3D Functionalized Multi-Supportive Structures (FMSS) – A Novel Route for Spinal Cord Injury Regeneration ABSTRACT A deregulation or injury in the nervous system usually leads to devastating consequences. In the particular case of spinal cord injury (SCI), patients have to deal with several neurological deficits and disabilities. Therefore, it is urgent to develop therapeutic strategies that can specifically target this problem. Different possible solutions have been experimented to solve these conditions, such as cell and molecular therapies, although the outcomes are still not satisfactory, imposing a need for alternative approaches. Tissue engineering has been proposed as a new method to address these problems. The tissue engineering strategy usually implies the use of a 3D structure that is able to support the cell growth and differentiation in an adequate environment towards the development of a functional tissue engineered system. With the concepts of tissue engineering in mind, the main goal of the work described in this thesis was to develop a structure that can be easily, efficiently, and successfully applied in the treatment of spinal cord lesions. In the work presented in this thesis, a natural blend of starch/poly-ε-caprolactone (SPCL) was processed by rapid prototyping in order to create a tubular porous scaffold. Then, these SPCL scaffolds were filled with the gellan gum hydrogel with the purpose of creating a novel hybrid structure. In this biphasic scaffold the SPCL phase aims to mimick the vertebra bone functions, while the gellan gum hydrogel is designed to be a cell encapsulation system to support axonal regeneration in the injured spinal cord. The developed scaffolds presented tunable outer layer thickness, mechanical modulus, fiber/filament orientation, and pore geometry. Moreover, the scaffolds disclosed a noncytotoxic behavior and allowed the in vitro culturing of oligodendrocytes, olfactory ensheathing cells (OECs) and Schwann cells for periods up to three weeks. In order to overcome some of the drawbacks associated with the use of gellan gum, namely the absence of biological signals for cellular adhesion and proliferation, this hydrogel was chemically conjugated with the peptide sequence GRGDS, via Diels-Alder click chemistry. It was observed that the novel GRGDS-gellan gum had a profound effect on neural stem cell morphology and proliferation. These results demonstrated the importance of GRGDS for cell-gellan gum interaction. Subsequently, the in vivo experiments revealed that hybrid structures are biocompatible. However, more importantly, in vivo tests showed that SPCL are suitable structures to promote spine stabilization and that the stabilization of SCI rats was associated with functional motor recovery. Finally, in the scope of this thesis, it was also assessed the effects of OECs secretome on the growth of adult stem cells derived from adipose, bone marrow, umbilical cord and nervous tissue. Results revealed that OECs secretome increase the metabolic activity and/or proliferation of these adult stem cells. As a concluding remark, it can be stated that the work described in this thesis brings new knowledge to the cell biology, biomaterial and spinal cord injury fields. The results obtained in the in vivo experiments indicate that researchers currently testing treatments for SCI repair might have to take into account the use of spine stabilization in combination with their approaches. From the biomaterial point of view, the simplicity and broad applicability of the Diels-Alder click chemistry (used to functionalize the gellan gum) can be easily extended to other molecules to further improve this material. Finally, important understanding was herein created about biological/molecular interactions between OECs and adult stem cells from several origins. Estruturas de Suporte Multifuncionais: Uma Nova Terapia para Regeneração de Lesões da Medula Espinal RESUMO Uma lesão do sistema nervoso acarreta normalmente consequências devastadoras. No caso particular de lesões da medula espinal (LME), os pacientes têm que lidar com múltiplas insuficiências biológicas. Por este motivo, é urgente desenvolver terapias que possam resolver eficazmente este problema. Diferentes estratégias têm sido propostas para tratar esta condição, tais como, terapias baseadas em transplantação celular e/ou terapias moleculares. No entanto, os resultados não têm sido satisfatórios, reforçando a ideia que são necessárias abordagens alternativas. A engenharia de tecidos tem sido proposta como um novo método para enfrentar estes problemas. Esta estratégia implica o uso de uma estrutura 3D que é capaz de suportar o crescimento e a diferenciação celular de forma a criar um ambiente adequado para o desenvolvimento de um tecido funcional. Tendo por base os conceitos da engenharia de tecidos, o principal objectivo do trabalho descrito nesta tese foi o desenvolvimento de um sistema que possa ser aplicado facilmente e eficazmente no tratamento de LME. Neste trabalho, o polímero natural de poli-caprolactona de amido (SPCL) foi processado por prototipagem rápida de forma a criar estruturas tubulares porosas. Seguidamente, o interior das estruturas de SPCL foram preenchidos com o hidrogel gellan gum de forma a criar uma estrutura híbrida. Neste sistema, o SPCL tem como objectivo mimetizar as funções do osso vertebral. Por sua vez, o hidrogel tem como objectivo servir como um sistema de encapsulamento celular de forma a suportar a regeneração nervosa. As estruturas desenvolvidas possuem espessura, orientação e geometria do poro e características mecânicas configuráveis. Adicionalmente, as estruturas apresentaram um comportamento não tóxico e permitiram o crescimento in vitro de oligodendrócitos, células do bolbo olfactivo (OECs) e células de Schwann. De forma a ultrapassar algumas das desvantagens do gellan gum, nomeadamente o facto de este material não possuir na sua estrutura sinais biológicos, este material foi modificado com o péptido GRGDS. Foi observado que o GRGDS-gellan gum tem um forte efeito na morfologia e proliferação de células estaminais neuronais. Estes resultados demonstraram a importância do péptido GRGDS na interacção célula-gellan gum. Seguidamente, as experiencias in vivo revelaram que estas estruturas são biocompatíveis, mas, mais importante, os testes em animais demostraram que as estruturas de SPCL permitem a eficaz estabilização da coluna vertebral e que esta estabilização promove a recuperação da função motora de ratos com LME. Finalmente, no âmbito do trabalho descrito nesta tese, foi também estudado o efeito que os factores secretados pelas OECs exercem sobre a proliferação e/ou actividade metabólica de células estaminais adultas derivadas do tecido adiposo, da medula óssea, do cordão umbilical e do tecido nervoso. Os resultados revelaram que as OECs produzem factores que promovem o aumento da actividade metabólica e/ou proliferação dessas células estaminais adultas. O trabalho descrito nesta tese originou novo conhecimento para as áreas de biologia, de biomateriais e de regeneração de LME. As experiências in vivo revelaram que os investigadores que estejam actualmente a testar terapias para LME devem ter em conta a estabilização vertebral. Do ponto de vista dos biomateriais, a modificação do gellan gum é simples e de ampla aplicabilidade. Neste sentido, o gellan gum pode agora ser facilmente modificado com diferentes moléculas consoante a aplicação desejada. Finalmente, o entendimento sobre o efeito dos factores produzidos pelas OECs em células estaminais, poderá revelar-se importante para futuras terapias celulares.