UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA CATARINA
CENTRO DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS
DEPARTAMENTO DE AQUICULTURA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM AQUICULTURA
Indução a poliploidia por choque térmico em jundiá Rhamdia quelen
(Quoy e Gaimard, 1824)
Tese apresentada como requisito a
obtenção do título de doutor em
Aquicultura, Centro de Ciências Agrárias,
Universidade Federal de Santa Catarina.
Orientador: Evoy Zaniboni Filho
Silvano Garcia
Florianópolis
2014
A minha esposa Dayana, meus
filhos Vitor e Silvano Filho e aos pais
Sylvio
e
Anselma,
pelos
ensinamentos, que todo o trabalho,
tem que ser feito com amor e
dedicação, porque se assim não for,
então não vale a pena fazê-lo.
AGRADECIMENTOS
A Deus, pela dádiva da vida e por tudo que me concede
diariamente;
Ao meu orientador Professor Dr. Evoy Zaniboni Filho, pela
orientação e apoio;
Aos mestres, que com seus conhecimentos, indicaram o caminho
a seguir;
A EPAGRI/CEPC, por disponibilizar o espaço, para que eu
pudesse realizar meus experimentos;
A FAPESC, pelo apoio financeiro, viabilizando o projeto;
A UFSC/LAPAD, pela estrutura disponibilizada e apoio as
pesquisas e análises;
A USP - Campus Pirassununga, laboratório de teriogenologia
FZEA;
Ao CEPTA-ICM-Bio, pelo apoio no processamento das amostras;
A todos amigos e companheiros de trabalho da EPAGRI/CEPC,
por se mostrarem dispostos a ajudar da melhor maneira possível;
Aos alunos e estagiários do Instituto Federal Catarinense Campus Camboriú;
Aos meus familiares, meus pais, irmãos, cunhados e sobrinhos,
pelo apoio e incentivo,principalmente minha esposa Dayana, meus
filhos Vitor e Silvano Filho, que durante este período fui obrigado
dividir o meu tempo, com o trabalho, eles e o computador;
Aos amigos da
compartilhados no curso;
Pós-graduação,
pelos
bons
momentos
E a todos que não encontraram seus nomes aqui, mas que
contribuíram comsuas críticas, discussões e sugestões, o meu sincero
agradecimento.
RESUMO
O jundiá (Rhamdia quelen) é um bagre nativo da América do Sul que
possui grande potencial para a aquicultura devido a sua rusticidade,
rápido crescimento, tolerância à variação de temperatura e facilidade de
reprodução. No entanto, pelo fato do macho atingir a maturidade sexual
prematuramente, grande parte da energia fornecida por meio do
alimento é direcionada para o desenvolvimento de suas gônadas e
comportamento reprodutivo, favorecendo um declínio na sua taxa de
crescimento corporal. A indução à poliploidia, feita por meio de choque
químico, térmico ou de pressão hidrostática é uma das técnicas que vem
sendo atualmente estudada para prevenir tais efeitos indesejados e
favorecer a esterilidade gonadal. O presente estudo avaliou a eficiência
do choque térmico duplo (calor e frio em sequência) na triploidização e
tetraplodização de jundiá Rhamdia quelen com vistas à sua utilização
em atividades de cultivo. Para induzir a triploidia, ovos aos 3 mpf
(minutos pós fertilização) foram submetidos a choque térmico quente às
temperaturas de 37, 39 e 41 °C por 2 minutos e, logo em seguida,
submetidos a choque frio à 1 °C por 20 min. Houve mortalidade total
dos ovos submetidos ao tratamento à 41°C. A porcentagem de
triploides, confirmada por citometria de fluxo, foi de 98,5% à 37 °C e
100% à 39 °C, enquanto que a taxa de eclosão foi de 64,6 ± 36,81%
(controle), 24,4 ± 15,49% (37°C) e 0,6 ± 0,07% (39°C). Para induzir a
tetraploidia, o experimento consistiu em submeter ovos de Rhamdia
quelen recém fertilizados (10, 15, 20, 25, 30 e 35 mpf) a choque térmico
quente (39 ± 0,2 ºC) durante 3 minutos, seguido por choque térmico frio
(1,0 ± 0,1 ºC) durante 30 minutos. A taxa de fertilização do tratamento
controle foi de 87,83%, e de 23,4% 28,5%, 30,4%, 20,0%, 30,3%,
36,7%, para os tratamentos 10, 15, 20, 25, 30, 35 mpf, respectivamente.
Larvas tetraploides foram encontradas somente nos grupos submetidos
ao choque aos tratamentos 15 e 20 mpf (três e duas larvas,
respectivamente). Os resultados indicam que é possível a obtenção de
um lote homogêneo de larvas triploides por choque térmico quente e frio
em sequência. Apesar disso, a nocividade do tratamento necessário é
muito grande, resultando na sobrevivência inferior a 1%.
Alternativamente, a técnica de tetraploidização de jundiá por choque
térmico duplo é viável, abrindo oportunidades para aperfeiçoar essa
técnica para a produção de larvas em larga escala.
Palavras-chave: Aquicultura,
tratamento térmico, triploidia.
esterilidade
gonadal,
tetraploidia,
ABSTRACT
THERMAL SHOCK INDUCTION OF POLYPLOIDY IN THE
SILVER CATFISH Rhamdia quelen (Quoy and Gaimard, 1824)
The jundiá (Rhamdia quelen) is a native catfish from South America,
with great potential in aquaculture systems due to its hardiness, rapid
growth, tolerance to a wide range of water temperatures and easy
breeding. Since males reach sexual maturity prematurely, most of the
energy provided by food ends up being directed to gonadal development
and reproductive behavior, with a subsequent decline in body growth
rate. The induction of polyploidy, made by chemical, thermal or
hydrostatic pressure shocks, is one of the used techniques to induce fish
gonadal sterility and prevent the above-mentioned undesired effect in
fish farming activities. Current assay assessed the efficiency of a dual
thermal shock (heat shock followed by a cold one) in the triploidization
and tetraploidizationof R. quelen for fish farming activities. Threeminute-old fertilized eggs were submitted to a heat thermal shock at 37,
39 and 41 °C during 2 minutes, followed by a cold one at 1 °Cfor20
minutes, to induce triploidy. No survival was observed in 41 °C
treatment. Triploidization percentage,assessedby flow cytometry,was
98.5% at 37 °C and100% at 39 °C, while hatching rates
were64.6±36.81% (control),24.4±15.49% (37 °C) and 0.6±0.07% (39
°C). In the case of tetraploidy, the experiment consisted of submitting
newly fertilized eggs (10, 15, 20, 25, 30 and 35 minutes postfertilization (mpf)) to a three-minute heat thermal shock (39 ± 0.2 ºC),
followed by a 30-minute cold thermal one (1.0 ± 0.1 ºC). Fertilization
rates reached 87.83% for control and 23.4%, 28.5%, 30.4%, 20.0%,
30.3% and 36.7% for the following treatments 10, 15, 20, 25, 30, 35
mpf, respectively. Tetraploid larvae were only found in the groups
submitted to thermal shock at 15 and 20 mpf (three and two larvae each,
respectively). Results indicate that it is possible to obtain an homogenius
group of triploid larvae by the induction of a heat thermal shock
followed by a cold one. However, its noxiousness was too great that
results in a very low survival (less than 1%). Alternatively, jundiá
tetraploidization induced by dual thermal shock is viable, opening
opportunities to improve its suitability for large-scale tetraploid larvae
production.
Keywords: Aquiculture,
treatment, triploidy.
gonadal
sterility,
tetraploidy,
thermal
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 - Histograma de citometria de fluxo de larva de jundia
Rhamdia quelen, submetida a choque térmico (quente e
frio) sequencial para induzir a triploidia. ......................... 37
Figura 2- Histograma de citometria de fluxo de larva de jundiá
Rhamdia quelen, submetida a choque térmico (quente e
frio) sequencial, para induzir a tetraploidia. Seta indica
pico referente ao controle 2n que foi utilizada
jutamente com as amostras tetraplóides. .......................... 52
Figura 3 – Valores médios das taxas de fertilização (A) e de eclosão
(B) dos tratamentos submetidos ao choque térmico em
diferentes períodos de tempo depois da fertilização (em
minutos pós-fertilização – mpf) e do grupo controle. ...... 54
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 -Desenvolvimento e ploidia de jundiá após os tratamentos
de temperatura. ................................................................... 38
Tabela 2 -Número de larvas sobreviventes, larvas analisadas e
quantidade de diplóides (2N) e tetraplóides (3N)
encontrados nos diferentes tratamentos (tempo para
indução do choque térmico em minutos pós-fertilização). . 55
SUMÁRIO
CAPÍTULO I ......................................................................................... 19
1.
INTRODUÇÃO .......................................................................... 20
1.1 - TRIPLOIDIA .................................................................... 22
1.2 - TETRAPLOIDIA ............................................................... 24
2.
JUSTIFICATIVA ....................................................................... 26
3.
OBJETIVO ................................................................................. 28
3.1
OBJETIVO GERAL ........................................................ 28
3.2
OBJETIVOS ESPECÍFICOS ............................................. 28
CAPÍTULO II ....................................................................................... 29
4. RESUMO .......................................................................................... 30
5.
ABSTRACT ............................................................................... 31
6.
INTRODUÇÃO .......................................................................... 32
7.
MATERIAL E MÉTODOS ........................................................ 34
7.1
REPRODUÇÃO E COLETA DAS AMOSTRAS .................... 34
7.2
PROCEDIMENTOS E ANÁLISES DE TRIPLOIDIZAÇÃO .... 35
7.3
ANÁLISE ESTATÍSTICA ................................................ 36
8.
RESULTADOS .......................................................................... 37
9.
DISCUSSÃO .............................................................................. 38
10.
REFERÊNCIAS ......................................................................... 40
CAPÍTULO III ...................................................................................... 45
11.
RESUMO ................................................................................... 46
12.
ABSTRACT ............................................................................... 47
13.
INTRODUÇÃO .......................................................................... 48
14.
MATERIAL E MÉTODOS ........................................................ 50
14.1 REPRODUÇÃO ............................................................. 50
14.3 ANÁLISES ESTATÍSTICA .............................................. 52
15.
RESULTADOS .......................................................................... 53
16.
DISCUSSÃO.............................................................................. 55
17.
REFERÊNCIAS ......................................................................... 57
18.
CONCLUSÕES GERAIS E CONSIDERAÇÕES ..................... 63
19.
REFERÊNCIAS DA INTRODUÇÃO ....................................... 65
20.
ANEXOS.................................................................................... 71
19
CAPÍTULO I
INTRODUÇÃO GERAL:Indução a poliploidia por choque térmico
em jundiá Rhamdia quelen (Quoy e Gaimard, 1824)
20
1. INTRODUÇÃO
O jundiá Rhamdia quelen (Quoy e Gaimard, 1824) é um peixe
nativo com distribuição Neotropical, desde a região Central da
Argentina até o Sul do México (SILFVERGRIP, 1996). Devido a sua
taxa de crescimento elevada, docilidade e resistência ao manejo, essa
espécie apresenta grande interesse por parte dos piscicultores (GOMES
et al., 2000; CARNEIRO, 2002), Além disso, possui carne saborosa,
sem espinhos intramusculares e grande aceitação pelo mercado
consumidor (FRACALOSSI et al., 2004). É uma espécie estenoalina e
euritérmica, suportando variações de salinidade de 0%o a 10%o
(MARCHIORO, 1997), e de temperatura de 15 a 35 oC, respectivamente
(BALDISSEROTO et al., 2004; ZANIBONI-FILHO, 2004). Devido a
sua tolerância às baixas temperaturas, o jundiá é bastante aceito pelos
produtores do sul do Brasil em função da temperatura que ocorre nesta
região (CHIPPARI-GOMES et al, 1999; ESQUIVEL, 2005).
O crescimento do jundiá é bastante pronunciado nos primeiros
meses de vida. Contudo os machos, devido ao amadurecimento sexual
precoce, desviam parte da energia para o desenvolvimento gonadal,
fazendo com que nessa fase as fêmeas apresentem um crescimento entre
20 e 30% superior (FRACALOSSI, 2004; ZANIBONI-FILHO, 2004;
ESQUIVEL, 2005).
Em virtude do crescimento diferenciado entre os sexos, técnicas
de inversão sexual são comumente utilizadas para obter peixes de um
único sexo com as características de crescimento desejadas. No jundiá,
por exemplo, a feminização por meio da utilização do hormônio 17 betaestradiol permite a obtenção de um crescimento mais rápido e
homogêneo (AMARAL JUNIOR, 2007; SILVA et al., 2003; GARCIA
et al., 2013).
Outra técnica utilizada para otimizar o crescimento é a produção
de animais estéreis pela poliploidia, que pode ser definida como
variações no conjunto dos cromossomos das células, aumentando ou
diminuindo o seu número conforme a técnica utilizada (VALENTI,
1975; THORGAARD, 1986; TAVE, 1993).
A alteração dos conjuntos cromossômicos em peixes é viável
devido à facilidade com que os gametas desses animais podem ser
manipulados e fertilizados artificialmente. Dentre essas facilidades estão
a fecundação externa, a alta fecundidade e o curto intervalo entre
gerações (TSUKAMOTO e RIGOLINO, 1993).
Uma das técnicas para obtenção de um organismo poliplóide é
feita através da inibição da 2ª divisão meiótica, de modo a evitar a
21
extrusão do 2º corpúsculo polar, ou ainda, promover a supressão da 1ª
clivagem do embrião, obtida por meio da inibição da primeira divisão
mitótica. Essa indução a poliploidia pode ser obtida por meio de
métodos físicos como choques térmicos e pressão hidrostática
(CHOURROUT, 1987; TAVE, 1993) ou por métodos químicos, como a
imersão dos ovos em citocalasina, colchicina, caseína ou azul de
toluidina (THORGAARD et al., 1986; PEREZ & BEAUMONT, 1996).
A indução à poliploidia por choque de pressão hidrostática tem
sido utilizada tanto para bloquear a expulsão do 2º corpúsculo polar
quanto para inibir a 1ª divisão mitótica. Porém, a aplicação desta técnica
permite a utilização de pequenas quantidades de ovos e de equipamentos
específicos. Este método consiste em introduzir os ovos recémfecundados em um cilindro de aço cheio de água e fechado com um
pistão, equipado com um êmbolo, pelo qual é exercida uma força
através de uma prensa hidráulica (LOZANO, et al., 1987; HUERGO &
ZANIBONNI-FILHO, 2006; SHELTON, 2002; PIFERRER et al.,
2009).
O método físico através de choque térmico consiste em submergir
os ovos recém-fertilizados dentro de um recipiente que contenha água
com temperatura previamente estabelecida, mantendo-os durante o
tempo do choque programado, depois os ovos são transferidos para
recipiente com água na temperatura fisiológica de incubação para a
continuidade do processo normal de cultivo (AVILA, 2004). Os detalhes
do tempo pós-fertilização, a duração do choque e a temperatura dos
diferentes tratamentos (que varia de 25,0 a 42,0 ºC para choques quentes
e 0 a 11,0 ºC para frios, segundo PÉREZ (1996) vão depender do ciclo
celular que, por sua vez, é de acordo com a espécie (SHELTON, 2002).
TOLEDO et al. (1996) concluíram que a temperatura que produz
os melhores resultados é aquela que se situa na proximidade do seu
limite letal. Na indução à poliploidia, os choques térmicos são os mais
facilmente aplicáveis por seus baixos custos e eficiência
(THORGAARD, 1986; SHELTON, 2002; FUKUSHIMA et al., 2012).
As manipulações cromossômicas podem contribuir com os
programas de melhoramento genético de organismos aquáticos
principalmente por meio da repetição maciça de material genético
superior (androgênese e ginogênese) e pela formação de organismos
com carga genética aumentada (poliploidia). Dentre estas técnicas se
destacam a triploidia e a tetraploidia.
22
1.1 - Triploidia
O processo citológico para indução à triploidia consiste em
bloquear a segunda divisão meiótica (por retenção do segundo
corpúsculo polar) pela aplicação de choques físicos ou químicos a ovos
recém-fecundados, formando um zigoto triplóide, ou seja, com três
conjuntos de cromossomos (CHOURROUT, 1987; CESAR et al., 2004;
PIFERRER et al., 2009). Em geral estes três conjuntos de cromossomos
durante a meiose impedem por completo a maturação sexual em fêmeas
e parcialmente em machos (TIWARY et al., 2004). É o tipo de
manipulação cromossômica mais comum em piscicultura, sendo
normalmente aplicada devido a características importantes dos
indivíduos triplóides em relação aos diplóides (CHERFAS et al.,1993;
BASAVARAJU et al., 2002).
Sob o aspecto teórico, espera-se que os indivíduaos triplóides
sejam estéreis pela divisão meiótica irregular e consequentemente
aformação de gametas aneuplóides (TIWARY et al., 2004). O interesse
no uso de triplóides deve-se não só à expectativa da esterilidade, que
evitaria o gasto energético com desenvolvimento das gônadas,
comportamento reprodutivo, reprodução e cuidados com a prole, mas
também por apresentarem maior peso e comprimento em relação aos
animais diplóides, pois suas células conteriam 33% mais informação
genética para o crescimento (LE COMBER & SMITH, 2004; MELO et
al., 2006).
Em salmonídeos têm-se verificado que diplóides e triplóides
crescem igualmente até o início da idade da primeira maturação.
Durante o período de maturação sexual os diplóides de ambos os sexos
sofrem uma redução no crescimento devido ao desenvolvimento das
gônadas. Entretanto, as fêmeas estéreis triplóides continuam
aumentando em peso e comprimento e superam as fêmeas diplóides em
5% a 20% ao final do período de maturação. A esterilidade em
salmonídeo evita ainda a susceptibilidade às doenças que estão
relacionadas com a maturação sexual (OLUFEAGBA et al., 2000;
TIWARY et al., 2004).
Pesquisas realizadas com siluriformes demonstraram que a
triploidia melhorou o desempenho zootécnico (WEISS & ZANIBONIFILHO, 2009), mostrando ser uma técnica capaz de propiciar redução
do tempo de engorda e, conseqüentemente, amortização dos custos de
produção (QIN et al., 1998 TURRA et al., 2012).
De fato, fêmeas triplóides apresentam somente gônadas residuais e
níveis de hormônios sexuais semelhantes aos das fêmeas diplóides
23
jovens imaturas. Machos triplóides também produzem quantidade
limitada de sêmen e bastante fluído, com poucos espermatozóides
móveis que, quando empregados em fecundações artificiais,
demonstram alto grau de infertilidade e produzem abortos precoces
(MELO et al., 2006; PIFERRER et al., 2009).
A retenção do segundo corpúsculo polar pode acontecer por erro
natural do processo de formação do ovo e indivíduos triplóides podem
surgir na natureza sem a intervenção humana (LE COMBER & SMITH,
2004; TIWARY et al., 2004; PIFERRER et al., 2009). Mas, pode-se
provocar o mesmo erro através de choque físico dos ovos recémfecundados por alteração térmica ou de pressão hidrostática (TIWARY
et al., 2004; PIFERRER et al., 2009). As metodologias através de
choques de pressão são difíceis de serem executadas, por exigirem
equipamentos específicos e que comportam poucos ovos por vez, além
de serem manuseio perigosos, mesmo em escala laboratorial (TURRA et
al., 2012).
Com isso, o processo de indução à triploidia mais empregado na
piscicultura é o de choques térmicos pela sua facilidade de execução,
podendo ser choques témicos quentes ou frios. Em peixes tropicais,
como a tilápia do Nilo, choques frios mostraram-se mais eficientes
(PRADEEP et al., 2014). Porém, o contrário também foi registrado para
essa espécie (EL GAMAL et al., 1999; MELO et al., 2006). Em choques
frios, as temperaturas variam de 9 a 13oC e o tratamento realizado
durante 30 a 60 min de exposição. Em choques quentes, a temperatura
usual varia entre 40 e 42oC, com duração de 3 a 5 min. Em ambas
metodologias o processo é executado 3 a 5 min depois da fertilização
dos ovócitos, sendo considerados como choques precoces. Um aspecto
negativo da indução à triploidia através de choques físicos é que a
sobrevivência larval é prejudicada em relação à obtida com larvas
diploides (TURRA et al., 2012).
Huergo e Zaniboni-Filho (2006) utilizaram ovos recém fertilizados
de jundiás submetidos a sete tratamentos definidos pela interação entre
diferentes intensidades de pressão (4000, 5000 e 6000 psi), tempos após
a fertilização (2, 5 e 8 min) e duração dos choques (2, 5 e 8 min).
Obtiveram o melhor resultado com exposição por 5 minutos a uma
pressão de 5000 psi aplicada aos 2 minutos após a fertilização,
tratamento que foi suficiente para induzir 100% de triploides em
Rhamdia quelen, Esses autores obtiveram sobrevivência larval de 29,1%
ao fim do período de alimentação endógena e a triploidização de todo o
lote.
24
A indução de poliploidia, frequentemente está associada à
ocorrência de altas taxas de mortalidade, conforme foi observado nos
testes de triploidia realizados por outros autores (LE COMBER &
SMITH, 2004; TIWARY et al., 2004; PIFERRER et al., 2009). Isto
pode ter como causa o desenvolvimento anormal determinado pela
adição de um novo conjunto cromossômico ao genoma diplóide, que
poderia resultar em desbalanços da atividade gênica nas células, ou
ainda, devido ao efeito latente da ação do choque térmico (TABATA et
al., 1999; PIFERRER et al., 2009). Outra dificuldade da técnica de
triploidização por choque consiste na identificação dos triplóides, já que
são fenotipicamente idênticos aos diplóides e a técnica de avaliação
geralmente não resulta em 100% de eficiência na caracterização
(VOZZI et al., 2003; SILVA et al., 2007; PRADEEP et al., 2014). A
técnica de avaliação do tamanho e do volume do eritrócito tem sido
utilizada com bastante eficácia na identificação de triplóides, pois o
tamanho das células tem uma relação direta com a ploidia
(FUKUSHIMA et al., 2012). Técnicas como a citogenética, contagem
de nucléolos e a medida da quantidade de DNA (citometria de fluxo),
também são utilizadas, no entanto, demandam tempo, equipamentos e
mão de obra especializada (EL GAMAL et al., 1999; FUKUSHIMA et
al., 2012; TURRA et al., 2012).
Uma alternativa para superar estas dificuldades é produzir
triplóides a partir de tetraplóides. Os animais oriundos destes
cruzamentos são chamados triplóides interplóides. O método triplóides
interplóides, apesar de pouco explorado, é o mais promissor para a
produção de indivíduos triplóides em larga escala. Este método consiste
na utilização de reprodutores tetraplóides em acasalamentos com
diplóides, produzindo progênie triplóide interplóide. Essa alternativa
evita os efeitos deletérios dos choques físicos ou químicos nos ovos,
aumentando o volume e segurança dos triplóides(PIFERRER et al.,
2009).
1.2 - Tetraploidia
Tetraplóides são peixes que possuem quatro conjuntos de
cromossomos ao invés dos dois conjuntos comumente encontrados.
Podem ser originados pelo choque aplicado em um zigoto diplóide antes
da primeira clivagem. O choque deve acontecer exatamente no momento
após o cromossomo ter se replicado e o núcleo do zigoto estar próximo
de se dividir. O choque impede a divisão celular e nuclear, portanto,
25
resulta em núcleos zigóticos com quatro conjuntos de cromossomos
(PIFIRRER et al., 2009).
O principal interresse na criação de tetraplóides é para a produção
de peixes triplóides interploides, os quais eliminariam a necessidade de
continuamente induzir a triploidia manualmente a cada geração. Essa
alternativa elimina os efeitos deletérios dos choques externos nos ovos,
além da produção sistemática de triplóides. O processo já se provou
confiável em trutas arco-íris Oncorhynchus mykiss e em outras espécies
de peixes(PIFERRER et al., 2009).
A obtenção de indivíduos tetraplóides se dá através do choque
físico, normalmente térmico, antes da primeira divisão mitótica do ovo,
causando o rompimento dos fusos mitóticos e a manutenção do material
genético duplicado na mesma célula, resultando em uma célula 4n, que
volta a se dividir normalmente e forma um organismo tetraplóide
(TAVE, 1993; CHERFAS et al., 1993; HUSSAIN et al., 1993;
CEZAR et al, 2004).
Para a obtenção de tretraplóides, os choques são executados com
pelo menos 15 min após a fertilização dos ovócitos, chamados de
choques tardios, para que o momento da primeira divisão mitótica possa
ser alcançado; logicamente depende da temperatura de incubação e
biologia da espécie estudada ( PIFERRER et al., 2009).
Os tetraplóides em piscicultura são usados para a produção de
triplóides estéreis. Entretanto, os cruzamentos de machos tetraplóides
com fêmeas diplóides, possuem taxas de fertilização reduzidas, pois os
espermatozóides têm dificuldade de penetrar nas micrópilas dos óvulos
(CESAR et. al., 2004; TEBALDI & AMARAL JUNIOR, 2010). Sendo
assim, para evitar essa limitação, deve ser feito o cruzamento de fêmea
tetraplóide com macho diploide. Uma vez criados alguns peixes
tetraplóides, estes podem ser perpetuados por cruzamentos entre eles,
como o obtido em trutas arco-iris (MOREIRA et. al., 2001; CESAR et
al., 2004).
26
2. JUSTIFICATIVA
A piscicultura da região sul do Brasil foi desenvolvida com base
no cultivo de espécies dulcícolas exóticas, tais como: carpa-comum
Cyprinus carpio carpio e carpas-chinesas Hypophthalmichthys nobilis,
Hypophthalmichthys molitrix e Ctenopharyngodon idella, truta
Oncorhynchus mykiss e tilápia do Nilo Oreochromis niloticus. Isto se
deu, principalmente pela falta de disponibilidade de tecnologias
aplicáveis ao cultivo de espécies nativas.
Com isso em mente, a EPAGRI (Empresa de Pesquisa
Agropecuária e Extensão Rural de Santa Catarina) a partir de 2005,
formou um grupo de estudos para reunir esforços e definir uma espécie
de peixe nativa, com interesse produtivo e comercial, que possuísse não
somente bom desempenho reprodutivo, mas também bons índices
zootécnicos.
O resultado de tais esforços elegeu o jundiá Rhamdia
quelen, que deixou de ser uma espécie desconhecida nos sistemas de
cultivos de peixes em Santa Catarina e passou a figurar na estatística das
espécies produzidas, passando de 12 toneladas comercializadas em 2005
para 900 toneladas em 2012 (GARCIA et al., 2013). Dessa forma, essa
espécie nativa vem despontando como uma das mais promissoras ao
cultivo em viveiro escavado no Estado devido a sua resistência ao
manejo, crescimento acelerado (inclusive no inverno), boa eficiência
alimentar e, sobretudo, por apresentar carne saborosa e sem espinhos
intramusculares, propiciando boa aceitação pelo mercado consumidor
(CARNEIRO et al., 2002).
Entre os conhecimentos que favoreceram o aumento na
produção e produtividade do jundiá, pode-se destacar o
desenvolvimento de um protocolo para inversão sexual da espécie, com
hormonio, que possibilitou a regularidade na produção de alevinos
destinados ao cultivo.
Deve-se lembrar que o tratamento com o hormônio apropriado,
administrado em dosagem adequada durante a fase indiferenciada de
desenvolvimento da gônada, é condição determinante do sucesso da
inversão sexual. Atualmente, mais de trinta diferentes hormônios
naturais e sintéticos têm sido usados por diferentes pesquisadores no
estudo da inversão. O mais utilizado entre os andrógenos é a 17 -metiltestosterona, e entre os estrógenos é o 17 -estradiol. Não obstante, a
inversão do sexo nem sempre é 100% efetiva, além da limitação de uso
em determinadas espécies. Dessa forma, o desenvolvimento de estoques
com a totalidade de indivíduos para cultivo monosexo e/ou estéreis,
27
pode ser alternativamente obtido por meio de técnicas de manipulação
cromossômica através de choques físicos e químicos (MELO et al.,
2006).
O choque térmicoé o mais fácildeaplicar emgrandeescala,
como observado nos salmonídeos (FORESTI & FORESTI, 2004;
BENFEY & SUTTELIN, 1984). Considerando o baixodesempenho dos
outros métodos já estudados em induzir a triploidianojundiá, foram
realizados estudos a fim deproduzir triplóidesem larga escala. O
método utilizadoé o duplo choque(calorseguido defrio), como testado
porNametal. (2004)emMizolepismisgurnuspara induçãoa tetraploidia.
28
3. OBJETIVO
3.1 Objetivo Geral
Verificar a efetividade do choque térmico duplo (calor e frio em
sequência) na triploidização e tetraploidização de jundiá Rhamdia
quelen com vistas à sua utilização em atividades de cultivo.
3.2 Objetivos específicos
a) Avaliar a efetividade do choque térmico quente seguido de frio
para a produção de larvas triplóides de Rhamdia quelen em diferentes
temperaturas;
b) Analisar as taxas de fertilização, deformação embrionária,
eclosão e sobrevivência larval nos ovos induzidos a triploidia;
c) Identificar o melhor momento pós-fertilização para induzir
ovos de jundiá a tetraploidia, pela combinação de choque quente e frio
sequencial;
d) Verificar as taxas de fertilização, eclosão e aproveitamento
larval nos ovos induzidos a tetraploidia.
29
CAPÍTULO II
Indução a triploidia em Rhamdia quelen (Actinopterygii,
Heptapteridae) por choque térmico quente e frio sequencial
Silvano Garcia1,2 e Evoy Zaniboni-Filho1,3
1
Programa de Pós-Graduação em Aquicultura, Centro de Ciências
Agrárias, Departamento de Aquicultura, Universidade Federal de Santa
Catarina. Rodovia Admar Gonzaga 1346, 8803-001 Florianópolis, SC,
Brazil. [email protected], [email protected].
2
Campo Experimental de Piscicultura de Camboriú, Empresa de
Pesquisa Agropecuária e Difusão de Tecnologia do estado de Santa
Catarina. Rua Joaquim Garcia S/N, 88340-000 Camboriú, SC, Brazil.
3
Professor do Departamento de Aquicultura, Universidade Federal de
Santa Catarina.
 Artigo submetido ao periódico Neotropical Ichthyology em
25/09/2014
30
4.
RESUMO
O objetivo deste estudo foi avaliar o choque duplo de temperatura
(quente e frio) para produção de jundiáRhamdia quelen triploides. Ovos
fertilizados foram submetidos a choques de calor de 37, 39 e 41 ºC, 3
min após a fertilização durante 2 min e imediatamente submetidos ao
choque de frio a 1 ºC por 20 min. Após os tratamentos, os ovos foram
incubados a 25 ºC. Ovos incubados normalmente, sem manipulação,
foram utilizados como controle. A taxa de fertilização do grupo controle
(sem choque de temperatura) foi significativamente maior
(65,5±36,99%) que dos grupos tratados a 37 °C (58,2 ± 37,71%), 39 °C
(1,8±0,33%) e 41 ºC (0%). A sobrevivência da larvicultura dos peixes
do controle (64,6±36,81%) também foi maior comparado com os peixes
tratados com choque de 37 ºC (24,4±15,49%) e 39 ºC (0,6±0,07%). A
porcentagem de larvas deformadas foi significativamente maior nos
peixes submetidos aos choques de 37 ºC (47,4±9,64%) e 39 ºC
(65,2±8,38%) que nos peixes do tratamento controle, que não
apresentaram deformidades. A porcentagem de triploides, confirmada
por citometria de fluxo, foi de 98,5% e 100% para os peixes
sobrevivente submetidos a 37 e 39 ºC, respectivamente. Considerando a
alta mortalidade e deformidades das larvas obtidas após o choque duplo
de temperatura, esse procedimento necessita de mais estudos para ser
aplicável em produções de larga escala de jundiá triploide.
Palavras chave: Jundiá, poliploide, choque de temperatura,
manipulação cromossômica, citometria de fluxo.
31
5. ABSTRACT
The aim of this study was to evaluate sequential double temperature
shock (heat and cold shock) for triploidization in Rhamdia quelen.
Fertilized eggs were heat shocked at 37, 39 and 41 °C, 3 min post
fertilization and then immediately cold shocked at 1°C for 20 min. After
temperature treatments, the eggs were incubated at ~25°C. Intact eggs
were used as controls. Fertilization rate in control groups (without
temperature shock) was significantly higher (65.5±36.99%) than at 37°C
(58.2 ± 37.71%), 39°C (1.8±0.33%) and 41°C (0%). The survival of
hatchery of control (64,6±36.81%) was higher compared to treatment of
37 ºC (24.4±15.49%) and 39 ºC (0.6±0.07%). The percentages of
abnormal larvae was significantly higher at 37 °C (47.4±9.64%) and 39
°C (65.2±8.38%) than at control, in which no abnormality was detected.
The percentage of triploids, confirmed by flow cytometry, were 98.5%
at 37 °C and 100% at 39 °C. Considering the high mortality and
abnormal larvae obtained after double shock, this procedure needs
others studies to be applicable in large-scale productions of silver catfish
triploid.
Key words: Silver catfish, polyploid, temperature shock, chromosomeset manipulation, flow cytometry.
32
6. INTRODUÇÃO
O jundiá Rhamdia quelen, é um peixe nativo, com ocorrência
desde a região central da Argentina até o sul do México (Silfvergrip,
1996). Na região sul do Brasil, o cultivo do jundiá tem aumentando,
devido a taxa de crescimento elevada em baixas temperaturas,
docilidade, resistência ao manejo, carne saborosa, ausência de espinhos
intramusculares e grande aceitação pelo mercado consumidor (ChippariGomes, et al., 1999; Fracalossi et al., 2004; Baldisserotto et al., 2004).
A produção em Santa Catarina aumentou significativamente nos últimos
anos, passando de 25 toneladas no ano de 2005 para 833 toneladas em
2011 (Silveira, 2014). Contudo, a maturação precoce dos machos, foi
identificada como um entrave que atrasa o seu crescimento. Essa
característica está relacionada ao fato dos peixes usarem energia que
seria utilizada no crescimento somático para a maturação gonadal. Isto
proporciona um crescimento desuniforme, aumentando o manejo, os
custos de produção e estendendo o ciclo de cultivo. Adicionalmente, tal
diferença entre machos e fêmeas gera problemas para o cultivo
implicando no manejo e no custo de produção. (Fracalossi et al., 2004;
Ribolli &Zaniboni-Filho, 2009).
Uma possível solução para este problema é o cultivo de peixes
triplóides em grande escala, porque, em geral, os triplóides são estéreis e
não apresentam os problemas relacionados com a maturação sexual
precoce (Chourrout, 1987;Lozanoet al., 1987;Fanjul e Toro,
1991;Cesaret al., 2004;Huergo& Zaniboni-Filho2006; Tebaldi &
Amaral Junior, 2009; Preston et al., 2013).
A triploidia é a forma de manipulação cromossômica mais
comum na aquicultura. Peixes triplóides podem ser obtidos pela
retenção do segundo corpúsculo polar em ovos recém-fertilizados,
efetuada pela aplicação de choques químicos, térmicos ou de pressão,
que impedem a metáfase durante a meiose. Pode também ser obtido pelo
cruzamento interespecífico (triploidia híbrida), cruzamento entre fêmeas
tetraplóides e machos diplóides, originando triplóides interplóides
(Chourrout, 1987;Lozanoet al., 1987;Fanjul& Toro, 1991;Cesaret al.,
2004;Huergo& Zaniboni-Filho2006; Tebaldi &Amaral Junior, 2009).
Triplóides
foram
produzidos
comercialmente
ou
experimentalmente, por choque de pressão em muitas espécies de peixes
e mariscos (Garneret al. 2008; Chiassonet al.2009), e tambem por
choque térmico quente (Benfey & Sutterlin 1984;. Rougeotet al. 2003) e
choque térmico frio (Silvaet al., 2007). Atualmente, existem protocolos
confiáveis de indução a triploidia para algumas espécies de salmonídeos
33
como por exemplo emSalmo salar e Oncorhynchus mykiss (Prestonet al.
2013).
No entanto, o uso de peixes triplóides é muito discutível na
aquicultura. Em primeiro lugar, embora as células de indivíduos
triplóides sejam teoricamente maior quando comparado com diplóides, o
tamanho do corpo é geralmente semelhante quando comparado com
peixes diferentes níveis de ploidia (Benfey & Sutterlin 1984; Chourrou,
1987; Meloet al., 2006). Pradeep et al. (2014) afirmam que a triploidia
leva ao aumento do conteúdo do DNA, que resulta em um aumento do
volume celular e nuclear em um grande número de tecidos, mas o
número de células é reduzido para manter o tamanho normal do corpo e
dos órgãos.
Em salmonídeos, que é a principal grupo de peixes induzidos a
triplóidesproduzidos em grande escala, as fêmeas triplóides apresentam
desempenho e aumento da qualidade de carne, especialmente após a
primeira maturação sexual (Chourrout, 1987; Tabataet al., 1999; Gillet
et al., 2001; Piferreret al., 2009; Preston et al., 2013).
Nas espécies de bagres triplóides estes apresentam melhor
desempenho quando comparados com diplóides, como observado com
bagre do canal, Ictalurus punctatus (Wolters et al., 1982; Basavarajuet
al., 2002), bagre asiático Clarias macrocephalus (Fast et al., 1995) e o
bagre chines Clarias fuscus (Qin et al., 1998).Portanto, o aumento do
desempenho e esterelidade de triplóides parecem depender da espécie.
Além disso, espécies decultivo são comumente encontradas em
ambientes naturais, devido ao escape.A triploidia elimina as interações
genéticas entre populações cultivadas e naturais, sendo um excelente
caminho para a utilização de espécies exóticas em programa de
piscicultura, minimizando os possíveis problemas de impacto ambiental
à biodiversidade aquática, pelo desaparecimento de espécies nativas em
decorrência da competição, predação e cruzamentos (Cotteretal., 2000;
Lutz, 2001; Foresti& Foresti 2004;Chiasson et al., 2009).A
intensificação dos cultivos, impulsionada pela facilidade na reprodução
artificial, manejo e desempenho zootécnico promissor da espécie,
aumentam as chances de escapes acidentais que podem provocar danos
na estrutura genética das populações naturais (Cotteret al., 2000; Lutz
2001; LeComber& Smith, 2004;Foresti e Foresti, 2004). Em
jundiáRhamdia quelen, tal esterilização é importante porque a produção
aquícola com esta espécie está aumentando rapidamente nos últimos
anos no Brasil e em outros países da região neotropical (Garciaet al.,
2013).
34
Estudos anteriores sobre triploidização emRhamdia quelen são
registrados na literatura. O primeiro experimento feito por Vozziet al.,
(2003) que obteve triplóides por choque térmico quente, enquanto que
Silvaet al. (2007) obteve com choque térmico frio, porém nos
experimementos acima citados foram alcançadas taxas inferiores a
100%. No entanto Huergo & Zaniboni-Filho (2006) também obteveram
experimentalmente 100% triplóides de jundiá com choque de pressão
hidrostática, porém a indução a triploidia por choque de pressão
hidrostática apresenta limitações em escala comercial, devido à pequena
quantidade de ovos que cabe no cilindro (Tiwaryet al., 2004). Além
disso, o choque por temperatura, não precisa de aparelhos sofisticados,
desta forma é mais fácil de aplicar em grande escala, como observado
em salmonídeos (Benfey & Sutterlin, 1984;Pifirreret al., 2009).
Considerando o baixo desempenho até aqui obtido na triploidização de
Rhamdia quelen, o objetivo do presente estudo foi o de aumentar a
produção em larga escala de triplóides para fins de aquicultura. Um
procedimento possível para aperfeiçoar esse desempenho é usar o
choque duplo (calor seguido de frio), como observado por Namet al.
(2004) em Misgurnus mizolepis para a indução tetraplóide. No entanto,
esta é a primeira tentativa de usar este método para produzir peixes
triplóides.
7. MATERIAL E MÉTODOS
O presente estudo foi conduzido no Campo Experimental de
Piscicultura de Camboriú (CEPC), pertencente ao Centro de
Desenvolvimento em Aquicultura e Pesca (CEDAP) da Empresa de
Pesquisa Agropecuária e Extensão Rural de Santa Catarina (EPAGRI);
no Laboratório de Biologia e Cultivo de Peixes de Água Doce
(LAPAD), pertencente ao Departamento de Aquicultura do Centro de
Ciências Agrárias da Universidade Federal de Santa Catarina (UFSC);
no Centro de Pesquisa e Gestão de Recursos Pesqueiros Continentais
(CEPTA) conveniado com a Universidade de São Paulo (USP).
7.1 Reprodução e coleta das amostras
Foram selecionadas12fêmeas (740 ±53g) (média ±desviopadrão)e 8machos (634 ±39g), as fêmeascom base na
aparênciaexterna(volumena regiãoperitoneal e papila entumecida),e os
machos queliberaram sêmen com leve pressão abdominal, (ChippariGomes, 1999;AmaralJunior,2007). Osreprodutoresselecionadosforam
35
distribuídos em hapas de 0,5m3(3 hapascom 4fêmeas cadae 8
machosemuma únicahapa). As hapasforamcolocadasnum tanque de
concreto de 3,0m3, com areração constante(oxigénio dissolvido >6
mg.L-1) eatemperatura de25,0±0,3°C.Apenasas fêmeasforam induzidas
àdesova,utilizandouma dose única deglândula pituitária decarpa na dose
de 5mg.kg-1 (Amaral Júnior,2007;WoynarovicheHorvath, 1983).
Para viabilizar os procedimentos durante o experimento, as
fêmeas foram induzidas com intervalo de uma hora entre cada hapa. Os
ovócitosforam coletadospor extrusão10h após a induçãoesomente os
ovócitoscom boa qualidadeforam utilizados(translúcido e cor
homogênea, forma e tamanho) para a fertilização.
O sêmenfoi coletado com uma leve pressão abdominal liberado
diretamente sobre os ovócitos,homogeneizado e, em seguida, os
gametasforam ativadosutilizando a águada incubadora.A fim deestimara
quantidade deovos, uma aliquota(0,5 g) decadalote foi coletada
efixadaemformalina
a
4%para
posterior
contagem
do
númerodeovos(Wirtz
&Steinmann,
2006),
estimado
como1.356±73ovócitos.g-1. As espécimes após a coleta dos gametas,
foram depositadas no Museude Zoologia daUniversidade Federal doRio
Grandedo Sul, (voucher UFRGS 18263, UFRGS 18264, UFRGS 1865 e
UFRGS 18266).
7.2 Procedimentos e análises de triploidização
Em cada tratamento e no grupo controle, uma amostra de 20 mL
de ovócitos fertilizados (1401,33±21,06) foram distribuídos em
unidades experimentais constituídas por peneiras cônicas de plástico
(15,0 cm de diâmetro, malha de 0,4 mm e volume de 900 ml), fixadas
em um sistema de incubação composto por placas de isopor e dispostos
em um tanque de concreto redondo com volume útil de 3000 litros com
aeração constante para manter os ovos em movimento. A temperatura
foi mantida em 25,0±0,3 ºC, o oxigênio dissolvido em 6,8±0,7 mg.L-1e
o pH 7,8±0,5, monitorados diariamente com uma sonda multiparâmetro
(YSI 556®).
O experimento consistiu em submeter ovos de Rhamdia quelen
recém fertilizados (3 min pós-fertilização - mpf) a choque térmico
quente (37, 39 e 41 ºC) durante 2 min (Nam et al., 2004), seguido por
choque térmico frio (1,0 ºC) durante 20 min (Vozzi et al., 2003). O
choque térmico quente foi realizado em banhos-maria, simultaneamente
para cada um dos tratamentos (as temperaturas foram estabilizadas 48 h
antes do experimento) e o choque à frio foi realizado em caixa de isopor
36
(120 L) contendo gelo. Um grupo contendo ovos incubados à 25 ºC foi
utilizado como controle. O experimento foi repetido três vezes ao longo
do tempo, com intervalo de uma hora cada repetição, sendo utilizada
uma única unidade experimental em cada tratamento.
As taxas de fertilizaçãode ovosdecada loteforammedidasna fasede
gástrulatardia
(12
horaspós-fertilização
-hpf)
emumaamostrade260embriões(Rizzo etal., 2003, Zaniboni-Filho, 1992).
As taxas de eclosãoeas porcentagens delarvasnormais e
anormaisforam mensuradasem 30 hpf. Aos 60hpf, foram
fixadas25larvas ou todas as sobreviventes, de cada unidade
experimentalem metanol com ácido acético(3 partes de metanol : 1 parte
ácidoacético) paraa confirmação da ploidiapor citometria de fluxo. Para
a análisepor citometria defluxo, foi utilizado o kit Cystain (Partec
Gmbh, Alemanha). Em resumo, cadalarvafoi lisadaem120µL desolução
A, a fim de isolarosnúcleos, e em seguida os núcleosforam
coradascom1,5mLdesoluçãoDAPI(4,6-diamidino-2-fenilindole).
Asuspensãoresultante foi, em seguida filtrada emum filtro com malha
de30 µL(Celltrics, PartecGmbh, Alemanha), e oconteúdo de DNAfoi
medidoporumcitômetro de fluxo(Partec Cy Flow Ploidy Analyzer,
Partec Gmbh, Alemanha).
O citômetro foi calibrado com um padrão diplóide de jundiá, e
utilizou-se
célulassomáticasdeAstyanaxaltiparanae,como
controle
durante as análises de citrometria de fluxo. A triploidia foi validada para
indivíduos que apresentaram conteúdo de DNA 50% maior que a dos
diplóides (Lamatsch et al., 2000).O conteúdo de DNA correspondente
foi expresso em histogramas(Figura 1).
7.3Análise estatística
Os dados de viabilidade dos ovos (taxa de fertilização) e de
deformidade das larvas (taxa de deformidade) foram agrupados por
tratamento e estruturados em tabelas de contingência para a avaliação da
dependência com a temperatura do choque através do teste do quiquadrado (α=0,05) (Zar, 2010). Os tratamentos que produziram
diferenças significativas entre as proporções foram evidenciados através
do particionamento das tabelas de contingência.
37
Figura 1- Histograma de citometria de fluxo de larva de jundia
Rhamdia quelen, submetida a choque térmico (quente e frio) sequencial
para induzir a triploidia.
8. RESULTADOS
As taxas de fertilização(χ² =752,78, P<0,05), larvas
deformadas(χ² =350,57, P<0,05) e eclosão (χ² =380,54, P <0,05)foram
significativamentedependentesdastemperaturas dos choques(Tabela 1).
Apercentagemdeaumento
de
peixes
triplóidesproduzidos
estádiretamente relacionada coma temperatura da água utilizada
nochoque térmico, sendode98,6% (37 °C) e de 100% (39 ºC) (χ ²
=165,89, P<0,05), masataxa de eclosãoreduziudrasticamente de24,4%
(37 °C)para 0,6% no 39 ºC. Tambémnãofoiobservadasobrevivência de
embriãoa 41 °C(Tabela 1). A produção delarvasanormaistambém
aumentouem 30%com oaumento de temperatura37 para 39 °C.
O tratamento 41ºC foi excluído das análises estatísticas porque não
produziu ovos viáveis.
38
Tabela 1 - Desenvolvimento eploidiadejundiáapós os tratamentosde
temperatura.
Temperatura do choque (ºC)
Variáveis
Controle
37
39
41*
Temperatura (ºC)
Fertilização (%)
37,0±0,05
58,2±37,71b
39,0±0,04
1,8±0,33c
b
c
24,4±15,49
Eclosão (%)
47,4±9,64b
Deformação (%)
72
Larvas analisadas (n)
a
71 (98,6)
Triploides (%)
0,6±0,07
65,2±8,38a
29
a
29 (100,0)
41,3±0,54
0,0
25,0±0,30
65,5±36,99a
0,0
0,0
0,0
0 (0,0)
64,6±36,81a
0,0c
66
b
0 (0,0)
Letras diferentes na mesma linha indicam diferença estatisticamente
significante no teste do qui-quadrado (p<0,05) seguido pela análise de
partição.
9. DISCUSSÃO
As temperaturas avaliadas neste estudo, nos tratamentos 37 ºC e
39 ºC, estão no limite da temperatura letal para incubação de ovos de
jundiá. No entanto no tratamento 41 ºC a temperatura ultrapassou o
limite tolerado pela espécie pois os ovos se tornaram inviáveis.
Considerando a sobrevivência e a percentagem de larvas anormais,
podemos concluir que o número de larvas viáveis foi severamente
diminuido em função da temperatura. Tiwary et al. (2004) afirmaram
que a temperatura que implica em melhores resultados são aquelas
próximas a temperatura letal. As temperaturas de indução à triplóidia
analisadas neste estudo, são muito próximas e com resultados diferentes,
por isso se faz necessário avaliar a duração dos choques em estudos
futuros.
De acordo com Nam et al. (2004), a combinação choques quente
e frio em sequência diminui as taxas de sobrevivência, mas por ser um
tratamento muito traumático aumenta a porcentagem de poliploides. No
entanto, outros estudos com jundiá apresentaram bons resultados após
choque quente ou frio. Vozzi et al. (2003) observaram taxas de
fertilização em 65,4 ± 3,1%, sobrevivência de 33,4% e 74,8% em
triploidia, depois de induzir a triploidia com choque quente a 36° C
durante 5 min, resultado semelhante ao nosso estudo, a 37 °C durante 2
min, seguido de 1 °C por 20 min. Em outro estudo realizado com jundiá
por Silva et al. (2007) após choque frio de 4 °C, 3 min após a
39
fertilização por um período de 20 min, resultou em 97,9 ± 1,16% de
triplóides, com taxa de sobrevivência de 65,4 ± 5,34%. Huergo &
Zaniboni-Filho (2006), utilizando o choque de pressão hidrostática, 2
min pós-fertilização submeteram os ovos a pressão de 5000 psi durante
5 min, obtiveram 100% de triploides, porém apresentaram baixa taxa de
sobrevivência (20,5%). Percentual de larvas de anormais foi maior em
nosso estudo, quando comparado com Vozzi et al. (2003) e Silva et al.
(2007). Resultados semelhante aos nossos também foi observado por
Huergo & Zaniboni-Filho (2006), usando choque de pressão
hidrostática.
A temperatura do choque térmico quente afetou
significativamente o desenvolvimento embrionário, inviabilizando os
ovos submetidos à temperatura de 41 ºC. A taxa média de fertilização,
deformação embrionária e eclosão foi diferente para cada temperatura
testada, chegando a ser letal a 100% dos embriões na temperatura de 41
ºC (Tabela 1).
As taxas de deformação embrionária encontradas no choque de
térmico a 37 ºC foram maiores que as encontradas por Vozzi et al.
(2003) e Silva et al. (2007), e inferiores as encontradas por Huergo e
Zaniboni Filho (2006) usando choque de pressão hidrostática. Esta taxa
de deformação acentuada está associada à interação dos choques quentes
e frio, bem próximo ao limite letal suportado pela espécie. Silva et al.
(2007) comparando os resultados do choque térmico quente com o
choque frio, observaram que o choque frio deve ser aplicado em um
tempo mais longo pós-fertilização, pois a temperatura baixa da água,
provoca um atraso na velocidade da meiose. Neste estudo, apesar de não
existir diferença significativa entre as temperaturas, pode-se notar que a
associação de choques (quente e frio) produziu uma taxa de triploides de
98,61% na temperatura a 37oC e de 100% na temperatura 39oC.
A indução a triploidia por choque térmico também foi bem
sucedida no bagre (Clarias macrocephalus) submetidos a choque frio 4
ºC por 15 min. Nestas condições foram obtidos animais triplóides com
poucas deformidades e maior sobrevivencia em comparação com
criação diplóides (Fast et al., 1995). Pradeep et al. (2012) observaram
que o choque térmico quente (41 ºC por 3,5 min) em tilápia vermelha
(Oreochromis mossambicus) resultou em 67% de sobrevivência das
larvas e 89,7% triploidia. No entanto, o choque frio (9 ºC durante 30
min) mostrou 98,7% triploidia e 75% de sobrevivência das larvas em
tilápia vermelha (Peruzzi et al., 2007; Pradeep et al., 2014).
Embora seja inovador e produzir alta porcentagem de triplóides,
até 100% de peixes triploides, a taxa de sobrevivência diminuiu
40
significativamente. Portanto, outros procedimentos alternativos são
necessários para determinar as melhores temperaturas e duração do
choque térmico, e com isso otimizar a eficiência deste método afim de
conseguir populações triplóides para cultivo em grande escala.
10. REFERÊNCIAS
Amaral Junior, H. 2007. Manual de reprodução de peixes de água doce
com cultivo comercial na região Sul do Brasil. Florianópolis, Epagri,
Boletim Técnico 136: 53.
Baldisserotto, B. & Radünz Neto, J. 2004. Criação de jundiá. Santa
Maria, Universidade Federal de Santa Maria, 232p.
Basavaraju, Y., Mair, G.C., MohanKumar, H.M., Pradeep Kumar, S.,
Keshavappa, G.Y., Penman, D.J. 2002. An evaluation of triploidy as a
potential solution to the problem of precocious sexual maturation in
common carp, Cyprinus carpio, in Karnataka, India. Aquaculture, 204
(3-4): 407-418.
Benfey, T.J. & Sutterlin, A.M. 1984. Triploidy induced by heat shock
and hydrostatic pressure in land locked Atlantic salmon (Salmo salar
L.). Aquaculture, 36(4): 359-367.
Cesar, M.P., Murgas, L.D.S., Araújo, R.V., Drummond, C.D. 2004.
Método para obtenção de população monosexo na piscicultura. Lavras,
Universidade Federal de Lavras, Boletim agropecuário 69, 27p.
Chiasson, M.A., Pelletier, C.S. & Benfey, T.J. 2009. Triploidy and fullsib family effects onsurvival and growth in juvenile Arctic charr
(Salvelinus alpinus). Aquaculture, 289(3-4): 244-252.
Chippari-Gomes, A.R., Gomes, L.C. & Baldisserotto, B. 1999. Lethal
temperature for silver catfish, Rhamdia quelen, fingerlings. Journal of
Applied Aquaculture, 9(4): 11-21.
Chourrout, D. 1987. Genetic manipulations in fish: review of methods,
p.111-126. In: K. Tiews (Ed.), Selection, Hybridization and Genetic
Engineering in Aquaculture, Schriften der Bundesfor-schungsanstaltfür
Fischerei, Heenemann, Berlin.
41
Cotter, D., O’Donovan, V., O’Maoiléidigh, N., Rogan, G., Roche, N. &
Wilkins, N.P. 2000. An evaluation of use of triploid Atlantic salmon
(Salmo salar L.) in minimizing the impact of escaped farmed salmon on
wild populations. Aquaculture, 186(1-2): 61-75.
Fanjul, L.C. & Toro, M.A. 1991. Mejora genética de peces y moluscos.
Madrid, Mundi Prensa. 110 p.
Fast, A.W.; Pewnim, T.; Keawtabtim, R.; Saijit, R.; Te, F.T. &
Vejaratpimol, R. 1995.Comparative Growth of Diploid and Triploid
Asian Catfish Clarias macrocephalus in Thailand. Journal of the World
Aquaculture Society, 26(4): 390-395.
Foresti, F.P. & Foresti, F. 2004. Genética e biotecnologia em
piscicultura: usos na produção, manejo e conservação dos estoques de
peixes,p. 195-215. In: J.E.P. Cyrino, E.C. Urbinati, D.M. Fracalossi& N.
Castagnolli (Eds.). Tópicos especiais em piscicultura de água doce
tropical intensiva. São Paulo, Sociedade Brasileira de Aquicultura e
Biologia Aquática, TecArt, 533 p.
Fracalossi, D.M., Meyer, G., Santamaria, F.M.,Weingartner, M. &
Zaniboni-Filho, E. 2004. Desempenho do jundiá, Rhamdia quelen, e do
dourado, Salminus brasiliensis, em viveiros de terra na região sul do
Brasil. Acta Scientiarum Animal Science, 26(3): 43-49.
Garcia, S., Amaral Junior, H., Souto, L.I.M., Warmiling, P.F., Bernardes
Junior, J.J. 2013. Cultivo mono sexo de jundiá Rhamdia quelen. p. 3241. In: S. Garcia & H. Amaral Junior (Eds.). O Jundiá Rhamdia quelen:
Relatos de avanços no cultivo do peixe de água doce nativo mais
promissor da região sul do Brasil. Camboriú, EPAGRI, Gráfica Delta,
106 p.
Gillet, C.; Vauchez, C. & Haffray, P. 2001. Triploidy induced by
pressure shock in Arctic charr (Salvelinus alpinus): growth, survival and
maturation until the third year. Aquatic Living Resources, 14(5): 327334.
Huergo, G.M. & Zaniboni-Filho, E. 2006. Triploidy Induction in Jundiá
(Rhamdia quelen, Quoy & Gaimard 1824) through hydrostatic pressure
shock. Journal of Applied Aquaculture, 18(4): 45-57.
42
Lamatsch, D.K.,Steinlein, C., Schmid M. & Schartl, M. 2000. Non
invasive determination of genome size and ploidy level in fishes by flow
cytometry: detection of triploid Poecilia formosa. Cytometry, 39(2): 9195.
Le Comber, S.C. & Smith, C. 2004. Polyploidy in fishes: patterns and
processes. Biological Journal of the Linnean Society, 82 (4): 431-442.
Lozano, R, Ruiz, C. & Ruiz, M. 1987. Manipulación cromosómica en
organismos acuáticos. p. 215-246. In: Espinosa De Los Monteros, J. &
Labarta, U. (Eds.). Genética en acuicultura, Madrid, CAYCIT. 274 p.
Lutz, C.G. 2001. Practical Genetics for Aquaculture. Oxford, WileyBlackwell, 252 p.
Melo, D.C., Oliveira, D.A.A., Sousa, A.B., Carvalho, D.C., Seerig, A.S.,
Crepaldi, D.V., Teixeira, E.A., Ribeiro, L.P. & Faria, P.M.C. 2006.
Manipulação cromossômica: aplicações práticas na aquacultura. Revista
Brasileira de Reprodução Animal, 30: 105-112.
Nam, Y.K., Cho, G.C. & Kim, D.S. 2004. An efficient method for
blocking the 1st mitotic cleavage of fish zygote using combined thermal
treatment, exemplified by mud loach (Misgurnus mizolepis).
Theriogenology, 61(5): 933-945.
Peruzzi, S., Kettunen, A., Primicerio, R., & Kaurić, G. (2007). Thermal
shock induction of triploidy in Atlantic cod (Gadus morhua
L.). Aquaculture Research, 38(9), 926-932.
Piferrer, F., Beaumont, A., Falguière, J. C., Flajshans, M., Haffray, P. &
Colombo, L. 2009. Polyploid fish and shellfish: Production, biology and
applications to aquaculture for performance improvement and genetic
containment. Aquaculture, 293:125-156.
Pradeep, P.J., Srijaya, T.C., Bahuleyan, A., Renjithkumar, C.R., Jose,
D., Papini, AChatterji, A.K. 2012. Triploidy induction by heat-shock
treatment in red tilapia. Caryologia, 65(2): 152-156.
Pradeep, P.J., Srijaya, T.C., Hassan, A., Chatterji, A.K.,
Withyachumnarnkul, B. & Jeffs, A. 2014. Optimal conditions for coldshock induction of triploidy in red tilapia. Aquaculture International,
22(3): 1163-1174.
43
Preston A.C., Taylor, J.F., Craig, B., Bozzolla, P., Penman, D.J. &
Migaud H. 2013. Optimization of triploidy induction in brown trout
(Salmo trutta L.). Aquaculture, 414-415: 160-166.
Qin, J.G., Fast, A.W. & Ako, H. 1998. Growo ut performance of
diploid and triploid Chinese catfish Clarias fuscus. Aquaculture,166(34): 247-258.
Ribolli, J. & Zaniboni-Filho, E. 2009. Individual contributions to
pooled-milt fertilizations of silver catfish Rhamdia quelen. Neotropical
Ichthyology, 7(4): 629-634.
Rizzo, E., Godinho, H.P., Sato, Y. 2003. Short-term storage of oocytes
from the neotropical teleost fish Prochilodus marggravii.
Theriogenology, 60(6): 1059-1070.
Rougeot, C., Minet, L., Prignon, C., Vanderplasschen, A., Detry, B.,
Pastoret, P.P., Mélard, C. 2003. Induced triploidy by heat shock in
Eurasian perch, Perca fluviatilis. Aquatic Living Resources, 16(2): 9094.
Silfvergrip, A.M.C. 1996. A systematic revision of the Neotropical
catfish genus Rhamdia (Teleostei, Pimelodidae). Dissertation (Master in
Zoology), Stockholm University, Stockholm, 156 pp. 1996.
Silva, F.S.D., Moreira, R.G., Orozco-Zapata, C.R., Hilsdorf, A.W.S.
2007. Triploidy induction by cold shock in the South American catfish,
Rhamdia quelen (Siluriformes) (Quoy & Gaimard, 1824). Aquaculture,
272:110-114.
Silveira, F.S. 2014. Desempenho da aquicultura, p. 204-208. In. Síntese
anual de agricultura de santa Catarina 2014, Florianópolis,
EPAGRI/CEPA.
Tabata, Y.A.; Rigolino, M.G.; Tsukamoto, R.Y. 1999. Production of
all female triploid rainbow-trout, Oncorhynchus mykiss (Pisces,
Salmonidae). III – Growth up to first sexual maturation. Boletim do
Instituto de Pesca, 25: 67-76.
Tebaldi, P.C. & Amaral Junior, H. 2009. Production of tetraploid nile
tilapia (Oreochromis niloticus) by the application of thermal shock.
Revista electrónica de Veterinaria, 10 (10). Available online at:
44
http://www.veterinaria.org/revistas/redvet/n101009/100908.pdf
[Acessed: Aug. 2014].
Tiwary, B.K., Kirubagaran, R. Ray, A.K. 2004. The biology of triploid
fish. Reviews in Fish Biology and Fisheries 14(4): 391-402.
Vozzi, P.A.; Sanchez, S.; Permingeat, E.D. 2003. Inducción de triploidia
em Rhamdia quelen. Boletim do Instituto de Pesca, 29(1) 87-94.
Woynarovich, E. & Horvath, L.A. 1983. A propagação artificial de
peixes de águas tropicais: Manual de extensão. Brasilia,
FAO/CODEVASF/CNPq, Documento Técnico sobre Pesca 201. 225p.
Wirtz S. & Steinmann P. 2006. Sperm characteristics in perch Perca
fluviatilis L. Journal of Fish Biology, 68(6): 1896-1902.
Wolters, W.R., Libey, G.S., Chrisman, C.L. 1982. Effect of triploidy on
growth and gonad development of channel catfish. Transactions of
American Fisheries Society, 111: 102-105.
Zaniboni-Filho, E. 1992. Incubação, larvicultura e alevinagem do
tambaqui (Colossoma macropomum Cuvier 1818). Thesis (PhD in
Ecology), Federal University of São Carlos, São Carlos, SP, Brazil, 202
pp. 1992.
Zar, J. H..Biostatistical analysis. New Jersey, Prentice Hall. 2010, 944p.
45
CAPÍTULO III
Tetraploidia em Rhamdia quelen (Actinopterygii,
Heptapteridae) por choque térmico quente e frio sequencial
Silvano Garcia1,2 e Evoy Zaniboni Filho1
1
Programa de Pós-Graduação em Aquicultura, Centro de
Ciências Agrárias, Departamento de Aquicultura, Universidade
Federal de Santa Catarina. Rodovia Admar Gonzaga 1346,
8803-001 Florianópolis, SC, Brazil.
[email protected], [email protected].
2
Campo Experimental de Piscicultura de Camboriú, Empresa
de Pesquisa Agropecuária e Extensão Rural de Santa Catarina.
Rua Joaquim Garcia S/N, 88340-000 Camboriú, SC, Brasil.
*Artigo será submetido ao periódico Neotropical Ichthyology
46
11. RESUMO
O objetivo desteexperimento foi avaliar a eficiência do choque térmico
duplo (quente seguido do frio) para induzir a tetraploidia emjundiá
Rhamdia quelen em diferentes tempos pós-fertilização. Paraidentificar o
melhor momento para aplicação dos choques,foram avaliadas as taxas
de fertilização, de eclosão, de sobrevivência larval e quantificadas as
larvas que sofreram alteração de ploidia.Foram selecionadas vinte
femeas (730 ± 68g) e 8 machos (614 ± 49g). Para viabilizar os
procedimentos durante o experimento as fêmeas foram induzidas por
dose única (5mg.kg-1), com intervalo de 90 min entre cada tanque
rede.O experimento consistiu em submeter 20 mL de ovócitos
fertilizados (1392,35±22,17)de Rhamdia quelen a (10, 15, 20, 25, 30 e
35 minutos pós-fertilização - mpf) a choque térmico quente (39±0,2ºC)
durante 3 min, seguido por choque térmico frio (1,0±0,1ºC) durante 30
min. O choque térmico quente foi realizado emcaixa de isopore
cadatempo pós-fertilização representou um tratamento. Um grupo
controle foi fertilizado sem sofrer nenhum choque térmico. As taxas de
fertilização ede eclosãoforam medidas na fasede gástrulatardia (12 hpósfertilização -hpf) e 30hpf,respectivamente.Decorridas 60hpf, 25larvasde
cada unidade experimentalforam fixadasem metanol com ácido
acético,para verificação da ploidiapor citometria de fluxo.A taxa de
fertilização do tratamento controle foi 87,83%, enquanto que os
tratamentos apresentaram valorese de 23,4% 28,5%, 30,4%, 20,0%,
30,3%, 36,7%, para os tempos de 10, 15, 20, 25, 30, 35 mpf,
respectivamente. Foram encontradas larvas tetraplóides apenas nos
grupos submetidos aos tratamentos realizados a 15 mpf e 20 mpf, sendo
observadas três e duas larvas em cada tratamento, respectivamente. Esse
é o primeiro trabalho bem sucedido na produção de jundiás tetraplóides
através de choque quente e frio sequencial, abrindo possibilidades para o
aperfeiçoamento dessa técnica objetivando a produção em larga escala.
Palavras-chave:
poliploidia.
Jundiá,
tetraploide,
choque
de
temperatura,
47
12. ABSTRACT
Current assay assessed the efficiency of a dual thermal shock (heat
shock followed by a cold one) to induce tetraploidy in the jundiá
(Rhamdia quelen) at different post-fertilization time. The best moment
to apply the shocks was evaluated by measuring the fertilization rate,
eclosion rate, larvae survival rate and the success in theploidy changes.
Fifteen females (730 ± 68g) and8 males (614 ± 49g) were selected. The
females were induced by a single dose (5mg.kg-1) of the carp pituitary
gland at 90-min intervals between each cage. Assay comprised the
submission of 20 mL of fertilized oocytes (1392.35 ± 22.17) of R.
quelen at 10, 15, 20, 25, 30 and 35 minutes post-fertilization (mpf) to a
heat thermal shock (39 ± 0.2ºC) for 3 minutes, followed by a cold
thermal shock (1.0 ± 0.1ºC) for 30 minutes. Heat thermal shock was
undertaken in styrofoam boxes and each treatment consisted of one
post-fertilization period. Control group was fertilized without any
thermal shock. Fertilization and eclosion rates were measured at the late
gastrula phase (12 h post-fertilization - hpf) and at 30 hpf, respectively.
At 60 hpf, 25 larvae of each experimental unit were fixed in methanol
with acetic acid to verify ploidy per flow cytometry. Fertilization rate
reached 87.83% in control treatment and was 23.4% 28.5%, 30.4%,
20.0%, 30.3% and 36.7%, respectively for treatments 10, 15, 20, 25, 30
and 35 mpf. Tetraploid larvae were only found in the groups submitted
to thermal shock at 15 and 20 mpf (three and two larvae, respectively).
For the first time tetraploids of jundia was produced using simultaneous
heat and cold shocks were employed, opening opportunities to improve
its suitability for large-scale tetraploid larvae production.
Keywords: jundiá, tetraploidy, heat thermal shock, poliploidy.
48
13. INTRODUÇÃO
O jundiá Rhamdia quelen é um bagre nativo da América do Sul
que apresenta grande potencial para a aquicultura na região Sul do
Brasil. É um animal rústico que apresenta rápido crescimento, tolera
variação de temperatura e se reproduz com facilidade. Entretanto, ocorre
um declínio na taxa de crescimento quando os peixes atingem a
maturidade sexual, quando passam a desviarparte da energia para o
processo reprodutivo, fato que é agravado nos machos devido a
precosidade da maturação gonadal (Fracalossi et al., 2004; Baldisserotto
& Radunz-Neto, 2004, Huergo& Zaniboni-Filho, 2006). Isto
proporciona um crescimento desuniforme, aumentando a necessidade de
manejo e os custos de produção, além de prolongar o ciclo de cultivo
(Garciaet al., 2013).
Uma das técnicas utilizadas para mitigar o problema decorrente
do crescimento desuniforme é a triploidia, a forma de manipulação
cromossômica mais comumente usada na aquicultura. Um dos maiores
interesses na produção de peixes triplóides está relacionado à
esterilidade gonadal (Fanjul e Toro, 1991; Kusunokiet al., 1994; Melo et
al., 2006; Huergo & Zaniboni Filho, 2006;Turra et al., 2012; Preston et
al., 2013).
Apesar das vantagens dos indivíduos triploides, a indução à
triploidia está frequentemente associada à ocorrência de altas taxas de
mortalidade. Além disso, a intensidade do choque pode possibilitar a
ocorrência de deformações (Mello et al., 2006). Outra dificuldade da
técnica de triploidização direta consiste na identificação dos triplóides,
já que são peixes fenotipicamente idênticos aos diplóides e as técnicas
de análise utilizadas para identificação da ploidia são pouco precisas ou
onerosas(Vozzi et al., 2003; Silva et al., 2007).
Peixes triploides também podem ser obtidos pelo cruzamento
interespecífico (triploidia híbrida), obtido pelo cruzamento de fêmeas
tetraplóides e machos diplóides, originando triplóidesinterplóides. Esse
procedimento evita os efeitos deletérios dos choques físicos aplicados
diretamente sobre os ovos e além disso os animais tetraploides poderão
ser usados a cada ciclo reprodutivo (Lozanoet al., 1987; Chourrout,
1987; Cesar et al., 2004; Piferrer et al., 2009; Tebaldi & Amaral Junior,
2009).
Sendo assim, a tetraploidiaé uma alternativa para superar estas
dificuldades observadas na produção de peixes triplóides. Os
tetraplóides podem ser originados pelo choque aplicado em um zigoto
diplóide, no momento da primeira clivagem. (Onozato e Zhang, 2004).
49
O choque deve acontecer no momento exato em que o cromossomo
tenha sido duplicado e o núcleo do zigoto esteja próximo a se dividir. O
choque aplicado impede a divisão celular e nuclear, portanto, resulta em
núcleos zigóticos com quatro conjuntos de cromossomos (Hong, 1990;
Diter et al. 1993; Le Comber & Smith, 2004).
Poucos casais de peixes tetraplóides maduros e férteis são
suficientes parainiciar um programa de melhoramento genético
orientado a aumentar a população de uma forma planejada, reduzindo o
risco de endogamia (Gui et al., 1991; Ávila, 2004).
Geraçãodelinhagenstetraplóidesfuncionaiséumpré-requisito
paraaprodução em massadeprogêniestriplóides (Chourrout et al., 1986).
Desdeadécada de 1980,váriastentativas foram feitaspara induzira
tetraploidia de peixes, tais como:salmonídeos,ciprinídeose e ciclídeos.
Tetraplóidesviáveis
foram
obtidosemalgumas
espécies,
por
exemplo:Misgurnus
anguillicaudatus,(Arai,1991);Cobitis
biwae,
(Kusunokiet al.,1994); Carassius Auratus langdorfii, (Kobayashi,1971;
Cherfaset al, 1994).Tetraploides emsalmonídeos, foram obtidos por
Chourrout et al.(1986), Blancet al.(1987) e Horstgen-Schwark (1993).
Destestetraploides,
progênies
comdiferentes
ploidias
foram
geradosapenas
emMisgurnus
anguillicaudatus.
Ocorrência
naturaldetetraploidefoi relatada poralgunspesquisadores em espécies tais
como: Barbus sp., (Agneseet al. 1990);Clarias batrachus, (Pandey e
Lakra1997);Fossilis heteropneustes, (Pandian e Koteeswaran1998)
Inúmeras
tentativas
de
utilizar
o
choque
térmicoúnico(Thorgaardet
al.,
1981;
Diter
et
al.,
1993)parabloquearaprimeira
clivagemmitóticaempeixes
foram
realizadas. No entanto, salvo raras exceções, as taxas de tetraploidia,
sobrevivência e rendimento larval foram baixas (Flajshanset al., 1983;
Weber et al., 2012).
Para otimizar a produção de tetraplóides, um protocolo para a
induçãoa
tetraploidia,
bloqueando
aprimeira
divisão
mitoticacomumacombinaçãodechoque térmico quente de curta duração,
seguidoporchoque térmico friode longa duração foi desenvolvido por
Nam et al. (2004).Considerando o bom desempenho do protocolo de
duplo choque térmico em outras espécies de peixes para induzir a
tetraploidia, o presente estudo teve como objetivo determinar o intervalo
de tempo em que a aplicação do choque térmico duplo (quente seguido
de frio) é necessária para a produção de larvas tetraploides de jundiá.
50
14. MATERIAL E MÉTODOS
O experimento foi realizado no Campo Experimental de
Piscicultura de Camboriú, da Empresa de Pesquisa Agropecuária e
Extensão Rural de Santa Catarina (EPAGRI) e no Centro de Pesquisa e
Gestão de Recursos Pesqueiros Continentais (CEPTA) conveniado com
a Universidade de São Paulo (USP).
14.1 Reprodução
Para o experimento foram selecionados peixes maduros e aptos à
reprodução, dentre as as fêmeas, aquelas que apresentavam região
peritoneal avolumada e papila entumecida, e machos que liberavam
sêmen com leve pressão abdominal (Gomes et al., 2000;Amaral Junior,
2007). Foram selecionadas 15 fêmeas (730 ± 68g)(peso médio ± desvio
padrão) e 8 machos (614 ± 49g). Os peixes selecionados foram
distribuídos em hapas de 0,5m3 (3 hapas com 5 fêmeas cada e 8 machos
em uma única hapa). As hapas foram instaladas em um tanque de
concreto de 2,5m3, com aeração constante (oxigênio dissolvido superior
a 6 mg.L-1) e temperatura da água de 25,0±0,3°C. Somente as fêmeas
foram induzidas à desova, utilizando a aplicação de uma dose única de
5mg.kg-1de extrato de pituitária de carpa (Woynarovich & Horvath,
1983; Amaral Júnior, 2007).
Para viabilizar os procedimentos necessários para o manejo dos
gametas durante o experimento, as fêmeas foram induzidas com um
intervalo de 90 min entre cada lote de cinco fêmeas (hapas). Os ovócitos
foram coletados por extrusão à seco aproximadamente 10 h após a
indução hormonal, sendo recolhidos em um recipiente para análise e
posterior fertilização. As desovas cujos ovócitos aparentavam boa
qualidade, ou seja, coloração homogênea e translúcida, tamanho
homogêneo e túrgidos foram selecionadas.
O sêmen foi coletado com uma leve pressão abdminal
diretamente sobre os ovócitos, homogenizado e, em seguida, os gametas
foram ativados utilizando a água do tanque de incubação. Para estimar a
quantidade de ovos, uma aliquota (0,5 g) de cada desova foi coletada e
fixada em formalina a 4% para posterior contagem do número de ovos
(Wirtz & Steinmann, 2006), tendo sido obtido o valor médio
de1.356±78 ovócitos.g1. Após condução dos trabalhos, uma parte do
lote de peixes foi depositada no Museu de Zoologia da Universidade
Federal do Rio Grandedo Sul ( voucher UFRGS 18258, UFRGS 18259,
UFRGS 18260).14.2 Delineamento e Procedimentos de tetraploidização
51
O experimento consistiu em submeter ovos de Rhamdia quelen
recém-fertilizados (em diferentes tempos da fertilização: 10, 15, 20, 25,
30 e 35 minutos pós-fertilização - mpf) a um choque térmico quente
(39±0,2ºC) durante 3 min (Nam et al., 2004), seguido por choque
térmico frio (1,0±0,1ºC) durante 30 min (Vozzi et al., 2003). Dessa
forma, foram testados seis tratamentos que consistiam na variação do
tempo pós-fertilização que foi iniciado o choque térmico, além de um
tratamento controle que não foi submetido a choque de temperatura. O
choque térmico quente foi realizado em caixas de isopor contendo 120
L de água na temperatura prevista, de modo que o grande volume de
água impedisse a variação da temperatura durante o procedimeto. O
choque térmico frio foi realizado em caixa de isopor de 100 L contendo
água e gelo. A temperatura da água para ambos os choques foi
estabilizada momentos antes dos procedimentos. A cada desova e
posterior fecundação, os ovos foram homogenizados e divididos ao
acaso em sete porções iguais (seis tratamentos e um controle). O grupo
controle foi fertilizado e incubado em água à cerca de 25 ºC.
Em cada unidade experimental e no grupo controle, uma amostra
de 20 mL de ovócitos fertilizados (1392,35±22,17) foram distribuídos em
unidades experimentais constituidas por peneiras cônicas de plástico (15,0
cm de diâmetro, malha de 0,4 mm e volume útil de 900 mL) fixadas em
um sistema de incubação composto por placas de isopor. Esse sistema de
incubação foi colocado na superfície de em um tanque de concreto com
volume útil de 2.500 L mantido com aeração constante, visando manter os
ovos em movimento dentro das peneiras. A temperatura foi mantida em
25,0±0,3ºC, o oxigênio dissolvido em 6,8±0,7 mg.L-1e o pH 7,8±0,5, com
valores mensurados diariamente com uma sonda multiparâmetro (YSI
556®). O experimento foi repetido três vezes no tempo (três desovas) e
realizadas com intervalo de 90 min entre elas.
A taxa de fertilização dos ovos de cada unidade experimental foi
avaliada na fase de gástrula tardia (12 h pós-fertilização - hpf) em uma
amostra de 260 embriões (Zaniboni-Filho, 1992; Rizzo et al., 2003).
A taxa de eclosão foi estimada em 30 hpf. Decorridas 60 hpf, 25
larvas ou as sobreviventers, de cada unidade experimental foram fixadas
em metanol com ácido acético (3 partes de metanol: 1 parte ácido
acético) para a confirmação da ploidia por citometria de fluxo. Para a
análise por citometria de fluxo, foi utilizado o kit Cystain (Partec Gmbh,
Alemanha). Nesse procedimento, cada larva foi lisada em 120 µL de
solução A(kit Cystain), para isolar os núcleos, e em seguida os núcleos
foram corados com 1,5 mL de solução DAPI (4,6-diamidino-2fenilindole). A suspensão resultante foi então filtrada numa malha de 30
52
µm (Celltrics, Partec Gmbh, Alemanha) e o filtrado que mantém o
conteúdo de DNA é mensurado por um citômetro de fluxo (Partec Cy
Flow Ploidy Analyzer, Partec Gmbh, Alemanha).
O citômetro foi calibrado com um padrão contendo células
diploides de jundiá, e utilizou-se ainda células somáticas de lambari
Astyanax altiparanae, como controle durante as análises de citrometria
de fluxo. A triploidia foi validada para indivíduos que apresentaram
conteúdo de DNA 50% maior que a dos diplóides (Lamatsch et al.,
2000) e o conteúdo de DNA correspondente foi expresso em
histogramas (Figura 2).
14.3 Análises estatística
Os dados da taxa de fertilização e de eclosão larval foram
submetidos ao teste de Levene para avaliar a homocedasticidade dos
dados. Posteriormente, foi realizada análise de variância unifatorial, e
quando necessário, foi feita a separação de média pelo teste SNK. Todas
as análises utilizaram um nível de significância de 5%. (Zar, 2010)
2n
4n
8n
Figura 2- Histograma de citometria de fluxo de larva de jundiá
Rhamdia quelen, submetida a choque térmico (quente e frio) sequencial,
para induzir a tetraploidia. Seta indica pico referente ao controle 2n que
foi utilizada jutamente com as amostras tetraplóides.
53
15. RESULTADOS
A taxa de fertilização e a eclosão larval foram maiores nos
embriões do tratamento controle do que nos demais tratamentos. Dentre
os peixes submetidos aos choques térmicos duplo, os que apresentaram
maiores taxas de fertilização e eclosão foram aqueles submetidos ao
choque 35 minutos pós-fertilização (mpf), enquanto que os submetidos
ao choque 25 mpf foram os que apresentaram as menores taxas de
fertilização (Figura 3A e 3B).
A sobrevivência das larvas 60 horas após a eclosão foi idêntica
entre os tratamentos, com valor inferior ao verificado no tratamento
controle (Tabela 2). O valor médio da taxa de sobrevivência das larvas
entre todos os tratamentos representa apenas 2,71% do valor obtido no
tratamento controle, confirmando a nocividade dos choques térmicos
aplicados na sobrevivência das larvas.
54
Taxa de fertilização
A
100
a
100
80
80
60
40
b
bc
bc
bc
c
%
%
60
40
c
20
20
0
10
15
20
25
30
35
Controle
mpf
100
Eclosão larval
a
B
80
%
60
b
40
20
cd
c
cd
d
cd
b
10
15
20
25
30
35
0
35
cd
0
Controle
A
Ecl
a
Controle
mpf
Figura 3 –Valores médios das taxas de fertilização (A) e de eclosão (B)
dos tratamentos submetidos ao choque térmico em diferentes períodos
de tempo depois da fertilização (em minutos pós-fertilização – mpf) e do
grupo controle.
Os tratamentos que a sobrevivência nao atigiu o número mínimo
de 25 larvas, foram usados todas as larvas sobreviventes para a análise
de verificação de ploidia por citometria de fluxo, além de 25 larvas do
grupo controle. Alem disso, houve dificuldade para extração do DNA
das larvas, devido a fixação ter sido feita em solução de metanol com
ácido acético, ocasionando a perda de cerca de 15% das larvas
processadas. Dentre as larvas analisadas, apenas nos grupos submetidos
10
55
ao choque térmico depois de 15 mpf e de 20 mpf é que foram
encontradas larvas tetraplóides (Tabela 2).
Tabela 2 - Número de larvas sobreviventes, larvas analisadas e
quantidade de diplóides (2N) e tetraplóides (3N) encontrados nos
diferentes tratamentos (tempo para indução do choque térmico em
minutos pós-fertilização).
Tratamento Sobrevivência
Larvas
2N
3N
(n)
analisadas
(n)
(n)
10
55
46
46
0
15
67
62
59
3
20
68
54
52
2
25
61
48
48
0
30
55
44
44
0
35
56
51
51
0
Controle
2357
73
73
0
16. DISCUSSÃO
Os valores da taxa de fertilização foram fortemente afetadas pelos
tratamentos com choques térmicos sequencial, independente se o
tratamento foi iniciado entre 10 e 30 minutos pós-fertilização (mpf).
Somente quando esse tempo foi de 35 mpf houve aumento na taxa de
fertilização. O efeito deletério dos choques físicos aplicados sobre os
ovos são conhecidos para diferentes espécies, sendo justificados pela
deformação dos microtúbulos do citoesqueleto na formação do fuso
mitótico(Tabata et al., 1999) ou ainda por desencadearem vários
processos fisiológicos em ovos recém-fertilizados e que são totalmente
desconhecidos, sendo determinados por reações no período
compreendido entre a fertilização e a primeira clivagem (Almeida,
2007).
Embora a aplicação de choques térmicos sequenciais (choque
quente seguido de choque frio) diminua muito a taxa de fertilização e de
eclosão, tem o benefício de aumentar a quantidade de tetraplóides
produzidos (Cherfas et al., 1994). Nam et al. (2004) afirmaram que a
baixa sobrevivencia de larvas tratadas com choques térmicos
sequenciais (quente e frio), quando comparada com a sobrevivencia por
choque térmico único, é compensada pelo aumento do número delarvas
tetraplóides geradas pelo tratamento duplo, que é mais nocivo e mais
56
eficiente. Apesar de ainda desconhecidas as razões que impedem a
primeira clivagematravés dacombinação dechoquestérmicos (quente e
frio sequencial) (Nam et al., 2004), os trabalhos que utilizaram choques
térmicos únicos para induzir a tetraploidia de Misgurnus mizolepis (Nam
et al., 1999; Diter et al., 1993; Malison et al., 1993;Yamazaki e
Goodier, 1993) sempre produziram quantidades inferiores de
tetraplóidesdo que os testes feitos com choques térmicos
sequenciais(Nam et al., 2004).
Para induzir a tretraploidia o choque deve ser aplicado pouco
antes que ocorra a primeira clivagem. Dessa forma, os resultados desse
trabalho indicaram que o choque térmico aplicado aos ovos de jundiá
deve ser iniciado entre 15 mpf e 20 mpf quando incubados em
temperatura de água de 25 ± 0,5ºC oC. Esses foram os únicos
tratamentos que produziram larvas tetraplóides. Considerando que a taxa
metabólica dos peixes é fortemente influenciada pela temperatura da
água, podemos supor que a manutenção de ovos incubados em
temperatura mais baixa amplia o período de tempo em que o choque
térmico deva ser iniciado para induzir a tetraploidia do jundiá, o que
pode melhorar a eficácia da poliploidização. Para isso há necessidade de
conhecer a amplitude térmica tolerável para a incubação dos ovos da
espécie trabalhada, além da cronologia do desenvolvimento
embrionário. Ovos de jundiá incubados a 24ºC eclodiram 26 horas pósfertilização (hpf), enquanto que aqueles incubados a21ºC eclodiram
apenas depois de 43 hpf (Rodrigues-Galdino et al., 2009). Nesse caso,
houve uma ampliação de 65% do tempo necessário para concluir o
desenvolvimento embrionário do jundiá, desde a fertilização até a
eclosão. Esse fato pode ser explorado na realização de novos estudos
que busquem a produção de tetraploides de jundiá, a fim de determinar o
melhor momento e otimizar a produção de tetraplóides.
As taxas de tetraploidias variam muito dependendo da espécie, da
qualidade dos ovócitos e da técnica aplicada (Nam et al., 2004;
Almeida, 2007; Weber e Hostuttler, 2012). Neste trabalho foi possível
estabelecer protocolo que produz larvas tetraploides de jundiá. A
produção de poucos tetraploides já pode ser suficiente para a
implantação de um programa de melhoramento genético(Gui et al.,
1991; Ávila, 2004), quando pode ser produzido progêniestriplóidesem
massa para sua aplicação no setor produtivo (Chourrout et al., 1986).
Esse é o primeiro trabalho bem sucedido na produção de jundiás
tetraplóides através de choque quente e frio sequencial, abrindo
possibilidades para o aperfeiçoamento dessa técnica, objetivando a
produção em larga escala.
57
17. REFERÊNCIAS
Agnese, J.F., Berresi, P., Leveque, C., Guegan, J. F., 1990. Two
lineages, 2n and 4n, demonstrated in African species Barbus
(Osteichthyes, Cyprinidae): on the coding of differential gene
expression. Aquat. Living Resour. 3, 305–311.
Almeida, R.B. de C. 2007. Astyanax altiparanae (Pisces,
Characiformes) como modelo biológico de espécie de peixe para
exploração zootécnica e biomanipulação. Tese de doutorado,
Universidade Estadual Paulista - UNESP, Botucatu, 119 pp
Amaral Junior, H. 2007. Manual de reprodução de peixes de água doce
com cultivo comercial na região Sul do Brasil. Florianópolis, Epagri,
Boletim técnico 136, 53p.
Arai, K. 1991. Genetic improvement of aquaculture finfish species by
chromosome manipulation techniques in Japan. Aquaculture, v.197,
p.205-228,
Avila, M.C., 2004. Indução à tetraploidia em tilápia nilótica
Oreochromis,niloticus, utilizando-se choque térmico/ Mauricio Carrillo
Ávila.—Jaboticabal, 59
Baldisserotto, B. & Radünz Neto, J. 2004. Criação de jundiá. Santa
Maria, Universidade Federal de Santa Maria, 232p.
Blanc, J.M., Chourrout, D., Krieg, F., 1987. Evaluation of juvenile
rainbow trout survival and growth in half-sib families from diploid and
tetraploid sires. Aquaculture 65, 215– 220.
Cesar, M.P.; Murgas, L.D.S.; Araújo, R.V.; Drummond, C.D. 2004.
Método para obtenção de população monosexo na piscicultura. Lavras,
Universidade Federal de Lavras, Boletim agropecuário 69, 27p.
Cherfas, N. B., Gomelsky, B. I., Emelyanova, O. V., Recoubratsky,
A.V. 1994. Induced diploid gynogenesis and polyploidy in the crucian
carp Carassius auratus gibelio (Bloch) common carp Cyprinus carpio, L.
Hybrids. Aquaculture Fish Manage, 25, 943– 954.
Chourrout, D. 1987. Genetic manipulations in fish: review of methods,
p. 111-126. In: K. Tiews (Ed.), Selection, Hybridization and Genetic
58
Engineering in Aquaculture, Schriften der Bundesfor-schungsanstaltfür
Fischerei, Heenemann, Berlin.
Chourrout, D., ChecassuS, B., Krieg, F., Happe, A., Burger, G., Renard,
P., 1986. Production of second generation triploid and tetraploid
rainbow trout by mating tetraploid males and diploid females potential
of tetraploid fish. Theriogenology Applicade Genetic 72, 193– 206.
Diter A, Quillet E, Chourrout D. 1993. Suppression of first egg mitosis
induced by heat shocks in the rainbow trout. Journal Fish Biolog,
42:777–86.
Fanjul, L.C. & Toro, M.A. 1991. Mejora genética de peces y moluscos.
Madrid, Mundi Prensa. 110 p.
Flajshans M, Linhart O, Kvasnicka P., 1993. Genetic studies of tench
(Tinca tinca L.): induced triploidy and tetraploidy and first performance
data. Aquaculture;113:301–12.
Fracalossi, D.M.; Meyer, G., Santamaria, F.M.; Weingartner, M.;
Zaniboni Filho, E. 2004. Desempenho do jundiá, Rhamdia quelen, e do
dourado, Salminus brasiliensis, em viveiros de terra na região sul do
Brasil. Acta Scientiarum Animal Scienc 26 (3): 43-49.
Garcia, S., Amaral Junior, H.Souto, L.I.M., Warmiling, P.F. &
Bernardes Junior, J.J. 2013. Cultivo mono sexo de jundiá Rhamdia
quelen. p. 32-41. In: S. Garcia & H. Amaral Junior (Eds.). O Jundiá
Rhamdia quelen: Relatos de avanços no cultivo do peixe de água doce
nativo mais promissor da região sul do Brasil. Camboriú, EPAGRI,
Gráfica Delta, 106 p.
Gomes, L.C., Golombieski, J.I., Gomes, A.R.C. 2000. Biologia do
jundiá Rhamdia quelen (Teleostei, Pimelodidae). Ciência Rural. Santa
Maria, v. 30, n. 1, p.179-185,
Gui, J., Sun, J., Lian G.S., Huang, W., Jiang, Y., 1991. Studies on
genome manipulation in fish: II. Tetraploidy induced by hydrostatic
pressure treatment and a combination of hydrostatic pressure and cold
treatments in transparent colored crucian carp. Hydrobiol. Sin. 15, 333–
342.
59
Hong, Y., 1990. Tetraploidy induced by heat shock in bighead carp,
Aristichthys nobilis. Acta Zool. Sin. 36, 70–75.
Horstgen-Schwark, G., 1993. Initiation of tetraploid breeding line
development in rainbow trout, Oncorhynchus mykiss (Walbaum).
Aquaculture Fish Manage, 24, 641– 652.
Huergo, G. M. & Zaniboni-Filho, E. 2006. Triploidy Induction in Jundiá
(Rhamdia quelen, Quoy & Gaimard 1824) through hydrostatic pressure
shock. Journal of Applied Aquaculture, 18 (4): 45-57.
Kobayashi, H., 1971. A cytological study on gynogenesis on triploid
ginbuna (Carassius auratus langsdorfii). Zool Mag. 80, 316–322.
Kusunoki, T., Arai, K., Suzuki, R., 1994. Production of viable gynogens
without chromosome duplication in thespinous loach Cobitisbiwae.
Aquaculture 119, 11 – 23
Lamatsch, D. K., Steinlein, C., Schmid M. & Schartl, M. 2000. Non
invasive determination of genome size and ploidy level in fishes by flow
cytometry: detection of triploid Poecilia formosa. Cytometry 39(2): 9195.
Le Comber, S. C. & Smith, C. 2004. Polyploidy in fishes: patterns and
processes. Biological Journal of the Linnean Society 82 (4): 431-442.
Lozano, R; Ruiz, C.; Ruiz, M. 1987. Manipulación cromosómica en
organismos acuáticos. p. 215-246. In: Espinosa De Los Monteros, J. &
Labarta, U. (Eds.). Genética en acuicultura, Madrid, Caycit. 274 p.
Malison J.A, Kayes T.B., Held J. A, Barry T.P. Amundson C. H. 1993.
Manipulation of ploidy in yellow perch (Perca flavescens) by heat
shock, hydrostatic pressure shock, and spermatozoa inactivation.
Aquaculture, 110: 229–42.
Malison, J.A., Procarione, L.S., Held, J.A., Kayes, T.B., Amundson,
C.H., 1993. The influence of triploidy and heat and hydrostatic pressure
shocks on the growth and reproductive development of juvenile yellow
perch (Perca flavescens). Aquaculture, 116, 121– 133.
Melo, D.C., Oliveira, D.A. A., Sousa, A.B., Carvalho, D.C. Seerig, A. S.
Crepaldi, D.V. Teixeira, E.A. Ribeiro, L.P., Faria, P.M.C. 2006.
60
Manipulação cromossômica: aplicações práticas na aquacultura. Revista
Brasileira de Reprodução Animal, 30: 105-112.
Nam Y.K., Choi G.C., Kim D.S. 1999. Blocking of the first cleavage in
mud loach (Misgurnus mizolepis). Aquaculture, 12: 167–73.
Nam, Y.K.; Cho, G.C. & Kim, D.S. 2004. An efficient method for
blocking the 1st mitotic cleavage of fish zygote using combined thermal
treatment, exemplified by mud loach (Misgurnus mizolepis).
Theriogenology, 61(5): 933-945.
Pandey, N. and Lakra, W.S (1997). Evidence of Female Heterogamety,
B-Chromosome and Natural Tetraploidy in the Asian catfish, Clarias
batraclus, used in Aquaculture; Aquaculture, 149: 31-3.
Pandian, T.J., Koteeswaran, R., 1998. Ploidy induction and sex control
in fish. Hydrobiologia 384, 167– 243
Piferrer, F., Beaumont, A., Falguiere, J.C. 2009. Polyploid fish and
shellfish: Production, biology and applications to aquaculture for
performance improvement and genetic containment. Aquaculture, 293
125-156.
Preston A.C., Taylor J.F., Craig B., Bozzolla P., Penma N.D.J., Migaud
H., 2013 Optimisation of triploidy induction in brown trout (Salmo
trutta L.) Aquaculture, v 415 p 160–166.
Rizzo, E.; Godinho, H.P.; Sato, Y. 2003. Short-term storage of oocytes
from the neotropical teleost fish Prochilodus marggravii.
Theriogenology 60(6): 1059-1070.
Rodrigues-GaldinoA.M.; Maiolino C.V.; Forgati M., DonattiL.;
MikosJ.D.; Carneiro P.C. F.; Sant’Anna F.R. 2009. Development of the
neotropical catfish Rhamdia quelen (Siluriformes, Heptapteridae)
incubated in differenttemperature regimes. Zygote, v 18 p 131–144.
Silva, F.S.D.; Moreira, R.G.; Orozco-Zapata, C.R.; Hilsdorf, A. W. S.
2007. Triploidy induction by cold shock in the South American catfish,
Rhamdia quelen (Siluriformes) (Quoy & Gaimard, 1824). Aquaculture,
272: 110-114.
61
Tabata, Y.A.; Rigolino, M.G.; Tsukamoto, R.Y. 1999. Production of all
female triploid rainbow-trout, Oncorhynchus mykiss (Pisces,
Salmonidae). III – Growth up to first sexual maturation. Boletim do
Instituto de Pesca, 25: 67-76.
Tebaldi, P.C. & Amaral Junior, H. 2009. Production of tetraploid nile
tilapia (Oreochromis niloticus) by the application of thermal shock.
Revista electrónica de Veterinaria 10. Available online at:
http://www.veterinaria.org/revistas/redvet/n101009/100908.pdf
[Acessed: Aug. 2014].
Thorgaard, G.; Jazwin, M.E.; Stier, A.R., 1981. Polyploidy induced by
heat shock in rainbow trout. Trans. Am. Fish. Soc. 110, 546– 550.
Turra, E.M.; Oliveira, D.A.A.; Valente, B.D. 2012. Estimation of
genetic parameters for body weights of Nile tilapia Oreochromis
niloticus using random regression models. Aquaculture, v.354-355, 3137,
Vozzi, P.A.; Sanchez, S. & Permingeat, E.D. 2003. Inducción de
triploidia em Rhamdia quelen. Boletim do Instituto de Pesca 29(1):8794.
Weber G.M.; Hostuttler M.A. 2012. Factors affecting the first cleavage
interval and effects of parental generation ontetraploid production in
rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) Aquaculture, 344-349: 231–238
Wirtz, S. & Steinmann P. 2006. Sperm characteristics in perch Perca
fluviatilis. Journal of Fish Biology, 68(6): 1896-1902.
Woynarovich, E. & Horvath, L.A. 1983. A propagação artificial de
peixes de águas tropicais: Manual de extensão. Brasilia,
FAO/CODEVASF/CNPq, Documento Técnico sobre Pesca 201. 225p.
Yamazaki F, & Goodier J. 1993. Cytogenetic effects of hydrostatic
pressure treatment to suppress the first cleavage of salmon embryos.
Aquaculture, 110:51–59.
Zaniboni-Filho, E. 1992. Incubação, larvicultura e alevinagem do
tambaqui (Colossoma macropomum Cuvier 1818). Thesis (PhD in
Ecology), Federal University of São Carlos, São Carlos, SP, Brazil, 202
pp.
62
Zar, J.H. 2010. Biostatistical analysis. New Jersey, Prentice Hall. 944p.
63
18. CONCLUSÕES GERAIS E CONSIDERAÇÕES
Nas condições em que foi desenvolvido este trabalho, podemos
concluir que:
- É possivel induzir a triploidia do jundiá (Rhamdia quelen) por
choque térmico (quente e frio em sequência), conseguindo taxas de até
100% de triplóides, apesar disso, a viabilidade para uso dessa técnica em
larga escala ainda fica comprometida devido as baixas taxas de
sobrevivência larval (< 1%).
- Estudos futuros poderão definir uma temperatura ideal para
induzir a triploidia com choques quente e frio em sequência sem reduzir
muito a taxa de sobrevivência larval. Neste trabalho houve elevada
sobrevivência no teste feito a 37 oC, embora com menor taxa de
triploidização, e baixa taxa de sobrevivência quando houve a produção
de larvas 100% triploides, no tratamento feito a 39 oC. Valores
intermediários não foram testados nesse trabalho.
- Foram obtidas larvas tetraploides nos tratamentos iniciados
depois de15 e 20 mpf, quando mantidos numa temperatura de 25± 0,5ºC
o
C. Outras temperatura de incubação poderão ser testadas, assim como
outros valores de temperatura. Neste trabalho, não houve a indução a
tetraploidia quando o choque térmico foi aplicado antes de 15 mpf ou
depois de 25 mpf.
64
65
19. REFERÊNCIAS DA INTRODUÇÃO
AMARAL JUNIOR, H. Manual de reprodução de peixes de água
doce, com cultivo comercial na região Sul do Brasil. Boletim técnico n
136 Florianópolis: Epagri, 2007.
ÁVILA, M.C. Indução à tetraploidia em tilápia nilotica,
Oreochromis niloticus utilizando-se
choque
térmico.2004.(
Dissertação em aquicultura) - Universidade Estadual Paulista. 2004.
BALDISSEROTTO, B. Biologia do jundiá. In: BALDISSEROTTO,
B; NETO, J.R.(Eds) Criação de Jundiá, 1. ed. Santa Maria: Ed.
UFSM, cap. 3, p.67-72,2004.
BASAVARAJU, Y.; MAIR, G.C.; MOHANKUMAR, H.M.;
PRADEEP KUMAR, S.; KESHAVAPPA, G. Y., PENMAN, D. J. An
evaluation of triploidy as a potential solution to the problem of
precocious sexual maturation in common carp,Cyprinus carpio, in
Karnataka, India. Aquaculture, v.204, p.407-418, 2002.
BENFEY, T.J. & SUTTERLIN, A.M. Triploidy induced by heat shock
and hydrostatic pressure in landlocked Atlantic salmon (Salmosalar).
Aquaculture, v. 36, n. 84. p. 359-367, 1984.
CARNEIRO, P.C.F. Jundiá: um grande peixe para a Região Sul.
Panorama da Aquicultura, v. 12, p.41-46, 2002.
CESAR, M.P.; MURGAS, L.D.S.; ARAÚJO, R.V.; DRUMMOND, C.
D. Método para obtenção de população monosexo na piscicultura.
Boletim agropecuário n- 69 Lavras, Minas Gerais, p. 1-27, 2004
CHERFAS, N.B.; HULATA, G.; KOZINSKY, O. Induced diploid
gynogenesis and polyploidy in ornamental (koi) caro, Cyprinus
carpio L. 2. Timing of heat shock during the first cleavage.
Aquaculture, v. 111, p. 281-290, 1993.
CHIPPARI-GOMES, A.R., GOMES, L.C., BALDISSEROTTO, B.
Lethal temperature for silver catfish, Rhamdia quelen, fingerlings.
Journalof Applied Aquaculture, v. 9, p. 11-21, 1999.
66
CHOURROUT, D. Genetic manipulation in fish: selectionh
hybridization and genetic engineering in aquaculture. Berlin:
Heenemann-Varlag, v. 11, 1987.
EL GAMAL, A.A.; DAVIS, K.B.; JENKINS, J.A. Induction of
Triploidy and Tetraploidy in NileTilapia, Oreochromis niloticus).
Journal of the World Aquaculture Society, v.30, p. 269-275, 1999.
ESQUIVEL, B.M. Produção de Jundiá (Rhamdia quelen) em áreas
de entorno do Parque Estadual da Serra do Tabuleiro em Paulo
Lopes. 2005. Tese (doutorado aquicultura) Universidade Federal de
Santa CatarinaFlorianópolis, 2005.
FORESTI, F.P.; FORESTI, F. Genética e biotecnologia em piscicultura:
usos na produção, manejo e conservação dos estoques de peixes. In:
CYRINO, J.E.P. et al. (Eds.). Tópicos especiais em piscicultura de
água doce tropical intensiva. São Paulo: Sociedade Brasileira de
Aqüicultura e Biologia Aquática, cap. 7, p. 195-215,2004.
FRACALOSSI, D.M.; MEYER, G.; MAZZOTI, F.; WEINGARTNER,
M.; ZANIBONI-FILHO, E.Criação do jundiá, Rhamdia quelen, e
dourado, Salminus brasiliensis em viveiros deterra na região Sul do
Brasil. Acta Scientarun., v. 26, n. 3,p. 43-49, 2004.
FUKUSHIMA, H.; BAILONE, R.L.; WEISS, L.A.; MARTINS, M.L.;
ZANIBONI-FILHO, E. Triploidy on the hematology of jundia juveniles
(Siluriformes: Heptapteridae) Brazilian Journal of Biology,
v.72, n.1, 2012.
GARCIA, S.; AMARAL JUNIOR, H.; SOUTO, L.I.M.; WARMILING,
P.F. BERNARDES JUNIOR, J.J. Cultivo mono sexo de jundiá
Rhamdiaquelen. p. 32-41. In: S. GARCIA & H. AMARAL JUNIOR
(Eds.). O Jundiá Rhamdiaquelen: Relatos de avanços no cultivo do
peixe de água doce nativo mais promissor da região sul do Brasil.
Camboriú, EPAGRI, Gráfica Delta, 2013. 106 p.
GOMES, L.C.; GOLOMBIESKI, J.I.; GOMES, A.R.C. Biologia do
jundiá Rhamdia quelen (Teleostei, Pimelodidae).Ciência Rural, v. 30,
n. 1, p. 179-185, 2000.
67
HUERGO, G.M.; ZANIBONI-FILHO, E. Triploidy Induction in Jundiá
(Rhamdia quelen, Quoy & Gaimard 1824) through hydrostatic pressure
shock. Journal of Applied Aquaculture, v. 18, n. 4, p. 45-57, 2006.
HUSSAIN, M.G.; PENMAN, D.J.; MACANDREW, B.J.;
JOHNSTONE, R. Supression of first cleavage in the Nile tilápia.
Oreochromis niloticus L. – a comparison of the relative effectiveness
of pressure and heat shock. Aquaculture,v. 111, p. 263-270, 1993.
LE COMBER, S.C.; SMITH, C. Biological relevance of poliploidy:
ecology to genomics. Biological Journal of the Linnean Society, v. 82,
p. 431-442, 2004.
LOZANO, R.; RUIZ REJÓN, C.; RUIZ REJÓN, M. Manipulación
cromossómica en organismos acuáticos. Editorial Mundi Prensa. 215246 p.1987.
MARCHIORO, M.I. Sobrevivência de alevinos de jundiá (Rhamdia
quelen, Quoy & Gaimard, 1824; Pisces, Pimelodidae) à variação de
pH e salinidade da água de cultivo. 1997. 87 f. Dissertação (Mestrado
em Zootecnia) –Universidade Federal de Santa Maria, 1997.
MELO, D.C.; OLIVEIRA, D.A.A.; SOUSA, A.
Manipulação
cromossômica: aplicações práticasna aquacultura. Revista Brasileira de
Reprodução Animal, v.30, p.105-112, 2006.
MOREIRA, H.L.M.; VARGAS, L.; RIBEIRO, R.P.;
ZIMMERMANN, S.Fundamentos da moderna aquicultura.
Canoas: Ed. Universidade Luterana do Brasil, 2001. 200p.
NAM, Y.K.; CHO, G.C. & KIM, D.S. 2004. An efficient
method for blocking the 1st mitotic cleavage of fish zygote
using combined thermal treatment, exemplified by mud
loach(Misgurnus mizolepis).Theriogenology, 61(5): 933-945.
OLUFEAGBA, S.O.; ALUKO, P.O.; OMOTOSHO, J.S. Effect of
triploidy
on fertility
of African
catfish
Heterobranchus
longifilis(Family: Clariidae). Journal of Fisheries Technology, v.2,
p.43-50, 2000.
68
PÉREZ, J. E. Mejoramiento Genético em Acuícultura. Universidad
de Oriente. Instituto Oceanográfico de Venezuela, 1996.
PIFERRER, F.; BEAUMONT, A.; FALGUIÈRE, J.C.Polyploid fish and
shellfish: Production,biology and applications to aquaculture for
performance improvement and genetic containment.Aquaculture, v.
293 p. 125-156, 2009.
PRADEEP, P.J.; SRIJAYA, T.C.; HASSAN, A.; CHATTERJI, A.K.;
WITHYACHUMNARNKUL, B.; JEFFS, A. Optimal conditions for
cold-shock induction of triploidy in red tilapia. Aquaculture
International, v. 22, n. 3, p. 1163-1174, 2014.
QIN, J.G.; FAST, A.W.; AKO, H. Growout performance of diploid and
triploid Chinese catfish Clariasfuscus. Aquaculture, v. 166, n. 3-4, p.
247-258, 1998.
SHELTON, W.L. Monosex tilapia production through androgenesis.
In: MCELWEE, K.; LEWIS, K.; NIDFFER, M.; BUITRAGO, P. (Eds).
Nineteenth Annual Technical Report. Pond Dynamic/Aquaculture
CRSP, Oregon State University, Corvallis, Oregon, p. 1-9. 2002.
SILFVERGRIP, A.M.C. A systematic revision of the neotropical
catfish genus Rhamdia (Telostei, Pimelodidae). 1996. 157 f. Tese
(Tese de Doutorado).1996.
SILVA, F.S.D.; MOREIRA, R.G.; OROZCO-ZAPATA, C.R.;
HILSDORF, A.W.S.Triploidy induction by cold shock in the South
American catfish, Rhamdiaquelen (Siluriformes) (Quoy&Gaimard,
1824).Aquaculture, v.272, p. 110-114, 2007.
SILVA, L.V.F.; GOLOMBIESKI, J.I.; BALDISSEROTTO, B.
Incubation of silver catfish, Rhamdia quelen (Pimelodidae), eggs at
different calcium and magnesium concentrations. Aquaculture, v. 228,
p. 279-287, 2003.
TABATA, Y.A.; RIGOLINO, M.G.; TSUKAMOTO, R.Y. Production
of all female triploid rainbow-trout, Oncorhynchus mykiss (Pisces,
Salmonidae). III – Growth up to first sexual maturation. Boletim do
Instituto de Pesca v. 25: p. 67-76, 1999.
69
TAVE, D. Chromosomal manipulation. Aquaculture, v. 16 n.1, p. 6265, 1993.
TEBALDI, P.C. & AMARAL, H. Production of tetraploid nile tilapia
(Oreochromis niloticus) by the application of thermal shock. REDVET,
v. 10, n. 10. Revista electrónica de Veterinaria.Disponível on line at:
http://www.veterinaria.org/revistas/redvet/n101009/
100908.pdf
[Acessado em 2014].
THORGAARD, G., JAZWIN, M.E., STIER, A.R. Polyploidy induced
by heat shock in rainbow trout. Transactions of the americam
Fisheries Society, v. 110, p. 546– 550, 1986.
TIWARY, B.K.; KIRUBAGARAN, R.; RAY, A.K. The biology of
triploid fish. Reviews in Fish Biology and Fisheries, v.14, p. 391-402,
2004.
TOLEDO FILHO, S.A.; FORESTI, F.; ALMEIDA TOLEDO, L.F.
Biotecnologia genética aplicada a piscicultura. São Paulo: Cadernos de
Ictiogenética, v. 3, 30, 1996.
TSUKAMOTO, R.Y.; RIGOLINO, M.G. Aplicações da biotecnologia à
aquicultura. In: Encontro Brasileiro de Ictiologia, 10., 1993. São Paulo,:
Universidade de São Paulo, 1993. p.314-338
TURRA, E.M.; OLIVEIRA, D.A.A.; VALENTE, B.D. Estimation of
genetic parameters for body weights of Nile tilapia Oreochromis
niloticus using random regression models. Aquaculture, v. 354-355, p.
31-37, 2012.
VALENTI, R.J. Induced polyploidy in Tilapia aurea (Steindachner) by
means of temperature shock treatment.Journal of fish Biology, v. 7, p.
519–528, 1975.
VOZZI, P.A.; SANCHEZ, S.; PERMINGEAT, E.D. Inducción de
triploidia em Rhamdia quelen. Boletim do Instituto de Pesca, v. 29, n.
1, p. 87-94, 2003.
WEISS, L.A.; ZANIBONI-FILHO, E. Survival of diploid and triploid
Rhamdia quelen juveniles under different oxygen concentrations.
Journal of Applied Aquaculture, v. 22, n. 1, p. 30-38, 2009.
70
ZANIBONI-FILHO, E. Piscicultura das espécies nativas de água doce.
In: POLI, C.R.; POLI, A.T.B.; ANDREATTA, E.R.; BELTRAME, E.
(Eds) Aquicultura: Experiências brasileiras.1. ed., Santa Catarina:
Multitarefa, 2004.
71
20. ANEXOS
Temperatura da água do choque térmico frio (A) no início do
experimento e no final do experimento (B); caixa de isopor contendo
água à temperatura de 1 oC onde foram colocadas a unidades
experimentais durante 30 minutos (C); fogareiro e panela com capcidade
de 60 L onde a água foi aquecida (D).
A
C
B
D
72
Citômetro de fluxo onde foram processadas as análises (A),
amostras fixadas em metanol e ácido acético (B), amostras sendo
filtradas (C), aplicação de enzima (lisina) para extrair o material
genético (D)
A
B
C
D
73
Extrusão de fêmea de jundiá Rhamdia quelen(A), óvulos recemestrusados (B), extrusão de macho de jundiá (C), tanque de concreto de
2,5 m3, contendo placas de isopor, onde foram colocadas as unidades
experimentais (peneiras) (D).
A
B
C
D