UNIVERSIDADE ESTADUAL DO CEARÁ
PRÓ-REITORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO E PESQUISA
FACULDADE DE VETERINÁRIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS VETERINÁRIAS
LINA RAQUEL SANTOS ARAÚJO
USO DE DILUENTES ALTERNATIVOS A BAIXAS TEMPERATURAS
NA MANUTENÇÃO DA QUALIDADE ESPERMÁTICA
DO SÊMEN SUÍNO
FORTALEZA
2012
LINA RAQUEL SANTOS ARAÚJO
USO DE DILUENTES ALTERNATIVOS A BAIXAS TEMPERATURAS NA
MANUTENÇÃO DA QUALIDADE ESPERMÁTICA
DO SÊMEN SUÍNO
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em
Ciências Veterinárias da Faculdade de Veterinária da
Universidade Estadual do Ceará, como requisito parcial para
a obtenção do grau de Mestre em Ciências Veterinárias.
Área de Concentração: Reprodução e Sanidade Animal.
Linha de Pesquisa: Reprodução e sanidade carnívoros,
onívoros, herbívoros e aves
Orientador: Prof. Dr. Ricardo Toniolli
FORTALEZA
2012
Dados Internacionais de Catalogação na Publicação
Universidade Estadual do Ceará
Biblioteca Central Prof. Antônio Martins Filho
A663u
Araújo, Lina Raquel Santos
Uso de diluentes alternativos a baixas temperaturas na
manutenção da qualidade espermática do sêmen suíno / Lina
Raquel Santos Araújo. – 2012.
92 f. : il. color., enc. ; 30 cm.
Dissertação (Mestrado) – Universidade Estadual do Ceará,
Faculdade de Medicina Veterinária, Curso de Mestrado Acadêmico
em Ciências Veterinárias, Fortaleza, 2012.
Área de Concentração: Reprodução e sanidade animal.
Orientação: Prof. Dr. Ricardo Toniolli.
1. Água de coco. 2. Leite em pó desnatado. 3. Trolox. 4.
Betaína. 5. Sêmen suíno. I. Título.
CDD: 636.089
LINA RAQUEL SANTOS ARAÚJO
USO DE DILUENTES ALTERNATIVOS A BAIXAS TEMPERATURAS NA
MANUTENÇÃO DA QUALIDADE ESPERMÁTICA
DO SÊMEN SUÍNO
Dissertação apresentada ao Programa de Pós- Graduação
em Ciências Veterinárias da Faculdade de Veterinária da
Universidade Estadual do Ceará, como requisito parcial
para a obtenção do grau de Mestre em Ciências
Veterinárias.
Aprovada em: 29/ 06/ 2012.
BANCA EXAMINADORA
_________________________________
Prof. Dr. Ricardo Toniolli
Universidade Estadual do Ceará
Orientador
_________________________________
Prof. Dr. Airton Alencar de Araújo
Universidade Estadual do Ceará
Examinador
_______________________________
Dra. Maria Gorete Flores Salles
Lar Antônio de Pádua
Examinadora
3
DEDICATÓRIA
Ao meu pai, que aplaudia minhas
conquistas, embora minúsculas fossem e que
sempre me fez acreditar que poderia mais...
4
AGRADECIMENTOS
À Deus, por sempre iluminar meus caminhos...
À Universidade Estadual do Ceará, pelo conhecimento adquirido neste curso de Pósgraduação em Ciências Veterinárias
À CAPES pelo apoio financeiro
À minha família, pelo apoio e encorajamento
Ao meu “Bixinho”, por ter tentado me aguentar e me compreender em meus momentos de
estresse e também por sua amizade e companheirismo
Ao professor Dr. Ricardo Toniolli, pelos ensinamentos, orientação e paciência com a minha
readaptação á pesquisa científica
Ao professor Dr. José Nailton Bezerra Evangelista, pelo apoio, sugestões, orientação
continuada, sobretudo por sua amizade
Ao Jocemar por sua gentileza, pontualidade e colaboração.
À técnica Rocilda pelo auxílio e por sua alegria em comemorar a vida!
Aos meus sempre amigos, que certamente compreenderão minha ausência durante essa fase
Ao Laboratório constituído pelo nosso heterogêneo, completo e divertido grupo formado pelo
Prof. Claudio, Tatyanne, Aline, Daianny, Ludymilla, Eduardo, Thalles, Ramon, Renata e
Cristina.
A todos vocês, muito obrigada!
5
RESUMO
Inúmeros trabalhos tem sido realizados com o propósito de melhorar a conservação do sêmen
suíno, seja com o uso de diluentes ou faixas de temperaturas alternativas, ou ainda
adicionando antioxidantes ou aminoácidos ao diluente. O presente estudo teve por objetivo
definir um diluente e temperatura alternativa de conservação do sêmen suíno e avaliar os
efeitos da inclusão de trolox ou betaína na manutenção da qualidade espermática. O sêmen de
oito reprodutores foram coletados semanalmente através da técnica da mão enluvada e no
laboratório foram submetidos às análises de vigor e motilidade no dia da coleta e durante o
período de conservação (D0 a D4), avaliados quanto a vitalidade, integridade de acrossoma e
teste hiposmótico no D0 e D4. Inicialmente os ejaculados foram conservados em três
diluentes: Beltsville Thawing Solution (BTS), água de coco em pó (ACP) e leite em pó
desnatado (LPD); e submetidos a duas temperaturas de armazenamento 17 e 10 °C,
totalizando seis tratamentos. Definido o melhor tratamento, adicionou-se três diferentes
concentrações de trolox (1000, 2000 e 3000 µM/ 100 mL) e de betaína (1, 2 e 3g/ 100 mL).
Dos diluentes testados, o LPD a 10 °C proporcionou uma melhor conservação da motilidade e
vigor espermáticos, além de maior taxa de vitalidade e maior percentual de células com
acrossoma íntegro. Diante desses resultados, o LPD a 10 °C apresentou-se como melhor
diluente para a realização das etapas seguintes. As amostras acrescidas de diferentes
concentrações de trolox não foram melhores quando comparadas ao tratamento controle em
nenhuma das análises realizadas. Concentrações elevadas de trolox (2000 e 3000 µM)
apresentaram efeitos negativos sobre o vigor e a motilidade espermática. Quanto às amostras
acrescidas de betaína, também não foram observados efeitos benéficos. A betaína
provavelmente devido a seus efeitos osmóticos, reduziu o vigor e motilidade das amostras,
esse efeito foi maior quando se elevou a concentração desse aminoácido. O LPD pode ser
utilizado como diluente para o sêmen suíno acondicionado a 10 °C para ser utilizado por até
24 horas após a diluição. Não se pode comprovar os efeitos benéficos do trolox na
conservação do sêmen suíno em meio à base de LPD. E a betaína apresentou efeitos negativos
sobre a qualidade espermática quando adicionada ao diluente à base de LPD, em
concentrações acima de 1% em temperatura de conservação a 10 °C.
Palavras-chave: Sêmen suíno, água de coco em pó, leite em pó desnatado, antioxidantes.
6
ABSTRACT
Countless studies have been conducted with the purpose of improving the conservation of
boar semen, either with the use of diluents or alternative temperature ranges, or adding
antioxidants or amino acid to the diluent. The present study aimed to define an alternative
diluent and temperature preservation of boar semen and evaluate the effects of adding trolox
or betaine in the maintenance of sperm quality. The semen of eight boars were collected
weekly through the gloved hand technique and underwent laboratory analysis of vigor and
motility on the day of collection and during the storage period (D0 to D4), evaluated for
vitality, acrosome integrity and test hyposmotic on D0 and D4. Initially, the ejaculates were
preserved in three diluents: BTS, water coconut powder (ACP) and skimmed milk powder
(LPD) and subjected to two storage temperatures 17 and 10 °C, a total of six treatments. The
best defined of these treatment was added three different concentrations of trolox (1000, 2000
and 3000 μM/ 100 mL) and betaine (1, 2 and 3g / 100 mL). Of the diluents tested, the LPD 10
°C provided better preservation of the spermatic motility and vigor, and higher rate of vitality
and a higher percentage of cells with intact acrosome. Given these results, the LPD 10 ° C
presented as the best diluent to perform the following steps. The samples added with different
concentrations of trolox were no better when compared to control treatment in any of the
analyzes. High concentrations of trolox (2000 and 3000 μM) had negative effects on the vigor
and sperm motility. The samples added with betaine, were not observed beneficial effects.
Betaine likely due to its osmotic effects, reduced vigor and motility of the samples, this effect
was greater when it increased the concentration of this amino acid. The LPD can be used as a
diluent for boar semen conditioned at 10 °C to be used for up to 24 hours after dilution. You
cannot prove the beneficial effects of trolox in the preservation of boar semen in medium
based on LPD. And betaine had detrimental effects on sperm quality when added to the
diluent based on the LPD, at concentrations above 1% by storage temperature to 10 °C.
Keywords: Boar semen, coconut powdered water, skimmed powdered milk, antioxidant.
7
LISTA DE TABELAS
CAPITULO II
Tabela 1: Vigor espermático do sêmen suíno conservado durante cinco dias em
diferentes temperaturas (17 e 10 °C) nos diluentes BTS, ACP-103® e
LPD...................................................................................................................
50
Tabela 2: Total de espermatozoides móveis (%) do sêmen suíno conservado durante
cinco dias em diferentes temperaturas (17 e 10 °C) nos diluentes BTS, ACP103® e LPD........................................................................................................
52
Tabela 3: Total de espermatozoides vivos (vitalidade %) do sêmen suíno, conservado
durante cinco dias em diferentes temperaturas (17 e 10 °C) nos diluentes
BTS, ACP-103® e LPD.....................................................................................
56
Tabela 4: Total de espermatozoides com acrossoma intacto (%) do sêmen suíno,
conservado durante cinco dias em diferentes temperaturas (17 e 10 °C) nos
diluentes BTS, ACP-103® e LPD......................................................................
57
CAPITULO III
Tabela 1. Análise do vigor espermático do sêmen suíno conservado durante cinco dias
em LPD a 10 °C, com diferentes concentrações de trolox................................
66
Tabela 2. Análise da motilidade espermática do sêmen suíno conservado durante cinco
dias em LPD a 10 °C, com diferentes concentrações de trolox........................
67
Tabela 3: Total de espermatozoides vivos (vitalidade %) do sêmen suíno, conservado
durante cinco dias no diluente LPD a 10 °C com diferentes concentrações de
trolox................................................................................................................
68
Tabela 4: Total de espermatozoides com acrossoma intacto (%) do sêmen suíno,
conservado durante cinco dias no diluente LPD a 10 °C com diferentes
concentrações de trolox....................................................................................
69
Tabela 5: Total de espermatozoides com reativos ao teste hiposmótico (%) do sêmen
suíno, conservado durante cinco dias no diluente LPD a 10 °C com
diferentes concentrações de trolox....................................................................
69
CAPITULO IV
Tabela 1. Análise do vigor espermático do sêmen suíno conservado durante cinco dias
em LPD a 10 °C, com diferentes concentrações de betaína..............................
Tabela 2. Análise da motilidade espermática do sêmen suíno conservado durante cinco
dias em LPD a 10 °C, com diferentes concentrações de betaína......................
77
78
8
Tabela 3: Total de espermatozoides vivos (vitalidade %) do sêmen suíno, conservado
durante cinco dias no diluente LPD a 10 °C com diferentes concentrações de
betaína...............................................................................................................
79
Tabela 4: Total de espermatozoides com acrossoma intacto (%) do sêmen suíno,
conservado durante cinco dias no diluente LPD a 10 °C com diferentes
concentrações de betaína..................................................................................
80
Tabela 5: Total de espermatozoides com reativos ao teste hiposmótico (%) do sêmen
suíno, conservado durante cinco dias no diluente LPD a 10 °C com
diferentes concentrações de betaína..................................................................
80
9
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
ACP - 103®
Água de coco em pó
AMP
Adenosina monofosfato
ATP
Adenosina trifosfato
BTS
Beltsville Thawing Solution
BWW
Biggers, Whitten and Wittingham
CA
Conversão alimentar
EROs
Espécies reativas ao oxigênio
ET
Espessura de toucinho
FAS
Fat acid sintetase
FAVET
Faculdade de Veterinária
GMD
Ganho médio diário
IA
Inseminação Artificial
LPD
Leite em pó desnatado
MET
Metionina
SPTZ
Espermatozoides
UECE
Universidade Estadual do Ceará
10
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO ...........................................................................................................
12
2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ..................................................................................
14
2.1. A importância da inseminação artificial na cadeia suinícola ................................
14
2.2. O sêmen suíno e métodos de avaliação ................................................................. 14
2.3. Conservação do sêmen ..........................................................................................
16
2.4. Temperatura de conservação ................................................................................. 17
2.5. Diluentes ...............................................................................................................
18
a) Água de coco em pó (ACP) ...........................................................................
19
b) Leite em pó desnatado (LPD) ........................................................................
20
2.6 Radicais livres ........................................................................................................
21
2.7 Geração de EROs ...................................................................................................
21
2.8. Antioxidantes ........................................................................................................
22
2.9. Aminoácidos .........................................................................................................
23
3. JUSTIFICATIVA .......................................................................................................
25
4. HIPOTESE CIENTÍFICA .........................................................................................
27
5. OBJETIVOS ................................................................................................................ 28
5.1. Objetivo Geral .......................................................................................................
28
5.2. Objetivos Específicos ............................................................................................
28
6. CAPITULO I - Aplicações da betaína na produção animal ........................................ 29
7. CAPÍTULO II - Uso de diferentes diluentes e temperatura alternativa na conservação do sêmen do varrão .....................................................................
45
8. CAPÍTULO III - Efeito da adição de trolox ao diluente leite em pó desnatado durante a conservação do sêmen suíno a 10 °C ...................................
61
9. CAPÍTULO IV - Efeito da adição de betaína ao diluente leite em pó desnatado durante a conservação do sêmen suíno a 10 °C ...................................
72
10 CONCLUSÕES ..........................................................................................................
84
11 PERSPECTIVAS …...................................................................................................
85
12 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ..................................................................... 86
11
1. INTRODUÇÃO
A inseminação artificial (IA) é uma técnica amplamente empregada na suinocultura,
utilizando o sêmen conservado sob a forma refrigerada, sendo uma prática comum em grande
parte do plantel de suínos do Brasil. A manutenção do sêmen suíno sob condições de
refrigeração tem se mostrado uma técnica eficiente para a difusão de material genético através
dos programas de inseminação artificial (BORTOLOZZO et al., 2005). Usualmente, a
temperatura de preservação do sêmen varia entre 15 a 20 ºC (JOHNSON et al., 2000),
entretanto já foi verificado que essa faixa de temperatura é imprópria à preservação do sêmen
por períodos prolongados de tempo (BRAGA, 2007).
O espermatozoide suíno é um dos mais sensíveis a flutuações de temperatura quando
comparado ao de outras espécies (CORRÊA et al., 2001). Desta forma, o processamento do
sêmen utilizando diluentes adequados é um dos pontos importantes para sua conservação e
consequentemente para o sucesso de um programa de inseminação (CORRÊA et al., 2001). O
diluente possui várias funções, tais como, aumentar o volume do ejaculado total, fornecer
nutrientes para a produção de energia, proteger os espermatozoides contra o choque térmico,
controlar a flutuação de pH, manter o balanço osmótico e inibir o desenvolvimento bacteriano
(ALTHOUSE, 1997; JOHNSON et al.,2000; LEVIS, 2000; CORRÊA et al., 2001;
BORTOLOZZO et al., 2005), dentre outros.
Deste modo, uma qualidade do meio diluente que permita um maior período de
conservação do ejaculado, é importante para o sucesso dos resultados de fertilidade (PEREZGARCIA, 1958; JOHNSON et al., 1988). Assim, se faz necessário o desenvolvimento de
técnicas e de soluções que permitam a utilização do sêmen resfriado, sem queda dos
resultados de fertilidade em particular na espécie suína (TONIOLLI et al., 1998; TONIOLLI
et al., 2001).
Numerosos trabalhos têm sido efetuados com a finalidade de desenvolver um diluente
para diferentes machos domésticos, inclusive com a adição de várias substâncias tais como
antioxidantes (JEONG et al., 2009) e crioprotetores (LINDEBERG et al., 1999; FAGUNDES
et al., 2010). Por outro lado, diluentes alternativos têm sido testados, tais como o leite
desnatado (MEIRELLES et al., 1998; TONIOLLI et al., 2001) e a água de coco (NUNES;
SALGUEIRO, 1999; CARDOSO et al., 2002; TONIOLLI et al., 2010), e vem sendo
utilizados na conservação do sêmen de diversas espécies domésticas, além do homem.
12
A escolha do diluente deve considerar as condições específicas em que a inseminação
artificial ocorre. O tempo que normalmente decorre entre o processamento das doses e a IA,
ou seja, se o sêmen se destina ao uso imediato ou ao armazenamento durante alguns dias, é
um dos fatores que deve ser levado em consideração. O manejo da IA adotado e o custo do
diluente também influenciam enormemente na sua escolha (BORTOLOZZO et al., 2005). A
busca por novos protocolos e/ou meios de conservação (TONIOLLI et al., 2001; NUNES;
SALGUEIRO, 1999; TONIOLLI et al., 2010) é de grande importância para a cadeia
suinícola, já que tem o propósito de aumentar a longevidade das doses inseminantes a um
baixo custo, uma vez que, um diluente de longa duração implicaria em custos adicionais
(BORTOLOZZO et al., 2005).
13
2. REVISÃO DE LITERATURA
2.1. A importância da inseminação artificial na cadeia suinícola
Na tentativa de reduzir os custos envolvidos na cadeia produtiva, bem como o
aumento do padrão genético e da qualidade do produto final, foi introduzida a inseminação
artificial (IA) na suinocultura (CASTAGNA et al., 2001). No Brasil, a IA em escala comercial
foi introduzida somente a partir de 1975, principalmente na região sul do país, devido a uma
forte concentração de criadores com alto nível de tecnificação além de taxas elevadas de
produtividade (SCHEID, 1992).
O crescente aumento do uso desta técnica, particularmente desde 1990, deveu-se ao
fato de que o seu domínio propicia uma maior demanda por suínos de alta qualidade genética,
fazendo com que estes animais possam ter uma maior produtividade, principalmente, no
beneficiamento de suas carcaças com índices cada vez menores de gordura (JOHNSON et al.,
2000). A utilização da IA promove uma série de vantagens quando comparada com a monta
natural, dentre as quais, os ganhos advindos da melhoria genética que são os de maior
importância. Como exemplo desta melhoria, é possível citar o maior rendimento de carne e,
consequentemente, o aumento na bonificação da carcaça, melhoria na eficiência alimentar,
maior ganho de peso e otimização do uso das instalações (CASTAGNA et al., 2001).
A manutenção do sêmen suíno sob condições de refrigeração tem se mostrado uma
técnica eficiente para a difusão do material genético através dos programas de inseminação
artificial. Quando o sêmen é adequadamente processado, é possível a obtenção de altos
resultados de prenhez e de prolificidade, com resultados no mínimo, semelhantes aos obtidos
com o uso da monta natural (BORTOLOZZO et al., 2005).
2.2. O sêmen suíno e os métodos de avaliação
Dentre as diversas espécies domésticas, o suíno é o que produz maior volume de
sêmen por ejaculação, com valores médios em animais adultos que oscilam entre 150 a 500
mL. Tal característica pode ser influenciada pela idade do animal, estação do ano, intervalo
entre coletas, estado nutricional e raça, dentre outras (CAVALCANTI, 1998).
O ejaculado do suíno é constituído de três porções: a fase pobre, com um número
muito pequeno de espermatozoides; a fase intermediária, que é a mais rica em células
14
espermáticas; a última porção que forma o tampão vaginal e é constituída de material
gelatinoso, sendo esta última fase, no caso do sêmen ser utilizado na inseminação, separada
do restante da amostra por filtrado, com gaze ou algodão (CAVALCANTI, 1998). Henry e
Neves (1998) consideram que o sêmen in natura não deve apresentar motilidade e vigor
inferiores a 70% e 3,0, respectivamente, no momento da diluição.
A avaliação qualitativa do ejaculado é realizada com o objetivo de predizer a
capacidade fecundante de uma amostra de sêmen ou o potencial reprodutivo de um animal,
não informando de maneira definitiva se um determinado macho é fértil ou não. Também é
empregada para a identificação de possíveis causas de infertilidade no rebanho ou para
detectar a tempo alterações que possam comprometer a capacidade fecundante de uma
determinada partida de sêmen (BORTOLOZZO et al., 2005).
A avaliação do ejaculado é dividida nas etapas macroscópicas (análise de volume,
aspecto, cor e odor) e microscópicas (concentração, vigor, motilidade e morfologia)
(BORTOLOZZO et al., 2005).
A análise da concentração é definida como sendo o número de células espermáticas
presentes em um ejaculado, por sua unidade de volume. Esta medida pode ser determinada de
três maneiras: espectrofotômetro, espermiodensímetro e câmara de Neubauer. O
espectrofotômetro é um aparelho que mede a concentração através da densidade óptica,
permitindo uma analise prática, rápida e precisa. O espermiodensímetro determina a
concentração através da observação do grau de turvação de uma suspensão de
espermatozoides. Esta avaliação pode ser laboriosa quando há necessidade de fazer uma prédiluição em caso de sêmen muito denso. Já a câmara de Neubauer é o método de contagem
mais demorado, não sendo indicado para um grande número de ejaculados (CORRÊA et al.,
2001).
Vigor e motilidade espermática são análises subjetivas rotineiras, embora exista o
sistema computadorizado de análise do sêmen, o CASA (Computer Assisted Sperm Analyzer)
utilizado apenas a nível experimental. O primeiro representa a força e o tipo de movimento do
espermatozoide, podendo ser classificado com notas de 0 a 5, onde 0 representa a ausência de
movimento progressivo com deslocamento lateral de cauda fraco e inexpressivo, e 5
representa um movimento vigoroso e veloz dos espermatozoides. Apesar desta análise
subjetiva, seguindo-se as características predeterminadas pela tabela de análise de vigor
espermático (TONIOLLI, 1996), os resultados obtidos para esta característica, por pessoas
bem treinadas, são bastante homogêneos. Já a motilidade consiste em estimar o percentual de
15
células móveis em relação ao total de células de um determinado campo do microscópio
(BORTOLOZZO et al., 2005).
A avaliação do sêmen deve ser conduzida de forma disciplinada, respeitando alguns
conceitos básicos de higiene e controle de temperatura. Os métodos empregados para
avaliação, na medida do possível, devem ser eficientes, econômicos e práticos, de modo a se
preservar a qualidade inicial do ejaculado. Apesar de não ser possível predizer com absoluta
exatidão a fertilidade de um ejaculado, os resultados obtidos através dessas análises permitem
selecionar um ejaculado quanto a sua provável capacidade fertilizante (CORRÊA et al.,
2001).
A análise morfológica permite a avaliação qualitativa das células espermáticas para
determinar o percentual de alterações na amostra de sêmen. Um alto percentual de defeitos
pode significar alterações durante a espermatogênese e maturação espermática, ou ainda, de
que o ejaculado tenha sido manipulado de forma imprópria. Com esse exame, é possível
descartar reprodutores com ejaculados de baixa qualidade para emprego na IA
(RODRIGUEZ-MARTINEZ; ERIKSSON, 2000).
2.3. Conservação do sêmen
Para conservar os espermatozoides durante períodos prolongados é necessário manter
a integridade celular, reduzir a atividade metabólica e manter sob controle o desenvolvimento
de microrganismos, para tanto é realizada a diluição em meio adequado além do abaixamento
da temperatura (SANCHEZ, 2003).
Há duas formas de conservação seminal já amplamente utilizadas: o resfriamento e a
congelação. A redução da temperatura tem sido um método utilizado para prolongar a
viabilidade dos espermatozoides ejaculados, devido a seu efeito de desaceleração dos
processos metabólicos celulares (ALMOND et al., 1994). Isso ocorre em virtude da
característica da membrana dos espermatozoides, que quanto menor for a temperatura do
meio, menor será a mobilidade de seus lipídios na dupla membrana, os quais se solidificam,
impedindo seu movimento e também o movimento das proteínas, mantendo desta forma a
estrutura da membrana celular (SANCHEZ, 2003).
Apesar dos benefícios dos processos de conservação citados acima, podem acontecer
danos irreversíveis a célula espermática em virtude do choque térmico, que levam a uma
redução da sua motilidade, resultando em inchaço na membrana acrossomal, aumento da
16
permeabilidade da membrana plasmática (FERNANDEZ-SANTOS et al., 2006), ruptura da
membrana plasmática, com perda de íons e enzimas interferindo assim na sua sobrevivência e
capacidade fecundante (LEEUW et al., 1991).
2.4. Temperatura de conservação
O espermatozoide suíno é uma das células mais sensíveis à flutuações de temperatura
quando comparado aos de outras espécies (CORRÊA et al., 2001). Vários fatores podem estar
envolvidos na susceptibilidade desses espermatozoides ao choque térmico, merecendo ênfase
a forma da cabeça (WATSON; PLUMMER, 1985), a composição química da membrana
(DARIN-BENNETT; WHITE, 1975; DE LEEUW et al.,1990) e a temperatura de fase de
transição (GADELLA, 1996).
A temperatura ideal para a manutenção das doses inseminantes situa-se entre 15 e 18
°C. Queda de temperatura abaixo de 15 °C normalmente é causa de choque térmico, que
resulta em perda irreversível da motilidade espermática e lesões na estrutura das células. Esta
sensibilidade é caracterizada pela perda da permeabilidade seletiva e da integridade da
membrana plasmática do espermatozoide, fato esse que normalmente o leva a morte
(WATSON, 1996).
Por outro lado, temperatura acima dos 18 °C, são deletérias por não reduzirem de
forma eficiente o metabolismo dos espermatozoides, facilitando a multiplicação de bactérias,
que tem uma ação negativa sobre a qualidade do sêmen (SCHEID, 2003).
Ao estudar o efeito da temperatura sobre a membrana plasmática dos espermatozoides
suínos, Canvin e Buhr (1989) constataram que, a fluidez das membranas plasmáticas da
cabeça e do corpo da célula diferem entre si, e que o processo de resfriamento e
reaquecimento do sêmen alteram significativamente as organizações moleculares, alterando a
funcionalidade da membrana. A reorganização das partículas da membrana, causada pelo
choque pelo frio, pode ser reversível e não causar, por si só, danos aos espermatozoides.
Porém, o funcionamento da membrana pode ser alterado, talvez de modo irreversível, devido
às mudanças decorrentes da separação de fases, conduzindo ao aumento da permeabilidade
com perda de cátions e enzimas, redução da atividade enzimática e perturbações nos
processos de difusão controlados pela membrana (DE LEEUW et al., 1990).
Estudos realizados por Watson e Plummer (1985) ressaltam que as organelas mais
frequentemente prejudicadas pelo efeito do choque térmico são a membrana plasmática, o
17
acrossoma e a mitocôndria. As mudanças relacionadas ao acrossoma são visíveis ao
microscópio óptico sendo observado menor refração apical e edema.
Observa-se menor motilidade após o reaquecimento quando a célula é resfriada
rapidamente abaixo de 10 ºC, nesse processo, o espermatozoide do varrão libera 30% do total
de glicose fosfatase isomerase e 4% de lactato desidrogenase em resposta ao choque térmico;
ocorre ganho intracelular de sódio e zinco e perda de potássio, sendo que a concentração de
magnésio diminui significativamente depois deste processo, tendo sido encontrados lipídios
na membrana extracelular após o choque térmico. O sinal mais visível da injúria causada pelo
choque térmico é a perda irreversível da motilidade (QUINN et al., 1966). Para White (1993),
o decréscimo no aporte de oxigênio e a queda de adenosina tri-fosfato (ATP) reduzem a
produção e o fornecimento de energia para a movimentação celular. Segundo Weber (1989), o
efeito imediato do choque térmico envolve os conteúdos intracelulares de ATP e AMP-cíclico
que diminuem rapidamente, não podendo mais ser ressintetizados pelas células lesadas.
O espermatozoide suíno é particularmente sensível ao resfriamento para temperaturas
inferiores a 15 ºC, principalmente quando o sêmen in natura é resfriado rapidamente, o que
resulta em uma redução da sobrevivência espermática. Os efeitos do resfriamento sobre a
célula espermática incluem uma série de mudanças nos espermatozoides, quando o sêmen é
exposto a temperaturas abaixo de 15 ºC (PURSEL et al., 1973; ALTHOUSE et al., 1998).
Essas mudanças em conjunto, têm sido denominadas de choque pelo frio ou cold
shock. O choque térmico caracteriza-se pela presença de espermatozoides com movimentação
atípica, perda prematura de motilidade, alterações nas membranas acrossômica, plasmática e
mitocondrial, resultando em mudanças bioquímicas envolvendo o metabolismo celular, perda
de enzimas intracelulares e distribuição de íons (AMANN; PICKETT, 1987; ZENG;
TERADA, 2000).
2.5. Diluentes
O processamento do sêmen utilizando diluentes adequados é um dos pontos
importantes para o sucesso de um programa de inseminação (CORRÊA et al., 2001). O termo
diluente, ou extensor, refere-se a uma solução aquosa que possui várias funções, tais como a
de aumentar o volume do ejaculado total, fornecer nutrientes para a produção de energia,
proteger os espermatozoides contra o choque térmico, controlar a flutuação de pH, manter o
balanço osmótico, inibir o desenvolvimento bacteriano (ALTHOUSE, 1997; JOHNSON et
18
al., 2000; LEVIS, 2000; CORRÊA et al., 2001; BORTOLOZZO et al., 2005) e preservar as
características funcionais das células espermáticas, favorecendo a obtenção de taxas de
prenhez adequadas (GADEA, 2003).
Usualmente, a temperatura de preservação do sêmen suíno tem variado de 15 a 20 ºC
(JOHNSON et al., 2000). Verifica-se que essa faixa de temperatura é imprópria à preservação
do sêmen por períodos prolongados de tempo, com ênfase para dois aspectos limitantes, a
saber, a inadequada redução do metabolismo espermático e a facilidade de multiplicação
bacteriana, que concomitantemente poderão reduzir a longevidade espermática (BRAGA,
2007).
Deste modo, a qualidade do meio diluente que permita um maior período de
conservação do ejaculado, é importante para o sucesso dos resultados da inseminação
artificial (PEREZ-GARCIA, 1958; JOHNSON et al., 1988). Assim, se faz necessário o
desenvolvimento de técnicas e soluções que permitam a utilização do sêmen resfriado, sem
queda dos resultados de fertilidade em particular na espécie suína (TONIOLLI et al., 1998;
TONIOLLI et al., 2001).
Numerosos trabalhos têm sido efetuados com a finalidade de desenvolver um diluente
para diferentes machos domésticos. O uso de várias substâncias adicionadas ao diluente como
os antioxidantes (JEONG et al., 2009), os crioprotetores, como os aminoácidos
(LINDEBERG et al., 1999; FAGUNDES et al., 2010), bem como, diferentes meios como o
leite desnatado (MEIRELLES et al., 1998; TONIOLLI et al., 2001) e a água de coco
(NUNES; SALGUEIRO, 1999: CARDOSO et al., 2002; TONIOLLI et al., 2010), foram
utilizados na conservação do sêmen de diversas espécies domésticas, além do homem.
a) Água de coco (ACP): A água de coco é uma solução estéril, ligeiramente ácida,
contendo proteínas, sais, açúcares, vitaminas, fatores de crescimento (fitohormônios) e muito
pouco fosfolipídeo (LAGUNA, 1996). Em virtude da presença dessas características, ela
passou a ser testada como meio diluente de sêmen para diversas espécies animais, como
suínos (TONIOLLI et al., 2010), caprinos (NUNES; SALGUEIRO, 1999; AZEVEDO;
TONIOLLI, 1999), ovinos (BRAZ et al., 2003), caninos (CARDOSO et al., 2002; SILVA et
al., 2000) e felinos (SILVA et al., 2007).
Após correção da sua osmolaridade e pH, ela vem apresentando, através de
experimentos in vitro e in vivo, resultados positivos na manutenção da viabilidade e poder
fecundante dos espermatozoides, sendo possível sua utilização em processos biotecnológicos
19
como a inseminação artificial, sem os custos elevados com diluentes importados (NUNES,
1998).
A água de coco como diluente de sêmen mostrou efeitos benéficos, evidenciados in
vitro sobre as características de motilidade espermática (TONIOLLI et al., 1998; TONIOLLI
et al., 2001), inclusive mantendo maiores valores para esta característica durante 96 horas de
conservação do sêmen suíno (TONIOLLI et al., 2010). No sêmen caprino e ovino a
motilidade manteve-se elevada por até 48 e 24 horas, respectivamente (NUNES;
SALGUEIRO, 1999). Além da manutenção da motilidade espermática, verificou-se também
uma maior proteção aos espermatozoides conferida pelo diluente ACP, que se traduziu por
um maior número de células vivas com acrossoma íntegro (TONIOLLI et al., 2010).
b) Leite em pó desnatado (LPD): O leite desnatado, utilizado como diluente de
sêmen é de uso prático e efetivo na proteção do espermatozoide durante o período de
conservação, inclusive preservando melhor a motilidade espermática do que outros diluentes,
tanto na forma líquida, quanto pós-descongelação (KULAKSIZ et al., 2012). Contem
componentes tanto com ação benéfica para o gameta (BARTELLIER et al., 1998).
O leite desnatado é um excelente meio conservador para os espermatozoides, quando
estocados a baixas temperaturas (4 ºC). Entretanto, em temperaturas mais altas (15 ºC), ele
teria efeitos deletérios à célula espermática, devido à presença de componentes moleculares
tóxicos (GARCIA; GRAHAN, 1987; MEIRELLES et al., 1998)
Embora o leite apresente capacidade de preservação do sêmen similar a outros
diluentes alternativos (gema de ovo e à base de soja) nos primeiros dias de armazenamento,
como observado em um estudo com sêmen ovino, ele não se mostrou capaz de preservar o
sêmen por um longo período, devido ao processo de deterioração (KASIMANICKAM et al.,
2011).
Segundo Foote (1974) e Memon e Ott (1981), a presença das lipoproteínas e lecitinas
do leite promovem a proteção da célula espermática contra o choque térmico, quando
adicionadas ao sêmen antes do resfriamento. Inclusive, há relatos sobre o efeito crioprotetor
do leite desnatado, também conferindo uma melhor proteção à célula espermática pósdescongelação, entretanto, sem efeitos benéficos sobre a motilidade (JULIANI; HENRY,
2008).
20
2.6 Radicais livres
Uma das razões que explicam a diminuição da qualidade do ejaculado de um
reprodutor é a maior produção de espécies reativas ao oxigênio (EROs), também chamadas de
radicais livres, ou seja, átomos ou moléculas que possuem um ou mais elétrons despareados
(STRYER, 1996). A formação do superóxido pode acontecer de forma espontânea nas
seguintes situações: em ambientes aeróbicos, ricos em elétrons; próximo à membrana
mitocondrial interna, devido ao escape de elétrons da cadeia respiratória (NORDBERG;
ÁRNER, 2001). Distúrbios no equilíbrio da produção de oxidante/antioxidante, levam a danos
celulares, denominados danos ou estresse oxidativo (AITKEN, 1995), que podem ser
causados de duas maneiras: pela redução na produção de antioxidantes para dentro do sistema
de defesa celular ou pela produção elevada de EROs (HALLEWELL; GUTTERIDGE, 1999).
Estudos realizados por vários pesquisadores indicam que o H 2O2 é a ERO que
promove os maiores danos in vitro aos espermatozoides, possuindo funções deletérias,
atuando na diminuição da motilidade espermática (ARMSTRONG, 1999). Na verdade, ela
não é um radical livre, porém é de grande importância, devido à sua habilidade de penetrar em
membranas biológicas (HALLIWELL, 1991) agindo como intermediária na formação de
EROs.
A grande sensibilidade espermática aos danos causados pelas EROs, pode ser
explicado por duas razões: 01. A quantidade de ácidos graxos polinsaturados presentes em sua
membrana plasmática; 02. Baixas concentrações de enzimas antioxidantes em seu reduzido
citoplasma (AITKEN; FISHEL, 1994).
Outra razão que pode explicar esta sensibilidade espermática às EROs, é que com a
perda da maior parte do citoplasma durante a espermiogênese, as células perdem também os
seus mecanismos endógenos de reparo e defesa enzimática. Contudo, na avaliação do
desequilíbrio entre a produção de antioxidantes e EROs pelo organismo, não se pode esquecer
a ação protetora do plasma seminal através de suas enzimas, protegendo os espermatozoides
contra os ataques oxidativos (HALLIWELL; GUTTERIDGE, 1999).
2.7 Geração de EROs no sêmen
Dentro do ejaculado existem duas fontes principais de EROs: o espermatozoide e os
leucócitos, com um mecanismo similar de geração de EROs localizada na membrana celular.
21
Os leucócitos geram EROs durante a fagocitose, com capacidade 100 vezes maior que as
células espermáticas, se tornando uma poderosa e perigosa, fonte de EROs com efeito
prejudicial sobre função espermática (AITKEN; BACKER, 2002).
Os danos causados no espermatozoide advêm da alta quantidade de ácidos graxos
polinsaturados oxidáveis em suas membranas, que o torna vulnerável à ação dose agentes
oxidantes (radicais livres) bem como sensíveis à peroxidação lipídica. (BILODEAU et al.,
2002). Quando as espécies reativas de oxigênio atacam as duplas ligações associadas aos
ácidos graxos insaturados, uma reação em cadeia de peroxidação lipídica é iniciada, a qual,
não sendo paralisada, leva a uma perda da permeabilidade da membrana e consequentemente
da função espermática (AITKEN; BACKER, 2002).
As espécies oxigênio reativas exercem um papel duplo na fertilidade do macho: 01.
Fundamentais em processos como hiperativação da motilidade, capacitação, reação
acrossômica e fertilização; 02. Podem causar severos danos ao espermatozoide, quando os
seus mecanismos de defesa estão limitados. Assim, o espermatozoide está continuamente na
“corda-bamba”, porque uma produção controlada de EROs é de vital importância para a sua
função normal, enquanto que a superprodução e/ou defesas antioxidantes inadequadas levam
a estresse oxidativo, com impacto negativo na fertilidade (AITKEN, 1995).
2.8. Antioxidantes
A peroxidação dos lipídios ocorre nas espécies reativas ao oxigênio durante a
preservação do sêmen, podendo ser agravada na presença de uma maior proporção de ácidos
graxos insaturados e do baixo nível de antioxidante presente no espermatozoide. Assim, a
suplementação com vários tipos de antioxidantes tem melhorado a viabilidade e motilidade
espermáticas no sêmen diluído ou criopreservado de várias espécies (FUNAHASHI; SANO,
2005).
Diferentes antioxidantes, como a vitamina E solúvel, a glutationa, a cisteína e a Nacetil-cisteína têm sido acrescentados aos diluentes para criopreservação ou armazenamento,
quando em temperaturas inferiores a 12 ºC (BRAGA, 2007).
O trolox (6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametil croman-2-ácido carboxílico), é um análogo
hidrossolúvel do α-tocoferol que foi sintetizado por Scott e sua equipe em 1974 e indicado
como antioxidante para a preservação de óleos e gorduras. Esta substância apresenta
propriedades antioxidantes e é eficaz tanto em gordura animal quanto vegetal. Característica,
22
que o torna singular, já que o tocoferol tem pouca atividade na prevenção da peroxidação de
óleos vegetais (SCOTT et al., 1974).
Os antioxidantes são inibidores de radicais livres que suprimem a formação de
espécies reativas ao oxigênio e/ou suas ações. A adição de antioxidantes ao diluente tem sido
avaliada quanto à sua capacidade de proteger o espermatozoide do efeito tóxico dos
metabólitos reativos do oxigênio (MAIA, 2006). Estudos têm mostrado que a vitamina E (αtocoferol) é capaz de interagir diretamente com radicais oxidantes (GIULIVI et al., 1992),
protegendo as células de estresse oxidativo (TIRADO; BROWN, 2005) e de danos nas
membranas plasmática e acrossomal (MAIA, 2006), bem como do DNA (DONNELLY et al.,
1999), podendo ser utilizado em diluentes de refrigeração a fim de aumentar a viabilidade de
sêmen criopreservado (BORBA NETO et al., 2010), melhorando a motilidade e a viabilidade
do espermatozoides (MAIA, 2006).
2.9. Aminoácidos
Os aminoácidos são moléculas carregadas, sendo possível que eles interajam
eletrostaticamente com os grupos fosfato dos fosfolipídios da membrana plasmática do
espermatozoide, formando assim uma camada sobre superfície da célula, protegendo-a contra
choques térmicos (EL-SHESHTAWY et al., 2008). Isto pode contribuir para sua capacidade
de manter a integridade da membrana acrossomal dos espermatozoides, durante o processo de
criopreservação
(FAGUNDES,
2008).
Estudos
sugerem
que
combinações
desses
crioprotetores podem ser benéfica para a criopreservação de sêmen de várias espécies
(FAGUNDES et al., 2010).
Alguns aminoácidos têm sido empregados na criopreservação de sêmen de várias
espécies de mamíferos, tais como a glutamina (MERCADO et al., 2009), histidina
(JUNNILA, 2000), metionina (ÇOYAN et al., 2010), betaína (LINDEBERG et al., 1999),
prolina (PEÑA et al., 1998), cisteína (EL-SHESHTAWY et al., 2008), alanina e glicina
(FAGUNDES et al., 2010). Eles têm sido usados com sucesso na congelação de sêmen equino
(JUNNILA, 2000), canino (PEÑA et al., 1998) bovino (EL-SHESHTAWY et al., 2008) e
ovino (ÇOYAN et al., 2010).
A capacidade dos aminoácidos em melhorar a criosobrevivência dos espermatozoides
tem sido relacionada com suas propriedades metabólicas e crioprotetoras, oxidantes ou
osmorregulativas (MARTINS-BESSA et al., 2007). Uma vez que os aminoácidos não podem
23
penetrar a membrana do espermatozoide, então, mecanismos osmóticos podem explicar, em
parte, a sua ação (TRIMECHE et al., 1999). Apesar de ter sido verificado o efeito crioprotetor
sobre espermatozoides em diversas espécies, os mecanismos de crioproteção espermática
conferidos pelos aminoácidos, assim como a função de aminoácidos livres na fisiologia do
espermatozoide, ainda não foram totalmente esclarecidos (FAGUNDES et al., 2010).
A betaína quando adicionada ao sêmen in natura de touros (100 e 200 mM), melhorou
significativamente o percentual de espermatozoides móveis a 20, 5 e a 0 °C. Além disso,
melhorou a motilidade espermática do sêmen de touros ditos como “congeladores pobres”, ou
seja, os que apresentam motilidade abaixo de 20% após resfriamento (ZHANG et al., 2001).
Junnila (2000) avaliou a adição do aminoácido betaína ao diluente de sêmen de
garanhão sobre a motilidade espermática pós congelação, e verificou que concentrações acima
de 1,5% melhoraram a motilidade espermática pós-descongelação. A adição de 2,5% de
betaína ao diluente usado na congelação de espermatozoides de garanhão aumentou
significativamente a motilidade progressiva pós-descongelação, mantendo 95% da motilidade
original. Uma explicação para o efeito positivo da betaína seria seu possível papel como um
osmólito intracelular no esperma de garanhão, um papel semelhante ao exibido por ela em
outras células. Também é possível que a betaína, neste contexto, impeça a desnaturação das
proteínas estruturais e enzimas, causada pela desidratação progressiva das células e evite os
efeitos osmóticos dos solutos no fluido intracelular de espermatozoides.
24
3. JUSTIFICATIVA
A inseminação artificial é uma biotécnica aplicada à reprodução que consolidou seu
emprego comercial em várias espécies domésticas ao longo da segunda metade do século XX,
conseguindo inclusive a obter resultados superiores aos da monta natural. No caso do suíno,
ela foi amplamente difundida ao longo da década de setenta e oitenta, consolidando-se nos
anos noventa, com uma utilização crescente chegando a atingir 90% de granjas tecnificadas.
O sêmen, quando é adequadamente processado, é possível a obtenção de ótimos resultados
reprodutivos, no mínimo semelhantes os conseguidos com monta natural (BORTOLOZZO et
al., 2005).
A inseminação artificial na espécie suína tem algumas limitações. A principal delas
seria o curto período de armazenamento da dose inseminante. Apesar de existir a tecnologia
de congelação de sêmen, o seu emprego comercial ainda não foi viabilizado. Com isso os
programas de IA em suínos são estruturados para empregar sêmen refrigerado, cujas doses
possuem curto período de três dias de viabilidade quando armazenadas (BORTOLOZZO et
al., 2005).
Há disponível no mercado os diluentes de longa duração, que permitem a viabilidade
espermática por até cinco dias, entretanto, são de preparação complexa e de custo elevado
(CORRÊA et al., 2001), o que justifica a busca por novos diluentes que preservem a
viabilidade das células espermáticas por mais tempo e que sejam de fácil preparo e de baixo
custo.
Vários são os trabalhos relacionados ao uso de diluentes a base de água de coco
(NUNES; SALGUEIRO, 1999: CARDOSO et al., 2002; TONIOLLI et al., 2010) e leite em
pó desnatado (MEIRELLES et al., 1998; TONIOLLI et al., 2001) na conservação do sêmen
de diferentes espécies domésticas. Os resultados obtidos valorizam a utilização desses
diluentes em protocolos de inseminação artificial, devido aos efeitos positivos, determinados
pela melhor manutenção da motilidade espermática (TONIOLLI et al., 1998; KULAKSIZ et
al., 2012), e podendo se constituir em alternativas menos onerosas.
Com a finalidade de reduzir danos às estruturas vitais dos espermatozoides oriundos
da redução da temperatura, além de diferentes meio diluentes, foram empregadas substâncias
para prolongar a vida dessas células, tais como antioxidantes e aminoácidos. Os antioxidantes
amenizam os efeitos da peroxidação lipídica que ocorre durante a conservação do sêmen, e os
aminoácidos adicionados ao diluente, exercem efeitos crioprotetores em nível de membrana
25
plasmática e acrossomal (FUNAHASHI; SANO, 2005), desta forma merecem um estudo
mais específico e aprofundado a fim de se poder colocar em evidência seus efeitos positivos
para a célula espermática.
Dessa forma, faz-se necessário o desenvolvimento de técnicas que prolonguem a
utilização do sêmen suíno resfriado com bons resultados zootécnicos (PEREZ-GARCIA,
1958; JOHNSON et al., 1988). O diluente representa aproximadamente 23% do custo de
material de consumo de uma central de inseminação, independente do seu tamanho, e cerca de
7 a 8% do custo total da dose inseminante (BORTOLOZZO et al., 2005). Estudos adicionais
com temperaturas e diluentes alternativos acrescidos de substâncias que permitam uma
melhor conservação do sêmen são de extrema importância para a cadeia produtiva suinícola,
principalmente se acompanhadas de vantagens econômicas que viabilizem seu emprego.
26
4. HIPÓTESES CIENTÍFICAS
Os diluentes alternativos testados constituem bons meios de diluição/conservação do
sêmen suíno.
A inclusão de antioxidantes ao diluente melhora a viabilidade espermática por um
período de tempo mais prolongado.
27
5. OBJETIVOS
5.1. OBJETIVO GERAL
Determinar a melhor temperatura e diluente alternativo visando uma melhor
conservação do sêmen suíno.
5.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS
a) Verificar os efeitos de diferentes diluentes e temperaturas sobre a conservação da
qualidade do sêmen suíno;
b) Desenvolver um meio diluente que permita uma melhor conservação do sêmen suíno;
c) Determinar uma nova temperatura que permita uma melhor conservação do sêmen
suíno;
d) Avaliar os efeitos de diferentes concentrações de trolox, sobre a conservação do sêmen
suíno;
e) Avaliar os efeitos de diferentes concentrações de betaína, sobre a conservação do sêmen
suíno;
28
6. CAPÍTULO I
Aplicações da betaína na produção animal
Betaine Applications on Livestocks
Araújo, Lina Raquel Santos; Barros, Tatyane Bandeira; Guimarães, Daianny Barboza;
Cantanhêde, Ludymila Furtado; Dias, Aline Viana; Toniolli, Ricardo
Periódico: Semina
Submetido em: 20 de junho de 2012.
29
6. CAPÍTULO I
Aplicações da betaína na produção animal
Betaine Applications on Livestocks
Araújo, Lina Raquel Santos1; Barros, Tatyane Bandeira1; Guimarães, Daianny Barboza1;
Cantanhêde, Ludymila Furtado 1; Dias, Aline Viana1; Toniolli, Ricardo 2
1
Programa de Pós-graduação em Ciências Veterinárias – FAVET/UECE, 2Laboratório de
Reprodução Suína e Tecnologia de Sêmen – FAVET/UECE, Av. Paranjana, 1700, Campus do
Itaperi, CEP: 60740-000; Fortaleza - Ceará - Brasil,
E-mail: [email protected]
Resumo
O presente trabalho aborda as principais aplicações da betaína na produção animal. A betaína
é um aminoácido doador de grupos metil, que apresenta qualidades osmoprotetora e
lipotrópica. Como doadora de grupos metil está envolvida no metabolismo proteico e
energético. Como osmoprotetora, protege a célula do estresse hídrico, com papel importante
em doenças osmóticas, como na Coccidiose em aves. Como agente lipotrópico, reduz a
espessura de toucinho e melhora o rendimento de carcaça em suínos. Além de melhorar
parâmetros reprodutivos em porcas e aumentar a produção de leite em cabras, é utilizada no
diluente de congelação, melhorando a motilidade espermática pós-descongelação do sêmen de
garanhão. A betaína apresenta efeitos benéficos na produção animal e sua principal aplicação
parece estar na substituição parcial da metionina da dieta, gerando vantagens econômicas para
o produtor.
Palavras-chaves: Betaína, alimentação, produção animal, sêmen, reprodução.
Abstract
This curent paper discusses the main applications of betaine in animal production. Betaine is
an amino acid, donor of methyl groups, which has osmoprotector and lipotropic qualities. As
a donor of methyl groups, it is involved in protein and energy metabolism. As osmoprotector,
it protects the cell from water stress, with an important role in osmotic diseases, such as
30
coccidiosis in poultry. As a lipotropic agent, reduces backfat thickness and improves the
carcass yeld in pigs. Besides improvement in reproductive parameters in sows and increase in
milk production of goats, it is used in freezing diluents, improving sperm post-thaw motility
in the semen of stallions. Betaine has beneficial effects on animal production and its main
application seems to be in the partial substitution of methionine in the animal’s diet,
generating economic benefits for the producer.
Keywords: Betaine, food, livestock, semen, reproduction.
Introdução
Em virtude de sua estrutura química, a betaína (trimetilglicina) é um derivado do
aminoácido glicina, em que três grupos de metila são ligados ao átomo de nitrogênio da
molécula de glicina. Como um subproduto do processamento da beterraba, ela é
comercialmente disponível como um aditivo. Em decorrência de sua função de doadora de
grupos metil, a betaína está envolvida no metabolismo de proteínas e energia (EKLUND et
al., 2005).
A betaína é uma molécula com dupla função no metabolismo animal, tanto é uma
fonte direta de grupos metil, quanto desempenha um importante papel na manutenção do
equilíbrio osmótico. A betaína é utilizada na alimentação animal para melhorar o desempenho
produtivo dos animais; inclusive há relatos de melhorias na qualidade de carcaça de suínos
(FERNANDEZ-FIGARES et al., 2002; HUANG et al., 2008), redução da espessura de
toucinho e melhor conversão alimentar na mesma espécie (RIBEIRO et al., 2011), maior
ganho de peso e melhor conversão alimentar em frangos de corte (ATTIA et al., 2005), maior
produção de leite em cabras (ARANTZAMENDI et al., 2006) e em porcas (RAMIS et al.,
2011). Em particular, sob certas condições fisiológicas, quando há exposição à patógenos ou
estresse osmótico, como na Coccidiose em aves, a betaína pode ter um impacto positivo na
produção animal (EKLUND et al., 2005).
A betaína, além de ser utilizada na alimentação animal como melhoradora de
desempenho, também tem sido estudada quanto à sua aplicação na conservação do sêmen de
animais domésticos e seus efeitos sobre a motilidade espermática pós-descongelação
(OLLERO et al., 1996; PEÑA et al., 1998; LINDEBERG et al., 1999; TRIMECHE et al.,
1999; JUNNILA, 2000). O presente trabalho tem por objetivo abordar as principais aplicações
da betaína na produção animal.
31
A betaína como doadora de grupos metil
Quanto ao seu papel como doadora de grupos metil, em geral, a betaína está
relacionada com outras substâncias, tais como a metionina e a colina. No entanto, das três
moléculas, a betaína é a mais eficiente como doadora de grupos metil (ARANTZAMENDI et
al., 2006). Grupos metil são necessários para a síntese de inúmeras substâncias, como a
creatina, fosfatidilcolina, carnitina, adrenalina, purinas metila, bem como aminoácidos
metilados (EKLUND et al., 2005).
A betaína na dieta funciona como um poupador de metionina e/ou colina nos
processos metabólicos, com vantagens econômicas. O resultado da transferência do grupo
metil é a transformação da betaína (trimetilglicina) para dimetilglicina, que ainda contém dois
grupos metil. Estes podem ser quebrados, por oxidação, na forma de fragmentos de carbono.
Durante esta reação a dimetilglicina é degradada a sarcosina e, por último, a glicina. Os
fragmentos de um carbono da dimetilglicina, bem como de outras fontes, como o ácido
fórmico ou grupos carboxila de outros ácidos orgânicos são utilizados para sintetizar novos
grupos metil, pela via tetrahidrofolato (EKLUND et al., 2005).
Em frangos de corte estudaram-se três níveis de inclusão de metionina na dieta sendo
0,32; 0,37 e 0,42%. Cada nível de metionina foi suplementado (ou não) com 0,035 e 0,070%
de betaína. Para o período experimental de 1 a 56 dias, esta suplementação aumentou de
forma significativa o ganho de peso em 5,1 e 9,0% e melhorou a conversão alimentar em 8,4 e
12,0%, respectivamente, em relação ao grupo não suplementado. Em geral, os resultados
indicaram que suplementação de betaína para 0,32 ou 0,37% do conteúdo de metionina na
dieta melhorou significativamente o ganho de peso e conversão alimentar, em comparação
com pintos alimentados com dieta contendo 0,42% de metionina, os quais mostraram menores
respostas, tanto para o nível médio quanto para o elevado de suplementação. A betaína pode
não substituir totalmente a metionina da dieta; porém, numa dieta para frangos contendo baixa
concentração de metionina, apenas a metionina isolada da proteína da soja, responde bem à
suplementação, seja com metionina, colina ou betaína (ATTIA et al., 2005).
A betaína contribui para uma menor necessidade de doadores de grupos metil, tais
como metionina e colina na alimentação animal, resultando em vantagens econômicas, sem
que haja comprometimento do desempenho animal (EKLUND et al., 2005).
Em frangos de corte, utilizou-se uma suplementação de 800g de betaína por tonelada,
em cinco concentrações diferentes de metionina (0; 18; 20; 22 e 24 g Met/kg de ração). A
suplementação de betaína foi eficaz no crescimento de frangos de corte (fase inicial), na
32
eficiência de conversão alimentar e rendimento do peito na carcaça de frangos, alimentados
com uma dieta contendo concentrações subótimas de metionina (15g/kg). Por outro lado, a
suplementação foi ineficaz em concentrações mais elevadas de metionina. Os dados (ganho de
peso aos 21 dias e eficiência de conversão alimentar aos 42 dias de idade) do presente estudo
indicam que a suplementação de betaína foi eficaz na melhoria de desempenho dos frangos de
corte, quando a dieta continha concentrações subótimas de metionina (15 e 18 g / kg). Ela,
através da sua propriedade de doadora de grupos metil, pode ter poupado a metionina desta
função e esta metionina dietética estaria disponível para outras funções vitais, como a síntese
de proteínas e modulação imunológica (RAO et al., 2011).
A betaína como osmoprotetor
A betaína age como uma substância osmoticamente ativa, retendo água no interior das
células, auxiliando a função das bombas iônicas e economizando a energia usada no balanço
eletrolítico (MOECKEL et al., 2002). Como substância osmoticamente ativa, ela pode
favorecer a um aumento da proliferação da estrutura intestinal que, por sua vez, pode ter um
impacto positivo sobre o estado de saúde animal e digestibilidade dos nutrientes. Dentro de
uma perspectiva em que o uso de antibióticos na alimentação será restrito em um futuro
relativamente próximo, haverá um interesse crescente no uso de betaína, como um composto
bioativo para melhorar a saúde intestinal (EKLUND et al., 2005).
Devido à sua estrutura polar, a molécula de betaína protege a célula do estresse hídrico
e de perdas de água intracelular. A proteção osmótica permite a manutenção de equilíbrio de
água e volume das células intestinais, facilitando a secreção de enzimas digestivas e
estimulando a proliferação de células no tecido intestinal. O epitélio da parede intestinal
proliferado proporcionaria uma superfície maior para a absorção de nutrientes, com impactos
positivos sobre o desempenho animal. Efeitos da betaína como uma substância osmótica ativa
podem ser mais pronunciados nos animais expostos a doenças osmóticas, como a Coccidiose
em aves. Esta melhoria da estrutura intestinal pode ocorrer em animais infectados e saudáveis
e pode afetar positivamente a digestibilidade dos nutrientes (EKLUND et al., 2005).
Devido à sua propriedade osmoprotetora, ela protege as células intestinais e mantém a
flora intestinal; consequentemente, contrabalança as perdas de desempenho durante o estresse
de calor e da Coccidiose. A propriedade osmótica da betaína pode ser essencial para apoiar a
função e crescimento intestinal; além disso, ela protege a flora intestinal contra variações
33
osmóticas e melhora a atividade de fermentação microbiana, que, por sua vez, também
contribui para aumentar a digestibilidade dos nutrientes (RATRIYANTO et al., 2009).
O papel osmorregulatório da betaína já foi evidenciado em peixes sob estresse
fisiológico no período de aclimatação, durante e após transferência gradual ou abrupta desses
animais da água doce para a água do mar, em uma unidade de piscicultura comercial na
Finlândia. Salmões do Atlântico, alimentados com ração comercial seca suplementada com
1,5% de betaína, foram capazes de manter seus íons e balanço hídrico ligeiramente melhores
durante e depois da transferência da água doce para a água do mar, com reflexos sobre a taxa
de mortalidade, menor no grupo que recebeu a ração acrescida de betaína (JUNNILA, 2000).
Atividade lipotrópica da betaína
Na nutrição animal, a betaína é amplamente discutida como um "modificador de
carcaça” devido à sua ação lipotrópica e de promoção de crescimento (EKLUND et al., 2005).
Constituídos como benefícios de sua inclusão em dieta de animais monogástricos, a redução
no conteúdo de gordura na carcaça, associado com o aumento na porcentagem de carne
magra, são de grande interesse para satisfazer as necessidades do consumidor, na busca de
alimentos mais saudáveis, com menor teor de gorduras (RATRIYANTO et al., 2009). Esta
substância tem sido usada como um agente de redução da homocisteína. As altas
concentrações plasmáticas dessa molécula são consideradas um fator de risco de
enfermidades, como a doença cardíaca coronariana e aterosclerose (MARTINS et al., 2010).
A betaína estimula a mobilização de lipídios do fígado e influi sobre os níveis de
lipoproteínas no sangue, melhorando as funções do órgão, local da homeostase no organismo.
Também estimula a síntese de carnitina, melhorando a oxidação de ácidos graxos na
mitocôndria, reduzindo o acúmulo de gordura nos tecidos. De fato, ela reduz e/ou redistribui a
gordura da carcaça em numerosas espécies animais, com consequente melhora no rendimento
de carcaça (EKLUND et al., 2005).
No estudo de Huang et al. (2008) com suínos na fase de terminação, a adição de 1250
mg/ kg de betaína na dieta aumentou o ganho de peso em 5,5% e melhorou as características
de carcaça. Porém, não afetou o consumo médio diário, nem a conversão alimentar. A
proporção de carne magra e a área de olho de lombo foram aumentadas pela suplementação
de betaína, enquanto a porcentagem de gordura na carcaça e espessura de toucinho
diminuíram 13,1% e 10,3%, respectivamente. A redução da deposição de gordura na carcaça
ocorrendo em suínos alimentados com betaína pode resultar de uma diminuição na taxa de
34
lipogênese no tecido adiposo, em consequência de uma redução na atividade e expressão
gênica de enzimas lipogênicas. Este foi o primeiro estudo a avaliar o seu efeito na expressão
gênica de enzimas lipogênicas em suínos (gene FAS - ácido graxo sintetase). Uma provável
explicação para a redução observada na expressão de mRNA do gen FAS pela betaína,
incluindo as reduções nas atividades de enzimas lipogênicas, pode estar na elevada
concentração circulante de hormônio do crescimento. Numerosos estudos têm estabelecido
que uma determinada concentração de hormônio do crescimento pode estimular o crescimento
muscular e, simultaneamente, reduzir a deposição de gordura. A diminuição do acúmulo de
gordura, devido ao hormônio de crescimento resulta, principalmente, de uma redução na
lipogênese e envolve uma diminuição de adipócitos com sensibilidade à insulina. Além disso,
a redução da lipogênese é consequência da diminuição na atividade e expressão gênica de
enzimas lipogênicas.
Em longo prazo, a suplementação de betaína (1g/ kg) induziu à dislipidemia e aumento
da concentração de colesterol na gordura subcutânea dorsal de suínos Alantejanos, uma raça
de suínos com forte tendência ao acúmulo de gorduras. No entanto, esta suplementação não
afetou a deposição de gordura corporal desses animais, assim como o conteúdo de lipídios
totais do músculo e do tecido adiposo subcutâneo também não foram alterados (MARTINS et
al., 2010).
Sales (2011) utilizando técnicas de meta-análise, avaliou os benefícios da inclusão de
betaína na ração sobre o crescimento e características de carcaça de suínos na fase de abate,
evidenciando o seu efeito sobre a diminuição na gordura da carcaça. Tal efeito também foi
observado por Ribeiro et al. (2011) em suínos, na fase de terminação.
No mesmo trabalho acima, animais que receberam ração suplementada com betaína
(0,1%; 0,2% e 0,3%) tiveram sua espessura de toucinho afetada (p < 0,05), sendo que a adição
de 0,3% proporcionou maior espessura de toucinho (ET), enquanto que concentrações de
0,1% e 0,2% apresentaram os melhores resultados. Pode-se inferir, portanto, que há um limite,
a partir do qual, a suplementação de betaína deixa de ser eficiente na redução da ET. Portanto,
ela pode, simplesmente, promover um aumento na disponibilidade do nutriente da dieta,
permitindo, então, uma melhor utilização da energia pelo tecido muscular, diminuindo a
formação de tecido adiposo (RIBEIRO et al., 2011).
35
Betaína na produção animal
Em um experimento com cabras, utilizaram-se dois grupos de 30 animais, alimentados
com uma dieta contendo ou não betaína (4 g/ kg), para estudar o efeito de sua adição na dieta
sobre a produção de leite, sua composição química e composição de ácidos graxos no leite. Os
tratamentos foram administrados 10 dias antes do parto e durante o período de lactação, nos
cinco meses seguintes ao parto. Ao final desse período de lactação, os resultados mostraram
um aumento significativo (p < 0,05) da produção de leite (0,28 kg) e de sua porcentagem em
gorduras nas cabras alimentadas com dietas suplementadas, em relação ao grupo controle. A
adição de betaína aumentou ligeiramente o conteúdo de compostos metílicos livres no leite,
tais como creatina, metionina e carnitina, mesmo que não sendo de forma significativa em
relação ao controle. O incremento do conteúdo de ácidos graxos de cadeias longas no leite
pode ser atribuído a uma melhora da digestibilidade dos lipídios dietéticos favorecida pela
betaína. Seus efeitos benéficos observados estão relacionados, principalmente, ao seu papel
como um doador de grupos metil e efeito poupador de colina e metionina, que podem ser
relacionados diretamente com o metabolismo lipídico (ARANTZAMENDI et al., 2006).
Em suínos, avaliou-se o efeito de altos níveis de betaína (10,5 g/ kg ração) como
aditivo em dietas sobre a performance de crescimento, qualidade de carcaça, lipídios
plasmáticos e qualidade sensorial da carne. Utilizaram-se 36 animais da raça Landrace, dos 53
dias até 156 dias de idade. A suplementação de dietas ricas em gordura com betaína não
conseguiu melhorar o desempenho de crescimento, qualidade de carcaça, digestibilidade de
nutrientes ou qualidade sensorial da carne suína. O tipo genético dos animais ou o regime de
alimentação restrita utilizada no presente experimento pode ter contribuído para a falta de
resposta da betaína na qualidade de carcaça. A falta de efeitos sobre a qualidade da carcaça
também pode ser explicado pelos altos níveis de doadores metil presentes na dieta basal,
devido ao conteúdo de aminoácidos sulfurados ou, ainda, à quantidade elevada de colina aí
presente, ultrapassando as exigências na ordem de 1.245 mg/ kg de ração (OVERLAND et al.,
1999).
Fernandez-Figares et al. (2002), quando utilizaram diferentes inclusões de betaína (0
%; 0,125 %; 0,25 %; e 0,50 %) na alimentação de suínos em fase de crescimento, dos 36 aos
64 kg, não obtiveram diferenças no ganho de peso ou na conversão alimentar entre os grupos
tratados e controle. É possível que os seus efeitos positivos sobre o desempenho de
crescimento e características de carcaça sejam mais evidentes somente sob certas condições,
especialmente durante estresse metabólico ou estresse nutricional.
36
A adição de 0,5% de betaína em dietas de suínos na fase de crescimento com
alimentação restrita resultou em uma diminuição em algumas medidas de gordura na carcaça
(10%), com um aumento concomitante da taxa de deposição de proteína na carcaça (23%).
Estes dados sugerem que ela altera a partição de nutrientes na alimentação restrita de suínos
jovens, de tal forma que a deposição de proteína é reforçada, em detrimento aparente da
deposição de gordura na carcaça e, desta forma, a betaína pode ser útil como um agente de
distribuição de aminoácidos em situações de baixa ingestão de energia (FERNANDEZFIGARES et al., 2002).
Evidenciaram-se efeitos benéficos da suplementação de betaína em fêmeas suínas no
período de lactação. Dentre elas, aquelas alimentadas com ração que a continha na proporção
de 2 kg/ ton., apresentaram uma redução do intervalo desmame-cio, reduzindo os dias não
produtivos, e produziram leitões mais pesados ao desmame (PIMENTEL et al., 2009). A
betaína pode ter aumentado a produção de leite das porcas suplementadas. A redução dos dias
não produtivos e o maior peso ao desmame favorecem a uma maior quantidade de carne
produzida por fêmea/ ano.
Ramis et al. (2011) não observaram diferenças significativas entre o grupo tratado com
2 kg de betaína por tonelada de ração e o grupo controle, em relação à perda de peso corporal
e perda de toucinho em porcas durante a lactação, embora o consumo médio diário de ração
tenha sido menor no grupo tratado. A perda de gordura subcutânea durante a lactação,
aparentemente, não influenciou o desempenho da parição posterior. A redução do consumo
médio diário de ração no parto posterior no grupo com betaína sugere um melhor uso da
energia e dos recursos mobilizados durante a lactação, ou, possivelmente, um uso mais
eficiente de recursos alimentares nutricionais.
Fêmeas arraçoadas com dieta contendo betaína apresentaram um maior numero de
leitões nascidos vivos e desmamados no parto subsequente (RAMIS et al., 2011). O estado
metabólico da porca durante a lactação influencia a maturação folicular após o desmame e é
um determinante crítico da fertilidade subsequente. Uma maior disponibilidade de energia
durante a lactação pode melhorar o desenvolvimento folicular, resultando em um maior
número de oócitos presentes na ovulação. O número de leitões nascidos correlacionou-se
negativamente com a perda de peso da fêmea na lactação anterior. O intervalo desmame-cio
foi menor no grupo com betaína, 4,7 dias versus 5,7 dias em animais do grupo controle, uma
diferença significativa de 19%.
37
Leitões de porcas alimentadas com betaína apresentaram ganho médio diário (GMD)
durante a lactação de 200 g, enquanto no grupo controle o GMD foi de 183,5 g. O peso da
leitegada aos 18 dias de idade foi maior nas leitegadas de porcas e marrãs alimentadas com
ração tratada. Isto pode sugerir que a produção de leite foi maior no grupo de betaína, já que
as análises qualitativas do colostro e do leite não diferiram entre os grupos. No entanto, devese também levar em conta que o conteúdo de betaína no leite foi maior no grupo de porcas
tratadas do que nos controles. Leitões do grupo tratado receberam 0,219 g de betaína por kg
de leite, em comparação com leitões do grupo controle, que receberam 0,125 g por kg de leite
(RAMIS et al., 2011).
Em experimentos mais recentes com suínos na fase de terminação, obtiveram-se
diferenças significativas para GMD e conversão alimentar (CA) (p < 0,05) entre os
tratamentos (0%, 0,1%, 0,2% e 0,3%), sendo que os animais alimentados com 0,2 e 0,3% de
betaína apresentaram os melhores desempenhos. Em termos percentuais, para CA, a adição
destes valores percentuais, quando comparada com o controle, foi superior 12,5 e 11,0%,
respectivamente, e 9,0% para GMD. O benefício da utilização de betaína nas fases de
crescimento e terminação tem sido atribuído a uma melhora na relação energia/ingrediente
das rações, através da redução na exigência de mantença. Em rações comerciais com ingestão
energética subótima, a betaína utilizada como suplemento pode resultar em melhorias na sua
eficiência em até 8%. Assim, pode-se reduzir o aporte energético da dieta, representando uma
economia considerável, sem afetar o desempenho dos animais (RIBEIRO et al., 2011).
Estudos com a adição da betaína no sêmen
Na literatura consultada, ainda não foram relatados os efeitos da utilização da betaína
na alimentação de reprodutores sobre a produção ou qualidade espermática, apenas sua
aplicação em diluente para criopreservação do sêmen de mamíferos domésticos. É bem
conhecida que a sobrevivência das células é muito maior após armazenamento do sêmen
líquido do que na forma congelada. Com declínios de temperatura, há uma redução inevitável
no proporção de espermatozoides que mantêm a integridade da membrana normal e de seus
componentes bioquímicos (JOHNSON et al., 2000).
A criopreservação de espermatozoides de mamíferos é um processo complexo, que
envolve o equilíbrio de muitos fatores, com a finalidade de obter resultados satisfatórios. Para
garantir o sucesso nessa técnica é necessário conhecer a fisiologia do espermatozoide, que é
38
essencial para maximizar a recuperação pós-descongelação de espermatozoides e,
consequentemente, a fertilidade (PURDY, 2006).
O sêmen suíno difere em vários aspectos do produzido por outros animais domésticos,
é gerado em grande volume e é extremamente vulnerável a choque pelo frio ou resfriamento
brusco, imediatamente após a coleta. O sucesso do congelamento de sêmen suíno depende da
compreensão dos fatores e as suas respectivas interações, que influenciam a capacidade dos
espermatozoides para sobreviver ao congelamento e descongelamento. Os fatores podem ser
classificados em duas categorias: (1) fatores internos ou fixos, tais como as características
inerentes aos espermatozoides e as diferenças entre machos e ejaculados; e (2) fatores
externos, tais como a composição dos diluentes, tipo e concentração de agentes crioprotetores,
as taxas de diluição e de resfriamento, o método de equilíbrio, e de congelamento e
descongelamento do sêmen (JOHNSON et al., 2000).
Em relação ao meio de diluição, numerosos trabalhos têm sido efetuados com a
finalidade de desenvolver um diluente para diferentes machos domésticos. O uso de várias
substâncias adicionadas ao diluente como substâncias antioxidantes (JEONG et al., 2009;
VALLORANI, et al., 2010), bem como, diferentes meios como o leite desnatado
(MEIRELLES et al., 1998; TONIOLLI et al., 2001) e a água de coco (NUNES;
SALGUEIRO, 1999: CARDOSO et al., 2002; TONIOLLI et al., 2010), foram utilizados na
conservação do sêmen de diversas espécies domésticas, além do homem.
A avaliação de crioprotetores alternativos ao glicerol para preservação de
espermatozoides tornou-se uma área de extensa investigação nos últimos anos (FAGUNDES
et al., 2010). Os mais comuns crioprotetores não penetrantes utilizados são a gema de ovo
(CARDOSO et al., 2003) e o leite desnatado sem gordura (KULAKSIZ et al., 2012).
Pesquisas recentes também identificaram outros produtos químicos impermeáveis à
membrana que podem ser utilizados como agentes crioprotetores, como os aminoácidos
(PURDY, 2006).
Alguns aminoácidos têm sido empregados na criopreservação de sêmen de várias
espécies de mamíferos, tais como a glutamina (MERCADO et al., 2009), histidina
(JUNNILA, 2000), metionina (ÇOYAN et al., 2010), betaína (LINDEBERG et al., 1999),
prolina (PEÑA et al., 1998), cisteína (EL-SHESHTAWY et al., 2008), alanina e glicina
(FAGUNDES et al., 2010). Eles têm sido usados com sucesso na congelação de sêmen equino
(JUNNILA, 2000), canino (PEÑA et al., 1998) bovino (EL-SHESHTAWY et al., 2008) e
ovino (ÇOYAN et al., 2010). Os aminoácidos são moléculas carregadas, é possível que eles
39
interajam eletrostaticamente com os grupos fosfato dos fosfolipídios da membrana plasmática
do espermatozoide, formando assim uma camada sobre superfície da célula, protegendo-a
contra choques térmicos (EL-SHESHTAWY et al., 2008). Isto pode contribuir para sua
capacidade de manter a integridade de membrana acrossomal dos espermatozoides, durante o
processo de criopreservação (FAGUNDES, 2008). Estudos sugerem que combinações desses
crioprotetores pode ser benéfica para a criopreservação de sêmen de várias espécies
(FAGUNDES et al., 2010).
A capacidade dos aminoácidos em melhorar a criosobrevivência dos espermatozoides
tem sido relacionada com suas propriedades metabólicas e crioprotetoras, oxidantes ou
osmorregulativas (MARTINS-BESSA et al., 2007). Uma vez que os aminoácidos não podem
penetrar a membrana do espermatozoide, então, mecanismos osmóticos podem explicar, em
parte, a sua ação (TRIMECHE et al., 1999). Apesar de ter sido verificado o efeito crioprotetor
sobre espermatozoides em diversas espécies, os mecanismos de crioproteção espermática
conferidos pelos aminoácidos, assim como a função de aminoácidos livres na fisiologia do
espermatozoide, ainda não foram esclarecidos (FAGUNDES et al., 2010).
A betaína quando adicionada ao sêmen fresco de touros (100 e 200 mM), melhorou
significativamente o percentual de espermatozoides móveis a 20°, 5° e a 0°C. Além disso,
melhorou a motilidade espermática do sêmen de touros ditos como “congeladores pobres”, ou
seja, os que apresentam motilidade abaixo de 20% após resfriamento (ZHANG et al., 2001).
No sêmen canino, estudaram-se os efeitos da adição de diferentes concentrações de
prolina e betaína combinadas no diluente de congelação (0; 10; 20; e 40 mMol/ L), num total
de 16 tratamentos. A adição de betaína, em comparação com a amostra controle, não
melhorou a motilidade ou integridade da membrana plasmática, embora seu efeito não tenha
sido negativo. Não há referências sobre efeitos da adição da betaína no plasma seminal
canino. Acredita-se que a betaína possa agir sobre os espermatozoides da mesma forma que a
carnitina (com um grau variável de atividade), aumentando a utilização de lipídios e
aumentando, assim, a síntese de adenosina trifosfato (ATP). Mas, se o processo de
congelação/descongelação afeta o metabolismo mitocondrial do sêmen canino, a betaína
talvez não seja capaz de aumentar a utilização de lipídios para produção de energia ou
melhorar a motilidade espermática em espermatozoides caninos descongelados a 39 °C, já
que o sistema metabólico poderia ter sido danificado. Se isto estiver correto, então a adição de
betaína ao diluente não implicará numa vida mais longa para os espermatozoides (PEÑA et
al., 1998).
40
Da mesma forma, Lindeberg et al. (1999), obtiveram maiores valores de motilidade
espermática e motilidade progressiva na concentração de 0,25 %, não havendo diferenças
significativas entre as concentrações menores que 4% para o sêmen equino. Quando foram
adicionados 4 e 5% do aminoácido, a motilidade espermática foi reduzida, verificando-se um
possível efeito deletério da betaína. Essa possível toxicidade é provocada pela alta
concentração do aminoácido e seu efeito osmótico (TRIMECHE et al., 1999).
Junnila (2000) avaliou a adição do aminoácido betaína ao diluente de sêmen de
garanhão sobre a motilidade espermática pós congelação, e obteve que concentrações acima
de 1,5% melhoraram a motilidade espermática pós-descongelação. A adição de 2,5% ao
diluente usado na congelação de espermatozoides de garanhão aumentou significativamente a
motilidade progressiva pós-descongelação dos espermatozoides, mantendo 95% da motilidade
original. Uma explicação para o efeito positivo da betaína seria seu possível papel como um
osmólito intracelular no esperma de garanhão, um papel semelhante ao exibido por ela em
outras células. Também é possível que a betaína, neste contexto, impeça a desnaturação das
proteínas estruturais e enzimas, causada pela desidratação progressiva das células e evite os
efeitos osmóticos dos solutos no fluido intracelular de espermatozoides.
Considerações finais
A betaína, alvo de vários estudos em diferentes espécies animais, apresenta efeitos
benéficos comprovados no tocante ao desempenho produtivo de suínos e aves, à qualidade da
carcaça de suínos e à congelação de sêmen de garanhão. A sua principal aplicação parece
estar relacionada à substituição parcial da metionina da dieta, gerando vantagens econômicas
para o produtor sem que haja o comprometimento do desempenho animal; resta conhecer seus
efeitos sobre a produção e qualidade espermática de reprodutores suplementados com o
produto em questão.
Referências Bibliográficas
ARANTZAMENDI, L.; DURÁN, R; BLANCH, A. Producción lechera y rendimiento
productivo en pequeños ruminantes: Betaína, mecanismos de acción. Revista Albeitar,
Zaragoza, v. 97, p.54-55, 2006.
ATTIA, Y. A.; HASSAN, R.A.; SHEHATTA, M.H.; ABD EL-HADY, S. B. Growth, Carcass
Quality and Serum Constituents of Slow Growing Chicks as Affected by Betaine Addition to
Diets Containing 2. Different Levels of Methionine. International Journal of Poultry
Science, v.4, n.11, p. 856-865, 2005.
41
CARDOSO, R. de C. S.; SILVA, A.R.; UCHOA, D.C.; SILVA, L.D.M. da. Criopreservação
de sêmen canino com um diluidor à base de água de coco. Ciência Rural, v. 32, n.4, p. 657661, 2002.
CARDOSO, R. de C. S.; SILVA, A.R.; UCHOA, D.C.; SILVA, L.D.M da. Cryopreservation
of canine semen using a coconut water extender with egg yolk and three different glycerol
concentrations. Theriogenology, v.59, p. 743-751, 2003.
ÇOYAN, K.; BASPINAR, N.; BUCAK, M.N.; AKALIN, P.P; ATAMAN, M.B.; ÖMÜR,
A.D.; GÜNGÖR, S.; KÜÇÜKGÜNAY, S.; ÖZKALP, B.; SARIÖZKAN, S. Influence of
methionine and dithioerythritol on sperm motility, lipid peroxidation and antioxidant
capacities during liquid storage of ram semen. Research in Veterinary Science. v. 89, p.
426–431, 2010.
EKLUND, M.; BAUER, E.; WAMATU, J.; MOSENTHIN, R. Potential nutritional and
physiological functions of betaine in livestock. Nutrition Research Reviews, v. 18, p. 31–48,
2005.
EL-SHESHTAWY, R. I.; EL-SISY, G.A.; EL-NATTAT, W.S. Use of selects aminoacids to
improve buffalo bull semen cryopreservation. Global Veterinária, v. 2, p. 146-150, 2008.
FAGUNDES, B. Adição de aminoácidos e insulina ao meio crioprotetor seminal de garanhões
da raça Mangalarga Marchador. JBCA – Jornal Brasileiro de Ciência Animal, v. 1, n. 1,
2008. Disponível em: <http://www.jbca.com.br/v1n1/resumos/resumo7.pdf> Acesso em:
12/04/2012.
FAGUNDES, B.; SILVA, J.F.S.; SHIMOYA,A.; CUNHA, I.C.N. DA; SOUZA, G.V, DE;
TILBURG, M.F. VAN. Adição de alanina, glicina e glutamina ao meio crioprotetor seminal
de garanhões Mangalarga Marchador. Revista Brasileira de Zootecnia, v.39, n.2, p.279-284,
2010.
FERNANDEZ-FIGARES, I.; WRAY-CAHEN, D.; STEELE, N. C.; CAMPBELL, R. G.;
HALL, D. D.; VIRTANEN, E.; CAPERNA, T. J. Effect of dietary betaine on nutrient
utilization and partitioning in the young growing feed-restricted pig. Journal of Animal
Science, v. 80, p.421–428, 2002.
HUANG, Q-C.; XU, Z.R., HAN, X.Y., LI, W.F. Effect of dietary betaine supplementation on
lipogenic enzyme activities and fatty acid synthase mRNA expression in finishing pigs.
Animal Feed Science and Technology, v.140, p. 365–375, 2008.
JEONG, Y-J;. KIM, M-K.; SONG, H-J; KANG, E-J; OCK, S-A.; KUMAR, B.M.;
BALASUBRAMANIAN, S.; RHO, G.J. Effect of a-tocopherol supplementation during boar
semen cryopreservation on sperm characteristics and expression of apoptosis related genes.
Cryobiology, v. 58, p. 181–189, 2009.
JOHNSON, L. A.; WEITZE, K. F., FISER, P., MAXWELL, W. M. C. Storage of boar semen.
Animal Reproduction Science, v. 62, p. 143-172, 2000.
JUNNILA, M. Betaine as a lipotropic agent and as na alleviator of osmotic stress. 2000.
70f. Trabalho de Conclusão de Curso (Graduação em Medicina Veterinária) - Faculty of
Veterinary Medicine, University of Helsinki, Helsinki, 2000.
42
KULAKSIZ, R.; ÇEBİ,Ç.; AKÇAY,E. The effect of different extenders on the motility and
morphology of ram sperm frozen or stored at 4 °C. Turkey Journal of Veterinary and
Animal Sciences, v.36, n.2, p.177-182, 2012.
LINDEBERG, H.; KURTEN, A.; KOSKINEN, E.; KATILA, T. Freezing of stallion semen
with addition of glycine betaine. Journal of Veterinary Medicine Serie A, v. 46, p. 87-90,
1999.
MARTINS, J. M.; NEVES, J. A.; FREITAS, A.;TIRAPICOS, J. L.. Betaine supplementation
affects the cholesterol but not the lipid profile of pigs. European Journal of Lipid Science
and Technology, v.112, p. 295–303, 2010.
MARTINS-BESSA, A., ROCHA, A.,MAYENCO-AGUIRRE, A. Incorporation of taurine
and hypotaurine did not improve the efficiency of the Uppsala Equex II extender for dog
semen freezing. Theriogenology, v.68, p. 1088–1096, 2007.
MEIRELES, L.S.; MALSCHITSKY, E.; NEVES, A.P.; VIEIRA, M.J.; KELLER, A.; HÖTT,
A.K.; MORAES, I.M.A. de; GARBADE, P.; GREGORY, R.M.; MATTOS, R.C. Leite em pó
desnatado não inativado e leite desnatado UHT para a preservação e fertilidade do sêmen
equino resfriado. Veterinária Ciência Rural, v. 28, n.3, p. 467-470, 1998.
MERCADO, E. D. E.; HERNANDEZ, M.; SANZ, E.; RODRIGUEZ, A.; GOMEZ, E.;
VAZQUEZ, J.M.; MARTINEZ, E.A.; ROCA, J. Evaluation of l-glutamine for
cryopreservation of boar spermatozoa. Animal Reproduction Science, v.115, p. 149–157,
2009.
MOECKEL, G. W.; SHADMAN R, FOGEL JM, SADRZADEH SMH. Organic osmolytes
betaine, sorbitol and inositol are potent inhibitors of erythrocyte membrane ATPases. Life
Sciences; v. 71, p.2413–2424, 2002.
NUNES, J. F.; SALGUEIRO, C. C. de M. Utilização da água de coco como diluidor de
sêmen de caprinos e ovinos. Revista Científica de Produção Animal, v.1, n.1, p. 17-26,
1999.
OLLERO, M.; MUIFIO-BLANCO, T.; LOPEZ-PEREZ, M.J.; CEBRIAN PEREZ, J.A.
Surface changes associated with ram sperm cryopreservation revealed by counter-current
distribution in an aqueous two-phase system effect of different cryoprotectants. Journal of
Chromatography B, v.680, p.157-164, 1996.
OVERLAND, M.; RORVIK, K. A.; SKREDE, A. Effect of trimethylamine oxide and betaine
in swine diets on growth performance, carcass characteristics, nutrient digestibility, and
sensory quality of pork. Journal of Animal Science, v. 77: p. 2143-2153, 1999.
PEÑA, A.I.; BARRIO, F.; QUINTELA, L.A.; HERRADON, P.G. Proline and Glycine
Betaine in a Diluent for Freezing Canine Spermatozoa. Reproduction in Domestic Animal,
v. 33, n.1, p. 5-9, 1998.
PIMENTEL, M. S.; COSTA, G.M.; MARTINS, L.A.O; ANDRADE, T.S.; COSTA, R.B.;
RONDINA, D.; EVANGELISTA, J.N.B. Efeito da suplementação de betaína sobre o
intervalo desmame cio. . In: CONGRESSO DA ABRAVES, 14, 2009, Uberlândia, MG.
Anais...Uberlândia: ABRAVES, 2009. 548-549p.
43
PURDY, P.H. A review on goat sperm cryopreservation. Small Ruminant Research, v.63, p.
215–225, 2006.
RAO, S. V. R.; RAJU, M. V. L. N.; PANDA, A. K.; SAHARIA, P.; SUNDER, G S. Effect of
Supplementing Betaine on Performance, Carcass Traits and Immune Responses in Broiler
Chicken Fed Diets Containing Different Concentrations of Methionine. Asian-Australasian
Journal of Animal Sciences, v. 24, n.5, p. 662 – 669, 2011.
RAMIS, G.; EVANGELISTA, J.N.B.; QUEREDA, J.J.; PALLARÉS, F.J.; FUENTE, J. M.
DE LA; MUÑOZ, A. Use of betaine in gilts and sows during lactation: effects on milk
quality, reproductive parameters, and piglet performance. Journal of Swine Health and
Production. v. 19, n.4, p. 226-232, 2011. Disponível em:
<http://www.aasv.org/shap/issues/v19n4/v19n4p226.pdf> Acesso em: 09/03/2012.
RATRIYANTO, A.; MOSENTHIN, R.; BAUER, E.; EKLUND, M. Metabolic,
Osmoregulatory and Nutritional Functions of Betaine in Monogastric Animals. AsianAustralasian Journal of Animal Sciences, v. 22, n. 10, p. 1461 – 1476, 2009.
RIBEIRO, P. R.; KRONKA, R.N.; THOMAZ, M.C.; HANNAS, M.I.; TUCCI, F.M.;
SCANDOLERA, A.J.; BUDIÑO, F.E.L. Diferentes níveis de betaína sobre incidência de
diarreia, desempenho, características de carcaça e parâmetros sanguíneos de suínos. Brazilian
Journal of Veterinary Research and Animal Science, São Paulo, v. 48, n. 4, p. 299-306,
2011. Disponível em: <http://www.revistasusp.sibi.usp.br/pdf/bjvras/v48n4/a04v48n4.pdf>
Acesso em: 11/02/2012.
SALES, J. A meta-analysis of the effects of dietary betaine supplementation on finishing
performance and carcass characteristics of pigs. Animal Feed Science and Technology, v.
165, p.68–78, 2011.
TONIOLLI, R.; JATAHY, P.C.; SILVA, M.C.; MOREIRA, F.R. da C.. Utilização do leite
desnatado e do ácido 3-indol acético na conservação do sêmen suínos. Ciência Animal, v.11,
n.1, p.21-26, 2001.
TONIOLLI, R.; TONIOLLO, G.H.; FRANCESCHINI, P.H.; MORATO, F.M.A.C.. Uso do
diluente água de coco em pó (ACP-103®) na conservação prolongada do sêmen do varrão:
avaliação in vitro e in vivo. Arquivos Brasileiros de Medicina Veterinária e Zootecnia,
v.62, n.5, p.1072-1079, 2010.
TRIMECHDE, A.; YVON, J.M.; VIDAMENT, M.; PALMER, E.; MAGISTRINI, M. Effects
of glutamine, proline, histidine and betaine on post-thaw motility of stallion spermatozoa.
Theriogenology, v. 52, p. 181-191, 1999.
VALLORANI, C.; SPINACI, M.; BUCCI, D; TAMANINI, C. GALEATI, G. Effects of
antioxidants on boar spermatozoa during sorting and storage. Animal Reproduction Science,
v. 122 , p. 58–65, 2010.
ZHANG, B.R.; BUHR, M; KROETSCH, T.; LEIBO, S.P. Glycine betaine improves survival
of fresh bovine spermatozoa. Reproduction, Fertility and Development, v.13, n. 3, p. 187 –
192, 2001.
44
7. CAPÍTULO II
Uso de diferentes diluentes e temperatura alternativa na
conservação do sêmen do varrão
Use of alternative Diluents and Temperatures in long term storage of boar semen
Araújo, Lina Raquel Santos; Barros, Tatyane Bandeira; Guimarães, Daianny Barboza;
Cantanhêde, Ludymila Furtado; Dias, Aline Viana; Toniolli, Ricardo
Periódico: Ciência Animal Brasileira
Submetido em: 09 junho de 2012.
45
7. CAPITULO II
USO DE DILUENTES E TEMPERATURAS ALTERNATIVAS NA
CONSERVAÇÃO PROLONGADA DO SÊMEN DO VARRÃO
Araújo, Lina Raquel Santos1; Barros, Tatyane Bandeira1; Guimarães, Daianny Barboza1;
Cantanhêde, Ludymila Furtado 1; Dias, Aline Viana1; Toniolli, Ricardo 2
1
Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias; 2Laboratório de Reprodução Suína e
Tecnologia de Sêmen, Universidade Estadual do Ceará (UECE). CORRESPONDENCIA: Toniolli, R.
[[email protected]] FONE:(85) 3101.9838 Av. Paranjana, 1700 – Campus Itaperi, Fortaleza-Ce,
CEP: 60.740-000. Trabalho faz parte de Dissertação de Mestrado.
RESUMO
O uso de diluentes adequados é um dos principais pontos a serem considerados para o sucesso de um
programa de inseminação artificial. O objetivo deste experimento foi avaliar a eficiência de diluentes
alternativos para sêmen suíno, conservado em diferentes temperaturas. Foram utilizados os diluentes:
Beltsville Thawing Solution (BTS); Água de coco em pó (ACP-103®) e Leite em pó desnatado (LPD),
submetidos a 17 e 10 °C. Os 50 ejaculados foram analisado in natura e após diluição (D0 a D4)
através do vigor e motilidade espermática. Avaliou-se a integridade do acrossoma e a vitalidade no D0
e D4. Foram utilizados os testes de Mann-Whitney e o qui-quadrado (p < 0,05). O diluente LPD a
10°C apresentou motilidade e vigor espermático superiores em relação ao BTS e ACP (10 °C) até D2,
e aos tratamentos conservados a 17 °C (p < 0,05). A taxa de vitalidade e de integridade acrossomal, no
D0 e D4 foi maior para os tratamentos com LPD a 10 °C (p < 0,001). O LPD mostrou ser um bom
meio diluente para o sêmen suíno em temperatura mais baixa (10 °C), conferindo uma maior proteção
à célula espermática, através de maiores taxas de vitalidade e integridade de acrossoma.
Palavras-chave: leite desnatado, água de coco, conservação, sêmen, varrão.
USE OF ALTERNATIVE EXTENDER AND TEMPERATURES IN LONG TERM
STORAGE OF BOAR SEMEN
ABSTRACT
The use of appropriate diluents is one of the main points to consider for the success of an artificial
insemination program. The objective of this study was to evaluate the efficiency of alternative diluents
for swine semen, kept at different temperatures. Diluents used were: Beltsville Thawing Solution
(BTS), powdered coconut water (CWP-103®) and skimmed milk powder (SMP), subjected to
temperatures of 17 and 10 °C. The 50 ejaculated was analyzed in natura and after dilution (D0 a D4),
through the spermatic vigor and motility. Semen smears were made in the D0 and D4, considered the
acrosome integrity and vitality. Data was analyzed using the Mann-Whitney and chi-square tests
(p<0.05). The SMP diluents at 10°C presented higher motility and sperm vigor compared to the BTS
and CWP until D2, and to treatments stored at 17 °C. The rate of vitality and integrity of the acrosome,
the D0 and D4, the SMP 10 °C remained higher (p<0.001). The SMP showed to be a good diluent for
the swine semen at lower temperature (10 °C). Furthermore, it gave a better protection to sperm cells,
by providing greater integrity and vitality of the acrosome.
Keywords: skim milk, coconut water, conservation, semen boar.
46
INTRODUÇÃO
O processamento do sêmen utilizando diluentes adequados é um dos pontos
importantes para o sucesso de um programa de inseminação (CORRÊA et al., 2001). Sua
utilização no preparo das doses de sêmen tem como finalidade aumentar o volume, proteger a
célula contra o choque térmico, fornecer substratos necessários ao metabolismo espermático,
estabilizar o pH, inibir o crescimento bacteriano e manter o espermatozoide viável até o
momento de ser introduzido no genital da fêmea (CORRÊA et al., 2001; BORTOLOZZO, et
al., 2005).
O sêmen suíno é o mais sensível às flutuações de temperatura (CORRÊA et al., 2001)
e uma queda abaixo dos 15 °C pode causar choque térmico, com lesões irreversíveis na
estrutura das células e perda de sua motilidade (SCHEID, 2003), da permeabilidade seletiva e
da integridade da membrana plasmática do espermatozoide, o que pode levar à sua morte
(WATSON, 1996).
A viabilidade do sêmen suíno mantém-se satisfatória durante 72 horas, à temperatura
de 16 °C, em diferentes diluentes até então utilizados (FIGUERÔA et al., 2001), sendo esse
período insuficiente para um bom aproveitamento dos reprodutores. A procura por novos
diluentes levou pesquisadores a estudarem a água de coco em pó (NUNES; SALGUEIRO,
1999; TONIOLLI et al., 2001; CARDOSO et al., 2002) e o leite desnatado (MEIRELES et
al., 1998; TONIOLLI et al., 2010) como alternativas viáveis na substituição dos tradicionais
diluentes.
Deste modo, um diluente que permita um maior período de conservação do ejaculado,
é importante para o sucesso dos resultados da inseminação artificial (PEREZ-GARCIA, 1958;
TONIOLLI et al., 1998). Assim, se faz necessário o desenvolvimento de técnicas e soluções
que permitam a utilização do sêmen resfriado, sem queda dos resultados de fertilidade em
particular na espécie suína (TONIOLLI et al., 1998; TONIOLLI et al., 2001). O objetivo deste
experimento foi avaliar a eficiência de diluentes alternativos para sêmen suíno, conservado
em diferentes temperaturas.
MATERIAL E MÉTODOS
01. Animais, coleta e análise do sêmen in natura
O sêmen de cinco reprodutores foi coletado durante 10 semanas (n = 50), por meio da
técnica da mão enluvada em recipiente coberto por filtro e protegido por copo térmico. Foi
utilizado o ejaculado total após a separação da parte gelatinosa. Foram utilizados animais com
47
idades variáveis entre 12 e 24 meses, provenientes do Laboratório de Reprodução Suína e
Tecnologia do Sêmen – da FAVET/UECE. A qualidade do ejaculado foi avaliada pela
concentração (x106 sptz/mL), volume (mL), total de espermatozoides (x10 9 sptz), vigor
espermático (0 a 5) e total células móveis (%). Só foram aproveitados os ejaculados que
apresentassem valores de ≥3,0 para o vigor e ≥80% de espermatozoides móveis.
02. Diluíção do sêmen e tratamentos experimentais
Foi separado de cada ejaculado um total de 2,63 x109sptz, repartido equitativamente
entre os seis tratamentos (35 x106 sptz/mL), com um volume final por tratamento de 12,5 mL
(sêmen+diluente), envazados em cinco tubos de ensaio/tratamento (2,5 mL = 87,5 x106
sptz/tubo). O dia da coleta foi considerado dia zero (D0) e o sêmen foi conservado até quatro
dias após (D4), com análises diárias em D0, D1, D2, D3 e D4. Foram testados três
tratamentos: 01. O Beltsville Thawing Solution (BTS – controle); 02. O diluente água de coco
em pó (ACP-103®), oriundo da desidratação da água de coco in natura, pela técnica do spray
dry (SALGUEIRO et al., 2002). O diluente era reconstituído com água destilada nas seguintes
proporções: 24g de ACP + 100 mL de água destilada + sulfato de gentamicina a 80 mg/ 100
mL; 03. O leite em pó desnatado (LPD), diluído em água destilada nas seguintes proporções:
10 g de LPD + 0,194 g de glicose + 100 mL de água destilada + sulfato de gentamicina a 80
mg/ 100 mL. Cada 100 g de LPD era composto por: carboidratos (56 g); proteínas (20,8 g);
fibra solúvel (9,6 g); sódio (300 mg); cálcio (2 g); ferro (17,2 mg); vitaminas A (564 µg), D (6
µg), E (18,8 mg) e C (92 mg) e ácido fólico (480 µg). Esses três diluentes foram submetidos a
duas temperaturas de conservação, 17 e 10 °C, totalizando os seis tratamentos. As amostras
conservadas a 10 °C permaneceram inicialmente estocadas a 17 °C, por 1 hora antes de serem
transferidas para a temperatura de conservação (10 °C). A cada dia de análise, foram retirados
os tubos equivalentes a cada ejaculado/tratamento, incubados a 39 °C por 10 minutos.
03. Análises do sêmen diluído durante a conservação
Para a avaliação da qualidade espermática, foi analisado o vigor espermático (0 a 5)
(TONIOLLI, 1996) e a porcentagem de células móveis (%), colocando-se uma gota de sêmen
de 15μL entre lâmina e lamínula, com leitura em microscopia óptica a um aumento de 200
vezes. O sêmen diluído e conservado em ambas as temperaturas foi reaquecido a 39 °C, com
leituras feitas após 10 minutos de incubação.
48
Visando as análises morfológicas e de vitalidade (% de espermatozoides vivos),
esfregaços de sêmen foram feitos no D0 (após 6 horas de conservação) (Exame 1) e no D4
(Exame 2). Em ambos os momentos, o sêmen era incubado a 39 °C, durante 10 minutos antes
das análises, onde eram consideradas a integridade do acrossoma e a vitalidade (% de células
vivas). Foram contadas 200 células por esfregaço corado, em microscopia óptica com lente de
imersão (aumento de 1000x). A solução corante utilizada foi formada por: azul de bromofenol
= 0,1g; citrato de sódio = 0,4g; água destilada = 10 mL. Juntou-se uma gota de sêmen com
outra de corante sendo homogeneizada em seguida. Após 30 segundos, procedeu-se ao
esfregaço, sendo secado à temperatura ambiente. Para análises, os espermatozoides foram
classificados em quatro categorias: 1) Vivos com acrossoma intacto; 2) Vivos com acrossoma
danificado; 3) Mortos com acrossoma intacto; 4) Mortos com acrossoma danificado.
04. Análise estatística
O delineamento experimental utilizado foi o de Blocos ao Acaso, usando-se análise de
variância e aplicando-se os testes Mann Whitney, para a comparação entre grupos, e QuiQuadrado, corrigido para os resultados expressos em porcentagem, usando-se o Programa
StatView (versão 5.0.1; SAS Institute Inc. 1992-1998) com nível de significância de 5% (p <
0,05).
RESULTADOS E DISCUSSÃO
O sêmen in natura dos 50 ejaculados analisados no experimento apresentou aspecto
normal, coloração branca leitosa, volume médio de 255 mL e concentração média de 393,4
x106 sptz/mL. Tais características estão dentro da normalidade para a espécie suína
(CORRÊA et al., 2001; SMITAL, 2009). A análise da motilidade espermática, apresentou
uma porcentagem média de 91 ± 6,2 e um vigor espermático de 4,0 ± 0,4. Estes valores se
mantiveram acima dos parâmetros mínimos estipulados pela metodologia para utilização do
ejaculado.
Das amostras conservadas a 17 °C, o LPD (3,2 ± 1,0) apresentou valores de vigor
espermático significativamente maiores em relação aos diluentes BTS (2,3 ± 1,0) e ACP (2,3
± 0,9) no D0 e apenas ao BTS no D1 (p < 0,05). Por outro lado, nos demais dias de
conservação, o BTS apresentou melhores valores para essa característica em relação ao LPD e
ACP, os quais apresentaram resultados ruins e similares aproximando-se de zero a partir do
terceiro dia conservação (D2) (Tabela 1).
49
Neste estudo, a baixa performance do diluente água de coco a 17 °C a partir do D2,
divergiu dos resultados obtidos por Toniolli et al. (2010), que encontraram valores para o
vigor espermático superiores aos do BTS até o quarto dia de conservação (D3), entretanto sem
diferenças significativas entre esses diluentes em D0. Embora já se tenha na literatura
excelentes resultados com a utilização de água de coco na preservação sêmen de diversos
animais domésticos (NUNES; SALGUEIRO, 1999; UCHOA et al., 2002; MEDEIROS, 2008;
RONDON et al., 2008; TONIOLLI et al., 2010), neste estudo em particular, este diluente
repetiu seu desempenho, não se destacando quanto à manutenção do vigor espermático por
mais de 24 horas.
Tabela 1. Vigor espermático do sêmen suíno conservado durante cinco dias em diferentes
temperaturas (17 e 10 °C) nos diluentes BTS, ACP-103® e LPD.
Dias de conservação
Tratamentos
17 °C
10 °C
D0
D1
D2
D3
D4
BTS
2,3 ± 1,0a
1,5 ± 1,0a
1,5 ± 1,0ab
1,3 ± 1,0ab
0,9 ± 0,9a
ACP
2,3 ± 0,9a
2,0 ± 1,0b
0,6 ± 0,9d
0,2 ± 0,6c
0,1 ± 0,5b
LPD
3,2 ± 1,0b
1,9 ± 1,1b
0,1 ± 0,5c
0,0 ± 0,1c
0,0 ± 0,1b
BTS
2,2 ± 0,9a
1,4 ± 1,1a
1,0 ± 1,0b
1,0 ± 1,0a
0,8 ± 1,0a
ACP
2,2 ± 1,0a
1,7 ± 1,2ab
1,6 ± 1,0a
1,2 ± 1,0ab
0,9 ± 0,9a
LPD
3,1 ± 1,1b
2,6 ± 1,1c
2,3 ± 1,0e
1,6 ± 1,1b
1,1 ± 1,1a
Letras diferentes na mesma coluna indicam diferenças estatisticamente significativas (p < 0,05).
Quando o sêmen diluído nos diferentes diluentes testados foi conservado a 10 °C, o
LPD apresentou os maiores valores médios para vigor espermático (p < 0,01) até o terceiro
dia de conservação (D2), em relação aos outros diluentes, indicando uma melhor capacidade
de manutenção dessa característica em temperatura mais baixa, que normalmente provoca
choque térmico (WATSON, 1996) e tem uma ação deletéria sobre o vigor espermático. Em
D3 o LPD igualou-se ao ACP e em D4 não houve diferenças estatísticas entre os três
diluentes testados (p > 0,05).
Em diferentes trabalhos, a utilização do diluente LPD tem apresentado como
resultados, em períodos de conservação a temperaturas mais baixas, valores de vigor
espermático superiores (MEIRELES et al., 1998), com uma melhor manutenção desta
característica por um período de tempo mais prolongado (FREITAS et al., 2011), quando
50
comparado ao BTS ou ACP. Desta forma, este diluente alternativo para o sêmen suíno,
apresenta-se como uma excelente opção de meio conservador, fornecendo uma melhor
condição de sobrevivência para os espermatozoides em temperaturas mais baixas (NUNES et
al., 2011) dispensando dessa forma o uso de conservadoras de sêmen que são mais onerosas.
Não foram verificadas diferenças entre os resultados obtidos com o diluente BTS nas
duas temperaturas de conservação (10 e 17 °C) quanto ao vigor espermático. Para o ACP,
uma mesma tendência foi observada apenas até o segundo dia de conservação. A partir de D2,
os resultados a 10 oC foram significativamente melhores (p < 0,05) até o final do período de
conservação do sêmen. O LPD foi o diluente, aparentemente, melhor adaptado à temperatura
de conservação mais baixa (10 oC). Apenas em D0 os resultados de vigor espermático se
equivaleram aos encontrados a 17 °C (p > 0,05). A partir do D1 os resultados médios a 10 oC
foram sempre melhores do que os encontrados a 17 oC (p < 0,05), que a partir do terceiro dia
de conservação (D2) apresentaram uma queda brusca, zerando seus valores já em D3.
O espermatozoide suíno é uma das células mais sensíveis às flutuações de temperatura
quando comparado aos de outras espécies (CORRÊA et al., 2001). A temperatura ideal para a
manutenção das doses inseminantes situa-se entre 15 e 18 °C, sendo que quedas de
temperatura abaixo de 15 °C normalmente é causa de choque térmico, resultando em lesões
na estrutura celular (WATSON, 1996). Porém, neste estudo, não se verificou uma queda dos
valores do parâmetro vigor espermático devido ao choque térmico, nas amostras incubadas a
baixa temperatura, o que permitiu uma melhor conservação no meio a base de LPD
(FREITAS et al., 2011). À temperatura de 17 °C, o LPD não se caracterizou como um bom
diluente para o sêmen suíno devido a não apresentar uma melhor conservação das
caracteristicas organolépticas do diluente, resultando na deterioração de seus componentes,
fato esse que pode ocorre durante um armazenamento prolongado (KASIMANICKAM et al.,
2011), na presença de contaminação bacteriana, bem como em temperaturas mais altas. Tais
possíveis alterações contribuiram para coagular o leite, fato esse que ocorreu com frequência
a partir do D2, dificultando a realização das análises e a qualidade de conservação das células.
Para a característica porcentagem de espermatozoides móveis, nas amostras
conservadas a 17 °C, o LPD apresentou resultado melhor (p < 0,05) no primeiro dia de
conservação (D0 - 72,9%) em relação aos diluentes BTS e ACP (58,2 e 54,2%,
respectivamente). Esta diferença não pode ser vista já em D2, e nos outros dias até o final do
período de conservação o LPD apresentou os piores resultados. Nesta temperatura, o BTS
manteve uma maior porcentagem de células moveis de D2 até o último dia de conservação
51
(D4), resultados esses melhores (p < 0,05) em relação aos outros dois diluentes testados
(Tabela 2). Os resultados de motilidade espermática divergem de estudos anteriores
utilizando-se a água de coco como diluente de sêmen em relação ao BTS, nos quais se
evidenciou seus efeitos benéficos in vitro sobre a característica de motilidade espermática
(TONIOLLI et al., 1998; TONIOLLI et al., 2001), inclusive mantendo maiores valores para
esta característica durante todo o período de conservação (TONIOLLI et al., 2010).
Igualmente ao que ocorreu com o vigor espermático, em geral, o percentual de células
móveis foi melhor quando mantido pelo diluente BTS a 17 °C durante todo o período de
análise, justificando o fato de ser o diluente mais utilizado nos programas de inseminação
artificial, também pela facilidade de fabricação e baixo preço de comercialização (LEVIS,
2000). Os fatores que resultaram em uma queda acentuada nos percentuais de células móveis
nas amostras conservadas em meio à base de LPD podem ter sido os mesmos já discutidos
para o vigor espermático.
Tabela 2. Total de espermatozoides móveis (%) do sêmen suíno conservado durante cinco
dias em diferentes temperaturas (17 e 10 °C) nos diluentes BTS, ACP-103® e LPD.
Tratamentos
17 °C
10 °C
Dias de conservação
D0
D1
D2
D3
D4
BTS
58,2 ± 27b
36,0 ± 28ab
32,1 ± 26a
26,5 ± 24ac
17,7 ± 21a
ACP
54,2 ± 24ab
44,4 ± 25a
12,8 ± 22b
3,9 ± 13b
1,8 ± 8,8b
LPD
72,9 ± 28c
43,6 ± 28a
2,7 ± 10c
0,1 ± 0,7b
0,1 ± 0,8b
BTS
46,9 ± 25a
27,4 ± 24b
20,1 ± 23b
20,1 ± 23a
13,4 ± 18a
ACP
50,8 ± 26ab
36,1 ± 28ab
31,4 ± 24a
27,3 ± 24ac
14,6 ± 19a
LPD
73,8 ± 26c
60,5 ± 27c
50,2 ± 26d
35,5 ± 26c
20,5 ± 23a
Letras diferentes na mesma coluna indicam diferenças estatisticamente significativas (p < 0,05).
Neste estudo também não foram evidenciados os efeitos benéficos da utilização da
água de coco como diluente, em relação ao leite em pó desnatado; a motilidade das amostras
conservadas a 17 °C em ACP caiu abaixo de 60% no dia da coleta (D0), valor inferior ao
obtido com o LPD (72,9%), mostrando resultado médio melhor apenas em D2 (12,8%),
porém apresentando valor muito baixo de motilidade (Tabela 2). Os resultados deste trabalho
discordam de estudos com sêmen caprino e ovino, onde uma melhor performance foi obtida
em água de coco como diluente, quando comparado ao leite em pó desnatado. A motilidade
52
espermática em água de coco manteve-se elevada por até 48 horas no sêmen caprino e 24
horas no sêmen ovino (NUNES; SALGUEIRO, 1999). Essas diferenças podem indicar um
comportamento individual do ejaculado, ligado à espécie animal, quando do sêmen diluído
em ACP. Possivelmente, a maior sensibilidade do espermatozoide suíno, pode ter contribuído
para essas diferenças de resultados de conservação entre as diferentes espécies em questão.
O baixo desempenho da água de coco como diluente na conservação da motilidade
espermática também já foi evidenciada em trabalhos mais recentes, inclusive apresentando
resultados inferiores ao do presente estudo já no primeiro dia de análise (BARROS, 2010),
não podendo ser indicado como diluente para o sêmen suíno, tendo em vista sua incapacidade
na manutenção desta característica.
Nos diluentes conservados a 10 °C (Tabela 2), os resultados de porcentagem de
espermatozoides móveis foram melhores quando se utilizou o LPD como meio de diluição do
sêmen, com diferenças significativas (p < 0,01) durante praticamente todo o período de
conservação (D0 a D3), em relação aos demais tratamentos. Apenas no último dia de
conservação (D4) os resultados entre os três diluentes não apresentaram diferenças
significativas (p > 0,05). O BTS e o ACP apresentaram resultados semelhantes durante todo o
período de conservação, exceto em D2, quando o ACP foi melhor (31,4%).
Pelos resultados obtidos para essa característica, conservando o sêmen à uma
temperatura mais baixa (10
o
C), o diluente leite desnatado demonstrou ser, em sua
constituição, o melhor adaptado para a conservação da célula espermática do varrão, durante
todo o período de conservação (FREITAS et al., 2011). Quanto aos diluentes ACP e BTS,
estes mantiveram a motilidade durante todo o período de conservação, entretanto em níveis
mais baixos que os preconizados para a prática de inseminação artificial, discordando de
achados que indicam a conservação do sêmen suíno no diluente BTS a 12 °C por até cinco
dias (KATZER, et al., 2004). O presente estudo corrobora com achados recentes, onde o LPD
manteve superioridade quanto ao percentual de células móveis em relação aos diluentes ACP
e BTS acondicionados a 12 °C (NUNES et al., 2011).
Em uma análise geral, comparando-se todos diluentes (BTS, ACP e LPD) nas duas
diferentes temperaturas de conservação (10 e 17 oC) (Tabela 2), o LPD demonstrou ser um
excelente meio de diluição/conservação para o sêmen suíno. Em relação aos outros
tratamentos seus resultados foram significativamente melhores (p < 0,05) até o terceiro dia de
conservação. Nos últimos dois dias, apesar de equivalência com alguns outros resultados (p >
0,05), ainda assim os valores médios apresentados pelos resultados das análises da
53
porcentagem de espermatozoides móveis foram superiores aos outros tratamentos nas duas
temperaturas de conservação do sêmen. Com os resultados obtidos nesse trabalho, com o uso
do LPD, particularmente a 10 oC, abriu-se uma nova perspectiva para a conservação do sêmen
do varrão, sem a necessidade de utilização de conservadoras de sêmen, que apresentam custo
significativamente maior em relação a uma geladeira comum.
O sêmen suíno diluído costuma sofrer quedas acentuadas de motilidade dentro das
primeiras 12 horas de armazenamento em diferentes temperaturas (tanto a 10 quanto a 17 °C),
sendo mais pronunciada a 10 °C. Uma contínua diminuição da motilidade, sugere que os
espermatozoides do varrão são incapazes de se adaptar à temperaturas abaixo de 12 °C,
devido provavelmente a danos na membrana plamática (ALTHOUSE et al., 1998). Entretanto,
esta tendência pode ser revertida dependendo do diluente utilizado, e no caso do uso do LPD,
os resultados obtidos, particularmente à temperatura de 10 oC, comprovaram que a utilização
de um meio melhor adaptado às necessidades do espermatozoide suíno, pode manter em
patamares superiores os valores de sua motilidade durante todo o período de conservação do
sêmen (FREITAS et al., 2011).
Os efeitos negativos da estocagem a baixas temperaturas não foram tão evidente neste
trabalho, inclusive houve uma melhor manutenção do percentual de células móveis quando do
uso dos diluentes ACP e LPD conservados a 10 °C. Com o uso do BTS, os resultados foram
semelhantes em ambas as temperaturas de conservação, exceto no D0, devido a adaptação das
células à temperatura (ALTHOUSE et al., 1998). Após três dias de conservação (D2), os
resultados apresentados corroboram com trabalhos anteriores, onde não foram também
evidenciados efeitos deletérios da temperatura de conservação (17 ou 12 °C) sobre a
motilidade espermática, com ou sem incubação prévia a 17 °C para as amostras
acondicionadas a 12 °C (KATZER, et al., 2004), protocolo também adotado neste
experimento, apesar de um período de adaptação mais reduzido.
O leite desnatado, utilizado neste experimento como diluente para o sêmen do varrão,
foi de fácil manipulação, uso prático e efetivo na proteção do espermatozoide durante o
período de conservação. Esse diluente alternativo já foi usado por outros autores preservando
de forma melhor a motilidade espermática em comparação a outros produtos, tanto na forma
líquida, quanto em ejaculados pós-descongelação (KULAKSIZ et al., 2012). Ele é um fluído
biológico de composição complexa, contendo componentes tanto com ação benéfica quanto
maléfica para o gameta (BARTELLIER et al., 1998), podendo ser utilizado com qualidade em
diferentes processos biotecnológicos.
54
Os melhores resultados de vigor espermático (D0 e D1) e de porcentagem de células
móveis (D0) obtidos nesse trabalho com o uso do LDP em relação ao BTS a 17 °C, puderam
ser vistos também nos resultados de outro trabalho de pesquisa (TONIOLLI et al., 2001), no
qual esta superioridade do LPD também foi estatisticamente significativa (p < 0,05) nos
mesmos dias de conservação. Desta forma, aparentemente, esta é uma característica que
deverá se repetir em diferentes protocolos experimentais a esta temperatura, podendo indicar a
possibilidade de utilização deste diluente alternativo de forma rotineira em programas de
inseminação artificial, ao menos aqueles onde não se exige do sêmen períodos de conservação
prolongados.
Para estas duas características, os resultados com o LPD a 17 °C apresentaram uma
queda bastante acentuada de seus valores a partir do D2, terminando o período de conservação
do sêmen com valores iguais a zero, apesar de ainda se manter em um bom patamar de
motilidade no D2. Desta forma, ele demonstrou certa dificuldade de conservação do sêmen
em períodos superiores a 48 horas, para as características analisadas, equivalendo-se a outros
diluentes alternativos similares (gema de ovo e à base de soja) no tocante a sua capacidade de
preservação do sêmen nos primeiros dias de armazenamento. No caso do LPD, ele não é
capaz de preservar o sêmen por um período prolongado de tempo, devido a um processo de
deterioração de seus componentes (KASIMANICKAM et al., 2011), particularmente em
temperaturas mais altas (17 oC).
Apesar dos resultados de vigor e motilidade, obtidos em uma conservação mais
prolongada, o leite desnatado apresentou-se como uma excelente opção de meio conservador
para os espermatozoides, particularmente quando conservados a temperaturas mais baixas
(≤10 ºC). Entretanto, em temperaturas mais altas (15 ºC), o LPD apresentaria efeitos
deletérios à célula espermática, devido à presença de componentes moleculares tóxicos
(GARCIA; GRAHAM, 1987; MEIRELES et al., 1998), o que explicaria a queda acentuada
nos valores de vigor e motilidade espermática após as primeiras 48 h de conservação a 17 °C
e a sua performance superior a 10 °C. De qualquer forma, trabalhos adicionais são necessários
a fim de se estabelecer de forma mais precisa o limite de temperatura que favoreça o
desencadeamento dos mecanismos envolvidos na produção desses componentes moleculares
tóxicos.
A taxa de vitalidade espermática em D0 foi significativamente maior para os
tratamentos com LPD, comparada ao obtido com BTS e ACP (p < 0,001), tanto a 10 como a
17 °C. Curiosamente, a diferença de temperatura não afetou o percentual de espermatozoides
55
vivos em cada um dos diluentes testados particularmente em D0 (Tabela 3). No final do
período de conservação (D4) a 17 °C, o BTS (18,1%) apresentou uma maior taxa
espermatozoides vivos quando comparado aos demais diluentes.
A forte queda do número de células vivas no LPD (8,6%) pode ser explicada pelo
mesmo mecanismo que afetou as características vigor e motilidade espermática (GARCIA;
GRAHAM, 1987; MEIRELES et al., 1998). Por outro lado, a 10 °C o LPD apresentou uma
maior taxa de vitalidade (p < 0,001), em relação aos outros diluentes, equivalendo-se apenas
ao BTS no D4 (p > 0,05), apesar de um valor médio melhor (32,9 e 19,7%, respectivamente Tabela 3). A queda natural na porcentagem de células vivas é explicada pelas alterações de
pH e osmolaridade do meio, já que com o decorrer do tempo, há o consumo do substrato
energético e a produção de metabólitos (FONTENELE et al., 2002). Esta queda foi menos
acentuada quando utilizado o diluente LPD (59,29%) em relação ao BTS (61,75%) e ao ACP
(69,71%), proporcionando um maior número de espermatozoides vivos ao final do período de
conservação do sêmen e demonstrando ser esse diluente, à temperatura de 10 °C, melhor
adaptado às necessidades de sobrevivência do espermatozoide suíno.
Tabela 3. Total de espermatozoides vivos (%) do sêmen suíno, conservado durante cinco dias
em diferentes temperaturas (17 e 10 °C) nos diluentes BTS, ACP-103® e LPD.
Temperaturas
17 oC
10 oC
Diluentes
Dias de conservação
D0
D4
BTS
61,3 ± 17,9a
18,1 ± 20,5a
ACP
56,2 ± 16,6a
9,6 ± 13,4bc
LPD
81,2 ± 16,0b
8,6 ± 13,4c
BTS
51,5 ± 17,6a
19,7 ± 21,9ad
ACP
51,5 ± 17,0a
15,6 ± 15,6ab
LPD
80,8 ± 19,6b
32,9 ± 27,8d
D0 e D4 - letras diferentes na mesma coluna indicam diferenças estatisticamente significativas (p < 0,001).
Conforme apresentado na tabela 4, o LPD manteve uma maior percentagem de células
com acrossoma intacto em ambas as temperaturas (10 e 17 °C) no D0 , quando comparado
aos demais diluentes (p < 0,001). No último dia de análise essa superioridade foi vista apenas
na temperatura de 10 °C, com significância de 0,01%, demonstrando mais uma vez a boa ação
deste diluente para o sêmen suíno a temperaturas mais baixas.
56
Comparando-se os outros dois diluentes (BTS e ACP), não foram observadas
diferenças significativas (p > 0,05) quanto ao percentual de células com acrossoma intacto,
nas duas diferentes temperaturas de conservação, discordando do observado por Toniolli et al.
(2010), que verificaram uma maior proteção aos espermatozoides em D4 conferida pelo
diluente ACP em relação ao BTS, que se traduziu por um maior número de células vivas com
acrossoma íntegro. Embora este estudo não tenha evidenciado da mesma forma esta qualidade
da ACP, tal fato não o descredencia como diluente para o sêmen suíno no tocante a
integridade de membrana, particularmente em temperaturas mais baixas.
Tabela 4. Total de células com acrossoma intacto (%) do sêmen suíno, conservado durante
cinco dias em diferentes temperaturas (17 e 10 °C) nos diluentes BTS, ACP-103® e
LPD.
Temperaturas
17 oC
10 oC
Diluentes
Dias de conservação
D0
D4
BTS
87,2 ± 9,2a
80,8 ± 9,7a
ACP
84,6 ± 7,2a
81,1 ± 12,0a
LPD
96,3 ± 3,6b
80,8 ± 9,3a
BTS
82,3 ± 10,5a
74,1 ± 15,4a
ACP
86,3 ± 8,0a
80,9 ± 10,7a
LPD
95,7 ± 6,1b
90,3 ± 10,1b
D0 e D4- letras diferentes na mesma coluna indicam diferenças significativas (p < 0,001)
A temperatura de conservação não afetou negativamente as taxas de vitalidade nem a
de espermatozoides com acrossoma íntegro. Discordando de estudos anteriores, os
percentuais de células com acrossoma íntegro de amostras armazenadas a 12 ou 5 °C foram
inferiores aos obtidos com o sêmen conservado a 17 °C (KATZER, et al., 2004). Apesar do
curto período de incubação prévia para o sêmen armazenado a 10 ºC, tal fato possivelmente
favoreceu aos resultados de percentual de células com acrossomas normais, apresentando-se
semelhantes aos do sêmen armazenado a 17 ºC (KATZER, et al., 2004).
Esses melhores resultados encontrados no LPD a 10 °C podem ser explicados devido à
presença das lipoproteínas e lecitinas do leite, que conferem uma proteção à célula
espermática contra o choque térmico, quando adicionadas ao sêmen antes do resfriamento
(FOOTE, 1974; MEMON; OTT, 1981). Inclusive, há relatos na literatura sobre o efeito
57
crioprotetor do leite desnatado, também conferindo uma melhor proteção à célula espermática
pós-descongelação (JULIANI; HENRY, 2008).
Os índices de viabilidade espermática com o armazenamento a 12 ºC, após incubação
prévia, mostram que o sêmen suíno suporta a redução da temperatura até este limite
(KATZER, et al., 2004), podendo chegar a 10 °C. Isto indica que, em casos de desregulagem
da incubadora de sêmen para temperaturas abaixo de 17 ºC, sobretudo em épocas de baixas
temperaturas ambientais, provavelmente não haveria prejuízo à conservação de sêmen
(KATZER, et al., 2004) se a queda de temperatura for até 10 ºC.
CONCLUSÕES
O leite em pó desnatado mostrou ser um bom meio diluente para o sêmen suíno em
temperatura mais baixa (10 °C), possibilitando uma diminuição de custos de produção por não
haver necessidade do uso de conservadoras de sêmen que são sempre mais caras do que
geladeiras comuns. Além disso, conferiu uma maior proteção à célula espermática, através de
maiores taxas de vitalidade e integridade de acrossoma, em relação aos outros diluentes nas
diferentes temperaturas, proporcionando a possibilidade melhores de taxas de fertilidade
quando do sêmen conservado dessa maneira.
AGRADECIMENTOS
A bolsa concedida pela Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível
Superior (CAPES).
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
ALTHOUSE, G.C.; WILSON, T.M M.E.; KUSTER, C.; PARSLEY, M. Characterization of lower
temperatures storage limitations of fresh-extended porcine semen. Theriogenology, v.50, p.535-543,
1998.
BARROS, T.B. Qualidade espermática do sêmen suíno conservado a baixas temperaturas em
diluentes alternativos. 66f. 2010. Fortaleza, CE. Dissertação (Mestrado em Ciências Veterinárias).
Programa de Pós-graduação em Ciências Veterinárias. Universidade Estadual do Ceará, 2010.
Disponível em: <http://www.uece.br/ppgcv/dmdocuments/tatyane_barros.pdf>. Acesso em:
10/05/2012.
BARTELLIER, F.; DUCHAMP, G.; VIDAMENT, M.; ARNAUD, G.; PALMER, E.; MAGISTRINI,
M. Delayed insemination is successful with a new extender for storing fresh equine semen at 15º C
under aerobic conditions. Theriogenology, v. 50, p.2 29-236, 1998.
BORTOLOZZO, F.P.; WENTZ, I.; BENNEMANN, P.E.; BERNARDI, M.L.; WOLLMANN, E.B.;
FERREIRA, F.M.; NETO, G.B. Inseminação Artificial na Suinocultura Tecnificada Suinocultura
em Ação. Porto Alegre, RS: Pallotti, 2005. 185 p.
58
CARDOSO, R. de C.S.; SILVA, A.R.; UCHOA, D.C.; SILVA, L.D.M. da. Criopreservação de sêmen
canino com um diluidor à base de água de coco. Ciência Rural, v. 32, n.4, p. 657-661, 2002.
CORRÊA MN, MEINCKE W, LUCIA JR T, DESCHAMPS JC. Inseminação artificial em suínos.
Pelotas: Printpar Gráfica e Editora, 2001. 181p.
FIGUEIRÔA, P.T.B.; SALVIANO NETO, P.; OLIVEIRA, R.R. Avaliação da viabilidade do sêmen
suíno submetido à refrigeração. Revista Brasileira de Reprodução Animal, v.25, p.442-445, 2001.
FONTENELE OS, CARDOSO JFS, CARDOSO RCS, SILVA AR, UCHOA DC, SILVA LDM.
Conservação a 5 °C do sêmen canino diluído em água de coco. In: Simpósio Cearense de Ciência
Animal, 4, 2002, Fortaleza; Simpósio Nordestino de Buiatria, 2, 2002, Fortaleza. Anais... Fortaleza:
SCCA, 2002. CD-ROM
FOOTE, R. H. Artificial Insemination. In: HAFEZ, E.S.E. Reproduction in farm animals.
Philadelphia: Ed. Lea and Lebiger, 1974. p.409-431.
FREITAS, E.N.; NUNES, T.G.P.; RODRIGUES, I.C.S.; MARTINS, L.A.; BARROS, T.B.;
TONIOLLI, R. Leite em pó desnatado adicionado de diferentes concentrações de antioxidante
sintético análogo da vitamina E. In: CONGRESSO BRASILEIRO DE MEDICINA VETERINARIA,
38, 2011, Florianópolis. Anais eletrônicos... Disponível em:
<http://www.sovergs.com.br/site/38conbravet/resumos/189.pdf> Acesso em: 22/04/2012.
GARCIA, M. A.; GRAHAM, E. F. Dialysis of bovine semen and its effects on fresh and freeze –
thawed spermatozoa. Cryobiology, v.24, p.446-454, 1987.
JULIANI, G.C.; HENRY, M. Efeito do glicerol, etilenoglicol, acetamida e leite desnatado na
criopreservação de espermatozoides equinos. Arquivos Brasileiros de Medicina Veterinária e
Zootecnia, v.60, n.5, p.1103-1109, 2008.
KATZER, L.H.;BERNARDI, M. L.; BORTOLOZZO,F.P.;WENTZ, I. Qualidade de sêmen suíno
resfriado sob a influencia de diluentes, da temperatura de armazenamento e da incubação prévia. Ars
Veterinária, v. 20, n. 2, p. 233-241, 2004
KASIMANICKAM, R.; KASIMANICKAM, V.; TIBARY, A. PELZER, K. Effect of semen extenders
on sperm parameters of ram semen during liquid storage at 4 ◦C. Small Ruminant Research, v.99,
p.208– 213, 2011.
KULAKSIZ, R.; ÇEBİ,Ç.; AKÇAY,E. The effect of different extenders on the motility and
morphology of ram sperm frozen or stored at 4 °C. Turk. J. Veterinary and Animal Sciences; v.36,
n.2, p.177-182, 2012.
LEVIS, D. Liquid boar semen production: Current extender technology and where do we go from
here!. In: INTERNATIONAL CONFERENCE ON BOAR SEMEN PRESERVATION. 4. 1999,
Beltsville. Proceedings... Lawrence: Allen, 2000. p.121-128.
MEDEIROS, B. F. de. Avaliação de sêmen ovino refrigerado diluído em água de coco em pó.
Campina Grande, 2008. 29 f. Trabalho de conclusão do Curso (Graduação em Medicina Veterinária) Universidade Federal de Campina Grande, 2008. Disponível em:
<http://www.cstr.ufcg.edu.br/mono_mv_2008_2/monogr_bruno_fernandes.pdf>. Acesso em: 05/2012.
MEIRELES, L.S.; MALSCHITSKY, E.; NEVES, A.P.; VIEIRA, M.J.; KELLER, A.; HÖTT, A.K.;
MORAES, I.M.A. de; GARBADE, P.; GREGORY, R.M.; MATTOS, R.C. Leite em pó desnatado não
inativado e leite desnatado UHT para a preservação e fertilidade do sêmen equino resfriado.
Veterinária Ciência Rural, v. 28, n.3, p. 467-470, 1998.
59
MEMON, M. A.; OTT, R. S. Methods of semen preservation and artificial insemination in sheep and
goats. World Review of Animal Production. v.17, n.1, p.19-25, 1981.
NUNES, J.F.; SALGUEIRO, C.C. de M. Utilização da água de coco como diluidor de sêmen de
caprinos e ovinos. Revista Científica de Produção Animal, v.1, n.1, p. 17-26, 1999.
NUNES, T.G.P.; FREITAS, E.N.; RODRIGUES, I.C.S.; MARTINS, L.A.O.; GUIMARÃES, D.B.;
BARROS, T.B.; TONIOLLI, R. Avaliação de diferentes diluentes de sêmen suíno conservado em
temperatura abaixo de 15 °C. In: Congresso da ABRAVES, 15, Fortaleza, 2011. Anais... Fortaleza:
ABRAVES, 2011. CD-ROM
PEREZ GARCIA, T. Importancia de la tecnologia en La obténcion del semen bovino. Revista
Patronal Biology Animal, v.4, p.249-257, 1958.
RONDON R. M. M., RONDON F. C. M., NUNES J.F., ALENCAR A.A., SOUSA F. M. de;
CARVALHO M.A. M. Uso da água de coco em pó (ACP®) em diferentes temperaturas como diluente
de espermatozoides de capote (Numida meleagris). Revista Brasileira de Saúde e Produção Animal,
v. 9, n.4, p. 848-854, 2008.
SALGUEIRO C. C. M.; NUNES J. F.; OLIVEIRA K. P. L. Utilização de diluentes á base de água de
coco in natura e em pó, na inseminação artificial programada de cabras. Revista Brasileira de
Reprodução Animal, v.5, sup.1, p.96-98, 2002.
SCHEID, I.R. Transportando e armazenando corretamente as doses de sêmen. Suínos & Cia, v.2,
p.25-31, 2003.
SMITAL. J. Effects influencing boar semen. Animal Reproduction Science, v.110, p.335–346, 2009.
TONIOLLI, R. Pouvoir fecondant des spermatozoides de verrat: amelioration des conditions de
conservation. 1996, 91 f. These (Doctorat) - Universite Francois Rabelais de Tours - France, 1996.
Resumo disponível em: <http://cat.inist.fr/?aModele=afficheN&cpsidt=182303> Acesso em: 01/2012.
TONIOLLI, R.; MESQUITA, D. S. M.; CAVALCANTE, S. G. Avaliação in vitro do sêmen de suíno
diluído em BTS e na água de coco in natura e estabilizada. Revista Brasileira de Reprodução
Animal, v.22, p.198-201, 1998.
TONIOLLI, R.; JATAHY, P.C.; SILVA, M.C.; MOREIRA, F.R. da C. Utilização do leite desnatado e
do ácido 3-indol acético na conservação do sêmen suínos. Ciência Animal, v.11, n.1, p.21-26, 2001.
TONIOLLI, R.; TONIOLLO, G.H.; FRANCESCHINI, P.H.; MORATO, F.M.A.C.. Uso do diluente
água de coco em pó (ACP-103®) na conservação prolongada do sêmen do varrão: avaliação in vitro e
in vivo. Arquivos Brasileiros de Medicina Veterinária e Zootecnia, v.62, n.5, p.1072-1079, 2010.
UCHOA D.C., SILVA A.R., CARDOSO R. de C. S., PEREIRA B.S., SILVA L. D. M. da.
Conservação do sêmen canino a 37 °C em diluentes â base de água de coco. Ciência Rural. v. 32, n.1,
p. 91-95, 2002.
WATSON, P.F. Cooling of spermatozoa and fertilizing capacity. Reproduction in Domestic
Animals. v. 31, n.1, p. 135-140, 1996.
60
8. CAPÍTULO III
Efeito da adição de trolox ao diluente leite em pó desnatado durante a
conservação do sêmen suíno a 10 °C.
Effect of trolox addition to diluent skimmed milk powder during storage of boar
semen at 10°C.
Araújo, Lina Raquel Santos; Barros, Tatyane Bandeira; Guimarães, Daianny Barboza;
Cantanhêde, Ludymila Furtado; Dias, Aline Viana; Toniolli, Ricardo
61
8. CAPITULO III
Efeito da adição de trolox ao diluente leite em pó desnatado durante a
conservação do sêmen suíno a 10°C.
Effect of trolox addition to diluent skimmed milk powder during storage of boar semen
at 10°C.
Araújo, Lina Raquel Santos1; Barros, Tatyane Bandeira1; Guimarães, Daianny Barboza1;
Cantanhêde, Ludymila Furtado 1; Dias, Aline Viana1; Toniolli, Ricardo 2
1
Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias – PPGCV; 2Orientador, Laboratório de
Reprodução Suína e Tecnologia de Sêmen – FAVET/UECE, Av. Paranjana, 1700 – Campus
Itaperi, Fortaleza-Ce, CEP: 60.740-000, email: [email protected]
RESUMO
Os antioxidantes são capazes de proteger as células do estresse oxidativo, podendo ser
utilizado em diluentes de refrigeração a fim de aumentar a viabilidade do sêmen
criopreservado. O presente estudo teve como objetivo verificar os efeitos da adição de
diferentes concentrações de trolox sobre espermatozoides suínos diluídos e conservados em
leite em pó desnatado (LPD) a 10°C. Foram utilizados 52 ejaculados submetidos a 4
tratamentos: (T1) LPD (controle); (T2) LPD + 1000 µM de trolox; (T3) LPD + 2000 µM de
trolox; e (T4) LPD + 3000 µM de trolox. Foram realizadas análises diárias (D0-D4) de vigor e
motilidade e no D0 e D4 foi realizado o teste hiposmótico e esfregaço para avaliar a vitalidade
e integridade acrossomal. As médias de vigor e motilidade do T1 foram superiores em relação
aos demais tratamentos, embora não diferentes do T2 e T3 (D0 a D2). O T4 apresentou as
piores médias de vigor e motilidade, não diferindo do T3. O percentual de espermatozoides
vivos e integridade de membranas plasmática e acrossomal, não foram diferentes entre os
tratamentos, tanto no D0 quanto no D4. A adição de trolox ao diluente LPD não promoveu
efeitos benéficos sobre a conservação do sêmen. Elevadas concentrações trolox prejudicaram
a qualidade espermática, não sendo aplicável na preparação de doses inseminantes.
PALAVRAS-CHAVE: sêmen suíno, leite em pó desnatado, trolox, antioxidante.
62
ABSTRACT
The antioxidants are capable of protecting cells from oxidative stress, may be used in
refrigeration extenders to increase the viability of cryopreserved semen. The present study
aimed to verify the effects of adding different concentrations of trolox on boar sperm diluted
and stored in milk powder (LPD) at 10 ° C. We used 52 ejaculates submitted to four
treatments: (T1) _LPD_ (control), (T2) _LPD +1000 µM of trolox, (T3) _LPD +2000 µM of
trolox and (T4) _LPD +3000 µM of trolox. Analyzes were performed daily (D0-D4) of force
and motion and the D0 and D4 hypoosmotic test was performed to assess the smear and
vitality and acrosomal integrity. The mean force and motility were higher in T1 compared to
other treatments, although not different from T2 and T3 (D0 to D2). The T4 showed the worst
average force and motility did not differ from T3. The percentage of live sperm and integrity
of plasma and acrosomal membranes were not different between treatments, both in the D0
and D4. The addition of trolox to solvent LPD did not promote beneficial effects on the
conservation of semen. High concentrations trolox impaired sperm quality, and is not
applicable in the preparation of insemination.
KEYWORDS: Boar semen, skimmed milk, trolox, antioxidant.
INTRODUÇÃO
O trolox (6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametil croman-2-ácido carboxílico), é um análogo
hidrossolúvel do α-tocoferol que foi sintetizado por Scott e sua equipe em 1974 e indicado
como antioxidante para a preservação de óleos e gorduras. Esta substância apresenta
propriedades antioxidantes e é eficaz tanto em gordura animal quanto vegetal. Característica,
que o torna singular, já que o tocoferol tem pouca atividade na prevenção da peroxidação de
óleos vegetais (SCOTT et al., 1974).
Os antioxidantes são inibidores de radicais livres que suprimem a formação de
espécies reativas ao oxigênio e/ou suas ações. A adição de antioxidantes ao diluente tem sido
avaliada quanto à sua capacidade de proteger o espermatozoide do efeito tóxico dos
metabólitos reativos do oxigênio (MAIA, 2006). Estudos têm mostrado que a vitamina E (αtocoferol) é capaz de interagir diretamente com radicais oxidantes (GIULIVI et al., 1992),
protegendo as células de estresse oxidativo (TIRADO; BROWN, 2005) e de danos das
membranas plasmática e acrossomal (MAIA, 2006), bem como do DNA (DONNELLY et al.,
1999), podendo ser utilizado em diluentes de refrigeração a fim de aumentar a viabilidade do
63
sêmen criopreservado (BORBA NETO et al., 2010), melhorando a motilidade e a viabilidade
do espermatozoides (MAIA, 2006).
O presente estudo teve como objetivo verificar os efeitos da adição de diferentes
concentrações de trolox sobre espermatozoides suínos diluídos e conservados em leite em pó
desnatado a 10 °C.
MATERIAL E MÉTODOS
01. Animais, coleta e análise do sêmen in natura
O sêmen de sete reprodutores, em sistema rotineiro semanal, foi coletado durante 9
semanas, por meio da técnica da mão enluvada em recipiente coberto por filtro e protegido
por copo térmico, sendo utilizado o ejaculado total após a separação da parte gelatinosa retida
no filtro. Foram utilizados animais com idade variando entre 12 e 24 meses, provenientes do
Laboratório de Reprodução Suína e Tecnologia do Sêmen – da FAVET/UECE. Os aspectos
qualitativos do sêmen avaliados foram: concentração espermática (x106sptz/mL), volume
(mL), total de espermatozoides (x109sptz), vigor espermático (0 a 5) e porcentagem de células
móveis (%).
02. Diluíção do sêmen e tratamentos experimentais
Foi separado de cada ejaculado um total de 2,1 x109 espermatozoides, repartidos entre
quatro tratamentos (concentração de 35 x106 sptz/ mL), com um volume final por tratamento
(15 mL = sêmen + diluente), repartido em cinco tubos de ensaio por tratamento (3 mL = 105
x106sptz/tubo). O dia da colheita foi considerado dia zero (D0), e o sêmen foi conservado até
quatro dias após (D4), com análises diárias no D0, D1, D2, D3 e D4. O meio de conservação
dotado neste experimento foi o leite em pó desnatado (LPD) diluído em água destilada nas
seguintes proporções: 10g de LPD + 0,194g glicose +100 mL de água destilada + sulfato de
gentamicina a 80mg/100 mL. O Leite em pó desnatado (LPD) sem adição de trolox foi o
tratamento controle (T1); LPD + 1000 µM de trolox (T2); LPD + 2000 µM de trolox (T3); e
LPD + 3000 µM de trolox (T4). Os tratamentos foram submetidos à temperatura de
conservação de 10°C. As amostras permaneceram 1h estocadas a 17°C antes de serem
transferidas a temperatura de 10 °C. A cada dia de análise, foram retirados os tubos
equivalentes a cada ejaculado/tratamento, incubados a 39°C por 10 minutos.
03. Análises do sêmen durante a conservação
64
Para a avaliação da qualidade espermática, foi analisado o vigor espermático (0 a 5;
TONIOLLI, 1996) e a porcentagem de células móveis (%), colocando-se uma gota de sêmen
de 15 μL entre lâmina e lamínula e com leitura com um aumento de 200 vezes. O sêmen
diluído e conservado a 10 °C foi reaquecido a 39 °C, com leituras feitas após 10 minutos de
incubação.
As amostras para avaliação da vitalidade foram processadas no D0 (no mínimo seis
horas após coleta e diluição) (Exame 1) e no D4, 5 minutos após a incubação a 39 °C (Exame
2), considerando-se a morfologia do acrossoma e a vitalidade (% de células vivas). Foram
feitos esfregaços de sêmen corados, contando-se 200 células/esfregaço em microscopia óptica
com lente de imersão (aumento de 1000x). A solução corante foi formada por: azul de bromofenol = 0,1g; citrato de sódio = 0,4g; água destilada = 10 mL. Juntou-se uma gota de sêmen
com outra de corante sendo homogeneizada em seguida. Após 30 segundos, procedeu-se ao
esfregaço, sendo secado à temperatura ambiente. Para análises, os espermatozoides foram
classificados em quatro categorias: 1) espermatozoides vivos com acrossoma intacto; 2)
espermatozoides vivos com acrossoma danificado; 3) espermatozoides mortos com acrossoma
intacto; 4) espermatozoides mortos com acrossoma danificado.
O teste hiposmótico também foi realizado nos dias D0 e D4, e permitiu a avaliação da
funcionalidade da membrana do espermatozoide, através de uma prova de resistência ao
choque osmótico. A técnica consistiu da adição de 0,5 mL de sêmen diluído em 7,5 mL de
água destilada e mantidos por 15 minutos em banho-maria a 39 °C (solução A). Após o
período de incubação, em 1 mL da solução A foi adicionado 0,5 mL de formol salino a 1%
(solução B). Dessa nova solução (B) foi retirado uma alíquota de 15 μL, colocado em uma
lamina, recoberto por uma lamínula e em seguida levado ao microscópio óptico com um
aumento de 40x, sendo contados um total de 200 espermatozoides. O espermatozoide com a
cauda reta e indicativo de perda da funcionalidade da membrana, os que permanecerem com
membrana funcional apresentaram cauda enrolada. Um bom sêmen deve ter no mínimo 50%
de espermatozoides com cauda enrolada.
04. Análise estatística
O delineamento experimental utilizado foi o de Blocos ao Acaso, usando-se análise de
variância e aplicando-se os testes Mann Whitney, para a comparação entre grupos, e QuiQuadrado, corrigido para os resultados expressos em porcentagem, usando-se o Programa
StatView (versão 5.0.1; SAS Institute Inc. 1992-1998) com nível de significância de 5% (p <
0,05).
65
RESULTADOS E DISCUSSÃO
A fração espermática do sêmen fresco dos 52 ejaculados analisados no experimento
apresentou aspecto normal, coloração branco leitosa, volume médio de 241 mL e
concentração média de 418,8 x106 sptz/ mL. Tais características estão dentro da normalidade
para a espécie suína (CORRÊA et al., 2001; SMITAL, 2009). O sêmen fresco apresentou uma
motilidade média de 90% ± 6,2 e vigor de 4,3 ± 0,3. Devido a oscilações de temperatura
durante a conservação, 5 amostras foram perdidas em D1 e 7 amostras em D2.
Resultados de vigor e motilidade espermática encontram-se nas tabelas 1 e 2. O
tratamento controle apresentou as maiores médias de vigor espermático em todos os dias de
análise, embora não diferindo estatisticamente das amostras tratadas com 1000 µM e 2000
µM de trolox (de D0 a D2), exceto em D3 e D4 (p < 0,05). As amostras tratadas com 2000
µM e 3000 µM não foram diferentes estatisticamente durante todos os dias de análise (D0 a
D4). As amostras tratadas com 3000 µM de trolox apresentaram os piores resultados quando
comparadas ao controle (p < 0,05) em todos os dias de conservação.
Resultados semelhantes foram obtidos com concentrações intermediárias de trolox
(500 μM, 1000 μM e 1500 μM / 100 mL) em LPD, não sendo observado efeito do trolox na
melhoria ou na manutenção do vigor espermático durante o período de conservação
(FREITAS et al., 2011). Entretanto, a adição de 1000 µM de trolox ao diluente BTS já
demonstrou ação benéfica na conservação do sêmen suíno, apresentando melhores resultados
médios de vigor espermático em relação ao controle (TONIOLLI et al., 2011), porém neste
estudo esta mesma concentração de trolox não produziu efeito algum, talvez o leite em pó
desnatado tenha interferido em sua atividade antioxidante.
Tabela 1. Análise do vigor espermático do sêmen suíno conservado em LPD a 10 °C durante
cinco dias, com diferentes concentrações de trolox.
Tratamentos
Dias de conservação
D0
D1
D2
D3
D4
0 µM
2,9 ± 1,1a
2,7 ± 1,0a
2,5 ± 0,9a
2,0 ± 0,8a
1,6 ± 0,8a
1000 µM
2,9 ± 1,0a
2,6 ± 1,1ab
2,3 ± 0,9a
2,0 ± 0,8a
1,2 ± 0,7b
2000 µM
2,7 ± 1,0a
2,5 ± 1,1ab
2,2 ± 0,9ab
1,7 ± 0,6b
1,1 ± 0,5b
3000 µM
2,7 ± 1,0a
2,3 ± 1,1b
1,9 ± 0,8b
1,5 ± 0,7b
1,0 ± 0,5b
a, b - letras diferentes na mesma coluna indicam diferenças significativas (p < 0,05)
66
Os resultados de percentagem de células móveis foram semelhantes aos encontrados
com o vigor espermático. O tratamento controle apresentou as maiores médias para
motilidade espermática, embora não sendo estatisticamente diferente das amostras tratadas
com 1000 µM durante todo o período de conservação. Da mesma forma as amostras tratadas
com 2000 µM e 3000 µM não foram diferentes estatisticamente durante todos os dias de
análise (D0 a D4). As amostras tratadas com 3000 µM de trolox apresentaram piores
resultados quando comparados aos obtidos com o tratamento controle (p < 0,05) em todo o
período de conservação.
Trabalhos recentes, inclusive com o mesmo meio de conservação (LPD), também não
demonstraram efeitos positivos da adição de trolox (500 μM, 1000 μM e 1500 μM / 100 mL)
na conservação da motilidade espermática do sêmen suíno conservado a 17 °C (FREITAS et
al., 2011). O trolox mesmo utilizado em concentrações mais baixas (20, 40 e 60 µM) teve
efeito prejudicial sobre a motilidade espermática do sêmen humano conservado em meio
Biggers, Whitten, and Wittingham (BWW) (DONNELLY et al., 1999). Embora o estresse
oxidativo seja muito maior após a criopreservação do sêmen (MAIA, 2006) a ação do trolox
também não foi notória na manutenção da motilidade após descongelação do sêmen ovino
conservado em meio Tris (MAIA, 2006) e gema de ovo (RODELLO, 2010).
Em discordância com deste estudo e com outros autores, a adição de 1000 µM trolox
ao diluente BTS foi benéfica na conservação do sêmen suíno, apresentando melhores
resultados médios de motilidade espermática em relação ao controle (TONIOLLI;
TONIOLLI, 2010), Este efeito não se repetiu quando se utilizou o LPD como meio de
conservação para o sêmen suíno, os resultados foram semelhantes entre os tratamentos (0 e
1000 µM de trolox).
Tabela 2. Análise da motilidade espermática do sêmen suíno conservado em LPD a 10 °C
durante cinco dias, com diferentes concentrações de trolox.
Dias de conservação
Tratamentos
D0
D1
D2
D3
D4
0 µM
64,4 ± 24,7a
58,4 ± 22,6a
50,5 ± 20,8a
38,3 ± 20,6a
29,1 ± 19,0a
1000 µM
64,0 ± 23,0a
52,4 ± 24,8ab 46,5 ± 21,5ab 34,9 ± 19,1ab 23,0 ± 18,0ab
2000 µM
59,1 ± 23,6ab
50,0 ± 22,3b 40,5 ± 19,9bc 30,9 ± 16,5ab 20,9 ± 14,6b
3000 µM
55,5 ± 24,7b
46,8 ± 23,6b
35,3 ± 19,4c
28,5 ± 16,3b
18,9 ± 15,6b
a, b, c - letras diferentes na mesma coluna indicam diferenças significativas (p < 0,05)
67
Conforme apresentado na tabela 3, o total de espermatozoides vivos em D0 e D4 não
diferiu entre o tratamento controle e as diferentes concentrações de trolox (p > 0,05). Da
mesma forma, a adição de trolox ao diluente não produziu efeito sobre o percentual de
espermatozoides com acrossoma intacto, apresentando-se semelhante entre os tratamentos
(tabela 4). Diferente dos resultados encontrados neste estudo, a adição de trolox em diluente
Tris ou BTS foi benéfica. Quando se utilizou BTS como diluente adicionado de trolox (400
µM/ 100 mL) observou-se uma maior percentagem de espermatozoides vivos com acrossoma
intacto, durante o período de conservação do sêmen suíno (D0 = 62,9% e D4 = 62,6%)
indicando uma melhor ação protetora a esta concentração e mantendo-se estável entre o
primeiro e último dia de conservação. Quando se utilizou uma concentração maior de trolox
(600 µM/100 mL), obteve-se um maior percentual de células vivas (72,6%) (GUIMARÃES;
TONIOLLI, 2010). Entretanto, no presente estudo, concentrações mais elevadas de trolox
(1000 µM; 2000 µM e 3000 µM), não demonstraram o aumento dessa ação protetora.
Resultados positivos também foram obtidos com sêmen ovino descongelado, onde o trolox
promoveu efeito benéfico na manutenção da integridade da membrana acrossomal de
espermatozoides, em relação ao controle em diluente Tris (MAIA, 2006), porém, em meio
Tris-gema, concordando com nosso estudo, a Vitamina E mesmo em associação com outros
antioxidantes não proporcionou uma maior integridade acrossomal no sêmen ovino (SOARES
et al., 2010).
Tabela 3. Total de espermatozoides vivos (vitalidade %) do sêmen suíno, conservado durante
cinco dias no diluente LPD a 10 °C com diferentes concentrações de trolox.
Tratamentos
Dias de conservação
D0
D4
0 µM
67,2 ± 19,7
25,8 ± 16,1
1000 µM
65,4 ± 20,1
25,3 ± 17,0
2000 µM
65,8 ± 19,1
23,9 ± 17,6
3000 µM
62,3 ± 24,2
17,6 ± 13,7
Em relação ao teste hiposmótico, os resultados não foram diferentes, o trolox nas
diferentes concentrações estudadas não produziu efeitos benéficos sobre a integridade de
membrana. Este resultado assemelha-se ao obtido em um estudo recente, quando se adicionou
a vitamina E ao diluente de sêmen descongelado (SOARES et al., 2010). Por outro lado, os
68
antioxidantes são inibidores de radicais livres que suprimem a formação de espécies reativas
ao oxigênio e/ou suas ações. Estudos têm mostrado que a vitamina E (α-tocoferol) é capaz de
proteger as células de estresse oxidativo (TIRADO; BROWN, 2005) e de danos das
membranas plasmática e acrossomal (MAIA, 2006), podendo ser utilizado em diluentes de
refrigeração a fim de aumentar a viabilidade de sêmen criopreservado (BORBA NETO et al.,
2010). Tais benefícios não foram observados quando se utilizou trolox em leite em pó
desnatado como diluente para sêmen suíno acondicionado a 10 °C.
Tabela 4. Total de espermatozoides com acrossoma intacto (%) do sêmen suíno, conservado
durante cinco dias no diluente LPD a 10 °C com diferentes concentrações de trolox.
Tratamentos
Dias de conservação
D0
D4
0 µM
94,0 ± 5,3
91,3 ± 7,0
1000 µM
93,6 ± 5,6
86,8 ± 16,3
2000 µM
93,9 ± 5,5
90,0 ± 8,8
3000 µM
94,3 ± 5,0
88,6 ± 8,5
Tabela 5. Total de espermatozoides com reativos ao teste hiposmótico (%) do sêmen suíno,
conservado durante cinco dias no diluente LPD a 10 °C com diferentes
concentrações de trolox.
Tratamentos
Dias de conservação
D0
D4
0 µM
57,7 ± 19,9
24,4 ± 11,8
1000 µM
55,3 ± 20,9
24,5 ± 11,2
2000 µM
55,0 ± 19,5
24,2 ± 11,7
3000 µM
52,7 ± 21,1
21,8 ± 10,5
CONCLUSÃO
A adição de trolox ao diluente leite em pó desnatado não promoveu efeitos benéficos
sobre a manutenção do vigor e da motilidade espermática nem sobre a integridade das
membranas plasmática e acrossomal. Elevadas concentrações dessa substância (2000 e 3000
69
µM) prejudicaram a qualidade espermática das amostras, não sendo aplicável na preparação
de doses inseminantes, onde a motilidade e o vigor são essenciais.
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
BORBA NETO, A.V.; SOARES, F.A.P; ARRUDA, L.C.P; SANTOS JÚNIOR, D DE A.;
SILVA, E.C.B DA; SILVA,S.V.; BATISTA, A.M.; CARVALHO, C.C.D.; GUERRA,
M.M.P.; SOARES, P.C. Efeito da Refrigeração e da adição de trolox e glutationa reduzida ma
lipoperoxidação, estresse oxidativo e viabilidade de espermatozoides ovinos. In: JORNADA
DE ENSINO, PESQUISA E EXTENSÃO, 10, 2010, Recife; SEMANA NACIONAL DE
CIÊNCIA E TECNOLOGIA, 1, 2010, Recife; SEMANA ESTADUAL DE CIÊNCIA E
TECNOLOGIA, 1, 2010, Recife. Anais..., Recife: UFRPE/SBPC, 2010.
CORRÊA MN, MEINCKE W, LUCIA JR T, DESCHAMPS JC. Inseminação artificial em
suínos. Pelotas: Printpar Gráfica e Editora, 2001. 181p.
DONNELLY, E.T.; MCCLURE, N.; LEWIS, S.E.M..Antioxidant supplementation in vitro
does not improve human sperm motility. Fertility & Sterility. v. 72, n. 3, p 484-495, 1999.
GIULIVI, C.; ROMERO, F.J.; CADENAS, E. The Interaction of Trolox C, a Water-Soluble
Vitamin E Analog, with Ferrylmyoglobin: Reduction of the Oxoferryl Moiety. Archives of
Biochemistry and Biophysics. v. 299, n. 2, p. 302-312, 1992.
GUIMARÃES, D.B.; TONIOLLI, R. Proteção morfológica da célula espermática suína em
diferentes concentrações de trolox. In: SEMANA UNIVERSITÁRIA DA UECE, 15, 2010.
Fortaleza. Anais eletrônicos.... Disponível em:
<http://semanauniversitaria.uece.br/anais/paginas/trabalhos.jsf> Acesso em: 22/04/2012.
MAIA, M.S. Viabilidade espermática e geração de metabólitos reativos do oxigênio
(ROS) no sêmen ovino criopreservado em diluidor aditivado de lauril sulfato de sódio
(OEP), trolox-c e catalase. 2006, 147f. Tese (Doutorado em Medicina Veterinária) Universidade Estadual Paulista, Botucatu, 2006.
FREITAS, E.N.; NUNES, T.G.P.; RODRIGUES, I.C.S.; MARTINS, L.A.; BARROS, T.B.;
TONIOLLI, R. Leite em pó desnatado adicionado de diferentes concentrações de antioxidante
sintético análogo da vitamina E. In: CONGRESSO BRASILEIRO DE MEDICINA
VETERINARIA, 38, 2011, Florianópolis. Anais eletrônicos... Disponível em:
<http://www.sovergs.com.br/site/38conbravet/resumos/189.pdf> Acesso em: 22/04/2012.
RODELLO, L. Prevenção do estresse oxidativo pela utilização de trolox, catalase e
glutationa no processo de congelação de sêmen ovino. 2010, 131f. Tese (Doutorado em
Medicina Veterinária) – Universidade Estadual Paulista, Botucatu, 2010. Disponível em;
<http://www.athena.biblioteca.unesp.br/exlibris/bd/bbo/33004064022P3/2010/rodello_l_dr_b
otfmvz.pdf> Acesso em: 22/04/2012.
SCOTT, J.W.; CORT, W.M.; HARLEY, H.; PARRISH, D.R.; SAUCY, G. 6Hydroxychroman-2-carboxylic acids: novel antioxidants. Journal of the American Oil
Chemist’s Society. v.51, p.200-203, 1974.
70
SMITAL. J. Effects influencing boar semen. Animal Reproduction Science. v.110, p.335–
346, 2009.
SOARES, F. A. P.; BORBA NETO, A. V.; ARRUDA, L. C. P.; SILVA, E. C. B.; SILVA, S.
V.; BATISTA, A. M.; CARVALHO, C. C. D.;GUERRA, M. M. P.; SOARES, P. C. . Efeito
da adição de antioxidantes (Trolox e Glutationa Reduzida) na lipoperoxidação, estresse
oxidativo e viabilidade de espermatozoides ovinos submetidos à congelação. In: JORNADA
DE ENSINO, PESQUISA E EXTENSÃO, 10, 2010, Recife; SEMANA NACIONAL DE
CIÊNCIA E TECNOLOGIA, 1, 2010, Recife; SEMANA ESTADUAL DE CIÊNCIA E
TECNOLOGIA, 1, 2010, Recife. Anais..., Recife: UFRPE/SBPC, 2010.
TIRADO, E.E.; BROWN, D.B. Oxidative Stress: Protective Effects of 6-Hydroxy-2,5,7,8Tetramethylchroman-. 2-Carboxylic Acid (Trolox) on Human Sperm Activation. Fertility &
Sterility – Abstracts. v. 84, Suppl. 1, p. 226-227, 2005.
TONIOLLI, R. Pouvoir fecondant des spermatozoides de verrat: amelioration des
conditions de conservation. 1996, 91 f. These (Doctorat) - Universite Francois Rabelais de
Tours - France, 1996. Resumo disponível em
<http://cat.inist.fr/?aModele=afficheN&cpsidt=182303> Acesso em: 10/01/2012.
TONIOLLI, L. de S.; TONIOLII, R. Diferentes concentrações de trolox e sua ação sobre
parâmetros qualitativos do sêmen suíno. In: SEMANA UNIVERSITÁRIA DA UECE, 15,
2010. Fortaleza. Anais eletrônicos.... Disponível em:
<http://semanauniversitaria.uece.br/anais/paginas/trabalhos.jsf> Acesso em: 22/04/2012.
TONIOLLI, L.S.; GUIMARÃES, D.B.; BARROS, T.B; ARAÚJO, L.R.S.; TONIOLLI, R.
Vigor espermático do sêmen suíno avaliado em diferentes concentrações de trolox adicionado
ao diluente BTS. In: Congresso da ABRAVES, 15, 2011. Anais..., Fortaleza:ABRAVES,
2011. CD-ROM.
71
9. CAPITULO IV
Efeito da adição de betaína ao diluente leite em pó desnatado durante a
conservação do sêmen suíno a 10 °C.
Effect of the addition of betaine to diluent skimmed milk powder during storage at
10°C of boar semen
Araújo, Lina Raquel Santos; Barros, Tatyane Bandeira; Guimarães, Daianny Barboza;
Cantanhêde, Ludymila Furtado; Dias, Aline Viana; Toniolli, Ricardo
72
9. CAPITULO IV
Efeito da adição de betaína ao diluente leite em pó desnatado durante a
conservação do sêmen suíno a 10 °C.
Effect of the addition of betaine to diluent skimmed milk powder during storage at
10°C of boar semen
Araújo, Lina Raquel Santos1; Barros, Tatyane Bandeira1; Guimarães, Daianny Barboza1;
Cantanhêde, Ludymila Furtado 1; Dias, Aline Viana1; Toniolli, Ricardo 2
1
Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias – PPGCV; 2Orientador,
Laboratório de Reprodução Suína e Tecnologia de Sêmen – FAVET/UECE, Av. Paranjana,
1700 – Campus Itaperi, Fortaleza-Ce, CEP: 60.740-000, email: [email protected]
RESUMO
A betaína tem sido utilizada como crioprotetor, melhorando a qualidade dos espermatozoides
criopreservados. O presente estudo teve como objetivo verificar os efeitos da adição de
diferentes concentrações de betaína sobre espermatozoides suínos diluídos e conservados em
leite em pó desnatado a 10 °C. Foram analisados 56 ejaculados, submetidos a 4 tratamentos:
(1) LPD; (2) LPD+1% de betaína; (3) LPD+2% de betaína; e (4) LPD+3% de betaína. Foram
realizadas análises diárias (D0-D4) de vigor e motilidade e no D0 e D4 foi realizado o teste
hiposmótico e esfregaço para avaliar a vitalidade e integridade acrossomal. Os resultados de
vigor, motilidade e vitalidade espermática diferiram entre os tratamentos, sendo superior no
T1. O T1 também manteve o maior percentual de células com membrana íntegra em D0 e em
D4, porém, neste ultimo não diferiu estatisticamente de T4. A betaína não exerceu efeito
protetor sobre a célula espermática suína diluída e conservada em meio à base de LPD a 10
°C. A adição de concentrações iguais ou acima de 1% de betaína no diluente influenciaram
negativamente a qualidade do sêmen, portanto, não são aplicáveis na conservação do sêmen
suíno resfriado a 10°C em LPD.
PALAVRAS-CHAVE: Sêmen suíno, leite desnatado, betaína
73
ABSTRACT
Betaine has been used as crioprotector, improving the quality of cryopreserved sperm. The
present study aimed to verify the effects of adding different concentrations of betaine on boar
sperm diluted stored in skimmed milk powder at 10 C. The 56 ejaculates were analyzed were
submitted to four treatments: (1)_LPD; (2)_LPD+1% of betaine; (3)_LPD+2% of betaine, and
(4)_LPD+3% of betaine. Analyzes were performed daily (D0-D4) of force and motion and the
hypoosmotic test and to assess smear was performed the vitality and acrosomal integrity in
D0 and D4. The results of vigor, vitality and sperm motility differed between treatments,
being higher in T1. The T1 also maintained the highest percentage of cells with intact
membrane on D0 and D4, however, in the latter did not differ statistically from T4. Betaine
did not exert a protective effect on the boar sperm cells diluted and preserved amid the basis
of LPD at 10 C. The addition of concentrations equal to or greater than 1% of betaine in the
diluents influence negatively the quality of semen is therefore not applicable in maintaining
the pig semen cooled to 10 °C in LPD.
KEYWORDS: boar sperm, skimmed milk, betaine
INTRODUÇÃO
Glicina betaína, também chamada betaína, é uma amina quaternária, um derivado
trimetil do aminoácido glicina (trimetilglicina), que desempenha um importante papel na
manutenção do equilíbrio osmótico (EKLUND et al., 2005) e tem sido utilizado como um
crioprotetor (LINDEBERG et al., 1999). Foi demonstrado que a betaína melhora a qualidade
dos espermatozoides de carneiro criopreservados (SANCHEZ-PARTIDA et al., 1992) como
bem como espermatozoides equinos (JUNNILA, 2000;. TRIMECHE et al., 1999), bovinos
(ZHANG et al., 2001), caninos (PEÑA et al., 1998), porém não há relatos de seus efeitos
sobre o sêmen suíno. O presente estudo teve como objetivo verificar os efeitos da adição de
diferentes concentrações de betaína sobre espermatozoides suínos diluídos e conservados em
leite em pó desnatado a 10 °C.
MATERIAL E MÉTODOS
01. Animais, coleta e análise do sêmen in natura
O sêmen de sete reprodutores, em sistema rotineiro semanal, foi coletado durante 9
semanas, por meio da técnica da mão enluvada em recipiente coberto por filtro e protegido
por copo térmico, sendo utilizado o ejaculado total após a separação da parte gelatinosa retida
74
no filtro. Foram utilizados animais com idade variando entre 12 e 24 meses, provenientes do
Laboratório de Reprodução Suína e Tecnologia do Sêmen – da FAVET/UECE. Os aspectos
qualitativos do ejaculado avaliados foram: concentração (x106sptz/mL), volume (mL), total de
espermatozoides (x109sptz), vigor espermático (0 a 5) e porcentagem de células móveis (%).
02. Diluíção do sêmen e tratamentos experimentais
Foi separado de cada ejaculado um total de 2,1 x109 espermatozoides, repartidos entre
quatro tratamentos (concentração de 35 x106 sptz/ mL), com um volume final por tratamento
(15 mL = sêmen + diluente), repartido em cinco tubos de ensaio por tratamento (3 mL = 105
x106 sptz/tubo). O dia da colheita foi considerado dia zero (D0), e o sêmen foi conservado até
quatro dias após (D4), com análises diárias no D0, D1, D2, D3 e D4. O meio de conservação
dotado neste experimento foi o leite em pó desnatado (LPD) diluído em água destilada nas
seguintes proporções: 10g de LPD + 0,194g glicose +100 mL de água destilada + sulfato de
gentamicina a 80mg/ 100 mL. O LPD sem adição de betaína foi o tratamento controle (T1);
LPD + 1 g de betaína (T2); LPD + 2 g de betaína (T3); e LPD + 3 g de betaína (T4). Os
tratamentos foram submetidos à temperatura de conservação de 10°C. As amostras
permaneceram 1h estocadas a 17 °C antes de serem transferidas a temperatura de 10 °C. A
cada dia de análise, foram retirados os tubos equivalentes a cada ejaculado/tratamento,
incubados a 39 °C por 10 minutos.
03. Análises do sêmen durante a conservação
Para a avaliação da qualidade espermática, foi analisado o vigor espermático (0 a 5;
TONIOLLI, 1996) e a porcentagem de células móveis (%), colocando-se uma gota de sêmen
de 15μL entre lâmina e lamínula e com leitura com um aumento de 200 vezes. O sêmen
diluído e conservado a 10 °C foi reaquecido a 39 °C, com leituras feitas após 10 minutos de
incubação.
As amostras para avaliação da vitalidade foram processadas no D0 (no mínimo seis
horas após coleta e diluição) (Exame 1) e no D4 (Exame 2), após a incubação a 39 °C por 5
minutos, considerando-se a morfologia do acrossoma e a vitalidade (% de células vivas).
Foram feitos esfregaços de sêmen corados, contando-se 200 células/esfregaço em microscopia
óptica com lente de imersão (aumento de 1000x). A solução corante foi formada por: azul de
bromo-fenol = 0,1g; citrato de sódio = 0,4g; água destilada = 10 mL. Juntou-se uma gota de
sêmen com outra de corante sendo homogeneizada em seguida. Após 30 segundos, procedeu75
se ao esfregaço, sendo secado à temperatura ambiente. Para análises, os espermatozoides
foram classificados em quatro categorias: 1) espermatozoides vivos com acrossoma intacto; 2)
espermatozoides vivos com acrossoma danificado; 3) espermatozoides mortos com acrossoma
intacto; 4) espermatozoides mortos com acrossoma danificado.
O teste hiposmótico também foi realizado nos dias D0 e D4, e permitiu a avaliação da
qualidade da membrana do espermatozoide, através de uma prova de resistência ao choque
osmótico. A técnica consistiu da adição de 0,5 mL de sêmen diluído em 7,5 mL de água
destilada e mantidos por 15 minutos em banho-maria a 39 °C (solução A). Após o período de
incubação, em 1 mL da solução A foi adicionado 0,5 mL de formol salino a 1% (solução B).
Dessa nova solução (B) foi retirado uma alíquota de 15 μL, colocado em uma lamina,
recoberto por uma lamínula e em seguida levado ao microscópio óptico com um aumento de
40x, sendo contados um total de 200 espermatozoides. O espermatozoide com a cauda reta e
indicativo de perda da funcionalidade da membrana, os que permanecerem com membrana
funcional apresentaram cauda enrolada. Um bom sêmen deve ter no mínimo 50% de
espermatozoides com cauda enrolada.
04. Análise estatística
O delineamento experimental utilizado foi o de Blocos ao Acaso, usando-se análise de
variância e aplicando-se os testes Mann Whitney, para a comparação entre grupos, e QuiQuadrado, corrigido para os resultados expressos em porcentagem, usando-se o Programa
StatView (versão 5.0.1; SAS Institute Inc. 1992-1998) com nível de significância de 5% (p <
0,05).
RESULTADOS E DISCUSSÃO
A fração espermática do sêmen fresco dos 56 ejaculados analisados no experimento
apresentou aspecto normal, coloração branco leitosa, volume médio de 238 mL e
concentração média de 437,2 x106 sptz/ mL. Tais características estão dentro da normalidade
para a espécie suína (CORRÊA et al., 2001; SMITAL, 2009). O sêmen fresco apresentou uma
motilidade média de 90% ± 6,0 e vigor de 4,3 ± 0,3. Devido a oscilações de temperatura
durante a conservação, 5 amostras foram perdidas em D1.
O tratamento controle (sem betaína) obteve as melhores médias de vigor espermático
durante todo o período de conservação em relação as amostras acrescidas de betaína nas
diferentes concentrações (1%, 2% e 3%). Os valores de vigor espermático foi reduzido com o
76
aumento da concentração de betaína no diluente, sendo que as amostras acrescidas de betaína
a 3% obtiveram nota zero de vigor já em D1. Todos os tratamentos diferiram entre si (p <
0,05) nos quatro dias de conservação, apenas em D4, o vigor espermático das amostras com
betaína a 2 e 3% foram semelhantes (Tabela 1).
Tabela 1. Análise do vigor espermático do sêmen suíno conservado em LPD a 10 °C durante
cinco dias, com diferentes concentrações de betaína.
Tratamentos
Dias de conservação
D0
D1
D2
D3
D4
0g
3,1 ± 0,9a
2,9 ± 0,8a
2,5 ± 0,8a
2,0 ± 0,8a
1,6 ± 0,7a
1g
2,8 ± 0,7b
2,4 ± 0,8b
1,8 ± 0,6b
1,4 ± 0,5b
1,0 ± 0,5b
2g
0,8 ± 0,7c
0,5 ± 0,4c
0,2 ± 0,3c
0,1 ± 0,2c
0,0 ± 0,1c
3g
0,1 ± 0,2d
0,0 ± 0,1d
0,0 ± 0,0d
0,0 ± 0,0d
0,0 ± 0,0c
a, b, c, d - letras diferentes na mesma coluna indicam diferenças significativas (p < 0,05)
Tendência similar ao vigor foi obtida com a motilidade espermática, ou seja, o
tratamento controle manteve superioridade em relação aos demais tratamentos (Tabela 2). A
motilidade também sofreu influencia da concentração de betaína, quanto maior a
concentração, menores percentuais de células móveis foram observados. Há poucos relatos na
literatura sobre a inclusão de betaína no diluente para conservação de sêmen na forma liquida,
a maioria volta-se para a criopreservação, provavelmente devido a seus mecanismos
osmóticos que são desejáveis para o processo (TRIMECHE et al., 1999).
Em desacordo com o presente estudo, onde a betaína não promoveu efeitos positivos
sobre a motilidade, o primeiro relato da adição de betaína ao diluente de conservação de
sêmen, mostrou que este aminoácido manteve a motilidade espermática elevada por 96 h, no
sêmen bovino armazenado a temperaturas < 20 °C (20, 5 e 0 °C), com concentrações de
betaína de 100 e 200 mM (ZHANG et al., 2001). Embora o nosso estudo tenha apresentado
pH próximo de 7,0, onde já foi verificada atividade da betaína (ZHANG et al., 2001), nenhum
efeito protetor foi encontrado.
A betaína exerceu um efeito negativo em altas concentrações, provavelmente devido
ao aumento da osmolaridade do meio (341; 422; e 510 mOsm em 1 %; 2 % e 3 % de betaína,
respectivamente), a pressão osmótica foi superior a adotada por Zhang et al. (2001) (275-295
mOsm) que utilizou valor próximo de condições isotônicas (291mOsmkg-1) (YESTE et al.,
77
2010), quando foram observados efeitos positivos desse aminoácido sobre a motilidade
espermática.
Comparando os efeitos da adição de betaína sobre o sêmen após congelação com o
presente estudo, observamos que mesmo com baixas concentrações de betaína de 1 e 2% em
diluente de sêmen, sem passar pelas injúrias dos processos de congelação e descongelação
não conseguimos observar os efeitos positivos da betaína na manutenção da motilidade, que
seria seu possível papel como um osmólito intracelular no sêmen, um papel semelhante ao
exibido por ela em outras células. Tal papel como osmólito foi observado, com a adição de
2,5% de betaína, com aumento significativo da motilidade progressiva dos espermatozoides
de garanhão, mantendo 95% da motilidade original (JUNNILA, 2000).
Já outros estudos também utilizando a betaína como crioprotetor apresentaram
resultados semelhantes ao deste estudo, onde a adição de betaína (0; 10; 20; e 40 mMol/ L),
em comparação com a amostra controle, não melhorou a motilidade do sêmen canino ou
integridade da membrana plasmática, embora seu efeito não tenha sido negativo (PEÑA et al.,
1998). No sêmen equino, maiores valores de motilidade espermática e motilidade progressiva
foram obtidos na concentração de 0,25%, não havendo diferenças significativas entre as
concentrações menores que 4%. Quando foram adicionados 4 e 5% do aminoácido, a
motilidade espermática foi reduzida, verificando-se um possível efeito deletério da betaína
(LINDEBERG et al., 1999). Essa possível toxicidade é provocada pela alta concentração do
aminoácido e seu efeito osmótico (TRIMECHE et al., 1999), também observada em nosso
estudo, com concentrações acima de 1% de betaína no sêmen suíno.
Tabela 2. Análise da motilidade espermática do sêmen suíno conservado em LPD a 10 °C
durante cinco dias, com diferentes concentrações de betaína.
Tratamentos
Dias de conservação
D0
D1
D2
D3
D4
0g
66,8 ± 18,8a
62,4 ± 18,5a
52,8 ± 19,2a
41,3 ± 20,3a
31,4 ± 18,2a
1g
60,9 ± 16,2b
53,5 ± 17,8b
41,7 ± 17,1b
31,0 ± 16,2b
17,5 ± 13,9b
2g
13,0 ± 12,6c
8,0 ± 8,7c
3,5 ± 6,0c
1,7 ± 3,6c
0,3 ± 1,2c
3g
1,1 ± 4,8d
0,1 ± 0,7d
0,0 ± 0,0d
0,0 ± 0,0d
0,0 ± 0,0c
a, b, c, d - letras diferentes na mesma coluna indicam diferenças significativas (p < 0,05)
78
O percentual de espermatozoides vivos (Tabela 3), obtidos do esfregaço de sêmen
corado em D0 e D4, foi maior (p < 0,05) no tratamento controle (LPD) e decresceu com o
aumento da inclusão de betaína ao diluente, embora em D4 o tratamento com 2% de betaína
não tenha diferido estatisticamente dos outros tratamentos com o mesmo aminoácido. Quanto
ao total de espermatozoides com acrossoma intacto (mortos ou vivos) não houve diferenças
entre os tratamentos estudados (p > 0,05).
Os aminoácidos são moléculas carregadas, é possível que eles interajam
eletrostaticamente com os grupos fosfato dos fosfolipídios da membrana plasmática do
espermatozoide, formando assim uma camada sobre superfície da célula, protegendo-a contra
choques térmicos (EL-SHESHTAWY et al., 2008). Isto pode contribuir para sua capacidade
de manter a integridade de membrana acrossomal dos espermatozoides, durante o processo de
criopreservação (FAGUNDES, 2008), corroborando com o nosso estudo onde o percentual de
células intactas foi semelhante entre os tratamentos, porém quando se tratou de células vivas e
intactas, houve a mesma tendência observada com a vitalidade (%), com o aumento da
concentração de betaína houve queda nos percentuais de espermatozoides vivos com
acrossoma intacto.
A osmolaridade do meio também teve sua influencia sobre a viabilidade espermática,
já que diluentes hipotônicos (p < 0,01) ou hipertônicos (p < 0,001) afetam negativamente os
percentuais de espermatozoides com acrossoma intacto. Em geral viabilidade cai
drasticamente quando a osmolaridade é maior do que 500mOsm kg-1 ou menor do que
200mOsm kg-1. (YESTE et al., 2010)
Tabela 3. Total de espermatozoides vivos (vitalidade %) do sêmen suíno, conservado durante
cinco dias no diluente LPD a 10 °C com diferentes concentrações de betaína.
Tratamentos
Dias de conservação
D0
D4
0g
65,1 ± 19,6a
26,4 ± 16,1a
1g
41,1 ± 24,0b
13,3 ± 12,6b
2g
21,3 ± 20,9c
7,3 ± 8,1bc
3g
11,9 ± 14,7d
4,4 ± 6,9c
a, b, c, d - letras diferentes na mesma coluna indicam diferenças significativas (p < 0,05)
79
O maior percentual de células reativas ao teste hiposmótico foi observado nas
amostras sem adição de betaína em D0 (controle). Em D4, o tratamento controle manteve-se
superior, entretanto, estatisticamente semelhante de tratamento com 3 g de betaína. O
tratamento com 3g de betaína apresentou uma menor queda do percentual de espermatozoides
reativos ao teste hiposmótico entre as análises de D0 e D4, tal resultado pode estar
relacionado às condições osmóticas desfavoráveis (< 200 e > 1500 mOsm kg-1), que
interferem na morfologia espermática aumentando os percentuais de espermatozoides com
caudas enroladas e caudas dobradas (ZOU; YANG, 2000).
Tabela 4. Total de espermatozoides com acrossoma intacto (%) do sêmen suíno, conservado
durante cinco dias no diluente LPD a 10 °C com diferentes concentrações de
betaína.
Tratamentos
Dias de conservação
D0
D4
0g
95,5 ± 5,0
93,6 ± 5,4
1g
94,0 ± 13,5
93,0 ± 5,9
2g
93,9 ± 13,5
90,8 ± 7,5
3g
93,0 ± 13,9
90,9 ± 9,4
Tabela 5. Total de espermatozoides com reativos ao teste hiposmótico (%) do sêmen suíno,
conservado durante cinco dias no diluente LPD a 10 °C com diferentes
concentrações de betaína.
Tratamentos
Dias de conservação
D0
D4
0g
49,9 ± 14,6a
23,9 ± 10,6a
1g
31,6 ± 10,2b
17,7 ± 8,9b
2g
21,1 ± 9,9c
15,5 ± 8,6b
3g
24,1 ± 12,2c
20,2 ± 9,9ab
a, b, c - letras diferentes na mesma coluna indicam diferenças significativas (p < 0,05)
Com declínios de temperatura, há uma redução inevitável na proporção de
espermatozoides que mantêm a integridade da membrana normal e de seus componentes
bioquímicos (JOHNSON et al., 2000). A capacidade dos aminoácidos em melhorar a
80
criosobrevivência dos espermatozoides tem sido relacionada com suas propriedades
metabólicas e crioprotetoras, oxidantes ou osmorregulativas (MARTINS-BESSA et al.,
2007). Uma vez que os aminoácidos não podem penetrar a membrana do espermatozoide,
então, mecanismos osmóticos podem explicar, em parte, a sua ação (TRIMECHE et al.,
1999).
Apesar de ter sido verificado o efeito crioprotetor sobre espermatozoides em diversas
espécies, os mecanismos de crioproteção espermática conferidos pelos aminoácidos, assim
como a função de aminoácidos livres na fisiologia do espermatozoide, ainda não foram
esclarecidos (FAGUNDES et al., 2010).
Embora os espermatozoides suínos sejam sensíveis a mudanças osmóticas no
ambiente, tanto a tratamentos hipotônicos e hipertônicos (YESTE et al., 2010), o estresse
osmótico, por si só, não é um fator importante em causar dano à membrana celular dentro de
um intervalo de 210 a 1500 mOsm. (DU et al., 1994). Isso pode significar que o efeitos dos
agentes osmóticos sobre os espermatozoides em grande parte não são somente devido à
osmolalidade do meio, mas também oriundos da concentração de íons e do tipo de composto
químico adicionado (ZENG et al., 2001).
CONCLUSÕES
A betaína não exerceu efeito protetor sobre a célula espermática suína diluída e
conservada em meio a base de leite em pó desnatado a temperatura de 10 °C. A adição de
concentrações iguais ou acima de 1% de betaína no diluente influenciaram negativamente a
qualidade do sêmen, portanto, não são aplicáveis na conservação do sêmen suíno resfriado a
10 °C em LPD.
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
CORRÊA MN, MEINCKE W, LUCIA JR T, DESCHAMPS JC. Inseminação artificial em
suínos. Pelotas: Printpar Gráfica e Editora, 2001. 181p.
DU, J.; TAO, J.; KLEINHANS, F.W.; PETER, A.T.; CRITSER, J.K. Determination of boar
spermatozoa water volume and osmotic response. Theriogenology, v. 42, p.1183- 1191,
1994.
EL-SHESHTAWY, R. I.; EL-SISY, G.A.; EL-NATTAT, W.S. Use of selects aminoacids to
improve buffalo bull semen cryopreservation. Global Veterinaria, v. 2, p. 146-150, 2008.
81
EKLUND, M.; BAUER, E.; WAMATU, J.; MOSENTHIN, R. Potential nutritional and
physiological functions of betaine in livestock. Nutrition Research Reviews, v. 18, p. 31–48,
2005.
FAGUNDES, B. Adição de aminoácidos e insulina ao meio crioprotetor seminal de garanhões
da raça Mangalarga Marchador. JBCA – Jornal Brasileiro de Ciência Animal, v. 1, n. 1,
2008. Disponível em: <http://www.jbca.com.br/v1n1/resumos/resumo7.pdf> Acesso em:
12/04/2012.
FAGUNDES, B.; SILVA, J.F.S.; SHIMOYA,A.; CUNHA, I.C.N. DA; SOUZA, G.V, DE;
TILBURG, M.F. VAN. Adição de alanina, glicina e glutamina ao meio crioprotetor seminal
de garanhões Mangalarga Marchador. Revista Brasileira de Zootecnia, v.39, n.2, p.279-284,
2010.
JOHNSON, L.A; WEITZE, K.F.; FISER, P.; MAXWELL, W.M.C. Storage of boar semen.
Animal Reproduction Science, v. 62, p.143–172, 2000.
JUNNILA, M. Betaine as a lipotropic agent and as na alleviator of osmotic stress. 2000.
70f. Trabalho de Conclusão de Curso (Graduação em Medicina Veterinária) - Faculty of
Veterinary Medicine, University of Helsinki, Helsinki, 2000.
LINDEBERG, H.; KURTEN, A.; KOSKINEN, E.; KATILA, T. Freezing of stallion semen
with addition of glycine betaine. Journal of Veterinary Medicine Serie A, v. 46, p; 87-90,
1999.
MARTINS-BESSA, A., ROCHA, A.,MAYENCO-AGUIRRE, A. Incorporation of taurine
and hypotaurine did not improve the efficiency of the Uppsala Equex II extender for dog
semen freezing. Theriogenology, v.68, p. 1088–1096, 2007.
PEÑA, A.I.; BARRIO, F.; QUINTELA, L.A.; HERRADON, P.G. Proline and Glycine
Betaine in a Diluent for Freezing Canine Spermatozoa. Reproduction in Domestic Animal,
v. 33, n.1, p. 5-9, 1998.
SANCHEZ-PARTIDA LG, MAXWELL WMC, PALEG LG, SETCHELL BP. Proline and
glycine betaine in cryoprotective diluents for ram spermatozoa. Reproduction, Fertility and
Development, v.4: p.113-118, 1992.
SMITAL. J. Effects influencing boar semen. Animal Reproduction Science, v.110, p.335–
346, 2009.
TONIOLLI, R. Pouvoir fecondant des spermatozoides de verrat: amelioration des
conditions de conservation. 1996, 91 f. These (Doctorat) - Universite Francois Rabelais de
Tours - France, 1996. Resumo disponível em
<http://cat.inist.fr/?aModele=afficheN&cpsidt=182303> Acesso em: 10/01/2012.
TRIMECHDE, A.; YVON, J.M.; VIDAMENT, M.; PALMER, E.; MAGISTRINI, M. Effects
of glutamine, proline, histidine and betaine on post-thaw motility of stallion spermatozoa.
Theriogenology, v. 52, p. 181-191, 1999.
82
YESTE, M.; BRIZ, M.; PINART, E.; SANCHO, S.; BUSSALLEU, E.; BONET, S. The
osmotic tolerance of boar spermatozoa and its usefulness as sperm quality parameter. Animal
Reproduction Science, v. 119, p.265–274, 2010.
ZENG, W.X.; SHIMADA, M.; ISOBE, N.; TERADA, T. Survival of boar spermatozoa
frozen in diluents of varyng osmolality. Theriogenology, v. 56, p. 447-458, 2001.
ZHANG, B.R.; BUHR, M; KROETSCH, T.; LEIBO, S.P. Glycine betaine improves survival
of fresh bovine spermatozoa. Reproduction, Fertility and Development, v.13, n. 3, p. 187 –
192, 2001.
ZOU, C.; YANG, Z. Evaluation on sperm quality of freshly ejaculated boar semen during in
vitro storage under different temperatures. Theriogenology, v.53, p.1477-1488, 2000.
83
10. CONCLUSÕES GERAIS
01) O LPD pode ser utilizado como diluente para o sêmen suíno acondicionado a 10 °C para
ser utilizado por até 24 horas após a diluição.
02) Não se pode comprovar os efeitos benéficos do trolox na conservação do sêmen suíno em
meio à base de LPD. Maiores estudos nesse sentido são necessários.
03) A betaína apresentou efeitos negativos sobre a qualidade espermática quando adicionada
ao diluente a base de LPD, em concentrações acima de 1% e temperatura de conservação
a 10 °C.
84
11. PERSPECTIVAS
Existem outras possibilidades para conservação do sêmen na espécie suína, em
diluentes e temperaturas diferentes da adotadas rotineiramente nos programas de inseminação
artificial. A busca por uma maior longevidade das doses inseminantes é constante e necessária
para o desenvolvimento de novas técnicas ou diluentes resultando em menores custos
produtivos para o setor suinícola. Sendo necessários estudos complementares incluindo
ensaios in vivo, com avaliação de taxas de fertilidade e parição, número de leitões nascidos
dentre outros parâmetros que validem os resultados obtidos.
85
12. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
AITKEN, R.J. Free radicals, lipid peroxidation and sperm function. Reproduction, Fertility
and Development, v.7, p.659-668, 1995.
AITKEN, R.J.; FISHEL, H. Reactive oxygen species generation and human spermatozoa: the
balance of benefit and risk. Bioassays, v.16, p.259-267, 1994.
AITKEN, R.J.; BAKER, M.A. Reactive oxygen species generation by human spermatozoa: a
continuing enigma. International Journal of Andrology, v.25, p.191-194, 2002.
ALMOND, G.W.; BRITT, J.H.; CARR, J.; FLOWER, W.; GLOSSOP, C.; MORROW, M.;
SEE, T. The swine AI book. A field and laboratory technician’s guide to artificial
insemination en swine, Editorial Ruth Cronje, North Carolina State University. Raleigh. 1994.
180p.
ALTHOUSE, G.C. Comparison of currently used semen extenders in the swine industry.
Compendio on Continuing Education for the Practicing Veterinarian, v.19, n.6, p. 777782, 1997.
ALTHOUSE, G.C.; WILSON, T.M M.E.; KUSTER, C.; PARSLEY, M. Characterization of
lower temperatures storage limitations of fresh-extended porcine semen. Theriogenology,
v.50, p.535-543, 1998.
AMANN, R.P.; PICKETT, B.W. Principles of cryopreservation and a review of
cryopreservation of stallion spermatozoa. Journal Equine Science, v.7, n.3, p.145-173,1987.
ARMSTRONG, J.S.; RAJASEKARAN, M.; CHAMULITRAT, W. Characterization of
reactive oxygen species induced effects on human spermatozoa movement and energy
metabolism. Free Radical Biology & Medicine, v.26, n.7/8, p.869-880, 1999.
AZEVEDO D.M.M.R.; TONIOLLI, R. Água de coco estabilizada suplementada com
antibióticos e acido 3-indol acético na conservação de sêmen de caprinos marota. Ciência
Animal. v.9, n.1, p.37-42, 1999.
BARTELLIER, F.; DUCHAMP, G.; VIDAMENT, M.; ARNAUD, G.; PALMER, E.;
MAGISTRINI, M. Delayed insemination is successful with a new extender for storing fresh
equine semen at 15º C under aerobic conditions. Theriogenology, v. 50, p.2 29-236, 1998.
BILODEAU, J.F.; BLANCHETTE, S.; CORMIER, N,; SIRAD, M.S. Reactive oxygen
species-mediated loss of bovine sperm motility in egg yolk Tris extender: protection by
pyruvate, metal chelators and bovine liver or oviductal fluid catalase. Theriogenology, v.57,
p.1105-1122, 2002.
BORBA NETO, A.V.; SOARES, F.A.P; ARRUDA, L.C.P; SANTOS JÚNIOR, D DE A.;
SILVA, E.C.B DA; SILVA,S.V.; BATISTA, A.M.; CARVALHO, C.C.D.; GUERRA,
M.M.P.; SOARES, P.C. Efeito da Refrigeração e da adição de trolox e glutationa reduzida ma
86
lipoperoxidação, estresse oxidativo e viabilidade de espermatozoides ovinos. In: JORNADA
DE ENSINO, PESQUISA E EXTENSÃO, 10, 2010, Recife; SEMANA NACIONAL DE
CIÊNCIA E TECNOLOGIA, 1, 2010, Recife; SEMANA ESTADUAL DE CIÊNCIA E
TECNOLOGIA, 1, 2010, Recife. Anais..., Recife: UFRPE/SBPC, 2010.
BORTOLOZZO, F.P.; WENTZ, I.; BENNEMANN, P.E.; BERNARDI, M.L.;
WOLLMANN, E.B.; FERREIRA, F.M.; NETO, G.B. Inseminação Artificial na
Suinocultura Tecnificada. Suinocultura em Ação. Porto Alegre, RS: Pallotti, 2005. 185 p
BRAGA, C. S. R. Fertilidade de fêmeas suínas inseminadas com sêmen diluído e
resfriado a 5ºC ou 17ºC. 2007. 172f. Dissertação (Mestrado em Medicina Veterinária) –
Universidade Federal de Minas Gerais, Belo Horizonte, 2007.
BRAZ, V.B.; ARAUJO, A.A.; NUNES, J.F.; MACHADO, V.P.; MOURA, A.A.A.;
OLIVEIRA, K.P.L. Viabilidade do sêmen ovino diluído em água de coco em pó. Revista
Brasileira de Reprodução Animal, v.27, n.3, p. 99-107, 2003.
CANVIN, A.T.; BUHR, M.M. Effect of temperature on the fluidity of boar sperm membrane.
Journal of Reproduction and Fertility, v.85, n.2, p.533-540, 1989.
CARDOSO, R. de C.S.; SILVA, A.R.; UCHOA, D.C.; SILVA, L.D.M. da. Criopreservação
de sêmen canino com um diluidor à base de água de coco. Ciência Rural, v. 32, n.4, p. 657661, 2002.
CASTAGNA, C. D., BORTOLOZZO, F. P., WENTZ, I. Estratégias de inseminação artificial
na suinocultura moderna. In: CONGRESSO BRASILEIRO DE VETERINÁRIOS
ESPECIALISTAS EM SUÍNOS, 10, Porto Alegre, 2001. Anais... Porto Alegre: EMBRAPA,
v. 1, 2001, p.143-150.
CAVALCATI, S.S. Suinocultura Dinâmica. MZV Editora: Minas Gerais, 1998. 494p.
CORRÊA MN, MEINCKE W, LUCIA JR T, DESCHAMPS JC. Inseminação artificial em
suínos. Pelotas: Printpar Gráfica e Editora, 2001. 181p.
ÇOYAN, K.; BASPINAR, N.; BUCAK, M.N.; AKALIN, P.P; ATAMAN, M.B.; ÖMÜR,
A.D.; GÜNGÖR, S.; KÜÇÜKGÜNAY, S.; ÖZKALP, B.; SARIÖZKAN, S. Influence of
methionine and dithioerythritol on sperm motility, lipid peroxidation and antioxidant
capacities during liquid storage of ram semen. Research in Veterinary Science, v. 89, p.
426–431, 2010.
DARIN-BENNETT, A.; WHITE, I.G. Cholesterol and phospholipid contend of mammalian
spermatozoa and its relation to membrane struture and cold-shock. Australian Journal of
Biological Sciences, v.26, n.6, p.383-384, 1975.
DE LEEUW, F.E.; CHING CHEN, H.; COLENBRANDER, B.E.M.; VERKLEIJ, A.J. Coldinduced ultrastructural changes in bull and boar sperm plasma membranes. Cryobiology,
v.27.p.171-183, 1990.
87
DONNELLY, E.T.; MCCLURE, N.; LEWIS, S.E.M..Antioxidant supplementation in vitro
does not improve human sperm motility. Fertility & Sterility. v. 72, n. 3, p.484-495, 1999.
EL-SHESHTAWY, R. I.; EL-SISY, G.A.; EL-NATTAT, W.S. Use of selects aminoacids to
improve buffalo bull semen cryopreservation. Global Veterinária, v. 2: p. 146-150, 2008.
FAGUNDES, B. Adição de aminoácidos e insulina ao meio crioprotetor seminal de garanhões
da raça Mangalarga Marchador. JBCA – Jornal Brasileiro de Ciência Animal, v. 1, n. 1,
2008. Disponível em: <http://www.jbca.com.br/v1n1/resumos/resumo7.pdf> Acesso em:
12/04/2012.
FAGUNDES, B.; SILVA, J.F.S.; SHIMOYA,A.; CUNHA, I.C.N. DA; SOUZA, G.V, DE;
TILBURG, M.F. VAN. Adição de alanina, glicina e glutamina ao meio crioprotetor seminal
de garanhões Mangalarga Marchador. Revista Brasileira de Zootecnia, v.39, n.2, p.279-284,
2010.
FERNANDEZ-SANTOS, M.R.; ESTESO, M.C.; SOLER, A.J.; MONTORO, V.; GARDE,
J.J. Effects of egg yolk and cooling rate on the survival of refrigerated of red 73 deer (Cervus
elaphus hispanicus) epididymal spermatozoa. Reproduction in Domestic Animals, v.41,
p.114-118, 2006.
FOOTE, R. H. Artificial Insemination. In: HAFEZ, E.S.E. Reproduction in farm animals,
Philadelphia: Ed. Lea and Lebiger, 1974, p.409-431
FUNAHASHI, H.; SANO, T. Select antioxidants improve the function of extended boar
semen stored at 10 8C. Theriogenology, v. 63, p. 1605–1616, 2005.
GADEA, J. Semen extenders used in the artificial insemination of swine. A review. Spanish
Journal of Agricultural Research, v.1, n.2, p.17-27, 2003.
GADELLA, B.M. Lipid changes in the plasma membrane of capacitating boar spermatozoa.
Reproduction in Domestic Animals., v.31, p.63-73,1996.
GARCIA, M. A.; GRAHAM, E. F. Dialysis of bovine semen and its effects on fresh and
freeze – thawed spermatozoa. Cryobiology, v.24, p.446-454, 1987.
GIULIVI, C.; ROMERO, F.J.; CADENAS, E. The Interaction of Trolox C, a Water-Soluble
Vitamin E Analog, with Ferrylmyoglobin: Reduction of the Oxoferryl Moiety. Archives of
Biochemistry and Biophysics, v. 299, n. 2, p. 302-312, 1992.
HALLIWELL, B. Reactive oxygen species in living systems: source, biochemistry and role in
human disease. American Journal of Medicine, v.91, p.14-22, 1991.
HALLIWELL, B.; GUTTERIDGE, J.M.C. Free radicals in biology and medicine. 3 ed.,
New York: Oxford, Clarendon Press, 1999. 936 p
88
HENRY, M.; NEVES, J. P. Manual para exame andrológico e avaliação de sêmen animal.
2.ed. Belo Horizonte: Colégio Brasileiro de Reprodução Animal, CBRA, 1998, 49 p.
JEONG, Y-J; KIM, M-K.; SONG, H-J; KANG, E-J; OCK, S-A.; KUMAR, B.M.;
BALASUBRAMANIAN, S.; RHO, G.J. Effect of a-tocopherol supplementation during boar
semen cryopreservation on sperm characteristics and expression of apoptosis related genes.
Cryobiology, v. 58, p. 181–189, 2009.
JOHNSON, L. A.; AALBERS, J. G.; GROOTEN, J. J. G. Artificial insemination of swine:
fecundity of boar semen stored in BTS-TS, modified Modena (MM) or MR-A and
inseminated on one, three and four days after collection. Zuchthygiene, v.23, p.49-55, 1988.
JOHNSON, L. A ., WEITZE, K. F., FISER, P., MAXWELL, W. M. C. Storage of boar
semen. Animal Reproduction Science, v. 62, p. 143-172, 2000.
JULIANI, G.C.; HENRY, M. Efeito do glicerol, etilenoglicol, acetamida e leite desnatado na
criopreservação de espermatozoides equinos. Arquivos Brasileiros de Medicina Veterinária
e Zootecnia, v.60, n.5, p.1103-1109, 2008.
JUNNILA, M. Betaine as a lipotropic agent and as na alleviator of osmotic stress. 2000.
70f. Trabalho de Conclusão de Curso (Graduação em Medicina Veterinária) - Faculty of
Veterinary Medicine, University of Helsinki, Helsinki, 2000.
KASIMANICKAM, R.; KASIMANICKAM, V.; TIBARY, A. PELZER, K. Effect of semen
extenders on sperm parameters of ram semen during liquid storage at 4 ◦C. Small Ruminant
Research, v.99, p.208– 213, 2011.
KULAKSIZ, R.; ÇEBİ,Ç.; AKÇAY,E. The effect of different extenders on the motility and
morphology of ram sperm frozen or stored at 4 °C. Turkey Journal Veterinary and Animal
Sciences; v.36, n.2, p.177-182, 2012.
LAGUNA, L.E. Determinações Físico-químicas da água de coco verde em duas
variedades (Cocus nucifera,l.) coco da praia e anão. 1996, 56f. Trabalho de Conclusão de
Curso (Especialização em Produção e Reprodução de Pequenos Ruminantes) - Universidade
Estadual do Ceara, Fortaleza, 1996.
LEEUW, F. E.; COLENBRANDER, B.;VERKLEIJ, A. J.. The role membrane damage plays
in cold shock and freezing injury. Reproduction in Domestics Animals. v. 1, Supplement.,
p.95-104, 1991.
LEVIS, D. Liquid boar semen production: Current extender technology and where do we go
from here!. In: INTERNATIONAL CONFERENCE ON BOAR SEMEN PRESERVATION.
4. 1999, Beltsville. Proceedings... Lawrence: Allen, 2000. p.121-128.
LINDEBERG, H.; KURTEN, A.; KOSKINEN, E.; KATILA, T. Freezing of stallion semen
with addition of glycine betaine. Journal of Veterinary Medicine Serie A, v. 46, p; 87-90,
1999.
89
MAIA, M.S. Viabilidade espermática e geração de metabólitos reativos do oxigênio
(ROS) no sêmen ovino criopreservado em diluidor aditivado de lauril sulfato de sódio
(OEP), trolox-c e catalase. 2006, 147f. Tese (Doutorado em Medicina Veterinária) Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Universidade Estadual Paulista, Botucatu,
2006.
MARTINS-BESSA, A., ROCHA, A.,MAYENCO-AGUIRRE, A.. Incorporation of taurine
and hypotaurine did not improve the efficiency of the Uppsala Equex II extender for dog
semen freezing. Theriogenology, v.68, p. 1088–1096, 2007.
MEIRELES, L.S.; MALSCHITSKY, E.; NEVES, A.P.; VIEIRA, M.J.; KELLER, A.; HÖTT,
A.K.; MORAES, I.M.A. de; GARBADE, P.; GREGORY, R.M.; MATTOS, R.C. Leite em pó
desnatado não inativado e leite desnatado UHT para a preservação e fertilidade do sêmen
equino resfriado. Ciência Rural, v. 28, n.3, p. 467-470, 1998.
MEMON, M. A.; OTT, R. S. Methods of semen preservation and artificial insemination in
sheep and goats. World Review of Animal Production. v.17, n.1, p.19-25, 1981.
MERCADO, E DE.; HERNANDEZ, M.; SANZ, E.; RODRIGUEZ, A.; GOMEZ, E.;
VAZQUEZ, J.M.; MARTINEZ, E.A.; ROCA, J, Evaluation of l-glutamine for
cryopreservation of boar spermatozoa. Animal Reproduction Science, v.115, p. 149–157,
2009.
NORDBERG, J.; ÁRNER, E.S.J. Reactive oxygen species, antioxidants, and the mammalian
thioredoxin system. Free Radical Biology & Medicine, v.31, n.11, p. 1287-1312, 2001.
NUNES, J.F. Utilização da água de coco como diluidor do sêmen de animais domésticos e do
Homem. Revista Brasileira de Reprodução Animal, v.22, n.2, p.109-112, 1998.
NUNES, J.F.; SALGUEIRO, C.C. de M. Utilização da água de coco como diluidor de sêmen
de caprinos e ovinos. Revista Científica de Produção Animal, v.1, n.1, p. 17-26, 1999.
PEÑA, A.I.; BARRIO, F.; QUINTELA, L.A.; HERRADON, P.G. Proline and Glycine
Betaine in a Diluent for Freezing Canine Spermatozoa. Reproduction in Domestic Animal,
v. 33, n.1, p. 5-9, 1998.
PEREZ GARCIA, T. Importância de la tecnologia en La obténcion del semen bovino.
Revista Patronal Biology Animal, v.4, p.249-257, 1958.
PURSEL, V.G.; JOHNSON, L.A.; SCHULMAN, L.L. Effect of dilution, seminal plasma and
incubation period on cold shock susceptibility of boar spermatozoa. Journal of Animal.
Science, v.37, n.2, p.528-535, 1973.
QUINN, P.J.; WHITE, I.G.; WIRRICK, B.R. The effect of dilution on the concentration of
sodium, potassium, calcium and magnesium in ram and bull spermatozoa. Journal
Reproduction and Fertility, v.12, n.1, p.131-138, 1966.
90
RODRÍGUEZ-MARTÍNEZ, H. y ERICSSON, B. Evaluación del semen de verraco y su
relación con fertilidad en inseminaçao artificial in suínos. In: Simpósio Internacional Minitub,
3, 2000, Flores da Cunha. Anais... Flores da Cunha, 2000. p. 11-33.
SANCHEZ, R.S. Conceito e fundamentos utilizados na inseminação artificial de
suínos.Suinos & Cia. v.2, p. 18-22, 2003.
SCHEID, I. R. Commercial swine artificial insemination in Brazil: Development and current
use. Reproduction in Domestics Animals, v.26, p.299-301, 1992.
SCHEID, I.R. Transportando e armazenando corretamente as doses de sêmen. Suíno & Cia,
v.2, p. 25-31, 2003.
SCOTT, J.W.; CORT, W.M.; HARLEY, H.; PARRISH, D.R.; SAUCY, G. 6Hydroxychroman-2-carboxylic acids: novel antioxidants. Journal of the American Oil
Chemist’s Society, v.51, p.200-203, 1974.
SILVA, A.R.; CARDOSO, R.C.S.; SILVA, L.D.M. Congelação de sêmen canino com
diferentes concentrações de gema de ovo e glicerol em diluidores a base de tris e água de
coco. Ciência Rural, v.30, n.6, p.1021-1025, 2000.
SILVA, T.F.P.; ACKERMANN, C.L.; PINHEIRO, F.T.S.; SILVA, L.D.M. Uso da água de
coco em pó (ACP-117) na criopreservação de sêmen de gato domestico. In: CONGRESSO
BRASILEIRO DE REPRODUÇÃO ANIMAL, 17, 2007, Curitiba. Anais.... Belo Horizonte:
CBRA, 2007, p.191.
STRYER, L. Bioquímica. 4 ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 1996.1000 p.
TIRADO, E.E.; BROWN, D.B. Oxidative Stress: Protective Effects of 6-Hydroxy-2,5,7,8Tetramethylchroman-. 2-Carboxylic Acid (Trolox) on Human Sperm Activation. Fertility &
Sterility . v. 84, Suppl 1, p. 226-227, 2005.
TONIOLLI, R. Pouvoir fecondant des spermatozoides de verrat: amelioration des
conditions de conservation. 1996, 91 f. These (Doctorat) - Universite Francois Rabelais de
Tours - France, 1996. Resumo disponível em
<http://cat.inist.fr/?aModele=afficheN&cpsidt=182303> Acesso em: 01/2012.
TONIOLLI, R.; MESQUITA, D.S.M.; CAVALCANTE, S.G. Avaliação “in vitro” do sêmen
de suíno diluído em BTS na água de coco “in natura” e estabilizada. Revista Brasileira de
Reprodução Animal, v.22, n.4, p.198-201, 1998.
TONIOLLI, R.; JATAHY, P.C.; SILVA, M.C.; MOREIRA, F.R. da C. Utilização do leite
desnatado e do ácido 3-indol acético na conservação do sêmen suínos. Ciência Animal, v.11,
n.1, p.21-26, 2001.
TONIOLLI, R.; TONIOLLO, G.H.; FRANCESCHINI, P.H.; MORATO, F.M.A.C.. Uso do
diluente água de coco em pó (ACP-103®) na conservação prolongada do sêmen do varrão:
91
avaliação in vitro e in vivo. Arquivos Brasileiros de Medicina Veterinária e Zootecnia,
v.62, n.5, p.1072-1079, 2010.
TRIMECHDE, A.; YVON, J.M.; VIDAMENT, M.; PALMER, E.; MAGISTRINI, M. Effects
of glutamine, proline, histidine and betaine on post-thaw motility of stallion spermatozoa.
Theriogenology, v. 52, p. 181-191, 1999.
WATSON, P.F.. Cooling of spermatozoa and fertilizing capacity. In: RATH, D., JOHNSON,
L.A., WEITZE, K.F. Eds.., Boar Semen Preservation III. Proceeding of 3rd International
Conference in Boar Semen Preservation, Mariensee, Germany, August, 1995. Reproduction
in Domestic Animals, v.31, p.135-140, 1996.
WATSON, P.F.; PLUMMER, J.M. The response of boar sperm membranes to cold shock and
cooling. In: INTERNATIONAL CONFERENCE ON DEEP FREEZING OF BOAR SEMEN
1, 1985, Uppsala. Proceedings... Uppsala, Swedish University of Agriculture Sciences v. 1,
1985, p.113-127.
WEBER, H. Zur Kalteschoskempfindlech keit von Ebersper miem: Einfluβ von
Verdunnermediu, Inkubation und Abkuhlrate. 1989, 103f. Tese (Doutorado em
Reprodução Animal) - Hannover: Tieraztliche hochschule. 1989.
WHITE, I.G. Lipids and calcium uptake of sperm in relation to cold shock and preservation: a
review. Reproduction, Fertility and Development, v.5, n.6, p.639-658, 1993.
ZHANG, B.R.; BUHR, M; KROETSCH, T.; LEIBO, S.P. Glycine betaine improves survival
of fresh bovine spermatozoa. Reproduction, Fertility and Development, v.13, n. 3, p. 187 –
192, 2001.
ZENG, W.X; TERADA, T. Protection of boar spermatozoa from cold shock damage by 2Hydroxypropyl-beta-cyclodextrin. Theriogenology, v.55, p.615-627, 2000.
92
Download

Uso de diluentes alternativos a baixas temperaturas na