MANIPULAÇÕES DE
PROTEÍNAS, DNA E
RNA.
BIOLOGIA MOLECULAR
CARLIZE CAMARGO, GÉDRIA ANTUNES

Os estudos mais detalhados sobre a célula e seus componentes,
foram aperfeiçoados quando os estudiosos conseguiram
confeccionar pequenas lentes de qualidade suficientemente alta
para observar células e suas subestruturas.

A partir daí, novos métodos para analisar proteínas, DNA e RNA
estão permitindo aos cientistas estudar células e suas
macromoléculas por meios nunca imaginados anteriormente.
PRINCIPAIS MÉTODOS
UTILIZADOS PARA ESTUDAR
OS COMPONENTES
MOLECULARES DAS CÉLULAS,
PROTEÍNAS, DNA E RNA.
ISOLAMENTO DE CÉLULAS E SEU
CRESCIMENTO EM CULTURA

ISOLAMENTO E ROMPIMENTO DE CÉLULAS
Entender como os componentes e organelas funcionam requer
uma análise bioquímica detalhada.

A maioria dos procedimentos bioquímicos requer que as
células sejam rompidas fisicamente para se ter acesso aos seus
componentes.

Essas manipulações resultam em uma população de células
que podem então ser analisadas, diretamente, ou após seu
número ser aumentado, pela proliferação das células em
cultura.
CÉLULAS PODEM SER ISOLADAS A PARTIR DE
TECIDOS INTACTOS
Isolamento de células
 Um tecido de pele, por exemplo, fornece a fonte de material celular mais
real, uma vez que representam as células encontradas no corpo da
maneira como realmente são, sem nenhuma alteração;

Rompimento da matriz extracelular tratadas com enzimas proteolíticas
(tripsina e colagenase) + EDTA (ácido etilenodiaminotetracético);

O tecido então ser dissociado em células individuais por agitação leve.
Matriz extracelular
une
as
células
dos
animais
e
que
é
composta
de colágeno, proteoglicanos,glicoproteínas, segregadas pelas próprias células.
Preenche os espaços não ocupados pelas células; onde a célula fica ancorada e
assim formar os tecidos.
MATRIZ EXTRACELULAR
SEPARADOR DE CÉLULAS ATIVADO POR
FLUORESCÊNCIA ELETRÔNICO.
A técnica mais comum de separação celular utiliza um anticorpo
ligado a um corante fluorescente para marcar determinadas células
que então podem ser separadas das não marcadas.
 As células deslocam-se em fileira única, em um fluxo preciso,
atravessam um feixe de laser e sua fluorescência é rapidamente
medida.
 Um tubo vibrador gera pequenas gotículas;
 Célula são carregadas automaticamente com uma carga positiva ou
negativa;
 Aglomerados de células detectados pelo seu espalhamento de luz
aumentado são deixados sem carga e descartados em um depósito
de resíduos.


MICRODISSECAÇÃO POR CAPTURA A
LASER

Células selecionadas também podem ser obtidas dissecando-se
cuidadosamente fatias finas de tecido que foram preparadas para
serem examinadas ao microscópio.

Um corte de tecido é coberto com um filme plástico fino, e a
região contendo as células de interesse é irradiada com um leve
foco de laser infravermelho.

O laser derrete um pequeno círculo do filme, ligando as células
abaixo dele. Essas células capturadas são então removidas para
serem analisadas.
Essa técnica pode ser utilizada para separar e analisar células de
diferentes áreas de um tumor, permitindo que suas propriedades
ou sua composição molecular sejam comparadas com as células
vizinhas normais.

CÉLULAS PODEM SER CULTIVADAS EM MEIO
DE CULTURA

Células cultivadas em meio de cultura fornecem uma população
celular mais homogênea, das quais materiais pode ser extraído
facilmente.

Diferentemente das bactérias, a maioria das células de tecidos não
está adaptada para viver em suspensão no líquido e requer uma
superfície sólida sobre a qual pode crescer e se dividir.

Tais células frequentemente apresentam várias das propriedades
diferenciadas apropriadas a sua origem.

Ex: células derivadas de músculo esquelético embrionário
fusionam para formar fibras musculares que contraem
espontaneamente na placa de cultura.

Culturas celulares obtidas pelo rompimento de tecidos tendem a sofrer de
um problema- no final as células morrem.

Senescência celular replicativa- A maioria das células de vertebrados
para de se dividir após um número finito de divisões celulares em cultura.

Células somáticas humanas como os fibroblastos, no organismo
desativaram a produção da enzima, chamada de telomerase;

Mas algumas células podem ser induzidas a proliferar indefinidamente
fornecendo um gene que codifica para a subunidade catalítica da
telomerase;
ALGUMAS CÉLULAS HUMANAS NÃO SÃO IMORTALIZADAS PELO
TRUQUE ANTERIOR
 mecanismos de ponto de checagem que detêm o ciclo celular um
processo algumas vezes chamado de "choque de cultura”.

oncogenes promotores de câncer - genes que podem provocar um
crescimento celular descontrolado, como aqueles derivados de vírus
tumorais.
CÉLULAS-TRONCO EMBRIONÁRIAS

As células-tronco de embriões têm a capacidade de se
transformar, num processo também conhecido por diferenciação
celular,
em
outros
tecidos
do
corpo,
como ossos, nervos, músculos e sangue.

Se as células da placa de cultura são recolocadas em um meio
embrionário inicial, elas podem dar origem a todos os tipos
celulares no corpo, incluindo células germinativas

Suas descendentes no embrião são capazes de se integrar
perfeitamente no local que irão ocupar, adotando as características
e os comportamentos que células normais teriam naquele local.
O TRANSPLANTE NUCLEAR DE CÉLULASSOMÁTICAS
PODE PROVER UMA
MANEIRA DE GERAR CÉLULAS-TRONCO
PERSONALIZADAS

O termo "clonagem" tem sido utilizado de maneiras confusas
como um termo geral para tipos de procedimentos bastante
distintos. É importante compreender as distinções,
particularmente no contexto dos debates públicos sobre a ética da
pesquisa em células-tronco.

Clonagem Terapêutica

Clonagem Reprodutiva
LINHAGENS CELULARES DE HIBRIDOMAS SÃO FÁBRICAS
QUE PRODUZEM ANTICORPOS MONOCLONAIS

Anticorpos são ferramentas particularmente úteis para a biologia
celular. A sua grande especificidade permite a visualização precisa
de proteínas selecionadas entre as várias milhares que cada célula
produz normalmente.

Anticorpos são produzidos por inoculação de animais em proteínas
de interesse e isolamento subsequente de anticorpos específicos
para aquela proteina a partir do soro do animal.

Esta tecnologia, desenvolvida em 1975, revolucionou a produção
de anticorpos, permitindo sua utilização como ferramentas na
biologia celular, assim como no diagnóstico e no tratamento de
certas doenças, incluindo artrite reumatoide e câncer.
P U R I F I CAÇÃO DE P ROTEÍNAS

A purificação de proteínas é uma série de processos que têm
em vista o isolamento de um único tipo de proteínas de uma
mistura complexa. A purificação de proteínas é vital para a
caracterização da função, estrutura e interações da proteínas de
interesse.

A tecnologia do DNA recombinante (transferência de um gene
de um organismo para outro) pode simplificar muito a tarefa de
"enganar" as células para produzir grandes quantidades de uma
proteína altamente purificada para uso clínico, tornando sua
purificação muito mais fácil.

CÉLULAS PODEM SER SEPARADAS EM SUAS FRAÇÕES
COMPONENTES
As células podem ser rompidas de várias maneiras: podem ser
submetidas ao choque osmótico ou à vibração ultrassônica.

Após rompidas, a suspensão de células é reduzida a um caldo
grosso (chamado de homogenato, células bem trituradas) que
contém uma variedade de organelas envolvidas por membranas.

Os diferentes componentes do homogenato devem então ser
separados, em um instrumento chamado de ultracentrifuga
preparativa, que centrifuga extratos de células rompidas em altas
velocidades
Sedimentação por velocidade e Sedimentação por
equilíbrio.
SEPARAÇÃO DE PROTEÍNAS
PROTEÍNAS PODEM SER SEPARADAS POR
CROMATOGRAFIA
técnica experimental utilizada para
separar misturas de substâncias
numa solução.

Existem alguns tipos de cromatografia, de acordo com sua carga
(cromatografia de troca iônica), seu tamanho (cromatografia de
filtração em gel) ou sua habilidade de se ligar a pequenas
moléculas em particular ou a outras macromoléculas
(cromatografia de afinidade).
ALVOS GENETICAMENTE MODIFICADOS
FORNECEM UMA MANEIRA FÁCIL DE
PURIFICAR PROTEÍNAS

Qualquer gene pode ser modificado para produzir sua proteína
com um marcador de reconhecimento especial ligado a ele, para
fazer a subsequente purificação da proteína por cromatografia de
afinidade com forma simples e rápida.
O anticorpo pode então ser
utilizado para localizar as
proteínas nas células como para
purificá-la.
ANÁLISE DE P ROTEÍNAS
AS PROTEÍNAS PODEM SER SEPARADAS POR ELETROFORESE EM
GEL DE POLIACRILAMIDA-SDS

A aplicação mais popular dessa propriedade é a eletroforese em gel de
poliacrilamida-SDS. Ela utiliza um gel de poliacrilamida (é um
polímero utilizados para fabricação de géis para eletroforese) de
ligações altamente cruzadas como uma matriz inerte, pela qual as
proteínas migram.

As proteínas estão em uma solução que inclui um detergente fortemente
carregado negativamente, dodecil sulfato de sódio – SDS.

Como esse detergente se liga a regiões hidrofóbicas das moléculas
proteicas, causando o seu desdobramento em cadeias polipeptídicas
estendidas.
Quebrar quaisquer
ligações S-S
(ligações dissulfeto)
nas proteínas.

PROTEÍNAS ESPECÍFICAS PODEM SER DETECTADAS POR
BLOTTING COM ANTICORPOS
Após o seu fracionamento na técnica anterior, todas as proteínas
presentes no gel são expostas a um anticorpo específico, que tenha
sido ligado a uma enzima facilmente detectável ou a um corante
fluorescente.

Esse procedimento normalmente é realizado depois de todas as
proteínas separadas presentes no gel terem sido transferidas (por
blotting) para uma folha de papel de nitrocelulose ou membrana de
náilon.

A membrana é então colocada em uma solução com o anticorpo
marcado para revelar a proteína de interesse. Esse método de
detecção de proteínas é chamado de Westem blotting.
A ESPECTROMETRIA DE MASSAS FORNECE UM MÉTODO
ALTAMENTE SENSÍVEL PARA IDENTIFICAR PROTEÍNAS
DESCONHECIDAS.

Espectrometria de massas (ferramenta física que caracteriza as
moléculas pela medida da relação massa/carga de seus íons)

A forma mais comum utilizada da técnica é chamada de
ionização/dessorção de matriz assistida por laser - espectrometria por
tempo de voo MALDI-TOF.

As proteínas na amostra são primeiro quebradas em peptídeos curtos.
Esses peptídeos são misturados com um ácido orgânico e então secados
sobre uma lâmina de metal ou cerâmica.

Um laser então atinge a amostra e ioniza os peptídeos.

Os peptídeos ionizados são acelerados em um campo elétrico e voam em
direção ao detector.

Pela análise desses peptídeos ionizados que chegam ao detector, as
massas precisas dos peptídeos podem ser determinadas.
Empregando-se o uso de
dois espectrômetros de
massas alinhados (um
arranjo conhecido como
MS/MS) é possível
determinar diretamente as
sequências de aminoácidos
de peptídeos individuais em
uma mistura complexa
MS/MS é
particularmente útil
para detectar e
mapear com precisão
modificações póstraducionais de
proteínas.
MEDIDAS HIDRODINÂMICAS REVELAM O TAMANHO E A
FORMA DE UM
COMPLEXO PROTEICO

A maioria das proteínas em uma célula atua como parte de
complexos maiores, e o conhecimento do tamanho e da forma
desses complexos muitas vezes leva a pistas a respeito da sua
função.

A massa molecular também pode ser determinada mais diretamente
utilizando-se uma
ultracentrífuga analítica, um aparelho complexo que permite que
medidas da absorbância proteica de uma amostra sejam realizadas
enquanto ela é submetida a forças centrífugas.
GRUPOS DE PROTEÍNAS QUE INTERAGEM PODEM SER
IDENTIFICADOS POR MÉTODOS BIOQUÍMICOS

Como a maioria das proteínas na célula funciona como parte de
complexos com outras proteínas, uma importante maneira para
começar a caracterizar o papel biológico de uma proteína
desconhecida é identificar todas as outras proteínas com as quais
ela se liga especificamente.
AS INTERAÇÕES ENTRE PROTEÍNAS TAMBÉM PODEM SER
IDENTIFICADAS POR UMA TÉCNICA DE DOIS HÍBRIDOS
EM LEVEDURAS

Até o momento, enfatizamos abordagens bioquímicas para
estudar as interações entre proteínas.
Entretanto, uma estratégia particularmente potente, chamada de
sistema de dois híbridos, explora os mecanismos das próprias
células para revelar as interações entre proteínas.
Quando essa construção é introduzida em levedura, as células
produzem a proteína de fusão, com a proteína-alvo ligada a esse
domínio de ligação ao DNA.
DADOS COMBINADOS DERIVADOS DE DIFERENTES
TÉCNICAS PRODUZEM MAPAS CONFIÁVEIS DE
INTERAÇÕES ENTRE PROTEÍNAS

Mapas extensivos de interações entre proteínas podem ser muito
úteis para identificar as funções das proteínas por essa razão, tanto
o método de dois híbridos como a técnica bioquímica foram
automatizados para determinar as interações entre milhares de
proteínas.
MÉTODOS ÓPTICOS PODEM MONITORAR AS
INTERAÇÕES ENTRE PROTEÍNAS EM TEMPO REAL

Um método particularmente útil para monitorar a dinâmica da
ligação de uma proteína com outras moléculas é chamado de
ressonância plasmônica de superfície SPR.

O método SPR tem sido utilizado para caracterizar uma ampla
variedade de interações moleculares, ínc1uíndo a ligação entre
anticorpo e antígeno, a ligação de proteínas ao DNA,
carboidratos, pequenas moléculas e outras proteínas.

Outro método óptico utiliza a proteína fluorescente verde
(GFP).

Essa técnica é especialmente potente, pois, quando combinada à
microscopia de fluorescência, ela pode ser utilizada para caracterizar
interações entre proteínas em locais específicos dentro das células vivas.

Nessa aplicação, duas proteínas de interesse são marcadas com
diferentes fluorocromos, de modo que o espectro de emissão de um
fluorocromo sobrepõe o espectro de absorção do segundo fluorocromo.

A transferência de energia, chamada de transferência de energia por
ressonância de fluorescência (FRET), é determinada iluminando-se o
primeiro fluorocromo e medindo-se a emissão do segundo
(A) proteina X é acoplada a uma
proteína fluorescente azul, que é
excitada por luz violeta e emite luz
azul. A proteína Y é acoplada a uma
proteína fluorescente verde, que é
excitada por luz azul e emite luz
verde.
(B) Se as proteínas X e Y não
interagirem, a incidência de luz
violeta
na
amostra
gera
fluorescência apenas a partir da
proteína fluorescente azul.
(C) Quando as proteínas X e Y
interagem, FRET pode ocorrer. A
incidência de luz violeta na amostra
excita a proteína fluorescente azul,
cuja emissão por sua vez excita a
proteína
fluorescente
verde,
resultando na emissão de luz verde.

A ESTRUTURA PROTEICA PODE SER DETERMINADA PELO USO
DE DIFRAÇÃO DE RAIOS X
 cristalografia por raios X.
A NMR PODE SER UTILIZADA PARA DETERMINAR A
ESTRUTURA DE PROTEÍNAS
EM SOLUÇÃO

Espectroscopia de ressonância magnética nuclear NMR- foi
muito utilizada por vários anos para analisar a estrutura de
pequenas moléculas

Um pequeno volume de solução proteica concentrada que é
colocado em um campo magnético forte; que irá detalhar a
estrutura tridimensional de moléculas em solução.
Ex: A RMN em alta resolução tem sido utilizada para determinar as
origens geográficas e autentificar sucos de frutas, estudar as trocas bioquímicas
em frutas e em seu suco, investigar a variabilidade dos compostos presentes em
uvas, quantificar componentes químicos em sucos, entre outros.


A SEQUÊNCIA DA PROTEÍNA E SUA ESTRUTURA
FORNECEM PISTAS SOBRE A
FUNÇÃO PROTEICA
Como as proteínas com estruturas similares frequentemente têm
funções semelhantes, a atividade bioquímica de uma proteína
muitas vezes pode ser predita pesquisando-se em bancos de
dados proteínas já caracterizadas que são similares em suas
sequências de aminoácidos.
 REFERÊCIAS:

BRUCE, Alberts. et al ; Biologia
molecular da célula. 5. ed. Porto Alegre.
Artrned, 2010.
OBRIGADA!!!!!