Universidade Camilo Castelo Branco
Programa de Pós-Graduação em Produção Animal
ANA CRISTINA SOARES DE FREITAS
EMPREGO DA TÉCNICA DE MIRU NO ESTUDO DA EPIDEMIOLOGIA
DA TUBERCULOSE BOVINA
Descalvado-SP
2010
ANA CRISTINA SOARES DE FREITAS
EMPREGO DA TÉCNICA DE MIRU NO ESTUDO DA EPIDEMIOLOGIA
DA TUBERCULOSE BOVINA
Orientador: Prof. Dr José Rodrigo C. Pandolfi
Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa
de Pós-Graduação em Produção Animal da
Universidade Camilo Castelo Branco, como
complementação dos créditos necessários para
obtenção do título de Mestre em Produção Animal.
Descalvado-SP
2010
F936e Freitas, Ana Cristina Soares de
Emprego da técnica de miru no estudo da epidemiologia
da tuberculose bovina. Ana Cristina Soares de Freitas.
Descalvado – SP : [sn.], 2010.
63 p.; 21cm
Dissertação de Mestrado apresentada à Universidade
Camilo Castelo Branco. Curso de Mestrado
Profissionalizante em Produção Animal.
Orientador: Dr. José Rodrigo Cláudio Pandolfi.
1. MIRU. 2. Tuberculose.
3. Tuberculose Bovina. I. José Rodrigo Cláudio
Pandolfi. Universidade Camilo Castelo Branco. Curso de
Mestrado Profissionalizante em Produção Animal.
CDD 636.0896
Autorizo exclusivamente para fins acadêmicos e científicos, a reprodução total ou
parcial desta dissertação, por processos xerográficos ou eletrônicos.
Descalvado, 20 de Agosto de 2010.
i
DEDICATORIA
Ao Felipe, pelo imenso amor, carinho, apoio e
paciência em todas as etapas.
Aos meus pais, por todo carinho, apoio e incentivo em
todos os anos da minha vida.
i
ii
AGRADECIMENTOS:
Primeiramente agradeço a Deus que está presente em
todos os momentos da minha vida e por permitir a conclusão desta etapa em
minha vida.
Ao meu querido orientador José Rodrigo C. Pandolfi, pela
orientação, confiança e incentivo empenhados durante toda realização deste
trabalho mesmo após seu afastamento da Unicastelo.
As Dra. Clarice Queico F. Leite e Dra. Klaudia dos Santos
G. Jorge por terem cedidos as amostras para o estudo, pois sem elas não
seria possível a realização desse estudo.
Ao aluno Ruy Carlos L. de Abreu Junior da Unicastelo pela
ajuda e colaboração.
Ao colega Adolfo Carlos B. Santos pela ajuda e
colaboração nas análises.
ii
iii
RESUMO
A pecuária é um dos setores da produção animal que tem evoluído muito
nas últimas décadas, constituindo-se, atualmente, em uma atividade econômica de
grande destaque. Correlacionado e essa evolução, é crescente o estudo das
doenças, visando à melhoria de qualidade e produtividade dos plantéis. As infecções
por micobactérias despertam interesses devido as características do sistema de
criação intensivo adotado em bovinocultura e às implicações em Saúde Animal e
Saúde Pública. O presente trabalho realizou o estudo genotípico de amostras de
DNA provenientes de cultivos de Mycobacterium bovis, isolados de carcaças de
bovinos em abatedouro, no Estado de Mato Grosso do Sul, no período de 2005 a
2007, empregando a técnica de MIRU. No decorrer do trabalho, foram identificadas
45 amostras de M. bovis, posteriormente genotipadas. Na genotipagem das
amostras observou-se que todas as 45 amostras estudadas foram agrupadas dentro
de um mesmo genótipo, caracterizando a formação de um único cluster, indicando a
predominância deste grupo genético, único e portanto dominante, dentre as
amostras estudadas.
Palavras-chave: Tuberculose bovina, MIRU, Mycobacterium bovis, genotipagem
iii
iv
ABSTRACT
Livestock farming is one sector of animal production that has evolved over the
last decades, becoming currently an economic activity of great importance.
Correlated to this, there is an increasing on the study of cattle diseases, aimed at
improving quality and productivity of flocks. Mycobacteria Infections are increasingly
important as the characteristics of intensive management system adopted in cattle
favors tuberculosis dissemination, an important problem in Animal Health. In addition,
as tuberculosis is a zoonosis, there are implications in Public Health. This work
aimed to study the epidemiology of bovine tuberculosis by MIRU genotyping
molecular technique, using samples of genomic DNA from cultures of Mycobacterium
bovis isolates from cattle carcasses in slaughterhouses in the state of Mato Grosso
do Sul. for that, following techniques were performed: Selection of DNA samples and
their identification by PCR, molecular typing of strains by MIRU technique, and data
obtained were analyzed by PAST software. This work conducted a study of
genotyping DNA samples from cultures of Mycobacterium bovis isolates from cattle
carcasses at abattoirs in the State of Mato Grosso do Sul in the period 2005 to 2007,
employing MIRU technique. During the work, were identified 45 samples of M. bovis,
that subsequently were typed. Samples genotyping showed that all 45 samples were
grouped within the same genotype, characterizing a single cluster, indicating the
prevalence of this genetic group, and therefore dominant, among studied samples.
Keywords: Bovine tuberculosis, MIRU, Mycobacterium bovis, genotyping
iv
v
SUMÁRIO
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS.........................................................vii
LISTA DE FIGURAS........................................................................................ix
LISTA DE QUADROS......................................................................................xi
1. INTRODUÇÃO..............................................................................................1
2. REVISÃO BIBLIOGRAFICA........................................................................3
2.1. . Importância Sanitária da Tuberculose...........................................3
2.2. Tuberculose Bovina...........................................................................4
2.3. Controle da Tuberculose Bovina no Brasil......................................7
2.4. Epidemiologia da Tuberculose Bovina............................................9
2.5. Diagnóstico da Tuberculose Bovina..............................................11
2.6. Genotipagem aplicada ao estudo da Tuberculose Bovina..........20
2.6.1 RFLP................................................................................................22
2.6.2 Spoligotyping.................................................................................25
2.6.3 MIRU................................................................................................28
3. OBJETIVOS...............................................................................................34
4. MATERIAL E MÉTODOS...........................................................................35
4.1. Amostras de DNA.............................................................................35
4.2. Diagnóstico Molecular das Amostras............................................35
4.3. Genotipagem das Amostras: Técnica de MIRU.............................37
4.3.1 Oligonucleotídeos iniciadores dos loci de MIRU........................37
4.4. Análise dos amplificados de MIRU e sua classificação em alelos
para cada um dos 12 loci estudados..........................................................40
4.5. Análise por Bioinformática..............................................................42
5.RESULTADOS E DISCUSSÃO..................................................................43
5.1. Amostras de DNA.............................................................................43
5.2. Diagnóstico Molecular das Amostras............................................43
5.3. Genotipagem das Amostras: Técnica de MIRU.............................44
5.4. Análise dos Amplificados de MIRU e sua Classificação em Alelos
v
vi
para cada um dos 12 loci estudados..........................................................44
5.5. Análise por Bioinformática..............................................................46
6. CONCLUSÃO.............................................................................................48
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRAFICAS..........................................................49
vi
vii
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS:
%: Porcentagem
µL: Microlitro
µM: Micrometro
±: mais ou menos
AIDS: Síndrome da imunodeficiência adquirida
AN5: Amostra padrão de Mycobacterium bovis
BCG : Bacilo de Calmette-Guérin
C. E.: Concentração de estoque
Cat:: catálago
Cm: Centimetro
D4: Amostra padrão de Mycobacterium avium
DNA: Acido desoxirribonucleico
DNTPs- Dinucleotideos
DR: Repetição direta
DR´s: Repetições diretas
Dra.: Doutora
ELISA: Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay, é um teste imunoenzimático
H: Horas
H2O: Água
H37Rv: Amostra virulenta padrão de Mycobacterium tuberculosis
hsp 65: Proteína de choque térmico 65
IFN-γ: Interferon-gama específico.
IS6110: é uma seqüência de inserção de 1361 pares de base
Linfócito T: São linfócitos produzidos no timo a partir de células T percursoras
derivadas de células tronco na medula óssea.
M. africanum: Mycobacterium africanum
M. aviaum: Mycobacterium aviaum
M. avium avium: Mycobacterium aviaum aviaum
M. avium hominissuis: Mycobacterium aviaum hominissuisM. avium paratuberculosis: Mycobacterium aviaum paratuberculosis
M. avium silvaticum: Mycobacterium aviaum silvaticum
vii
viii
M. bovis: Mycobacterium bovis
M. canettii: Mycobacterium canettii
M. intracellulare: Mycobacterium intracellulare
M. microti: Mycobacterium microti
M. tuberculosis: Mycobacterium tuberculosis
MgCl2: Cloreto de magnésio
MIRU: Mycobacterial Interspersed Repetitive Units
mL: mililitro
o
C: Graus Celsius
OIE: Organização Mundial de Sanidade Animal
Oligonucleotídeo Tb 11: Oligonucleotídeo Tuberculose 11
Oligonucleotídeo Tb 12: Oligonucleotídeo Tuberculose 12
OMS: Organização Mundial de Saúde
PAST: Paleontological Statistics Software Package for Education and Data Analysis
pb: Pares de bases
PCR: Reação em cadeia da polimerase
PGRS: Região polimorfica repetitiva
PNCEBT: Programa Nacional de Controle e Erradicação da Brucelose e
Tuberculose Animal.
Pol.: Polimerase
PPD:Derivado Protéico purificado ou proteína purificada derivada
Profa: Professora
PTC 100: Modelo de termociclador
PTC 150: Modelo de termociclador
RFLP: Restriction Fragment Lenght Polymorfism
Spoligotyping: Spacer Oligonucleotide Typing
Taq: Thermus aquaticus
TBE: Tampão Tris, ácido bórico e EDTA
U: unidade de enzima
UNESP: Universidade Estadual Paulista
VNTR: Variable Number of Tandem Repeat
Vol.: Volume
viii
ix
LISTA DE FIGURAS:
Figura 1: Representação esquemática da posição dos 12 loci de MIRU no
cromossomo da cepa padrão de M. tuberculosis H37Rv (MOKROUSOV et
al., 2005)........................................................................................................
30
Figura 2: Demonstração do método de MIRU. As setas pretas maiores,
apontadas no gel, representam amplificados de duas cepas distintas,
empregando oligonucleotídeos iniciadores do locus 10. Na cepa A o
esquema mostra quatro repetições da seqüência repetitiva, enquanto na
cepa B a repetição ocorre três vezes. Neste exemplo, o tamanho de cada
seqüência repetitiva é de 53 bp, gerando uma diferença de tamanho
molecular entre os diferentes alelos do locus (que são diferentes no
número de cópias da seqüência repetida), permitindo assim a análise do
polimorfismo alélico neste locus de MIRU (PANDOLFI, 2006)......................
31
Figura 3: Demonstração da determinação dos alelos de MIRU a partir das
bandas observadas no gel. A banda em destaque tem tamanho molecular
de
696bp
e
foi
obtida
por
PCR
empregando
oligonucleotídeos
flanqueadores do locus 10 de MIRU (PANDOLFI, 2006). Consultando a
coluna MIRU 10 no quadro 5, observa-se que o valor correspondente a
esse tamanho é o número 4, ou seja, o alelo em questão é o alelo 4 do
locus do MIRU................................................................................................ 41
Figura 4: Fotografia do gel de agarose a 1%, onde foram resolvidos
produtos da PCR para diagnóstico de M. bovis. Observa-se a presença de
amostras positivas com bandas de 430 pares de base de tamanho, nas
canaletas de número 1, 2, 3, 4, 5, 6 e 13. As canaletas 7, 8, 9, 10, 11 e 12
contém amostras que apresentaram resultado negativo e portanto foram
desconsideradas para este trabalho..............................................................
43
FIGURA 5- Amplificação de 13 amostras de M. bovis com os
ix
x
oligonucleotídeos iniciadores específicos para os loci 02 (a esquerda) e 04
(a direita) de MIRU, respectivamente. As 13 amostras foram dispostas em
ordem crescente............................................................................................. 44
Figura 6. Dendrograma obtido através da análise dos dados das amostras
de DNA de M. bovis provenientes de animais abatidos no Estado do Mato
Grosso do Sul, nos anos de 2005 a 2007, feito pelo programa PAST. A
numeração da primeira linha corresponde às amostras estudadas. Note a
formação de um grupo com similaridade de 100%, simbolizado pela reta
em azul........................................................................................................... 47
x
xi
LISTA DE QUADROS:
Quadro 1: Concentração de estoque (C.E.), concentração final (C.F.) e
volume (VOL.) dos reagentes utilizados em uma PCR para a identificação
de uma amostra M. bovis.............................................................................. 36
Quadro 2: Sequências dos oligonucleotídeos iniciadores referentes aos
12 loci de MIRU, conforme descrito por Supply et al., (2001), com
modificações.................................................................................................
37
Quadro 3: Resumo do protocolo de PCR com os reagentes, suas
concentrações de estoque (C.E.), os volumes utilizados (VOL.) e as suas
concentrações finais (C.F.) na reação..........................................................
38
Quadro 4: Resumo dos protocolos de ciclagem de PCR empregado nos
testes das estratégias de PCR.....................................................................
39
Quadro 5: Correlação entre os tamanhos dos amplificados e os alelos de
MIRU............................................................................................................
40
Quadro 6. Relação das amostras de DNA com seus respectivos alelos...... 45
xi
12
1. INTRODUÇÃO
A pecuária é um dos setores da produção animal que tem evoluído muito nas
últimas décadas, constituindo-se, atualmente, em uma atividade econômica de
grande destaque. Correlacionado a esta evolução, é crescente o estudo das
doenças, visando a melhoria de qualidade e produtividade dos plantéis. Neste
sentido, as infecções por micobactérias, e em especial a Tuberculose Bovina,
despertam interesse devido às características de sistemas de criação intensivo,
muitas vezes adotados em bovinocultura e às implicações em Saúde Animal e
Saúde Pública.
A Tuberculose Bovina é uma das enfermidades listadas pela Organização
Mundial de Sanidade Animal (OIE). A OIE especifica condições para a declaração
de países, zonas, compartimentos ou rebanhos livres desta doença. Esta declaração
favorece a manutenção de mercados de exportação e a abertura de novos
mercados. Esta também valoriza o produto declarado como livre, contribuindo ainda
mais para a aquisição de ganhos altamente representativos.
Neste sentido, o Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento instituiu,
em 2001, o Programa nacional de Controle e Erradicação da Brucelose e
Tuberculose Animal (PNCEBT), para diminuir o impacto negativo destas zoonoses
na saúde comunitária e de promover a competitividade da pecuária nacional. Dessa
forma, iniciativas que favoreçam a compreensão adequada dos processos
epidemiológicos da Tuberculose Bovina têm importância vital para o sucesso do
PNCETB.
Assim, as pesquisas sobre a tuberculose bovina e, mais especificamente
aquelas que utilizam de técnicas moleculares, propiciarão melhor entendimento da
12
13
epidemiologia da Tuberculose Bovina apontando caminhos e soluções a serem
adotados no rebanho, região, no Estado e/ou no país, com a finalidade de controlar
e até erradicar esta zoonose. Ademais, este avanço tecnológico e de conhecimento
permitirá uma evolução qualitativa na pesquisa de micobactérias e micobacterioses
na área veterinária.
Em vista do exposto, o presente trabalho teve como objetivo geral estudar a
epidemiologia da tuberculose bovina, pela técnica molecular de MIRU, utilizando
amostras de DNA genômico provenientes de cultivos de Mycobacterium bovis,
isolados de carcaças de bovinos em abatedouros, no Estado de Mato Grosso do
Sul.
13
14
2. REVISÃO BIBLIOGRAFICA
2.1 Importância sanitária da Tuberculose
De acordo com a Organização Mundial de Saúde (OMS) em 1990 existiam 8
milhões de casos ativos de tuberculose em todo mundo dos quais 7,6 milhões
estavam em países em desenvolvimento e 400 mil em países industrializados nesse
mesmo ano as mortes por tuberculose representaram quase 2.9 milhões de pessoas
a maiorias delas em países de terceiro mundo (GUERERO et al.,2008).
Em 1993, a OMS já havia declarado a tuberculose como emergência global e
desde então vem desenvolvendo políticas para contê-la (RETAMAL et al., 2003;
SANTOS et al., 2007).
A estimativa para este século, entre os anos 2000 a 2020 é que
aproximadamente um bilhão de pessoas, estarão infectadas por esta doença e
destas, 200 milhões de pessoas ficarão doentes e 35 milhões irão morrer de
tuberculose, caso o controle não seja eficiente e rígido (WORLD HEALTH
ORGANIZATION, 1993; WORLD HEALTH ORGANIZATION, 2005).
A tuberculose bovina, doença contagiosa, causada pelo Mycobacterium bovis
é uma zoonose que tem como principal reservatório os bovinos, mas infecta uma
grande variedade de espécies animais (OLIVEIRA et al., 2008).
O Brasil detém o maior rebanho bovino comercial do mundo, com
aproximadamente 195 milhões de cabeças, distribuídas em quase 2,5 milhões de
propriedades rurais; há mais de 4500 estabelecimentos de abate sob inspeção
industrial e sanitária em nível federal e o país configura-se como o principal
exportador de carne bovina in natura, mais há ainda o paradoxo do abate
clandestino responsável pela metade do total de bovinos abatidos no país, para
14
15
consumo no mercado interno. Não obstante, quase metade da produção brasileira
de leite não recebe processamento, antes de ser fornecido para a população
(ALVES, 2001; PARDO et al., 2001; BRASIL, 2005).
Segundo a OMS, em 1993 no Brasil suspeitava-se que o M. bovis fosse
responsável por aproximadamente 4000 dos 80000 casos de tuberculose em
humanos registrados por ano (WORLD HEALTH ORGANIZATION, 1993).
Os prejuízos à cadeia produtiva da carne e do leite, em função da
tuberculose, estimulados entre 10 e 25% estão vinculados às perdas diretas
resultantes da morte de animais, a redução gradativa dos índices zootécnicos e as
condenações de carcaças em matadouros frigoríficos sob inspeção sanitária (LAGE
etal., 1998). A tuberculose bovina constitui um grave problema de saúde pública, os
prejuízos causados por esta enfermidade representam significativas barreiras
econômicas (BRASIL, 2006). Os prejuízos na pecuária mundial, em função da
tuberculose, giram em torno de três bilhões de dólares por ano (LAGE et al., 1998).
2.2 Tuberculose bovina
A tuberculose bovina tem como agente etiológico o M. bovis, um
microorganismo pertencente a ordem Actinomycetales, família Mycobacteriaceae e
ao gênero Mycobacterium. Esses microrganismos são pequenos bastonetes, grampositivos, curtos, imóveis, não ramificados, aeróbicos, álcool-ácido resistentes e não
apresentam hifas aéreas. Essas bactérias podem ser encurvadas ou em forma de
bastões, às vezes filamentosas. São finas, não apresentam cápsula nem esporo e
possuem crescimento lento (KANTOR, 1979; CORRÊA & CORRÊA, 1992;
PANDOLFI et al., 2007).
15
16
As espécies causadoras de tuberculose em mamíferos constituem um grupo
de cinco micobactérias filogeneticamente relacionadas, nomeando como complexo
Mycobacterium tuberculosis de mamíferos. Estes agentes são M. tuberculosis, M.
bovis, M. africanum, M. microti e o M. canettii. (GRANCE & YATES, 1994).
Outros grupos de micobacterias genotipicamente diferentes das constintuintes
do complexo M. tuberculosis formam o complexo Mycobacterium aviumintracellulare, no qual inclui duas espécies (M. avium e M. intracellulare). O gênero
M. avium possui 4 sub-espécies: M. avium avium, M. avium paratuberculosis, M.
avium silvaticum e recentemente M. avium hominissuis. São bactérias que em
bovinos provocam reação cruzada nos testes de hipersensibilidade a derivados
protéicos purificados. O M. avium é o agente da tuberculose em varias espécies de
aves e associado aos quadros de linfadenites granulomatosas em suínos. O M.
avium paratuberculosis é causador da doença de Johne (DVORSKA et al., 2004).
A Tuberculose é de conhecimento humano desde os primórdios da historia,
múmias da dinastia de Ramsés há três mil anos apresentavam lesões tuberculose
óssea. Descrições de lesões pulmonares encontradas em artigos manuscritos
hindus são sugestivas de que tratasse dessa doença. Várias são as indicações de
que a tuberculose era comum nas populações do mundo grego e romano. Entre os
animais, também seu conhecimento é antigo. A orientação da conduta para sacrifício
ritualístico e de matadouro sugere que os judeus antigos conheciam as lesões da
tuberculose em ruminantes (CORREA, 1992).
Em 1882 Robert Koch isolou o agente (M. bovis), em lesão de humanos. Em
1898 foi isolado o M. bovis em bovinos por Theobald Smith. Quatro anos mais tarde,
Revenel isolou o M. bovis em humanos.
16
17
De acordo com MORRIS et al. (1994) esta doença possui uma ampla
variedade de hospedeiro, sendo frequentemente observada em bovinos e suínos e
menos comuns em ovinos, caprinos, carnívoros e eqüinos (CORREA & CORREA,
1992).
A tuberculose no bovino é principalmente uma doença pulmonar, e as vacas
podem trasmití-la através de via aerógena (GRANGE & YATES, 1994).
Os sinais clínicos da tuberculose em bovinos são: cansaço anormal, perda de
apetite, inapetência, pelo sem brilho, emagrecimento, sinais respiratórios, mastite,
temperatura oscilante, os gânglios linfáticos intermaxilares e pré-escapulares
aumentados de volume, endurecidos e indolores (RADOSTIST, et al., 2002).
A lesão macroscópica característica da tuberculose causada por M. bovis é o
tubérculo, a lesão granulomatosa, um nódulo de consistência firme que apresenta
coloração variando do branco ao cinza ou amarelo. Nas secções de corte, o centro
da lesão apresenta-se necrosado e caseoso, com coloração amarelada, geralmente
seco e sólido, parecendo rodeado por uma cápsula esbranquiçada. Em muitos
animais é comum ocorrer calcificação nas lesões do granuloma. Ao seccionar um
tubérculo, uma sensação arenosa e rangente indica a presença de material calcário
(SMITH, 1993; CARLTON, 1998; JONES, 2000; RIET- CORREA et al., 2001).
O leite de vacas tuberculosas não aparece alterado de forma visível quando a
glândula mamaria não está acometida, nem quando a enfermidade desta se
encontra no começo. Por isto, a vaca pode estar eliminando o M. bovis com o leite
durante muito tempo. Há diminuição paulatina na quantidade de leite, que faz mais
fluido e de aspecto mais aquoso transparente. Quando o leite de uma vaca com
tuberculose se mistura com o de um grupo de vacas sadias, as alterações se tornam
irreconhecíveis (LERCHE, 1969). Uma só vaca pode excretar bacilos viáveis
17
18
suficientes para contaminar todo o leite misturado, proveniente de 100 vacas
(ABRAHÃO, 1998).
Um dos maiores problemas de saúde pública é a transmissão da tuberculose
bovina ao homem através do leite de vacas infectadas, contudo, com o
desenvolvimento da pasteurização este problema foi minimizado (O' REILLY &
DABORN, 1995). A obrigatoriedade da pasteurização do leite em nosso país
estabeleceu-se em 1952 e ainda hoje se acredita que aproximadamente 50% de
todo o leite consumido, não é pasteurizado, aumentando-se o risco de infecção por
M. bovis (LEITE et al.,2003).
A inativação do M. bovis pode ser de forma lenta ou rápida: pelo processo de
pasteurização lenta, que consiste no aquecimento do leite a 62-65°C por 30 minutos,
e a pasteurização rápida, que consiste no aquecimento do leite a 72-75°C por 15 a
20 segundos (BRANDÃO, 1994).
2.3 Controle da Tuberculose Bovina no Brasil
O Brasil segue as normas preconizadas pelo programa nacional de controle e
erradicação da brucelose e tuberculose (PNCEBT). O objetivo do programa é baixar
a prevalência e a incidência de casos de brucelose e de tuberculose; Criando um
número significativo de propriedades certificadas que ofereçam ao consumidor
produtos de baixo risco sanitário (BRASIL, 2006)
No Brasil está sendo realizada a certificação de estabelecimento de criação
livre de tuberculose. Este certificado é emitido pela Delegacia Federal da Agricultura,
e consta do PNCEBT. O Ministério da Agricultura condiciona à obtenção de três
18
19
testes de rebanho negativos consecutivos, realizados num intervalo de 90 a 120 dias
entre o primeiro e o segundo testes, e de 180 a 240 dias entre o segundo e o
terceiro testes. O certificado de estabelecimento de criação livre de tuberculose tem
validade de 12 meses. Ocorre também a certificação de estabelecimentos de criação
monitorados para tuberculose, restrito a criação especializada em pecuária de corte.
Neste caso os animais são escolhidos por um método aleatório. Os testes de
diagnóstico para tuberculose devem ser realizados num intervalo de 10 a 12 meses,
até obterem-se dois resultados negativos consecutivos em todos os animais
testados, passando então a serem realizados num intervalo de 18 a 24 meses
(BRASIL, 2006).
Os animais que apresentarem resultado positivo aos testes diagnósticos para
tuberculose deverão ser sacrificados no prazo máximo de trinta dias após o
diagnóstico, devendo ser encaminhados para abate sanitário em estabelecimentos
com serviço de inspeção oficial. Caso isto não seja possível, eles poderão ser
abatidos na própria unidade de criação, e esta precisa ser acompanhada pelo
médico veterinário do serviço oficial de defesa sanitária animal (BRASIL, 2006).
2.4 Epidemiologia da Tuberculose Bovina
A população bovina no Brasil possui uma prevalência de tuberculose,
variando entre 0.9 e 2,9 %, dependendo da região e o tipo de produção (KANTOR &
RITACCO, 1994). Entre 1989 e 1998, dados de notificação oficial indicavam uma
prevalência nacional de 1,3 % dos animais infectados (BRASIL, 2005).
A aquisição da infecção, pelos humanos, devido ao M. bovis, por meio da
inalação de aerossóis contendo o bacilo, pode ocorrer sobre tudo em grupos
19
20
ocupacionais de maior exposição à doença, como tratadores de rebanhos,
ordenhadores e seus familiares, trabalhadores das industriais de carne (açougueiro,
pessoal de matadouros e frigorífico) e veterinários, além de membros da
comunidade rural, que vivem em estreito contato com seus animais (MODA et
al.,1996; ROXO, 1996). Em geral, a incidência de infecções de humanos por M.
bovis é maior nas áreas rurais em rebanhos infectados (MODA et al., 1996).
Observou-se alta prevalência de animais reagentes positivos entre as vacas,
fato característico de rebanhos confinados e altamente infectados, aspecto citado
por LANGENEGGER et al., 1981.
O aumento do aparecimento de novos casos de tuberculose bovina acontece
principalmente em rebanhos leiteiros com animais de raças mais puras e,
conseqüentemente, mais produtivas. Isso se deve, em parte, ao confinamento e ao
maior contato entre os animais, aumentando a predisposição à infecção (OLIVEIRA
et al, 2008).
Em relação ao sistema de criação, 8% dos casos apresentam-se oriundos de
sistema extensivo, 11% intensivo e 81% semi-intensivo. Estes resultados mostram
que o confinamento e aglomeração dos animais são elementos determinantes para
a epidemiologia da doença (BEDARD, 1993; HINES et al., 1995; HERMANDEZ,
1998).
A freqüência da infecção é mais alta em vacas leiteiras do que em bovinos de
corte, porque sua vida econômica útil é mais prolongada, e estes animais
apresentam um maior contato quando eles se reúnem para a ordenha (ACHA &
SZYFRES, 2001). Animais criados em sistemas de manejo intensivo ou
confinamento estão mais predispostos a desenvolver a doença posto que, quanto
20
21
maior o contato entre os animais, maior é a chance de transmissão da doença
(RADOSTISTS, et al., 2000).
O M. bovis é moderadamente resistente ao calor e pode permanecer viável
em estábulos, pastos, estercos e em locais onde se enterrem cadáveres, por
períodos de 6 meses a 4 anos (CORREA e CORREA, 1992; ROXO, 1996). A água
parada pode ser uma importante fonte de contaminação, pois o bacilo pode
permanecer vivo neste local por até um ano (ROXO, 1996). Além disso, o
microorganismo pode sobreviver por longos períodos nos pastos (RADOSTITS, et
al.,1994).
A eficiência do tratamento não depende somente do tempo e da temperatura
empregados, mas também de outros fatores que afetam a morte térmica dos
microorganismos, como a carga microbiana inicial, a atividade de água, ph, NaCl,
proteínas e porcentagem de gordura dos produtos (CHHABRA, et al., 1999)
Em alguns países a presença de animais silvestres, que atuam como
reservatórios de M. bovis, tornam difícil a erradicação da doença em determinadas
áreas as quais permanecem como áreas endêmicas. (TWEDDLE & LIVINGSTONE,
1994). Esta doença tem um enorme impacto no bem estar dos animais selvagens e
conservação da biodiversidade que normalmente tem sido negligenciada podendo
ate ameaçar espécies em risco de extinção (ROMERO et al., 2008).
A persistência do agente, depois da morte de hospedeiros selvagens pode
ser a fonte da infecção para animais que se alimentam de carcaças e possivelmente,
também para os animais domésticos, que consomem o capim contaminado com
resto de carcaças com tuberculose (MORRIS et al., 1994).
O bovino elimina o bacilo da tuberculose no leite, no ar expirado, no
corrimento nasal, nas fezes, urina, nas secreções vaginais, uterinas, e pelo sêmen
21
22
(ABRAHAO, 1998; RADOSTITS, et al., 2000). Na maioria dos casos a transmissão
de bovino para bovino é a ocorrência mais freqüente, facilitando a disseminação e
persistência do M. bovis na população (HADDAD, et al., 2004). As principais vias de
infecção por M. bovis são a respiratória e a alimentar (RODOSTITS, et al., 1994). A
transmissão placentária nos bovinos pode ser considerada rara ou inexistente. As
vias de transmissão referidas com menor freqüência são a intra-uterina, o coito e a
inseminação artificial, através do sêmen contaminado (NEIL et al., 1994; ROXO,
1996).
2.5 Diagnóstico da Tuberculose Bovina
Para realização do diagnóstico da tuberculose pode-se recorrer aos métodos
clínicos,
alérgicos,
bacteriológicos,
sorológicos
e/ou
anatomopatológicos
(ROSENBERGER et al., 1989) e mais modernamente através de técnicas
moleculares como a PCR (ROXO, 1996).
Apesar das dificuldades, o exame anatomopatológico é muito importante para
o diagnóstico da tuberculose bovina. Isto pode ser confirmado com base nos bons
resultados preliminares alcançados pelos programas de controle, implementados em
regiões com alta prevalência da doença, onde o exame post-mortem convencional
detecta cercas de 47% de lesões presuntivas de tuberculose em carcaças de
bovinos abatidos (CORNER, 1994; LAGE et al., 1998).
A histopatologia é uma forma de diagnóstico complementar ao exame postmortem de carcaças com lesões presuntivas de tuberculose. Este exame constitui-se
em uma técnica direta ou indireta, detectando o granuloma, considerado a lesão
característica dessa doença. Para se efetivar este tipo de exame devem-se obter
22
23
fragmentos das lesões, com espessura de até 1 cm, abrangendo preferencialmente,
a zona de transição entre a área lesada e a aparentemente normal. Os fragmentos
devem ser colhidos e acondicionados em frascos de boca larga, contendo formol a
10% em volume 10 vezes maior que o do material a ser fixado (LEMOS, 1998;
CASSIDY, et al., 1999). O exame histopatológico das lesões, embora requeira
pessoal e laboratórios especializados, permitem a confirmação da presença da lesão
granulomatosa característica na maioria dos casos duvidosos de lesões sugestivas
de tuberculose (FRAGUAS et al., 2008).
O diagnóstico imunológico da tuberculose bovina é baseado em reações
alérgicas in vivo, através da prova tuberculínica. Esta se constitui em um método
indireto de diagnóstico da tuberculose e deve ser efetuada somente em animais com
idade igual ou superior a seis semanas (BRASIL, 2006). Não deve ser efetuado novo
teste antes de 60 dias, pois podem ocorrer resultados falsos negativos (RIETCORREA et aI., 2001). A aplicação indevida da tuberculina pode interferir no
resultado do teste. Após a tuberculinização, os animais apresentam sua capacidade
de responder a novos testes, diminuída (dessensibilização) (MONAGHAN et al.,
1994). Da mesma forma, essa prova não deve ser realizada no intervalo de 15 dias
antes do parto e até 15 dias após o parto, pois uma hipossensibilidade relativa
ocorre neste período (SMITH, 1993; BRASIL, 2006). Essa perda da sensibilidade é
provavelmente decorrente de reduzida atividade imunológica geral, que ocorre
associada ao parto (RADOSTITS et al., 2002). Quando a prova é realizada neste
período, os animais deverão ser retestados 60 a 90 dias após o parto, obedecendo a
um intervalo mínimo de 60 dias entre testes (BRASIL, 2006).
A prova da tuberculina deve ser realizada somente pelo médico veterinário
cadastrado, com equipamento adequado, utilizando tuberculina refrigerada, nunca
23
24
congelada. A tuberculina deve ser injetada sempre por via intradérmica, formando
uma pápula, e devendo ser repetida quando for injetada por via subcutânea (RIETCORREA et aI., 2001)
A tuberculina é atualmente denominada de derivado protéico purificado ou
proteína purificada derivada (PPD), amplamente utilizada para o diagnóstico indireto
in vivo da tuberculose bovina; na apresentação de PPD bovino, correspondente ao
extrato antigênico de proteína purificada, derivado da amostra AN5 de M. bovis e de
PPD aviário, que é sintetizado a partir da amostra D4 de M. avium (MONAGHAN et
al., 1994).
Animais em estado adiantado da doença podem desenvolver o fenômeno da
anergia, que se caracteriza pela ausência de reatividade ao teste cutâneo
tuberculínico,
podendo
ocasionar
resultados
falso-negativos
interferindo
no
diagnostico. Este fenômeno também pode ser observado em casos de infecção
recente por M. bovis, entre 30 e 50 dias, final de gestação, parto recente,
desnutrição e uso inadequado de drogas imunossupressoras. Além disso, variações
inerentes ao teste, tais como dose de inóculo, cuidados com a armazenagem e
conservação e a própria tuberculina utilizada, somados às possíveis variações nos
métodos de realização, critérios de leitura e formas de interpretação do teste, podem
contribuir para o aumento da ocorrência de resultados falso-negativos (MONAGHAN
et al., 1994; ROXO, 1997).
A prova da tuberculina pode ser realizada apenas com o PPD bovino,
conhecida então como teste intradérmico simples, ou então pode ser feita
comparando-se as reações provocadas pela estimulação dos PPDs bovino e o
aviário simultaneamente (MONAGHAN et al., 1994).
24
25
O teste intradérmico simples nos bovinos pode ser feito na região cervical ou
da prega ano-caudal. Para a realização da prova intradérmica simples cervical, fazse primeiramente a tricotomia de uma área quadrada da pele, com cerca de três
centímetros de lado, situada cranialmente à espinha da escápula. Após isto, faz-se
uma dobra vertical da pele nessa área e mede-se sua espessura com o auxílio de
um cutímetro. Logo em seguida injeta-se, por via intradérmica, 0,1mL de tuberculina
bovina na parte dorsal da prega da pele, com auxílio da seringa com dosagem
automática. A reação do animal à tuberculina injetada é avaliada 72h ± 6h, após a
tuberculinização (BRASIL, 2006). Para observação do resultado, deve-se medir
novamente a espessura da pele no local da injeção e, subtraindo-se deste número o
valor de espessura inicial, calcula-se o aumento da espessura da pele (em
milímetros). Além disso, a respectiva área deve ser inspecionada e palpada para
verificar a presença de outras alterações, como exsudação, edema, endurecimento
e necrose no local de aplicação (CARTER 1988; CORRÊA & CORRÊA, 1992;
SMITH, 1993; RADOSTITS et aI., 2002; BRASIL, 2006).
A avaliação da prova intradérmica cervical simples é feita avaliando-se o
aumento da espessura da dobra da pele onde aplicou-se o PPD bovino,
considerando-se como uma reação negativa, um aumento da espessura da pele de
até 1,9mm, como reação inconclusiva, um aumento de 2,0 a 3,9mm, sem exsudação
e necrose, e reação positiva, tendo, ao menos 4mm de aumento (BRASIL, 2006).
Na prega caudal, a tuberculina bovina é inoculada por via intradérmica na
dosagem de 0,1 mL, seis a dez centímetros da base da cauda, na junção das peles
pilosa e glabra. A leitura é realizada no mesmo momento do teste cervical simples,
mas através da avaliação visual e pela palpação, sendo considerado reagente o
animal que apresentar qualquer aumento da espessura da prega inoculada. No
25
26
Brasil este teste é utilizado somente em bovinos de corte (BRASIL, 2006). Um
pequeno
número
de
reações
inespecíficas
pode
ocorrer
em
animais
tuberculinizados, visto que o teste simples caudal tem uma especificidade de 96 a
98,8% (MONAGHAN et al., 1994). Segundo KANTOR et al. (1984) as vantagens
principais do teste simples caudal são: a alta sensibilidade, similar ao teste cervical
simples, facilidade, rapidez de aplicação e leitura, como também alta especificidade,
servindo apropriadamente para fins de triagem de rebanho. Sensibilizações não
específicas constituem-se numa realidade na região sudeste do Brasil e geram
dificuldades aos médicos veterinários que se utilizam apenas da tuberculinização
simples (LANGENEGGER et aI., 1981). O teste cervical comparativo teria uso
limitado a elucidar rebanhos com grande número de inconclusivos. Segundo
REBHUN (2000), o teste cervical comparativo é considerado como tendo
aproximadamente 85% de sensibilidade e 98% de especificidade.
Um dos problemas na interpretação da reação à tuberculina são as
denominadas reações inespecíficas, que ocorrem em conseqüência de outras
micobactérias patogênicas, facultativamente patogênicas ou saprófitas para os
bovinos (RIET-CORREA et aI., 2001). Nesses casos, recomenda-se a realização da
prova comparativa. Para isso, recomenda-se a inoculação da tuberculina aviária em
um ponto da pele situado cranialmente à espinha da escápula e a tuberculina bovina
caudalmente, a cerca de 15 a 20 cm da primeira (BRASIL, 2006), devendo a
inoculação ser efetuada de um mesmo lado de todos os animais do estabelecimento
de criação. A avaliação, realizada 72h ± 6h, baseia-se nos critérios preconizados
pelo Ministério da Agricultura, avaliando-se o aumento da espessura da dobra da
pele onde aplicou-se PPD bovino e PPD aviário (BRASIL, 2006).
26
27
O teste de ELISA e a cultura bacteriológica, além de apresentarem
desvantagens quanto ao tempo de realização, custo e necessidade de laboratório
especializado, não apresentaram vantagens significativas que justifiquem sua
adoção como métodos complementares de diagnóstico da tuberculose bovina em
animais reativos à tuberculinização. (FRAGUAS et al., 2008). Outros testes
sorológicos, como fixação do complemento e a imunofluorescência, apresentam
pouco valor potencial para o diagnóstico da tuberculose (RADOSTITS et aI., 2002).
Outro teste imunológico é o de detecção da produção de interferon-gama
específico (IFN-γ), um método de diagnóstico indireto in vitro, realizado em amostras
heparinizadas de sangue total de animais suspeitos, com o objetivo de mensurar a
produção de interferon (WOOD & JONES, 2001). Trata-se de um ensaio
imunoenzimático através do qual é possível se verificar a existência de resposta
imune mediada por células, desenvolvidas pelo organismo do animal em resposta à
infecção micobacteriana. O IFN-γ produzido pelo linfócito T do animal infectado é
detectado através do teste de ELISA de captura, utilizando-se anticorpos
monoclonais anti-IFN-γ. A ausência de detecção de IFN-γ caracteriza a negatividade
do animal para infecção pelo M. bovis uma vez que os linfócitos de bovinos não
infectados não produzem esta quimiocina de forma específica. Como se trata de um
teste in vitro tem a vantagem de não interferir no estado imune do animal, podendo
ser repetido no mesmo animal sem a necessidade de respeitar o período de
dessensibilização (MADRUGA et al., 2001).
Utiliza-se, atualmente, em alguns países o teste de IFN-γ junto com o teste
intradérmico (REBHUN, 2000).
O isolamento do M. bovis é um método direto de diagnóstico, considerado
como “padrão-ouro”. Porém, o longo período requerido para o isolamento e
27
28
identificação bioquímica do agente é um dos seus pontos de estrangulamento, já
que pode demandar até 12 semanas para a conclusão definitiva do diagnóstico
(COLLINS et al., 1994; CORNER, 1994).
A identificação e determinação de cepas constitui um método adicional útil em
investigações epidemiológicas, pois é um meio para se entender melhor os
mecanismos que influenciam a dinâmica de transmissão e a identificação dos
fatores de risco em uma comunidade. Esta identificação permite a elaboração de um
modelo adequado de medidas de controle, alem de poder ser usada para investigar
propriedades biológicas das linhagens, como virulência e patogenia (KATO et al.,
2001).
A fim de controlar a tuberculose bovina é necessário conhecer quantos e
quais os tipos de M. bovis estão espalhados no campo. Métodos bacteriológicos
clássicos são importantes para o isolamento da bactéria patogênica de amostras dos
animais, mas são incapazes de distinguir os tipos (cepas) entre as mesmas espécies
(JEON et al., 2008).
A PCR representa uma ferramenta de grande ajuda para os métodos de
diagnósticos, sendo a técnica mais difundida desde a sua criação em 1983 (MULLIS,
1990), permitindo a amplificação, in vitro, de um trecho de DNA, inúmeras vezes em
poucas horas. Com a capacidade de identificar e amplificar baixos níveis de DNA
bacteriano (aproximadamente 2 organismos). Uma das vantagens deste método é a
capacidade de reproduzir a replicação natural do DNA, com o beneficio de ser mais
rápido e determinar precisamente o trecho de DNA a ser amplificado, e já no
processo natural de replicação, todo o genoma seria amplificado lentamente
(ANDRADE, 1993).
28
29
Inúmeras são as aplicações do teste de PCR como na medicina forense, no
diagnóstico de doenças genéticas, neoplásicas e infecciosas. Na tuberculose, os
estudos visam o emprego desta técnica, seja a partir de cultura com o agente já
isolado ou através de amostras clinicas (SAKAMOTO et al., 1999).
A detecção de DNA micobacteriano em amostras clínicas pela reação em
PCR é uma promessa para o diagnostico rápido da infecção tuberculosa. Contudo,
os resultados de PCR, devem ser corrigidos para a presença de inibidores, assim
como para a contaminação por DNA (GARG et al., 2003). O desenvolvimento e o
refinamento destes ensaios são necessários antes que eles se tornem o método de
escolha do diagnóstico post-mortem, fazendo com que no futuro imediato o
diagnóstico continue a ser baseado no cultivo bacteriológico (COLLINS, et al., 1994),
principalmente quando existir a necessidade da realização de testes de sensibilidade
a drogas antimicrobianas.
O método de PCR é muito sensível para diagnostico de culturas de
micobacterias, mas não apresenta o mesmo resultado para amostras clínicas,
principalmente em tecidos, isto devido a pequena quantidade de bacilos. Para que a
técnica tenha uma performance melhor que a cultura, a sensibilidade do método de
extração é essencial. As diversidades de metodologias e de materiais empregados
dificultam a comparação da sensibilidade entre eles (RORING et al., 2000).
Apesar de ser um método promissor, o seu uso, especialmente em locais com
altos índices da doença é limitado devido ao custo e a complexidade do método
(KLASTER, et al., 1998).
As principais barreiras para a aplicação do método de PCR na rotina
laboratorial é a extração de DNA e a escolha de oligonucleotídeos iniciadores
adequados. Estudos relacionados com os métodos de extração existem, mas
29
30
emprega soluções ou kits comerciais inadequados a realidade do produtor brasileiro.
A maior dificuldade no processo de extração esta relacionada principalmente a
pequena quantidade de bacilos presentes em lesões de bovinos tuberculosos, a
dificuldade em concentrar o DNA no “pellet” e a presença de DNA do animal, alem
do DNA do agente, ainda a presença de inibidores em amostras pode interferir com
seu desempenho (HADDAD et al, 2004; SINGH et al., 2004; BRASIL, 2005).
Quanto ao emprego da PCR para diagnóstico da tuberculose bovina, esta
reação vem sendo amplamente avaliada na detecção de micobactérias do complexo
M. tuberculosis em colônias cultivadas em leite, em tecidos frescos, e em tecidos
fixados em formol e embebidos em parafina (LEITE et al., 2003).
Devido ao diagnóstico e o crescimento muito lento, a identificação de M. bovis
pelos métodos convencionais de bioquímica é complicada e demorada. A reação em
cadeia da polimerase (PCR) é uma ferramenta sensível, de diagnostico rápido, que
pode ser utilizada para detectar o agente, em amostras clínicas em 48h, mas a
presença de inibidores em amostras pode interferir com seu desempenho (HADDAD
et al., 2004; BRASIL, 2005). Assim, para o diagnóstico definitivo da tuberculose
ainda é necessário seu cultivo.
O método de visualização de micobactérias através da coloração de Ziehl
Neelsen, só consegue revelar a presença de bacilos álcool acido resistentes em
concentrações superiores a 104 bactérias/mL, sendo que esta técnica não permite
distinguir dentre os membros da família Mycobacteriaceae (BARKSDALE & KIM,
1977).
Os adventos das técnicas moleculares contribuíram grandemente para a
identificação e tipificação de M. bovis. Tais técnicas também favorecem a
identificação de M. bovis num curto espaço de tempo.
30
31
2.6 Genotipagem aplicada ao estudo da Tuberculose Bovina
A tuberculose é um exemplo de doença infecciosa em que as técnicas de
biologia molecular permitiram a obtenção de informações que seriam difíceis ou até
mesmo
impossíveis
de
serem
obtidas
através
de
métodos
laboratoriais
convencionais. A tipagem molecular tem importância preponderante no que diz
respeito ao monitoramento da transmissão da tuberculose nos países endêmicos
(SANTOS et al., 2007).
Os métodos de tipagem molecular são úteis para a diferenciação dos
membros do complexo M. tuberculosis. Estes consistem em 4 espécies
relacionadas: M. tuberculosis, M. bovis, M. microti e M. africamum (TSUKAMURA,
1983), as quais, apesar de demonstrarem diferenças fenotípicas, possuem um
elevado grau de identidade genética (DOMENECH et al., 2001). Os genomas
dessas espécies são ricos em DNA repetitivo (COLE et al., 1998), fato que tem sido
explorado pela tipagem molecular. Os conhecimentos adquiridos a partir dessas
análises permitiram a discriminação entre as espécies, bem como correlacioná-lo
com as características clinicas da doença, alem de fornecerem dados como
patogenicidade, adaptação ao hospedeiro e origem (REID et al., 2001).
A epidemiologia molecular revolucionou a compreensão da epidemiologia da
tuberculose permitindo comparação entre linhagens de M. tuberculosis de diferentes
áreas geográficas, rastreamento da movimentação de linhagens individuais,
confirmação de surtos em Instituições e identificação de fatores de risco em
infecções por M. tuberculosis em uma comunidade (FOXMAN & RILEY, 2001;
PANDOLFI et al., 2007). A possibilidade da aplicação de técnicas de biologia
31
32
molecular em estudos epidemiológicos concomitante à epidemiologia clássica, tem
trazido enormes contribuições para melhor entender o as relações entre os
microorganismos e as doenças infecciosas. O estudo da epidemiologia molecular
para M. tuberculosis, é realizado através de diferentes técnicas vigentes como
IS6110-Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP), Spacer Oligonucleotide
Typing (Spoligotyping) e Mycobacterial Interspersed Repetitive Units (MIRU)
(PANDOLFI et al., 2007).
2.6.1 RFLP
O método de tipagem baseada na seqüência IS6110 tem sido usado para
uma variedade de investigações epidemiológicas como confirmação de surtos em
Instituições, identificação de surtos em situações que parecem ser de casos
esporádicos de tuberculose, de fatores de risco para infecções recentes ou para
doenças em progressão rápida, rastreamento geográfico da distribuição de clones
de M. tuberculosis de importância para a saúde pública e avaliação de contaminação
laboratorial cruzada com o M. tuberculosis (FOXMAN & RILEY, 2001).
Um método de tipagem altamente discriminatório, baseado na variação da
seqüência de DNA no genoma bacteriano, denominado de polimorfismo de
comprimento de fragmentos de restrição (RFLP – “Restriction Fragment Lenght
Polymorfism”) vem sendo amplamente utilizado no estudo epidemiológico da
tuberculose. Este método se baseia na digestão da fita de DNA por enzimas de
restrição, denominadas de endonucleases, que geram fragmentos de diferentes
comprimentos. Os fragmentos são então separados em gel de agarose e
hibridizados por sonda de DNA. A seqüência mais utilizada para o estudo
32
33
epidemiológico da tuberculose é a IS6110. Todas as cepas de M. tuberculosis
contem de 1 a 20 cópias de IS6110. A localização, assim como a quantidade de
cópias dessa inserção presente no cromossomo, variam enormemente de cepa para
cepa, mas são relativamente estáveis dentro da mesma cepa (SUPPLY et al., 2001).
Estudos epidemiológicos realizados com a utilização de uma metodologia
padronizada como a RFLP permitem, que os resultados obtidos em diferentes
laboratórios possam ser analisados, o que possibilitaria a comparação entre
linhagens de diferentes áreas geográficas e que a movimentação de linhagens
individuais possa ser rastreada. Dados assim são de grande importância no estudo
da transmissão global da tuberculose e na identificação de linhagens com
propriedades particulares, como alta infectividade, virulência e resistência a drogas.
A análise de grande número de isolados pode gerar respostas para questões de
longa data como a eficiência da vacinação com BCG e a freqüência de reativação
versus re-infecção, questões estas que são de importância crescente com o
surgimento da AIDS pandêmica (van EMBDEN et al., 1993).
O IS6110 é uma seqüência de 1361 pares de base (bp) que foi detectada em
membros do complexo M. tuberculosis e tem se mostrado bastante conservada
entre os diferentes isolados. O número de copias de IS6110 presente no genoma é
espécie e linhagem dependentes (KANDUMA et al., 2003), portanto o IS6110 RFLP
é amplamente aplicado na diferenciação de isolados (NIEMANN et al., 2000). A
técnica é de fácil comparação porque geralmente, apresenta bandas hibridizadas
com igual intensidade, diferentemente de outras técnicas como o Spoligotyping
(KREMER et al., 1999). Por sua utilização mundial, os dados obtidos em qualquer
laboratório podem ser comparados, facilitando o entendimento das cadeias de
transmissão.
33
34
Além de números de copias de IS6110 por linhagem ser variável, de 0 a 25
copias, a posição desses elementos no genoma também é variável, ampliando a
possibilidade de gerar um número maior quantidade de padrões de bandas com
fragmentos de resultantes após o tratamento com enzima de restrição: Pvull (van
EMBDEN et al., 1993).
A maior desvantagem do IS6110 refere-se à exigência de cultura de várias
semanas, com organismos viáveis para obtenção de DNA em grande quantidade e
de elevada qualidade, além de seu alto custo (BAUER et al., 1999 ;MAGUIRE et al.,
2002).
Segundo HILTY et al., 2005, a RFLP tem seu poder discriminatório baixo para
tipagem de M. bovis. Entretanto, a tipagem de linhagem e IS6110 por RFLP são
sempre instrumentos úteis apesar de serem menos discriminatórios que outros
métodos de tipagem para M. bovis (JEON et al., 2008).
Em humanos, o método mais freqüentemente utilizado para diferenciar cepas
de M. tuberculosis é o de IS6110-RFLP que, aliado aos dados do paciente, permite
que se estabeleça uma correlação epidemiológica. Entretanto, apesar dos
resultados promissores, a técnica de RFLP é trabalhosa, necessitando de pessoal
altamente qualificado para a realização do ensaio, sendo tendência mundial a
substituição desta técnica por outras de execução mais rápida e facilitada. Dentre
elas, vêm sendo sugeridas técnicas de epidemiologia molecular muito bem aceitas
como o MIRU e o Spoligotyping (COWAN et al., 2005).
A técnica padrão ouro para a tipificação de M. tuberculosis é a RFLP,
utilizando como marcador biológico uma sonda derivada da seqüência de inserção
IS6110 (van EMBDEN et al.,1993; GENEWEIN et al., 1993). A mesma técnica,
porém, quando testada em isolamentos de M. bovis, apresenta uma capacidade
34
35
pequena de discriminação entre elas, ou seja, pouco polimorfismo, porque esta
espécie possui frequentemente um número baixo de copias IS6110 em seu genoma
(SZEWZYK et al., 1995; COUSINS et al., 1998). Este problema pode ser contornado
com o uso complementar de vários marcadores biológicos. Aplicando as mesmas
estirpes, as sondas genéticas derivadas de DR e PGRS (van EMBDEN et al., 1996)
e possível encontrar padrões polimórficos onde IS6110 não pode diferenciar cepas
(ROMANO et al., 1996; COUSINS et al., 1998)
2.6.2 Spoligotyping
O método de Spoligotyping tem sido usado para acompanhar linhagens com
diferentes aplicações epidemiológicas (WARREN et al., 2002). Por sua simplicidade
é frequentemente utilizando para a tipagem adicional para linhagens com menos 5
copias IS6110 (BAUER et al., 1999; GOGUET et al., 1997; SUFFYS et al., 2000).
Quando usado em associação com outras técnicas alternativas ao RFLPIS6110, o Spoligotyping se mostra uma técnica rápida, efetiva e econômica
(BRUDEY et al., 2006; LINDSTEDT, 2005).
O Spoligotyping baseia-se na detecção de 43 seqüências espaçadoras
variáveis de 35 a 41bp que separam seqüências repetidas diretas (DR) de 36bp,
existentes na região genômica denominada DR (DIRECT REPEAT) (DUARTE et al.,
2007).
Através do Spoligotyping podemos detectar a presença ou ausência dos
espaçadores de seqüência conhecida. O primeiro passo no método é amplificar a
região DR da estirpe em estudo, pela PCR. Os oligonucleotídeos iniciadores usados
são baseados na seqüência do DR e permite a amplificação dos espaçadores entre
35
36
as DR’s. O produto da PCR obtido difere em tamanho por duas razões: primeiro, o
amplificado contém muitos espaçadores com suas DR’s se os oligonucleotódeos se
hibridizarem em DR’s não imediatamente vizinhas; segundo, os amplificados em
cada ciclo funcionam eles mesmos como iniciadores e se polimerizam com uma ou
mais DR´s (RODRIGUEZ, 2005).
Por utilizar a PCR em uma das etapas, o Spoligotyping pode ser aplicado
diretamente em amostras clínicas permitindo a detecção, a identificação e a
diferenciação
de
estirpes
de
M.
bovis
simultaneamente
(ARANAZ
et
al.,1996;KAMERBEEK et al., 1997). Assim o Spoligotyping possibilita a detecção e a
tipificação
simultâneas
de
micobacterias
do
Complexo
M.
tuberculosis
(KAMERBEEK et al., 1997), e é indicada como técnica de eleição para a
comparação de estirpes com poucas copias de IS6110. Outra vantagem é a
diferenciação entre M. bovis e M. tuberculosis pela ausência e presença,
respectivamente, dos espaçadores 39 ao 43. Novos espaçadores estão sendo
estudados para tentar melhorar seu polimorfismo (RODRIGUEZ, 2005).
A discriminação molecular de isolados de M. bovis através do Spoligotyping é
uma técnica nova, sofisticada, mas não apresenta grande dificuldade na sua
realização constitui-se numa ferramenta valorosa para dar apoio e racionalidade ao
sistema de vigilância para detecção de focos de tuberculose bovina, sistema este de
grande importância para as áreas de baixa prevalência de focos, como parece ser
grande parte do território brasileiro (RODRIGUEZ, 2005).
A técnica molecular de Spoligotyping pode ser empregada em investigação
epidemiológica, permitindo a identificação do curso da infecção e das rotas de
transmissão da doença, ou mesmo a compreensão da epidemiologia da infecção,
36
37
que são fundamentais para um melhor controle e erradicação da doença (ROMANO
et al., 1996; ZANINI et al., 2001).
O Spoligotyping tem sido extensamente aplicado no estudo da epidemiologia
molecular da tuberculose. Esse método baseia-se no polimorfismo do DNA dentro
do locus de repetição direta (direct repeat - DR locus) de M. tuberculosis. A variação
dos espaçadores dentro das regiões DRs conservadas é utilizada para diferenciar
por reação da polimerase em cadeia (Polymerase Chain Reaction- PCR) as cepas
de M. tuberculosis (GROENEN et al., 1993). A técnica de Spoligotyping é prática e
menos dispendiosa do que a de RFLP, somada a vantagem de se encontrar bases
de dados no mundo todo, o que permite a comparação de perfis e a compreensão
da transmissibilidade da tuberculose ao redor do mundo (SOLA et al., 2001).
O polimorfismo é proporcionado por estes espaços, os quais são variáveis em
comprimento (de 34 a 41) seqüência e número (van SOOLINGEN et al., 1991).
Embora esses espaços sejam variáveis, cada um é comum para um grupo de
linhagens (GOGUET et al., 1997). Este polimorfismo é provavelmente duplo para
recombinações homologas entre DRs vizinhas ou distantes e para rearranjos
dirigidos para o elemento de inserção IS6110, o qual esta presente na região DR de
muitas linhagens de M. tuberculosis. Visto que regiões DRs são bem conservadas
entre as linhagens de M. tuberculosis, cada copia DR dentro do locus DR é um
potente alvo para a amplificação pela PCR (KAMERBEEK et al., 1997).
Através do uso da técnica de Spoligotyping foi possível a caracterização de
M. tuberculosis da família clonal Beijing caracterizada pela resistência a múltiplas
drogas e documentada vantagem seletiva em relação a outras famílias do complexo
M. tuberculosis. (van SOOLOINGEN et al., 1995; GLYNN, et al., 2002). Entretanto,
37
38
para M. bovis seu poder discriminatório é baixo, deixando a desejar na genotipagem
de cepas.
2.6.3 MIRU
Devido à maioria dos isolados de M. bovis ter uma ou poucas copias de DR
ou IS6110, respectivamente, o método MIRU mostrou-se mais reprodutível, estável e
sensível para o complexo M. tuberculosis do que IS1610 RFPL (JEON et al., 2008).
Outro fator limitante a aplicação da RFLP em maior escala e a necessidade de
grande massa de DNA o que demandaria subcultivos das micobacterias isoladas,
isso forma desejável o emprego de métodos de tipificação em PCR (ou amplificação
gênica) como o Spoligotyping e MIRU.
A técnica de MIRU (Mycobacterial Interspersed Repetitive Units) que é uma
técnica baseada na PCR, foi desenvolvida e aperfeiçoada por Supply et al. (2000,
2001) e se baseia no estudo de VNTRs (Variable Number of Tandem Repeats),
seqüências que se repetem (tandem repeats) até centenas de vezes. A técnica de
MIRU consiste em um sistema altamente reprodutível e rápido, e nesta, há geração
de genótipos confiáveis baseado no estudado detalhado de 12 loci semelhantes à
mini-satélites contendo VNTRs do genoma do complexo M. tuberculosis (Figura 1)
(SUPPLY et al., 2001). Esta técnica possibilita uma comparação entre linhagens de
diferentes áreas geográficas e permite o rastreamento da movimentação de
linhagens individuais (SUPPLY et al., 2000; MAZARS et al., 2001; SUPPLY et al.,
2001) de forma semelhante à técnica de RFLP sendo, no entanto de execução muito
mais fácil. Este tipo de abordagem torna possível maior numero de analises e
38
39
identificação de mais focos de contágio na população, podendo-se assim estudar
métodos mais adequados para interromper a transmissão da doença.
SAVINE et al., 2002, relatam em suas pesquisas que os 12 loci de MIRU são
bastante estáveis dentro de um período superior a 6 anos num grande número de
linhagens e de “backgrounds” genéticos. Baseado nessa estabilidade de MIRUs, a
descoberta de variações no genótipo de MIRU pode auxiliar na definição de reinfecção exógena que é normalmente baseada na observação da variação de no
mínimo 3 a 4 bandas de IS6110 RFLP. Esse recurso é particularmente importante
para estimar os níveis de sucesso dos programas de controle de tuberculose e
avaliação de novos métodos clínicos e novas terapias. Esses resultados indicam que
a tipagem com MIRU pode ser utilizada como uma ferramenta de primeira linha para
o estudo da diversidade genética de isolados de M tuberculosis em larga escala.
Figura 1: Representação esquemática da posição dos 12 loci de MIRU no
cromossomo da cepa padrão de M. tuberculosis H37Rv (MOKROUSOV et
al., 2005).
A tipagem MIRU é baseada na PCR, produzindo dados facilmente manejáveis
para serem aplicados nos estudos de epidemiologia molecular global do complexo
39
40
M. tuberculosis (MAZARS, et al., 2001). Para revelar o número de repetições em
sequência (“tandem”), a PCR é realizada com oligonucleotideos iniciadores
destinados a amplificar o VNTR selecionado. A presença e o tamanho do produto da
PCR são determinados por eletroforese em gel de agarose. Com base no
conhecimento do tamanho de diferentes repetições, o número de repetições é
calculado, de acordo com dados já publicados (Figura 2) (COWAN et al., 2002). Esta
tipagem tem se mostrado muito informativa, pois se baseia na repetição do número
de copias em locus especifico. (SANTOS et al., 2007).
Figura 2: Demonstração do método de MIRU. As setas pretas maiores, apontadas
no gel, representam amplificados de duas cepas distintas, empregando
oligonucleotídeos iniciadores do locus 10. Na cepa A o esquema mostra
quatro repetições da seqüência repetitiva, enquanto na cepa B a repetição
ocorre três vezes. Neste exemplo, o tamanho de cada seqüência
repetitiva é de 53 bp, gerando uma diferença de tamanho molecular entre
os diferentes alelos do locus (que são diferentes no número de cópias da
seqüência repetida), permitindo assim a análise do polimorfismo alélico
neste locus de MIRU (PANDOLFI, 2006).
40
41
A identificação do locus de MIRU mostrou ser igualmente aplicável para
tipagem de M. bovis, o qual tem se demonstrado ser de difícil tipagem pelos
métodos existentes (ROMERO et al., 2008). Esta técnica tem discriminação similar
ao RFLP-IS6110 em linhagens com grande número de copias do elemento IS6110 e
se mostra melhor quando as linhagens possuem número reduzido de copias (LEE et
al., 2002).
Segundo um consenso recente da União Européia sobre a determinação de
novos marcadores e técnicas para epidemiologia e controle da tuberculose, o
método de tipagem MIRU poderá substituir o IS6110 em futuro próximo (KANDUMA
et al., 2003)
O método de MIRU mostrou se mais reprodutível, estável e sensível para o
complexo M. tuberculosis do que IS1610 RFPL (JEON et al., 2008).
A técnica de MIRU tem como vantagem uma capacidade discriminatória maior
que o Spoligotyping e como desvantagem necessitar de vários oligonucleotídeos
iniciadores com diferentes protocolos de amplificação para análise de uma única
amostra (RODRIGUEZ, 2005).
Seqüências MIRU têm sido empregadas em estudos epidemiológicos. Elas
estão distribuídas em vários loci, variando de 40 a 100 bp. Para análise, cada MIRU
é amplificada separadamente pela PCR, usando oligonucleotídeos indicadores que
flanqueiam a seqüências e o número de repetições das seqüências foi calculado
pelo tamanho do produto amplificado (RODRIGUEZ, 2005).
Uma infecção com múltiplas linhagens pode ser difícil de ser detectada e a
análise combinada de MIRU pode ser um instrumento disponível para a
disseminação de cepas mistas (ROMERO et al., 2008).
41
42
A Tipagem MIRU é provavelmente aplicável a M. avium e pode ser útil para
outras espécies de bactérias (FROTHINGHAM & O´CONELL, 1998).
Os estudos de loci de MIRU são instrumentos valiosos na tipagem de
linhagens de M. bovis, tanto se usados em isolados de campo e também em
desenvolvimentos futuros de epidemiologia molecular. A tipagem por análise de
MIRU também demonstrou ser uma técnica promissora, com excelente potencial a
ser otimizado e desenvolvido para uso em larga escala em pesquisas
epidemiológicas. A variação molecular foi previamente pesquisada para determinar a
relação evolucionária entre organismos (RORING et al., 2002).
Os estudos de MIRU têm sido especialmente úteis na genotipagem de
bactérias patogênicas que possuem, à semelhança do complexo M. tuberculosis, um
genoma muito conservado como Bacillus anthracis ou Yersina pestis (LINDSTEDT,
2005).
Os marcadores genéticos podem ser empregados tais como instrumentos
epidemiológicos moleculares no exame quantitativo de semelhanças e diferenças
entre os isolados. Os isolados epidemiologicamente ligados têm sido relacionados
através do uso de tipagem de MIRU (KEIM et al., 1999; SUPPLY et al., 2000).
A evolução e a intensidade com que a técnica de MIRU tem sido empregada
em diferentes problemas da biologia de Micobactérias têm gerado um avanço
considerável nesta área, o que pode demonstrar a importância dos estudos de MIRU
para o desenvolvimento mais acelerado da epidemiologia molecular e sugerir a
necessidade de novos estudos, implementando este método e comparando o
emprego de diferentes técnicas moleculares na epidemiologia e filogenia de
Micobactérias, bem como a utilização de mais de um método para a obtenção de
resultados ainda mais discriminatórios (PANDOLFI, 2006).
42
43
3. OBJETIVOS
O presente trabalho teve como objetivo geral estudar a epidemiologia da
tuberculose bovina, pela técnica molecular de MIRU, utilizando amostras de DNA
genômico provenientes de cultivos de Mycobacterium bovis, isolados de carcaças de
bovinos em abatedouro, no Estado de Mato Grosso do Sul, no período de 2005 a
2007.
Com este estudo, objetivou-se alcançar os seguintes objetivos específicos.
-
Identificar, por técnica molecular, espécies do gênero Mycobacterium.
-
Agrupar por similaridade epidemiológica as amostras estudadas;
-
Comparar os resultados obtidos pela técnica de MIRU;
-
Avaliar a presença efetiva de grupos genéticos predominantes;
-
Correlacionar os dados moleculares com o auxílio do programa PAST
versão 1.81 (Paleontological Statistics).
-
Verificar a relação epidemiológica entre as cepas isoladas;
43
44
4. MATERIAL e MÉTODOS
4.1 Amostras de DNA:
Foram incluídas neste estudo 78 amostras de DNA previamente extraídas de
cultivos micobacterianos isolados de lesões compatíveis com granulomas obtidas
durante a inspeção de carcaças em abatedouros de bovinos no Estado do Mato
Grosso do Sul. Estas amostras de DNA encontravam-se estocadas a -20oC, no
Laboratório de Micobacteriologia da Faculdade de Ciências Farmacêuticas de
Araraquara, UNESP, e foram gentilmente cedidas pela Profa. Dra. Clarice Queico
Fujimura Leite, para a realização deste estudo.
As amostras de DNA genômico encontravam-se acondicionadas a mais de 24
meses em congelador a -20oC, portanto fez-se necessária nova identificação
molecular das mesmas, pela PCR, para a seleção de amostras contendo DNA não
degradado, que pudesse ser empregado posteriormente na etapa de genotipagem.
4.2 Diagnóstico molecular das amostras
Os ensaios foram realizados empregando a técnica de TELENTI et al.(1993).
O diagnóstico das amostras de DNA foi realizado com o emprego dos
oligonucleotídeos iniciadores que amplificam fragmento da proteína
hsp 65
de
430bp específico de gênero Mycobacterium:
- Tb11- 5’ ACCAACGATGGTGTGTCCAT 3’
- Tb12- 5’ CTTGTCGAACCGCATACCCT 3’.
Para a realização da PCR, 5,0 µL de amostra de DNA foram submetidos a
amplificação sob as seguintes condições: em tubos de 0,2 mL foram acrescentados
2,5 µL de tampão de PCR 10 x, 0,5 µL de dNTPs (10 mM cada), 0,6 µL de 5 µM de
44
45
cada oligonucleotídeo iniciador (Tb11 e Tb12), 0,5 µL de Taq DNA - polimerase
(Invitrogen número de cat. 11615-028 ) e água ultra-pura estéril até completar o
volume de 25µL, como pode ser observado no quadro 1.
Quadro 1: Concentração de estoque (C.E.), concentração final (C.F.) e volume
(VOL.) dos reagentes utilizados em uma PCR para a identificação de uma
amostra M. bovis.
REAGENTE
C.E.
C.F.
VOL.
10 vezes
01 vez
2,5µL
MgCl2
50mM
2mM
1µL
DNTPs
10mM
0,5mM
0,5µL
Oligonucleotídeo Tb11
5µM
0,2µM
0,6µL
Oligonucleotídeo Tb12
5µM
0,2µM
0,6µL
DNA da amostra
-
-
5µL
Água ultrapura
-
-
16,3µL
Taq DNA pol.
5U/µL
2,5 U
0,5µL
-
-
25µL
Tampão de PCR
Volume final da reação
O produto de amplificação de 430bp, confirmatório para o gênero
Mycobacterium, foi resolvido por eletroforese em gel de agarose a 1% acrescido de
brometo de etídio (TBE 0,5x), corrido paralelamente ao padrão de tamanho
molecular de 100 pares de base. Os produtos de amplificação foram visualizados,
através
da
exposição
do
gel
à
luz
ultravioleta,
em
transiluminador
ou
alternativamente com o auxílio de um equipamento de fotodocumentação digital
Alfa-imager 2200 (Alfa Innotech Corporation), que permite a digitalização da imagem
do gel.
45
46
4.3 Genotipagem das amostras: Técnica de MIRU
4.3.1 Oligonucleotídeos iniciadores dos loci de MIRU
As sequências dos oligonucleotídeos empregados na amplificação dos 12 loci
de MIRU, conforme descrito por SUPPLY et al., (2000), com modificações, são
demonstradas no quadro 2.
Quadro 2: Sequências dos oligonucleotídeos iniciadores referentes aos 12 loci de
MIRU, conforme descrito por Supply et al., (2001), com modificações.
Locus de MIRU Identificação
2
4
10
16
20
23
24
26
27
31
39
40
2F
2R
4F
4R
10F
10R
16F
16R
20F
20R
23F
23R
24F
24R
26R
26F
27F
27R
31F
31R
39F
39R
40F
40R
Seqüência do oligonucleotídeo
TggACTTgCAgCAATggACCAACT
TACTCggACgCCggCTCAAAAT
gCgCgAgAgCCCgAACTgC
gCgCAgCAgAAACgTCAgC
gTTCTTgACCAACTgCAgTCgTCC
gCCACCTTggTgATCAgCTACCT
TCggTgATCgggTCCAgTCCAAgTA
CCCgTCgTgCAgCCCTggTAC
TCggAgAgATgCCCTTCgAgTTAg
ggAgACCgCgACCAggTACTTgTA
CTgTCgATggCCgCAACAAAACg
AgCTCAACgggTTCgCCCTTTTgTC
CgACCAAgATgTgCAggAATACAT
gggCgAgTTgAgCTCACAgAA
TAggTCTACCgTCgAAATCTgTgAC
CATAggCgACCAggCgAATAg
TCgAAAgCCTCTgCgTgCCAgTAA
gCgATgTgAgCgTgCCACTCAA
ACTgATTggCTTCATACggCTTTA
gTgCCgACgTggTCTTgAT
CgCATCgACAAACTggAgCCAAAC
CggAAACgTCTACgCCCCACACAT
gggTTgCTggATgACAACgTgT
gggTgATCTCggCgAAATCAgATA
46
47
As amplificações foram realizadas individualmente, utilizando-se 12 pares de
oligonucleotídeos, conforme descrito por Supply et al. (2000), modificado.
Para cada reação, com volume final de 25µL, foram utilizados 23µL de Master
Mix, 2µL de amostra de DNA e 1µL de cada oligonucleotídeo iniciador (40µM) e
23µL de água ultra-purificada autoclavada.
O quadro 3 demonstra as concentrações de estoque e de reação de cada
componente da PCR empregados.
Quadro 3: Resumo do protocolo de PCR com os reagentes, suas concentrações de
estoque (C.E.), os volumes utilizados (VOL.) e as suas concentrações
finais (C.F.) na reação.
REAGENTE
C.E.
VOL.
C.F.
5U/µL
0,5µL
2,5 U
10 vezes
2,5 µL
01 vez
MgCl2
50mM
1,5µL
3mM
Oligonucleotídeo iniciador R
40µM
1µL
0,8µM
Oligonucleotídeo iniciador F
40µM
1µL
0,8µM
H2O ultrapura
-
14,0µL
-
dNTPs (cada)
10mM
2,5µL
1mM
Amostra de DNA
-
2µL
-
Volume final
-
25µL
-
Taq DNA pol.
Tampão enzima
Os ciclos das reações foram realizados em um termociclador PTC-150
ou alternativamente em um modelo PTC 100 (MJ Research) e constituíram-se de
três passos: o primeiro, denominado de “hot start”, elevou a temperatura da reação a
95oC por 15 minutos e ocorreu apenas uma vez. O segundo, de quarenta ciclos, se
iniciou com temperatura de 94oC por 01 minuto, seguida da temperatura de
hibridização que variou de 48 a 60oC, (dependendo dos pares de oligonucleotídeos
47
48
iniciadores desenhados) por 01 minuto e temperatura de polimerização de 72oC por
02 minutos. O terceiro correspondente ao passo de polimerização final, manteve a
temperatura de 72oC por 10 minutos. Após o término, as reações foram mantidas,
sob refrigeração a 4°C, ainda dentro do equipamento, até que fossem retiradas e
congeladas a -20°C (SUPPLY et al., 2000). Um resumo deste programa de ciclagem
pode ser observado no Quadro 4.
Quadro 4: Resumo dos protocolos de ciclagem de PCR empregado nos testes das
estratégias de PCR.
PASSOS TEMPERATURA
1
95ºC
94ºC
48 a 60ºC
72ºC
72ºC
04ºC
2
3
FUNÇÃO
Desnaturação
Desnaturação
Hibridização
Polimerização
Polimerização final
Refrigeração
TEMPO EM
REPETIÇÕES
MINUTOS
15
1
1
2
10
∞
1
40
1
1
Os produtos de amplificação, de tamanho variável, foram resolvidos por
eletroforese em gel de agarose (DNA TYPING GRADE AGAROSE, GIBCO BRL
número de cat 14610-018) a 2% (TBE 0,5x), corridos paralelamente a padrões de
peso molecular de 25, 50 e 100 pares de base (INVITROGEN - respectivamente
números de cat., 10597-011, 10416-014, 15628-019); o gel foi corado com brometo
de etídio e os produtos de amplificação foram visualizados, através da exposição do
gel à luz ultravioleta, em transiluminador ou alternativamente com o auxílio de um
equipamento de fotodocumentação digital Alfa-imager 2200 (Alfa Innotech
Corporation), que permite a digitalização da imagem do gel e a sua impressão em
papel térmico.
48
49
4.4 Análise dos amplificados de MIRU e sua classificação em alelos para cada
um dos 12 loci estudados
Após a obtenção dos amplificados de todas as amostras para um dado locus,
foram determinados os tamanhos dos fragmentos em pares de base. Com essa
informação, foi consultada uma tabela, publicada por Mazars et al. (2001), que
relaciona os tamanhos obtidos, em pares de base, com um determinado valor
referente a cada alelo do locus em estudo (Quadro 5).
Quadro 5: Correlação entre os tamanhos dos amplificados e os alelos de MIRU
Alelo
MIRU
02
04
10
16
20
23
24
26
27
31
39
40
0
402 175 482 565 437 150 395 285 498 492 540 354
1
455 252 537 618 514 200 447 336 551 545 593 408
2
508 329 590 671 591 253 501 387 604 598 646 462
3
561 406 643 724 668 306 555 438 657 651 699 516
4
614 483 696 777 745 359 609 489 710 704 752 570
5
667 560 749 830 822 412 663 540 763 757 805 624
6
720 637 802 883 899 465 717 591 816 810 858 678
7
773 714 855 936 976 518 771 642 869 863 911 732
8
826 791 908 989 1053 571 825 693 922 916 964 786
9
879 868 961 1042 1130 624 879 744 975 969 1017 840
10
932 945 1014 1095 1207 677 933 795 1028 1022 1070 894
11
985 1022 1067 1148 1284 730 987 846 1081 1075 1123 948
12
1038 1099 1120 1201 1361 783 1041 897 1134 1128 1176 1002
13
1091 1176 1173 1254 1438 836 1095 948 1187 1181 1229 1056
14
1144 1253 1226 1307 1515 889 1149 999 1240 1234 1282 1110
15
1197 1330 1279 1360 1592 942 1203 1050 1293 1287 1335 1164
OBS. Quadro construído para permitir a correlação com amplificados obtidos com
“primers” desenhados segundo Supply et al. 2001. Nota-se que são possíveis 15
alelos para cada um dos 12 loci.
49
50
Assim, cada amostra recebeu um valor para cada um dos 12 loci estudados.
Estes resultados foram utilizados na construção de outras tabelas, as quais foram
empregadas na geração de dendrogramas, com a utilização de programa de análise
filogenética. A figura 3, adaptada de PANDOLFI (2006) ilustra o processo.
Figura 3: Demonstração da determinação dos alelos de MIRU a partir das bandas
observadas no gel. A banda em destaque tem tamanho molecular de
696bp e foi obtida por PCR empregando oligonucleotídeos flanqueadores
do locus 10 de MIRU (PANDOLFI, 2006). Consultando a coluna MIRU 10
no quadro 5, observa-se que o valor correspondente a esse tamanho é o
número 4, ou seja, o alelo em questão é o alelo 4 do locus do MIRU 10.
50
51
4.5. Análise por Bioinformática
Os perfis alélicos de cada cepa foram analisados com o auxílio do programa
PAST (Paleontological Statistics Software Package for Education and Data Analysis)
(HAMMER et al. 2001).
51
52
5. RESULTADOS e DISCUSSÃO
5.1 Amostras de DNA:
Foram empregadas neste estudo 78 amostras de DNA que encontravam-se
estocadas a -20oC.
5.2 Diagnóstico molecular das amostras
Das 78 amostras estudadas pela amplificação do fragmento da proteína hsp
65 específico de gênero Mycobacterium, 45 amostras foram diagnosticadas como
positivas, como pode ser observado na figura 4. Este resultado indica que ocorreu
grande degradação do DNA, estocado a -20oC, por longo período de tempo.
O produto de amplificação de 430bp, confirmatório para o gênero
Mycobacterium, foi resolvido por eletroforese em gel de agarose a 1% acrescido de
brometo de etídio (TBE 0,5x), corrido paralelamente ao padrão de tamanho
molecular de 100 pares de base.
Figura 4: Fotografia do gel de agarose a 1%, onde foram resolvidos produtos da
PCR para diagnóstico de M. bovis. Observa-se a presença de amostras
positivas com bandas de 430pares de base de tamanho, nas canaletas de
número 1, 2, 3, 4, 5, 6 e 13. As canaletas 7, 8, 9, 10, 11 e 12 contém
amostras que apresentaram resultado negativo e, portanto foram
desconsideradas para este trabalho.
52
53
5.3 Genotipagem das amostras: Técnica de MIRU
As amplificações realizadas conforme descrito por SUPPLY et al. (2000),
modificado por PANDOLFI (2006) foram resolvidas por eletroforese em gel de
agarose (DNA TYPING GRADE AGAROSE, GIBCO BRL número de cat 14610-018)
a 2% (TBE 0,5x), corridos paralelamente a padrões de peso molecular de 50 e/ou
100 pares de base (INVITROGEN - respectivamente números de cat., 10416-014,
15628-019); o gel foi corado com brometo de etídio e os produtos de amplificação
foram visualizados, através da exposição do gel à luz ultravioleta (Figura 5).
FIGURA 5 - Amplificação de 13 amostras de M. bovis com os oligonucleotídeos
iniciadores específicos para os loci 02 (a esquerda) e 04 (a direita) de
MIRU, respectivamente. As 13 amostras foram dispostas em ordem
crescente.
5.4 Análise dos amplificados de MIRU e sua classificação em alelos para cada
um dos 12 loci estudados
Conforme demonstrado na figura 3, foram determinados os tamanhos dos
fragmentos em pares de base e então os alelos do locus de MIRU em estudo. Estes
resultados são apresentados no quadro 6.
53
54
Quadro 6. Relação das amostras de DNA com seus respectivos alelos.
Amostra
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
33
34
35
36
37
38
39
40
41
42
43
44
45
02
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
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2
2
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2
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MIRU
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3
3
3
3
3
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0
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0
0
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0
0
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0
0
0
0
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2
2
2
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2
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2
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2
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1
1
1
1
1
1
54
55
5.5 Análise por Bioinformática
Os perfis alélicos constantes no quadro 6 foram utilizados na análise pelo
programa PAST (Paleontological Statistics Software Package for Education and Data
Analysis) (HAMMER et al. 2001).
Esse programa foi o responsável pela geração de um dendrograma,
apresentado na figura 6, permitindo-se o agrupamento das amostras estudadas.
Assim,
com
as
amostras
empregadas
neste
estudo,
nestas
condições
experimentais, obtivemos o agrupamento de todas as amostras em um único grupo
ou cluster.
Numa análise inicial, pode-se afirmar que pela técnica de MIRU, empregando
os 12 pares de oligonucleotídeos originais e dentre as 45 amostras estudadas,
nenhuma diferença genotípica foi observada. Estes dados indicam a predominância
de apenas um genótipo de M. Bovis circulante nos rebanhos estudados, localizados
em uma mesma região. A baixa prevalência da tuberculose bovina, muitas vezes
inferior a 1%, aponta a necessidade da avaliação de um número maior de amostras.
Além disso, este resultado aponta também a necessidade do estudo de loci
adicionais de cada amostra, empregando novos conjuntos de oligonucleotídeos
iniciadores. Atualmente a literatura apresenta estudos que utilizam até 24 pares de
oligonucleotídeos, quantidade que representa o dobro da empregada neste estudo.
55
56
11
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37
38
39
40
41
42
Figura 6. Dendrograma obtido através da análise dos dados das amostras de DNA
de M. Bovis provenientes de animais abatidos no Estado do Mato Grosso do Sul,
nos anos de 2005 a 2007, feito pelo programa PAST. A numeração da primeira linha
corresponde às amostras estudadas. Note a formação de um grupo com
similaridade de 100%, simbolizado pela reta em azul.
56
57
6. CONCLUSÃO
O presente trabalho realizou o estudo genotípico de amostras de DNA
provenientes de cultivos de Mycobacterium bovis, isolados de carcaças de bovinos
em abatedouro, no Estado de Mato Grosso do Sul, no período de 2005 a 2007,
empregando a técnica de MIRU.
No decorrer do trabalho, foram identificadas 45 amostras de M. bovis,
posteriormente genotipadas.
Na genotipagem das amostras observou-se que todas as 45 amostras
estudadas foram agrupadas dentro de um mesmo genótipo, caracterizando a
formação de um único cluster, indicando a predominância deste grupo genético,
único e, portanto dominante, dentre as amostras estudadas.
57
58
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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