UNIVERSIDADE ESTADUAL DO CEARÁ PRÓ-REITORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO E PESQUISA FACULDADE DE VETERINÁRIA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS VETERINÁRIAS LINA RAQUEL SANTOS ARAÚJO USO DE DILUENTES ALTERNATIVOS A BAIXAS TEMPERATURAS NA MANUTENÇÃO DA QUALIDADE ESPERMÁTICA DO SÊMEN SUÍNO FORTALEZA 2012 LINA RAQUEL SANTOS ARAÚJO USO DE DILUENTES ALTERNATIVOS A BAIXAS TEMPERATURAS NA MANUTENÇÃO DA QUALIDADE ESPERMÁTICA DO SÊMEN SUÍNO Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias da Faculdade de Veterinária da Universidade Estadual do Ceará, como requisito parcial para a obtenção do grau de Mestre em Ciências Veterinárias. Área de Concentração: Reprodução e Sanidade Animal. Linha de Pesquisa: Reprodução e sanidade carnívoros, onívoros, herbívoros e aves Orientador: Prof. Dr. Ricardo Toniolli FORTALEZA 2012 Dados Internacionais de Catalogação na Publicação Universidade Estadual do Ceará Biblioteca Central Prof. Antônio Martins Filho A663u Araújo, Lina Raquel Santos Uso de diluentes alternativos a baixas temperaturas na manutenção da qualidade espermática do sêmen suíno / Lina Raquel Santos Araújo. – 2012. 92 f. : il. color., enc. ; 30 cm. Dissertação (Mestrado) – Universidade Estadual do Ceará, Faculdade de Medicina Veterinária, Curso de Mestrado Acadêmico em Ciências Veterinárias, Fortaleza, 2012. Área de Concentração: Reprodução e sanidade animal. Orientação: Prof. Dr. Ricardo Toniolli. 1. Água de coco. 2. Leite em pó desnatado. 3. Trolox. 4. Betaína. 5. Sêmen suíno. I. Título. CDD: 636.089 LINA RAQUEL SANTOS ARAÚJO USO DE DILUENTES ALTERNATIVOS A BAIXAS TEMPERATURAS NA MANUTENÇÃO DA QUALIDADE ESPERMÁTICA DO SÊMEN SUÍNO Dissertação apresentada ao Programa de Pós- Graduação em Ciências Veterinárias da Faculdade de Veterinária da Universidade Estadual do Ceará, como requisito parcial para a obtenção do grau de Mestre em Ciências Veterinárias. Aprovada em: 29/ 06/ 2012. BANCA EXAMINADORA _________________________________ Prof. Dr. Ricardo Toniolli Universidade Estadual do Ceará Orientador _________________________________ Prof. Dr. Airton Alencar de Araújo Universidade Estadual do Ceará Examinador _______________________________ Dra. Maria Gorete Flores Salles Lar Antônio de Pádua Examinadora 3 DEDICATÓRIA Ao meu pai, que aplaudia minhas conquistas, embora minúsculas fossem e que sempre me fez acreditar que poderia mais... 4 AGRADECIMENTOS À Deus, por sempre iluminar meus caminhos... À Universidade Estadual do Ceará, pelo conhecimento adquirido neste curso de Pósgraduação em Ciências Veterinárias À CAPES pelo apoio financeiro À minha família, pelo apoio e encorajamento Ao meu “Bixinho”, por ter tentado me aguentar e me compreender em meus momentos de estresse e também por sua amizade e companheirismo Ao professor Dr. Ricardo Toniolli, pelos ensinamentos, orientação e paciência com a minha readaptação á pesquisa científica Ao professor Dr. José Nailton Bezerra Evangelista, pelo apoio, sugestões, orientação continuada, sobretudo por sua amizade Ao Jocemar por sua gentileza, pontualidade e colaboração. À técnica Rocilda pelo auxílio e por sua alegria em comemorar a vida! Aos meus sempre amigos, que certamente compreenderão minha ausência durante essa fase Ao Laboratório constituído pelo nosso heterogêneo, completo e divertido grupo formado pelo Prof. Claudio, Tatyanne, Aline, Daianny, Ludymilla, Eduardo, Thalles, Ramon, Renata e Cristina. A todos vocês, muito obrigada! 5 RESUMO Inúmeros trabalhos tem sido realizados com o propósito de melhorar a conservação do sêmen suíno, seja com o uso de diluentes ou faixas de temperaturas alternativas, ou ainda adicionando antioxidantes ou aminoácidos ao diluente. O presente estudo teve por objetivo definir um diluente e temperatura alternativa de conservação do sêmen suíno e avaliar os efeitos da inclusão de trolox ou betaína na manutenção da qualidade espermática. O sêmen de oito reprodutores foram coletados semanalmente através da técnica da mão enluvada e no laboratório foram submetidos às análises de vigor e motilidade no dia da coleta e durante o período de conservação (D0 a D4), avaliados quanto a vitalidade, integridade de acrossoma e teste hiposmótico no D0 e D4. Inicialmente os ejaculados foram conservados em três diluentes: Beltsville Thawing Solution (BTS), água de coco em pó (ACP) e leite em pó desnatado (LPD); e submetidos a duas temperaturas de armazenamento 17 e 10 °C, totalizando seis tratamentos. Definido o melhor tratamento, adicionou-se três diferentes concentrações de trolox (1000, 2000 e 3000 µM/ 100 mL) e de betaína (1, 2 e 3g/ 100 mL). Dos diluentes testados, o LPD a 10 °C proporcionou uma melhor conservação da motilidade e vigor espermáticos, além de maior taxa de vitalidade e maior percentual de células com acrossoma íntegro. Diante desses resultados, o LPD a 10 °C apresentou-se como melhor diluente para a realização das etapas seguintes. As amostras acrescidas de diferentes concentrações de trolox não foram melhores quando comparadas ao tratamento controle em nenhuma das análises realizadas. Concentrações elevadas de trolox (2000 e 3000 µM) apresentaram efeitos negativos sobre o vigor e a motilidade espermática. Quanto às amostras acrescidas de betaína, também não foram observados efeitos benéficos. A betaína provavelmente devido a seus efeitos osmóticos, reduziu o vigor e motilidade das amostras, esse efeito foi maior quando se elevou a concentração desse aminoácido. O LPD pode ser utilizado como diluente para o sêmen suíno acondicionado a 10 °C para ser utilizado por até 24 horas após a diluição. Não se pode comprovar os efeitos benéficos do trolox na conservação do sêmen suíno em meio à base de LPD. E a betaína apresentou efeitos negativos sobre a qualidade espermática quando adicionada ao diluente à base de LPD, em concentrações acima de 1% em temperatura de conservação a 10 °C. Palavras-chave: Sêmen suíno, água de coco em pó, leite em pó desnatado, antioxidantes. 6 ABSTRACT Countless studies have been conducted with the purpose of improving the conservation of boar semen, either with the use of diluents or alternative temperature ranges, or adding antioxidants or amino acid to the diluent. The present study aimed to define an alternative diluent and temperature preservation of boar semen and evaluate the effects of adding trolox or betaine in the maintenance of sperm quality. The semen of eight boars were collected weekly through the gloved hand technique and underwent laboratory analysis of vigor and motility on the day of collection and during the storage period (D0 to D4), evaluated for vitality, acrosome integrity and test hyposmotic on D0 and D4. Initially, the ejaculates were preserved in three diluents: BTS, water coconut powder (ACP) and skimmed milk powder (LPD) and subjected to two storage temperatures 17 and 10 °C, a total of six treatments. The best defined of these treatment was added three different concentrations of trolox (1000, 2000 and 3000 μM/ 100 mL) and betaine (1, 2 and 3g / 100 mL). Of the diluents tested, the LPD 10 °C provided better preservation of the spermatic motility and vigor, and higher rate of vitality and a higher percentage of cells with intact acrosome. Given these results, the LPD 10 ° C presented as the best diluent to perform the following steps. The samples added with different concentrations of trolox were no better when compared to control treatment in any of the analyzes. High concentrations of trolox (2000 and 3000 μM) had negative effects on the vigor and sperm motility. The samples added with betaine, were not observed beneficial effects. Betaine likely due to its osmotic effects, reduced vigor and motility of the samples, this effect was greater when it increased the concentration of this amino acid. The LPD can be used as a diluent for boar semen conditioned at 10 °C to be used for up to 24 hours after dilution. You cannot prove the beneficial effects of trolox in the preservation of boar semen in medium based on LPD. And betaine had detrimental effects on sperm quality when added to the diluent based on the LPD, at concentrations above 1% by storage temperature to 10 °C. Keywords: Boar semen, coconut powdered water, skimmed powdered milk, antioxidant. 7 LISTA DE TABELAS CAPITULO II Tabela 1: Vigor espermático do sêmen suíno conservado durante cinco dias em diferentes temperaturas (17 e 10 °C) nos diluentes BTS, ACP-103® e LPD................................................................................................................... 50 Tabela 2: Total de espermatozoides móveis (%) do sêmen suíno conservado durante cinco dias em diferentes temperaturas (17 e 10 °C) nos diluentes BTS, ACP103® e LPD........................................................................................................ 52 Tabela 3: Total de espermatozoides vivos (vitalidade %) do sêmen suíno, conservado durante cinco dias em diferentes temperaturas (17 e 10 °C) nos diluentes BTS, ACP-103® e LPD..................................................................................... 56 Tabela 4: Total de espermatozoides com acrossoma intacto (%) do sêmen suíno, conservado durante cinco dias em diferentes temperaturas (17 e 10 °C) nos diluentes BTS, ACP-103® e LPD...................................................................... 57 CAPITULO III Tabela 1. Análise do vigor espermático do sêmen suíno conservado durante cinco dias em LPD a 10 °C, com diferentes concentrações de trolox................................ 66 Tabela 2. Análise da motilidade espermática do sêmen suíno conservado durante cinco dias em LPD a 10 °C, com diferentes concentrações de trolox........................ 67 Tabela 3: Total de espermatozoides vivos (vitalidade %) do sêmen suíno, conservado durante cinco dias no diluente LPD a 10 °C com diferentes concentrações de trolox................................................................................................................ 68 Tabela 4: Total de espermatozoides com acrossoma intacto (%) do sêmen suíno, conservado durante cinco dias no diluente LPD a 10 °C com diferentes concentrações de trolox.................................................................................... 69 Tabela 5: Total de espermatozoides com reativos ao teste hiposmótico (%) do sêmen suíno, conservado durante cinco dias no diluente LPD a 10 °C com diferentes concentrações de trolox.................................................................... 69 CAPITULO IV Tabela 1. Análise do vigor espermático do sêmen suíno conservado durante cinco dias em LPD a 10 °C, com diferentes concentrações de betaína.............................. Tabela 2. Análise da motilidade espermática do sêmen suíno conservado durante cinco dias em LPD a 10 °C, com diferentes concentrações de betaína...................... 77 78 8 Tabela 3: Total de espermatozoides vivos (vitalidade %) do sêmen suíno, conservado durante cinco dias no diluente LPD a 10 °C com diferentes concentrações de betaína............................................................................................................... 79 Tabela 4: Total de espermatozoides com acrossoma intacto (%) do sêmen suíno, conservado durante cinco dias no diluente LPD a 10 °C com diferentes concentrações de betaína.................................................................................. 80 Tabela 5: Total de espermatozoides com reativos ao teste hiposmótico (%) do sêmen suíno, conservado durante cinco dias no diluente LPD a 10 °C com diferentes concentrações de betaína.................................................................. 80 9 LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS ACP - 103® Água de coco em pó AMP Adenosina monofosfato ATP Adenosina trifosfato BTS Beltsville Thawing Solution BWW Biggers, Whitten and Wittingham CA Conversão alimentar EROs Espécies reativas ao oxigênio ET Espessura de toucinho FAS Fat acid sintetase FAVET Faculdade de Veterinária GMD Ganho médio diário IA Inseminação Artificial LPD Leite em pó desnatado MET Metionina SPTZ Espermatozoides UECE Universidade Estadual do Ceará 10 SUMÁRIO 1. INTRODUÇÃO ........................................................................................................... 12 2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA .................................................................................. 14 2.1. A importância da inseminação artificial na cadeia suinícola ................................ 14 2.2. O sêmen suíno e métodos de avaliação ................................................................. 14 2.3. Conservação do sêmen .......................................................................................... 16 2.4. Temperatura de conservação ................................................................................. 17 2.5. Diluentes ............................................................................................................... 18 a) Água de coco em pó (ACP) ........................................................................... 19 b) Leite em pó desnatado (LPD) ........................................................................ 20 2.6 Radicais livres ........................................................................................................ 21 2.7 Geração de EROs ................................................................................................... 21 2.8. Antioxidantes ........................................................................................................ 22 2.9. Aminoácidos ......................................................................................................... 23 3. JUSTIFICATIVA ....................................................................................................... 25 4. HIPOTESE CIENTÍFICA ......................................................................................... 27 5. OBJETIVOS ................................................................................................................ 28 5.1. Objetivo Geral ....................................................................................................... 28 5.2. Objetivos Específicos ............................................................................................ 28 6. CAPITULO I - Aplicações da betaína na produção animal ........................................ 29 7. CAPÍTULO II - Uso de diferentes diluentes e temperatura alternativa na conservação do sêmen do varrão ..................................................................... 45 8. CAPÍTULO III - Efeito da adição de trolox ao diluente leite em pó desnatado durante a conservação do sêmen suíno a 10 °C ................................... 61 9. CAPÍTULO IV - Efeito da adição de betaína ao diluente leite em pó desnatado durante a conservação do sêmen suíno a 10 °C ................................... 72 10 CONCLUSÕES .......................................................................................................... 84 11 PERSPECTIVAS …................................................................................................... 85 12 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ..................................................................... 86 11 1. INTRODUÇÃO A inseminação artificial (IA) é uma técnica amplamente empregada na suinocultura, utilizando o sêmen conservado sob a forma refrigerada, sendo uma prática comum em grande parte do plantel de suínos do Brasil. A manutenção do sêmen suíno sob condições de refrigeração tem se mostrado uma técnica eficiente para a difusão de material genético através dos programas de inseminação artificial (BORTOLOZZO et al., 2005). Usualmente, a temperatura de preservação do sêmen varia entre 15 a 20 ºC (JOHNSON et al., 2000), entretanto já foi verificado que essa faixa de temperatura é imprópria à preservação do sêmen por períodos prolongados de tempo (BRAGA, 2007). O espermatozoide suíno é um dos mais sensíveis a flutuações de temperatura quando comparado ao de outras espécies (CORRÊA et al., 2001). Desta forma, o processamento do sêmen utilizando diluentes adequados é um dos pontos importantes para sua conservação e consequentemente para o sucesso de um programa de inseminação (CORRÊA et al., 2001). O diluente possui várias funções, tais como, aumentar o volume do ejaculado total, fornecer nutrientes para a produção de energia, proteger os espermatozoides contra o choque térmico, controlar a flutuação de pH, manter o balanço osmótico e inibir o desenvolvimento bacteriano (ALTHOUSE, 1997; JOHNSON et al.,2000; LEVIS, 2000; CORRÊA et al., 2001; BORTOLOZZO et al., 2005), dentre outros. Deste modo, uma qualidade do meio diluente que permita um maior período de conservação do ejaculado, é importante para o sucesso dos resultados de fertilidade (PEREZGARCIA, 1958; JOHNSON et al., 1988). Assim, se faz necessário o desenvolvimento de técnicas e de soluções que permitam a utilização do sêmen resfriado, sem queda dos resultados de fertilidade em particular na espécie suína (TONIOLLI et al., 1998; TONIOLLI et al., 2001). Numerosos trabalhos têm sido efetuados com a finalidade de desenvolver um diluente para diferentes machos domésticos, inclusive com a adição de várias substâncias tais como antioxidantes (JEONG et al., 2009) e crioprotetores (LINDEBERG et al., 1999; FAGUNDES et al., 2010). Por outro lado, diluentes alternativos têm sido testados, tais como o leite desnatado (MEIRELLES et al., 1998; TONIOLLI et al., 2001) e a água de coco (NUNES; SALGUEIRO, 1999; CARDOSO et al., 2002; TONIOLLI et al., 2010), e vem sendo utilizados na conservação do sêmen de diversas espécies domésticas, além do homem. 12 A escolha do diluente deve considerar as condições específicas em que a inseminação artificial ocorre. O tempo que normalmente decorre entre o processamento das doses e a IA, ou seja, se o sêmen se destina ao uso imediato ou ao armazenamento durante alguns dias, é um dos fatores que deve ser levado em consideração. O manejo da IA adotado e o custo do diluente também influenciam enormemente na sua escolha (BORTOLOZZO et al., 2005). A busca por novos protocolos e/ou meios de conservação (TONIOLLI et al., 2001; NUNES; SALGUEIRO, 1999; TONIOLLI et al., 2010) é de grande importância para a cadeia suinícola, já que tem o propósito de aumentar a longevidade das doses inseminantes a um baixo custo, uma vez que, um diluente de longa duração implicaria em custos adicionais (BORTOLOZZO et al., 2005). 13 2. REVISÃO DE LITERATURA 2.1. A importância da inseminação artificial na cadeia suinícola Na tentativa de reduzir os custos envolvidos na cadeia produtiva, bem como o aumento do padrão genético e da qualidade do produto final, foi introduzida a inseminação artificial (IA) na suinocultura (CASTAGNA et al., 2001). No Brasil, a IA em escala comercial foi introduzida somente a partir de 1975, principalmente na região sul do país, devido a uma forte concentração de criadores com alto nível de tecnificação além de taxas elevadas de produtividade (SCHEID, 1992). O crescente aumento do uso desta técnica, particularmente desde 1990, deveu-se ao fato de que o seu domínio propicia uma maior demanda por suínos de alta qualidade genética, fazendo com que estes animais possam ter uma maior produtividade, principalmente, no beneficiamento de suas carcaças com índices cada vez menores de gordura (JOHNSON et al., 2000). A utilização da IA promove uma série de vantagens quando comparada com a monta natural, dentre as quais, os ganhos advindos da melhoria genética que são os de maior importância. Como exemplo desta melhoria, é possível citar o maior rendimento de carne e, consequentemente, o aumento na bonificação da carcaça, melhoria na eficiência alimentar, maior ganho de peso e otimização do uso das instalações (CASTAGNA et al., 2001). A manutenção do sêmen suíno sob condições de refrigeração tem se mostrado uma técnica eficiente para a difusão do material genético através dos programas de inseminação artificial. Quando o sêmen é adequadamente processado, é possível a obtenção de altos resultados de prenhez e de prolificidade, com resultados no mínimo, semelhantes aos obtidos com o uso da monta natural (BORTOLOZZO et al., 2005). 2.2. O sêmen suíno e os métodos de avaliação Dentre as diversas espécies domésticas, o suíno é o que produz maior volume de sêmen por ejaculação, com valores médios em animais adultos que oscilam entre 150 a 500 mL. Tal característica pode ser influenciada pela idade do animal, estação do ano, intervalo entre coletas, estado nutricional e raça, dentre outras (CAVALCANTI, 1998). O ejaculado do suíno é constituído de três porções: a fase pobre, com um número muito pequeno de espermatozoides; a fase intermediária, que é a mais rica em células 14 espermáticas; a última porção que forma o tampão vaginal e é constituída de material gelatinoso, sendo esta última fase, no caso do sêmen ser utilizado na inseminação, separada do restante da amostra por filtrado, com gaze ou algodão (CAVALCANTI, 1998). Henry e Neves (1998) consideram que o sêmen in natura não deve apresentar motilidade e vigor inferiores a 70% e 3,0, respectivamente, no momento da diluição. A avaliação qualitativa do ejaculado é realizada com o objetivo de predizer a capacidade fecundante de uma amostra de sêmen ou o potencial reprodutivo de um animal, não informando de maneira definitiva se um determinado macho é fértil ou não. Também é empregada para a identificação de possíveis causas de infertilidade no rebanho ou para detectar a tempo alterações que possam comprometer a capacidade fecundante de uma determinada partida de sêmen (BORTOLOZZO et al., 2005). A avaliação do ejaculado é dividida nas etapas macroscópicas (análise de volume, aspecto, cor e odor) e microscópicas (concentração, vigor, motilidade e morfologia) (BORTOLOZZO et al., 2005). A análise da concentração é definida como sendo o número de células espermáticas presentes em um ejaculado, por sua unidade de volume. Esta medida pode ser determinada de três maneiras: espectrofotômetro, espermiodensímetro e câmara de Neubauer. O espectrofotômetro é um aparelho que mede a concentração através da densidade óptica, permitindo uma analise prática, rápida e precisa. O espermiodensímetro determina a concentração através da observação do grau de turvação de uma suspensão de espermatozoides. Esta avaliação pode ser laboriosa quando há necessidade de fazer uma prédiluição em caso de sêmen muito denso. Já a câmara de Neubauer é o método de contagem mais demorado, não sendo indicado para um grande número de ejaculados (CORRÊA et al., 2001). Vigor e motilidade espermática são análises subjetivas rotineiras, embora exista o sistema computadorizado de análise do sêmen, o CASA (Computer Assisted Sperm Analyzer) utilizado apenas a nível experimental. O primeiro representa a força e o tipo de movimento do espermatozoide, podendo ser classificado com notas de 0 a 5, onde 0 representa a ausência de movimento progressivo com deslocamento lateral de cauda fraco e inexpressivo, e 5 representa um movimento vigoroso e veloz dos espermatozoides. Apesar desta análise subjetiva, seguindo-se as características predeterminadas pela tabela de análise de vigor espermático (TONIOLLI, 1996), os resultados obtidos para esta característica, por pessoas bem treinadas, são bastante homogêneos. Já a motilidade consiste em estimar o percentual de 15 células móveis em relação ao total de células de um determinado campo do microscópio (BORTOLOZZO et al., 2005). A avaliação do sêmen deve ser conduzida de forma disciplinada, respeitando alguns conceitos básicos de higiene e controle de temperatura. Os métodos empregados para avaliação, na medida do possível, devem ser eficientes, econômicos e práticos, de modo a se preservar a qualidade inicial do ejaculado. Apesar de não ser possível predizer com absoluta exatidão a fertilidade de um ejaculado, os resultados obtidos através dessas análises permitem selecionar um ejaculado quanto a sua provável capacidade fertilizante (CORRÊA et al., 2001). A análise morfológica permite a avaliação qualitativa das células espermáticas para determinar o percentual de alterações na amostra de sêmen. Um alto percentual de defeitos pode significar alterações durante a espermatogênese e maturação espermática, ou ainda, de que o ejaculado tenha sido manipulado de forma imprópria. Com esse exame, é possível descartar reprodutores com ejaculados de baixa qualidade para emprego na IA (RODRIGUEZ-MARTINEZ; ERIKSSON, 2000). 2.3. Conservação do sêmen Para conservar os espermatozoides durante períodos prolongados é necessário manter a integridade celular, reduzir a atividade metabólica e manter sob controle o desenvolvimento de microrganismos, para tanto é realizada a diluição em meio adequado além do abaixamento da temperatura (SANCHEZ, 2003). Há duas formas de conservação seminal já amplamente utilizadas: o resfriamento e a congelação. A redução da temperatura tem sido um método utilizado para prolongar a viabilidade dos espermatozoides ejaculados, devido a seu efeito de desaceleração dos processos metabólicos celulares (ALMOND et al., 1994). Isso ocorre em virtude da característica da membrana dos espermatozoides, que quanto menor for a temperatura do meio, menor será a mobilidade de seus lipídios na dupla membrana, os quais se solidificam, impedindo seu movimento e também o movimento das proteínas, mantendo desta forma a estrutura da membrana celular (SANCHEZ, 2003). Apesar dos benefícios dos processos de conservação citados acima, podem acontecer danos irreversíveis a célula espermática em virtude do choque térmico, que levam a uma redução da sua motilidade, resultando em inchaço na membrana acrossomal, aumento da 16 permeabilidade da membrana plasmática (FERNANDEZ-SANTOS et al., 2006), ruptura da membrana plasmática, com perda de íons e enzimas interferindo assim na sua sobrevivência e capacidade fecundante (LEEUW et al., 1991). 2.4. Temperatura de conservação O espermatozoide suíno é uma das células mais sensíveis à flutuações de temperatura quando comparado aos de outras espécies (CORRÊA et al., 2001). Vários fatores podem estar envolvidos na susceptibilidade desses espermatozoides ao choque térmico, merecendo ênfase a forma da cabeça (WATSON; PLUMMER, 1985), a composição química da membrana (DARIN-BENNETT; WHITE, 1975; DE LEEUW et al.,1990) e a temperatura de fase de transição (GADELLA, 1996). A temperatura ideal para a manutenção das doses inseminantes situa-se entre 15 e 18 °C. Queda de temperatura abaixo de 15 °C normalmente é causa de choque térmico, que resulta em perda irreversível da motilidade espermática e lesões na estrutura das células. Esta sensibilidade é caracterizada pela perda da permeabilidade seletiva e da integridade da membrana plasmática do espermatozoide, fato esse que normalmente o leva a morte (WATSON, 1996). Por outro lado, temperatura acima dos 18 °C, são deletérias por não reduzirem de forma eficiente o metabolismo dos espermatozoides, facilitando a multiplicação de bactérias, que tem uma ação negativa sobre a qualidade do sêmen (SCHEID, 2003). Ao estudar o efeito da temperatura sobre a membrana plasmática dos espermatozoides suínos, Canvin e Buhr (1989) constataram que, a fluidez das membranas plasmáticas da cabeça e do corpo da célula diferem entre si, e que o processo de resfriamento e reaquecimento do sêmen alteram significativamente as organizações moleculares, alterando a funcionalidade da membrana. A reorganização das partículas da membrana, causada pelo choque pelo frio, pode ser reversível e não causar, por si só, danos aos espermatozoides. Porém, o funcionamento da membrana pode ser alterado, talvez de modo irreversível, devido às mudanças decorrentes da separação de fases, conduzindo ao aumento da permeabilidade com perda de cátions e enzimas, redução da atividade enzimática e perturbações nos processos de difusão controlados pela membrana (DE LEEUW et al., 1990). Estudos realizados por Watson e Plummer (1985) ressaltam que as organelas mais frequentemente prejudicadas pelo efeito do choque térmico são a membrana plasmática, o 17 acrossoma e a mitocôndria. As mudanças relacionadas ao acrossoma são visíveis ao microscópio óptico sendo observado menor refração apical e edema. Observa-se menor motilidade após o reaquecimento quando a célula é resfriada rapidamente abaixo de 10 ºC, nesse processo, o espermatozoide do varrão libera 30% do total de glicose fosfatase isomerase e 4% de lactato desidrogenase em resposta ao choque térmico; ocorre ganho intracelular de sódio e zinco e perda de potássio, sendo que a concentração de magnésio diminui significativamente depois deste processo, tendo sido encontrados lipídios na membrana extracelular após o choque térmico. O sinal mais visível da injúria causada pelo choque térmico é a perda irreversível da motilidade (QUINN et al., 1966). Para White (1993), o decréscimo no aporte de oxigênio e a queda de adenosina tri-fosfato (ATP) reduzem a produção e o fornecimento de energia para a movimentação celular. Segundo Weber (1989), o efeito imediato do choque térmico envolve os conteúdos intracelulares de ATP e AMP-cíclico que diminuem rapidamente, não podendo mais ser ressintetizados pelas células lesadas. O espermatozoide suíno é particularmente sensível ao resfriamento para temperaturas inferiores a 15 ºC, principalmente quando o sêmen in natura é resfriado rapidamente, o que resulta em uma redução da sobrevivência espermática. Os efeitos do resfriamento sobre a célula espermática incluem uma série de mudanças nos espermatozoides, quando o sêmen é exposto a temperaturas abaixo de 15 ºC (PURSEL et al., 1973; ALTHOUSE et al., 1998). Essas mudanças em conjunto, têm sido denominadas de choque pelo frio ou cold shock. O choque térmico caracteriza-se pela presença de espermatozoides com movimentação atípica, perda prematura de motilidade, alterações nas membranas acrossômica, plasmática e mitocondrial, resultando em mudanças bioquímicas envolvendo o metabolismo celular, perda de enzimas intracelulares e distribuição de íons (AMANN; PICKETT, 1987; ZENG; TERADA, 2000). 2.5. Diluentes O processamento do sêmen utilizando diluentes adequados é um dos pontos importantes para o sucesso de um programa de inseminação (CORRÊA et al., 2001). O termo diluente, ou extensor, refere-se a uma solução aquosa que possui várias funções, tais como a de aumentar o volume do ejaculado total, fornecer nutrientes para a produção de energia, proteger os espermatozoides contra o choque térmico, controlar a flutuação de pH, manter o balanço osmótico, inibir o desenvolvimento bacteriano (ALTHOUSE, 1997; JOHNSON et 18 al., 2000; LEVIS, 2000; CORRÊA et al., 2001; BORTOLOZZO et al., 2005) e preservar as características funcionais das células espermáticas, favorecendo a obtenção de taxas de prenhez adequadas (GADEA, 2003). Usualmente, a temperatura de preservação do sêmen suíno tem variado de 15 a 20 ºC (JOHNSON et al., 2000). Verifica-se que essa faixa de temperatura é imprópria à preservação do sêmen por períodos prolongados de tempo, com ênfase para dois aspectos limitantes, a saber, a inadequada redução do metabolismo espermático e a facilidade de multiplicação bacteriana, que concomitantemente poderão reduzir a longevidade espermática (BRAGA, 2007). Deste modo, a qualidade do meio diluente que permita um maior período de conservação do ejaculado, é importante para o sucesso dos resultados da inseminação artificial (PEREZ-GARCIA, 1958; JOHNSON et al., 1988). Assim, se faz necessário o desenvolvimento de técnicas e soluções que permitam a utilização do sêmen resfriado, sem queda dos resultados de fertilidade em particular na espécie suína (TONIOLLI et al., 1998; TONIOLLI et al., 2001). Numerosos trabalhos têm sido efetuados com a finalidade de desenvolver um diluente para diferentes machos domésticos. O uso de várias substâncias adicionadas ao diluente como os antioxidantes (JEONG et al., 2009), os crioprotetores, como os aminoácidos (LINDEBERG et al., 1999; FAGUNDES et al., 2010), bem como, diferentes meios como o leite desnatado (MEIRELLES et al., 1998; TONIOLLI et al., 2001) e a água de coco (NUNES; SALGUEIRO, 1999: CARDOSO et al., 2002; TONIOLLI et al., 2010), foram utilizados na conservação do sêmen de diversas espécies domésticas, além do homem. a) Água de coco (ACP): A água de coco é uma solução estéril, ligeiramente ácida, contendo proteínas, sais, açúcares, vitaminas, fatores de crescimento (fitohormônios) e muito pouco fosfolipídeo (LAGUNA, 1996). Em virtude da presença dessas características, ela passou a ser testada como meio diluente de sêmen para diversas espécies animais, como suínos (TONIOLLI et al., 2010), caprinos (NUNES; SALGUEIRO, 1999; AZEVEDO; TONIOLLI, 1999), ovinos (BRAZ et al., 2003), caninos (CARDOSO et al., 2002; SILVA et al., 2000) e felinos (SILVA et al., 2007). Após correção da sua osmolaridade e pH, ela vem apresentando, através de experimentos in vitro e in vivo, resultados positivos na manutenção da viabilidade e poder fecundante dos espermatozoides, sendo possível sua utilização em processos biotecnológicos 19 como a inseminação artificial, sem os custos elevados com diluentes importados (NUNES, 1998). A água de coco como diluente de sêmen mostrou efeitos benéficos, evidenciados in vitro sobre as características de motilidade espermática (TONIOLLI et al., 1998; TONIOLLI et al., 2001), inclusive mantendo maiores valores para esta característica durante 96 horas de conservação do sêmen suíno (TONIOLLI et al., 2010). No sêmen caprino e ovino a motilidade manteve-se elevada por até 48 e 24 horas, respectivamente (NUNES; SALGUEIRO, 1999). Além da manutenção da motilidade espermática, verificou-se também uma maior proteção aos espermatozoides conferida pelo diluente ACP, que se traduziu por um maior número de células vivas com acrossoma íntegro (TONIOLLI et al., 2010). b) Leite em pó desnatado (LPD): O leite desnatado, utilizado como diluente de sêmen é de uso prático e efetivo na proteção do espermatozoide durante o período de conservação, inclusive preservando melhor a motilidade espermática do que outros diluentes, tanto na forma líquida, quanto pós-descongelação (KULAKSIZ et al., 2012). Contem componentes tanto com ação benéfica para o gameta (BARTELLIER et al., 1998). O leite desnatado é um excelente meio conservador para os espermatozoides, quando estocados a baixas temperaturas (4 ºC). Entretanto, em temperaturas mais altas (15 ºC), ele teria efeitos deletérios à célula espermática, devido à presença de componentes moleculares tóxicos (GARCIA; GRAHAN, 1987; MEIRELLES et al., 1998) Embora o leite apresente capacidade de preservação do sêmen similar a outros diluentes alternativos (gema de ovo e à base de soja) nos primeiros dias de armazenamento, como observado em um estudo com sêmen ovino, ele não se mostrou capaz de preservar o sêmen por um longo período, devido ao processo de deterioração (KASIMANICKAM et al., 2011). Segundo Foote (1974) e Memon e Ott (1981), a presença das lipoproteínas e lecitinas do leite promovem a proteção da célula espermática contra o choque térmico, quando adicionadas ao sêmen antes do resfriamento. Inclusive, há relatos sobre o efeito crioprotetor do leite desnatado, também conferindo uma melhor proteção à célula espermática pósdescongelação, entretanto, sem efeitos benéficos sobre a motilidade (JULIANI; HENRY, 2008). 20 2.6 Radicais livres Uma das razões que explicam a diminuição da qualidade do ejaculado de um reprodutor é a maior produção de espécies reativas ao oxigênio (EROs), também chamadas de radicais livres, ou seja, átomos ou moléculas que possuem um ou mais elétrons despareados (STRYER, 1996). A formação do superóxido pode acontecer de forma espontânea nas seguintes situações: em ambientes aeróbicos, ricos em elétrons; próximo à membrana mitocondrial interna, devido ao escape de elétrons da cadeia respiratória (NORDBERG; ÁRNER, 2001). Distúrbios no equilíbrio da produção de oxidante/antioxidante, levam a danos celulares, denominados danos ou estresse oxidativo (AITKEN, 1995), que podem ser causados de duas maneiras: pela redução na produção de antioxidantes para dentro do sistema de defesa celular ou pela produção elevada de EROs (HALLEWELL; GUTTERIDGE, 1999). Estudos realizados por vários pesquisadores indicam que o H 2O2 é a ERO que promove os maiores danos in vitro aos espermatozoides, possuindo funções deletérias, atuando na diminuição da motilidade espermática (ARMSTRONG, 1999). Na verdade, ela não é um radical livre, porém é de grande importância, devido à sua habilidade de penetrar em membranas biológicas (HALLIWELL, 1991) agindo como intermediária na formação de EROs. A grande sensibilidade espermática aos danos causados pelas EROs, pode ser explicado por duas razões: 01. A quantidade de ácidos graxos polinsaturados presentes em sua membrana plasmática; 02. Baixas concentrações de enzimas antioxidantes em seu reduzido citoplasma (AITKEN; FISHEL, 1994). Outra razão que pode explicar esta sensibilidade espermática às EROs, é que com a perda da maior parte do citoplasma durante a espermiogênese, as células perdem também os seus mecanismos endógenos de reparo e defesa enzimática. Contudo, na avaliação do desequilíbrio entre a produção de antioxidantes e EROs pelo organismo, não se pode esquecer a ação protetora do plasma seminal através de suas enzimas, protegendo os espermatozoides contra os ataques oxidativos (HALLIWELL; GUTTERIDGE, 1999). 2.7 Geração de EROs no sêmen Dentro do ejaculado existem duas fontes principais de EROs: o espermatozoide e os leucócitos, com um mecanismo similar de geração de EROs localizada na membrana celular. 21 Os leucócitos geram EROs durante a fagocitose, com capacidade 100 vezes maior que as células espermáticas, se tornando uma poderosa e perigosa, fonte de EROs com efeito prejudicial sobre função espermática (AITKEN; BACKER, 2002). Os danos causados no espermatozoide advêm da alta quantidade de ácidos graxos polinsaturados oxidáveis em suas membranas, que o torna vulnerável à ação dose agentes oxidantes (radicais livres) bem como sensíveis à peroxidação lipídica. (BILODEAU et al., 2002). Quando as espécies reativas de oxigênio atacam as duplas ligações associadas aos ácidos graxos insaturados, uma reação em cadeia de peroxidação lipídica é iniciada, a qual, não sendo paralisada, leva a uma perda da permeabilidade da membrana e consequentemente da função espermática (AITKEN; BACKER, 2002). As espécies oxigênio reativas exercem um papel duplo na fertilidade do macho: 01. Fundamentais em processos como hiperativação da motilidade, capacitação, reação acrossômica e fertilização; 02. Podem causar severos danos ao espermatozoide, quando os seus mecanismos de defesa estão limitados. Assim, o espermatozoide está continuamente na “corda-bamba”, porque uma produção controlada de EROs é de vital importância para a sua função normal, enquanto que a superprodução e/ou defesas antioxidantes inadequadas levam a estresse oxidativo, com impacto negativo na fertilidade (AITKEN, 1995). 2.8. Antioxidantes A peroxidação dos lipídios ocorre nas espécies reativas ao oxigênio durante a preservação do sêmen, podendo ser agravada na presença de uma maior proporção de ácidos graxos insaturados e do baixo nível de antioxidante presente no espermatozoide. Assim, a suplementação com vários tipos de antioxidantes tem melhorado a viabilidade e motilidade espermáticas no sêmen diluído ou criopreservado de várias espécies (FUNAHASHI; SANO, 2005). Diferentes antioxidantes, como a vitamina E solúvel, a glutationa, a cisteína e a Nacetil-cisteína têm sido acrescentados aos diluentes para criopreservação ou armazenamento, quando em temperaturas inferiores a 12 ºC (BRAGA, 2007). O trolox (6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametil croman-2-ácido carboxílico), é um análogo hidrossolúvel do α-tocoferol que foi sintetizado por Scott e sua equipe em 1974 e indicado como antioxidante para a preservação de óleos e gorduras. Esta substância apresenta propriedades antioxidantes e é eficaz tanto em gordura animal quanto vegetal. Característica, 22 que o torna singular, já que o tocoferol tem pouca atividade na prevenção da peroxidação de óleos vegetais (SCOTT et al., 1974). Os antioxidantes são inibidores de radicais livres que suprimem a formação de espécies reativas ao oxigênio e/ou suas ações. A adição de antioxidantes ao diluente tem sido avaliada quanto à sua capacidade de proteger o espermatozoide do efeito tóxico dos metabólitos reativos do oxigênio (MAIA, 2006). Estudos têm mostrado que a vitamina E (αtocoferol) é capaz de interagir diretamente com radicais oxidantes (GIULIVI et al., 1992), protegendo as células de estresse oxidativo (TIRADO; BROWN, 2005) e de danos nas membranas plasmática e acrossomal (MAIA, 2006), bem como do DNA (DONNELLY et al., 1999), podendo ser utilizado em diluentes de refrigeração a fim de aumentar a viabilidade de sêmen criopreservado (BORBA NETO et al., 2010), melhorando a motilidade e a viabilidade do espermatozoides (MAIA, 2006). 2.9. Aminoácidos Os aminoácidos são moléculas carregadas, sendo possível que eles interajam eletrostaticamente com os grupos fosfato dos fosfolipídios da membrana plasmática do espermatozoide, formando assim uma camada sobre superfície da célula, protegendo-a contra choques térmicos (EL-SHESHTAWY et al., 2008). Isto pode contribuir para sua capacidade de manter a integridade da membrana acrossomal dos espermatozoides, durante o processo de criopreservação (FAGUNDES, 2008). Estudos sugerem que combinações desses crioprotetores podem ser benéfica para a criopreservação de sêmen de várias espécies (FAGUNDES et al., 2010). Alguns aminoácidos têm sido empregados na criopreservação de sêmen de várias espécies de mamíferos, tais como a glutamina (MERCADO et al., 2009), histidina (JUNNILA, 2000), metionina (ÇOYAN et al., 2010), betaína (LINDEBERG et al., 1999), prolina (PEÑA et al., 1998), cisteína (EL-SHESHTAWY et al., 2008), alanina e glicina (FAGUNDES et al., 2010). Eles têm sido usados com sucesso na congelação de sêmen equino (JUNNILA, 2000), canino (PEÑA et al., 1998) bovino (EL-SHESHTAWY et al., 2008) e ovino (ÇOYAN et al., 2010). A capacidade dos aminoácidos em melhorar a criosobrevivência dos espermatozoides tem sido relacionada com suas propriedades metabólicas e crioprotetoras, oxidantes ou osmorregulativas (MARTINS-BESSA et al., 2007). Uma vez que os aminoácidos não podem 23 penetrar a membrana do espermatozoide, então, mecanismos osmóticos podem explicar, em parte, a sua ação (TRIMECHE et al., 1999). Apesar de ter sido verificado o efeito crioprotetor sobre espermatozoides em diversas espécies, os mecanismos de crioproteção espermática conferidos pelos aminoácidos, assim como a função de aminoácidos livres na fisiologia do espermatozoide, ainda não foram totalmente esclarecidos (FAGUNDES et al., 2010). A betaína quando adicionada ao sêmen in natura de touros (100 e 200 mM), melhorou significativamente o percentual de espermatozoides móveis a 20, 5 e a 0 °C. Além disso, melhorou a motilidade espermática do sêmen de touros ditos como “congeladores pobres”, ou seja, os que apresentam motilidade abaixo de 20% após resfriamento (ZHANG et al., 2001). Junnila (2000) avaliou a adição do aminoácido betaína ao diluente de sêmen de garanhão sobre a motilidade espermática pós congelação, e verificou que concentrações acima de 1,5% melhoraram a motilidade espermática pós-descongelação. A adição de 2,5% de betaína ao diluente usado na congelação de espermatozoides de garanhão aumentou significativamente a motilidade progressiva pós-descongelação, mantendo 95% da motilidade original. Uma explicação para o efeito positivo da betaína seria seu possível papel como um osmólito intracelular no esperma de garanhão, um papel semelhante ao exibido por ela em outras células. Também é possível que a betaína, neste contexto, impeça a desnaturação das proteínas estruturais e enzimas, causada pela desidratação progressiva das células e evite os efeitos osmóticos dos solutos no fluido intracelular de espermatozoides. 24 3. JUSTIFICATIVA A inseminação artificial é uma biotécnica aplicada à reprodução que consolidou seu emprego comercial em várias espécies domésticas ao longo da segunda metade do século XX, conseguindo inclusive a obter resultados superiores aos da monta natural. No caso do suíno, ela foi amplamente difundida ao longo da década de setenta e oitenta, consolidando-se nos anos noventa, com uma utilização crescente chegando a atingir 90% de granjas tecnificadas. O sêmen, quando é adequadamente processado, é possível a obtenção de ótimos resultados reprodutivos, no mínimo semelhantes os conseguidos com monta natural (BORTOLOZZO et al., 2005). A inseminação artificial na espécie suína tem algumas limitações. A principal delas seria o curto período de armazenamento da dose inseminante. Apesar de existir a tecnologia de congelação de sêmen, o seu emprego comercial ainda não foi viabilizado. Com isso os programas de IA em suínos são estruturados para empregar sêmen refrigerado, cujas doses possuem curto período de três dias de viabilidade quando armazenadas (BORTOLOZZO et al., 2005). Há disponível no mercado os diluentes de longa duração, que permitem a viabilidade espermática por até cinco dias, entretanto, são de preparação complexa e de custo elevado (CORRÊA et al., 2001), o que justifica a busca por novos diluentes que preservem a viabilidade das células espermáticas por mais tempo e que sejam de fácil preparo e de baixo custo. Vários são os trabalhos relacionados ao uso de diluentes a base de água de coco (NUNES; SALGUEIRO, 1999: CARDOSO et al., 2002; TONIOLLI et al., 2010) e leite em pó desnatado (MEIRELLES et al., 1998; TONIOLLI et al., 2001) na conservação do sêmen de diferentes espécies domésticas. Os resultados obtidos valorizam a utilização desses diluentes em protocolos de inseminação artificial, devido aos efeitos positivos, determinados pela melhor manutenção da motilidade espermática (TONIOLLI et al., 1998; KULAKSIZ et al., 2012), e podendo se constituir em alternativas menos onerosas. Com a finalidade de reduzir danos às estruturas vitais dos espermatozoides oriundos da redução da temperatura, além de diferentes meio diluentes, foram empregadas substâncias para prolongar a vida dessas células, tais como antioxidantes e aminoácidos. Os antioxidantes amenizam os efeitos da peroxidação lipídica que ocorre durante a conservação do sêmen, e os aminoácidos adicionados ao diluente, exercem efeitos crioprotetores em nível de membrana 25 plasmática e acrossomal (FUNAHASHI; SANO, 2005), desta forma merecem um estudo mais específico e aprofundado a fim de se poder colocar em evidência seus efeitos positivos para a célula espermática. Dessa forma, faz-se necessário o desenvolvimento de técnicas que prolonguem a utilização do sêmen suíno resfriado com bons resultados zootécnicos (PEREZ-GARCIA, 1958; JOHNSON et al., 1988). O diluente representa aproximadamente 23% do custo de material de consumo de uma central de inseminação, independente do seu tamanho, e cerca de 7 a 8% do custo total da dose inseminante (BORTOLOZZO et al., 2005). Estudos adicionais com temperaturas e diluentes alternativos acrescidos de substâncias que permitam uma melhor conservação do sêmen são de extrema importância para a cadeia produtiva suinícola, principalmente se acompanhadas de vantagens econômicas que viabilizem seu emprego. 26 4. HIPÓTESES CIENTÍFICAS Os diluentes alternativos testados constituem bons meios de diluição/conservação do sêmen suíno. A inclusão de antioxidantes ao diluente melhora a viabilidade espermática por um período de tempo mais prolongado. 27 5. OBJETIVOS 5.1. OBJETIVO GERAL Determinar a melhor temperatura e diluente alternativo visando uma melhor conservação do sêmen suíno. 5.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS a) Verificar os efeitos de diferentes diluentes e temperaturas sobre a conservação da qualidade do sêmen suíno; b) Desenvolver um meio diluente que permita uma melhor conservação do sêmen suíno; c) Determinar uma nova temperatura que permita uma melhor conservação do sêmen suíno; d) Avaliar os efeitos de diferentes concentrações de trolox, sobre a conservação do sêmen suíno; e) Avaliar os efeitos de diferentes concentrações de betaína, sobre a conservação do sêmen suíno; 28 6. CAPÍTULO I Aplicações da betaína na produção animal Betaine Applications on Livestocks Araújo, Lina Raquel Santos; Barros, Tatyane Bandeira; Guimarães, Daianny Barboza; Cantanhêde, Ludymila Furtado; Dias, Aline Viana; Toniolli, Ricardo Periódico: Semina Submetido em: 20 de junho de 2012. 29 6. CAPÍTULO I Aplicações da betaína na produção animal Betaine Applications on Livestocks Araújo, Lina Raquel Santos1; Barros, Tatyane Bandeira1; Guimarães, Daianny Barboza1; Cantanhêde, Ludymila Furtado 1; Dias, Aline Viana1; Toniolli, Ricardo 2 1 Programa de Pós-graduação em Ciências Veterinárias – FAVET/UECE, 2Laboratório de Reprodução Suína e Tecnologia de Sêmen – FAVET/UECE, Av. Paranjana, 1700, Campus do Itaperi, CEP: 60740-000; Fortaleza - Ceará - Brasil, E-mail: [email protected] Resumo O presente trabalho aborda as principais aplicações da betaína na produção animal. A betaína é um aminoácido doador de grupos metil, que apresenta qualidades osmoprotetora e lipotrópica. Como doadora de grupos metil está envolvida no metabolismo proteico e energético. Como osmoprotetora, protege a célula do estresse hídrico, com papel importante em doenças osmóticas, como na Coccidiose em aves. Como agente lipotrópico, reduz a espessura de toucinho e melhora o rendimento de carcaça em suínos. Além de melhorar parâmetros reprodutivos em porcas e aumentar a produção de leite em cabras, é utilizada no diluente de congelação, melhorando a motilidade espermática pós-descongelação do sêmen de garanhão. A betaína apresenta efeitos benéficos na produção animal e sua principal aplicação parece estar na substituição parcial da metionina da dieta, gerando vantagens econômicas para o produtor. Palavras-chaves: Betaína, alimentação, produção animal, sêmen, reprodução. Abstract This curent paper discusses the main applications of betaine in animal production. Betaine is an amino acid, donor of methyl groups, which has osmoprotector and lipotropic qualities. As a donor of methyl groups, it is involved in protein and energy metabolism. As osmoprotector, it protects the cell from water stress, with an important role in osmotic diseases, such as 30 coccidiosis in poultry. As a lipotropic agent, reduces backfat thickness and improves the carcass yeld in pigs. Besides improvement in reproductive parameters in sows and increase in milk production of goats, it is used in freezing diluents, improving sperm post-thaw motility in the semen of stallions. Betaine has beneficial effects on animal production and its main application seems to be in the partial substitution of methionine in the animal’s diet, generating economic benefits for the producer. Keywords: Betaine, food, livestock, semen, reproduction. Introdução Em virtude de sua estrutura química, a betaína (trimetilglicina) é um derivado do aminoácido glicina, em que três grupos de metila são ligados ao átomo de nitrogênio da molécula de glicina. Como um subproduto do processamento da beterraba, ela é comercialmente disponível como um aditivo. Em decorrência de sua função de doadora de grupos metil, a betaína está envolvida no metabolismo de proteínas e energia (EKLUND et al., 2005). A betaína é uma molécula com dupla função no metabolismo animal, tanto é uma fonte direta de grupos metil, quanto desempenha um importante papel na manutenção do equilíbrio osmótico. A betaína é utilizada na alimentação animal para melhorar o desempenho produtivo dos animais; inclusive há relatos de melhorias na qualidade de carcaça de suínos (FERNANDEZ-FIGARES et al., 2002; HUANG et al., 2008), redução da espessura de toucinho e melhor conversão alimentar na mesma espécie (RIBEIRO et al., 2011), maior ganho de peso e melhor conversão alimentar em frangos de corte (ATTIA et al., 2005), maior produção de leite em cabras (ARANTZAMENDI et al., 2006) e em porcas (RAMIS et al., 2011). Em particular, sob certas condições fisiológicas, quando há exposição à patógenos ou estresse osmótico, como na Coccidiose em aves, a betaína pode ter um impacto positivo na produção animal (EKLUND et al., 2005). A betaína, além de ser utilizada na alimentação animal como melhoradora de desempenho, também tem sido estudada quanto à sua aplicação na conservação do sêmen de animais domésticos e seus efeitos sobre a motilidade espermática pós-descongelação (OLLERO et al., 1996; PEÑA et al., 1998; LINDEBERG et al., 1999; TRIMECHE et al., 1999; JUNNILA, 2000). O presente trabalho tem por objetivo abordar as principais aplicações da betaína na produção animal. 31 A betaína como doadora de grupos metil Quanto ao seu papel como doadora de grupos metil, em geral, a betaína está relacionada com outras substâncias, tais como a metionina e a colina. No entanto, das três moléculas, a betaína é a mais eficiente como doadora de grupos metil (ARANTZAMENDI et al., 2006). Grupos metil são necessários para a síntese de inúmeras substâncias, como a creatina, fosfatidilcolina, carnitina, adrenalina, purinas metila, bem como aminoácidos metilados (EKLUND et al., 2005). A betaína na dieta funciona como um poupador de metionina e/ou colina nos processos metabólicos, com vantagens econômicas. O resultado da transferência do grupo metil é a transformação da betaína (trimetilglicina) para dimetilglicina, que ainda contém dois grupos metil. Estes podem ser quebrados, por oxidação, na forma de fragmentos de carbono. Durante esta reação a dimetilglicina é degradada a sarcosina e, por último, a glicina. Os fragmentos de um carbono da dimetilglicina, bem como de outras fontes, como o ácido fórmico ou grupos carboxila de outros ácidos orgânicos são utilizados para sintetizar novos grupos metil, pela via tetrahidrofolato (EKLUND et al., 2005). Em frangos de corte estudaram-se três níveis de inclusão de metionina na dieta sendo 0,32; 0,37 e 0,42%. Cada nível de metionina foi suplementado (ou não) com 0,035 e 0,070% de betaína. Para o período experimental de 1 a 56 dias, esta suplementação aumentou de forma significativa o ganho de peso em 5,1 e 9,0% e melhorou a conversão alimentar em 8,4 e 12,0%, respectivamente, em relação ao grupo não suplementado. Em geral, os resultados indicaram que suplementação de betaína para 0,32 ou 0,37% do conteúdo de metionina na dieta melhorou significativamente o ganho de peso e conversão alimentar, em comparação com pintos alimentados com dieta contendo 0,42% de metionina, os quais mostraram menores respostas, tanto para o nível médio quanto para o elevado de suplementação. A betaína pode não substituir totalmente a metionina da dieta; porém, numa dieta para frangos contendo baixa concentração de metionina, apenas a metionina isolada da proteína da soja, responde bem à suplementação, seja com metionina, colina ou betaína (ATTIA et al., 2005). A betaína contribui para uma menor necessidade de doadores de grupos metil, tais como metionina e colina na alimentação animal, resultando em vantagens econômicas, sem que haja comprometimento do desempenho animal (EKLUND et al., 2005). Em frangos de corte, utilizou-se uma suplementação de 800g de betaína por tonelada, em cinco concentrações diferentes de metionina (0; 18; 20; 22 e 24 g Met/kg de ração). A suplementação de betaína foi eficaz no crescimento de frangos de corte (fase inicial), na 32 eficiência de conversão alimentar e rendimento do peito na carcaça de frangos, alimentados com uma dieta contendo concentrações subótimas de metionina (15g/kg). Por outro lado, a suplementação foi ineficaz em concentrações mais elevadas de metionina. Os dados (ganho de peso aos 21 dias e eficiência de conversão alimentar aos 42 dias de idade) do presente estudo indicam que a suplementação de betaína foi eficaz na melhoria de desempenho dos frangos de corte, quando a dieta continha concentrações subótimas de metionina (15 e 18 g / kg). Ela, através da sua propriedade de doadora de grupos metil, pode ter poupado a metionina desta função e esta metionina dietética estaria disponível para outras funções vitais, como a síntese de proteínas e modulação imunológica (RAO et al., 2011). A betaína como osmoprotetor A betaína age como uma substância osmoticamente ativa, retendo água no interior das células, auxiliando a função das bombas iônicas e economizando a energia usada no balanço eletrolítico (MOECKEL et al., 2002). Como substância osmoticamente ativa, ela pode favorecer a um aumento da proliferação da estrutura intestinal que, por sua vez, pode ter um impacto positivo sobre o estado de saúde animal e digestibilidade dos nutrientes. Dentro de uma perspectiva em que o uso de antibióticos na alimentação será restrito em um futuro relativamente próximo, haverá um interesse crescente no uso de betaína, como um composto bioativo para melhorar a saúde intestinal (EKLUND et al., 2005). Devido à sua estrutura polar, a molécula de betaína protege a célula do estresse hídrico e de perdas de água intracelular. A proteção osmótica permite a manutenção de equilíbrio de água e volume das células intestinais, facilitando a secreção de enzimas digestivas e estimulando a proliferação de células no tecido intestinal. O epitélio da parede intestinal proliferado proporcionaria uma superfície maior para a absorção de nutrientes, com impactos positivos sobre o desempenho animal. Efeitos da betaína como uma substância osmótica ativa podem ser mais pronunciados nos animais expostos a doenças osmóticas, como a Coccidiose em aves. Esta melhoria da estrutura intestinal pode ocorrer em animais infectados e saudáveis e pode afetar positivamente a digestibilidade dos nutrientes (EKLUND et al., 2005). Devido à sua propriedade osmoprotetora, ela protege as células intestinais e mantém a flora intestinal; consequentemente, contrabalança as perdas de desempenho durante o estresse de calor e da Coccidiose. A propriedade osmótica da betaína pode ser essencial para apoiar a função e crescimento intestinal; além disso, ela protege a flora intestinal contra variações 33 osmóticas e melhora a atividade de fermentação microbiana, que, por sua vez, também contribui para aumentar a digestibilidade dos nutrientes (RATRIYANTO et al., 2009). O papel osmorregulatório da betaína já foi evidenciado em peixes sob estresse fisiológico no período de aclimatação, durante e após transferência gradual ou abrupta desses animais da água doce para a água do mar, em uma unidade de piscicultura comercial na Finlândia. Salmões do Atlântico, alimentados com ração comercial seca suplementada com 1,5% de betaína, foram capazes de manter seus íons e balanço hídrico ligeiramente melhores durante e depois da transferência da água doce para a água do mar, com reflexos sobre a taxa de mortalidade, menor no grupo que recebeu a ração acrescida de betaína (JUNNILA, 2000). Atividade lipotrópica da betaína Na nutrição animal, a betaína é amplamente discutida como um "modificador de carcaça” devido à sua ação lipotrópica e de promoção de crescimento (EKLUND et al., 2005). Constituídos como benefícios de sua inclusão em dieta de animais monogástricos, a redução no conteúdo de gordura na carcaça, associado com o aumento na porcentagem de carne magra, são de grande interesse para satisfazer as necessidades do consumidor, na busca de alimentos mais saudáveis, com menor teor de gorduras (RATRIYANTO et al., 2009). Esta substância tem sido usada como um agente de redução da homocisteína. As altas concentrações plasmáticas dessa molécula são consideradas um fator de risco de enfermidades, como a doença cardíaca coronariana e aterosclerose (MARTINS et al., 2010). A betaína estimula a mobilização de lipídios do fígado e influi sobre os níveis de lipoproteínas no sangue, melhorando as funções do órgão, local da homeostase no organismo. Também estimula a síntese de carnitina, melhorando a oxidação de ácidos graxos na mitocôndria, reduzindo o acúmulo de gordura nos tecidos. De fato, ela reduz e/ou redistribui a gordura da carcaça em numerosas espécies animais, com consequente melhora no rendimento de carcaça (EKLUND et al., 2005). No estudo de Huang et al. (2008) com suínos na fase de terminação, a adição de 1250 mg/ kg de betaína na dieta aumentou o ganho de peso em 5,5% e melhorou as características de carcaça. Porém, não afetou o consumo médio diário, nem a conversão alimentar. A proporção de carne magra e a área de olho de lombo foram aumentadas pela suplementação de betaína, enquanto a porcentagem de gordura na carcaça e espessura de toucinho diminuíram 13,1% e 10,3%, respectivamente. A redução da deposição de gordura na carcaça ocorrendo em suínos alimentados com betaína pode resultar de uma diminuição na taxa de 34 lipogênese no tecido adiposo, em consequência de uma redução na atividade e expressão gênica de enzimas lipogênicas. Este foi o primeiro estudo a avaliar o seu efeito na expressão gênica de enzimas lipogênicas em suínos (gene FAS - ácido graxo sintetase). Uma provável explicação para a redução observada na expressão de mRNA do gen FAS pela betaína, incluindo as reduções nas atividades de enzimas lipogênicas, pode estar na elevada concentração circulante de hormônio do crescimento. Numerosos estudos têm estabelecido que uma determinada concentração de hormônio do crescimento pode estimular o crescimento muscular e, simultaneamente, reduzir a deposição de gordura. A diminuição do acúmulo de gordura, devido ao hormônio de crescimento resulta, principalmente, de uma redução na lipogênese e envolve uma diminuição de adipócitos com sensibilidade à insulina. Além disso, a redução da lipogênese é consequência da diminuição na atividade e expressão gênica de enzimas lipogênicas. Em longo prazo, a suplementação de betaína (1g/ kg) induziu à dislipidemia e aumento da concentração de colesterol na gordura subcutânea dorsal de suínos Alantejanos, uma raça de suínos com forte tendência ao acúmulo de gorduras. No entanto, esta suplementação não afetou a deposição de gordura corporal desses animais, assim como o conteúdo de lipídios totais do músculo e do tecido adiposo subcutâneo também não foram alterados (MARTINS et al., 2010). Sales (2011) utilizando técnicas de meta-análise, avaliou os benefícios da inclusão de betaína na ração sobre o crescimento e características de carcaça de suínos na fase de abate, evidenciando o seu efeito sobre a diminuição na gordura da carcaça. Tal efeito também foi observado por Ribeiro et al. (2011) em suínos, na fase de terminação. No mesmo trabalho acima, animais que receberam ração suplementada com betaína (0,1%; 0,2% e 0,3%) tiveram sua espessura de toucinho afetada (p < 0,05), sendo que a adição de 0,3% proporcionou maior espessura de toucinho (ET), enquanto que concentrações de 0,1% e 0,2% apresentaram os melhores resultados. Pode-se inferir, portanto, que há um limite, a partir do qual, a suplementação de betaína deixa de ser eficiente na redução da ET. Portanto, ela pode, simplesmente, promover um aumento na disponibilidade do nutriente da dieta, permitindo, então, uma melhor utilização da energia pelo tecido muscular, diminuindo a formação de tecido adiposo (RIBEIRO et al., 2011). 35 Betaína na produção animal Em um experimento com cabras, utilizaram-se dois grupos de 30 animais, alimentados com uma dieta contendo ou não betaína (4 g/ kg), para estudar o efeito de sua adição na dieta sobre a produção de leite, sua composição química e composição de ácidos graxos no leite. Os tratamentos foram administrados 10 dias antes do parto e durante o período de lactação, nos cinco meses seguintes ao parto. Ao final desse período de lactação, os resultados mostraram um aumento significativo (p < 0,05) da produção de leite (0,28 kg) e de sua porcentagem em gorduras nas cabras alimentadas com dietas suplementadas, em relação ao grupo controle. A adição de betaína aumentou ligeiramente o conteúdo de compostos metílicos livres no leite, tais como creatina, metionina e carnitina, mesmo que não sendo de forma significativa em relação ao controle. O incremento do conteúdo de ácidos graxos de cadeias longas no leite pode ser atribuído a uma melhora da digestibilidade dos lipídios dietéticos favorecida pela betaína. Seus efeitos benéficos observados estão relacionados, principalmente, ao seu papel como um doador de grupos metil e efeito poupador de colina e metionina, que podem ser relacionados diretamente com o metabolismo lipídico (ARANTZAMENDI et al., 2006). Em suínos, avaliou-se o efeito de altos níveis de betaína (10,5 g/ kg ração) como aditivo em dietas sobre a performance de crescimento, qualidade de carcaça, lipídios plasmáticos e qualidade sensorial da carne. Utilizaram-se 36 animais da raça Landrace, dos 53 dias até 156 dias de idade. A suplementação de dietas ricas em gordura com betaína não conseguiu melhorar o desempenho de crescimento, qualidade de carcaça, digestibilidade de nutrientes ou qualidade sensorial da carne suína. O tipo genético dos animais ou o regime de alimentação restrita utilizada no presente experimento pode ter contribuído para a falta de resposta da betaína na qualidade de carcaça. A falta de efeitos sobre a qualidade da carcaça também pode ser explicado pelos altos níveis de doadores metil presentes na dieta basal, devido ao conteúdo de aminoácidos sulfurados ou, ainda, à quantidade elevada de colina aí presente, ultrapassando as exigências na ordem de 1.245 mg/ kg de ração (OVERLAND et al., 1999). Fernandez-Figares et al. (2002), quando utilizaram diferentes inclusões de betaína (0 %; 0,125 %; 0,25 %; e 0,50 %) na alimentação de suínos em fase de crescimento, dos 36 aos 64 kg, não obtiveram diferenças no ganho de peso ou na conversão alimentar entre os grupos tratados e controle. É possível que os seus efeitos positivos sobre o desempenho de crescimento e características de carcaça sejam mais evidentes somente sob certas condições, especialmente durante estresse metabólico ou estresse nutricional. 36 A adição de 0,5% de betaína em dietas de suínos na fase de crescimento com alimentação restrita resultou em uma diminuição em algumas medidas de gordura na carcaça (10%), com um aumento concomitante da taxa de deposição de proteína na carcaça (23%). Estes dados sugerem que ela altera a partição de nutrientes na alimentação restrita de suínos jovens, de tal forma que a deposição de proteína é reforçada, em detrimento aparente da deposição de gordura na carcaça e, desta forma, a betaína pode ser útil como um agente de distribuição de aminoácidos em situações de baixa ingestão de energia (FERNANDEZFIGARES et al., 2002). Evidenciaram-se efeitos benéficos da suplementação de betaína em fêmeas suínas no período de lactação. Dentre elas, aquelas alimentadas com ração que a continha na proporção de 2 kg/ ton., apresentaram uma redução do intervalo desmame-cio, reduzindo os dias não produtivos, e produziram leitões mais pesados ao desmame (PIMENTEL et al., 2009). A betaína pode ter aumentado a produção de leite das porcas suplementadas. A redução dos dias não produtivos e o maior peso ao desmame favorecem a uma maior quantidade de carne produzida por fêmea/ ano. Ramis et al. (2011) não observaram diferenças significativas entre o grupo tratado com 2 kg de betaína por tonelada de ração e o grupo controle, em relação à perda de peso corporal e perda de toucinho em porcas durante a lactação, embora o consumo médio diário de ração tenha sido menor no grupo tratado. A perda de gordura subcutânea durante a lactação, aparentemente, não influenciou o desempenho da parição posterior. A redução do consumo médio diário de ração no parto posterior no grupo com betaína sugere um melhor uso da energia e dos recursos mobilizados durante a lactação, ou, possivelmente, um uso mais eficiente de recursos alimentares nutricionais. Fêmeas arraçoadas com dieta contendo betaína apresentaram um maior numero de leitões nascidos vivos e desmamados no parto subsequente (RAMIS et al., 2011). O estado metabólico da porca durante a lactação influencia a maturação folicular após o desmame e é um determinante crítico da fertilidade subsequente. Uma maior disponibilidade de energia durante a lactação pode melhorar o desenvolvimento folicular, resultando em um maior número de oócitos presentes na ovulação. O número de leitões nascidos correlacionou-se negativamente com a perda de peso da fêmea na lactação anterior. O intervalo desmame-cio foi menor no grupo com betaína, 4,7 dias versus 5,7 dias em animais do grupo controle, uma diferença significativa de 19%. 37 Leitões de porcas alimentadas com betaína apresentaram ganho médio diário (GMD) durante a lactação de 200 g, enquanto no grupo controle o GMD foi de 183,5 g. O peso da leitegada aos 18 dias de idade foi maior nas leitegadas de porcas e marrãs alimentadas com ração tratada. Isto pode sugerir que a produção de leite foi maior no grupo de betaína, já que as análises qualitativas do colostro e do leite não diferiram entre os grupos. No entanto, devese também levar em conta que o conteúdo de betaína no leite foi maior no grupo de porcas tratadas do que nos controles. Leitões do grupo tratado receberam 0,219 g de betaína por kg de leite, em comparação com leitões do grupo controle, que receberam 0,125 g por kg de leite (RAMIS et al., 2011). Em experimentos mais recentes com suínos na fase de terminação, obtiveram-se diferenças significativas para GMD e conversão alimentar (CA) (p < 0,05) entre os tratamentos (0%, 0,1%, 0,2% e 0,3%), sendo que os animais alimentados com 0,2 e 0,3% de betaína apresentaram os melhores desempenhos. Em termos percentuais, para CA, a adição destes valores percentuais, quando comparada com o controle, foi superior 12,5 e 11,0%, respectivamente, e 9,0% para GMD. O benefício da utilização de betaína nas fases de crescimento e terminação tem sido atribuído a uma melhora na relação energia/ingrediente das rações, através da redução na exigência de mantença. Em rações comerciais com ingestão energética subótima, a betaína utilizada como suplemento pode resultar em melhorias na sua eficiência em até 8%. Assim, pode-se reduzir o aporte energético da dieta, representando uma economia considerável, sem afetar o desempenho dos animais (RIBEIRO et al., 2011). Estudos com a adição da betaína no sêmen Na literatura consultada, ainda não foram relatados os efeitos da utilização da betaína na alimentação de reprodutores sobre a produção ou qualidade espermática, apenas sua aplicação em diluente para criopreservação do sêmen de mamíferos domésticos. É bem conhecida que a sobrevivência das células é muito maior após armazenamento do sêmen líquido do que na forma congelada. Com declínios de temperatura, há uma redução inevitável no proporção de espermatozoides que mantêm a integridade da membrana normal e de seus componentes bioquímicos (JOHNSON et al., 2000). A criopreservação de espermatozoides de mamíferos é um processo complexo, que envolve o equilíbrio de muitos fatores, com a finalidade de obter resultados satisfatórios. Para garantir o sucesso nessa técnica é necessário conhecer a fisiologia do espermatozoide, que é 38 essencial para maximizar a recuperação pós-descongelação de espermatozoides e, consequentemente, a fertilidade (PURDY, 2006). O sêmen suíno difere em vários aspectos do produzido por outros animais domésticos, é gerado em grande volume e é extremamente vulnerável a choque pelo frio ou resfriamento brusco, imediatamente após a coleta. O sucesso do congelamento de sêmen suíno depende da compreensão dos fatores e as suas respectivas interações, que influenciam a capacidade dos espermatozoides para sobreviver ao congelamento e descongelamento. Os fatores podem ser classificados em duas categorias: (1) fatores internos ou fixos, tais como as características inerentes aos espermatozoides e as diferenças entre machos e ejaculados; e (2) fatores externos, tais como a composição dos diluentes, tipo e concentração de agentes crioprotetores, as taxas de diluição e de resfriamento, o método de equilíbrio, e de congelamento e descongelamento do sêmen (JOHNSON et al., 2000). Em relação ao meio de diluição, numerosos trabalhos têm sido efetuados com a finalidade de desenvolver um diluente para diferentes machos domésticos. O uso de várias substâncias adicionadas ao diluente como substâncias antioxidantes (JEONG et al., 2009; VALLORANI, et al., 2010), bem como, diferentes meios como o leite desnatado (MEIRELLES et al., 1998; TONIOLLI et al., 2001) e a água de coco (NUNES; SALGUEIRO, 1999: CARDOSO et al., 2002; TONIOLLI et al., 2010), foram utilizados na conservação do sêmen de diversas espécies domésticas, além do homem. A avaliação de crioprotetores alternativos ao glicerol para preservação de espermatozoides tornou-se uma área de extensa investigação nos últimos anos (FAGUNDES et al., 2010). Os mais comuns crioprotetores não penetrantes utilizados são a gema de ovo (CARDOSO et al., 2003) e o leite desnatado sem gordura (KULAKSIZ et al., 2012). Pesquisas recentes também identificaram outros produtos químicos impermeáveis à membrana que podem ser utilizados como agentes crioprotetores, como os aminoácidos (PURDY, 2006). Alguns aminoácidos têm sido empregados na criopreservação de sêmen de várias espécies de mamíferos, tais como a glutamina (MERCADO et al., 2009), histidina (JUNNILA, 2000), metionina (ÇOYAN et al., 2010), betaína (LINDEBERG et al., 1999), prolina (PEÑA et al., 1998), cisteína (EL-SHESHTAWY et al., 2008), alanina e glicina (FAGUNDES et al., 2010). Eles têm sido usados com sucesso na congelação de sêmen equino (JUNNILA, 2000), canino (PEÑA et al., 1998) bovino (EL-SHESHTAWY et al., 2008) e ovino (ÇOYAN et al., 2010). Os aminoácidos são moléculas carregadas, é possível que eles 39 interajam eletrostaticamente com os grupos fosfato dos fosfolipídios da membrana plasmática do espermatozoide, formando assim uma camada sobre superfície da célula, protegendo-a contra choques térmicos (EL-SHESHTAWY et al., 2008). Isto pode contribuir para sua capacidade de manter a integridade de membrana acrossomal dos espermatozoides, durante o processo de criopreservação (FAGUNDES, 2008). Estudos sugerem que combinações desses crioprotetores pode ser benéfica para a criopreservação de sêmen de várias espécies (FAGUNDES et al., 2010). A capacidade dos aminoácidos em melhorar a criosobrevivência dos espermatozoides tem sido relacionada com suas propriedades metabólicas e crioprotetoras, oxidantes ou osmorregulativas (MARTINS-BESSA et al., 2007). Uma vez que os aminoácidos não podem penetrar a membrana do espermatozoide, então, mecanismos osmóticos podem explicar, em parte, a sua ação (TRIMECHE et al., 1999). Apesar de ter sido verificado o efeito crioprotetor sobre espermatozoides em diversas espécies, os mecanismos de crioproteção espermática conferidos pelos aminoácidos, assim como a função de aminoácidos livres na fisiologia do espermatozoide, ainda não foram esclarecidos (FAGUNDES et al., 2010). A betaína quando adicionada ao sêmen fresco de touros (100 e 200 mM), melhorou significativamente o percentual de espermatozoides móveis a 20°, 5° e a 0°C. Além disso, melhorou a motilidade espermática do sêmen de touros ditos como “congeladores pobres”, ou seja, os que apresentam motilidade abaixo de 20% após resfriamento (ZHANG et al., 2001). No sêmen canino, estudaram-se os efeitos da adição de diferentes concentrações de prolina e betaína combinadas no diluente de congelação (0; 10; 20; e 40 mMol/ L), num total de 16 tratamentos. A adição de betaína, em comparação com a amostra controle, não melhorou a motilidade ou integridade da membrana plasmática, embora seu efeito não tenha sido negativo. Não há referências sobre efeitos da adição da betaína no plasma seminal canino. Acredita-se que a betaína possa agir sobre os espermatozoides da mesma forma que a carnitina (com um grau variável de atividade), aumentando a utilização de lipídios e aumentando, assim, a síntese de adenosina trifosfato (ATP). Mas, se o processo de congelação/descongelação afeta o metabolismo mitocondrial do sêmen canino, a betaína talvez não seja capaz de aumentar a utilização de lipídios para produção de energia ou melhorar a motilidade espermática em espermatozoides caninos descongelados a 39 °C, já que o sistema metabólico poderia ter sido danificado. Se isto estiver correto, então a adição de betaína ao diluente não implicará numa vida mais longa para os espermatozoides (PEÑA et al., 1998). 40 Da mesma forma, Lindeberg et al. (1999), obtiveram maiores valores de motilidade espermática e motilidade progressiva na concentração de 0,25 %, não havendo diferenças significativas entre as concentrações menores que 4% para o sêmen equino. Quando foram adicionados 4 e 5% do aminoácido, a motilidade espermática foi reduzida, verificando-se um possível efeito deletério da betaína. Essa possível toxicidade é provocada pela alta concentração do aminoácido e seu efeito osmótico (TRIMECHE et al., 1999). Junnila (2000) avaliou a adição do aminoácido betaína ao diluente de sêmen de garanhão sobre a motilidade espermática pós congelação, e obteve que concentrações acima de 1,5% melhoraram a motilidade espermática pós-descongelação. A adição de 2,5% ao diluente usado na congelação de espermatozoides de garanhão aumentou significativamente a motilidade progressiva pós-descongelação dos espermatozoides, mantendo 95% da motilidade original. Uma explicação para o efeito positivo da betaína seria seu possível papel como um osmólito intracelular no esperma de garanhão, um papel semelhante ao exibido por ela em outras células. Também é possível que a betaína, neste contexto, impeça a desnaturação das proteínas estruturais e enzimas, causada pela desidratação progressiva das células e evite os efeitos osmóticos dos solutos no fluido intracelular de espermatozoides. Considerações finais A betaína, alvo de vários estudos em diferentes espécies animais, apresenta efeitos benéficos comprovados no tocante ao desempenho produtivo de suínos e aves, à qualidade da carcaça de suínos e à congelação de sêmen de garanhão. A sua principal aplicação parece estar relacionada à substituição parcial da metionina da dieta, gerando vantagens econômicas para o produtor sem que haja o comprometimento do desempenho animal; resta conhecer seus efeitos sobre a produção e qualidade espermática de reprodutores suplementados com o produto em questão. Referências Bibliográficas ARANTZAMENDI, L.; DURÁN, R; BLANCH, A. Producción lechera y rendimiento productivo en pequeños ruminantes: Betaína, mecanismos de acción. Revista Albeitar, Zaragoza, v. 97, p.54-55, 2006. ATTIA, Y. A.; HASSAN, R.A.; SHEHATTA, M.H.; ABD EL-HADY, S. B. Growth, Carcass Quality and Serum Constituents of Slow Growing Chicks as Affected by Betaine Addition to Diets Containing 2. 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CAPÍTULO II Uso de diferentes diluentes e temperatura alternativa na conservação do sêmen do varrão Use of alternative Diluents and Temperatures in long term storage of boar semen Araújo, Lina Raquel Santos; Barros, Tatyane Bandeira; Guimarães, Daianny Barboza; Cantanhêde, Ludymila Furtado; Dias, Aline Viana; Toniolli, Ricardo Periódico: Ciência Animal Brasileira Submetido em: 09 junho de 2012. 45 7. CAPITULO II USO DE DILUENTES E TEMPERATURAS ALTERNATIVAS NA CONSERVAÇÃO PROLONGADA DO SÊMEN DO VARRÃO Araújo, Lina Raquel Santos1; Barros, Tatyane Bandeira1; Guimarães, Daianny Barboza1; Cantanhêde, Ludymila Furtado 1; Dias, Aline Viana1; Toniolli, Ricardo 2 1 Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias; 2Laboratório de Reprodução Suína e Tecnologia de Sêmen, Universidade Estadual do Ceará (UECE). CORRESPONDENCIA: Toniolli, R. [[email protected]] FONE:(85) 3101.9838 Av. Paranjana, 1700 – Campus Itaperi, Fortaleza-Ce, CEP: 60.740-000. Trabalho faz parte de Dissertação de Mestrado. RESUMO O uso de diluentes adequados é um dos principais pontos a serem considerados para o sucesso de um programa de inseminação artificial. O objetivo deste experimento foi avaliar a eficiência de diluentes alternativos para sêmen suíno, conservado em diferentes temperaturas. Foram utilizados os diluentes: Beltsville Thawing Solution (BTS); Água de coco em pó (ACP-103®) e Leite em pó desnatado (LPD), submetidos a 17 e 10 °C. Os 50 ejaculados foram analisado in natura e após diluição (D0 a D4) através do vigor e motilidade espermática. Avaliou-se a integridade do acrossoma e a vitalidade no D0 e D4. Foram utilizados os testes de Mann-Whitney e o qui-quadrado (p < 0,05). O diluente LPD a 10°C apresentou motilidade e vigor espermático superiores em relação ao BTS e ACP (10 °C) até D2, e aos tratamentos conservados a 17 °C (p < 0,05). A taxa de vitalidade e de integridade acrossomal, no D0 e D4 foi maior para os tratamentos com LPD a 10 °C (p < 0,001). O LPD mostrou ser um bom meio diluente para o sêmen suíno em temperatura mais baixa (10 °C), conferindo uma maior proteção à célula espermática, através de maiores taxas de vitalidade e integridade de acrossoma. Palavras-chave: leite desnatado, água de coco, conservação, sêmen, varrão. USE OF ALTERNATIVE EXTENDER AND TEMPERATURES IN LONG TERM STORAGE OF BOAR SEMEN ABSTRACT The use of appropriate diluents is one of the main points to consider for the success of an artificial insemination program. The objective of this study was to evaluate the efficiency of alternative diluents for swine semen, kept at different temperatures. Diluents used were: Beltsville Thawing Solution (BTS), powdered coconut water (CWP-103®) and skimmed milk powder (SMP), subjected to temperatures of 17 and 10 °C. The 50 ejaculated was analyzed in natura and after dilution (D0 a D4), through the spermatic vigor and motility. Semen smears were made in the D0 and D4, considered the acrosome integrity and vitality. Data was analyzed using the Mann-Whitney and chi-square tests (p<0.05). The SMP diluents at 10°C presented higher motility and sperm vigor compared to the BTS and CWP until D2, and to treatments stored at 17 °C. The rate of vitality and integrity of the acrosome, the D0 and D4, the SMP 10 °C remained higher (p<0.001). The SMP showed to be a good diluent for the swine semen at lower temperature (10 °C). Furthermore, it gave a better protection to sperm cells, by providing greater integrity and vitality of the acrosome. Keywords: skim milk, coconut water, conservation, semen boar. 46 INTRODUÇÃO O processamento do sêmen utilizando diluentes adequados é um dos pontos importantes para o sucesso de um programa de inseminação (CORRÊA et al., 2001). Sua utilização no preparo das doses de sêmen tem como finalidade aumentar o volume, proteger a célula contra o choque térmico, fornecer substratos necessários ao metabolismo espermático, estabilizar o pH, inibir o crescimento bacteriano e manter o espermatozoide viável até o momento de ser introduzido no genital da fêmea (CORRÊA et al., 2001; BORTOLOZZO, et al., 2005). O sêmen suíno é o mais sensível às flutuações de temperatura (CORRÊA et al., 2001) e uma queda abaixo dos 15 °C pode causar choque térmico, com lesões irreversíveis na estrutura das células e perda de sua motilidade (SCHEID, 2003), da permeabilidade seletiva e da integridade da membrana plasmática do espermatozoide, o que pode levar à sua morte (WATSON, 1996). A viabilidade do sêmen suíno mantém-se satisfatória durante 72 horas, à temperatura de 16 °C, em diferentes diluentes até então utilizados (FIGUERÔA et al., 2001), sendo esse período insuficiente para um bom aproveitamento dos reprodutores. A procura por novos diluentes levou pesquisadores a estudarem a água de coco em pó (NUNES; SALGUEIRO, 1999; TONIOLLI et al., 2001; CARDOSO et al., 2002) e o leite desnatado (MEIRELES et al., 1998; TONIOLLI et al., 2010) como alternativas viáveis na substituição dos tradicionais diluentes. Deste modo, um diluente que permita um maior período de conservação do ejaculado, é importante para o sucesso dos resultados da inseminação artificial (PEREZ-GARCIA, 1958; TONIOLLI et al., 1998). Assim, se faz necessário o desenvolvimento de técnicas e soluções que permitam a utilização do sêmen resfriado, sem queda dos resultados de fertilidade em particular na espécie suína (TONIOLLI et al., 1998; TONIOLLI et al., 2001). O objetivo deste experimento foi avaliar a eficiência de diluentes alternativos para sêmen suíno, conservado em diferentes temperaturas. MATERIAL E MÉTODOS 01. Animais, coleta e análise do sêmen in natura O sêmen de cinco reprodutores foi coletado durante 10 semanas (n = 50), por meio da técnica da mão enluvada em recipiente coberto por filtro e protegido por copo térmico. Foi utilizado o ejaculado total após a separação da parte gelatinosa. Foram utilizados animais com 47 idades variáveis entre 12 e 24 meses, provenientes do Laboratório de Reprodução Suína e Tecnologia do Sêmen – da FAVET/UECE. A qualidade do ejaculado foi avaliada pela concentração (x106 sptz/mL), volume (mL), total de espermatozoides (x10 9 sptz), vigor espermático (0 a 5) e total células móveis (%). Só foram aproveitados os ejaculados que apresentassem valores de ≥3,0 para o vigor e ≥80% de espermatozoides móveis. 02. Diluíção do sêmen e tratamentos experimentais Foi separado de cada ejaculado um total de 2,63 x109sptz, repartido equitativamente entre os seis tratamentos (35 x106 sptz/mL), com um volume final por tratamento de 12,5 mL (sêmen+diluente), envazados em cinco tubos de ensaio/tratamento (2,5 mL = 87,5 x106 sptz/tubo). O dia da coleta foi considerado dia zero (D0) e o sêmen foi conservado até quatro dias após (D4), com análises diárias em D0, D1, D2, D3 e D4. Foram testados três tratamentos: 01. O Beltsville Thawing Solution (BTS – controle); 02. O diluente água de coco em pó (ACP-103®), oriundo da desidratação da água de coco in natura, pela técnica do spray dry (SALGUEIRO et al., 2002). O diluente era reconstituído com água destilada nas seguintes proporções: 24g de ACP + 100 mL de água destilada + sulfato de gentamicina a 80 mg/ 100 mL; 03. O leite em pó desnatado (LPD), diluído em água destilada nas seguintes proporções: 10 g de LPD + 0,194 g de glicose + 100 mL de água destilada + sulfato de gentamicina a 80 mg/ 100 mL. Cada 100 g de LPD era composto por: carboidratos (56 g); proteínas (20,8 g); fibra solúvel (9,6 g); sódio (300 mg); cálcio (2 g); ferro (17,2 mg); vitaminas A (564 µg), D (6 µg), E (18,8 mg) e C (92 mg) e ácido fólico (480 µg). Esses três diluentes foram submetidos a duas temperaturas de conservação, 17 e 10 °C, totalizando os seis tratamentos. As amostras conservadas a 10 °C permaneceram inicialmente estocadas a 17 °C, por 1 hora antes de serem transferidas para a temperatura de conservação (10 °C). A cada dia de análise, foram retirados os tubos equivalentes a cada ejaculado/tratamento, incubados a 39 °C por 10 minutos. 03. Análises do sêmen diluído durante a conservação Para a avaliação da qualidade espermática, foi analisado o vigor espermático (0 a 5) (TONIOLLI, 1996) e a porcentagem de células móveis (%), colocando-se uma gota de sêmen de 15μL entre lâmina e lamínula, com leitura em microscopia óptica a um aumento de 200 vezes. O sêmen diluído e conservado em ambas as temperaturas foi reaquecido a 39 °C, com leituras feitas após 10 minutos de incubação. 48 Visando as análises morfológicas e de vitalidade (% de espermatozoides vivos), esfregaços de sêmen foram feitos no D0 (após 6 horas de conservação) (Exame 1) e no D4 (Exame 2). Em ambos os momentos, o sêmen era incubado a 39 °C, durante 10 minutos antes das análises, onde eram consideradas a integridade do acrossoma e a vitalidade (% de células vivas). Foram contadas 200 células por esfregaço corado, em microscopia óptica com lente de imersão (aumento de 1000x). A solução corante utilizada foi formada por: azul de bromofenol = 0,1g; citrato de sódio = 0,4g; água destilada = 10 mL. Juntou-se uma gota de sêmen com outra de corante sendo homogeneizada em seguida. Após 30 segundos, procedeu-se ao esfregaço, sendo secado à temperatura ambiente. Para análises, os espermatozoides foram classificados em quatro categorias: 1) Vivos com acrossoma intacto; 2) Vivos com acrossoma danificado; 3) Mortos com acrossoma intacto; 4) Mortos com acrossoma danificado. 04. Análise estatística O delineamento experimental utilizado foi o de Blocos ao Acaso, usando-se análise de variância e aplicando-se os testes Mann Whitney, para a comparação entre grupos, e QuiQuadrado, corrigido para os resultados expressos em porcentagem, usando-se o Programa StatView (versão 5.0.1; SAS Institute Inc. 1992-1998) com nível de significância de 5% (p < 0,05). RESULTADOS E DISCUSSÃO O sêmen in natura dos 50 ejaculados analisados no experimento apresentou aspecto normal, coloração branca leitosa, volume médio de 255 mL e concentração média de 393,4 x106 sptz/mL. Tais características estão dentro da normalidade para a espécie suína (CORRÊA et al., 2001; SMITAL, 2009). A análise da motilidade espermática, apresentou uma porcentagem média de 91 ± 6,2 e um vigor espermático de 4,0 ± 0,4. Estes valores se mantiveram acima dos parâmetros mínimos estipulados pela metodologia para utilização do ejaculado. Das amostras conservadas a 17 °C, o LPD (3,2 ± 1,0) apresentou valores de vigor espermático significativamente maiores em relação aos diluentes BTS (2,3 ± 1,0) e ACP (2,3 ± 0,9) no D0 e apenas ao BTS no D1 (p < 0,05). Por outro lado, nos demais dias de conservação, o BTS apresentou melhores valores para essa característica em relação ao LPD e ACP, os quais apresentaram resultados ruins e similares aproximando-se de zero a partir do terceiro dia conservação (D2) (Tabela 1). 49 Neste estudo, a baixa performance do diluente água de coco a 17 °C a partir do D2, divergiu dos resultados obtidos por Toniolli et al. (2010), que encontraram valores para o vigor espermático superiores aos do BTS até o quarto dia de conservação (D3), entretanto sem diferenças significativas entre esses diluentes em D0. Embora já se tenha na literatura excelentes resultados com a utilização de água de coco na preservação sêmen de diversos animais domésticos (NUNES; SALGUEIRO, 1999; UCHOA et al., 2002; MEDEIROS, 2008; RONDON et al., 2008; TONIOLLI et al., 2010), neste estudo em particular, este diluente repetiu seu desempenho, não se destacando quanto à manutenção do vigor espermático por mais de 24 horas. Tabela 1. Vigor espermático do sêmen suíno conservado durante cinco dias em diferentes temperaturas (17 e 10 °C) nos diluentes BTS, ACP-103® e LPD. Dias de conservação Tratamentos 17 °C 10 °C D0 D1 D2 D3 D4 BTS 2,3 ± 1,0a 1,5 ± 1,0a 1,5 ± 1,0ab 1,3 ± 1,0ab 0,9 ± 0,9a ACP 2,3 ± 0,9a 2,0 ± 1,0b 0,6 ± 0,9d 0,2 ± 0,6c 0,1 ± 0,5b LPD 3,2 ± 1,0b 1,9 ± 1,1b 0,1 ± 0,5c 0,0 ± 0,1c 0,0 ± 0,1b BTS 2,2 ± 0,9a 1,4 ± 1,1a 1,0 ± 1,0b 1,0 ± 1,0a 0,8 ± 1,0a ACP 2,2 ± 1,0a 1,7 ± 1,2ab 1,6 ± 1,0a 1,2 ± 1,0ab 0,9 ± 0,9a LPD 3,1 ± 1,1b 2,6 ± 1,1c 2,3 ± 1,0e 1,6 ± 1,1b 1,1 ± 1,1a Letras diferentes na mesma coluna indicam diferenças estatisticamente significativas (p < 0,05). Quando o sêmen diluído nos diferentes diluentes testados foi conservado a 10 °C, o LPD apresentou os maiores valores médios para vigor espermático (p < 0,01) até o terceiro dia de conservação (D2), em relação aos outros diluentes, indicando uma melhor capacidade de manutenção dessa característica em temperatura mais baixa, que normalmente provoca choque térmico (WATSON, 1996) e tem uma ação deletéria sobre o vigor espermático. Em D3 o LPD igualou-se ao ACP e em D4 não houve diferenças estatísticas entre os três diluentes testados (p > 0,05). Em diferentes trabalhos, a utilização do diluente LPD tem apresentado como resultados, em períodos de conservação a temperaturas mais baixas, valores de vigor espermático superiores (MEIRELES et al., 1998), com uma melhor manutenção desta característica por um período de tempo mais prolongado (FREITAS et al., 2011), quando 50 comparado ao BTS ou ACP. Desta forma, este diluente alternativo para o sêmen suíno, apresenta-se como uma excelente opção de meio conservador, fornecendo uma melhor condição de sobrevivência para os espermatozoides em temperaturas mais baixas (NUNES et al., 2011) dispensando dessa forma o uso de conservadoras de sêmen que são mais onerosas. Não foram verificadas diferenças entre os resultados obtidos com o diluente BTS nas duas temperaturas de conservação (10 e 17 °C) quanto ao vigor espermático. Para o ACP, uma mesma tendência foi observada apenas até o segundo dia de conservação. A partir de D2, os resultados a 10 oC foram significativamente melhores (p < 0,05) até o final do período de conservação do sêmen. O LPD foi o diluente, aparentemente, melhor adaptado à temperatura de conservação mais baixa (10 oC). Apenas em D0 os resultados de vigor espermático se equivaleram aos encontrados a 17 °C (p > 0,05). A partir do D1 os resultados médios a 10 oC foram sempre melhores do que os encontrados a 17 oC (p < 0,05), que a partir do terceiro dia de conservação (D2) apresentaram uma queda brusca, zerando seus valores já em D3. O espermatozoide suíno é uma das células mais sensíveis às flutuações de temperatura quando comparado aos de outras espécies (CORRÊA et al., 2001). A temperatura ideal para a manutenção das doses inseminantes situa-se entre 15 e 18 °C, sendo que quedas de temperatura abaixo de 15 °C normalmente é causa de choque térmico, resultando em lesões na estrutura celular (WATSON, 1996). Porém, neste estudo, não se verificou uma queda dos valores do parâmetro vigor espermático devido ao choque térmico, nas amostras incubadas a baixa temperatura, o que permitiu uma melhor conservação no meio a base de LPD (FREITAS et al., 2011). À temperatura de 17 °C, o LPD não se caracterizou como um bom diluente para o sêmen suíno devido a não apresentar uma melhor conservação das caracteristicas organolépticas do diluente, resultando na deterioração de seus componentes, fato esse que pode ocorre durante um armazenamento prolongado (KASIMANICKAM et al., 2011), na presença de contaminação bacteriana, bem como em temperaturas mais altas. Tais possíveis alterações contribuiram para coagular o leite, fato esse que ocorreu com frequência a partir do D2, dificultando a realização das análises e a qualidade de conservação das células. Para a característica porcentagem de espermatozoides móveis, nas amostras conservadas a 17 °C, o LPD apresentou resultado melhor (p < 0,05) no primeiro dia de conservação (D0 - 72,9%) em relação aos diluentes BTS e ACP (58,2 e 54,2%, respectivamente). Esta diferença não pode ser vista já em D2, e nos outros dias até o final do período de conservação o LPD apresentou os piores resultados. Nesta temperatura, o BTS manteve uma maior porcentagem de células moveis de D2 até o último dia de conservação 51 (D4), resultados esses melhores (p < 0,05) em relação aos outros dois diluentes testados (Tabela 2). Os resultados de motilidade espermática divergem de estudos anteriores utilizando-se a água de coco como diluente de sêmen em relação ao BTS, nos quais se evidenciou seus efeitos benéficos in vitro sobre a característica de motilidade espermática (TONIOLLI et al., 1998; TONIOLLI et al., 2001), inclusive mantendo maiores valores para esta característica durante todo o período de conservação (TONIOLLI et al., 2010). Igualmente ao que ocorreu com o vigor espermático, em geral, o percentual de células móveis foi melhor quando mantido pelo diluente BTS a 17 °C durante todo o período de análise, justificando o fato de ser o diluente mais utilizado nos programas de inseminação artificial, também pela facilidade de fabricação e baixo preço de comercialização (LEVIS, 2000). Os fatores que resultaram em uma queda acentuada nos percentuais de células móveis nas amostras conservadas em meio à base de LPD podem ter sido os mesmos já discutidos para o vigor espermático. Tabela 2. Total de espermatozoides móveis (%) do sêmen suíno conservado durante cinco dias em diferentes temperaturas (17 e 10 °C) nos diluentes BTS, ACP-103® e LPD. Tratamentos 17 °C 10 °C Dias de conservação D0 D1 D2 D3 D4 BTS 58,2 ± 27b 36,0 ± 28ab 32,1 ± 26a 26,5 ± 24ac 17,7 ± 21a ACP 54,2 ± 24ab 44,4 ± 25a 12,8 ± 22b 3,9 ± 13b 1,8 ± 8,8b LPD 72,9 ± 28c 43,6 ± 28a 2,7 ± 10c 0,1 ± 0,7b 0,1 ± 0,8b BTS 46,9 ± 25a 27,4 ± 24b 20,1 ± 23b 20,1 ± 23a 13,4 ± 18a ACP 50,8 ± 26ab 36,1 ± 28ab 31,4 ± 24a 27,3 ± 24ac 14,6 ± 19a LPD 73,8 ± 26c 60,5 ± 27c 50,2 ± 26d 35,5 ± 26c 20,5 ± 23a Letras diferentes na mesma coluna indicam diferenças estatisticamente significativas (p < 0,05). Neste estudo também não foram evidenciados os efeitos benéficos da utilização da água de coco como diluente, em relação ao leite em pó desnatado; a motilidade das amostras conservadas a 17 °C em ACP caiu abaixo de 60% no dia da coleta (D0), valor inferior ao obtido com o LPD (72,9%), mostrando resultado médio melhor apenas em D2 (12,8%), porém apresentando valor muito baixo de motilidade (Tabela 2). Os resultados deste trabalho discordam de estudos com sêmen caprino e ovino, onde uma melhor performance foi obtida em água de coco como diluente, quando comparado ao leite em pó desnatado. A motilidade 52 espermática em água de coco manteve-se elevada por até 48 horas no sêmen caprino e 24 horas no sêmen ovino (NUNES; SALGUEIRO, 1999). Essas diferenças podem indicar um comportamento individual do ejaculado, ligado à espécie animal, quando do sêmen diluído em ACP. Possivelmente, a maior sensibilidade do espermatozoide suíno, pode ter contribuído para essas diferenças de resultados de conservação entre as diferentes espécies em questão. O baixo desempenho da água de coco como diluente na conservação da motilidade espermática também já foi evidenciada em trabalhos mais recentes, inclusive apresentando resultados inferiores ao do presente estudo já no primeiro dia de análise (BARROS, 2010), não podendo ser indicado como diluente para o sêmen suíno, tendo em vista sua incapacidade na manutenção desta característica. Nos diluentes conservados a 10 °C (Tabela 2), os resultados de porcentagem de espermatozoides móveis foram melhores quando se utilizou o LPD como meio de diluição do sêmen, com diferenças significativas (p < 0,01) durante praticamente todo o período de conservação (D0 a D3), em relação aos demais tratamentos. Apenas no último dia de conservação (D4) os resultados entre os três diluentes não apresentaram diferenças significativas (p > 0,05). O BTS e o ACP apresentaram resultados semelhantes durante todo o período de conservação, exceto em D2, quando o ACP foi melhor (31,4%). Pelos resultados obtidos para essa característica, conservando o sêmen à uma temperatura mais baixa (10 o C), o diluente leite desnatado demonstrou ser, em sua constituição, o melhor adaptado para a conservação da célula espermática do varrão, durante todo o período de conservação (FREITAS et al., 2011). Quanto aos diluentes ACP e BTS, estes mantiveram a motilidade durante todo o período de conservação, entretanto em níveis mais baixos que os preconizados para a prática de inseminação artificial, discordando de achados que indicam a conservação do sêmen suíno no diluente BTS a 12 °C por até cinco dias (KATZER, et al., 2004). O presente estudo corrobora com achados recentes, onde o LPD manteve superioridade quanto ao percentual de células móveis em relação aos diluentes ACP e BTS acondicionados a 12 °C (NUNES et al., 2011). Em uma análise geral, comparando-se todos diluentes (BTS, ACP e LPD) nas duas diferentes temperaturas de conservação (10 e 17 oC) (Tabela 2), o LPD demonstrou ser um excelente meio de diluição/conservação para o sêmen suíno. Em relação aos outros tratamentos seus resultados foram significativamente melhores (p < 0,05) até o terceiro dia de conservação. Nos últimos dois dias, apesar de equivalência com alguns outros resultados (p > 0,05), ainda assim os valores médios apresentados pelos resultados das análises da 53 porcentagem de espermatozoides móveis foram superiores aos outros tratamentos nas duas temperaturas de conservação do sêmen. Com os resultados obtidos nesse trabalho, com o uso do LPD, particularmente a 10 oC, abriu-se uma nova perspectiva para a conservação do sêmen do varrão, sem a necessidade de utilização de conservadoras de sêmen, que apresentam custo significativamente maior em relação a uma geladeira comum. O sêmen suíno diluído costuma sofrer quedas acentuadas de motilidade dentro das primeiras 12 horas de armazenamento em diferentes temperaturas (tanto a 10 quanto a 17 °C), sendo mais pronunciada a 10 °C. Uma contínua diminuição da motilidade, sugere que os espermatozoides do varrão são incapazes de se adaptar à temperaturas abaixo de 12 °C, devido provavelmente a danos na membrana plamática (ALTHOUSE et al., 1998). Entretanto, esta tendência pode ser revertida dependendo do diluente utilizado, e no caso do uso do LPD, os resultados obtidos, particularmente à temperatura de 10 oC, comprovaram que a utilização de um meio melhor adaptado às necessidades do espermatozoide suíno, pode manter em patamares superiores os valores de sua motilidade durante todo o período de conservação do sêmen (FREITAS et al., 2011). Os efeitos negativos da estocagem a baixas temperaturas não foram tão evidente neste trabalho, inclusive houve uma melhor manutenção do percentual de células móveis quando do uso dos diluentes ACP e LPD conservados a 10 °C. Com o uso do BTS, os resultados foram semelhantes em ambas as temperaturas de conservação, exceto no D0, devido a adaptação das células à temperatura (ALTHOUSE et al., 1998). Após três dias de conservação (D2), os resultados apresentados corroboram com trabalhos anteriores, onde não foram também evidenciados efeitos deletérios da temperatura de conservação (17 ou 12 °C) sobre a motilidade espermática, com ou sem incubação prévia a 17 °C para as amostras acondicionadas a 12 °C (KATZER, et al., 2004), protocolo também adotado neste experimento, apesar de um período de adaptação mais reduzido. O leite desnatado, utilizado neste experimento como diluente para o sêmen do varrão, foi de fácil manipulação, uso prático e efetivo na proteção do espermatozoide durante o período de conservação. Esse diluente alternativo já foi usado por outros autores preservando de forma melhor a motilidade espermática em comparação a outros produtos, tanto na forma líquida, quanto em ejaculados pós-descongelação (KULAKSIZ et al., 2012). Ele é um fluído biológico de composição complexa, contendo componentes tanto com ação benéfica quanto maléfica para o gameta (BARTELLIER et al., 1998), podendo ser utilizado com qualidade em diferentes processos biotecnológicos. 54 Os melhores resultados de vigor espermático (D0 e D1) e de porcentagem de células móveis (D0) obtidos nesse trabalho com o uso do LDP em relação ao BTS a 17 °C, puderam ser vistos também nos resultados de outro trabalho de pesquisa (TONIOLLI et al., 2001), no qual esta superioridade do LPD também foi estatisticamente significativa (p < 0,05) nos mesmos dias de conservação. Desta forma, aparentemente, esta é uma característica que deverá se repetir em diferentes protocolos experimentais a esta temperatura, podendo indicar a possibilidade de utilização deste diluente alternativo de forma rotineira em programas de inseminação artificial, ao menos aqueles onde não se exige do sêmen períodos de conservação prolongados. Para estas duas características, os resultados com o LPD a 17 °C apresentaram uma queda bastante acentuada de seus valores a partir do D2, terminando o período de conservação do sêmen com valores iguais a zero, apesar de ainda se manter em um bom patamar de motilidade no D2. Desta forma, ele demonstrou certa dificuldade de conservação do sêmen em períodos superiores a 48 horas, para as características analisadas, equivalendo-se a outros diluentes alternativos similares (gema de ovo e à base de soja) no tocante a sua capacidade de preservação do sêmen nos primeiros dias de armazenamento. No caso do LPD, ele não é capaz de preservar o sêmen por um período prolongado de tempo, devido a um processo de deterioração de seus componentes (KASIMANICKAM et al., 2011), particularmente em temperaturas mais altas (17 oC). Apesar dos resultados de vigor e motilidade, obtidos em uma conservação mais prolongada, o leite desnatado apresentou-se como uma excelente opção de meio conservador para os espermatozoides, particularmente quando conservados a temperaturas mais baixas (≤10 ºC). Entretanto, em temperaturas mais altas (15 ºC), o LPD apresentaria efeitos deletérios à célula espermática, devido à presença de componentes moleculares tóxicos (GARCIA; GRAHAM, 1987; MEIRELES et al., 1998), o que explicaria a queda acentuada nos valores de vigor e motilidade espermática após as primeiras 48 h de conservação a 17 °C e a sua performance superior a 10 °C. De qualquer forma, trabalhos adicionais são necessários a fim de se estabelecer de forma mais precisa o limite de temperatura que favoreça o desencadeamento dos mecanismos envolvidos na produção desses componentes moleculares tóxicos. A taxa de vitalidade espermática em D0 foi significativamente maior para os tratamentos com LPD, comparada ao obtido com BTS e ACP (p < 0,001), tanto a 10 como a 17 °C. Curiosamente, a diferença de temperatura não afetou o percentual de espermatozoides 55 vivos em cada um dos diluentes testados particularmente em D0 (Tabela 3). No final do período de conservação (D4) a 17 °C, o BTS (18,1%) apresentou uma maior taxa espermatozoides vivos quando comparado aos demais diluentes. A forte queda do número de células vivas no LPD (8,6%) pode ser explicada pelo mesmo mecanismo que afetou as características vigor e motilidade espermática (GARCIA; GRAHAM, 1987; MEIRELES et al., 1998). Por outro lado, a 10 °C o LPD apresentou uma maior taxa de vitalidade (p < 0,001), em relação aos outros diluentes, equivalendo-se apenas ao BTS no D4 (p > 0,05), apesar de um valor médio melhor (32,9 e 19,7%, respectivamente Tabela 3). A queda natural na porcentagem de células vivas é explicada pelas alterações de pH e osmolaridade do meio, já que com o decorrer do tempo, há o consumo do substrato energético e a produção de metabólitos (FONTENELE et al., 2002). Esta queda foi menos acentuada quando utilizado o diluente LPD (59,29%) em relação ao BTS (61,75%) e ao ACP (69,71%), proporcionando um maior número de espermatozoides vivos ao final do período de conservação do sêmen e demonstrando ser esse diluente, à temperatura de 10 °C, melhor adaptado às necessidades de sobrevivência do espermatozoide suíno. Tabela 3. Total de espermatozoides vivos (%) do sêmen suíno, conservado durante cinco dias em diferentes temperaturas (17 e 10 °C) nos diluentes BTS, ACP-103® e LPD. Temperaturas 17 oC 10 oC Diluentes Dias de conservação D0 D4 BTS 61,3 ± 17,9a 18,1 ± 20,5a ACP 56,2 ± 16,6a 9,6 ± 13,4bc LPD 81,2 ± 16,0b 8,6 ± 13,4c BTS 51,5 ± 17,6a 19,7 ± 21,9ad ACP 51,5 ± 17,0a 15,6 ± 15,6ab LPD 80,8 ± 19,6b 32,9 ± 27,8d D0 e D4 - letras diferentes na mesma coluna indicam diferenças estatisticamente significativas (p < 0,001). Conforme apresentado na tabela 4, o LPD manteve uma maior percentagem de células com acrossoma intacto em ambas as temperaturas (10 e 17 °C) no D0 , quando comparado aos demais diluentes (p < 0,001). No último dia de análise essa superioridade foi vista apenas na temperatura de 10 °C, com significância de 0,01%, demonstrando mais uma vez a boa ação deste diluente para o sêmen suíno a temperaturas mais baixas. 56 Comparando-se os outros dois diluentes (BTS e ACP), não foram observadas diferenças significativas (p > 0,05) quanto ao percentual de células com acrossoma intacto, nas duas diferentes temperaturas de conservação, discordando do observado por Toniolli et al. (2010), que verificaram uma maior proteção aos espermatozoides em D4 conferida pelo diluente ACP em relação ao BTS, que se traduziu por um maior número de células vivas com acrossoma íntegro. Embora este estudo não tenha evidenciado da mesma forma esta qualidade da ACP, tal fato não o descredencia como diluente para o sêmen suíno no tocante a integridade de membrana, particularmente em temperaturas mais baixas. Tabela 4. Total de células com acrossoma intacto (%) do sêmen suíno, conservado durante cinco dias em diferentes temperaturas (17 e 10 °C) nos diluentes BTS, ACP-103® e LPD. Temperaturas 17 oC 10 oC Diluentes Dias de conservação D0 D4 BTS 87,2 ± 9,2a 80,8 ± 9,7a ACP 84,6 ± 7,2a 81,1 ± 12,0a LPD 96,3 ± 3,6b 80,8 ± 9,3a BTS 82,3 ± 10,5a 74,1 ± 15,4a ACP 86,3 ± 8,0a 80,9 ± 10,7a LPD 95,7 ± 6,1b 90,3 ± 10,1b D0 e D4- letras diferentes na mesma coluna indicam diferenças significativas (p < 0,001) A temperatura de conservação não afetou negativamente as taxas de vitalidade nem a de espermatozoides com acrossoma íntegro. Discordando de estudos anteriores, os percentuais de células com acrossoma íntegro de amostras armazenadas a 12 ou 5 °C foram inferiores aos obtidos com o sêmen conservado a 17 °C (KATZER, et al., 2004). Apesar do curto período de incubação prévia para o sêmen armazenado a 10 ºC, tal fato possivelmente favoreceu aos resultados de percentual de células com acrossomas normais, apresentando-se semelhantes aos do sêmen armazenado a 17 ºC (KATZER, et al., 2004). Esses melhores resultados encontrados no LPD a 10 °C podem ser explicados devido à presença das lipoproteínas e lecitinas do leite, que conferem uma proteção à célula espermática contra o choque térmico, quando adicionadas ao sêmen antes do resfriamento (FOOTE, 1974; MEMON; OTT, 1981). Inclusive, há relatos na literatura sobre o efeito 57 crioprotetor do leite desnatado, também conferindo uma melhor proteção à célula espermática pós-descongelação (JULIANI; HENRY, 2008). Os índices de viabilidade espermática com o armazenamento a 12 ºC, após incubação prévia, mostram que o sêmen suíno suporta a redução da temperatura até este limite (KATZER, et al., 2004), podendo chegar a 10 °C. Isto indica que, em casos de desregulagem da incubadora de sêmen para temperaturas abaixo de 17 ºC, sobretudo em épocas de baixas temperaturas ambientais, provavelmente não haveria prejuízo à conservação de sêmen (KATZER, et al., 2004) se a queda de temperatura for até 10 ºC. CONCLUSÕES O leite em pó desnatado mostrou ser um bom meio diluente para o sêmen suíno em temperatura mais baixa (10 °C), possibilitando uma diminuição de custos de produção por não haver necessidade do uso de conservadoras de sêmen que são sempre mais caras do que geladeiras comuns. Além disso, conferiu uma maior proteção à célula espermática, através de maiores taxas de vitalidade e integridade de acrossoma, em relação aos outros diluentes nas diferentes temperaturas, proporcionando a possibilidade melhores de taxas de fertilidade quando do sêmen conservado dessa maneira. AGRADECIMENTOS A bolsa concedida pela Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES). 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Araújo, Lina Raquel Santos1; Barros, Tatyane Bandeira1; Guimarães, Daianny Barboza1; Cantanhêde, Ludymila Furtado 1; Dias, Aline Viana1; Toniolli, Ricardo 2 1 Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias – PPGCV; 2Orientador, Laboratório de Reprodução Suína e Tecnologia de Sêmen – FAVET/UECE, Av. Paranjana, 1700 – Campus Itaperi, Fortaleza-Ce, CEP: 60.740-000, email: [email protected] RESUMO Os antioxidantes são capazes de proteger as células do estresse oxidativo, podendo ser utilizado em diluentes de refrigeração a fim de aumentar a viabilidade do sêmen criopreservado. O presente estudo teve como objetivo verificar os efeitos da adição de diferentes concentrações de trolox sobre espermatozoides suínos diluídos e conservados em leite em pó desnatado (LPD) a 10°C. Foram utilizados 52 ejaculados submetidos a 4 tratamentos: (T1) LPD (controle); (T2) LPD + 1000 µM de trolox; (T3) LPD + 2000 µM de trolox; e (T4) LPD + 3000 µM de trolox. Foram realizadas análises diárias (D0-D4) de vigor e motilidade e no D0 e D4 foi realizado o teste hiposmótico e esfregaço para avaliar a vitalidade e integridade acrossomal. As médias de vigor e motilidade do T1 foram superiores em relação aos demais tratamentos, embora não diferentes do T2 e T3 (D0 a D2). O T4 apresentou as piores médias de vigor e motilidade, não diferindo do T3. O percentual de espermatozoides vivos e integridade de membranas plasmática e acrossomal, não foram diferentes entre os tratamentos, tanto no D0 quanto no D4. A adição de trolox ao diluente LPD não promoveu efeitos benéficos sobre a conservação do sêmen. Elevadas concentrações trolox prejudicaram a qualidade espermática, não sendo aplicável na preparação de doses inseminantes. PALAVRAS-CHAVE: sêmen suíno, leite em pó desnatado, trolox, antioxidante. 62 ABSTRACT The antioxidants are capable of protecting cells from oxidative stress, may be used in refrigeration extenders to increase the viability of cryopreserved semen. The present study aimed to verify the effects of adding different concentrations of trolox on boar sperm diluted and stored in milk powder (LPD) at 10 ° C. We used 52 ejaculates submitted to four treatments: (T1) _LPD_ (control), (T2) _LPD +1000 µM of trolox, (T3) _LPD +2000 µM of trolox and (T4) _LPD +3000 µM of trolox. Analyzes were performed daily (D0-D4) of force and motion and the D0 and D4 hypoosmotic test was performed to assess the smear and vitality and acrosomal integrity. The mean force and motility were higher in T1 compared to other treatments, although not different from T2 and T3 (D0 to D2). The T4 showed the worst average force and motility did not differ from T3. The percentage of live sperm and integrity of plasma and acrosomal membranes were not different between treatments, both in the D0 and D4. The addition of trolox to solvent LPD did not promote beneficial effects on the conservation of semen. High concentrations trolox impaired sperm quality, and is not applicable in the preparation of insemination. KEYWORDS: Boar semen, skimmed milk, trolox, antioxidant. INTRODUÇÃO O trolox (6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametil croman-2-ácido carboxílico), é um análogo hidrossolúvel do α-tocoferol que foi sintetizado por Scott e sua equipe em 1974 e indicado como antioxidante para a preservação de óleos e gorduras. Esta substância apresenta propriedades antioxidantes e é eficaz tanto em gordura animal quanto vegetal. Característica, que o torna singular, já que o tocoferol tem pouca atividade na prevenção da peroxidação de óleos vegetais (SCOTT et al., 1974). Os antioxidantes são inibidores de radicais livres que suprimem a formação de espécies reativas ao oxigênio e/ou suas ações. A adição de antioxidantes ao diluente tem sido avaliada quanto à sua capacidade de proteger o espermatozoide do efeito tóxico dos metabólitos reativos do oxigênio (MAIA, 2006). Estudos têm mostrado que a vitamina E (αtocoferol) é capaz de interagir diretamente com radicais oxidantes (GIULIVI et al., 1992), protegendo as células de estresse oxidativo (TIRADO; BROWN, 2005) e de danos das membranas plasmática e acrossomal (MAIA, 2006), bem como do DNA (DONNELLY et al., 1999), podendo ser utilizado em diluentes de refrigeração a fim de aumentar a viabilidade do 63 sêmen criopreservado (BORBA NETO et al., 2010), melhorando a motilidade e a viabilidade do espermatozoides (MAIA, 2006). O presente estudo teve como objetivo verificar os efeitos da adição de diferentes concentrações de trolox sobre espermatozoides suínos diluídos e conservados em leite em pó desnatado a 10 °C. MATERIAL E MÉTODOS 01. Animais, coleta e análise do sêmen in natura O sêmen de sete reprodutores, em sistema rotineiro semanal, foi coletado durante 9 semanas, por meio da técnica da mão enluvada em recipiente coberto por filtro e protegido por copo térmico, sendo utilizado o ejaculado total após a separação da parte gelatinosa retida no filtro. Foram utilizados animais com idade variando entre 12 e 24 meses, provenientes do Laboratório de Reprodução Suína e Tecnologia do Sêmen – da FAVET/UECE. Os aspectos qualitativos do sêmen avaliados foram: concentração espermática (x106sptz/mL), volume (mL), total de espermatozoides (x109sptz), vigor espermático (0 a 5) e porcentagem de células móveis (%). 02. Diluíção do sêmen e tratamentos experimentais Foi separado de cada ejaculado um total de 2,1 x109 espermatozoides, repartidos entre quatro tratamentos (concentração de 35 x106 sptz/ mL), com um volume final por tratamento (15 mL = sêmen + diluente), repartido em cinco tubos de ensaio por tratamento (3 mL = 105 x106sptz/tubo). O dia da colheita foi considerado dia zero (D0), e o sêmen foi conservado até quatro dias após (D4), com análises diárias no D0, D1, D2, D3 e D4. O meio de conservação dotado neste experimento foi o leite em pó desnatado (LPD) diluído em água destilada nas seguintes proporções: 10g de LPD + 0,194g glicose +100 mL de água destilada + sulfato de gentamicina a 80mg/100 mL. O Leite em pó desnatado (LPD) sem adição de trolox foi o tratamento controle (T1); LPD + 1000 µM de trolox (T2); LPD + 2000 µM de trolox (T3); e LPD + 3000 µM de trolox (T4). Os tratamentos foram submetidos à temperatura de conservação de 10°C. As amostras permaneceram 1h estocadas a 17°C antes de serem transferidas a temperatura de 10 °C. A cada dia de análise, foram retirados os tubos equivalentes a cada ejaculado/tratamento, incubados a 39°C por 10 minutos. 03. Análises do sêmen durante a conservação 64 Para a avaliação da qualidade espermática, foi analisado o vigor espermático (0 a 5; TONIOLLI, 1996) e a porcentagem de células móveis (%), colocando-se uma gota de sêmen de 15 μL entre lâmina e lamínula e com leitura com um aumento de 200 vezes. O sêmen diluído e conservado a 10 °C foi reaquecido a 39 °C, com leituras feitas após 10 minutos de incubação. As amostras para avaliação da vitalidade foram processadas no D0 (no mínimo seis horas após coleta e diluição) (Exame 1) e no D4, 5 minutos após a incubação a 39 °C (Exame 2), considerando-se a morfologia do acrossoma e a vitalidade (% de células vivas). Foram feitos esfregaços de sêmen corados, contando-se 200 células/esfregaço em microscopia óptica com lente de imersão (aumento de 1000x). A solução corante foi formada por: azul de bromofenol = 0,1g; citrato de sódio = 0,4g; água destilada = 10 mL. Juntou-se uma gota de sêmen com outra de corante sendo homogeneizada em seguida. Após 30 segundos, procedeu-se ao esfregaço, sendo secado à temperatura ambiente. Para análises, os espermatozoides foram classificados em quatro categorias: 1) espermatozoides vivos com acrossoma intacto; 2) espermatozoides vivos com acrossoma danificado; 3) espermatozoides mortos com acrossoma intacto; 4) espermatozoides mortos com acrossoma danificado. O teste hiposmótico também foi realizado nos dias D0 e D4, e permitiu a avaliação da funcionalidade da membrana do espermatozoide, através de uma prova de resistência ao choque osmótico. A técnica consistiu da adição de 0,5 mL de sêmen diluído em 7,5 mL de água destilada e mantidos por 15 minutos em banho-maria a 39 °C (solução A). Após o período de incubação, em 1 mL da solução A foi adicionado 0,5 mL de formol salino a 1% (solução B). Dessa nova solução (B) foi retirado uma alíquota de 15 μL, colocado em uma lamina, recoberto por uma lamínula e em seguida levado ao microscópio óptico com um aumento de 40x, sendo contados um total de 200 espermatozoides. O espermatozoide com a cauda reta e indicativo de perda da funcionalidade da membrana, os que permanecerem com membrana funcional apresentaram cauda enrolada. Um bom sêmen deve ter no mínimo 50% de espermatozoides com cauda enrolada. 04. Análise estatística O delineamento experimental utilizado foi o de Blocos ao Acaso, usando-se análise de variância e aplicando-se os testes Mann Whitney, para a comparação entre grupos, e QuiQuadrado, corrigido para os resultados expressos em porcentagem, usando-se o Programa StatView (versão 5.0.1; SAS Institute Inc. 1992-1998) com nível de significância de 5% (p < 0,05). 65 RESULTADOS E DISCUSSÃO A fração espermática do sêmen fresco dos 52 ejaculados analisados no experimento apresentou aspecto normal, coloração branco leitosa, volume médio de 241 mL e concentração média de 418,8 x106 sptz/ mL. Tais características estão dentro da normalidade para a espécie suína (CORRÊA et al., 2001; SMITAL, 2009). O sêmen fresco apresentou uma motilidade média de 90% ± 6,2 e vigor de 4,3 ± 0,3. Devido a oscilações de temperatura durante a conservação, 5 amostras foram perdidas em D1 e 7 amostras em D2. Resultados de vigor e motilidade espermática encontram-se nas tabelas 1 e 2. O tratamento controle apresentou as maiores médias de vigor espermático em todos os dias de análise, embora não diferindo estatisticamente das amostras tratadas com 1000 µM e 2000 µM de trolox (de D0 a D2), exceto em D3 e D4 (p < 0,05). As amostras tratadas com 2000 µM e 3000 µM não foram diferentes estatisticamente durante todos os dias de análise (D0 a D4). As amostras tratadas com 3000 µM de trolox apresentaram os piores resultados quando comparadas ao controle (p < 0,05) em todos os dias de conservação. Resultados semelhantes foram obtidos com concentrações intermediárias de trolox (500 μM, 1000 μM e 1500 μM / 100 mL) em LPD, não sendo observado efeito do trolox na melhoria ou na manutenção do vigor espermático durante o período de conservação (FREITAS et al., 2011). Entretanto, a adição de 1000 µM de trolox ao diluente BTS já demonstrou ação benéfica na conservação do sêmen suíno, apresentando melhores resultados médios de vigor espermático em relação ao controle (TONIOLLI et al., 2011), porém neste estudo esta mesma concentração de trolox não produziu efeito algum, talvez o leite em pó desnatado tenha interferido em sua atividade antioxidante. Tabela 1. Análise do vigor espermático do sêmen suíno conservado em LPD a 10 °C durante cinco dias, com diferentes concentrações de trolox. Tratamentos Dias de conservação D0 D1 D2 D3 D4 0 µM 2,9 ± 1,1a 2,7 ± 1,0a 2,5 ± 0,9a 2,0 ± 0,8a 1,6 ± 0,8a 1000 µM 2,9 ± 1,0a 2,6 ± 1,1ab 2,3 ± 0,9a 2,0 ± 0,8a 1,2 ± 0,7b 2000 µM 2,7 ± 1,0a 2,5 ± 1,1ab 2,2 ± 0,9ab 1,7 ± 0,6b 1,1 ± 0,5b 3000 µM 2,7 ± 1,0a 2,3 ± 1,1b 1,9 ± 0,8b 1,5 ± 0,7b 1,0 ± 0,5b a, b - letras diferentes na mesma coluna indicam diferenças significativas (p < 0,05) 66 Os resultados de percentagem de células móveis foram semelhantes aos encontrados com o vigor espermático. O tratamento controle apresentou as maiores médias para motilidade espermática, embora não sendo estatisticamente diferente das amostras tratadas com 1000 µM durante todo o período de conservação. Da mesma forma as amostras tratadas com 2000 µM e 3000 µM não foram diferentes estatisticamente durante todos os dias de análise (D0 a D4). As amostras tratadas com 3000 µM de trolox apresentaram piores resultados quando comparados aos obtidos com o tratamento controle (p < 0,05) em todo o período de conservação. Trabalhos recentes, inclusive com o mesmo meio de conservação (LPD), também não demonstraram efeitos positivos da adição de trolox (500 μM, 1000 μM e 1500 μM / 100 mL) na conservação da motilidade espermática do sêmen suíno conservado a 17 °C (FREITAS et al., 2011). O trolox mesmo utilizado em concentrações mais baixas (20, 40 e 60 µM) teve efeito prejudicial sobre a motilidade espermática do sêmen humano conservado em meio Biggers, Whitten, and Wittingham (BWW) (DONNELLY et al., 1999). Embora o estresse oxidativo seja muito maior após a criopreservação do sêmen (MAIA, 2006) a ação do trolox também não foi notória na manutenção da motilidade após descongelação do sêmen ovino conservado em meio Tris (MAIA, 2006) e gema de ovo (RODELLO, 2010). Em discordância com deste estudo e com outros autores, a adição de 1000 µM trolox ao diluente BTS foi benéfica na conservação do sêmen suíno, apresentando melhores resultados médios de motilidade espermática em relação ao controle (TONIOLLI; TONIOLLI, 2010), Este efeito não se repetiu quando se utilizou o LPD como meio de conservação para o sêmen suíno, os resultados foram semelhantes entre os tratamentos (0 e 1000 µM de trolox). Tabela 2. Análise da motilidade espermática do sêmen suíno conservado em LPD a 10 °C durante cinco dias, com diferentes concentrações de trolox. Dias de conservação Tratamentos D0 D1 D2 D3 D4 0 µM 64,4 ± 24,7a 58,4 ± 22,6a 50,5 ± 20,8a 38,3 ± 20,6a 29,1 ± 19,0a 1000 µM 64,0 ± 23,0a 52,4 ± 24,8ab 46,5 ± 21,5ab 34,9 ± 19,1ab 23,0 ± 18,0ab 2000 µM 59,1 ± 23,6ab 50,0 ± 22,3b 40,5 ± 19,9bc 30,9 ± 16,5ab 20,9 ± 14,6b 3000 µM 55,5 ± 24,7b 46,8 ± 23,6b 35,3 ± 19,4c 28,5 ± 16,3b 18,9 ± 15,6b a, b, c - letras diferentes na mesma coluna indicam diferenças significativas (p < 0,05) 67 Conforme apresentado na tabela 3, o total de espermatozoides vivos em D0 e D4 não diferiu entre o tratamento controle e as diferentes concentrações de trolox (p > 0,05). Da mesma forma, a adição de trolox ao diluente não produziu efeito sobre o percentual de espermatozoides com acrossoma intacto, apresentando-se semelhante entre os tratamentos (tabela 4). Diferente dos resultados encontrados neste estudo, a adição de trolox em diluente Tris ou BTS foi benéfica. Quando se utilizou BTS como diluente adicionado de trolox (400 µM/ 100 mL) observou-se uma maior percentagem de espermatozoides vivos com acrossoma intacto, durante o período de conservação do sêmen suíno (D0 = 62,9% e D4 = 62,6%) indicando uma melhor ação protetora a esta concentração e mantendo-se estável entre o primeiro e último dia de conservação. Quando se utilizou uma concentração maior de trolox (600 µM/100 mL), obteve-se um maior percentual de células vivas (72,6%) (GUIMARÃES; TONIOLLI, 2010). Entretanto, no presente estudo, concentrações mais elevadas de trolox (1000 µM; 2000 µM e 3000 µM), não demonstraram o aumento dessa ação protetora. Resultados positivos também foram obtidos com sêmen ovino descongelado, onde o trolox promoveu efeito benéfico na manutenção da integridade da membrana acrossomal de espermatozoides, em relação ao controle em diluente Tris (MAIA, 2006), porém, em meio Tris-gema, concordando com nosso estudo, a Vitamina E mesmo em associação com outros antioxidantes não proporcionou uma maior integridade acrossomal no sêmen ovino (SOARES et al., 2010). Tabela 3. Total de espermatozoides vivos (vitalidade %) do sêmen suíno, conservado durante cinco dias no diluente LPD a 10 °C com diferentes concentrações de trolox. Tratamentos Dias de conservação D0 D4 0 µM 67,2 ± 19,7 25,8 ± 16,1 1000 µM 65,4 ± 20,1 25,3 ± 17,0 2000 µM 65,8 ± 19,1 23,9 ± 17,6 3000 µM 62,3 ± 24,2 17,6 ± 13,7 Em relação ao teste hiposmótico, os resultados não foram diferentes, o trolox nas diferentes concentrações estudadas não produziu efeitos benéficos sobre a integridade de membrana. Este resultado assemelha-se ao obtido em um estudo recente, quando se adicionou a vitamina E ao diluente de sêmen descongelado (SOARES et al., 2010). Por outro lado, os 68 antioxidantes são inibidores de radicais livres que suprimem a formação de espécies reativas ao oxigênio e/ou suas ações. Estudos têm mostrado que a vitamina E (α-tocoferol) é capaz de proteger as células de estresse oxidativo (TIRADO; BROWN, 2005) e de danos das membranas plasmática e acrossomal (MAIA, 2006), podendo ser utilizado em diluentes de refrigeração a fim de aumentar a viabilidade de sêmen criopreservado (BORBA NETO et al., 2010). Tais benefícios não foram observados quando se utilizou trolox em leite em pó desnatado como diluente para sêmen suíno acondicionado a 10 °C. Tabela 4. Total de espermatozoides com acrossoma intacto (%) do sêmen suíno, conservado durante cinco dias no diluente LPD a 10 °C com diferentes concentrações de trolox. Tratamentos Dias de conservação D0 D4 0 µM 94,0 ± 5,3 91,3 ± 7,0 1000 µM 93,6 ± 5,6 86,8 ± 16,3 2000 µM 93,9 ± 5,5 90,0 ± 8,8 3000 µM 94,3 ± 5,0 88,6 ± 8,5 Tabela 5. Total de espermatozoides com reativos ao teste hiposmótico (%) do sêmen suíno, conservado durante cinco dias no diluente LPD a 10 °C com diferentes concentrações de trolox. Tratamentos Dias de conservação D0 D4 0 µM 57,7 ± 19,9 24,4 ± 11,8 1000 µM 55,3 ± 20,9 24,5 ± 11,2 2000 µM 55,0 ± 19,5 24,2 ± 11,7 3000 µM 52,7 ± 21,1 21,8 ± 10,5 CONCLUSÃO A adição de trolox ao diluente leite em pó desnatado não promoveu efeitos benéficos sobre a manutenção do vigor e da motilidade espermática nem sobre a integridade das membranas plasmática e acrossomal. Elevadas concentrações dessa substância (2000 e 3000 69 µM) prejudicaram a qualidade espermática das amostras, não sendo aplicável na preparação de doses inseminantes, onde a motilidade e o vigor são essenciais. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS BORBA NETO, A.V.; SOARES, F.A.P; ARRUDA, L.C.P; SANTOS JÚNIOR, D DE A.; SILVA, E.C.B DA; SILVA,S.V.; BATISTA, A.M.; CARVALHO, C.C.D.; GUERRA, M.M.P.; SOARES, P.C. Efeito da Refrigeração e da adição de trolox e glutationa reduzida ma lipoperoxidação, estresse oxidativo e viabilidade de espermatozoides ovinos. In: JORNADA DE ENSINO, PESQUISA E EXTENSÃO, 10, 2010, Recife; SEMANA NACIONAL DE CIÊNCIA E TECNOLOGIA, 1, 2010, Recife; SEMANA ESTADUAL DE CIÊNCIA E TECNOLOGIA, 1, 2010, Recife. Anais..., Recife: UFRPE/SBPC, 2010. CORRÊA MN, MEINCKE W, LUCIA JR T, DESCHAMPS JC. Inseminação artificial em suínos. Pelotas: Printpar Gráfica e Editora, 2001. 181p. DONNELLY, E.T.; MCCLURE, N.; LEWIS, S.E.M..Antioxidant supplementation in vitro does not improve human sperm motility. Fertility & Sterility. v. 72, n. 3, p 484-495, 1999. GIULIVI, C.; ROMERO, F.J.; CADENAS, E. 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Diferentes concentrações de trolox e sua ação sobre parâmetros qualitativos do sêmen suíno. In: SEMANA UNIVERSITÁRIA DA UECE, 15, 2010. Fortaleza. Anais eletrônicos.... Disponível em: <http://semanauniversitaria.uece.br/anais/paginas/trabalhos.jsf> Acesso em: 22/04/2012. TONIOLLI, L.S.; GUIMARÃES, D.B.; BARROS, T.B; ARAÚJO, L.R.S.; TONIOLLI, R. Vigor espermático do sêmen suíno avaliado em diferentes concentrações de trolox adicionado ao diluente BTS. In: Congresso da ABRAVES, 15, 2011. Anais..., Fortaleza:ABRAVES, 2011. CD-ROM. 71 9. CAPITULO IV Efeito da adição de betaína ao diluente leite em pó desnatado durante a conservação do sêmen suíno a 10 °C. Effect of the addition of betaine to diluent skimmed milk powder during storage at 10°C of boar semen Araújo, Lina Raquel Santos; Barros, Tatyane Bandeira; Guimarães, Daianny Barboza; Cantanhêde, Ludymila Furtado; Dias, Aline Viana; Toniolli, Ricardo 72 9. CAPITULO IV Efeito da adição de betaína ao diluente leite em pó desnatado durante a conservação do sêmen suíno a 10 °C. Effect of the addition of betaine to diluent skimmed milk powder during storage at 10°C of boar semen Araújo, Lina Raquel Santos1; Barros, Tatyane Bandeira1; Guimarães, Daianny Barboza1; Cantanhêde, Ludymila Furtado 1; Dias, Aline Viana1; Toniolli, Ricardo 2 1 Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias – PPGCV; 2Orientador, Laboratório de Reprodução Suína e Tecnologia de Sêmen – FAVET/UECE, Av. Paranjana, 1700 – Campus Itaperi, Fortaleza-Ce, CEP: 60.740-000, email: [email protected] RESUMO A betaína tem sido utilizada como crioprotetor, melhorando a qualidade dos espermatozoides criopreservados. O presente estudo teve como objetivo verificar os efeitos da adição de diferentes concentrações de betaína sobre espermatozoides suínos diluídos e conservados em leite em pó desnatado a 10 °C. Foram analisados 56 ejaculados, submetidos a 4 tratamentos: (1) LPD; (2) LPD+1% de betaína; (3) LPD+2% de betaína; e (4) LPD+3% de betaína. Foram realizadas análises diárias (D0-D4) de vigor e motilidade e no D0 e D4 foi realizado o teste hiposmótico e esfregaço para avaliar a vitalidade e integridade acrossomal. Os resultados de vigor, motilidade e vitalidade espermática diferiram entre os tratamentos, sendo superior no T1. O T1 também manteve o maior percentual de células com membrana íntegra em D0 e em D4, porém, neste ultimo não diferiu estatisticamente de T4. A betaína não exerceu efeito protetor sobre a célula espermática suína diluída e conservada em meio à base de LPD a 10 °C. A adição de concentrações iguais ou acima de 1% de betaína no diluente influenciaram negativamente a qualidade do sêmen, portanto, não são aplicáveis na conservação do sêmen suíno resfriado a 10°C em LPD. PALAVRAS-CHAVE: Sêmen suíno, leite desnatado, betaína 73 ABSTRACT Betaine has been used as crioprotector, improving the quality of cryopreserved sperm. The present study aimed to verify the effects of adding different concentrations of betaine on boar sperm diluted stored in skimmed milk powder at 10 C. The 56 ejaculates were analyzed were submitted to four treatments: (1)_LPD; (2)_LPD+1% of betaine; (3)_LPD+2% of betaine, and (4)_LPD+3% of betaine. Analyzes were performed daily (D0-D4) of force and motion and the hypoosmotic test and to assess smear was performed the vitality and acrosomal integrity in D0 and D4. The results of vigor, vitality and sperm motility differed between treatments, being higher in T1. The T1 also maintained the highest percentage of cells with intact membrane on D0 and D4, however, in the latter did not differ statistically from T4. Betaine did not exert a protective effect on the boar sperm cells diluted and preserved amid the basis of LPD at 10 C. The addition of concentrations equal to or greater than 1% of betaine in the diluents influence negatively the quality of semen is therefore not applicable in maintaining the pig semen cooled to 10 °C in LPD. KEYWORDS: boar sperm, skimmed milk, betaine INTRODUÇÃO Glicina betaína, também chamada betaína, é uma amina quaternária, um derivado trimetil do aminoácido glicina (trimetilglicina), que desempenha um importante papel na manutenção do equilíbrio osmótico (EKLUND et al., 2005) e tem sido utilizado como um crioprotetor (LINDEBERG et al., 1999). Foi demonstrado que a betaína melhora a qualidade dos espermatozoides de carneiro criopreservados (SANCHEZ-PARTIDA et al., 1992) como bem como espermatozoides equinos (JUNNILA, 2000;. TRIMECHE et al., 1999), bovinos (ZHANG et al., 2001), caninos (PEÑA et al., 1998), porém não há relatos de seus efeitos sobre o sêmen suíno. O presente estudo teve como objetivo verificar os efeitos da adição de diferentes concentrações de betaína sobre espermatozoides suínos diluídos e conservados em leite em pó desnatado a 10 °C. MATERIAL E MÉTODOS 01. Animais, coleta e análise do sêmen in natura O sêmen de sete reprodutores, em sistema rotineiro semanal, foi coletado durante 9 semanas, por meio da técnica da mão enluvada em recipiente coberto por filtro e protegido por copo térmico, sendo utilizado o ejaculado total após a separação da parte gelatinosa retida 74 no filtro. Foram utilizados animais com idade variando entre 12 e 24 meses, provenientes do Laboratório de Reprodução Suína e Tecnologia do Sêmen – da FAVET/UECE. Os aspectos qualitativos do ejaculado avaliados foram: concentração (x106sptz/mL), volume (mL), total de espermatozoides (x109sptz), vigor espermático (0 a 5) e porcentagem de células móveis (%). 02. Diluíção do sêmen e tratamentos experimentais Foi separado de cada ejaculado um total de 2,1 x109 espermatozoides, repartidos entre quatro tratamentos (concentração de 35 x106 sptz/ mL), com um volume final por tratamento (15 mL = sêmen + diluente), repartido em cinco tubos de ensaio por tratamento (3 mL = 105 x106 sptz/tubo). O dia da colheita foi considerado dia zero (D0), e o sêmen foi conservado até quatro dias após (D4), com análises diárias no D0, D1, D2, D3 e D4. O meio de conservação dotado neste experimento foi o leite em pó desnatado (LPD) diluído em água destilada nas seguintes proporções: 10g de LPD + 0,194g glicose +100 mL de água destilada + sulfato de gentamicina a 80mg/ 100 mL. O LPD sem adição de betaína foi o tratamento controle (T1); LPD + 1 g de betaína (T2); LPD + 2 g de betaína (T3); e LPD + 3 g de betaína (T4). Os tratamentos foram submetidos à temperatura de conservação de 10°C. As amostras permaneceram 1h estocadas a 17 °C antes de serem transferidas a temperatura de 10 °C. A cada dia de análise, foram retirados os tubos equivalentes a cada ejaculado/tratamento, incubados a 39 °C por 10 minutos. 03. Análises do sêmen durante a conservação Para a avaliação da qualidade espermática, foi analisado o vigor espermático (0 a 5; TONIOLLI, 1996) e a porcentagem de células móveis (%), colocando-se uma gota de sêmen de 15μL entre lâmina e lamínula e com leitura com um aumento de 200 vezes. O sêmen diluído e conservado a 10 °C foi reaquecido a 39 °C, com leituras feitas após 10 minutos de incubação. As amostras para avaliação da vitalidade foram processadas no D0 (no mínimo seis horas após coleta e diluição) (Exame 1) e no D4 (Exame 2), após a incubação a 39 °C por 5 minutos, considerando-se a morfologia do acrossoma e a vitalidade (% de células vivas). Foram feitos esfregaços de sêmen corados, contando-se 200 células/esfregaço em microscopia óptica com lente de imersão (aumento de 1000x). A solução corante foi formada por: azul de bromo-fenol = 0,1g; citrato de sódio = 0,4g; água destilada = 10 mL. Juntou-se uma gota de sêmen com outra de corante sendo homogeneizada em seguida. Após 30 segundos, procedeu75 se ao esfregaço, sendo secado à temperatura ambiente. Para análises, os espermatozoides foram classificados em quatro categorias: 1) espermatozoides vivos com acrossoma intacto; 2) espermatozoides vivos com acrossoma danificado; 3) espermatozoides mortos com acrossoma intacto; 4) espermatozoides mortos com acrossoma danificado. O teste hiposmótico também foi realizado nos dias D0 e D4, e permitiu a avaliação da qualidade da membrana do espermatozoide, através de uma prova de resistência ao choque osmótico. A técnica consistiu da adição de 0,5 mL de sêmen diluído em 7,5 mL de água destilada e mantidos por 15 minutos em banho-maria a 39 °C (solução A). Após o período de incubação, em 1 mL da solução A foi adicionado 0,5 mL de formol salino a 1% (solução B). Dessa nova solução (B) foi retirado uma alíquota de 15 μL, colocado em uma lamina, recoberto por uma lamínula e em seguida levado ao microscópio óptico com um aumento de 40x, sendo contados um total de 200 espermatozoides. O espermatozoide com a cauda reta e indicativo de perda da funcionalidade da membrana, os que permanecerem com membrana funcional apresentaram cauda enrolada. Um bom sêmen deve ter no mínimo 50% de espermatozoides com cauda enrolada. 04. Análise estatística O delineamento experimental utilizado foi o de Blocos ao Acaso, usando-se análise de variância e aplicando-se os testes Mann Whitney, para a comparação entre grupos, e QuiQuadrado, corrigido para os resultados expressos em porcentagem, usando-se o Programa StatView (versão 5.0.1; SAS Institute Inc. 1992-1998) com nível de significância de 5% (p < 0,05). RESULTADOS E DISCUSSÃO A fração espermática do sêmen fresco dos 56 ejaculados analisados no experimento apresentou aspecto normal, coloração branco leitosa, volume médio de 238 mL e concentração média de 437,2 x106 sptz/ mL. Tais características estão dentro da normalidade para a espécie suína (CORRÊA et al., 2001; SMITAL, 2009). O sêmen fresco apresentou uma motilidade média de 90% ± 6,0 e vigor de 4,3 ± 0,3. Devido a oscilações de temperatura durante a conservação, 5 amostras foram perdidas em D1. O tratamento controle (sem betaína) obteve as melhores médias de vigor espermático durante todo o período de conservação em relação as amostras acrescidas de betaína nas diferentes concentrações (1%, 2% e 3%). Os valores de vigor espermático foi reduzido com o 76 aumento da concentração de betaína no diluente, sendo que as amostras acrescidas de betaína a 3% obtiveram nota zero de vigor já em D1. Todos os tratamentos diferiram entre si (p < 0,05) nos quatro dias de conservação, apenas em D4, o vigor espermático das amostras com betaína a 2 e 3% foram semelhantes (Tabela 1). Tabela 1. Análise do vigor espermático do sêmen suíno conservado em LPD a 10 °C durante cinco dias, com diferentes concentrações de betaína. Tratamentos Dias de conservação D0 D1 D2 D3 D4 0g 3,1 ± 0,9a 2,9 ± 0,8a 2,5 ± 0,8a 2,0 ± 0,8a 1,6 ± 0,7a 1g 2,8 ± 0,7b 2,4 ± 0,8b 1,8 ± 0,6b 1,4 ± 0,5b 1,0 ± 0,5b 2g 0,8 ± 0,7c 0,5 ± 0,4c 0,2 ± 0,3c 0,1 ± 0,2c 0,0 ± 0,1c 3g 0,1 ± 0,2d 0,0 ± 0,1d 0,0 ± 0,0d 0,0 ± 0,0d 0,0 ± 0,0c a, b, c, d - letras diferentes na mesma coluna indicam diferenças significativas (p < 0,05) Tendência similar ao vigor foi obtida com a motilidade espermática, ou seja, o tratamento controle manteve superioridade em relação aos demais tratamentos (Tabela 2). A motilidade também sofreu influencia da concentração de betaína, quanto maior a concentração, menores percentuais de células móveis foram observados. Há poucos relatos na literatura sobre a inclusão de betaína no diluente para conservação de sêmen na forma liquida, a maioria volta-se para a criopreservação, provavelmente devido a seus mecanismos osmóticos que são desejáveis para o processo (TRIMECHE et al., 1999). Em desacordo com o presente estudo, onde a betaína não promoveu efeitos positivos sobre a motilidade, o primeiro relato da adição de betaína ao diluente de conservação de sêmen, mostrou que este aminoácido manteve a motilidade espermática elevada por 96 h, no sêmen bovino armazenado a temperaturas < 20 °C (20, 5 e 0 °C), com concentrações de betaína de 100 e 200 mM (ZHANG et al., 2001). Embora o nosso estudo tenha apresentado pH próximo de 7,0, onde já foi verificada atividade da betaína (ZHANG et al., 2001), nenhum efeito protetor foi encontrado. A betaína exerceu um efeito negativo em altas concentrações, provavelmente devido ao aumento da osmolaridade do meio (341; 422; e 510 mOsm em 1 %; 2 % e 3 % de betaína, respectivamente), a pressão osmótica foi superior a adotada por Zhang et al. (2001) (275-295 mOsm) que utilizou valor próximo de condições isotônicas (291mOsmkg-1) (YESTE et al., 77 2010), quando foram observados efeitos positivos desse aminoácido sobre a motilidade espermática. Comparando os efeitos da adição de betaína sobre o sêmen após congelação com o presente estudo, observamos que mesmo com baixas concentrações de betaína de 1 e 2% em diluente de sêmen, sem passar pelas injúrias dos processos de congelação e descongelação não conseguimos observar os efeitos positivos da betaína na manutenção da motilidade, que seria seu possível papel como um osmólito intracelular no sêmen, um papel semelhante ao exibido por ela em outras células. Tal papel como osmólito foi observado, com a adição de 2,5% de betaína, com aumento significativo da motilidade progressiva dos espermatozoides de garanhão, mantendo 95% da motilidade original (JUNNILA, 2000). Já outros estudos também utilizando a betaína como crioprotetor apresentaram resultados semelhantes ao deste estudo, onde a adição de betaína (0; 10; 20; e 40 mMol/ L), em comparação com a amostra controle, não melhorou a motilidade do sêmen canino ou integridade da membrana plasmática, embora seu efeito não tenha sido negativo (PEÑA et al., 1998). No sêmen equino, maiores valores de motilidade espermática e motilidade progressiva foram obtidos na concentração de 0,25%, não havendo diferenças significativas entre as concentrações menores que 4%. Quando foram adicionados 4 e 5% do aminoácido, a motilidade espermática foi reduzida, verificando-se um possível efeito deletério da betaína (LINDEBERG et al., 1999). Essa possível toxicidade é provocada pela alta concentração do aminoácido e seu efeito osmótico (TRIMECHE et al., 1999), também observada em nosso estudo, com concentrações acima de 1% de betaína no sêmen suíno. Tabela 2. Análise da motilidade espermática do sêmen suíno conservado em LPD a 10 °C durante cinco dias, com diferentes concentrações de betaína. Tratamentos Dias de conservação D0 D1 D2 D3 D4 0g 66,8 ± 18,8a 62,4 ± 18,5a 52,8 ± 19,2a 41,3 ± 20,3a 31,4 ± 18,2a 1g 60,9 ± 16,2b 53,5 ± 17,8b 41,7 ± 17,1b 31,0 ± 16,2b 17,5 ± 13,9b 2g 13,0 ± 12,6c 8,0 ± 8,7c 3,5 ± 6,0c 1,7 ± 3,6c 0,3 ± 1,2c 3g 1,1 ± 4,8d 0,1 ± 0,7d 0,0 ± 0,0d 0,0 ± 0,0d 0,0 ± 0,0c a, b, c, d - letras diferentes na mesma coluna indicam diferenças significativas (p < 0,05) 78 O percentual de espermatozoides vivos (Tabela 3), obtidos do esfregaço de sêmen corado em D0 e D4, foi maior (p < 0,05) no tratamento controle (LPD) e decresceu com o aumento da inclusão de betaína ao diluente, embora em D4 o tratamento com 2% de betaína não tenha diferido estatisticamente dos outros tratamentos com o mesmo aminoácido. Quanto ao total de espermatozoides com acrossoma intacto (mortos ou vivos) não houve diferenças entre os tratamentos estudados (p > 0,05). Os aminoácidos são moléculas carregadas, é possível que eles interajam eletrostaticamente com os grupos fosfato dos fosfolipídios da membrana plasmática do espermatozoide, formando assim uma camada sobre superfície da célula, protegendo-a contra choques térmicos (EL-SHESHTAWY et al., 2008). Isto pode contribuir para sua capacidade de manter a integridade de membrana acrossomal dos espermatozoides, durante o processo de criopreservação (FAGUNDES, 2008), corroborando com o nosso estudo onde o percentual de células intactas foi semelhante entre os tratamentos, porém quando se tratou de células vivas e intactas, houve a mesma tendência observada com a vitalidade (%), com o aumento da concentração de betaína houve queda nos percentuais de espermatozoides vivos com acrossoma intacto. A osmolaridade do meio também teve sua influencia sobre a viabilidade espermática, já que diluentes hipotônicos (p < 0,01) ou hipertônicos (p < 0,001) afetam negativamente os percentuais de espermatozoides com acrossoma intacto. Em geral viabilidade cai drasticamente quando a osmolaridade é maior do que 500mOsm kg-1 ou menor do que 200mOsm kg-1. (YESTE et al., 2010) Tabela 3. Total de espermatozoides vivos (vitalidade %) do sêmen suíno, conservado durante cinco dias no diluente LPD a 10 °C com diferentes concentrações de betaína. Tratamentos Dias de conservação D0 D4 0g 65,1 ± 19,6a 26,4 ± 16,1a 1g 41,1 ± 24,0b 13,3 ± 12,6b 2g 21,3 ± 20,9c 7,3 ± 8,1bc 3g 11,9 ± 14,7d 4,4 ± 6,9c a, b, c, d - letras diferentes na mesma coluna indicam diferenças significativas (p < 0,05) 79 O maior percentual de células reativas ao teste hiposmótico foi observado nas amostras sem adição de betaína em D0 (controle). Em D4, o tratamento controle manteve-se superior, entretanto, estatisticamente semelhante de tratamento com 3 g de betaína. O tratamento com 3g de betaína apresentou uma menor queda do percentual de espermatozoides reativos ao teste hiposmótico entre as análises de D0 e D4, tal resultado pode estar relacionado às condições osmóticas desfavoráveis (< 200 e > 1500 mOsm kg-1), que interferem na morfologia espermática aumentando os percentuais de espermatozoides com caudas enroladas e caudas dobradas (ZOU; YANG, 2000). Tabela 4. Total de espermatozoides com acrossoma intacto (%) do sêmen suíno, conservado durante cinco dias no diluente LPD a 10 °C com diferentes concentrações de betaína. Tratamentos Dias de conservação D0 D4 0g 95,5 ± 5,0 93,6 ± 5,4 1g 94,0 ± 13,5 93,0 ± 5,9 2g 93,9 ± 13,5 90,8 ± 7,5 3g 93,0 ± 13,9 90,9 ± 9,4 Tabela 5. Total de espermatozoides com reativos ao teste hiposmótico (%) do sêmen suíno, conservado durante cinco dias no diluente LPD a 10 °C com diferentes concentrações de betaína. Tratamentos Dias de conservação D0 D4 0g 49,9 ± 14,6a 23,9 ± 10,6a 1g 31,6 ± 10,2b 17,7 ± 8,9b 2g 21,1 ± 9,9c 15,5 ± 8,6b 3g 24,1 ± 12,2c 20,2 ± 9,9ab a, b, c - letras diferentes na mesma coluna indicam diferenças significativas (p < 0,05) Com declínios de temperatura, há uma redução inevitável na proporção de espermatozoides que mantêm a integridade da membrana normal e de seus componentes bioquímicos (JOHNSON et al., 2000). A capacidade dos aminoácidos em melhorar a 80 criosobrevivência dos espermatozoides tem sido relacionada com suas propriedades metabólicas e crioprotetoras, oxidantes ou osmorregulativas (MARTINS-BESSA et al., 2007). Uma vez que os aminoácidos não podem penetrar a membrana do espermatozoide, então, mecanismos osmóticos podem explicar, em parte, a sua ação (TRIMECHE et al., 1999). Apesar de ter sido verificado o efeito crioprotetor sobre espermatozoides em diversas espécies, os mecanismos de crioproteção espermática conferidos pelos aminoácidos, assim como a função de aminoácidos livres na fisiologia do espermatozoide, ainda não foram esclarecidos (FAGUNDES et al., 2010). Embora os espermatozoides suínos sejam sensíveis a mudanças osmóticas no ambiente, tanto a tratamentos hipotônicos e hipertônicos (YESTE et al., 2010), o estresse osmótico, por si só, não é um fator importante em causar dano à membrana celular dentro de um intervalo de 210 a 1500 mOsm. (DU et al., 1994). Isso pode significar que o efeitos dos agentes osmóticos sobre os espermatozoides em grande parte não são somente devido à osmolalidade do meio, mas também oriundos da concentração de íons e do tipo de composto químico adicionado (ZENG et al., 2001). CONCLUSÕES A betaína não exerceu efeito protetor sobre a célula espermática suína diluída e conservada em meio a base de leite em pó desnatado a temperatura de 10 °C. A adição de concentrações iguais ou acima de 1% de betaína no diluente influenciaram negativamente a qualidade do sêmen, portanto, não são aplicáveis na conservação do sêmen suíno resfriado a 10 °C em LPD. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS CORRÊA MN, MEINCKE W, LUCIA JR T, DESCHAMPS JC. Inseminação artificial em suínos. Pelotas: Printpar Gráfica e Editora, 2001. 181p. DU, J.; TAO, J.; KLEINHANS, F.W.; PETER, A.T.; CRITSER, J.K. Determination of boar spermatozoa water volume and osmotic response. Theriogenology, v. 42, p.1183- 1191, 1994. EL-SHESHTAWY, R. I.; EL-SISY, G.A.; EL-NATTAT, W.S. Use of selects aminoacids to improve buffalo bull semen cryopreservation. Global Veterinaria, v. 2, p. 146-150, 2008. 81 EKLUND, M.; BAUER, E.; WAMATU, J.; MOSENTHIN, R. 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PERSPECTIVAS Existem outras possibilidades para conservação do sêmen na espécie suína, em diluentes e temperaturas diferentes da adotadas rotineiramente nos programas de inseminação artificial. A busca por uma maior longevidade das doses inseminantes é constante e necessária para o desenvolvimento de novas técnicas ou diluentes resultando em menores custos produtivos para o setor suinícola. Sendo necessários estudos complementares incluindo ensaios in vivo, com avaliação de taxas de fertilidade e parição, número de leitões nascidos dentre outros parâmetros que validem os resultados obtidos. 85 12. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS AITKEN, R.J. Free radicals, lipid peroxidation and sperm function. Reproduction, Fertility and Development, v.7, p.659-668, 1995. AITKEN, R.J.; FISHEL, H. Reactive oxygen species generation and human spermatozoa: the balance of benefit and risk. Bioassays, v.16, p.259-267, 1994. 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