 E e F) revelou a presença de
cocos e bacilos em sete animais (4,5,7,10,12,13,e,14) e bacilos em três animais (1,
2 e 3). O animal 11 foi negativo para cocos e bacilos em todas as regiões. Algumas
amostras (cavalos 6 e 9) foram caracterizadas como contaminação por
apresentarem outras bactérias e /ou fungos que não interessavam ao estudo.
UFF
Juliana da Silva Leite
2009
87
5.4.3 Coloração Especial de Warthin-Starry
Um total de 115 amostras de 14 cavalos foram avaliadas pela coloração
especial de Warthin-Starry. A freqüência de resultados desta análise foi disposta na
tabela 7.
Tabela 7 - Freqüência dos resultados da coloração especial de Warthin-Starry
para a pesquisa de Helicobacter spp. em amostras gastroduodenais
dos eqüinos submetidos a treinamento de corrida avaliados (n=14).
Niterói, 2009.
Coloração Warthin-Starry
Resultado
Freqüência
Porcentagem
Positivo
42
36,52%
Negativo
6
5,22%
Indefinido
67
58,26%
Total
115
100,00%
Todos os animais avaliados pela coloração “Warthin-Starry” obtiveram a
presença de bactérias com morfologia compatível com Helicobacter spp. em, pelo
menos, uma região da mucosa gastroduodenal.
A coloração “Warthin-Starry” mostrou impregnação pela prata de cocos
e/ou bacilos em forma de vírgula ou ligeiramente espiralados. As regiões positivas
apresentavam essas bactérias imersas no muco superficial, na luz de glândulas
gástricas da mucosa glandular (Figuras 6A e 6B) e na superfície do epitélio
UFF
Juliana da Silva Leite
2009
88
estratificado da região aglandular do estômago (Figuras 6C). Em alguns animais, a
região de fundo, principalmente, apresentou estruturas esféricas a ovaladas
impregnadas pela prata no interior de células parietais.
Os grupos de amostra lesão e coleta padrão não apresentaram diferença
estatística entre si quanto aos resultados da coloração especial Warthin-Starry
segundo o teste estatístico do Qui-quadrado de Pearson (p=0,788).
5.4.4 Imuno-histoquímica
Foram avaliadas pela imuno-histoquímica 126 amostras de 15 cavalos. A
freqüência dos resultados obtidos está descrita na tabela 8.
Tabela 8 - Freqüência dos resultados da imuno-histoquímica com anticorpo
anti-Helicobacter pylori. em amostras gastroduodenais dos eqüinos
submetidos a treinamento de corrida avaliados (n=15). Niterói, 2009.
Imuno-histoquímica – anticorpo anti-Helicobacter pylori
Resultado
Freqüência
Porcentagem
Positivo
53
42,06%
Negativo
3
2,38%
Indefinido
70
55,56%
Total
126
100,00%
A imuno-histoquímica revelou positividade leve a moderada em amostras
de, pelo menos, uma região de 14 cavalos. As amostras positivas apresentavam
UFF
Juliana da Silva Leite
2009
89
marcação avermelhada de estruturas ora cocóides ora bacilares no muco superficial
(Figura 6D), na luz de glândulas gástricas e no interior de células parietais da
mucosa da região glandular (Figura 6E) e na superfície e extensão do epitélio
estratificado da região aglandular (Figura 6F), podendo de estender à lâmina própria,
e na interface entre esta e a submucosa. O animal 11 foi o único que apresentou
amostras negativas e outras indefinidas, ou seja, a marcação foi muito tênue ou com
aspecto de depósito de pigmento, gerando dúvida.
O teste estatístico do qui-quadrado não revelou diferença estatística entre
os grupos de amostra lesão e coleta padrão quanto aos resultados da Imunohistoquímica (p=0,540).
5.4.5 Status Final
Para a determinação do status final de infecção foram avaliadas 128
amostras. Dessas, 48,40% eram positivas e 51,60% indefinidas. A tabela 9 explicita
os resultados obtidos pelos diferentes métodos de diagnóstico utilizados para a
detecção de bactérias do gênero Helicobacter e demonstra a conclusão final quanto
ao estado de infecção por Helicobacter spp.
UFF
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2009
90
Tabela 9 - Resultados dos testes para detecção de Helicobacter spp. e status
final de infecção por eqüino submetido a treinamento de corrida
avaliado (n=15). Niterói, 2009.
Resultados
Animal
TRU
EBD
WS
IHQ
Status Final
1
positivo
bacilos
positivo
positivo
Positivo
2
positivo
bacilos
positivo
positivo
Positivo
3
n
bacilos
positivo
positivo
Positivo
4
n
cocos e
bacilos
positivo
positivo
Positivo
5
positivo
cocos e
bacilos
positivo
positivo
Positivo
6
negativo
contaminaç
ão
positivo
positivo
Positivo
7
negativo
cocos e
bacilos
positivo
positivo
Positivo
8
n
contaminaç
ão
positivo
positivo
Positivo
9
n
contaminaç
ão
positivo
positivo
Positivo
10
negativo
cocos e
bacilos
positivo
positivo
Positivo
11
negativo
contaminaç
ão
positivo
indefinido
Indefinido
12
positivo
cocos e
bacilos
positivo
positivo
Positivo
13
n
cocos e
bacilos
positivo
positivo
Positivo
14
positivo
cocos e
bacilos
positivo
positivo
Positivo
15
n
n
n
positivo
Positivo
Total
9
14
14
15
15
n = não realizado / TRU = teste rápido da uréase / EBD = exame bacterioscópico direto / WS =
Warthin-Starry / IHQ = Imuno-histoquímica.
UFF
Juliana da Silva Leite
2009
91
Não existe diferença estatística entre os grupos de fragmentos lesão e
coleta padrão quanto ao status final de infecção pelo Helicobacter spp. segundo o
teste estatístico do qui-quadrado de Pearson (p=0,948).
O teste estatístico do qui-quadrado de Pearson evidenciou uma diferença
significativa entre os grupos positivo e indefinido do Status Final de infecção em
relação aos resultados da Imuno-histoquímica, demonstrando similaridade entre o
status final e o teste de Imuno-histoquímica. A mesma diferença foi visualizada ao se
testar a coloração de Warthin-Starry, indicando similaridade entre esta e o status
final.
5.5
ANÁLISE HISTOPATOLÓGICA: HEMATOXILINA -EOSINA
A análise histopatológica pela coloração de hematoxilina-eosina (HE)
revelou elevada freqüência de erosões e úlceras dentre os animais estudados.
Conforme ilustrado no gráfico 6, o animal 14 apresentou erosão nas amostras de
todas as regiões avaliadas e todos os animais exceto o animal 5 tinham amostras
com erosão do epitélio em pelo menos uma região.
UFF
Juliana da Silva Leite
2009
92
7
6
5
4
3
2
1
0
1
2
3
4
5
PI
6
A.N.
7
MP
8
9
FUA
10
11
FUG
12
13 14
15
DU
Gráfico 6 – Regiões gastroduodenais que apresentam erosão da mucosa em
cavalos de corrida (para DU n= 10; PI n = 11; FUA n=14 e para as
demais regiões n=15). Entende-se por PI = piloro; A.N. = antro; MP =
margo plicatus; FUA = fundo aglandular; DU = duodeno. Niterói,
2009.
O gráfico 7 ilustra as regiões gastroduodenais ulceradas nos cavalos de
corrida Puro Sangue Inglês avaliados. A região com maior freqüência de úlceras na
mucosa é a margo plicatus, acometida em 9 animais (60,00% - figura 7A). O fundo
aglandular e o duodeno estavam ulcerados em três animais (21,43% e 30,00%
respectivamente). Apenas um animal (6,67%) apresentou amostras de fundo
glandular ulceradas.
UFF
Juliana da Silva Leite
2009
93
2
1
0
1
2
3
4
PI
5
AN
6
7
MP
8
9 10 11 12 13 14 15
FUA
FUG
DU
Gráfico 7 – Regiões gastroduodenais ulceradas de cavalos de corrida (para DU
n= 10; PI n = 11; FUA n=14 e para as demais regiões n=15). Entendese por PI = piloro; A.N. = antro; MP = margo plicatus; FUA = fundo
aglandular; DU = duodeno. Niterói, 2009.
Na tabela 10 podem ser observadas as freqüências das alterações
histopatológicas encontradas nas 112 amostras avaliadas.
UFF
Juliana da Silva Leite
2009
94
Tabela 10 – Freqüência das alterações histopatológicas observadas nas 112
amostras da mucosa gastroduodenal dos cavalos de corrida
estudados, Niterói, 2009.
Freqüência (porcentagem)
Alteração Histopatológica
(n=112)
Erosão
Presente
Ausente
64,28%
35,71%
Úlcera
19,64%
80,36%
Congestão
96,43%
3,57%
Hemorragia
66,07%
33,93%
Fibrina (n = 103)
45,63%
54,37%
Edema
77,68%
22,32%
A congestão foi avaliada em 112 amostras de 15 animais e foi evidenciada
em 108 amostras (96,4% - tabela 10) sendo leve em 23 (20,5%), moderada em 41
(36,6%) e grave em 44 amostras (39,3%). Quando se estuda a congestão levando
em consideração o animal encontram-se três (20%) animais com congestão de leve
a moderada, seis (40%) animais com congestão moderada, três (20%) animais com
congestão moderada e grave e três (20%) animais com congestão grave.
A hemorragia também foi avaliada em 112 amostras, das quais, 74 (66,1%)
apresentavam hemorragia (tabela 10). A hemorragia leve foi observada em 41
amostras (36,6%), moderada em 22 amostras (19,6%), e grave em 11 amostras
(9,8%). Quando o foco passa para a avaliação dos animais quanto à presença de
hemorragia, observou-se que os cavalos 2 e 12 (13,33%) não apresentaram
nenhuma amostra com hemorragia. Já hemorragia de grau leve foi observada em
UFF
Juliana da Silva Leite
2009
95
cinco (33,33%) cavalos, grau leve a moderado foi observado em três (20%), grau
moderado em dois (13,33%) e grave em três animais (20%).
Outra alteração histopatológica estudada nas 112 amostras foi o edema,
estando presente em 77,7% delas (tabela 10). Desse montante, 39,3% das amostras
apresentavam edema intracelular subqueratótico, 29,5%, edema subepitelial, e 8,9%
edema de submucosa.
Dando continuidade aos achados microscópicos em amostras coradas
pela coloração de hematoxilina-eosina, foi observada hiperplasia epitelial em
amostras das regiões de fundo glandular e margo plicatus em 9 animais (60%).
Quatro animais (26,7%) apresentaram hiperplasia epitelial apenas nas amostras de
margo plicatus. Já na região glandular a hiperplasia não foi um achado muito
freqüente, amostras de piloro de um animal (6,7%) e de antro de outro (6,7%),
apresentaram hiperplasia da mucosa. Quando avaliamos este parâmetro (epitélio
hiperplásico) num total de 106 amostras estudadas a freqüência é de 35,2%.
Necrose e displasia foram menos freqüentes nessas amostras: 3,7% e 1,2%
respectivamente.
A freqüência dos parâmetros avaliados com relação a edema, queratose e
a camada basal nas amostras de epitélio pavimentoso estratificado foi descrita na
tabela 11. A maioria das amostras da região aglandular (n=30) apresentou edema
intracelular subqueratótico (83,4%), hiperqueratose paraqueratótica (80%) e
hiperplasia da camada basal (66,7%).
UFF
Juliana da Silva Leite
2009
96
Tabela 11 – Freqüência em percentual de amostras das regiões da porção
aglandular do estômago dos eqüinos submetidos a treinamento de
corrida avaliados (n=15) quanto aos parâmetros histopatológicos da
camada basal, queratose e edema. Niterói, 2009.
Região
Parâmetros
Classificação
FUA
MP
Ausente
20,00%
13,33%
Intracelular subqueratótico
80,00%
86,67%
Normal
33,33%
0,00%
hiper/paraqueratótica
60,00%
100,00%
hiper/ortoqueratótica
6,67%
0,00%
Normal
26,67%
26,67%
Hiperplásica
66,67%
66,67%
Irregular
6,67%
6,67%
Edema
Queratose
Camada Basal
FUA = fundo aglandular e MP = margo plicatus.
As alterações histopatológicas da tabela 11 quando analisadas com foco
no animal avaliado, revelam que o cavalo 12 apresentava irregularidade na camada
basal e apenas os animais 5, 7 e 10 apresentavam todas as amostras normais para
este parâmetro. Quanto à queratose, somente as amostras de fundo aglandular dos
cavalos 2, 6, 9, 10 e 15 apresentavam-na dentro da normalidade. As amostras dos
cavalos 13 e 15 e do fundo aglandular do cavalo 9 não apresentavam edema em
quanto que todas as outras apresentavam edema intracelular subqueratótico.
As glândulas gástricas foram avaliadas em 84 amostras (da região
glandular do estômago) e dentre elas, 19 (22,62%) revelaram glândulas hipertróficas
UFF
Juliana da Silva Leite
2009
97
e 9 (10,71%) glândulas atróficas. As amostras com glândulas hipertróficas eram
provenientes de sete (em 15 animais - 46, 67%) cavalos diferentes - cavalos
4,8,9,10,11,13 e 14 -, mas seis amostras eram da região de margo plicatus, cinco
amostras da região de fundo glandular, quatro de antro e uma de piloro. As amostras
com glândulas atróficas provinham de seis cavalos diferentes (em 15 animais –
40,00% – cavalos 5,6,10,12,14 e15 - sendo que duas delas eram da região do piloro,
duas da região do fundo glandular duas da margo plicatus e uma do antro.
As tabelas 12, 13 e 14 revelam os dados obtidos pela avaliação
histopatológica do infiltrado inflamatório por região de cada animal
UFF
Juliana da Silva Leite
2009
98
Tabela 12 – Resultados da avaliação de amostras das regiões da porção
aglandular do estômago dos eqüinos submetidos a treinamento de
corrida avaliados (n=15) quanto aos parâmetros do infiltrado
inflamatório. Niterói, 2009.
Animal
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
Região
MP
FUA
MP
FUA
MP
FUA
MP
FUA
MP
FUA
MP
FUA
MP
FUA
MP
FUA
MP
FUA
MP
FUA
MP
FUA
MP
FUA
MP
FUA
MP
FUA
MP
FUA
Tipo
LP
LP
LP
LP
M
LP
LP
LP
LP
MN
LP
LP
LP
M
M
M
MN
LP
LP
LP
LP
LP
LP
LP
MN
n
LP
LP
M
LP
DI
D
D
D
D
F
F
D
D
D
D
D
D
D
D
F
F
D
D
D
D
MF
D
D
D
D
n
D
D
D
D
Infiltrado Inflamatório
Grau
FL*
2
1
2
0
1
1
1
0
2
0
1
0
2
1
1
0
2
1
1
0
1
1
3
0
1
1
3
0
3
1
2
0
2
1
2
1
3
0
1
0
3
0
1
0
3
1
3
0
1
1
n
n
2
0
2
1
3
0
2
0
AL*
0
0
0
0
0
0
0
0
1
0
0
0
1
0
0
0
1
2
2
0
1
0
5
0
0
n
2
1
2
0
Exo
n
n
0
0
0
0
0
0
0
0
0
1
1
1
0
1
1
1
0
0
0
1
1
1
0
n
0
1
1
1
FUA = fundo aglandular; MP = margo plicatus;DI = distribuição do infiltrado FL = folículo linfóide; AL =
aglomerado linfóide; Exo = exocitose; LP = linfoplasmocitário; M = misto; MN = mononuclear; D =
difuso; MF= multifocal; F = focal Grau 1 = leve; 2= moderado ; 3 = grave. * número por amostra.
UFF
Juliana da Silva Leite
2009
99
Tabela 13 – Resultados da avaliação de amostras das regiões da porção
glandular do estômago dos eqüinos submetidos a treinamento de
corrida avaliados (n=15) quanto aos parâmetros do infiltrado
inflamatório. Niterói, 2009.
Animal
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
Região
PI
AN
FUG
AN
FUG
AN
FUG
PI
AN
FUG
PI
AN
FUG
PI
AN
FUG
PI
AN
FUG
PI
AN
FUG
PI
AN
FUG
PI
AN
FUG
PI
AN
FUG
PI
AN
FUG
AN
FUG
PI
AN
FUG
AN
FUG
Tipo
LP
LP
LP
LP
LP
LP
LP
LP
LP
LP
LP
LP
LP
LP
LP
LP
LP
LP
LP
LP
LP
LP
MN
LP
LP
M+E
LP
LP
LP
LP
LP
LP
LP
LP
MN
MN
LP
LP
LP
LP
M
Infiltrado Inflamatório
DI
Grau
FL*
D
2
4
D
2
0
D
2
0
D
2
0
D
1
0
D
1
0
D
1
0
D
2
4
D
2
4
D
1
0
D
2
0
D
2
0
D
1
0
D
2
0
D
2
0
MF
2
0
D
2
0
D
1
0
D
1
0
D
2
0
D
2
0
D
1
0
D
3
0
D
2
0
D
2
0
F
3
0
D
3
1
D
1
0
D
3
0
D
2
1
D
1
0
D
2
1
D
2
0
D
3
0
D
2
4
D
1
0
D
2
0
D
2
1
D
2
0
D
2
0
D
2
0
AL*
1
1
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
2
2
1
2
0
0
2
1
0
2
1
0
0
0
0
0
0
0
1
3
3
2
2
0
3
0
1
0
Exo
n
n
n
0
0
0
0
0
1
0
0
0
0
1
0
1
0
0
0
0
0
0
0
1
0
0
1
0
0
0
0
1
1
1
0
0
0
1
0
1
1
FUA = fundo aglandular; MP = margo plicatus;DI = distribuição do infiltrado FL = folículo linfóide; AL =
aglomerado linfóide; Exo = exocitose; LP = linfoplasmocitário; M = misto; MN = mononuclear; M + E =
UFF
Juliana da Silva Leite
2009
100
misto + eosinófilos; D = difuso; MF= multifocal; F = focal Grau 1 = leve; 2= moderado ; 3 = grave. *
número por amostra.
Tabela 14 – Resultados da avaliação de amostras de duodeno dos eqüinos
submetidos a treinamento de corrida avaliados (n=10) quanto aos
parâmetros do infiltrado inflamatório. Niterói, 2009.
Animal
4
5
6
8
9
10
11
13
14
15
Tipo
LP
LP
LP
LP
MN
LP
LP
M+E
M+E
LP
DI
D
D
MF
D
D
D
D
D
D
D
Infiltrado Inflamatório
Grau
FL*
3
6
2
0
2
2
3
3
3
2
2
0
3
0
3
5
3
12
2
4
AL*
1
0
3
2
0
0
10
2
4
0
Exo
0
0
0
0
0
0
0
1
1
1
FUA = fundo aglandular; MP = margo plicatus;DI = distribuição do infiltrado FL = folículo linfóide; AL =
aglomerado linfóide; Exo = exocitose; LP = linfoplasmocitário; MN = mononuclear; M + E = misto +
eosinófilos; D = difuso; MF= multifocal; Grau 1 = leve; 2= moderado ; 3 = grave. * número por
amostra.
As freqüências obtidas da avaliação histopatológica do infiltrado
inflamatório nas 112 amostras dos 15 animais avaliados estão descritas na tabela
15.
UFF
Juliana da Silva Leite
2009
101
Tabela 15 – Freqüência em percentual dos parâmetros histopatológicos do
infiltrado
inflamatório
obtidas
da
avaliação
de
amostras
gastroduodenais dos eqüinos submetidos a treinamento de
corrida avaliados (n=15). Niterói, 2009.
Infiltrado Inflamatório
Freqüência
Linfoplasmocitário
76,79%
Mononuclear
10,71%
Misto
8,93%
Misto + Eosinófilos
3,57%
Difuso
88,29%
Focal
8,11%
Multifocal
3,60%
Leve
31,25%
Moderado
45,54%
Grave
23,21%
Presente
30,77%
Ausente
69,23%
Tipo
(n=112)
Distribuição
(n=111)
Grau
(n=112)
Exocitose
(n=104)
Como pôde ser observado na tabela 15 houve um predomínio de infiltrado
inflamatório composto por linfócitos e plasmócitos com distribuição difusa e grau
moderado. Essas células estavam distribuídas principalmente próximas a muscular
da mucosa, mas por vezes infiltravam toda a extensão da mucosa incluindo a região
logo abaixo do epitélio de revestimento e a submucosa (Figuras 7 B, C, D, E , F).
UFF
Juliana da Silva Leite
2009
102
Dessa forma, o diagnóstico final para as amostras gástricas e duodenais
dos 15 animais avaliados foi descrito na tabela 16.
Tabela 16 – Diagnóstico final após avaliação histopatológica das amostras
gastroduodenais dos eqüinos submetidos a treinamento de
corrida avaliados (n=15). Niterói, 2009.
Animal
Gastrite
Enterite
1
Cônica (LP) moderada
-
2
Cônica (LP) leve
-
3
Cônica (LP) leve ativa (MP)
-
4
Cônica (LP) moderada
Cônica (LP) grave
5
Cônica (LP) moderada
Cônica (LP) moderada
6
Cônica (LP) moderada a grave
Cônica (LP) moderada
7
Cônica (LP) grave
-
8
Cônica (LP) moderada ativa (MP + FUA)
Cônica (LP) grave
9
Cônica (MN) moderada
Cônica (MN) grave
10
Cônica (LP) grave ativa (PI)
Cônica (LP) moderada
11
Cônica (LP) moderada
Cônica (LP) grave
12
Cônica (LP) grave
-
13
Cônica (MN) leve
Cônica (MN) grave
14
Cônica (LP) moderada
Cônica (MN) grave
15
Cônica (LP) moderada ativa (MP + FUG)
Cônica (LP) moderada
LP = linfoplasmocitário; MN = mononuclear; MP = margoplicatus FUA = fundo aglandular; FUG = fundo glandular
De todos os parâmetros avaliados pela hematoxilina-eosina, existe
diferença estatística entre o grupo de amostras coletadas de lesões e o grupo de
UFF
Juliana da Silva Leite
2009
103
amostras com padrão de coleta usual quanto ao tipo de infiltrado inflamatório
encontrado (p=0,028), a quantidade de folículos linfóides (0,043), ao tipo de gastrite
(p = 0,017). Existe tendência à diferença estatística entre esses grupos quanto à
distribuição do infiltrado inflamatório (p=0,065) e a presença de úlceras (p=0,056).
5.6
O INFILTRADO INFLAMATÓRIO PELA IMUNO – HISTOQUÍMICA
5.6.1 Mieloperoxidase
Um estudo piloto revelou imunorreatividade satisfatória ao se avaliar o
anticorpo
anti-mieloperoxidase
humana
nas
diferentes
amostras
do
trato
gastrintestinal dos eqüinos. A imunomarcação se caracterizou por ser intensa no
citoplasma das células polimorfonucleares e muito mais discreta no citoplasma dos
macrófagos. Esses polimorfonucleares compreendiam tanto neutrófilos quanto
eosinófilos. Ambos os tipos celulares foram observados dispersos na mucosa
gastrintestinal e infiltravam discretamente a submucosa (Figuras 8A e B).
Foram realizadas as reações imuno-histoquímicas com anticorpo antimieloperoxidase em 126 amostras de 15 animais e a média do número de células
marcadas por campo por animal e por região foi indicada na tabela 17. No total do
número de amostras a média foi de 29,8 células por campo e desvio padrão de 62,6.
UFF
Juliana da Silva Leite
2009
104
Tabela 17 – Média do número células marcadas por campo pela imunomarcação com anticorpo anti-mieloperoxidase em amostras
gástricas e duodenais de cavalos PSI sob treinamento de corrida
(n=15), Niterói, 2009.
Cavalo
1
2
3
4
5
6
FUA
MP
FUG
AN
PI
1,4
45,8
1,8
4,2
-
1,4
6,5
6,6
8,2
0,6
5,6
31
1
18,6
8,2
0,8
3,2
1,2
41,2
9
40,4
1,8
0,2
1,4
10,6
29,2
7
8
9
10
11
12
13
15
Média por
região
1
1,2
1,2
244
43,6
8,4
24,4
23
98,8
223,6
3,2
5,2
1,2
Lesão
Média por
animal
Grau *
-
-
13,3
2
-
3 MP
4,0
1
1,2
25 MP
12,9
2
2
70,8
MP
21,1
2
0,6
-
9,2
1
3,4
210,2
MP
55,3
3
n
231,3
FUA
95.8
3
-
55,8
3
127,4
MP
25,2
2
-
33.8
2
43,8
MP
87,1
3
-
23,2
2
179.9
MP e
AN
32,0
2
23,7
MP e
AN
13,5
2
2,2 MP
8,4
1
91,7
-
-
2,8
22,6
10,8
2
2,2
9
2,2
5,2
97
13,6
23,8
29
34
10,2
441,6
6,2
94,2
4,8
9,2
46
7,2
27,4
21,4
13,8
-
11
14
87,4
DU
4,6
6,4
8
2,6
11,6
54
3,6
7,4
2,8
1
2
12,2
11,6
10,4
11,6
n
2,4
38,9
68
7,1
17,9
10,6 13,4
FUA = fundo aglandular, MP = margo plicatus, FUG = fundo aglandular, AN = antro, PI = piloro,
DU=duodeno. * Grau obtido com base na média por animal: 0 – ausência de células marcadas; 1 – de
1 a 10 células por campo; 2 – de 11 a 50 células por campo; 3 - de 51 a 100 células por campo; 4 –
>100 células por campo.
Existe diferença significativa entre os grupos lesão e coleta padrão quanto
à contagem do número de células imuno-marcadas pelo anticorpo antiUFF
Juliana da Silva Leite
2009
105
mieloperoxidase por campo segundo o teste estatístico de Mann-Whitney (p=0,020),
como observado no gráfico 8.
Gráfico 8 – Média da contagem de células imunomarcadas pelo anticorpo antimieloperoxidase em amostras da mucosa gastroduodenal dos
cavalos de corrida avaliados que foram distribuídas em dois grupos
de lesão e de coleta padrão . Niterói, 2009.
UFF
Juliana da Silva Leite
2009
106
5.6.2 CD3
Foi realizado estudo piloto que revelou imunorreatividade satisfatória das
amostras eqüinas em relação ao anticorpo anti-CD3. Este marcou os linfócitos
presentes na periferia dos folículos linfóides. Assume-se que as células marcadas
pelo anticorpo anti-CD3 nas amostras eqüinas eram linfócitos T.
Um total de 114 amostras de 15 cavalos foi estudado, com média de 54,6
células por campo e desvio padrão de 40,2. A tabela 18 indica a média do número
de células por campo pela imunorreação com anticorpo anti-CD3 por região e por
animal nas amostras gastroduodenais dos cavalos avaliados.
UFF
Juliana da Silva Leite
2009
107
Tabela 18 – Média do número células marcadas por campo pela imunorreação
com anticorpo anti-CD3 em amostras gástricas e duodenais de
cavalos PSI sob treinamento de corrida (n=15), Niterói, 2009.
Cavalo
FUA
MP
FUG
AN
PI
DU
Lesão
Média
por
animal
Grau *
1
35,2
31,2
42,2
72,4
-
-
-
46,8
2
2
36,8
-
-
-
-
-
-
36,8
2
3
22,8
69,8
22,6
37,8
-
-
46,2
39,8
2
4
19
64,8
60,4
161
69,2
85
70,8
75,7
3
5
42,2
36,6
20,6
47,2
50,8
n
42,2
39.9
2
6
12,8
56
39,8
50,6
31,6
29,4
50,8
38,7
2
7
10,8
49,2
27,2
27,2
60
-
4,4
29,8
2
8
34,4
46,2
51,2
22,4
108
86,6
-
58,1
3
9
91
52,6
n
72,2
69,2
130,8
43,4
76,5
3
10
16,4
82,4
40,8
50,4
62
11,2
-
43,9
2
11
22,6
65,8
33,6
66,4
49,6
61,8
27
46,7
2
12
42,6
61,8
n
69,4
74,4
-
-
62,1
3
13
28,4
14,6
53,4
24,4
170,4
168,6
33,8
70,5
3
14
69,8
89
47,4
73,2
73,2
93,2
36,2
58,4
3
15
54,2
126
19,2
73
n
259,8
54,2
59,4
3
Média
por
região
35,9
60,4
38,2
60,5
74,4 102,9
40,9
-
-
FUA = fundo aglandular, MP = margo plicatus, FUG = fundo aglandular, AN = antro, PI = piloro,
DU=duodeno. * Grau obtido com base na média por animal: 0 – ausência de células marcadas; 1 – de
1 a 10 células por campo; 2 – de 11 a 50 células por campo; 3 - de 51 a 100 células por campo; 4 –
>100 células por campo.
A análise estatística identificou correlação negativa entre a infiltração de
células CD3 positivas e de Mieloperoxidase positivas nas amostras gastroduodenais
eqüinas (Correlação de Pearson = -0,014).
UFF
Juliana da Silva Leite
2009
108
5.6.3 CD20
O estudo piloto realizado demonstrou imunomarcação adequada do
anticorpo anti-CD20 nas amostras do trato gastroduodenal eqüino. Este anti-corpo
marcou os linfócitos presentes na região central dos folículos linfóides. Assume-se
que as células marcadas pelo anticorpo anti-CD20 nas amostras eqüinas eram
linfócitos B.
Foram analisadas 115 amostras de 15 cavalos e a média de células por
campo encontrada foi de 161,6 células por campo e desvio padrão de 522,6. A
tabela 19 exibe a média do número de células marcadas por campo pela
imunorreação com anticorpo anti-CD20 em amostras gástricas e duodenais dos
cavalos avaliados.
UFF
Juliana da Silva Leite
2009
109
Tabela 19 – Média do número células marcadas por campo pela imunorreação
com anticorpo anti-CD20 em amostras gástricas e duodenais de
cavalos PSI sob treinamento de corrida (n=15), Niterói, 2009.
Cavalo
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
Média
por
região
FUA
MP
FUG AN
PI
DU
Lesão
2
8
1
17,1
2
96
3
40,3
2
7,1
1
16,3
2
-
69,7
3
0
120,4
3
-
25
2
0
59,4
3
-
95,1
3
486,2
4
278.8
4
131.3
4
-
-
67,4
8,2
0
-
-
0
8
0
0
-
-
31,8
0
0
8,4
43,6
0
-
50,8
6,4
106,6
0
243,4
209,6
0
106.6
119
0
2,6
1
0
-
119
0
16,4
1,8
2
-
-
37,8
0
6,6
16
37,6
-
15,4
0
0
0
24,2
0
108,2
286
249,8
0
-
266,6
0
206
0
89,4
10,6
-
-
0
0
10,8
0
5,4
184,6
214,8
6,4
226
n
116,6
31,4
n
175,8
1112,8
4,2
780
414
378
538,8
3,8
106,4
18,6
491
580,6
656
0
28,4
52,4
97
-
610
95
0
118,1 10,6 147,3 156,6 293,9
Grau *
18,9
-
0
39,9
Média
por
animal
87
FUA = fundo aglandular, MP = margo plicatus, FUG = fundo aglandular, AN = antro, PI = piloro,
DU=duodeno. * Grau obtido com base na média por animal: 0 – ausência de células marcadas; 1 – de
1 a 10 células por campo; 2 – de 11 a 50 células por campo; 3 - de 51 a 100 células por campo; 4 –
>100 células por campo.
A análise estatística identificou tendência de correlação negativa entre a
infiltração de células CD20 positivas e de Mieloperoxidase positivas nas amostras
gastroduodenais eqüinas (Correlação de Pearson = -0,061).
UFF
Juliana da Silva Leite
2009
110
5.7
ALTERAÇÕES HISTOPATOLÓGICAS X REGIÕES
A região com maior número de amostras foi a margo plicatus (MP) com
um total de 33 fragmentos (ou 25,2%) dos quais 33,3% (11/33) eram do grupo com
lesão. Em número de fragmentos a MP foi seguida por fundo aglandular (FUA – 24
ou 18,3% das amostras), fundo glandular (FUG – 20 ou 15,3%), antro (A.N. – 19 ou
14,5%), piloro (PI - 14 ou 10,7%) e duodeno (DU – 11 ou 8,4%). Cada uma dessas
regiões FUA, FUG e A.N. compuseram o grupo com lesão com duas amostras cada
(gráfico 9). A diferença entre as regiões quanto a sua distribuição nos grupos do
padrão de coleta e lesão foi comprovada estatisticamente pelo Qui-quadrado de
Pearson.
UFF
Juliana da Silva Leite
2009
111
Gráfico 9 – Número de amostras da mucosa gastroduodenal dos cavalos de
corrida avaliados que foram distribuídas nos grupos do padrão de
coleta e lesão. FUA = fundo aglandular, MP = margo plicatus, FUG
= fundo aglandular, AN = antro, PI = piloro, DU=duodeno. Niterói,
2009.
Após
uma
análise
estatística
abordando
todas
as
regiões
simultaneamente, considerando-as avaliações pareadas de um mesmo animal (teste
de Friedman), foi evidenciada uma diferença entre estas quanto ao grau do infiltrado
inflamatório (p = 0,003). E o teste de Wilcoxon, identificou que as diferenças estão
entre FUA e PI (p = 0,033); FUG e A. N. (p = 0,035); FUG e MP (p = 0,035); DU e
FUA (p = 0,033); DU e FUG (p = 0,010). E que existe uma tendência à diferença
entre as regiões DU e A. N (p = 0,059); e DU e MP (p=0,058).
UFF
Juliana da Silva Leite
2009
112
Da mesma forma, houve diferença estatística, no teste de Friedman, entre
as regiões quanto ao tipo de alteração do epitélio (p = 0,000); identificada pelo teste
de Wilcoxon entre FUA e PI (p = 0, 033). Também foi evidenciada diferença
estatística entre as regiões, por meio do teste de Friedman, quanto ao número de
folículos linfóides (p = 0,018), a presença de edema (p = 0,000), congestão (p =
0,023), hemorragia (p = 0,026) e fibrina (p = 0,004).
5.8
QUANTIFICAÇÃO DO INFILTRADO INFLAMATÓRIO X REGIÕES
Ao
se
avaliar
as
diferentes
regiões
quanto
à
contagem
de
mieloperoxidase, foi verificada diferença significativa por meio do teste de Friedman
(p= 0,13). Esta diferença foi evidenciada, pelo teste de Wilcoxon, entre MP e PI (p =
0,046); FUA e PI (p = 0,023); FUG e A.N. (p = 0,020); FUG e MP (p = 0,020); FUG e
FUA (p = 0,017); DU e MP (p = 0,010) e tendência à diferença significativa entre MP
e A.N. (p = 0,064); DU e FUA (p = 0,062 - gráfico 10).
UFF
Juliana da Silva Leite
2009
113
Gráfico 10 – Média do números de células marcadas por campo pelo anticorpo
anti-mieloperoxidase em amostras da mucosa gastroduodenal dos
cavalos de corrida avaliados que foram distribuídas de acordo
com a região estudada. FUA = fundo aglandular, MP = margo
plicatus, FUG = fundo aglandular, AN = antro, PI = piloro,
DU=duodeno. Niterói, 2009.
Quanto à contagem de CD3 havia apenas uma tendência de diferença
entre as regiões pelo teste de Friedman (p=0,066). Mas no teste de Wilcoxon, foi
identificada diferença estatística entre as regiões de FUA e PI (p = 0,010); FUG e PI
(p = 0,011); FUA e A.N. (p = 0,014); FUA e MP (p = 0,017); FUG e MP (p = 0,041);
DU e FUA (p = 0,011) e tendência a diferença significativa entre FUG e A.N. (p =
0,075),e DU e FUG (p = 0,069 - gráfico 11).
UFF
Juliana da Silva Leite
2009
114
Gráfico 11 – Média do números de células marcadas por campo pelo anticorpo
anti-CD3 em amostras da mucosa gastroduodenal dos cavalos de
corrida avaliados que foram distribuídas de acordo com a região
estudada. FUA = fundo aglandular, MP = margo plicatus, FUG =
fundo aglandular, AN = antro, PI = piloro, DU=duodeno. Niterói,
2009.
Já em relação à contagem de CD20 houve diferença estatística entre as
regiões pelo teste de Friedman (p = 0,043 - gráfico 12). E no teste de Wilcoxon
foram identificadas diferenças estatísticas entre as regiões de FUG e PI (p = 0,036)
e tendência à diferença ente DU e FUA (p=0,066).
UFF
Juliana da Silva Leite
2009
115
Gráfico 12 – Média do números de células marcadas por campo pelo anticorpo
anti-CD20 em amostras da mucosa gastroduodenal dos cavalos
de corrida avaliados que foram distribuídas de acordo com a
região estudada. FUA = fundo aglandular, MP = margo plicatus,
FUG = fundo aglandular, AN = antro, PI = piloro, DU=duodeno.
Niterói, 2009.
5.9
DETECÇÃO DE Helicobacter spp X REGIÕES
A tabela 20 demonstra a freqüência de amostras positivas por região pelos
diferentes testes diagnósticos para Helicobacter spp.
UFF
Juliana da Silva Leite
2009
116
Tabela 20 – Freqüência das amostras positivas para os diferentes testes
diagnósticos para Helicobacter spp. por região analisada da
mucosa gastroduodenal dos eqüinos submetidos a treinamento
de corrida avaliados. Niterói, 2009.
Região
WS
IHQ
TRU
Status Final
Nº. amostras
17
19
9
19
Nº. positivas
13
9
3
12
Nº. amostras
10
11
2
11
Nº. positivas
2
5
0
5
Nº. amostras
22
24
10
24
Nº. positivas
4
6
5
7
Nº. amostras
29
32
9
32
Nº. positivas
13
17
2
19
Nº. amostras
16
19
8
19
Nº. positivas
5
9
3
10
Nº. amostras
14
13
7
14
Nº. positivas
3
4
1
5
AN
DU
FUA
MP
FUG
PI
FUA = fundo aglandular, MP = margo plicatus, FUG = fundo aglandular, AN = antro, PI = piloro,
DU=duodeno. WS = Warthin-Starry, IHQ = imuno-histoquímica, TRU = teste rápido da urease.
A avaliação das regiões por meio do teste de Friedman quanto aos
resultados do teste rápido da urease e exame bacterioscópico direto revelou que
não há diferença estatística entre elas (p = 0,231 e p = 0,153, respectivamente).
De um total de 115 amostras avaliadas pela coloração especial de
Warthin-Starry, 29 amostras (25,2%) eram da MP, 22 (19,1%) de FUA, 17 (14,8%)
de A.N., 16 (13,9%) de FUG, 14 (12,2%) de PI e 10 (8,7%) de DU (Tabela 20 e
UFF
Juliana da Silva Leite
2009
117
gráfico 13). Proporcionalmente ao número total de amostras avaliada em cada
região, a região com maior porcentagem de amostras positivas foi o A.N. 76,5%
(13/17), seguido da MP com 44,8% (13/29), FUG 31,3% (5/16), PI 21,4% (3/14), DU
20,0% (2/10) e FUA 18,2% (4/22). Ficou clara a diferença estatística entre as regiões
quanto aos resultados de coloração Warthin-Starry por meio do teste de Friedman (p
= 0,005 - gráfico 13). Foram identificadas diferenças significativas, ao se utilizar o
teste de teste de Wilcoxon, entre as regiões de A.N. e PI (p = 0,006); MP e PI (p =
0,025); FUA e A.N. (p = 0,004); FUG e A. N. (p = 0,010); DU e A.N. (p = 0,029); DU e
MP (p = 0,046) e tendência a diferença significativa entre FUA e MP (p = 0,052).
Gráfico
13
–
Freqüência
de
amostras
de
cada
região
da
mucosa
gastroduodenal dos cavalos de corrida avaliados que foram
distribuídas de acordo com os resultados da coloração WarthinStarry para a detecção de Helicobacter spp.. FUA = fundo
aglandular, MP = margo plicatus, FUG = fundo aglandular, AN =
antro, PI = piloro, DU=duodeno. Niterói, 2009.
UFF
Juliana da Silva Leite
2009
118
No teste de Imuno-histoquímica foram avaliadas 126 amostras distribuídas
entre as regiões conforme a tabela 20 e gráfico 14. Proporcionalmente ao número
total de amostras estudadas em cada região, a região com maior porcentagem de
amostras positivas foi a MP com 53,1% (17/32), seguido do A.N. 47,4% (9/19) e
FUG 47,4% (9/19), DU 45,5% (5/11), PI 30,8% (4/13) e FUA 25,0% (6/24)
Gráfico
14
–
Freqüência
de
amostras
de
cada
região
da
mucosa
gastroduodenal dos cavalos de corrida avaliados que foram
distribuídas de acordo com os resultados da reação imunohistoquímica com o anticorpo anti-Helicobacter pylori. FUA =
fundo aglandular, MP = margo plicatus, FUG = fundo aglandular,
AN = antro, PI = piloro, DU=duodeno. Niterói, 2009.
Quanto à avaliação imuno-histoquímica, no teste de Friedman, houve
tendência à diferença significativa entre as regiões (p=0,056). O teste de WIlcoxon
UFF
Juliana da Silva Leite
2009
119
revelou diferença estatística entre as regiões FUA e A.N. (p = 0,014); FUA e MP(p =
0,003),; e DU e FUA(p = 0,046), e tendência a diferença estatística entre MP e PI (p
= 0,058) e FUG e FUA (p = 0,059).
Observou-se diferença estatística, segundo o teste de Friedman, entre as
regiões quanto ao status final de infecção pelo Helicobacter spp. (p = 0.020) e a
freqüência de amostras em cada região foi identificada na tabela 20 e gráfico 15.
Gráfico
15
–
Freqüência
de
amostras
de
cada
região
da
mucosa
gastroduodenal dos cavalos de corrida avaliados que foram
distribuídas de acordo com o status final de infecção por
Helicobacter spp.. FUA = fundo aglandular, MP = margo plicatus,
FUG = fundo aglandular, AN = antro, PI = piloro, DU=duodeno.
Niterói, 2009.
UFF
Juliana da Silva Leite
2009
120
Para se saber qual a região com maior número de amostras positivas foi
calculada a porcentagem de amostras positivas proporcionalmente ao número total
de amostras avaliadas por região. O antro foi a região proporcionalmente mais
acometida por Helicobacter spp. com 63,2% (12/19) das amostras positivas, seguido
pela MP 59,4% (19/32), FUG 52,6% (10/19), DU 45,5% (5/11), PI 35,7% (5/14) e
FUA 29,2% (7/24). O teste de Wilcoxon demonstrou diferença estatística entre as
regiões A.N. e PI (p = 0,034), MP e PI (p = 0,034), FUA e A.N. (p = 0,003), e FUA e
MP(p = 0,003), e tendência a diferença significativa entre FUG e FUA (p = 0,059).
5.10 ALTERAÇÕES HISTOPATOLÓGICAS X QUANTIFICAÇÃO DO
INFILTRADO INFLAMATÓRIO
O teste estatístico de Kruskal-Wallis revelou diferença estatística entre as
amostras dispostas em parâmetros observados do epitélio quanto à contagem de
Mieloperoxidase (p = 0,001 - gráfico 16) e existe tendência à diferença estatística
quanto à contagem de CD3 (p=0,052 – gráfico 17).
UFF
Juliana da Silva Leite
2009
121
Gráfico 16 – Média da contagem de células imunomarcadas pelo anticorpo
anti-mieloperoxidase em amostras da mucosa gastroduodenal dos
cavalos de corrida avaliados que foram distribuídas nos parâmetros
observados do epitélio. Niterói, 2009.
UFF
Juliana da Silva Leite
2009
122
Gráfico 17 – Média da contagem de células imunomarcadas pelo anticorpo
anti-CD3 em amostras da mucosa gastroduodenal dos cavalos de
corrida
avaliados
que
foram
distribuídas
nos
parâmetros
observados do epitélio. Niterói, 2009.
Há diferença estatística entre as amostras distribuídas entre os tipos de
infiltrado inflamatório quanto à contagem de células mieloperoxidase positivas,
segundo o teste estatístico de Kruskal-Wallis (p = 0,000 - gráfico 18). O teste de
Mann-Whitney revelou que a diferença estatística está entre amostras dos tipos
mononuclear e misto (p = 0,009) e linfoplasmocitário e misto (p = 0,000). Este teste
também demonstrou diferença estatística entre as amostras com os tipos
linfoplasmocitário e misto (p= 0,036) quanto à contagem de CD3.
UFF
Juliana da Silva Leite
2009
123
Gráfico 18 – Média da contagem de células imunomarcadas pelo anticorpo
anti-Mieloperoxidase em amostras da mucosa gastroduodenal
dos cavalos de corrida avaliados que foram distribuídas nos
tipos de infiltrado inflamatório. Niterói, 2009.
Segundo o teste de Mann-Whitney, existe diferença estatística entre
infiltrado inflamatório difuso e focal quanto à contagem de mieloperoxidase (p =
0,006 - gráfico 19).
UFF
Juliana da Silva Leite
2009
124
Gráfico 19 – Média da contagem de células imunomarcadas pelo anticorpo
anti-Mieloperoxidase em amostras da mucosa gastroduodenal
dos cavalos de corrida avaliados que foram distribuídas quanto
à localização de infiltrado inflamatório. Niterói, 2009.
Existe diferença estatística, pela avaliação do teste de Kruskal-Wallis,
entre as amostras distribuídas no diferentes graus do infiltrado inflamatório quanto
ao número de mieloperoxidase (p = 0,000 - gráfico 20), CD3 (p = 0,003 - gráfico 21),
e aglomerados linfóides (p = 0,028). Existe tendência à diferença estatística entre as
amostras distribuídas no diferentes graus do infiltrado inflamatório quanto ao número
de folículos linfóides (p = 0,067).
UFF
Juliana da Silva Leite
2009
125
Gráfico 20 – Média da contagem de células imunomarcadas pelo anticorpo
anti-Mieloperoxidase em amostras da mucosa gastroduodenal
dos cavalos de corrida avaliados que foram distribuídas quanto
ao grau de infiltrado inflamatório. Niterói, 2009.
Segundo o teste de Mann-Whitney, a diferença está entre os grupos leve e
grave (p = 0.000) e moderado e grave (p = 0,001) quanto à contagem de
mieloperoxidase.
UFF
Juliana da Silva Leite
2009
126
Gráfico 21 – Média da contagem de células imunomarcadas pelo anticorpo
anti-CD3 em amostras da mucosa gastroduodenal dos cavalos
de corrida avaliados que foram distribuídas quanto ao grau de
infiltrado inflamatório. Niterói, 2009.
Quanto a contagem de células imuno marcadas pelo anticorpo anti-CD3, a
diferença está entre leve e moderado (p = 0,001) e leve e grave (p = 0,011) segundo
o teste de Mann-Whitney.
Com relação à contagem de aglomerados linfóides, o teste Mann-Whitney
revelou que a diferença estatística está entre leve e grave (p = 0,034) e leve e
moderado (p = 0,009). O mesmo teste revelou diferença estatística quanto á
contagem de folículos linfóides entre leve e moderado (p = 0,21).
UFF
Juliana da Silva Leite
2009
127
Há diferença estatística entre as amostras distribuídas nos diferentes tipos
de edema quanto à contagem de Mieloperoxidase (p = 0,040 - gráfico 22) e CD20 (p
= 0,006 - gráfico 23), segundo o teste de Kruskal-Wallis. Foi revelada também
tendência à diferença estatística em relação ao edema quanto à contagem de CD3
(p = 0,059).
Gráfico 22 – Média da contagem de células imunomarcadas pelo anticorpo
anti-mieloperoxidase em amostras da mucosa gastroduodenal
dos cavalos de corrida avaliados que foram distribuídas quanto
aos tipos de edema. Niterói, 2009.
UFF
Juliana da Silva Leite
2009
128
Gráfico 23 – Média da contagem de células imunomarcadas pelo anticorpo
anti-CD20 em amostras da mucosa gastroduodenal dos cavalos
de corrida avaliados que foram distribuídas quanto aos tipos de
edema. Niterói, 2009.
O teste de Mann-Whitney revelou que a diferença estatística está entre as
amostras classificadas em ausente e edema intracelular subqueratótico quanto à
contagem de mieloperoxidase (p = 0,026) e CD20 (p= 0,001) e entre edema
subepitelial e intracelular subqueratótico quanto à contagem de mieloperoxidase (p =
0,015), CD3 (p = 0,010) e CD20 (p= 0,018).
Já as amostras distribuídas devido à presença e ausência de erosão são
diferentes entre si, segundo o teste de Mann-Whitney, quanto à contagem de CD3 (p
= 0,000 - gráfico 24), CD20 (p = 0.028 - gráfico 25) e aglomerados linfóides (p =
0,005). O mesmo acontece quando se distribui as amostras baseando-se na
UFF
Juliana da Silva Leite
2009
129
presença de fibrina quanto á contagem de CD3 (p = 0,002), CD20 (p = 0,034) e
aglomerados linfóides (p = 0,004).
Gráfico 24 – Média da contagem de células imunomarcadas pelo anticorpo
anti-CD3 em amostras da mucosa gastroduodenal dos cavalos
de corrida avaliados que foram distribuídas quanto à presença
de erosão. Niterói, 2009.
UFF
Juliana da Silva Leite
2009
130
Gráfico 25 – Média da contagem de células imunomarcadas pelo anticorpo
anti-CD20 em amostras da mucosa gastroduodenal dos cavalos
de corrida avaliados que foram distribuídas quanto à presença
de erosão. Niterói, 2009.
Quanto à contagem de mieloperoxidase, a diferença entre os grupos de
amostras com ou sem úlceras foi significativa (p = 0,000 - gráfico 26).
UFF
Juliana da Silva Leite
2009
131
Gráfico 26 – Média da contagem de células imunomarcadas pelo anticorpo
anti-mieloperoxidase em amostras da mucosa gastroduodenal
dos cavalos de corrida avaliados que foram distribuídas quanto
à presença de úlceras. Niterói, 2009.
Há diferença estatística entre as amostras distribuídas entre os graus de
gastrite linfoplasmocitária quanto à contagem de células mieloperoxidase positivas
(p = 0,002), CD3 positivas (p = 0,003 - gráfico 27) e de aglomerados linfóides (p =
0,019), segundo o teste estatístico de Kruskal-Wallis. O teste de Mann-Whitney
revelou que a diferença estatística quanto à mieloperoxidase está entre amostras
com graus leve e grave (p = 0,001) e moderado e grave (p = 0,001). Este teste
também demonstrou diferença estatística entre as amostras com graus leve e
moderado quanto à contagem de CD3 (p = 0,000) e de aglomerados linfóides (p =
0,004).
UFF
Juliana da Silva Leite
2009
132
Gráfico 27 – Média da contagem de células imunomarcadas pelo anticorpo
anti-CD3 em amostras da mucosa gastroduodenal dos cavalos
de corrida avaliados que foram distribuídas quanto aos tipos de
gastrite. Niterói, 2009.
5.11 Helicobacter spp. X ALTERAÇÕES HISTOPATOLÓGICAS
Há diferença estatística entre os grupos positivo e indefinido do status final
de infecção pelo Helicobacter spp. quanto aos parâmetros glândulas gástricas
(p=0,024 - Gráfico 28) e hemorragia (p=0,001 - Gráfico 29), os outros parâmetros
avaliados não apresentaram diferença significativa no teste Qui-quadrado de
Pearson.
UFF
Juliana da Silva Leite
2009
133
Gráfico 28 –Distribuição dos achados das glândulas gástricas de acordo com o
status final de infecção de Helicobacter spp. em amostras da
mucosa gastroduodenal dos cavalos de corrida avaliados. Niterói,
2009.
Uma maior porcentagem de amostras com glândulas atróficas foi
observada dentre as amostras positivas para Helicobacter spp (13,3%) em relação
às amostras indefinidas (7,7%). Amostras com glândulas hiperplásicas são
encontradas em maior porcentagem nas amostras com status final indefinido
(35,9%) do que nas positivas (11,1%).
UFF
Juliana da Silva Leite
2009
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Gráfico 29 –Distribuição dos graus de hemorragia de acordo com o status final
de infecção para Helicobacter spp. em amostras da mucosa
gastroduodenal dos cavalos de corrida avaliados. Niterói, 2009.
As porcentagens de amostras com hemorragia moderada e grave dentre
as amostras Helicobacter spp. positivas (5,7% e 7,7%, respectivamente) são
menores do que dentre as amostras com status final indefinido (32,2% e 11,9%). Já
a hemorragia leve foi mais freqüente nas amostras positivas (50,9%) do que nas
indefinidas (23,7%).
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5.12 O Helicobacter spp. X QUANTIFICAÇÃO DO INFILTRADO
INFLAMATÓRIO
Segundo o teste de Mann-Whitney, há diferença estatística entre amostras
positivas e indefinidas para a infecção para Helicobacter spp. quanto ao número de
células CD3 positivas (p=0,016 - gráfico 30), porém não houve diferença estatística
quanto aos números de células MPO (p = 0,832) e CD20 (p = 0,683) positivas nem
de folículos (p = 0,325) e aglomerados linfóides (p = 0,393).
Gráfico 30 – Distribuição da contagem de CD3 de acordo com o status final de
infecção
para
Helicobacter
spp.
em
amostras
da
mucosa
gastroduodenal dos cavalos de corrida avaliados. Niterói, 2009.
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5.13 AVALIAÇÃO
DOS
MÉTODOS
DE
DIAGNÓSTICO
DE
Helicobacter spp.
Segundo o teste do sinal, os métodos de Imuno-histoquímica e a
coloração de Warthin-Starry são estatisticamente semelhantes (p=0,766 - gráfico
31). Por outro lado, os testes Imuno-histoquímica e o teste rápido da urease são
estatisticamente diferentes (p=0,005 - gráfico 32).
Gráfico 31 – Comparação entre os testes de Imuno-histoquímica com anticorpo
anti-Helicobacter pylori e Warthin-Starry para identificação de
Helicobacter spp. em amostras da mucosa gastroduodenal dos
cavalos de corrida avaliados. Niterói, 2009.
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Gráfico 32 – Comparação entre os testes de Imuno-histoquímica com anticorpo
anti-Helicobacter pylori e Teste rápido da urease para identificação
de Helicobacter spp. em amostras da mucosa gastroduodenal dos
cavalos de corrida avaliados. Niterói, 2009.
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6
DISCUSSÃO
O presente estudo demonstrou que eqüinos submetidos a treinamento de
corrida são susceptíveis à infecção natural por Helicobacter spp. e às diversas
alterações macroscópicas e microscópicas da mucosa gastroduodenal que estão
associadas a uma reação inflamatória relevante.
Dentre
as
alterações
macroscópicas
observadas
nos
animais
investigados, ganham destaque edema, eritema, hemorragia, espessamento do
epitélio pavimentoso estratificado e a presença de lesão de continuidade da mucosa
gástrica, classificada macroscopicamente neste trabalho através do grau do
conselho SUGE. Segundo Castro et al. (1993), esses termos descritivos listados são
considerados características endoscópicas da inflamação, pois a mucosa normal
apresenta revestimento gástrico de cor rósea uniforme e brilhante, sem exudato
aderente, com pregas de no máximo 5 mm no corpo e antro praticamente liso.
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O uso de um sistema de graduação facilita comparações entre diferentes
grupos de pesquisa e clínicos (Bell et al. 2007). Dessa forma, neste estudo foi
realizada associação de um dos métodos mais empregados para a avaliação
macroscópica da úlcera gástrica em eqüinos, a classificação do conselho SUGE, e a
classificação de gastrite, o Sistema Sidney Atualizado, empregado por patologistas
humanos.
O Sistema Sydney Atualizado é uma classificação de gastrite que tem o
mérito de integrar a descrição das lesões observadas na endoscopia e lhes dar
fundamentação histológica por meio de biopsias sistemáticas (Mainguet et al. 1996).
Este foi escolhido por já estar estabelecido e ser corriqueiro na rotina de patologistas
humanos, e já ser utilizado em trabalhos científicos na Medicina Veterinária em cães
(Trouillet et al, 2004), além de trazer um detalhamento importante tanto para os
aspectos macroscópicos quanto para os microscópicos. Já a graduação do conselho
SUGE foi escolhida por ser amplamente utilizada e por terem sido demonstradas sua
facilidade de uso, reprodutibilidade e correlação entre diferentes observadores (Bell
et al. 2007).
A associação dos dois métodos de classificação possibilitou um melhor
entendimento das gastroduodenites e ulcerações gastroduodenais, uma vez que
descreve minuciosamente as alterações macro e microscópicas das mucosas
gástrica e duodenal, graduando-as. Com a utilização de sistemas de classificação, o
diálogo entre clínicos, endoscopistas e patologistas se torna bastante facilitado pela
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uniformidade de termos e correlação entre os dados obtidos. Isso possibilita uma
melhor interação entre profissionais afins e reprodutibilidade de pesquisas
científicas, contribuindo, dessa forma, para um melhor entendimento da enfermidade
e para o bem estar animal uma vez que o diagnóstico é mais preciso e fidedigno,
então, o tratamento será acertado, e o prognóstico definido de forma acurada.
Com base no Sistema Sidney, a gastrite macroscópica enantematosa é a
forma mais freqüente encontrada em humanos e foi a mais freqüente dentre os
animais do presente estudo, 46,7%, e caracteriza-se por placas avermelhadas,
superfície mucosa finamente nodulosa, perda de brilho normal da mucosa, exsudato
puntiforme e, ocasionalmente, leve friabilidade (Castro et al. 1993). A gastrite
hemorrágica foi identificada em 33,3% dos animais e foi caracterizada por ou franca
hemorragia na luz do estômago, sendo graduada com base no número de manchas
hemorrágicas (Castro et al. 1993). Por último, a gastrite erosiva foi diagnosticada em
20% dos cavalos e tem como principal característica erosões, as quais podem estar
cobertas por uma camada de exsudato e associadas à enantema focal (Castro et al.
1993). Foi demonstrada, neste trabalho predominância de gastrites com graduação
moderada e acentuada sobre as gastrites com graduação leve. Em um estudo
endoscópico realizado em cavalos de vaquejada foi observada mucosa normal em
37,14%, gastrite não erosiva em 32,86 %, gastrite erosiva em 15,71%, e em 14,29%
ulceração (até duas úlceras) (Buonora et al. 2004). Apesar dos dois esportes,
vaquejada e corrida, envolverem altas velocidades e exigência física extrema,
observou-se no presente trabalho maior porcentagem de gastrite, provavelmente
devido a 100% dos eqüinos estudados serem encocheirados, com tempo de
confinamento bastante elevado.
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A classificação macroscópica do Sistema Sidney revelou duodenite nos 11
cavalos
avaliados
para
este
parâmetro
neste
estudo.
Esta
enfermidade
caracterizada por hiperemia e aparência irregular da mucosa, também foi constatada
em 16 cavalos de diversas raças em estudo endoscópico realizado por Murray et al.
(2001), apesar de ser raramente investigada.
O grau SUGE mais freqüente neste estudo foi o 2 (53,33%) que
representa erosões ou úlceras pequenas (menores de 3 cm), solitárias ou
multifocais. Mas 86,66% dos animais avaliados estavam distribuídos entre os graus
2 ou 3 o que discorda do trabalho de Jonsson & Egenvall (2006), também com
cavalos em treinamento de corrida, onde os escores mais freqüentes foram de 0 a 2.
Como o sistema de classificação usado possibilita concordância elevada entre
avaliadores (Bell et al, 2007) acredita-se que esta diferença possa ser devido a
características inerentes a população estudada como, por exemplo, diferenças de
manejo, alimentação, período de confinamento, atividade, treinamento, transporte, e
uso de antiinflamatórios não esteroidais (AINEs). Estes fatores de risco foram
descritos por outros autores (Buchanan & Andrews, 2003; Murray, 2003; Andrews,
2005a; Reese & Andrews, 2009).
A análise histopatológica baseada no Sistema Sidney das amostras
gastroduodenais dos cavalos avaliados revelou ocorrência elevada de erosões e
úlceras (64,3% e 19,6% das amostras ou 14 e 12 dos 15 animais avaliados
respectivamente). Estes achados são compatíveis com a prevalência de úlceras
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gástricas em cavalos sob treinamento de corrida anteriormente descrita pela
literatura (Murray, 1997a; Babuffo et al, 2002). Vale ressaltar, o grande número de
animais com erosões da mucosa glandular, alteração que pode passar despercebida
na análise macroscópica, como constatado em estudo anterior (Andrews et al.
2002). Apesar disso, Murray et al (2001) ao avaliar os cavalos endoscopicamente,
também observou uma alta prevalência de lesões na região glandular com cerca de
58% de erosões ou úlceras em antro e piloro. O presente estudo detectou, ainda,
depósito de fibrina em um grande número de amostras, alteração quase sempre
associada à presença de erosão como já descrito por Mainguet et al, (1993).
No presente trabalho a região gástrica com maior freqüência de ulceração
foi a margo plicatus. Esta parece ser a área mais dinâmica do estômago e é também
a mais exposta ao suco gástrico (MacAllister et al, 1993), por esse motivo já foi
descrita como a mais acometida por úlcera gástrica por muitos pesquisadores
(Brashier & Geor, 1995; Fernandes et al, 2003; Roy et al, 2005).
Dois fatores que aparentemente contribuem para a ulceração da mucosa
gástrica escamosa são a intensidade de treinamento e o manejo alimentar (Murray
1998). Está bem documentado que um programa de treinamento forçado está
associado com alta porcentagem de lesões gástricas em cavalos, entretanto, não foi
possível,
ainda,
diferenciar
os
efeitos
inter-relacionados
dos
constituintes
alimentares, do manejo e do comportamento alimentares e os efeitos do exercício na
fisiologia gástrica envolvendo a enfermidade péptica (Murray, 2003).
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147
Os efeitos do exercício foram estudados por Lorenzo-Figueras & Merrit
(2002) que afirmaram que, em cavalos, o aumento da pressão intra-abdominal
durante o exercício intenso causa compressão gástrica empurrando o conteúdo
ácido para a região proximal do estômago revestida por epitélio escamoso. Uma
longa duração da exposição ao HCl durante o exercício intenso, que pode ser diária,
é a razão pela qual as lesões da mucosa escamosa tendem a se desenvolver ou
piorar quando o cavalo está num programa de treinamento intensivo (LorenzoFigueras & Merritt, 2002; Murray, 2003; White et al, 2007). Todavia, alguns anos
mais tarde, foi observado que a porcentagem e gravidade das úlceras gástricas não
são determinadas apenas pela intensidade de treinamento e provas, mas também
pelo tempo de confinamento dos animais (Buonora et al., 2004). Além disso, alguns
autores afirmam que os cavalos usados predominantemente em seu ambiente de
fazenda podem ter menor ocorrência de úlceras gástricas na mucosa aglandular do
que as populações de cavalos de corrida e exposição, independente da freqüência e
intensidade de suas atividades (Chameroy et al, 2006).
Outro fator relacionado ao aparecimento de úlceras na região aglandular é
o transporte. Nele, o consumo de água e de alimento é diminuído o que pode causar
um aumento na incidência de SUGE (Buchanan & Andrews, 2003), inclusive úlceras
na mucosa gástrica escamosa podem se desenvolver em cinco dias dentro dessas
condições (Mcclure et al, 2005). O fator alimentar também parece ser bem aceito
entre os pesquisadores uma vez que a ingestão de alto teor de carboidratos
hidrolizáveis promove substrato para a fermentação gástrica por bactérias
residentes. Ácidos graxos voláteis, álcool e ácido lático são subprodutos da
fermentação gástrica que podem danificar a mucosa escamosa (Andrews et al,
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2005b). A alimentação intermitente pode ainda ser tida como uma grande vilã já que
pode causar e aumentar a gravidade das úlceras gástricas em cavalos e, inclusive,
esta técnica foi desenvolvida como modelo para a produção de SUGE (Murray,
1994).
Com relação à freqüência de erosão, no presente estudo esta foi alta e a
região mais afetada foi o fundo glandular. Isso discorda do trabalho de Murray
(2003) que sugere que a maior parte das lesões da mucosa glandular eqüina ocorre
na mucosa do antro e do piloro por lesão da barreira mucosa ou por ação da bile.
Porém, os efeitos da bile são questionáveis uma vez que os ácidos biliares são
provenientes de refluxo duodenal que é menos ácido e eles não são ulcerogênicos
em pH maior do que 4 (Argenzio, 1999; Berschneider et al, 1999).
Um papel para Helicobacter spp. não pode ser descartado na patogênese
das úlceras gastroduodenais eqüinas já que espécies de Helicobacter spp tem sido
isoladas de seres humanos e animais com ulceração gástrica e gastrite, funcionando
claramente como patógenos constantes ou oportunistas (Harbour & Suton, 2008).
Helicobacter spp. foi observado em 48,4% das amostras avaliadas do presente
estudo. Essas amostras positivas eram provenientes de 14 animais diferentes, 11
deles apresentavam úlceras e 13 erosão. No único estudo em que cavalos de
corrida foram testados para Helicobacter spp. em sua mucosa gástrica Contreras et
al (2007) observou que Helicobacter-like DNA foi detectado no estômago de 10
cavalos de corrida. Neste estudo, o DNA dessas bactérias foi observado em dois de
sete cavalos com úlcera gástrica, em três de cinco cavalos com gastrite, em cinco de
seis cavalos com ambas as afecções e em um cavalo com mucosa gástrica normal.
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149
Assim como no estudo de Contreras et al (2007), o presente estudo não comprovou
associação estatística entre úlceras e erosões gástricas e infecção por Helicobacter
spp. o que pode demonstrar que múltiplas causas podem estar associadas a essas
lesões, como Videla & Andrews (2009) já haviam sugerido.
Por outro lado, o presente estudo encontrou associação estatística entre a
colonização por Helicobacter spp. e atrofia de glândulas gástricas. A atrofia de
glândulas gástricas é uma característica histopatológica observada em seres
humanos com gastrite atrófica multifocal, uma pangastrite que é desenvolvida por
indivíduos infectados por H. pylori com risco de desenvolvimento de úlceras
gástricas e adenocarcinoma gástrico distal (Czinn, et al, 1999). Já a hemorragia leve
foi associada a amostras Helicobacter spp. positivas no estudo atual enquanto que
as hemorragias moderada e acentuada foram relacionadas a amostras indefinidas.
O que leva a crer que a hemorragia pode ter dificultado a identificação das bactérias
no corte histológico ou ter facilitado a perda de microorganismos durante o
processamento de rotina das amostras, como já citado por Jergens et al (1998).
Quanto à avaliação dos diferentes testes diagnósticos utilizados, no
presente trabalho não houve diferença estatística entre a coloração Warthin-Starry e
a Imuno-histoquímica, demonstrando que ambos os testes produzem resultados
bastante similares quanto à presença de Helicobacter spp. Esses resultados
discordam do encontrado por Mello (2005) em sagüis, apesar das técnicas utilizadas
terem o mesmo protocolo. Isso pode ter ocorrido devido às diferenças anatômicas
entre os animais, à distribuição do microorganismo na mucosa gástrica dos dois
animais e à densidade microbiana. A sensibilidade do diagnóstico microscópico é
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150
muito influenciada pelo tipo de corante usado e pelo número de bactérias
encontrado no fragmento (Morais et al, 1997). Então, neste trabalho, foi utilizada
coloração especial Warthin-Starry e imuno-histoquímica para melhor evidenciar as
bactérias no tecido, além de ter sido feita coleta sistemática de todas as regiões do
estômago e duodeno, já que a distribuição e densidade das bactérias na mucosa
não é uniforme (Genta & Graham, 1994).
Apesar de não ter havido diferença estatística entre Warthin-Starry e
Imuno-histoquímica, em raras amostras cocos presentes coraram pela prata, mas
não marcaram pela imuno-histoquímica, sendo possível a existência de falsopositivos. Melo (2005) relatou um número elevado de amostras negativas para a
imuno-histoquímica que obtiveram resultados positivos na coloração de WarthinStarry, e concluiu que outros microorganismos poderiam estar presentes. Os falsonegativos também podem ocorrer pelo reduzido número de bactérias (Laine et al,
1997) ou por perdas no processamento do material (Jergens et al, 1998).
Na imuno-histoquímica o anticorpo policlonal anti-H. pylori de coelho
utilizado reage com antígenos somáticos resistentes ao calor do microorganismo
inteiro e proporciona uma marcação individual do microorganismo H.pylori quando
presente na superfície do epitélio ou no citoplasma das células epiteliais (DAKO,
2001). Por usar um anticorpo específico, este é um método preciso e com bom
custo-benefício para a detecção de H. pylori em biopsias gástricas (Toulaymat et al,
1999), além de ser particularmente útil para detecção de formas cocoides (Chan et
al, 1994). Estas devem ser diferenciadas de cocos patogênicos e não patogênicos,
esporos fúngicos, e criptosporidia que podem colonizar o estômago humano (Chan
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2009
151
et al, 1994), e de animais. Dessa forma, a imuno-histoquímica foi considerada o
teste ouro para comparação com o teste rápido da urease. Ao se comparar ambos
os testes, foi observada diferença estatística entre eles. Apesar disso, Morais et al
(1997) relata que o teste rápido da urease tem sensibilidade de 86% e
especificidade de 100%, sendo sua grande vantagem à facilidade de execução e
baixo custo, além da rapidez de diagnóstico. A sensibilidade do teste pode ser
afetada pelo uso de agentes que reduzem a carga bacteriana ou inibem diretamente
a atividade enzimática, como: antimicrobianos, inibidores de bomba de próton, e
compostos contendo bismuto (Cutler, 1996). Isso pode explicar a baixa correlação
do teste rápido da urease com a imuno-histoquímica no presente estudo.
O exame bacterioscópico direto (EBD) foi realizado em todos os animais
do estudo, porém, não se pôde avaliar como positivo ou negativo, pois as bactérias
encontradas não apresentavam morfologia helicoidal característica das espécies de
Helicobacter encontradas em animais. Então, foi realizada análise indicando
presença de bactérias ou não, classificando-as em cocos e bacilos. Esses bacilos
tinham morfologia distinta ente si: desde bactérias curtas espessas, até afiladas e
alongadas. Já havia sido observada bactéria do gênero Helicobacter como, por
exemplo, H. hepaticus, apresentando outras formas não espiraladas como bastão ou
cocos (Dubois, 1998). Portanto, o EBD, como única forma de diagnóstico, não foi
conclusivo.
Entretanto, a associação de técnicas histoquímicas com técnicas imunohistoquímicas é recomendável para se obter um resultado mais seguro, pois os
métodos de diagnóstico estudados, quando utilizados isoladamente, não foram
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adequados para conferir o “status” de infecção de um indivíduo. Então foi necessária
a associação de dois ou mais métodos, incluindo um histológico, para esse fim. Com
base nisso, 14 eqüinos foram considerados positivos para Helicobacter spp.. E um
animal recebeu “status” indefinido por apresentarem positividade de amostras em
um método sem comprovação da imuno-histoquímica.
A imuno-histoquímica e a coloração Warthin Starry demonstraram
marcação na superfície e na camada queratinizada do epitélio escamoso, no muco
superficial, na luz de glândulas gástricas e nas células parietais da mucosa
glandular. Portanto, todas as regiões do estômago eqüino parecem susceptíveis à
infecção por bactérias do gênero Helicobacter. Apesar disso, o antro foi a região
gastroduodenal mais acometida por Helicobacter spp. com 63,2% das amostras
positivas, seguido pela margo plicatus 59,4%. Mello (2005) não encontrou diferença
significativa entre as três regiões avaliadas – fundo, corpo e antro - em seu estudo
com amostras gástricas de sagüis. No entanto, é possível que diferentes espécies
ou diferentes cepas de Helicobacter spp. possam se distribuir de forma diferente na
mucosa gastroduodenal. Um estudo com a espécie de primata Macaca fascicularis
observou bactérias morfologicamente compatíveis com H. pylori na mucosa antral e
organismos morfologicamente compatíveis com H. heilmannii na região fúndica
(Reindel et al, 1999). Recentemente, foi identificado que o fator de virulência
citotoxina vacuolizante de H. pylori também está envolvido numa maior atividade
neutrofílica no corpo gástrico (Umit et al, 2009), e nada impede que esta possa estar
associada a uma maior colonização bacteriana em uma determinada região. Nos
seres humanos, a colonização do antro gástrico está associada a secreção gástrica
normal e uma gastrite antro-predominante (Kusters et al, 2006).
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153
Com relação ao diagnóstico histopatológico da inflamação, os diagnósticos
mais freqüentes foram gastrite linfoplasmocitária moderada e enterite grave. A
infiltração linfoplasmocitária de mucosa gástrica também foi evidenciada em
macacos infectados por H. pylori (Reindel et al, 1999) e cães e gatos Helicobacter
spp. positivos (Simpson et al, 2000b). Porém, no presente trabalho, a análise
estatística não foi conclusiva para relacionar essas alterações com a presença de
Helicobacter spp.
A existência de trabalhos sobre o número dos diferentes tipos de células
inflamatórias na lamina própria gastroduodenal de cavalos saudáveis é praticamente
nula. O presente estudo teve o mérito de quantificar o número de células
inflamatórias na mucosa gastroduodenal com auxílio da imuno-histoquímica para
identificação celular. Foram utilizados anticorpos produzidos para identificar
moléculas humanas. Na falta de anticorpos específicos para as espécies
domésticas, a patologia veterinária freqüentemente faz uso de anticorpos que
apresentam reatividade cruzada entre antígenos humanos e animais (Ruiz et al,
2005). Com isso, baseado nos estudos de Deby-Dupont (1998), que assegura uma
estreita similaridade entre a mieloperoxidase humana e a eqüina, o uso do anticorpo
anti-mieloperoxidase humana em eqüinos avaliados pelo presente estudo parecia
ser viável e apresentou resultados bastante satisfatórios.
Alguns trabalhos que avaliaram bioquimicamente a atividade de MPO
tecidual associada à avaliação histopatológica por hematoxilina-eosina no cólon
eqüino relatam que existe correlação entre a atividade de MPO e a infiltração
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mucosa de eosinófilos (McConnico et al, 1999; 2002). Já os trabalhos de avaliação
da atividade de MPO nos tecidos do homem, ratos e hamsters afirmam que a
atividade de mieloperoxidase é uma função dos neutrófilos e está diretamente
relacionada à presença deles nos tecidos (Bradley et al, 1982; Krawisz et al, 1984;
Grisham & Granger, 1988). Diante disso, se poderia pensar em uma particularidade
eqüina na qual os eosinófilos estariam envolvidos na atividade de MPO. Por outro
lado, a MPO purificada de polimorfonucleares eqüinos é bastante similar a MPO
humana e foi evidenciada em neutrófilos e monócitos, não tendo sido encontrada
nos eosinófilos, sugerindo uma diferença entre a estrutura protéica da peroxidase
eosinofílica e a mieloperoxidase neutrofílica (Deby-Dupont, 1998), O anticorpo antimieloperoxidase
humana
imunorreagiu
no
presente
trabalho
com
células
morfologicamente compatíveis com neutrófilos e eosinófilos. Portanto, o anticorpo
anti-Mieloperoxidase apresenta reatividade satisfatória para antígenos eqüinos,
porém o(s) tipo(s) de polimorfonucleares imunomarcados não pode(m) ser
científicamente determinado(s) com a metodologia aplicada por este trabalho.
O uso do anticorpo CD3 humano em amostras de eqüinos já havia sido
descrito por Lemos et al (2007) para a caracterização do infiltrado mononuclear em
amostras de cérebro. O presente trabalho testou o mesmo clone em amostras do
trato gastrintestinal de eqüinos e obteve dados satisfatórios, com imunomarcação
dos linfócitos T na periferia dos folículos linfóides.
Em seres humanos a imunomarcação da molécula CD20 vem sendo
usada para avaliar qualitativamente a inflamação crônica (Lins et al, 2008). O
presente trabalho fez uma abordagem semelhante em amostras do trato
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gastroduodenal eqüino. A imunomarcação foi obtida no lado citoplasmático da
membrana celular de linfócitos do centro de folículos linfóides como especificado
pelo fabricante (Dako, 2001).
O presente estudo chegou a algum conhecimento relevante sobre a
infiltração de polimorfonucleares, linfócitos T e linfócitos B em cavalos de corrida
apresentando enfermidades gastroduodenais.
A média de células polimorfonucleares por campo nas amostras avaliadas
neste estudo foi de 29,8. Em um estudo do ano de 2009 (Otani et al.) foi
demonstrado um aumento na atividade de mieloperoxidase após inoculação de H.
pylori e, histologicamente, houve aumento gradual da infiltração de células
inflamatórias, incluindo mononucleares e neutrófilos na lamina própria e submucosa
São necessários novos estudos para a determinação do papel disso na patogênese
da infecção por Helicobacter spp. em eqüinos.
A contagem de células marcadas pelo anticorpo anti-CD3 nas amostras do
estudo revelou média de 54,6 células por campo e a contagem de células marcadas
pelo anti-corpo anti-CD20, média de 161,6. Devido a irregularidade da infiltração de
células CD20 na mucosa gastroduodenal eqüina, o desvio padrão é muito elevado,
não sendo possível compararmos a contagem de linfócitos B com T apenas pela
média.
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O presente estudo revelou também associação entre a presença de
Helicobacter spp. e um aumento no número de células CD3 positivas, ou seja,
linfócitos T. Já foi relatada associação entre a infecção por Helicobacter felis e a
presença de linfócitos T, inclusive indicando que essas células, diferentes dos
linfócitos B, são mediadores críticos de enfermidades associadas ao Helicobacter
spp (Roth et al, 1999). Na infecção pelo H. pylori foi relatada uma resposta local por
células Th1 com síntese aumentada de interferon (IFN)-γ, fator de necrose tumoral
(TNF)-α e interleucina (IL)-12 (Monteleone et al, 2004). Células T CD4+ entre outras
células imflamatórias ainda produziriam IL-17A na mucosa gástrica infectada por
H.pylori. Esta citocina possui efeitos supressores na gastrite induzida por H.pylori
pois inibe a produção de citocinas Th1 (IFN-γ e TNF-α) porém não induz uma
redução significativa na atividade de MPO (Otani et al, 2009).
Além disso, um maior número de células CD3 positivas - linfócitos T, e
células CD20 positivas - linfócitos B, infiltrando a mucosa gástrica estava associada
à erosão e depósitos de fibrina. Assim como, uma infiltração mais intensa de células
mieloperoxidase positivas – polimorfonucleares foi comprovada estatisticamente nas
amostras com ulceração. A referida alteração é esperada uma vez que a ulceração é
caracterizada por uma base com debris fibrino-necroticos e abaixo, uma zona de
infiltrado inflamatório não específico com predomínio de neutrófilos (Liu & Crawford,
2004).
A região mais acometida por polimorfonucleares foi a margo plicatus e a
região mais acometida tanto por linfócitos B quanto por linfócitos T foi o duodeno.
Esses achados podem ser explicados pela margo plicatus ser a região com maior
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incidência de úlceras e o duodeno ser a região com maior número de folículos e
aglomerados linfóides em um mesmo animal.
Dentre os dados observados e discutidos no decorrer deste trabalho,
deve-se ressaltar a importância de um maior conhecimento da reação inflamatória
na mucosa gastroduodenal eqüina. Alguns parâmetros puderam ser associados à
colonização por Helicobacter spp., porém para uma definição do papel deste
microorganismo na patogênese das lesões gastroduodenais eqüinas mais estudos
envolvendo o tema devem ser executados.
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7 CONCLUSÕES
•
Os achados mais freqüentes no lúmen estomacal dos cavalos de corrida são
muco, fibrina e sangue, respectivamente.
•
Os achados macroscópicos mais freqüentes da mucosa gastroduodenal dos
cavalos de corrida avaliados são edema, eritema, hemorragia e espessamento
do epitélio estratificado pavimentoso.
•
Enterite acentuada e gastrite enantematosa leve associadas a erosões ou
úlceras pequenas (menores de 3 cm), solitárias ou multifocais parecem ser os
diagnósticos macroscópicos mais freqüentes do trato gastroduodenal de cavalos
sob treinamento de corrida.
•
Os achados microscópicos que ocorrem com maior freqüência em cavalos de
corrida são congestão, edema, hemorragia, erosão, fibrina, úlcera e infiltrado
inflamatório linfoplasmocitário difuso moderado.
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•
Hiperqueratose paraqueratótica, edema intracelular subqueratótico e hiperplasia
da camada basal são achados histopatológicos da mucosa aglandular bastante
freqüentes em cavalos de corrida.
•
Erosão é um achado corriqueiro em cavalos de corrida, mais do que a ulceração.
•
A região gástrica mais acometida por úlceras é a margo plicatus e a mais
acometida por erosão é o fundo glandular em cavalos sob treinamento de corrida.
•
Gastrite linfoplasmocitária moderada e enterite grave são os diagnósticos
histopatológicos mais freqüentes nos cavalos de corrida avaliados.
•
Helicobacter spp. coloniza naturalmente a mucosa gástrica de cavalos
submetidos a treinamento de corrida e a ocorrência pode ser elevada.
•
O antro é a região na qual a colonização por Helicobacter spp. é mais intensa em
eqüinos.
•
Pode haver relação entre a colonização por Helicobacter spp. e a atrofia de
glândulas gástricas em eqüinos.
•
Hemorragia moderada ou severa pode dificultar a identificação de Helicobacter
spp. em amostras gastroduodenais eqüinas.
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•
Não há diferença estatística entre os resultados dos testes de Imunohistoquímica e coloração Warthin-Starry quanto a presença de Helicobacter spp.,
mas eles podem ser complementares.
•
Os testes imuno-histoquímica e teste rápido da uréase diferem entre si quanto
aos resultados, não sendo recomendado o uso do teste rápido da urease
isoladamente para diagnóstico da infecção por Helicobacter spp. em eqüinos.
•
Os anticorpos anti-mieloperoxidase humana, anti-CD3, anti CD20 podem ser
utilizados satisfatoriamente em amostras gastrintestinais eqüinas.
•
A imunomarcação com o anticorpo anti-mieloperoxidase otimiza a identificação
de polimorfonucleares, possibilitando uma análise quantitativa da inflamação
aguda em amostras gástricas eqüinas.
•
Em cavalos de corrida, a região gastroduodenal com maior número de
polimorfonucleares por campo é a margo plicatus.
•
Em cavalos de corrida, as regiões com maior número de linfócitos T e B por
campo são o duodeno seguido do piloro.
•
As amostras com erosão apresentam maior infiltração de linfócitos B e T; e
amostras ulceradas apresentam maior número de polimorfonucleares infiltrando a
mucosa gastroduodenal eqüina.
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161
•
A colonização da mucosa gastroduodenal eqüina por Helicobacter spp. está
relacionada a um aumento do número de linfócitos T infiltrando este tecido.
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9.1.1 Apresentação Oral
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Águas de Lindóia, SP. 12 a 16 de outubro de 2009. (ACEITO)
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Positivas na Mucosa Gátrica de Equinos com Gastrite, Úlceras e Através da
Técnica de Imuno-histoquímica. XXVII Congresso Brasileiro de Patologia, Buzios,
RJ. 28 a 31 de outubro de 2009. (ACEITO)
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