Células
Neutrófilo, MEV
Fermento, MET
Bacilus anthracis
Injetando DNA
exógenos no núcleo
de um ovo de
camundongo,
microscopia de luz
polarizada
Monócitos do sangue,
MEV
Trypanosoma brucei
Glóbulos vermelhos
Macrófago, MET
Linfócito-T, MET
Linfócitos , microscopia óptica
Glóbulos
vermelhos
Neurônios do córtex cerebral
Corte, microscopia óptica
Microscopia eletrônica de transmissão
Célula epitelial de rim de canguru
Microscopia de fluorescência
Vermelho: actina
Verde: microtúbulos
Azul: DNA
Mitocôndria, TME
Tecidos
Epitélio estratificado ceratinizado
(pele)
Tecido muscular estriado
Córtex renal e glomérulo
Intestino delgado
Ilhota pancreática
Universidade de São Paulo
Uso de Células Tronco
na Terapia Celular:
Realidade ou Ilusão?
Marco Antonio Zago
Instituto de Física São Carlos
USP
Agosto – 2011
Universidade de São Paulo
A Miraculous Medicine
I have seen a medicine
That’s able to breathe life into a stone,
Quicken a rock, and make you dance canary
With spritely fire and motion, whose simple touch
Is powerful to araise King Pippen, nay,
To give great Charlemain a pen in 's hand
And write to her a love-line.
W. Shakespeare
All's Well That Ends Well
Terapia Celular
Universidade de São Paulo
Terapia Celular
Conjunto de novas técnicas ou métodos para
substituir células doentes ou disfuncionais com
células sadias
Medicina regenerativa
(substituição de tecidos, células e órgãos)
Transplantes de células hematopoéticas
Imunoterapia: células dendríticas
Aférese, criopreservação, imunosseleção
Terapia gênica
Universidade de São Paulo
Doenças potencialmente tratáveis com
terapia celular com células-tronco
Diabete melito
Fibrose pulmonar
Infarto do miocárdio
Defeitos da face
Miocardiopatias
Vasculopatia periférica
Cirrose hepática
D. vascular cerebral
Câncer
Grandes defeitos ósseos
Doença de Parkinson
Doenças auto-imunes
Distrofias musculares
Doenças ósteo-articulares
Doenças hematológicas
Doenças metabólicas
Universidade de São Paulo
Doenças atualmente tratáveis com terapia
celular com células-tronco
Diabete melito
Infarto do miocárdio
Miocardiopatias
Cirrose hepática
Câncer
Grandes defeitos ósseos
Doença de Parkinson
Doenças auto-imunes
Distrofias musculares
Doenças ósteo-articulares
Doenças hematológicas
Doenças metabólicas
Universidade de São Paulo
Células tronco para a cegueira
Notícias na Imprensa
Cientistas britânicos pretendem usar células
tronco para tratar uma forma comum de cegueira
Pacientes cegos por queimaduras químicas
recuperaram a visão após implante de células
tronco em centro italiano
Universidade de São Paulo
Degeneração Macular Relacionada à Idade
Forma “úmida” Proliferação vascular
10% casos
Mais grave
Várias formas de tratamento
Forma “seca”
Atrofia
90% casos
Não há tratamento
Universidade de São Paulo
Fibroblastos humanos
OCT4, SOX2, NANOG, LIN28
iPS
iPS
EPR
Epitélio Pigmentado Retiniano
Neural
Epitélio
Cartilagem Intestinal
Universidade de São Paulo
Fibroblastos humanos
OCT4, SOX2, NANOG, LIN28
iPS
iPS
EPR
Epitélio Pigmentado Retiniano
Royal College of Surgeons
dystrophic rats
Neural
Epitélio
Cartilagem Intestinal
Universidade de São Paulo
Córnea e células tronco
Limbo contém as células tronco que repõem as células da
superfície da córnea
Conjuntiva
Limbo
Córnea
Universidade de São Paulo
Córnea e células tronco
Limbo contém as células tronco que repõem as células da
superfície da córnea
Conjuntiva
Limbo
Córnea
Neovascularização
Deficiência parcial
Invasão da córnea pelo
Inflamação
Destruição (queimadura) epitélio conjuntival
Cicatrização
Universidade de São Paulo
Limbal Stem-Cell Therapy
and Long-Term Corneal Regeneration
Pacientes com perda de visão por queimadura da córnea
Células do limbo contralateral obtidas por biópsia, cultivadas e implantadas
Sucesso
Sucesso parcial
Insucesso
82 (77%)
14 (13%)
11 (10%)
p63-bright cells: holoclone forming cells in culture
Antes
Depois
NEJ Medicine 363:147, 2010
Universidade de São Paulo
PESQUISA
Cientistas brasileiros testam o uso de
células-tronco contra cegueira
O Globo
RIO – O uso de células-tronco pode ser uma esperança para o tratamento
de problemas graves de visão, como a retinose pigmentar, que leva à
cegueria. .... Se der certo para retinose pigmentar – estima-se que no
Brasil 40 mil pessoas sofrem desse mal – o tratamento poderá ser testado
em outras doenças, como a degeneração macular relacionada com a idade
(DMRI) e a retinopatia diabética.
.... Daí a idéia de retirar as células da própria medula óssea desses
pacientes, que em seguida foram processadas e injetadas no vítreo do
globo ocular.
Células tronco hematopoéticas
Células tronco mesenquimais
Universidade de São Paulo
Mononuclears
Metho-Cult GFH4434 medium
Ficoll-Hypaque
gradient
14 days
37o C
5% CO2
Bone Marrow
Peripheral Blood
Umbilical Cord
Colonies
Universidade de São Paulo
BFU-E
BFU-E
CFU-GM
Universidade de São Paulo
CFU-GM
CFU-GEMM
Mononuclears
 - MEM
20% Fetal Calf Serum
72 hours
Remove
non-adherent cells
14 days
Ficoll-Hypaque
gradient
Trypsin
Detach cells
Bone Marrow
Umbilical Vein
Weekly
Diferenciação
Osteoblástica
Dexametasone
Ácido ascórbico
Diferenciação
Adipocítica
Insulina
Dexametasone
Indometacina
Universidade de São Paulo
Fontes de MSC em Humanos
Tecidos Adultos
Tecidos Fetais
Placenta
Medula óssea
Tecido adiposo
Veias e artérias
Medula óssea fetal
Fígado fetal
Sague periférico fetal
Sangue de cordão umbilical
Veia de cordão umbilical
Gônadas
Células fetais
Células maternas
MSC de veia umbilical
MSC
Sudan II
Fosfatase Alcalina
Von Kossa
H.E.
Colágeno II
Universidade de São Paulo
mTOR
mTOR (FRAP1)
mammalian Target of Rapamycin
Serina/treonina proteino-cinase
Síntese Ciclina D1
Proliferação celular
Proteínas angiogênicas
Angiogênse
TSC1 e TSC2
Ativa metabolismo
Inibidores de mTOR
Inibidores de mTOR
rapanalogs
Tratamento de câncer
PTEN regulador (inibidor) de mTOR
Deleção de PTEN
Síndrome mielodisplásica
Leucemias
Universidade de São Paulo
Células-tronco:
Propriedades e Fontes
Blastocisto
Universidade de São Paulo
Todos
os tecidos
do adulto
Universidade de São Paulo
Células-tronco Embrionárias
blastocisto
CT embrionários
adipócitos
epitélio
corpo embrióide
fibras musculares neurônios
*
corpo embrióide
Lygia V. Pereira
Instituto de Biologia
USP
Universidade de São Paulo
Propriedade Fundamental das Células-Tronco
Divisão Assimétrica
Universidade de São Paulo
Universidade de São Paulo
Célula-tronco Instestinal
Universidade de São Paulo
Células-tronco: Papel de Oct-4 e Nanog
Universidade de São Paulo
Reprogramação de Células com Base em Fatores de Transcrição
Embrião
Endoderma
+Gata4/5 Massa Interna
+Oct3/4
+Sox2
+Klf4
(+cMyc)
CT Embrionária
iPS
Progenitores
+Cdx2
Trofoectoderma
Progenitores
Hematopoéticos
-Pax5
+Cebp
Fibroblastos
Músculos
+Myod
Cels Maduras
Células B
Macrófagos
Célula Acinar
Célula 
+Pdx1, Ng3n, Mafa
Universidade de São Paulo
Universidade de São Paulo
Teratomas derivados de iPS
Takahashi & Yamanaka
Universidade de São Paulo
Reprogramação de Células com Base em Fatores de Transcrição
Embrião
Endoderma
+Gata4/5 Massa Interna
+Oct3/4
+Sox2
+Klf4
(+cMyc)
CT Embrionária
iPS
Progenitores
+Cdx2
Trofoectoderma
Progenitores
Hematopoéticos
-Pax5
+Cebp
Fibroblastos
Músculos
+Myod
Cels Maduras
Células B
Macrófagos
Célula Acinar
Célula 
+Pdx1, Ng3n, Mafa
Universidade de São Paulo
Células Tronco
Células tronco pluripotentes
• células tronco embrionárias (blastocisto 4-5 dias)
• células embrionárias germinais (feto 5-9 semanas)
• iPS (induced pluripotent stem cell)
Células tronco de adultos
• medula óssea
• vasos
• músculos esqueléticos
• fígado
• cérebro
• dentes
• intestino
• pele
• coração
Uso Terapêutico
Universidade de São Paulo
Doenças potencialmente tratáveis com
terapia celular com células-tronco
Diabete melito
Infarto do miocárdio
Miocardiopatias
Cirrose hepática
Câncer
Grandes defeitos ósseos
Doença de Parkinson
Doenças auto-imunes
Distrofias musculares
Cegueria
Doenças hematológicas
Doenças metabólicas
Doenças ósteo-articulares
Fibrose pulmonar
Defeitos da face
Vasculopatia periférica
D. vascular cerebral
Universidade de São Paulo
Doenças atualmente tratáveis com terapia
celular com células-tronco
Diabete melito
Infarto do miocárdio
Miocardiopatias
Cirrose hepática
Câncer
Grandes defeitos ósseos
Doença de Parkinson
Doenças auto-imunes
Distrofias musculares
Cegueira
Doenças hematológicas
Doenças metabólicas
Universidade de São Paulo
Estratégias de Terapia com Células Tronco
Estratégia
Fonte de Células
Células totipotentes
Células tronco embrionários
Células iPS
Cultura
Diferenciação
Injeção/transplante
Células tronco adultas tecido-específica
Medula óssea
Pele
Olho
S. nervoso
Isolamento
Enriquecimento, cultura
Injeção/transplante
Universidade de São Paulo
Bone marrow cells regenerate infarcted myocardium
Donald Orlic, Jan Kajstura, Stefano Chimenti, Igor Jaloniuk, Stacie M. Anderson, Baosheng Li, James
Pickel, Ronald McKay, Bernardo Nadal-Ginardi, David M. Bodline, Annarosa Leri & Piero Anversa
Nature 410:701, 2000
Infarcted myocardium
Transplanted cells
Unknown molecular signal(s)
LVEDP
mm Hg
40
Cell migration to damaged area
30
Proliferation and
differentiation
20
10
C
Cytoplasmic proteins
Cardiac myosin
-Sarcomeric actin
Connexin 43
Infarction
+ BM cells
Nuclear proteins
Csx/Nkx2.5
MEF2
GATA-4
Functional competence
Transdiferenciação:
Fusão
Contaminação
Transdiferenciação:
Fusão
Contaminação
Universidade de São Paulo
Pesquisa Básica
Pesquisa Translacional
Pesquisa Clínica
Evidência Médica Sólida
Mudança da Abordagem Médica
Resultados
Avaliação
Universidade de São Paulo
Evidência Médica Sólida
Trials com resultados convincentes
Abordagem que modifica significativamente o
desfecho clínio em relação aos tratamentos
existentes estabelecidos
Resultados são obtidos consistentemente por
diferentes observadores
Vantagem adicional é suficientemente grande
para sobrepujar os riscos adicionais
Universidade de São Paulo
Evidência Médica Sólida
Exceto para os tratamentos com base em
transplante de células tronco hematopoéticas,
tratamento de lesões da córnea e o uso de MSC
como imunomoduladora,
Há evidência médica sólida, não controvertida,
que qualquer outra forma de terapia celular
com células-tronco adultas seja vantajosa em
um ambiente clínico?
Não, não há evidência
Universidade de São Paulo
Terapia Celular
Estratégias
Substituição
S
do tecido doente ou destruído
Células tronco tecido-específicas
Transplante de medula óssea
Transplante de células pancreáticas
Mesenquimais: osso e cartilagem
Pele cultivada
Células tronco embrionárias ou células iPS
Células de m. óssea: regeneração de outros órgãos
Universidade de São Paulo
Terapia Celular
Estratégias
Imunoterapia + Transplante autólogo
Diabete melito tipo I
Efeito imuno-modulador
Células tronco mesenquimais
Células modificadas (antitumorais)
Linfócitos T autólogos anti-CD19 na LLC
Universidade de São Paulo
Terapia Celular de Doenças Cardíacas
Células Hematopoéticas
Precursores hematopoéticas não originam cardio-miócitos
MSC não originam cardiomócitos
Derivadas de tecido hematopoético (linhagem monocítica)
fundem-se com hepatócitos, cardiomiócitos, células de
Purkinje, CT intestinais
Precursoras hematopoéticas podem se incorporar no endotélio
MSC são imunossupressoras
MSC poderiam reduzir reação inflamatória
Precursoras da medula óssea poderiam secretar substâncias
bioativas localmente
Registered Clinical Trials with “Stem Cells”
Clinical Trials
Condition
Stem Cell
All
Heart Disease
127
4.489
Myocardial Ischemia
101
2.010
Myocardial Infarction
62
631
Coronary Disease
44
1.433
Heart Failure
36
934
Cardiomyopathies
20
218
Hypertension
9
2.218
Peripheral Vascular Disease
17
272
Stroke
13
887
Diabetic Angiopathies
3
226
Intracranial Hemorrhages
1
119
Evidence*
C
C
C
C
No
No
No
No
No
No
No
*Evidence = published results of convincing double-blind trials
C = contradictory or non-reproducible results
Registered Clinical Trials with MSC
Condition
Graft-versus-Host Disease
Heart Disease
Myocardial Ischemia
Heart Failure
Autoimmune Diseases
Bone Diseases
Diabetes Mellitus 2
Peripheral Vascular Disease
Stroke
Intestinal Disease
All studies
Clinical Trials
MSC Stem Cells
15
216
15
127
8
101
7
36
7
51
7
23
2
13
1
17
1
13
5
35
82
2.641
Evidence*
C
No
No
No
No
No
No
*Evidence = published results of convincing double-blind trials
C = contradictory or non-reproducible results
Universidade de São Paulo
Conclusion: In patients with AMI and impaired
LVEF, treatment with BM cells does not lead to a
significant improvement of LVEF or volumes.
Universidade de São Paulo
N= 20
N= 46
N= 51
Universidade de São Paulo
Randomized Trials with BMC – Acute Myocardial Infarction
BOOST
Follow-up (mos)
Control/placebo
Treatment
Janssens
18
30
30
Improvement LVEF
C/P
51-54%
Treatment
50-56%
Mortality + Reinfarct
C/P
Treatment
3%
3%
ASTAMI
4
34
33
REPAIR-AMI
12
50
50
12
103
101
47-49%
49-52%
43-49%
41-49%
47-50%
48-54%
0%
6%
0%
2%
6%
2%
Universidade de São Paulo
Universidade de São Paulo
↑EF 3-4%
Changes observed with cell-therapy
are in the range observed with other
therapies
Universidade de São Paulo
Captopril
Ramipril
Captopril
Valsantan
Carvedilol
Universidade de São Paulo
Intracoronary Transplantation of PB or BM derived cells
Increase in LVEF = 3-4%
Changes in functional and morphometric parameters of LV
In the range observed with:
Reperfusion therapy
Beta-blockers
Interventions in the renin-angiotensin pathway
Universidade de São Paulo
Efeito Mecânico da Destruição Ventricular
no Infarto do Miocárdio
Ventrículo Esquerdo
200 g = 4 x 109 miócitos
Infarto
Destruição celular
25%
40%
1 bilhão miócitos
Insuficiência cardíaca
Choque cardiogênico
Universidade de São Paulo
Regeneração Cardíaca Verdadeira
Restauração 1 x 109 miócitos
Inserção nos sítios adequados
Junção eletromecânica
Contração síncrona com o restante do
miocárdio
Células da medula óssea não substituem cardiomiócitos
a
Purificação
Células LacZ-positivas
Fibrose
Medula Óssea
Doador
LacZ
Recipiente
b
Cardiomiócito
(sem LacZ)
Células GFP-positivas
Fibrose
Doador
GFP
Transfusão
direta
Recipiente
Lesão
Cardiomiócito
(sem GFP)
Universidade de São Paulo
Fontes de Células para Terapia de Doenças Cardíacas
Sem sucesso
Cardiomiócitos
Mioblastos esqueléticos
Músculos lisos
Fibroblastos
Precursores endoteliais
Medula óssea (total ou frações)
Células-tronco mesenquimais
Universidade de São Paulo
Fontes de Células para Terapia de Doenças Cardíacas
Perspectivas
Progenitores miocárdicos residentes
Células-tronco embrionárias
Injeção de fatores de crescimento
Transplante de células modificadas (terapia gênica)
iPS com diferenciação cardíaca
Universidade de São Paulo
iPS recapitula a propensão cardiogênica in utero
Nelson et al, Circulation, 2009
Universidade de São Paulo
iPS restaura função do miocárdio
após infarto experimental
Nelson et al, Circulation, 2009
Universidade de São Paulo
Heart reconstruction with on-demand cardiovasculogenesis
Nuclear reprogramming offers a revolutionary strategy for
embryo-independent derivation of pluripotent stem cells form
an ordinary adult source. iPS reverse cell fate to reset
embryonic-like potential of somatic tissue. In this way, iPS
have attained functions of natural embryonic stem cells to
produce all tissue types and develop the complete organism.
The proof-of-principle study here establishes the practical
application of bioengineered stem cells to respond to the
ischemic myocardium and heal the damaged areas with iPSderived integrated functional tissue.
Nelson et al, Circulation, 2009
Universidade de São Paulo
Universidade de São Paulo
CT scans
Bone marrow biopsy
Perspectivas
Universidade de São Paulo
Perspectivas para Terapias Inovadoras
Abordagens gerais
Transdiferenciação
Células Tronco Tecido-específicas
Reprogramação Nuclear (iPS)
Aplicações Específicas ou Focalizadas
Células Tronco Mesenquimais
Manipulação Imunológica seguida de transplante
de HSC
Deficiências Enzimáticas: Terapia Substitutiva
Manipulação Celular para Induzir ou Inibir a
Expressão de Gene(s) Específico(s)
Universidade de São Paulo
Terapias Inovadoras: os Gargalos
Células Tronco Tecido Específicas
Isolamento em números significativos
Obter a célula ou a combinação “correta”
iPS
Eficiência de indução
Indução mais “fisiológica”
Obter a diferenciação “correta”
Excluir células pluripotenciais
Células-tronco
na natureza