UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ - UFC
UNIVERSIDADE
FEDERAL DO
PROGRAMA
DE PÓS-GRADUAÇÃO
EM CEARÁ
FARMACOLOGIA
CENTRO
DE CIÊNCIAS
DA SAÚDE
FACULDADE
DE MEDICINA
LABORATÓRIO
DE ONCOLOGIA
EXPERIMENTAL
FACULDADE
DE MEDICINA
PÓS-GRADUAÇÃO EM FARMACOLOGIA
INDUCTION OF G2/M ARREST BY FR42
ISOLATED FROM Mitracarpus Baturitensis Sucre
(RUBIACEAE) IN SF-295 CELLS.
MSc. Igor da Silva Bomfim
Orientadora: Prof. Drª Cláudia do Ó Pessoa
Fortaleza/CE
2014
História
Esqueletos de pessoas antiga Grécia,
Egito e Chile – tumores malignos;
 Diagnóstico câncer retal em uma
múmia egípcia (DAVID & ZIMMERMAN, 2010)
 Câncer (Grego - caranguejo)
◦ Hipócrates – Grécia Antiga
 Conjunto de doenças
◦ Crescimento desordenado
◦ Poder invasivo (BROWN & ATTARDI, 2005)

http://www.thedailygreen.com
http://www.ciclodavida.com.br
Câncer
• 2ª causa de morte no mundo → Problema de saúde pública
Em 2008:
7,6 milhões de
mortes (13 % do
total) no mundo
70 % ocorreram
em países de baixa
ou média renda
Brasil – 518.510 novos casos
(estimativa do INCA para 2012 e
2013)
Até 2020:
Cerca
de
15
milhões de novos
casos
60 % em países
em
desenvolvimento
Fonte: OMS 2008
Brasil
Fonte: INCA 2011
Câncer
“ Doença complexa caracterizada pela instabilidade
genética de células que tem a capacidade de se
multiplicar descontroladamente.”
ATIVAÇÃO
DE
ONCOGENES
SILENCIAMENTO DE
GENES SUPRESSORES
DE TUMOR
ALTERAÇÃO
PROGRAMAS
CELULARES:
PROLIFERAÇÃO
MIGRAÇÃO
DIFERENCIAÇÃO
APOPTOSE
(HAHN & WEINBERG, 2002; LUO et al., 2009)
Carcinogênese
Dano ao DNA – mutação
Falha mecanismos
de reparo e na
maquinaria apoptótica
Agentes
Citotóxicos
Céls. transformadas
Expanção clonal –
câncer
Dano ao
DNA
Reparação de céls.
com menor intensidade
proliferativa
DNA reparado
Mecanismos de morte
funcionantes
Adaptado de ALLAN & TRAVIS, 2005
TIPOS DE MORTE CELULAR
Apoptose
Autofagia
PS
PS
PS
PS
PS
LC
3
LC
3
PS
Catástrofe Mitótica
Necrose
NECROSE
Alterações mitocondriais
Vacuolização
Inchaço
Célula normal
Perda da integridade de membrana
Extravasamento de mediadores inflamatórios
Desintegração de organelas
APOPTOSE
Diminuição do volume celular
Condensação da cromatina
Formação de Blebs
Fragmentação internucleossomal do DNA
Lise dos
corpos apoptóticos
Célula normal
Formação dos
corpos apoptóticos
Ações Importantes:
Promoção da saúde;
Detecção precoce;
Assistência aos pacientes;
Vigilância;
Formação de recursos humanos;
Comunicação e mobilização social;
Na pesquisa e gestão do SUS;
Desenvolvimento de tratamento mais eficazes.
Terapias Anticâncer

Cirurgia
Remoção da massa tumoral
Mata rapidamente células tumorais em divisão,
incluindo células tumorais nos tecidos adjacentes

Radiação Ionizante

Imunoterapia

Terapia Dirigida
Inibe especificamente os processos
necessários para crescimento da célula tumoral

Quimioterapia
Mata rapidamente células em divisão
(tumorais e sadias)
Terapia que se utiliza do sistema imune
para combater o câncer
KUMAR et al., 2004
Quimioterapia

Definição:
◦ Consiste em um tratamento a base de
fármacos que interferem em diferentes
processos tais como: desenvolvimento,
crescimento, disseminação e invasão de
células cancerígenas (Souza et al., 2007).

Objetivo primário:
◦ Destruir células neoplásicas preservando
células normais.
PRODUTOS NATURAIS COM ATIVIDADE
ANTICÂNCER
Produtos Naturais
Papaver somniferum
Plantas
Cryptotethya crypta
Penicillium notatum
Organismos
Marinhos
Microorganismos
Síntese Química
Drogas Anti-câncer Originadas de
Plantas
Derivados
da Vinca
 Vimblastina
 Vincristina
 Vindesina
Taxanos
Vinca rosea
Taxus brevifolia
Paclitaxel
 Docetaxel

Camptotecinas
 Topotecano

Irinotecano
Podofilotoxinas
Etoposídeo
 Tenoposídeo

Camptotheca accuminata
Produtos Naturais x Derivados
Contudo
há
necessidade
do
desenvolvimento de novas drogas que
reduzam os efeitos adversos do
tratamento;
 O trabalho da química medicinal tem
propiciado
o surgimento de novos
compostos, os quais tem levado a novos
protótipos de drogas;

(MARKMAN, 1998)
Produtos Naturais x Derivados
Número de drogas
Nº de Drogas Aprovadas nos
EUA até 2007
Derivados de prod. nat.
Produtos naturais
anos
Adaptado de LI & VEDERAS, 2010
Problemática da Quimioterapia
Esquemas terapêuticos falhos;
 Altos índices de recidivas;
 Redução da sobrevida de pacientes;
 Efeitos adversos;
 Resistência

◦ Inerente
◦ Adquirida
Mitracarpus Baturitensis Sucre
(Rubiaceae)
Utilizadas para tratamento:
 Hanseníase
 Cefaléia
 Dor de dente
 Doenças venéreas
 Dispepsia

OBTENÇÃO DA
MOLÉCULA FR42
•Parte aérea seca (temp. Ambiente)
•Triturada e submetida a extração
exaustiva com hexano à frio seguida de
EtOH.
•Soluções obtidas foram destiladas sob
pressão reduzida.
•Resultando: Extratos hexânicos e EtOH
em gel de sílica
benzoisoquinolina-5,10-diona (FR42)
Quinonas
Definição: Compostos oxigenados, formados a partir da oxidação de
fenóis. Sua principal característica é a presença de 2 grupos carbonílicos
formando um sistema conjugado.
Ampla e variada família de metabólitos de distribuição natural;
Amplo espectro de atividades biológicas:
Microbicida
Tripanossomicidas
Viruscidas
Antitumorais
benzoquinona
naftoquinona
antraquinona
QUINONAS UTILIZADAS NA TERAPIA DO CÂNCER
MECANISMO DE AÇÃO DAS QUINONAS
Inibição de Topoisomerase
Geração de espécies reativas de oxigênio
Objetivos

Geral:
Estudar o potencial citotóxico em células
cancerígenas e os prováveis mecanismos
de ação da FR42 (benzoisoquinolina),
isolada do Mitracarpus baturitensis, em
ensaios in vitro.
Objetivos
 Epecíficos:
 Determinar
a IC50 da FR42 em um painel de
linhagens celulares cancerígenas: através do
ensaio de MTT. Além de células normais CMSP
através do ensaio Alamar Blue.
 Definir a citotoxicidade da FR42 sobre as
células SF-295, através do ensaio de
citotoxicidade em tempo real (XCELLligence)
 Avaliar o provável mecanismo de ação da FR42
através de citometria de fluxo (integridade de
membrana, fragmentação de DNA,
despolarização mitocondrial) a partir de células
SF-295 (glioblastoma humano) tratadas com a
benzoisoquinolina.
METODOLOGIA
RESULTADOS
DISCUSSÃO
Manutenção das Linhagens Celulares
10mL
Cultura de células
• Meio de cultura RPMI 1640;
•10 ou 20% de soro fetal bovino;
• 1% de antibióticos (penicilina/estreptomicina);
• 3% de fitohemaglutinina (linfócitos).
37°C / 5% de CO2
Repique em meio de cultura novo
Contagem/Observação
Ensaio de Citotoxicidade em Células
Tumorais e Não Tumorais – Teste
MTT
Contagem
Cultura de células
Células plaqueadas e drogas diluídas
usando o HTS (High throughput screening)
Formasan
0,039 a 5µg/mL
MTT
3h
Absorbância em 595nm
72 h
Formazan
Doadores de eSuccinato
MTT
NADH
+
NADPH
Citoplasma
Berridge & Tan, 1993
meio extra-celular
TESTE DE CITOTOXICIDADE EM CMSP
ENSAIO DO ALAMAR BLUE
Princípio: Baseia-se na redução do alamar blue ou resazurina (azul e não fluorescente)
por células viáveis à resorufina (róseo e altamente fluorescente), mensurando
indiretamente a proliferação celular.
Forma oxidada
Forma reduzida
Ensaio de Citotoxicidade – MTT e Alamar Blue (CMSPH) – 72h
Linhagens
FR42 μM
DOX
Tumorais
SF-295
HCT-116
2,0 (1,70 -2,45)
0,41 (0,34 – 046)
0,01-0,02
2,10 (1,72 – 2,48)
0,21 (0,15 – 0,29)
4,39 (3,53 – 5,40)
0,45 (0,29 – 0,52)
OVCAR - 8
HL-60
2,20 (1,90 – 2,77)
0,02 (0,02 – 0,03)
Normais
CMSPH
16,82 (12,18 – 23,27)
1,78 (0,52 – 1,80)
Ensaio de citotoxidade em
tempo real (xCELLigence).
Ensaio de citotoxidade em
tempo real (xCELLigence).
C-
ESTUDO DO MECANISMO DE AÇÃO
CITOMETRIA DE FLUXO
CITOMETRIA DE FLUXO
Diluição com
Corante desejado
FR42
48 h
Células SF-295
CONCENTRAÇÃO DE CÉLULAS
Princípio: Baseia-se na capacidade de o iodeto de propídeo penetrar as células cuja
membrana esteja rompida e ligar-se ao DNA nuclear, emitindo alta fluorescência
vermelha.
Viáveis
Não Viáveis
Iodeto de propídeo
não ligado
Iodeto de propídeo ligado
CONCENTRAÇÃO DE CÉLULAS
CICLO CELULAR E FRAGMENTAÇÃO DO DNA
DETERMINAÇÃO DO CONTEÚDO DE DNA
Princípio: Esse teste baseia-se na capacidade do iodeto de propídeo se ligar ao DNA.
Assim, pode-se determinar as diferentes fases do ciclo celular, baseando-se pelo
conteúdo de DNA.
Quantidade de DNA
por núcleo
G1
S
G2/M
DNA
Fragmentado
4n
2n
G1
S
G2
Interfase
Mitose
FRAGMENTAÇÃO INTERNUCLEOSSOMAL DE DNA
CICLO CELULAR
POTENCIAL TRANSMEMBRÂNICO DA
MITOCÔNDRIA
Princípio: Seqüestro da rodamina 123, um corante fluorescente nucleofílico, para
dentro da mitocôndria quando esta apresenta seu potencial transmembrânico
inalterado, emitindo, assim, alta fluorescência.
Despolarizadas
Polarizadas
POTENCIAL TRANSMEMBRÂNICO DA MITOCÔNDRIA
Microscopia Confocal
SF-295
24h
20.000 céls/poço
Tratar com os
compostos
testes
24h
Aspirar o meio e resuspender com
200 uL de meio novo
Adicionar 4 uL da
Anexina
V/AlexaFluor568
Lavar com PBS
15 min – temp. ambiente
Resuspende com
200 uL de meio
novo
Hoechst – 10 min
CONCLUSÃO
OBRIGADO!