UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE
FACULDADE DE VETERINÁRIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MEDICINA VETERINÁRIA
ÁREA DE CONCENTRAÇÃO EM CLÍNICA E REPRODUÇÃO
DANIELA ARAUJO DE SOUSA
Helicobacter sp em gatos domésticos – identificação
e relação com alterações anatomo-histopatológicas
gástricas em animais de sangue tipo A
NITERÓI
2012
DANIELA ARAUJO DE SOUSA
Helicobacter sp em gatos domésticos – identificação
e relação com alterações anatomo-histopatológicas
gástricas em animais de sangue tipo A
Dissertação apresentada ao Programa de
Pós Graduação em Medicina Veterinária da
Universidade
Federal
Fluminense,
como
requisito parcial para obtenção do Grau de
Mestre. Área de Concentração: Clínica e
Reprodução Animal.
Orientadora: Prof. Dra. Ana Maria Reis Ferreira
Co-orientadora: Prof. Dra. Marcela Freire Vallim de Mello
Niterói
2012
2
DANIELA ARAUJO DE SOUSA
Helicobacter sp em gatos domésticos – identificação
e relação com alterações anatomo-histopatológicas
gástricas em animais de sangue tipo A
Dissertação apresentada ao Programa de Pós
Graduação em Medicina Veterinária da
Universidade Federal Fluminense, como
requisito parcial para obtenção do Grau de
Mestre. Área de Concentração: Clínica e
Reprodução Animal
Aprovada em fevereiro de 2012
BANCA EXAMINADORA
___________________________________________________________________
Prof. Dra. Ana Maria Reis Ferreira – Orientadora
UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE
Prof. Dra. Heloísa Justen Moreira de Souza
UNIVERSIDADE FEDERAL RURAL DO RIO DE JANEIRO
Prof. Dra. Sara Maria de Carvalho e Suzano
UNIVERSIDADE CASTELO BRANCO
Niterói
2012
3
AGRADECIMENTOS
À minha filha Laura de Sousa Palmeiro por tornar minha vida tão boa;
Ao meu marido Marcos Angulo Palmeiro pelo apoio financeiro;
À minha irmã Valéria Araujo de Sousa pela orientação, incentivo, apoio e pelo tempo
dispensado no meu aprendizado;
Ao meu pai João Luis, minha mãe Marilena e minha irmã Sandra por todo apoio que
deram até hoje;
À Prof.ª Ana Maria Reis Ferreira pela orientação e apoio na realização deste
trabalho;
À Prof.ª Marcela Freire Vallim de Mello pela co-orientação pelo apoio e pelo tempo
dispensado;
Ao Dr. Miguel Ângelo da Silva Medeiros e Dra Mariana pela grande ajuda com a
tipagem sanguínea;
À Prof.ª Ana Beatriz Soares Monteiro, do Departamento de Estatística do Instituto de
Matemática da UFF, pela análise estatística dos resultados;
À Mônica Pitrez que me auxiliou em todas as coletas do trabalho;
Ao professor Paulo Perissé e sua equipe do Hospital Gaffrée e Guinle por ter me
iniciado no aprendizado da endoscopia;
À Juliana, Elaine, Fabiane e todas as pessoas do Setor de Patologia Veterinária da
Faculdade de Veterinária da UFF;
À Júlia Gleich, Paula e Sidney da coordenação da pós graduação pelo auxílio
prestado sempre que solicitados;
À Isabella Morand, Carla Dray e toda a equipe do consultório Bicho Bacana por
ceder o espaço para realização das coletas;
Ao meu mentor espiritual por sempre me acompanhar em minhas conquistas;
A todos que direta ou indiretamente me ajudaram na realização do trabalho.
4
SUMÁRIO
LISTA DE ILUSTRAÇÕES ........................................................................................................................... 6
LISTA DE TABELAS .................................................................................................................................... 7
LISTA DE ABREVIATURAS ........................................................................................................................ 8
RESUMO ........................................................................................................................................................ 9
ABSTRACT ..................................................................................................................................................10
1 INTRODUÇÃO ..........................................................................................................................................11
2 FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA ...............................................................................................................13
2.1 BARREIRA DA MUCOSA GÁSTRICA ................................................................................................. 13
2.2 HELICOBACTER SP............................................................................................................................... 14
2.2.1 Epidemiologia .................................................................................................................................. 14
2.2.2 Gênero .............................................................................................................................................. 15
2.2.3 Morfologia ......................................................................................................................................... 17
2.2.4 Patogenia ......................................................................................................................................... 18
2.2.4.1 Fatores de Virulência ................................................................................................................................18
2.2.4.2 Patogênese de Helicobacter sp ..............................................................................................................19
2.2.4.3 Patogênese em gatos ...............................................................................................................................20
2.2.4.4 Potencial Zoonótico...................................................................................................................................21
2.3 ENDOSCOPIA ......................................................................................................................................... 22
3 OBJETIVOS ..............................................................................................................................................23
3.1 OBJETIVO GERAL .................................................................................................................................. 23
3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS .................................................................................................................. 23
4 MATERIAIS E MÉTODOS .......................................................................................................................25
4.1 ANIMAIS/ AMOSTRAS ........................................................................................................................... 25
4.2 METODOLOGIA ...................................................................................................................................... 26
4.2.1 Avaliação Clínica ............................................................................................................................. 26
4.2.2- Coleta de sangue, processamento e Identificação do grupo sanguíneo .............................. 26
4.2.3 Procedimento e Exame endoscópico ........................................................................................... 26
4.2.4 Exame bacterioscópico direto corado por fucsina fenicada ..................................................... 27
4.2.5 Teste de urease ............................................................................................................................... 27
4.2.6 Processamento histológico e exame histopatológico ................................................................ 28
4.3 ANÁLISE ESTATÍSTICA ........................................................................................................................ 29
5 RESULTADOS ..........................................................................................................................................30
6 DISCUSSÃO ..............................................................................................................................................37
7 CONCLUSÃO ............................................................................................................................................44
8 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .......................................................................................................46
5
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 1- Microtubos com amostras gástricas para o teste rápido de urease:
microtubo com conteúdo de cor magenta com amostra considerada positiva e
microtubo com conteúdo de cor amarela com uma amostra negativa.......................28
Figura 2- Fotomicrografias do antro gástrico de gatos domésticos. A-B:Gato n° 33 presença de folículo linfóide; C: Gato n° 31 e D: Gato n° 5 - presença de infiltrado
inflamatório de células mononucleares na lâmina própria da mucosa (A-D- HE; A
40X original; B - 100X original; C, D 400X original....................................................35
Figura 3- A-F: Fotomicrografia da mucosa gástrica de gatos domésticos. A: Gato n°
5, região do corpo gástrico mostrando a presença de estruturas espiraladas róseas
semelhantes ao Helicobacter sp; B: Gato nº 30 região do fundo gástrico, mostrando
estruturas espiraladas marcadas em preto - Helicobacter SP no muco. C: Gato n° 9,
região do corpo gástrico, mostrando grande quantidade de estruturas espiraladas
marcadas em preto - Helicobacter sp no muco. D: Gato n°9, região do fundo gástrico,
mostrando estruturas espiraladas marcadas em preto - Helicobacter sp no lúmen
glandular. E: Gato n° 28, região do fundo gástrico, mostrando a bactéria espiralada
em preto - Helicobacter sp na célula epitelial (setas). F: Gato n°30, região do corpo
gástrico, mostrando estruturas espiraladas marcadas em preto - Helicobacter sp em
tamanhos variados. (A : HE; B, C, D, E e F: Coloração de Prata – WS; A, B, C, D, E e
F:400X original)..........................................................................................................36
Figura 4 - Fotomicrografias do esfregaço citológico da mucosa do antro gástrico,
Gato n°8 - Presença de estruturas espiraladas roseas semelhantes ao Helicobacter
sp. coloração de Fucsina Fenicada; objetiva 100X (original).............................................37
6
LISTA DE TABELAS
Tabela 1- Resultado do teste da urease – relação entre tempo decorrido até a
mudança de cor do meio e percentual de amostras de cada região gástrica
indicando positividade para
Helicobacter sp em gatos domésticos,
UFF,2012....................................................................................................................31
Tabela 2 - Percentual de amostras de cada região gástrica em relação ao escore da
quantidade de Helicobacter sp encontrado na histopatologia corada pela coloração
de prata – WS, de gatos domésticos,UFF,2012........................................................33
Tabela 3- Escore de intensidade de infiltrado inflamatório predominantemente de
células mononucleares e seu percentual em relação à região gástrica de gatos
domésticos positivos para Helicobacter sp, UFF, 2012............................................34
7
LISTA DE ABREVIATURAS
GHLO (gastric helicobacters like organism) – organismos gástricos semelhantes a
Helicobacter
GMB – Barreira da mucosa gástrica
H. heilmanni – Helicobacter heilmannii
H. pylori – Helicobacter pylori
HE- hematoxilina e eosina
MALT –( mucosa associated lymphoid tissue)
WS- Warthin-Starry
8
RESUMO
Há 25 anos, H.pylori, uma bactéria do gênero Helicobacter, foi associada ao
aparecimento de úlceras gástricas, gastrite e adenocarcinoma gástrico em humanos.
Desde então, as pesquisas sobre este gênero de bactérias se intensificaram e já
foram identificadas várias espécies que colonizam o trato gastrentérico de humanos
e animais, dentre eles os animais de companhia como cães e gatos. As pesquisas
têm demonstrado que grande parte dos felinos adultos assintomáticos apresentam
Helicobacter sp em seus estômagos, e que animais sintomáticos apresentam algum
tipo de afecção gástrica associada à infecção. Este trabalho teve como objetivo
identificar a presença de Helicobacter sp e avaliar as alterações anatomohistopatológicas em amostras de mucosa gástrica de gatos domésticos de sangue
tipo A, coletadas por meio de biópsia endoscópica. Foram estudados 32 animais que
foram submetidos ao exame de sangue identificando o tipo sanguíneo. Depois foi
realizado o exame endoscópico e foram coletadas amostras da mucosa gástrica do
corpo, fundo e antro. A pesquisa da presença de Helicobater sp foi feita por exame
bacterioscópico direto em amostras coradas com fucsina fenicada e teste de urease.
Amostras foram também fixadas em formol 10% tamponado, processadas e
incluídas em parafina, coradas em Hematoxilina eosina e pela coloração de prata –
Warthin-Starry. Foi realizada análise estatística dos dados obtidos. À avaliação
endoscópica, observou-se alteração na mucosa gástrica de 25% dos animais
estudados. O teste da urease foi positivo em 96,9% dos animais enquanto o exame
citológico e o histopatológico com coloração de prata - WS, obtiveram percentuais
de 100% de positividade. Infiltrado inflamatório mononuclear leve, com predomínio
linfócitos e plasmócitos foi a alteração histopatológica mais freqüente. A observação
das amostras pela coloração pela prata, apresentou escores semelhantes entre as 3
regiões gástricas avaliadas sugerindo uma colonização homogênea.Pôde ser
observado infiltrado inflamatório em pelo menos uma região gástrica de 87,5 % dos
animais. Não houve relação entre o infiltrado de células inflamatórias e a
colonização por Helicobacter sp, nas diferentes regiões gástricas estudadas. O alto
percentual de gatos infectados, a diferente patogenicidade entre as espécies e
cepas de Helicobacter sp e a patogenicidade pouco conhecida dos GHLOs indicam
a importância de estudos para elucidar o papel do Helicobacter sp na patogênese da
gastrite felina e na sua potencial transmissão para o homem e outros animais.
Palavras chaves: Helicobacter sp, felinos, gastrite, endoscopia.
9
ABSTRACT
Twenty five years ago, H. pylori, a bacterium of the Helicobacter genus has
been associated with gastric ulceration, gastritis and gastric adenocarcinoma in
humans. Since then, studies about this genus of bacteria have been intensified and
several species have been identified in the gastrenteric tract of humans and animals,
including pets, such as dogs and cats. Studies have shown that almost all
asymptomatic adult cats have Helicobacter sp. in their stomachs and that
symptomatic cats presents any sort of gastric pathology associated with gastric
infection. The aim of this study was to identify the presence of Helicobacter sp and
evaluate the gross and microscopic changes in gastric mucosa endoscopic samples
from domestic cats with A blood type. We used 32 animals that underwent blood type
tests. Endoscopic examination was performed and histological specimens from
fundic, corpus, and antral gastric regions were collected. The search for Helicobacter
sp. was made by direct bacterioscopic examination in phenic fuchsin stained
samples and by urease test. Histological specimens were fixed in 10% buffered
formalin, processed and embedded in paraffin. Sections were stained with
hematoxylin-eosin (HE) and the Warthin-Starry (WS) silver impregnation method.
Statistical analysis was performed on resulting data. Endoscopic examination
revealed gastric mucosa changes in 25% of the animals. The urease test was
positive in 96.9% of the animals, while direct bacterioscopic examination and
histological examination of silver-stained sections were positive in 100% of the cats.
Mild inflammatory mononuclear cell infiltrates with predominance of lymphocytes and
plasma cells were the most common histopathological findings observed. The
observation of the samples by silver staining, showed similar scores between the
three gastric regions evaluated, suggesting a homogeneous colonization.
Inflammatory infiltrate was observed in at least one gastric region of 87.5% of
animals. There was no correlation between the infiltration of inflammatory cells and
colonization by Helicobacter sp. in the different gastric regions studied. The high
percentage of infected cats, the pathogenicity of different species and strains of
Helicobacter sp., and the little known pathogenicity of the HGNP indicate the
importance of studies to elucidate the role of Helicobacter sp in the pathogenesis of
feline gastritis, and in its potencial transmission to humans and other animals.
Keywords: Helicobacter sp, cats, gastritis, endoscopy.
10
1 INTRODUÇÃO
Bactérias espiraladas foram vistas na mucosa gástrica de humanos no início
do século XX (Krienitz, 1906) e descritas por vários pesquisadores. Organismos
similares foram também observados na mucosa gástrica de cães e gatos e em
vários outros animais em estudos feitos por Rappin (1881), Bizzozero (1892),
Salomon (1896), Lim (1920), Doenges (1939), (Solnick et al, 2006).
A descoberta de que o estômago humano é normalmente infectado pela
bactéria H. pylori resultou na identificação de uma nova família de bactéria
patogênica.
Em menos de vinte e cinco anos, o gênero Helicobacter saiu da
obscuridade para cerca de 38 espécies diferentes com muitas outras aguardando
classificação (Harbour & Sutton, 2008).
As bactérias espirais do gênero Helicobacter sp infectam o estômago de
muitos hospedeiros mamíferos, incluindo humanos, cães e gatos. Esses organismos
espirais Gram negativos produzem caracteristicamente urease, uma enzima que
permite sua adaptação ao ambiente gástrico e que podem ser usada no diagnóstico
para confirmar a infecção (DeNovo, 2003).
No geral, Helicobacter sp apresentam uma forma helicoidal embora sua forma
varie em espirais largas e curtas, e se movimentam através de flagelos. Estudos da
ultra-estrutura mostram uma bactéria com parede celular tipicamente Gram-negativa
(Solnick et al, 2006).
A prevalência relatada da infecção gástrica por Helicobacter sp. é alta em
cães e gatos clinicamente normais, assim como em cães e gatos com sinais de
gastrite (DeNovo, 2003).
11
Desde que grande parte dos gatos adultos saudáveis abrigam Helicobacter
sp. em sua mucosa gástrica, a possibilidade de serem agentes zoonóticos, em
potencial de H. heilmannii, pode ter importantes implicações na saúde pública
(Pregel et al, 2008).
O aspecto endoscópico da suspeita de gastrite associada à Helicobacter sp. é
variável, podendo ir de mucosa com aspecto normal a mucosas hiperêmicas e
erosões ponteadas. Alguns pacientes apresentam gastrite nodular difusa com
aspecto folicular aumentado, causada por um acúmulo de linfócitos. Os achados
histológicos associados com Helicobacter sp. em humanos, cães e gatos variam em
gravidade, de ligeira vacuolização do epitélio superficial a inflamação linfocítico
plasmocítica ou neutrofílica da mucosa. Os nódulos linfocíticos ocorrem em
pacientes mais gravemente afetados. Os cães e gatos que apresentam gastrite leve
no exame histológico são assintomáticos e quando estão com gastrite moderada a
grave são sintomáticos (DeNovo, 2003).
A endoscopia era considerada como um exame complementar aos outros
métodos diagnósticos como radiografia e ultrassonografia, mas hoje em dia, é
provável que ela seja a ferramenta mais importante disponível para avaliação de
doenças do estômago e intestino. Isso é particularmente verdadeiro em relação aos
casos agudos e crônicos (Tams, 2011).
Apesar de vários estudos demonstrarem alterações na mucosa gástrica
causadas por Helicobacter sp em cães e gatos, sua patogenicidade nestas espécies
ainda não é bem conhecida. Assim, é necessário aprofundar as pesquisas
envolvendo os microorganismos do gênero Helicobacter para que sua patogenia
seja o mais brevemente elucidada, e é importante avaliar os diferentes métodos de
diagnósticos para testar sua eficiência em amostras gástricas pequenas coletadas
através de endoscopia.
12
2 FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA
2.1 BARREIRA DA MUCOSA GÁSTRICA
O estômago é um órgão em forma de bolsa, posicionado transversalmente
entre o esfíncter esofagiano inferior e o piloro. Sua parede tem três camadas: a
mucosa, a muscular e a serosa. A mucosa consiste em epitélio superficial, lâmina
própria glandular e camada muscular (De Novo, 2003).
O estômago está bem protegido dos efeitos danosos do ácido gástrico,
pepsina, ácidos biliares e outras enzimas digestivas por uma unidade funcional
conhecida como barreira da mucosa gástrica (gastric mucosal barrier, GMB;
Simpson, 2005). O componente mais superficial da GMB é uma fina camada de
muco-bicarbonato secretado pelas células epiteliais gástricas. O muco superficial
funciona como um lubrificante para evitar lesão mecânica. Um gel de glicoproteína
basal se adere à mucosa e aprisiona o bicarbonato secretado pelas células epiteliais
para manter o pH da mucosa acima de 6 (De Novo, 2003). Outra característica
importante da GMB é a capacidade das células epiteliais gástricas de repararem
contínua e rapidamente as células lesadas, a qual é conhecida como restituição
celular. Também possui uma densa rede de capilares da submucosa que fornece
oxigênio e nutrientes para as necessidades metabólicas altas de secreção de muco
e bicarbonato e da rápida renovação celular (De Novo, 2003).
A perda da barreira de muco tem um importante papel na habilidade do íon
Hidrogênio penetrar e danificar a GMB. Em humanos tem sido mostrado que
13
Helicobacter sp digere ativamente a GMB, em particular a camada superficial, o que
resulta em um muco menos hidrofóbico, portanto aumentando a taxa de degradação
luminal (Sturgess, 2001).
2.2 HELICOBACTER SP
2.2.1 Epidemiologia
A principal espécie de Helicobacter que se distingue em estômago de
humanos é Helicobacter pylori. Cerca de metade da população mundial hospeda
esta bactéria e sua prevalência difere, sobretudo, pela área geográfica, com a idade,
raça e com o status socioeconômico. De acordo com a área geográfica, a infecção
por H. pylori mostrou ser mais prevalente em países subdesenvolvidos, numa taxa
igual ou superior a 70 % de infecção, em oposição aos países industrializados, onde
40% das pessoas ou menos estão infectadas (Kusters, et al., 2006).
Uma revisão feita por Goh e colaboradores (2011), em artigos de abril de
2010 a março de 2011 sobre a epidemiologia da infecção por H. pylori e suas
implicações na saúde pública, mostra que as taxas de prevalência variam muito
entre as diferentes regiões geográficas e os grupos étnicos. Um estudo nos Estados
Unidos da América (EUA) identificou o grau de ascendência africana como um
preditor independente da infecção por H. pylori e outros dois estudos demonstraram
a primeira infância como o período de transmissão da infecção e identificou um
irmão infectado como um fator de risco importante. A transmissão direta através da
via oral foi substanciada com vários estudos mostrando a presença de H. pylori na
cavidade oral. Pesquisas demonstram o papel das más condições de vida e
saneamento em infecção por H. pylori e também a presença de H. pylori na água
potável, suportando uma via orofecal de propagação (Goh et al, 2011).
Em gatos, a infecção por Helicobacter sp. apresenta distribuição mundial, com
alta prevalência, variando de 90% a 100%, no entanto sua patogenicidade não está
bem elucidada, embora haja relatos de associação de helicobactérias com lesões
gástricas de inflamação, presença de nódulos linfóides, degeneração glandular e
fibrose da lâmina própria (Takemura et al, 2009).
14
As espécies mais comuns encontradas nos gatos são Helicobacter felis,
Candidatus Helicobacter heilmanii (Haesebrouck et al, 2009) e com menos
freqüência o H. pylori (DeNovo, 2003), mas estudos relatam também a presença de
Helicobacter pametensis (Neiger et al, 1998), Helicobacter baculiformis (Baele et al,
2008) e Helicobacter canis (Foley et al,1999).
Estudos mostram que o percentual de gatos infectados com Helicobacter sp é
alto. Na Alemanha Geyer e colaboradores (1993) verificou que 56,6% dos gatos
doentes estavam infectados com Helicobacter sp e em 41,4% dos gatos sadios
havia a presença da bactéria. Papasouliotis e colaboradores (1997) descrevem uma
taxa de 100% de infecção em gatos sadios em Bristol, Inglaterra.
No Japão
Yamasaki e colaboradores (1998) descrevem um percentual de 90% em gatos
sadios e 64% em gatos que apresentavam sintomatologia gástrica, bem como
Neiger e colaboradores (1998), Camargo (2002), Van Den Bulck e colaboradores
(2005) e Takemura (2007) relatam uma taxa de 84,5% na Suiça, 100% no Brasil,
86% na Bélgica e 87% no Brasil respectivamente.
Os dados epidemiológicos demonstram que existe uma grande variação na
prevalência destas bactérias nas várias populações de animais de companhia no
mundo. Esta variação pode também influenciar os dados relatados nos diversos
estudos, uma vez que a não observação de relação entre colonização e doença num
país não pode ser diretamente extrapolada para outro. Por esta razão, é importante
estabelecer a prevalência de Helicobacter sp. em diferentes países, avaliando quais
as espécies mais comuns e qualquer relação com alterações gástricas em animais
de companhia (Teixeira, 2010).
2.2.2 Gênero
O gênero Helicobacter consiste em um grupo de organismos que colonizam o
muco que recobre a superfície epitelial do trato gastrointestinal de humanos e de
várias espécies de animais (Solnick et al, 2006).
Espécies de Helicobacter já foram detectadas em 142 espécies de
vertebrados, incluindo animais de todos os continentes e todas as classes de
vertebrados excluindo os peixes. A colonização por Helicobacter sp foi confirmada
15
pela primeira vez em jabuti, golfinhos e gambás e a família Helicobacteriaceae
recentemente se expandiu com a descrição de Helicobacter magdeburgensis. (Smet
et al, 2011).
Desde a descrição do H. pylori o número de espécies do gênero rapidamente
se expandiu. Logo no início das pesquisas com H. pylori, os patologistas, ao
examinarem biópsias de mucosa gástrica, relataram a presença de uma bactéria
morfologicamente distinta por seu formato típico longo e espiralado. Estas
helicobactérias maiores que a H. pylori e intensamente espiraladas, foram
previamente descritas como H. heilmanni (O’Rourke et al, 2004) e subdivididas em
pelo menos cinco espécies diferentes, todas colonizando o estômago de animais
que
eram
“Candidatus
Helicobacter
suis”,
Helicobacter
felis,
Helicobacter
bizzozeronii, Helicobacter salomonis e “Candidatus Helicobacter heilmannii” (Baele
et al, 2009).
Helicobacter heilmannii foi identificada no estomago dos carnívoros
domésticos (Otto, et al, 1994; Strauss-Ayali, et al, 1999; Scanziani, et al, 2001). Um
estudo que avaliou a patologia gástrica em um homem causada por H. heilmanni
idêntica a de seus gatos, sugere que esta seja uma zoonose (Dieterich et al 1998)
uma vez que humanos com esta infecção, frequentemente vivem em contato íntimo
com animais (Loon et al, 2003). Helicobacter heilmanni é o nome proposto para
bactérias espiraladas, com tamanho que vai de 4 a 10 µm, móveis, com 3 a 8 voltas
helicoidais, com até 14 flagelos uni ou bipolar, sem filamentos periplasmáticos e que
são encontrados 0,2 a 4 % dos pacientes humanos com gastrite ( Priestnal et al,
2004).
Os organismos gástricos semelhantes a Helicobacter (GHLOs – gastric
helicobacter
like
organisms)
os
quais
foram
originalmente
chamados
de
Gastrospirillum hominis e posteriormente de H. heilmannii foram subdividido em tipo
I e II sendo o tipo I idêntico a H. suis e o tipo II ao grupo de helicobctérias que
colonizam a mucosa gástrica de cães e gatos. Uma característica comum desta
bactéria é que é um organismo muito fastidioso e, pelo que se sabe, foi cultivada da
mucosa gástrica de somente dois pacientes humanos (Haesebrouck et al, 2011).
Hoje, um grande número de espécie GHLOs presente em humanos e animais tem
sido descrita e o gênero já contém 39 espécies classificadas taxonomicamente
(Takemura, 2010). A frequente mudança na nomenclatura do GHLOs vem causando
16
muita confusão não somente entre os clínicos, mas entre os bacteriologistas
(Haesebrouck, et al, 2009). Para evitar confusão, Haesebrouck, e colaboradores
(2011), fizeram a proposta para que fosse adotado o nome de H. heilmannii lato
sensu (H. heilmannii l. s.) e H. heilmannii strictu sensu (H. heilmannii s.s.) onde H.
heilmannii l. s. seria usado quando somente os resultados da histopatologia,
microscopia eletrônica e dados taxonômicos brutos estivessem disponíveis e H.
heilmannii s.s. usado quando a bactéria é identificada por sua espécie.
O sequênciamento dos genes 16S ou 23S rRNA permite diferenciar o H. suis
dos outros Helicobacter gástricos não pylori mas não pode distinguir entre H. felis, H.
bizzozeronii, H. salomonis, H. cynogastricus, H. baculiformis e H. heilmanii s.l. O
sequenciamento dos genes urease A e B parece ser o método mais adequado uma
vez que o seqüenciamento destes genes estão disponíveis para todas as espécies
de H. heilmannii s.l.. (Haesebrouck, 2011).
2.2.3 Morfologia
Em geral as bactérias Helicobacter sp. são helicoidais, embora sua forma
varie em espirais largas e curtas e se movimentam através de flagelos. Acredita-se
que estas características sejam vantajosas para sua sobrevivência no muco
gastrointestinal.
Estudos da estrutura revelam uma bactéria com estrutura de
parede celular tipicamente gram-negativa, isto é, membrana interna e externa
separadas por um espaço periplasmático de 30 nm e um citoplasma denso contendo
material nuclear e ribossomos (Solnick et al, 2006). Todas as helicobactérias
possuem flagelo que variam entre um único flagelo em uma das extremidades até
tufos com mais de vinte flagelos nas duas extremidades. Os flagelos periplasmáticos
localizados bem abaixo da membrana externa no espaço periplasmático, foram
descritos em várias espécies de Helicobacter (Solnick et al, 2006).
Uma característica fundamental das bactérias do gênero Helicobacter é a
capacidade de sobreviver num meio ácido e hostil, através da produção de uma
enzima, a urease, tornando este gênero único no seu modo de ação e patogenia
(Duarte, 2009).
17
A urease atua promovendo a hidrólise da uréia, fisiologicamente presente no
suco gástrico, com formação de amônia, que age como aceptor de íons H+,
aumentando o pH ao redor da bactéria. Dessa forma, o microorganismo fica
protegido, ao menos temporariamente, dos efeitos deletérios do pH ácido do
estômago, podendo, assim, ter acesso a camada de muco gástrico (Filho, 2003).
Em Solnick et al, 2006 morfologicamente as helicobactérias se apresentam da
seguinte maneira:
Formato
Tamanho
Nº e localização de
flagelos
Helicoidal com
espirais curtas
Espiral com 5 a 7
voltas
0,4 µm X 5 – 7,5 µm
Tufos bipolares
0,5 a 0,6 µm X 5 a
10 µm
10 a 20 tufos
bipolares
H. pametensis
Helicoidal enrolada
com extremidades
arredondadas
0,4 µm X 1,5 µm
Único flagelo em
cada extremidade
H. canis
Bacilos curvos
0,25 µm X 4 µm
Único flagelo em
cada extremidade
H. pylori
Bastão curvado em
formato de “S”
0,5 µm X 2,5 a 5,0
µm
4 a 8 flagelos em
uma ou nas duas
extremidades
H. felis
H. heilmannii
2.2.4 Patogenia
2.2.4.1 Fatores de Virulência
Os
fatores
de
virulência
são
mecanismos
que
permitem
que
um
microrganismo consiga colonizar o hospedeiro e sua evasão ao sistema imune. Para
que se tenha uma compreensão sobre a fisiopatologia de uma doença e da
patogenia do microrganismo é importante conhecer seus fatores de virulência.
Entre estes fatores encontram-se a endotoxina e as exotoxinas. A endotoxina
é, por definição, um componente da parede celular das bactérias de Gram negativo,
libertada após a morte das mesmas. As exotoxinas, em contraste, são substâncias
18
liberadas pelas bactérias que induzem uma resposta específica do organismo
hospedeiro, frequentemente nociva. Estas exotoxinas podem ser produzidas na
sequência do metabolismo normal da bactéria, ou podem ter uma ação específica de
alteração das células alvo (Teixeira, 2010).
Backert e Clyne (2011), em uma revisão sobre a patogenia do H. pylori,
relatam sobre a importância da interação entre os fatores bacterianos e as vias de
resposta do hospedeiro para a indução dos processos patogênicos e o
desenvolvimento
da
doença.
Os
fatores
bacterianos
associados
com
a
patogenicidade envolvem um sistema de secreção tipo IV codificado pela ilha de
patogenicidade Cag, a proteína efetora Cag A, a citotoxina vacuolizante (Vac A),
peptidoglicano, lipopolissacarídeo (LPS), c-glutamil transpeptidase (GGT), protease
HtrA e as adesinas Bab A, Sab A e outras.
O genoma de H. felis já foi seqüenciado e nele detectado codificações
homólogas aos fatores de virulência do H. pylori. No entanto, a sequência não
apresenta a ilha de patogenicidade Cag, bem como os genes que codificam a
citotoxina vacuolizante Vac A e as adesinas Bab A e Sab A (Smet et al, 2011).
A maioria da pesquisas sobre os fatores de virulência e a resposta do
hospedeiro foi feita com H. pylori e pouca informação está disponível sobre o
mecanismo de patogenicidade dos GHLOs A patogenicidade das espécies de
Helicobacter gástricos em gatos permanece uma incógnita e pode estar relacionada
com a espécie ou cepa. Muito pouco é conhecido sobre a diferença de
patogenicidade entre as espécies e as cepas de uma mesma espécie onde a
inflamação é considerada apenas um dos aspectos. (Haesebrouck et al, 2009).
2.2.4.2 Patogênese de Helicobacter sp
Um estudo visando a elucidação das diferentes susceptibilidades de H. pylori
encontrado na população demonstrou que camundongos infectados com 5 a 6
semanas de idade desenvolveram gastrite, gastrite atrófica, metaplasia epitelial e
hiperplasia enquanto que neonatos infectados aos 7 dias de idade foram protegidos
de lesões neoplásicas. Isto ocorreu no camundongo neonato devido ao
desenvolvimento de uma relação distorcida das células T reguladoras para as
19
células T efetoras, promovida por uma exposição prolongada a uma dose baixa de
antígeno, sugerindo que a idade em que a aquisição da infecção ocorre pode
desempenhar um papel na mediação da doença (Backert et al, 2011).
A demonstração da presença de Helicobacter sp. nos mais variados animais e
associação da presença destas espiroquetas com alterações gástricas levanta a
possibilidade de, tal como no homem, Helicobacter poder ter um papel patogênico
no desenvolvimento de alterações gástricas (Teixeira, 2010).
Priestnall e colaboradores (2004) apontam H. heilmannii como tendo um
possível potencial carcinogênico. Segundo Andersen e colaboradores (1999), H.
heilmannii é encontrado em 0,2 a 0,6% dos pacientes que apresentam sintomas
gástricos na Europa e em até 4% na China.
Em humanos, as espécies H. pylori e H. heilmannii têm sido relacionada a
quadros de gastrite, úlcera péptica e ainda adenocarcinoma e linfoma MALT.
Segundo Filho (2003), em humanos, o H. pylori adquirido por via oral se fixa
na mucosa gástrica após atravessar a barreira de muco. Esta ligação é mediada por
adesinas presentes na superfície bacteriana, as quais se ligam a receptores
específicos da superfície epitelial. Algumas adesinas têm afinidade por grupos
sanguíneos do grupo O, o que pode explicar o maior riscos dos indivíduos deste
grupo de desenvolver úlcera péptica.
2.2.4.3 Patogênese em gatos
A patogenicidade das espécies de Helicobacter sp gástricas em gatos ainda é
uma incógnita e provavelmente é dependente da espécie ou da cepa da bactéria
(Haesebrouck, et al, 2009). Gatos infectados experimentalmente por H. felis,
apresentaram uma pangastrite com infiltrado de mononucleares em toda a mucosa
gástrica, a qual é equivalente as respostas inflamatórias de animais não infectados.
Contudo, a organização folicular das células inflamatórias foi restrita aos animais
infectados (Haesebrouck, et al, 2009).
Scanziani e colaboradores (2001), relatam hiperplasia folicular linfóide grave
na mucosa do piloro em todos os gatos estudados com H. pylori
e hiperplasia
folicular linfóide moderada na mucosa do piloro e infiltrados inflamatórios moderados
20
compostos por linfócitos, plasmócitos e macrófagos na mucosa do fundo e do piloro
de um gato apresentando vômitos crônicos, diarréia e perda de peso infectado por
H. heilmannii. Outros gatos infectados por H. heilmanni neste mesmo estudo,
apresentaram raros e leves infiltrados inflamatórios compostos de linfócitos e
plasmócitos, resultados similares aos gatos que não apresentavam infecção por
Helicobacter sp.
Em um estudo, Bridgeford e colaboradores (2008), sugerem que a presença
de Helicobacter sp em estômago de felinos possa estar associada com o linfoma
gástrico.
Até o momento, não foram encontrados estudos que avaliassem a relação da
susceptibilidade do gato em desenvolver gastrite devido a infecção por Helicobacter
sp e seu tipo sanguíneo. Em 1950 foi descrito para felinos um sistema de grupo
sanguíneo que consistia de 2 tipos onde ocorriam naturalmente aloanticorpos. Em
1962 a nomenclatura A e B foi usada pela primeira vez. Um terceiro tipo sanguíneo
felino, o AB, foi descrito em 1980 e até hoje não houve descrição de felinos que não
possuíssem antígenos eritrocitários (tipo O ou nulo). Apesar do uso das mesmas
letras para demonstrar os tipos sanguíneos humano, não há relação sorológica entre
os grupos AB felino e o ABO humano. (Hohenhaus, 2004). Estudos feitos em vários
países mostram que a grande maioria dos gatos mestiços é do tipo sanguíneo A
(Malick, et al 2005) .
2.2.4.4 Potencial Zoonótico
Uma vez que quase todo gato adulto saudável abriga Helicobacter sp. em sua
mucosa gástrica, a possibilidade de gatos como agentes zoonóticos em potencial de
H. heilmannii pode ter importantes implicações na saúde pública (Pregel et al, 2008).
Haesebrouck
e
colaboradores
(2009)
relatam
que
as
espécies
de
Helicobacter descritas em felinos são capazes de causar patologias gástricas em
humanos e que as infecções destes são adquiridas provavelmente dos animais.
Logo, é importante estudar e determinar as espécies encontradas nos felinos para
que seu potencial zoonótico seja o mais brevemente elucidado.
21
Dieterich e colaboradores (1998), demostraram através da PCR que
Helicobacter heilmannii presente no estômago de um homem com gastrite erosiva
aguda era idêntica à encontrada no estômago de seu gato. Em outro estudo, Loon e
colaboradores (2003), identificaram através da PCR espécies idênticas de
Helicobacter heilmannii no estômago de um menino de 5 anos, que apresentava
diminuição no seu crescimento e dor abdominal, e em seus dois gatos.
El-Zaatari e colaboradores (1997), relatam que a não identificação de H. pylori
em gatos não domiciliados aliado a identificação deste em uma colônia de gatos em
contato com humanos, sugere que H. pylori em gatos seja uma antropozoonose.
2.3 ENDOSCOPIA
A gastroduodenoscopia é o método mais útil no diagnóstico da doença
gástrica porque permite a visualização direta e a biópsia da superfície do estômago
e do duodeno. Pequenas lesões que não são detectadas por radiografias
geralmente podem ser vistas com um endoscópio, corpos estranhos podem ser
removidos e amostras de biópsia, obtidas. De modo geral, este exame é indicado em
caso de vômitos persistentes, vômitos recorrentes, diarréias crônicas, perda de
peso, anorexia, tenesmo, hematêmese ou hematoquezia. A endoscopia tem a
vantagem indubitável de permitir não somente o exame visual da superfície da
mucosa, mas também a amostragem direcionada, com obtenção de inúmeras
amostras para avaliação citológica e histológica via instrumentos adequados de
biópsia. Sempre é recomendável a obtenção de amostras, mesmo quando não se
observa nenhuma alteração na mucosa (Tams, 2011).
22
3 OBJETIVOS
3.1 OBJETIVO GERAL
- Identificar a presença de Helicobacter sp e avaliar as alterações anatomohistopatológicas em amostras de mucosa gástrica de gatos domésticos de sangue
tipo A, coletadas por meio de biópsia endoscópica.
3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
1- Avaliar os aspectos clínicos e os achados macroscópicos da mucosa
gástrica por meio da endoscopia digestiva alta de gatos domésticos do grupo
sanguíneo A;
2- Detectar a presença de bactérias produtoras de urease através do teste
rápido de urease em amostras do antro, corpo e fundo gástrico, coletadas por
endoscopia, de gatos domésticos do grupo sanguíneo A;
3- Identificar a presença de bactérias do gênero Helicobacter em amostras do
antro, corpo e fundo gástrico de gatos domésticos do grupo sanguíneo A, coletadas
por endoscopia, por meio do exame bacterioscópico direto;
4- Identificar a presença de Helicobacter sp em amostras da mucosa gástrica
de gatos domésticos do grupo sanguíneo A, coletadas por endoscopia, por meio de
exame histopatológico com coloração especial de prata – método de Warthin-Starry;
23
5- Avaliar as alterações histopatológicas em amostras do antro, corpo e fundo
gástrico de gatos domésticos do grupo sanguíneo A, coletadas por endoscopia e a
sua relação com a presença de bactérias do gênero Helicobacter;
6- Verificar a densidade da colonização de bactérias do gênero Helicobacter
nas diferentes regiões gástricas de gatos domésticos do grupo sanguíneo A;
7- Relacionar a presença de Helicobacter sp com alterações macroscópicas
da mucosa gástrica de gatos domésticos do grupo sanguíneo A;
8- Identificar o grupo sanguíneo dos animais avaliados e verificar a relação
com a presença de bactérias do gênero Helicobacter;
24
4 MATERIAIS E MÉTODOS
Este trabalho foi aprovado pelo Comite de Ética no Uso de Animais (CEUA)
sob protocolo número 48 – 2011. Foi recebida autorização para realização do
estudo, pelo responsável do abrigo “Gatos do Humaitá” (em anexo).
4.1 ANIMAIS/ AMOSTRAS
Foram utilizados 32 gatos sem raça definida, 12 machos e 20 fêmeas, de
sangue tipo A, recolhidos da rua por um abrigo, para esterilização. Alguns destes
animais foram trazidos para o procedimento logo após sua captura e outros se
encontravam a poucos dias no abrigo, junto com outros gatos, se alimentando com
ração industrial. Apenas 3 animais já haviam sido adotados no momento do exame e
viviam em seus lares há mais de três meses.
Foram excluídos os gatos com menos de 2,0 quilos de peso para que o
procedimento endoscópico pudesse ser realizado sem risco de lesão no trato
gastrointestinal
25
4.2 METODOLOGIA
4.2.1 Avaliação Clínica
Os animais foram avaliados antes do procedimento observando-se a
presença de sinais de patologias que pudessem colocar suas vidas em risco devido
ao procedimento anestésico. Foram submetidos a exame clínico completo, que
constou de: avaliação da hidratação, das membranas mucosas externas, da
cavidade oral, da ausculta torácica e da palpação abdominal. Os que apresentaram
sinais de doenças sistêmicas que poderiam colocá-los em risco de morte devido ao
procedimento anestésico ou que pudessem comprometer os resultados obtidos
foram excluídos.
4.2.2- Coleta de sangue, processamento e Identificação do grupo sanguíneo
O sangue foi coletado através da veia cefálica ou femural, acondicionado em
tubo de ensaio contendo EDTA e encaminhado para o laboratório onde foi tipificado.
Para realizar este exame, associou-se 30 µl de sangue com 30 µl de Triticum
vulgaris num tubo de ensaio, para cada animal separadamente. O Triticum vulgaris é
uma lectina de germe de trigo que induz a aglutinação de células do tipo B, não
ocorrendo aglutinação se o grupo sanguíneo for A. Caso ocorra aglutinação, então o
sangue é testado com soro anti A e anti B. Se ocorrer aglutinação somente com o
anti B então o tipo sanguíneo é B e se ocorrer aglutinação com os dois soros então o
sangue é do tipo AB
4.2.3 Procedimento e Exame endoscópico
Os animais foram submetidos a jejum hídrico e alimentar de 12 horas, para
que fosse possível a realização do exame endoscópico e da anestesia geral. O
exame endoscópico e a coleta foram feitos por meio do endoscópio Pentax FG-28C
26
com canal de biopsia de 2,0 mm. Para realização do exame os animais foram
posicionados em decúbito lateral esquerdo. Durante o exame foram avaliadas as
mucosas do esôfago e estômago quanto a sua integridade, observando-se a
presença ou ausência de enantema, edema, erosões e/ou úlceras de acordo com o
sistema Sidney revisado para classificação de gastrites (Dixon et al, 1996) e
coletadas amostras da mucosa de antro, corpo e fundo gástricos. Entre cada animal
examinado, o endoscópio e as pinças utilizadas foram lavados com sabão comum e
depois submergidos em solução de glutaraldeído por um tempo superior a 20
minutos e, posteriormente, lavados com água corrente para eliminar resíduos da
solução. Os animais foram pré-anestesiados com 0,2 mg de xilazina associada a 10
mg de ketamina por via intramuscular. Depois foi feito uma associação de 12,5 mg
de ketamina, 5,0 mg de xilazina e 1,25 mg de diazepan diluídos até 5,0 ml de soro
fisiológico e aplicados por via endovenosa com dose dependente do efeito
desejado..
4.2.4 Exame bacterioscópico direto corado por fucsina fenicada
As amostras de citologia foram confeccionadas com uma escova de citologia
inserida através do canal de biópsia do endoscópio. Foi realizada uma escovação de
cada região da mucosa gástrica separadamente. Depois de ser retirada do aparelho,
a escova foi deslizada sobre uma lâmina de vidro que era seca ao ar. Para a
coloração, as amostras foram submergidas em fucsina fenicada por 60 segundos,
lavadas em água destilada e colocadas para secar. Posteriormente foram avaliadas
ao microscópio óptico com objetiva de 40X e feita a pesquisa direta de bactérias do
gênero Helicobacter que podiam ser observadas em cor rosa, sendo considerado
resultado positivo a presença de apenas uma bateria (Figura 4).
4.2.5 Teste de urease
O teste rápido de urease foi realizado imediatamente após a coleta de
amostras do antro, corpo e fundo de cada animal, que foram colocadas
separadamente em microtubos do kit comercial Uretest® do fabricante Renylab,
27
seguindo as instruções que acompanhavam o produto. A leitura foi realizada em 30
minutos, 2 horas, 8 horas e 24 horas. Foram consideradas positivas para
Helicobacter sp, as amostras que mudaram de cor do amarelo para magenta. As
amostras onde o meio se manteve em cor amarela foram consideradas negativas.
Figura 1- Microtubos com amostras gástricas para o teste rápido de urease. Microtubo com
conteúdo de cor magenta com amostra considerada positiva e Microtubo com conteúdo de cor
amarela com uma amostra negativa.
4.2.6 Processamento histológico e exame histopatológico
As amostras foram fixadas em formol tamponado a 10%, processadas e
incluídas em parafina. Foram realizadas secções histológicas de 3 a 5 µm de
espessura, coradas pelas técnicas de Hematoxilina e Eosina (HE) e coloração de
prata (Warthin-Starry - WS). Posteriormente foram analisadas através de
microscopia óptica por dois observadores.
A contagem de Helicobacter sp foi feita utilizando as amostras coradas pela
prata pelo método de Warthin-Starry- WS, com microscópio óptico, usando objetiva
de 40X em cinco campos e atribuindo um escore à quantidade de bactérias
encontrada. O escore estabelecido foi o mesmo utilizado por Araujo (2002) em seu
28
estudo que atribuía o valor 0 quando não houvesse presença de bactérias,
1
quando fossem observadas de uma a nove bactérias, 2 quando fossem observadas
de dez a cinqüenta bactérias, 3 para cinqüenta e uma a cem bactérias, 4 para
cento e uma a duzentas e 5 para mais de duzentas bactérias.
Para análise da presença de infiltrado de células inflamatórias os critérios
utilizados foram classificação em normal, leve, moderada e intensa. Foi avaliado
também se havia hiperplasia de folículos linfóides. Para o infiltrado inflamatório, foi
usado um escore de 0 a 3, onde o 0 era considerado sem alteração com uma
contagem de até 10 células inflamatórias por campo em objetiva de 40X, 1 era o
escore para infiltrado inflamatório leve com média de 10 a 50 células inflamatórias
por campo, escore 2 para infiltrado inflamatório moderado com média de 51 a 100
células por campo e escore 3 com média de mais de 100 células inflamatórias por
campo (Araujo, 2002).
4.3 ANÁLISE ESTATÍSTICA
Foi realizada uma análise exploratória sobre as variáveis disponíveis no
banco de dados. Foi utilizado o teste de qui-quadrado ou o teste exato de Fisher
para comparar grupos independentes (de sexo - já que o tipo sanguíneo foi igual
entre os animais) quanto aos resultados nos testes (citologia, urease, etc).
Foi utilizado o teste de McNemar para comparar concordância entre testes
cujos resultados possuíam apenas duas categorias e foi utilizado o Coeficiente de
Cramer para verificar associação entre variáveis qualitativas, considerando aqueles
testes que tinham mais do que um resultado possível. O nível de significância
adotado em todos os testes foi de 5%.
29
5 RESULTADOS
Este trabalho utilizou 32 gatos, 20 fêmeas e 12 machos, com peso acima de
dois quilos. Três destes gatos viviam em domicílio há 3 meses e o restante eram
animais não domiciliados.
Na avaliação da tipagem sanguínea não houve aglutinação na presença de
lectina em nenhuma das amostras testadas, levando a concluir que todos os animais
testados eram do grupo sanguíneo A.
Dos 32 animais avaliados no exame endoscópico, 8/32 (25%) apresentaram
alteração. Observou-se gastrite leve em 6/32 animais, sendo que 2/32 estavam com
enantema leve em antro, 1/32 com enantema leve em fundo, 1/32 com uma erosão e
uma pequena úlcera em corpo, 2/32 com pequena erosão no fundo e 2/32 animais
apresentaram pangastrite moderada com edema e enantema. Um dos gatos que
apresentou pangastrite era um dos 3/32 animais que viviam em domicílio . Os outros
24 animais não apresentaram alteração macroscópica em suas mucosas gástricas
as quais se apresentavam íntegras, com cor rosa pálido e com pregas suaves na
região do corpo.
30
No teste de urease, apenas um dos 32 animais, não apresentou mudança da
cor do meio nas 3 regiões gástricas, levando a um percentual de 3,1 %. Todas as
outras amostras de todos os gatos mudaram a cor do meio conferindo ao teste
resultado positivo para Helicobacter sp . Para as amostras do antro, 17 mudaram
para a cor magenta em até 30 minutos, 5 entre 30 minutos e 2 horas e 9 entre 2 e 8
horas. Para as amostras de corpo as mudanças ocorreram em até 30 minutos para
12 amostras, entre 30 minutos e 2 horas para 10 amostras e entre 2 e 8 horas para 9
amostras. Nas amostras do fundo gástrico, 19 amostras mudaram a tonalidade do
meio para magenta em até 30 minutos, 5 amostras entre 30 minutos e 2 horas e 7
amostras entre 2 e 8 horas. Neste teste, a mudança de cor indicando positividade
para Helicobacter sp variou entre as regiões gástricas apresentando maior
percentual para até 30 minutos em todas as regiões e se tornando magenta em até
duas horas para mais de 70% das amostras em todas as regiões (tabela 1).
Tabela 1- Resultado do teste da urease – relação entre tempo decorrido até a mudança de cor
do meio e percentual de amostras de cada região gástrica indicando positividade para
Helicobacter sp em gatos domésticos, UFF,2012.
Tempo até mudança
de cor
Região gástrica
Antro
Corpo
Fundo
Até 30 min
17 (54,8 %)
12 (38,7 %)
19 (61,3 %)
De 30 min a 2 h
5 (16,1 %)
10 (32,2 %)
5 (16,1 %)
De 2 h a 8 h
9 (29,1 %)
9 (29,1 %)
7 (22,6 %)
1
1
1
Negativo
Na citologia verificou-se a presença de Helicobacter sp em todas as amostras,
de todas as regiões, de todos os animais avaliados o que confere um percentual de
100% dos resultados positivos. Houve variação entre a quantidade de bactérias
observadas em cada amostra da citologia, porém sendo considerado como positivo,
em presença de pelo menos uma bactéria (figura 4).
Em algumas amostras de histopatologia coradas por HE foi possível observar
a presença de grande quantidade de Helicobacter sp localizada no lúmen das
glândulas gástricas e principalmente no muco (figura 3 – A). Nesta coloração a
bactéria apresentou-se com coloração rosada semelhante ao tecido adjacente, com
31
espessura fina e forma espiralada, podendo ter sua identificação dificultada devido a
sua coloração ser semelhante a outras estruturas do tecido da amostra gástrica. Isto
torna difícil sua visualização podendo levar a um resultado falso positivo. Nas
amostras onde não havia grande concentração de Helicobacter sp, sua observação
não foi possível.
Todas as amostras da mucosa de antro, corpo e fundo gástricos coradas pela
coloração de prata – WS, dos 32 animais avaliados, revelaram a presença de
Helicobacter sp, confirmando o resultado observado na citologia.
No exame microscópico das amostras gástricas coradas pela prata (WS) foi
observada uma variação quanto ao tamanho e a forma espiralada de Helicobacter
sp coradas em preto, devido à impregnação pela prata. Em algumas amostras
densamente colonizadas foram observadas Helicobacter sp formando grumos o que
em alguns campos dificultou a contagem, tendo sido feita uma estimativa do seu
número (figura 3- B, C, D, E e F).
Na avaliação quantitativa das amostras gástricas pela coloração de prata
(WS), o corpo foi a região que continha maior número de bactérias Helicobacter sp
com 46,8% das amostras apresentando escore 5. O antro apresentou uma menor
variação de escore entre suas amostras gástricas com 21,9 % nos escores 2, 3 e 5.
A região do fundo apresentou 34,4 % das suas amostras com escore 4 e o mesmo
percentual no escore 5. Em todas as regiões, mais de 50 % das amostras se
encontraram nos escores 4 e 5. (Tabela 2).
Tabela 2- Percentual de amostras de cada região gástrica em relação ao escore da quantidade
de Helicobacter sp encontrado na histopatologia corada pela coloração de prata – WS, de
gatos domésticos, UFF,2012.
Região gástrica
Escore da quantidade de Helicobacter sp encontrada
1
2
3
4
5
Antro
3,1 %
21,9 %
21,9 %
31,2 %
21,9 %
Corpo
6,3 %
15,6 %
9,4 %
21,9 %
46,8 %
fundo
3,1 %
15,6 %
12,5 %
34,4 %
34,4 %
32
Nos exames para pesquisa da presença da bactéria Helicobacter sp como o
citológico e o histopatológico corado pela prata - WS, pôde ser observada a
presença de Helicobacter sp em todas as amostras de todas as regiões dos 32
gatos, não sendo observados portanto, resultados negativos.
Não houve associação entre sexo, infecção e densidade de colonização, pois
todos eles apresentaram Helicobacter sp em seus estômagos, sendo que a maioria
apresentou escores elevados.
A avaliação histopatológica das amostras gástricas coradas por HE mostrou
que a alteração mais freqüente foi o infiltrado inflamatório predominantemente de
células mononucleares (linfócitos e plasmócitos), que estava presente em pelo
menos uma região gástrica de 87,5% dos animais. Apenas 4 dos 32 animais não
apresentaram infiltrado de células mononucleares em nenhuma das regiões
gástricas, o que representou um percentual de 12,5%. Em seguida pode ser
observada a hiperplasia de folículos linfóides, que estava presente em 3/ 32 gatos,
isto é, 9,4% dos animais. (Figura 2 – A e B).
Em relação ao infiltrado inflamatório, foi observado que 8 amostras da região
de antro, 11 da região de corpo e 9 da região de fundo gástrico, apresentaram
escore 0. O escore 1, que representa infiltrado inflamatório leve de células
mononucleares foi encontrado em 24 amostras gástricas do antro, em 20 amostras
gástricas do corpo e em 21 amostras gástricas do fundo. Para o escore 2, somente
uma amostra gástrica da região de corpo e 2 amostras gástricas da região de fundo.
Não foram encontradas amostras das diferentes regiões gástricas com escore 3
(Tabela 3).
Tabela 3 - Escore de intensidade de infiltrado inflamatório predominantemente de células
mononucleares e seu percentual em relação à região gástrica de gatos domésticos positivos
para Helicobacter sp, UFF, 2012
Escore de intensidade de infiltrado inflamatório
Região gástrica
0
1
2
3
Antro
8 (25,0 %)
24 (75,0 %)
0
0
Corpo
11 (34,4 %)
20 (62,5 %)
1 (3,1 %)
0
Fundo
9 (28,1 %)
21 (65,6 %)
2 (6,3 %)
0
33
Mais de 50% das amostras de todas as regiões gástricas apresentaram
infiltrado inflamatório leve de células mononucleares e somente 4 animais tiveram
escore 0 para todas as regiões. Os outros animais que apresentaram escore 0 em
uma região gástrica tinham o escore 1 em pelo menos uma das outras regiões o que
representou um percentual de 87,5 % dos animais com infiltrado inflamatório leve em
pelo menos uma região gástrica. Não houve correlação entre o escore de
colonização e o infiltrado inflamatório em nenhuma das regiões gástricas que
apresentaram p= 0,454 no antro, p=0,195 no corpo e p=0,501 no fundo
representados no gráfico 1.
HE X WS
Antro – p= 0,454
Corpo - p= 0,1 95
Fundo- p= 0,501
HE- Antro
HE- Corpo
HE- Fundo
Gráfico 1- Relação entre o infiltrado inflamatório e o escore de colonização nas
regiões gástricas
Na avaliação de folículos linfóides, algumas amostras gástricas foram
consideradas insuficientes para esta análise, por não atingirem espessura
satisfatória para observação adequada da lâmina própria, o que pode ter levado a
uma contagem não fidedigna de folículos hiperplásicos.
A presença de hiperplasia dos folículos linfóides, foi observada somente em 3
amostras de antro, 1 de corpo e 3 de fundo o que representa 9,4%, 3,1% e 9,4% do
total das amostras gástricas respectivamente. Destas amostras, uma de fundo e
uma de corpo pertenciam a um mesmo animal, e uma outra amostra de fundo com
34
uma de antro pertenciam a um outro animal. Logo, foi encontrado está alteração em
apenas 3 dos 32 animais avaliados.
A
C
B
D
Figura 2- Fotomicrografias do antro gástrico de gatos domésticos. A-B:Gato n° 33 - presença de
folículo linfóide; C: Gato n° 31 e D: Gato n° 5 - presença de infiltrado inflamatório de células
mononucleares na lâmina própria da mucosa (A-D- HE; A 40X original; B - 100X original; C, D
400X original)
35
A
B
B
C
D
E
F
Figura 3- A-F: Fotomicrografia da mucosa gástrica de gatos domésticos. A: Gato n° 5, região do
corpo gástrico mostrando a presença de estruturas espiraladas róseas semelhantes ao
Helicobacter sp; B: Gato nº 30 região do fundo gástrico, mostrando estruturas espiraladas
marcadas em preto - Helicobacter SP no muco. C: Gato n° 9, região do corpo gástrico, mostrando
grande quantidade de estruturas espiraladas marcadas em preto - Helicobacter sp no muco. D:
Gato n°9, região do fundo gástrico, mostrando estruturas espiraladas marcadas em preto Helicobacter sp no lúmen glandular. E: Gato n° 28, região do fundo gástrico, mostrando a bactéria
espiralada em preto - Helicobacter sp na célula epitelial (setas). F: Gato n°30, região do corpo
gástrico, mostrando estruturas espiraladas marcadas em preto - Helicobacter sp em tamanhos
variados. (A : HE; B, C, D, E e F: Coloração de Prata – WS; A, B, C, D, E e F:400X original).
36
Figura 4 - Fotomicrografias do esfregaço citológico da mucosa do antro gástrico, Gato
n°8 - Presença de estruturas espiraladas roseas semelhantes ao Helicobacter sp.
coloração de Fucsina Fenicada; objetiva 100X (original)
37
6 DISCUSSÃO
Neste trabalho, os gatos avaliados pesavam mais de 2,0 quilos, pois não era
adequado fazer endoscopia com o aparelho utilizado em animais muito pequenos,
para que não houvesse risco de lesão. Não houve associação entre sexo, infecção e
densidade de colonização, pois todos eles apresentaram Helicobacter sp em seus
estômagos, sendo que a maioria apresentou escores elevados. Akhtardanesh e
colaboradores (2006) fizeram um estudo em gatos domiciliados e não domiciliados,
com machos e fêmeas, acima de 6 meses de idade. Neste estudo, não encontraram
associação entre sexo, infecção e densidade de colonização em nenhum dos grupos
estudados, resultado semelhante ao presente estudo, onde esta associação também
não foi observada.
Jaff e colaboradores (2011) realizaram um estudo em humanos com sintomas
gástricos que teve como objetivo verificar a frequência dos grupos sanguíneos ABO
com a soropositividade para Helicobacter pylori e concluíram que pessoas do grupo
sanguíneo O são mais susceptíveis às infecções por Helicobacter pylori e suas
complicações gastrointestinais e/ou têm mais respostas celular e imunológica
expressada pela soropositividade do que indivíduos dos outros grupos ABO.
Estudos que determinam os grupos sanguíneos dos gatos domésticos em vários
países mostram que, em média, mais de 90% dos gatos domésticos pertencem ao
grupo sanguíneo A (Hohenhaus, 2004), mas não foi encontrado, até o presente
momento, algum estudo que relacionasse o grupo sanguíneo com a infecção por
Helicobacter sp e a relação com processo inflamatório, então ainda é necessário
38
fazer pesquisas para avaliar se o grupo B e AB seriam mais susceptíveis. Segundo
Medeiros (2008), que estudou a freqüência de cada grupo, dos gatos sem raça
definida na cidade do Rio de Janeiro, a grande maioria dos animais pertence ao
grupo sanguíneo A. Em seu estudo, o percentual ficou estabelecido em 94,8% para
o grupo A, 2,9% para o grupo B e 2,3% para o grupo AB, logo, o presente trabalho
foi realizado com animais do grupo A por ser a grande maioria dos gatos sem raça
definida da cidade do Rio de Janeiro. Neste trabalho achamos 100% de gatos
infectados pelo por Helicobacter sp., com a maioria deles apresentando apenas
gastrite leve. Uma característica que pode contribuir para a disseminação de
microorganismos entre os felinos, entre elas Helicobacter spp, é o hábito de se
lamberem mutuamente.
Como uma das supostas vias de transmissão destas
bactérias é a transmissão direta por via oral, isto explicaria o alto percentual de
animais infectados encontrados nos diferentes estudos.
As alterações macroscópicas nas mucosas de 8 dos 32 gatos avaliados por
endoscopia, levando a um percentual de 25%, foram um resultado semelhante a
Araujo (2010) que também avaliou gatos não domiciliados, porém este percentual foi
maior que Neiger e colaboradores (1998) que avaliaram gatos domiciliados e De
Majo e colaboradores (1998) que estudaram gatos de abrigo, observando mucosa
normal em quase todos os gatos avaliados.
As pequenas amostras gástricas de gatos coletadas por um endoscópio
pediátrico de 9.0 mm de diâmetro com canal de biópsia de 2.0 mm foram adequadas
para fornecer o resultado para o teste rápido de urease, citologia e histopatologia
convencional pela coloração de prata – WS na avaliação da infecção pelo
Helicobacter sp. Algumas amostras gástricas não apresentaram espessura suficiente
para observar toda a extensão da lâmina própria, o que pode ter diminuído o real
número de folículos linfóides hiperplásicos, achado semelhante a Strauss- Ayali e
colaboradores
(2001),
Papasouliotis
e
colaboradores
(1997)
e
Neiger
e
colaboradores (1998) que também relataram percentual menor de folículos
hiperplásicos, provavelmente devido ao tamanho da amostra gástricas endoscópica
de gatos, porém a maior parte das amostras apresentou-se satisfatória. Devido a
isto, não foi possível avaliar a relação entre a infecção por Helicobacter sp e a
hiperplasia dos folículos linfóides. Estudos que avaliaram toda a espessura da
mucosa gástrica, coletada em necropsia de gatos, relataram correlação entre a
39
infecção e a hiperplasia dos folículos linfóides (Otto et al , 1994; Happonen et al
,1996, Araujo, 2002) embora em Araujo e colaboradores (2010), que avaliaram a
mucosa gástrica de 56 gatos, esta relação não tenha sido observada.
Neste trabalho foi observada alta frequência de Helicobacter sp nas amostras
gástricas de gatos o que está de acordo com várias outras pesquisas feitas em
diferentes países (Geyer et al,1993; Papasouliotis et al, 1997; Yamasaki et al 1998;
Neiger et al 1998; Camargo, 2002; Van Den Bulck et al, 2005b; Takemura, 2007;
Araujo et al, 2010).
Segundo Araujo (2002), a sensibilidade e a especificidade do teste de
urease, dependem do tempo em que a leitura é feita. Quando o teste é lido em até
uma hora a especificidade é ótima, mas a sensibilidade não. Se a leitura é feita em
24 horas a sensibilidade aumenta, mas a especificidade diminui, devido à
possibilidade de contaminação por outras bactérias produtoras de urease.
Happonem e colaboradores (1996) compararam diferentes métodos de diagnóstico
para identificar Helicobacter sp em cães e gatos e relataram que a sensibilidade do
teste da urease em gatos foi de 94% para as leituras feitas aos 30 minutos e 100%
para as leituras feitas aos 60 minutos e a especificidade foi de 100%. Araujo (2002)
usou o teste de urease para detectar Helicobacter sp em gatos, fazendo a leitura em
24 horas para aumentar a sensibilidade, porém, encontrando um percentual de 20%
de resultados falso-negativos. No presente estudo, foi observada uma alta
sensibilidade do teste de urease, uma vez que mais de 70% do total de amostras
apresentou resultado positivo em até 2 horas, e o restante das amostras em até 8
horas concordando com Happonem e colaboradores (1996).
Nas avaliações citopatológica e histopatológica pela coloração de prata - WS
foi constatada uma taxa de 100% de infecção de Helicobacter sp na mucosa gástrica
de gatos em ambos testes, mostrando que estes testes tiveram sensibilidade mais
alta que o teste rápido de urease, que apresentou 3,1% de seus resultados
negativos. Este percentual representou apenas um animal, o qual foi considerado
um falso-negativo, uma vez que a citologia e o exame histopatológico com coloração
de prata revelaram a presença de Helicobacter sp. Araujo (2002) obteve resultados
diferentes e concluiu que a citologia é um método sensível e de rápido diagnóstico,
mas que a coloração pela prata é mais sensível e específica para detecção de
Helicobacter sp, tendo sido superior em 14,3% das amostras dos gatos avaliados.
40
Mégraud (1996), que comparou diferentes testes diagnósticos para detecção
de H. pylori, em amostras gástricas de humanos, recomenda que sejam
considerados positivos os casos que indiquem a presença de Helicobacter sp em
pelo menos 2 testes diagnósticos, para que os resultados falso-positivos e falsonegativos não influenciem nos resultados, o que está de acordo com Araujo (2002).
Desta maneira, o presente estudo obteve resultado de 100% de gatos com presença
da Helicobacter sp em suas mucosas gástricas, evidenciando uma alta freqüência de
infecção, resultado igual ao de Papasouliotis e colaboradores (1997) e Camargo
(2002), que também relataram um percentual de 100% de infecção por Helicobacter
sp em mucosas gástricas de gatos em suas pesquisas e semelhante também aos
relatos de Takemura (2007) e Araujo e colaboradores (2010).
O único animal que apresentou resultado negativo no teste rápido de urease
teve resultados positivo nos exames de citologia e histopatologia corada pela
coloração de prata - WS, com número reduzido de bactérias, atingindo apenas o
escore 1 em todas as regiões gástricas. Este escore baixo pode ter levado a um
resultado falso-negativo no teste da urease. Isto mostra que a coloração pela prata
tem alta sensibilidade e, em concordância com Takemura (2007), ressalta que o
teste rápido da urease, apesar de também ter alta sensibilidade, não deve ser usado
como único método para o diagnóstico de Helicobacter sp necessitando ser
confirmado por outros testes, como relatado por Mégraud (1996).
Apenas 3 gatos deste estudo já estavam vivendo em domicílio após serem
resgatados da rua, sendo que 2 deles estavam no mesmo lar há mais de três meses.
Um destes gatos foi o que apresentou menor colonização na coloração de prata WS, tendo escore 1 em todas as regiões gástricas e foi o único animal a apresentar
resultado negativo no teste rápido de urease. O outro gato deste domicílio
apresentou mudança de cor no teste de urease em 30 minutos em todas as regiões
gástricas e alto grau colonização na histopatologia corada pela coloração de prata WS chegando ao escore 5 na região do corpo. O outro gato domiciliado vivia com
mais um gato e apresentou escores de colonização 3 para antro, 4 para fundo e 5
para corpo. Os resultados da colonização por Helicobacter sp e infiltrado inflamatório
na mucosa gástrica encontrados nos animais domiciliados, são semelhantes aos dos
animais não domiciliados, resultado semelhante a Akhtardanesh e colaboradores
(2006) que estudou a alterações causadas pelo Helicobacter sp em gatos não
41
domiciliados e gatos de companhia e também não observou diferença entre as
categorias.
O maior percentual de colonização pela Helicobacter sp na mucosa gástrica
de gatos foi observado nas regiões de corpo e fundo gástrico, concordando com
outros trabalhos em felinos, como Takemura (2009) e Araujo e colaboradores
(2010), que observaram o mesmo resultado em seus estudos. Se considerarmos
que, neste estudo, mais de 50% de todas as regiões atingiram os escores 4 e 5 e o
percentual mais alto para o escore 1 foi de 6,3% das amostras na região do corpo
podemos dizer que os gatos não domiciliados tem suas mucosas gástricas com
colonizações por Helicobacter
sp de moderadas a intensas. A observação das
amostras com coloração de prata, revelou escores semelhantes entre as 3 regiões
gástricas avaliadas, sugerindo uma colonização homogênea, resultado também
observado por Camargo (2002) e Takemura (2007).
A presença de infiltrado inflamatório discreto a moderado nas diferentes
regiões gástricas é semelhante a outros estudos (Geyer et al, 1993; Araujo, 2002;
Camargo, 2002; Takemura, 2007). No presente estudo não houve associação entre
a intensidade da colonização e o grau do infiltrado inflamatório, resultado relatado
também por Neiger et al (1998), Akhtardanesh et al (2006) e Takemura (2007),
porém em desacordo com Otto et al (1994) e Happonen et al (1996), que relataram
esta associação. Isto sugere que as diferentes espécies de Helicobacter possam
desencadear diferentes intensidades de respostas inflamatórias, uma vez que
nestes estudos não houve identificação em nível de espécie.
Os dois gatos diagnosticados com pangastrite moderada enantematosa ao
exame endoscópico, tiveram apenas infiltrado leve de células mononucleares e um
deles apresentou hiperplasia de folículo linfóide, o que leva a cocluir que o escore de
infiltrado inflamatório não é diretamente proporcional ao grau endoscópico da
gastrite. Porém, deve-se levar em consideração, que o aspecto macroscópico do
enantema moderado, pode estar relacionado a uma gastrite aguda causada por
fatores diferentes da infecção por Helicobacter sp, e como um destes animais era
não domiciliado, causas como indiscriminação alimentar pode ter levado às
alterações. O outro que apresentou este quadro era um dos três animais que já
viviam em domicílio quando o exame foi realizado e é possível que as alterações
observadas em sua mucosa gástrica se deva a presença de Helicobacter sp.
42
Em algumas amostras coradas por HE era possível observar Helicobacter sp,
porém sua visualização era dificultada devido à coloração das bactérias ser
semelhante ao tecido adjacente. Eram mais facilmente visualizadas quando estavam
em grande quantidade no muco. Custódio e colaboradores (2005) relatam uma
superioridade da citologia para diagnosticar H. pylori., sobre a histopatologia corada
por HE, o que também foi observado no presente trabalho. Nas amostras com
coloração de prata, a visualização da bactéria foi muito mais fácil, pois elas se
coravam de preto, contrastando com o tecido, que ficava corado em amarelo e
marrom claro. Nesta coloração então, as bactérias puderam ser observadas em
vários sítios e estruturas, como no muco, no lúmen das glândulas gástricas, nas
fossetas gástricas, no interior das células e na lâmina própria da mucosa.
A hiperplasia de folículos linfóides foi encontrada em somente 3 animais, o
que representa 9,4% do total de animais estudados. Este resultado é inferior ao
encontrado por Araujo (2002) e Araujo e colaboradores (2010), cujos resultados
foram de 59,6% e 57%, respectivamente, de animais apresentando hiperplasia de
folículo em pelo menos uma região gástrica. O presente estudo foi feito a partir de
amostras endoscópicas, que por serem muito pequenas, podem não conter toda a
camada mucosa, o que leva à possibilidade da não coleta de áreas com folículos
linfóides e dessa forma, o número dessas estruturas presentes nas amostras pode
ter sido subestimado.
Scanziani e colaboradores (2001) observaram que as diferentes espécies de
Helicobacter e as diferentes cepas da mesma espécie, podem causar alterações não
similares nas diferentes regiões gástricas. As alterações causadas por H. pylori e H.
felis são mais intensas do que as causadas por H. heilmanni. Gatos infectados por
H. pylori apresentam sinais de inflamação gástrica crônica caracterizada por
hiperplasia folicular linfóide severa e infiltrado inflamatório leve a moderado. As
lesões presentes em gatos infectados por H. felis, eram caracterizadas por
hiperplasia folicular linfóide com infiltrado de mononucleares leve difuso. Infiltrado
inflamatório leve estava presente nos gatos infectados com H. heilmannii. No
presente trabalho, é provável que a maioria dos gatos estivesse infectada por H.
heilmannii ou por outros GHLOs não tão patogênicos quanto H. pylori e H. felis, o
que explicaria a ausência de alterações histopatológicas mais intensas.
43
Para verificar se existe influência do grupo sanguíneo e patogenia do
Helicobacter sp em felinos, como existe em humanos, estudos com gatos dos
grupos B e AB precisam ser realizados.
Levando-se em consideração todo o conhecimento que se tem sobre H. pylori
e o quanto ainda falta saber sobre as outras espécies de Helicobacter, sua
patogenicidade e seu papel na indução da gastrite nos felinos e em outros animais,
é importante que GHLOs sejam estudado para esclarecer todas as dúvidas que
acercam este microrganismo, pois nos últimos anos, os felinos vem sendo cada vez
mais consideraods como animais de companhia pelos humanos.
44
7 CONCLUSÃO
- A frequência de Helicobacter sp em felinos domésticos não domiciliados, do
grupo sanguíneo A, na cidade do Rio de Janeiro foi alta.
- O teste da urease pode apresentar resultado falso-negativo devendo ter
resultado comparado com outros exames, como o citológico e o histopatológico,
especialmente com coloração de prata, pelo método de WS.
- As diferentes regiões gástricas dos gatos domésticos do grupo sanguíneo A,
são colonizadas de forma semelhante quanto à densidade de Helicobacter sp.
- A presença de infiltrado inflamatório linfoplasmocitário nos gatos do grupo
sanguíneo A, infectados por Helicobacter sp. não apresenta relação com a
densidade da colonização bacteriana na mucosa gástrica.
- Gatos de sexos diferentes podem apresentar densidade semelhante de
colonização por Helicobacter sp. na mucosa gástrica.
45
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