MOLECULAR BIOLOGY IN DENTISTRY: CONCEPTS AND TECHNIQUES
FABIANE BORTOLUCI DA SILVA
SIMONE MARIA GALVÃO DE SOUSA
Bióloga especialista em Ciências da Universidade do Sagrado Coração
Professora doutora da disciplina de Patologia Bucal da Faculdade de
Odontologia da Universidade do Sagrado Coração
RESUMO
SUMMARY
A implementação e o desenvolvimento de novas terapias e
métodos baseados nos conhecimentos da biologia molecular
requerem uma reciclagem educacional intensiva dos profissionais das áreas de saúde, entre eles, o cirurgião dentista. Esse
avanço biotecnológico e as mudanças conceituais já estão promovendo modificações positivas na longevidade e na qualidade de vida dos indivíduos. Este trabalho visa abordar os
conceitos, avanços, técnicas e aplicações da biologia molecular
na área da saúde, especificamente na odontologia.
UNITERMOS: BIOLOGIA MOLECULAR – CÂNCER BUCAL – DOENÇA
PERIODONTAL.
The establishment and development of new techniques and
therapies based on knowledge of molecular biology need
an intensive education of the health professionals, such
as, dental clinician. This biotechnological improvements
associated with new concepts are promoting positive
modifications in the longevity and life quality of
population. This study aims to discuss about concepts,
innovations, techniques and application of the molecular
biology in Dentistry.
UNITERMS : MOLECULAR BIOLOGY – ORAL CANCER –
PERIODONTAL DISEASE.
vol. 14 nos 2 jul./dez. 2002
FOL • Faculdade de Odontologia de Lins / UNIMEP
APLICAÇÕES DA BIOLOGIA
MOLECULAR NA ODONTOLOGIA:
CONCEITOS E TÉCNICAS
7
Os avanços na biologia molecular têm
contribuído significativamente para o entendimento da etiologia das doenças humanas.
As técnicas de recombinação dos ácidos
nucléicos têm permitido aos pesquisadores
identificar os vários genes responsáveis por
doenças hereditárias, detectar agentes infecciosos em material biológico, avaliar os mecanismos de infecção dos microrganismos e
conhecer os processos que regulam a diferenciação e proliferação celular (principalmente
neoplasias), entre outros. A biologia molecular
também vem apresentando aplicação bastante expressiva na pesquisa de marcadores genéticos úteis no diagnóstico laboratorial e na
avaliação da predisposição a inúmeras doenças. Por outro lado, as diferenças nas seqüências do DNA observadas entre as espécies ou
entre os indivíduos são extremamente úteis
para a identificação de pessoas. Inegavelmente, os avanços foram inúmeros, contudo, muitas descobertas e importantes aplicações na
área médica ainda devem levar algum tempo
para serem desenvolvidas ou empregadas rotineiramente.9,16
Na área odontológica, a biologia molecular tem proporcionado o diagnóstico precoce da cárie dental, da doença periodontal e
do câncer bucal. Além disso, a saliva atualmente está sendo usada no diagnóstico de
doenças bucais e sistêmicas, e os marcadores
genéticos, aplicados na identificação das demais neoplasias presentes no complexo
maxilofacial.10
Este trabalho visa abordar os princípios
básicos da biologia molecular, seus conceitos,
avanços, técnicas e aplicações na área da saúde, em especial na odontologia.
8
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DNA
E
RNA
AS BASES MOLECULARES DA HEREDITARIEDADE
Os cromossomos são estruturas responsáveis pelo armazenamento, duplicação e
transmissão de material genético. Cada
cromossomo consiste em duas cromátides-irmãs, que são formadas por uma única fita de
DNA associada a proteínas de RNA. O ser
humano possui 23 pares de cromossomos de
tamanhos e formas diferentes. Cada par de
cromossomos tem, normalmente, a mesma
seqüência de genes. Portanto, atuando sobre
cada característica genética, existem dois
genes, ou seja, dois alelos, um em certo
cromossomo e o outro na mesma localização
no seu homólogo. Os genes formam uma seqüência linear ao longo dos cromossomos e
são as unidades que determinam os traços
hereditários.3,9,16
ESTRUTURA DA MOLÉCULA DE DNA
O DNA é um polímero formado por
nucleotídeos. Cada nucleotídeo é composto
por um grupo fosfato, um açúcar e uma base
nitrogenada. As bases nitrogenadas podem ser
de dois tipos: pirimidínicas (citosina e timina)
e púricas (adenina e guanina). Estruturalmente, sempre uma base adenina (A) se liga a uma
timina (T) e uma citosina (C) sempre aparece pareada a uma guanina (G). A molécula
do DNA é muito longa e, se esticada, pode
chegar a dois metros. O DNA é formado por
porções sem função codificante, chamadas
íntrons, e porções com seqüências codificadoras, denominadas éxons. A molécula de
DNA é constituída de duas cadeias de
nucleotídeos que se enrolam, originando a
dupla hélice, e são mantidas unidas por pontes de hidrogênio entre as bases nitrogenadas
de nucleotídeos opostos (AT ou CG).3, 6,7,9,16,19
Para o DNA ser comprimido dentro do
núcleo celular, ele é helicoidizado em diversos níveis. Primeiramente, ele se enrola ao
redor de proteínas chamadas histonas, para
formar um nucleossomo. Os nucleossomos
compõem um solenóide helicoidal. Cada volta do solenóide inclui cerca de seis nucleossomos. Os solenóides são organizados em
alças de cromatina, que se ligam a um arcabouço de proteína. Cada uma dessas alças
contém aproximadamente 100 mil pares de
bases do DNA. Depois de helicoidizado e
condensado, o DNA atinge cerca de 1/10.000
do comprimento que teria se fosse totalmente estendido (fig. 1).3,6,16,17
ESTRUTURA DA MOLÉCULA DE RNA
O RNA é composto por uma única cadeia de nucleotídeos. No entanto, o açúcar
presente é a ribose e a base timina é substituída no RNA pela base uracila (U). Existem
três tipos de RNA: RNA mensageiro, cuja
função é transportar uma mensagem específica do DNA até o citoplasma, RNA
ribossômico, que se liga às proteínas para
compor os ribossomos, e RNA transportador,
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INTRODUÇÃO
SÍNTESE DE PROTEÍNAS
A síntese de proteínas é ativada quando
uma proteína torna-se necessária ao metabolismo celular. Para iniciar a síntese, a seqüência de DNA que contém o gene específico para
determinada proteína deve estar com as pontes de hidrogênio rompidas entre as bases e a
dupla hélice desenrolada. Essa ação é comandada por enzimas nucleares específicas. Estando o DNA exposto, ocorrerá a transcrição, ou seja, a formação de uma molécula de
RNA mensageiro (RNAm) complementar à
seqüência do DNA. O RNAm deixará o núcleo indo para o citoplasma, onde se unirá aos
ribossomos. Na tradução, a cada códon de
RNAm irá se acoplar um RNA transportador
(RNAt). Os RNAts possuem uma região de
três pares de bases, denominadas anticódons,
que transportam em sua extremidade os
aminoácidos. Dessa forma, os ribossomos
promovem a ligação códon versus anticódon
e a aproximação dos aminoácidos em seqüência, que irão formar entre si, ligações
peptídicas, dando origem às proteínas.3,9,16
TÉCNICAS
DE
BIOLOGIA MOLECULAR
A análise molecular é um novo método
de avaliação que busca as alterações expressas
em nível genético, ou seja, pelo DNA. O DNA
genômico é obtido de qualquer material biológico, mas as amostras mais utilizadas são sangue (leucócitos), tecidos biopsiados (células
FIGURA 1.
PADRÕES DE HELICOIDIZAÇÃO DO DNA.
residentes), fluido amniótico e vilosidade
coriônica. Para extrair o DNA do núcleo celular, são necessárias várias etapas, que compreendem lise celular, extração das proteínas e do
RNA, precipitação do DNA, até a purificação.
O DNA obtido será digerido por enzimas de
restrição que produzem muitos fragmentos de
DNA do gene em estudo.3 Essas enzimas de
restrição cortam a dupla hélice do DNA em
uma seqüência específica, denominada de sítio de restrição, que varia de quatro a seis bases. A enzima de restrição EcoRI sempre reconhece uma mesma seqüência e faz o corte entre
as bases G e A de cada cadeia.3,14 Atualmente,
já estão identificadas mais de 400 enzimas de
restrição, cada uma atuando em sítios de restrição diferentes. O nome da enzima refere-se
ao microrganismo em que foi identificada sua
linhagem e a ordem de descoberta. Por exemplo, a enzima EcoRI significa enzima de restrição descoberta na Escherichia coli, linhagem R,
e foi a primeira enzima de restrição identificada
neste organismo.3,6,14
As pontes de hidrogênio podem ser rompidas aumentando-se a temperatura, no processo
chamado de desnaturação, e, se a temperatura
diminuir, a dupla hélice forma-se novamente.
Essa capacidade da molécula de DNA de se
renaturar, reassociando-se com sua cadeia complementar para formar a dupla hélice, é utilizada
no processo da hibridização. Na hibridização, as
regras de pareamento entre A-T e C-G são
mantidas. É importante mencionar que entre
A-T existem duas pontes de hidrogênio, enquanto entre C-G há três. Dessa forma, uma molécula de DNA rica em pares C-G requer, para sua
desnaturação, uma temperatura mais alta do que
uma molécula de DNA composta principalmente
por pares A-T.9,16
ELETROFORESE
A eletroforese em gel de agarose ou de
poliacrilamida é um método simples e rápido
que separa o DNA em fragmentos de tamanhos diferentes usando enzimas de restrição.
Quando submetidas a um campo elétrico
(matriz) em pH neutro, as moléculas de DNA
são atraídas para o pólo positivo e repelidas
do pólo negativo. Quando a matriz apresenta
resistência à migração das moléculas, os fragmentos menores podem se mover com maior
facilidade do que os maiores, havendo, então,
uma migração diferenciada dos fragmentos.
A escolha do material da matriz depende da
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que transporta no citoplasma os aminoácidos,
que se unirão para formar uma nova cadeia
polipeptídica.7,9
9
10
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MÉTODOS
MÉTODO DE SOUTHERN
Depois de obtidos os fragmentos de DNA
no gel, um certo segmento do DNA que contém o gene de interesse pode ser detectado pela
hibridização com uma sonda específica. Para
isso, o DNA contido no gel é transferido para
um filtro de nitrocelulose ou náilon por meio
do método de transferência chamado Southern
blotting. Quando o material presente no gel é
RNA, o método chama-se Northern blotting e,
caso seja proteína, denomina-se Western blotting.
Após ser fotografado em UV, o gel é mergulhado em solução de hidróxido de sódio, ocasionando a desnaturação da dupla fita de DNA. O
DNA em fita simples é, então, coberto com a
membrana de transferência em um fluxo de
solução salina, onde é desprendido da matriz e
transferido para a membrana. Nela, o DNA é
fixado e hibridizado com uma sonda específica
marcada radioativamente, ligando-se a sua seqüência complementar. Em seguida, é retirado
o material radioativo que não se hibridizou, e a
membrana é exposta a um filme de raios-X sensível à radioatividade. Como resultado, observamos na auto-radiografia um padrão com uma
ou mais bandas, indicando o número e o tamanho dos fragmentos de DNA complementares
à sonda. Assim, para amostra de DNA, o padrão de bandas será constante, desde que o
DNA seja digerido com uma certa enzima de
restrição e hibridizado com uma determinada
sonda. Diferença no padrão normal obtido indica a presença de um gene mutante.3,7
HIBRIDIZAÇÃO COM OLIGONUCLEOTÍDEOS ALELOESPECÍFICOS (ASO)
Esse método consiste no reconhecimento
de um alelo particular usando-se diferentes
sondas. A sonda é uma seqüência de
oligonucleotídeos complementar ao máximo
a cada alelo possível do gene (ASO). Dessa
forma, é possível distinguir diferentes alelos de
um mesmo gene, visto que essa hibridização
somente ocorrerá se o oligonucleotídeo for
absolutamente complementar ao alelo. Esse é
um método restrito, pois é necessário conhecer a seqüência de bases em cada alelo para
sintetizar o oligonucleotídeo específico para
cada gene.3
REAÇÃO EM CADEIA DE POLIMERASE (PCR)
Consiste na amplificação enzimática específica do DNA visando à produção de milhões
de cópias dessa seqüência em um tubo de ensaio. Uma fita simples do DNA é usada como
molde para a síntese de novas cadeias complementares sob a ação da enzima polimerase do
DNA, que adiciona os nucleotídeos presentes
na reação de acordo com a fita molde. A
polimerase do DNA precisa de um ponto de início. Ele é fornecido por um oligonucleotídeo que
hibridiza a fita molde simples (primer). As fitas
simples iniciais precisam fornecer os primers específicos a cada uma delas. Portanto, a região
do DNA genômico a ser sintetizado é definida
pelos primers, que se anelam às seqüências complementares na fita molde, delimitando o fragmento de DNA a ser amplificado. No início,
usava-se a polimerase do DNA extraída da E.
coli, mas como ela era sensível a altas tempera-
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resistência necessária para a separação efetiva
dos fragmentos. Uma matriz feita de agarose
possui um tamanho de poros que permite a
separação de fragmentos que variam de 200
pb (pares de bases) a 50 kb (kilobase). A
poliacrilamida permite a separação de fragmentos muito pequenos, até 1.000 pb, sendo
o material ideal para géis de seqüenciamento.
No entanto, a separação de fragmentos de
DNA em tamanhos superiores a 50 kb não
pode ser realizada por esse tipo de eletroforese
convencional e exige uma variação conhecida
como eletroforese em campo pulsado (PFGE).
A PFGE permite a separação de fragmentos
que variam de 50 a 10.000 kb. Isso ocorre devido à alternância de dois campos elétricos em
direções perpendiculares. De acordo com esse
método, se as moléculas de DNA forem submetidas a um campo perpendicular à sua migração, elas irão se reorientar nessa nova direção e as moléculas menores serão capazes de
assumir o novo caminho mais rapidamente do
que as maiores. Assim, a separação das moléculas dependeria da sua capacidade de se
reorientar em resposta às mudanças de direção do campo elétrico aplicado. O nível de resolução depende do tempo do pulso elétrico.
A PFGE pode ser aplicada para a análise de
grandes fragmentos de DNA, o mapeamento
gênico, o estudo de cromossomos ou para
detecção de grandes deleções do DNA
genômico. Depois de separado, o DNA pode
ser corado com um corante fluorescente e
visualizado sob luz ultravioleta (UV).3,7
HIBRIDIZAÇÃO IN SITU DE FLUORESCÊNCIA (FISH)
Na hibridização in situ, geralmente utiliza-se uma preparação de cromossomos
metafásicos em lâmina, na qual o DNA
cromossômico foi desnaturado pela exposição a formamida antes da hibridização, com
uma sonda apropriada. Na técnica de FISH,
a sonda de DNA pode ser marcada diretamente, pela incorporação de um precursor de
nucleotídeo marcado com fluorescência, ou
indiretamente, pela incorporação de um
nucleotídeo contendo uma molécula repórter (biotina ou digoxigenina). Depois de incorporada ao DNA, essa molécula repórter é
ligada, por afinidade, a uma molécula marcada
com fluorescência.7,16
Essa técnica fornece resultados rápidos, que
podem ser visualizados sob microscopia de
fluorescência. Nos cromossomos metafásicos, os
sinais positivos aparecem como pontos duplos,
correspondendo à hibridização da sonda em
ambas as cromátides-irmãs. As aplicações da técnica são a detecção de alterações cromossômicas
numéricas e estruturais, o diagnóstico pré-natal,
o diagnóstico de doenças virais, a determinação
do sexo pré-natal, o mapeamento gênico e, na
oncologia, a detecção de doença residual mínima como células tumorais em baixa freqüência e
o monitoramento de transplantes de medula óssea. Sua desvantagem é que ela se limita ao segmento pesquisado.7,16
APLICAÇÕES DA BIOLOGIA MOLECULAR
ODONTOLOGIA
NA
O progresso da engenharia genética na
medicina terá efeitos similares na prática do
cirurgião dentista. Novos métodos serão abandonados em favor das técnicas da bioengenharia. O avanço mais significativo será na
interação entre dentistas e pacientes, com o
desenvolvimento de novos sistemas de diagnóstico, prevenção e tratamento.19
A microbiologia bucal é essencial para
a identificação e caracterização de vários microrganismos envolvidos nas infecções bucais. A bolsa periodontal tem cerca de 300
espécies diferentes de bactérias. Alguns microrganismos têm sido associados com a doença periodontal, como Actinobacillus actinomycetemcomintans (Aa), Fusobacterium
nucleatum (Fn), Porphyromonas gingivalis (Pg),
Prevotella intermédia (Pi) e Eikenella corrodens
(Ec). Muitos métodos têm sido usados na
detecção da variação fenotípica e genotípica
para a caracterização desses patógenos
periodontais, assim como na identificação de
bactérias da cavidade bucal. Por meio dessas
técnicas, o patógeno pode ser diagnosticado
antes que a doença esteja em estado avançado, sendo possível identificar, simultaneamente, mais de um patógeno. A PCR é uma das
técnicas mais utilizadas na identificação de
patógenos associados à doença periodontal,
à placa e à carie dental.1,4,6
Com o seqüenciamento, provavelmente
será possível a modificação das bactérias que
causam doenças bucais. A determinação do
genoma bacteriano permitirá ao dentista
pesquisar e compreender melhor a função
celular desses organismos responsáveis pelo
início da cárie dental e da doença periodontal.
Na terapia endodôntica, os profissionais serão capazes de desenvolver geneticamente te-
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turas, passou-se a utilizar a Taq polimerase, extraída da bactéria Thermus aquaticus. Usualmente, os primers têm 20 pares de bases, para garantir a identificação de uma única seqüência
complementar. No final do processo, o DNA
produzido pode ser observado em eletroforese
em gel de agarose ou poliacrilamida. A vantagem desse método é que o resultado fica pronto em até 24 horas e requer quantidades muito
pequenas de DNA.3,7,9,16
A PCR tem uma ampla faixa de aplicações: 1. possibilita a amplificação rápida de um
DNA molde para a coleção de mutações não
caracterizadas; 2. permite uma identificação rápida de marcadores polimórficos; e 3. pode ser
utilizada para a análise de mutações conhecidas. Essa técnica – que revolucionou o estudo
do câncer – tem sido usada para detectar mutações nos oncogenes associados ao câncer, nos
genes supressores de tumores, nos linfócitos B
e T e translocações.7,16
A PCR tem algumas limitações. Embora
seja um método para aumentar a quantidade
do gene de interesse in vitro, pode haver dificuldades devidas ao material necessário no estudo de pequenas quantidades de DNA. Além
disso, a especificidade da reação pode ser limitada e depende de muitos fatores, como o tamanho dos oligonucleotídeos, a temperatura
de anelamento e a concentração do sal. Todavia, uma das maiores limitações é a suscetibilidade do processo à contaminação.7,16
11
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12
no câncer bucal está associada à proliferação
celular. A superexpressão das oncoproteínas
ciclina D1 e mdm2 associadas com o ciclo
celular, tanto quanto a subexpressão dos
supressores p53, p16 e p27, podem ser
marcadores tumorais importantes.8
As mutações somáticas no gene p53 são
encontradas em aproximadamente 50% de
todos os tumores humanos, tornando-o o
gene de câncer geralmente mais alterado. O
p53 é ativado em resposta a sinais de dano
celular. Esse gene codifica um fator de transcrição que interage com pelo menos seis outros genes. Como o gene p53 é considerado
um supressor tumoral, as mutações que nele
ocorrem podem ocasionar uma perda de função. Entretanto, algumas mutações do p53
podem ter um efeito negativo dominante, em
que o produto protéico do alelo mutado
interage e inativa o produto protéico do alelo
normal, induzindo a transformação celular.
O gene p53 é importante por dois motivos.
Primeiro, porque sua presença geralmente
indica tumores mais agressivos, com chance
de sobrevida baixa; segundo, porque ele é importante na prevenção do tumor. Alguns testes labo-ratoriais mostram que a inserção de
um gene p53 normal em células tumorais resulta numa diminuição significativa da
carcinogê-nese, sendo um indicativo de forma alternativa de tratamento do câncer.14,16,17
O p53 é comumente encontrado mutado
no câncer humano e, algumas vezes, também
está superexpressado em outras lesões, como
o ameloblastoma. Já a proteína mdm2 é capaz de se associar com a p53 e impedir a função de supressão da p53. Sandra et al.14 analisaram 34 pacientes com ameloblastoma por
meio de testes imunohistoquímicos Western
blotting e ELISA. O resultado mostrou que o
p53 não está relacionado com a atividade
proliferativa no ameloblastoma, enquanto a
proteína mdm2 causou alta atividade
proliferativa, principalmente no ameloblastoma de células basais.
Acredita-se que o mapeamento do
genoma e a clonagem de genes para síndromes
de câncer fornecerão informações importantes a respeito dos mecanismos de carcinogênese e dos processos biológicos fundamentais. O diagnóstico pré-sintomático de
membros familiares com risco de câncer e a
possibilidade de intervenções genéticas são
outras metas importantes desses estudos.16
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cido pulpar dentro do canal para crescer e
preencher a câmara. Será possível, também,
a regeneração da perda de tecido ósseo
alveolar, de tecido gengival e de cemento, proporcionando, assim, um ótimo nível de saúde
periodontal.19
A genética do câncer tem se desenvolvido devido aos avanços nas técnicas de biologia molecular e de imunohistoquímica. O câncer é causado por componentes ambientais e
alterações genéticas que ocorrem nos tecidos,
com predisposição hereditária em algumas
famílias. Câncer pode ser definido como uma
coleção de distúrbios que compartilham,
como característica afim, o crescimento celular descontrolado, formando uma massa de
células chamada neoplasia ou tumor. Os genes
do câncer são classificados em três principais
categorias: os que normalmente inibem a proliferação celular (supressores tumorais), os
que ativam a proliferação (oncogenes) e os
que participam do reparo do DNA e da
apoptose.16
Os genes supressores tumorais têm a propriedade de bloquear a proliferação celular
descontrolada. Uma de suas características é
a de que as mutações herdadas são alelos dominantes em nível de indivíduo, mas
recessivos em nível celular. Isso pode ser explicado pelo fato de que apenas uma célula
tumoral é necessária para iniciar um tumor
em um indivíduo. Os genes supressores
tumorais apresentam mutações na linhagem
germinativa que causam síndromes de câncer herdado, como o retinoblastoma (Rb).16
A maioria dos oncogenes origina-se de
proto-oncogenes, genes envolvidos com os
quatros reguladores básicos do crescimento
celular. Um oncogene é o resultado de uma
mutação em um proto-oncogene. Os oncogenes são geralmente dominantes em nível
celular, ou seja, apenas uma única cópia de
um oncogene é necessária para contribuir para
o processo de multietapas de progressão
tumoral. As mutações oncogênicas de linhagem germinativa raramente causam síndromes de câncer herdado.16
Tem sido evidenciado que genes específicos estão alterados no câncer bucal. Muitas
das proteínas desses genes podem ser detectadas por técnicas de imunohistoquímica, servindo como marcadores de lesões com alto
risco de progressão para doença maligna. A
maioria dos genes e proteínas desregulados
dular a expressão de vários outros genes – como
p21, mdm2, Bax e bcl-2 – envolvidos no controle do ciclo celular, parada do crescimento, supervisão e reparo do DNA, diferenciação celular
e no controle da apoptose.13,15
Segundo Birchall et al.,2 uma desordem
no balanço entre proliferação e apoptose podem contribuir para a carcinogênese. A
apoptose pode ocorrer na porção mais superficial do epitélio displásico. A superexpressão
do gene bcl-2 nas células B prolonga a sobrevivência e subseqüente malignidade das células. De acordo com Sandra et al.,14 há relatos que evidenciam a expressão das proteínas
p53 e/ou mdm2 não só em tumores malignos
e benignos nas regiões bucais e maxilofaciais
como também em lesões odontogênicas.
Ng et al.11 estudaram a expressão das
oncoproteínas p21, p53, mdm2 e Ki-67
(MIB1) para determinar se havia uma correlação entre elas na diferenciação tumoral, nos
estágios dos tumores e na terapia por radiação
em 88 amostras de 56 pacientes com carcinoma espinocelular. Os resultados das amostras
para p21, p53, mdm2 e MIB1 foram, respectivamente, 82,4%, 67,8%, 25,95 e 98,8%. Foi
evidenciado que as oncoproteínas p21 e mdm2
predominam nas regiões suprabasal e superior dos tumores e que a expressão positiva da
p21 está correlacionada à expressão da mdm2,
mas não à expressão da p53. Além disso, o nível de expressão da p21 foi maior em pacientes mais velhos e em mulheres. Não foi encontrada uma associação significativa entre p53,
mdm2 e MIB1. A expressão da p53 foi mais
elevada nos tumores com pobre diferenciação
celular e em pacientes jovens. A terapia por
radiação não alterou a expressão de nenhuma
das oncoproteínas. Os autores concluíram que
a proteína p21 estava superexpressada nos carcinomas de células escamosas bucais, e que essa
superexpressão estava relacionada com a proliferação celular e com a expressão da mdm2,
mas era independente da p53 alterada.
De acordo com a pesquisa de Yao et al.,18
a utilização dos marcadores para p53 e bcl2
e, especialmente, sua combinação na determinação dos índices proliferativos e apoptótico podem contribuir para a determinação prognóstica da agressividade dos
carcinomas espinocelulares da língua. Foi verificado, ainda, que a supressão do oncogene
bcl2 na regulação da apoptose contribui para
a manutenção desse tipo tumoral.
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Atualmente, os patologistas têm dado
maior importância à identificação da apoptose
e da mitose para poderem melhor compreender a cinética e o desenvolvimento de diversos processos patológicos. A participação das
alterações nos proto-oncogenes, genes
supressores e genes associados com a apoptose
está relacionada ao desenvolvimento e à progressão de tumores. Os avanços referentes a
conceitos, mecanismos e técnicas de identificação são importantes na determinação da
apoptose, como auxiliar no diagnóstico e no
prognóstico dos cânceres humanos.15,18
A relação entre a apoptose e a proliferação celular em um tumor é determinada pela
participação, nesses processos, dos mesmos
genes, dos mesmos inibidores do ciclo celular e das mesmas proteinoquinases, refletindo, assim, a cinética celular tumoral. A
apoptose é ativada por substâncias e genes
envolvidos na homeostase das células normais,
bem como em alterações patológicas específicas, como o câncer. A apoptose pode ser regulada, tanto direta como indiretamente, por
oncogenes e por genes supressores de tumor.
Os genes bcl-2, c-myc, c-fos, p53, Rb, seus
homólogos e proteínas têm sido associados
com a modulação, inibição e indução da
apoptose em vários tipos de cânceres humanos, em que variações da expressão desses
genes e produtos podem contribuir, retardando ou aumentando o crescimento tumoral em
resposta a fatores como radiação, hormônios,
quimioterapia citotóxica e hipertermia.15
A expressão da oncoproteína bcl-2 pode
ser encontrada no esôfago, na tireóide, na cabeça e pescoço e em carcinomas bucais, como
o de células escamosas da língua. Alguns estudos revelaram que o gene p53 interage inversamente com o gene bcl-2 na regulação da
apoptose. Yao et al. 18 realizaram análise
imunohistoquímica de 52 pacientes com carcinoma espinocelular da borda lateral da língua, em que as oncoproteínas bcl-2 e p53 foram identificadas em 50% e 60% dos
pacientes cancerosos, respectivamente.
Os carcinomas espinocelulares na cavidade
bucal constituem a maior proporção de cânceres
de cabeça e pescoço e umas das principais causas de morbidade e mortalidade mundial. Os
genes supressores p53 e Rb estão freqüentemente
associados com o carcinoma espinocelular.Também foi evidenciado que, nesse tipo de carcinoma, o gene p53 apresenta a capacidade de mo-
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14
são muitos. Nesta revisão, encontramos algumas técnicas utilizadas para a identificação
molecular de doenças humanas e suas aplicações na odontologia.
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UNIMEP • Universidade Metodista de Piracicaba
O leiomiossarcoma é um tumor muito
raro da cavidade bucal e que apresenta dificuldade de identificação histopatológica entre tumor maligno e benigno. Nikitakis et al.12 realizaram o diagnóstico e prognóstico de dois
pacientes por imunohistoquímica e marcadores
moleculares. Os autores concluíram que a proteína p53 pode ser identificada em leiomiossarcomas, possibilitando a distinção entre os dois tipos de tumores. A expressão da
proteína p53 também pode estar associada com
a alta taxa de recorrência e com o curto período de sobrevivência. Além da proteína p53, foi
identificada a expressão do oncogene mdm2.
Ambos os casos foram imunohistoquimicamente positivos para quinase 4 dependente da ciclina (CDK4), cuja amplificação e
superexpressão tem sido considerada como um
mecanismo alternativo para a mutação no gene
Rb e a desregulação do ciclo celular. Alterações na regulação do ciclo celular envolvendo
a proteína do retinoblastoma, ciclinas e
quinases dependentes da ciclina têm sido relatadas em diferentes tipos de sarcomas humanos, incluindo o leiomiossarcoma.
A técnica de imunohistoquímica tem contribuído para uma determinação mais precisa
no prognóstico de pacientes com neoplasias,
principalmente nos casos em que o diagnóstico definitivo não pode ser estabelecido pela
coloração com a hematoxilina-eosina. Primeiro, a técnica pode ser usada rotineiramente em
tecidos já preparados; segundo, é um sistema
muito sensível, que pode detectar antígenos que
são expressos em pequenas quantidades e, se
cuidadosamente selecionados, o complexo
antígeno-anticorpo pode ser muito específico;
terceiro, os aspectos técnicos, como baixo custo dos equipamentos e pequena área laboratorial, são favoráveis. A seleção dos anticorpos
para esse teste é feita com base na especificidade do tumor e se o anticorpo provavelmente irá reagir com o tumor sob avaliação.
Essa técnica é utilizada para o estudo dos padrões gerais de expressão em nível de proteínas dentro de um tecido ou outra estrutura
multicelular. Os tecidos são geralmente congelados ou embebidos em parafina e cortados
em secções muito finas. O anticorpo apropriado é utilizado para se ligar à proteína do tecido, podendo produzir dados de expressão disponíveis para a comparação com a coloração
histológica de cortes de tecidos vizinhos.8,16
Os avanços na área da biologia molecular