AVALIAÇÃO DA ANTIGENICIDADE DE PROTEÍNAS RECOMBINANTES DE M.
HYOPNEUMONIAE
EVALUATION OF ANTIGENICITY OF RECOMBINANT PROTEINS OF M.
HYOPNEUMONIAE
Fisch, Andressa1; Galli, Vanessa1; Simionatto, Simone; Marchioro, Silvana B.1; Gomes,
Charles K.1; Dellagostin, Odir A.1*
Resumo
Pneumonia Enzoótica Suína é uma doença infecciosa de alta incidência, causada pelo
Mycoplasma hyopneumoniae. Provoca sinais respiratórios e queda nos índices produtivos
gerais. As vacinas atualmente utilizadas para controle da enfermidade apresentam alto custo e
limitada eficiência, e o desenvolvimento de alternativas profiláticas torna-se essencial para a
melhoria da sanidade e rendimento dos rebanhos suínos. Para tal, genes que codificam para
proteínas secretadas de M. hyopneumoniae foram clonados e expressos em E. coli. Proteínas
recombinantes purificadas foram avaliadas quanto à antigenicidade utilizando soros de suínos
convalescentes, suínos experimentalmente infectados com M. hyopneumoniae 7448 e suínos
SPF. Os testes realizados indicam maior antigenicidade das proteínas MHP0107, MHP0272,
MHP0487, MHP0372, MHP0418, reconhecidas por soros de suínos convalescentes.
Palavras chave- M. hyopneumoniae, proteína recombinante, antigenicidade
Summary
Porcine Enzootic Pneumonia is an infectious disease of high incidence, caused by
Mycoplasma hyopneumoniae. It causes respiratory signs and a drop in overall production
rates. The vaccines currently used to control the disease have a high cost and limited
efficiency, and development of alternative prophylactic interventions is essential for
improving the health and performance of swine herds. To this end, genes coding for proteins
secreted by M. hyopneumoniae were cloned and expressed in E. coli and evaluated for
antigenicity using sera form convalescent pigs, pigs experimentally infected with M.
hyopneumoniae 7448 and SPF pigs. Tests indicated stronger antigenicity of proteins
MHP0107, MHP0272, MHP0487, MHP0372 e MHP0418, recognized by sera from
convalescent pigs.
Key words - M. hyopneumoniae, recombinant protein, antigenicity
M. hyopneumoniae é agente etiológico da Pneumonia Enzoótica Suína (PMS), doença
de alta incidência nos rebanhos suínos em todo o mundo, caracterizada por pneumonia
catarral crônica com tosse improdutiva, queda na conversão alimentar e no ganho de peso
(SOBESTIANSKY; BARCELLOS; MORES, 1999). Tradicionalmente, o controle desta
enfermidade é feito através da vacinação associada a adequadas práticas de manejo. As
vacinas utilizadas atualmente são bacterinas, e embora melhorem os indicadores produtivos,
apresentam alto custo de produção e eficiência limitada (HAESEBROUCK et al., 2004). O
investimento para caracterização de novos antígenos de M. hyopneumoniae apresenta-se
_______________________
1
Laboratório de Biologia Molecular – CDTec/UFPel
*Autor para correspondência: Odir A. Dellagostin, Laboratório de Biologia Molecular, Núcleo de Biotecnologia,
CDTec - Universidade Federal de Pelotas, Campus universitário S/N; Cx Postal 354; 96010-900; Pelotas - RS;
Brazil; [email protected]
caracterização de novos antígenos de M. hyopneumoniae apresenta-se como alternativa no
desenvolvimento de novas estratégias profiláticas para esta patologia.Este trabalho teve por
objetivo avaliar a antigenicidade das seguintes proteínas recombinantes secretadas de M.
hyopneumoniae: MHP0107, MHP0272, MHP0487, MHP0372, MHP0418, MHP443 e
MHP0660.
As regiões codificadoras dos genes que codificam para as proteínas em questão foram
amplificadas PCR a partir do DNA genômicoda cepa 7448 de M. hyopneumoniae. Os alvos
MHP0418 e MHP0372 foram submetidos à mutagênese sítio-dirigida através da técnica de
PCR-overlapingconforme Simionatto et al. (2009), Os amplicons resultantes foram clonados
nos vetores de expressão em E. colipAE ou Champion pET200D/TOPO. Os plasmídeos
recombinantes foram transformados por eletroporação em E. coli TOP 10. Os clones
recombinantes foram caracterizados através da digestão com enzimas de restrição e
transformados por eletroporação na cepa de expressão E. coli BL21 (DE3) RIL, A indução da
expressão e a purificação das proteínas foram realizadas conforme descrito por Galli et al.
(2011).A presença das proteínas foi verificada por SDS-PAGE 12%. As proteínas foram
submetidas a Western blot utilizando anticorpos monoclonais anti-histidina (Sigma) para
confirmação.
A antigenicidade das proteínas recombinantes foi avaliada através de ELISA
utilizando 4 soros suínoshiperimunes(imunizados com cultivo celular inativado de M.
hyopneumoniae 7448), 36 soros previamente titulados de suínos convalescentes com
necrópsia positiva para a PES e 10 soros de suínos livres de patógenos específicos (SPF).
Microplacas de 96 cavidades foram sensibilizadas com 50 ng de cada proteína diluída em
tampão carbonato/bicarbonato. Após incubação overnight a 4 ºC, as placas foram lavadas com
PBST e incubadas com 200 µL do tampão de bloqueio a (leite desnatado 5%) 37 ºC por 2 h.
As placas foram lavadas novamente e incubadas com soro de suíno (1:100 em tampão de
bloqueio) a 37 ºC por 4 h. Após nova lavagem, as placas foram incubadas com anticorpo de
coelho anti-IgG de suíno conjugado com peroxidase (1:2000 em tampão de bloqueio) a 37 ºC
por 1 h. A reação colorimétrica foi gerada com a adição de o-fenilenediaminadihidrocloridee
peróxido de hidrogênio. Após 15 min a reação foi interrompida com a adição de 50 µL de 2 M
H2SO4. A absorbância foi determinada a 492 nm.
As proteínas recombinantes mostraram-se puras em SDS-PAGE 12% (Fig. 1A) e
foram reconhecidas por anticorpo anti-histidina em Western blot (Fig. 1B). Através do ELISA
(Fig. 2), todas as proteínas exceto MHP0443 e MHP0660 apresentaram reatividade
estatisticamente significativa quando confrontadas com soro de animais convalescentes em
comparação a quando confrontadas com soro de animais SPF. Este resultado indica que a
maioria das proteínas avaliadas são expressas pela bactéria durante a infecção natural. A
ausência de reatividade significativa com as proteínas MHP0443 e MHP0660 indica que estas
não são expressas ou são expressasem baixas concentrações durante a infecção.
Os procedimentos de clonagem, expressão e purificação das proteínas em questão
foram realizados com sucesso. Os resultados obtidos através do teste de ELISA indicam
maior capacidade antigênica das proteínas MHP0107, MHP0272, MHP0487, MHP0372,
MHP0418, as quais foram reconhecidas por soros de suínos convalescentes. Estas proteínas
são candidatas a compor uma vacina recombinante contra PES.
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Figura 1. A. Eletroforese em SDS-PAGE 12%, corada com Comassie blue, mostrando as sete proteínas
recombinantes purificadas por cromatografia de afinidade. B. Análise em Western blotdas proteínas
recombinantes separadas em 12% SDS-PAGE, transferidas para uma membrana de nitrocelulose e confrontadas
contra anticorpo anti-histidina (diluído 1:10000) e anticorpo anti-mouse conjugado com peroxidase (diluído
1:2000). Coluna 1, MHP0107 (38 kDa); Coluna 2, MHP0272 (59 kDa); Coluna 3, MHP0418 (37 kDa); Coluna
4, MHP0443 (54 kDa); Coluna 5, MHP0372 (44 kDa); Coluna 6, MHP0660 (48,5 kDa); Coluna 7, MHP0487
(33 kDa). As setas indicam as bandas correspondentes às proteínas recombinantes.
Figura 2.Avaliação da antigenicidade das sete proteínas recombinantes através de ELISA indireto, utilizando
soro de suínos SPF, soro de suínos hiperimunes contra a cepa 7448 de M. hyopneumoniae e soro de suínos
convalescentes. O asterisco indica diferença estatística (P<0,01) quando comparado soro de suínos
convalescentes e SPF ou hiperimune e SPF, de acordo com teste de Tukey.
Referências Bibliográficas
GALLI, V. Resposta imune induzida por antígenos de Mycoplasma hyopneumoniae avaliados
como vacina de DNA ou subunidade recombinante. 2011. 105p. Dissertação (Mestrado em
Biotecnologia) – Programa de Pós Graduação em Biotecnologia. Universidade Federal de
Pelotas, Pelotas.
HAESEBROUCK, F. et al Efficacy of vaccines against bacterial diseases in swine: what can
we expect?.Veterinary Microbiology.v.100, p.225-268, 2004.
SIMIONATTO, S.; MARCHIORO, S. B.; GALLI V.; HARTWIG, D. D.; CARLESSI, R. M.;
MUNARI, F. M.; LAURINO, J. P.; CONCEIÇÃO, F. R.; DELLAGOSTIN, O. A. Cloning
and purification of recombinant proteins of Mycoplasma hyopneumoniaeexpressed in
Escherichia coli.Protein Expression and Purification, v.79, i.1, p.101-105, 2009.
SOBESTIANSKY, J.; BARCELLOS, D.; MORES, N.; et al. Pneumonia enzoótica. In:
Clínica e Patologia Suína. 2a ed., Art 3 Impressos Especiais, Goiânia, Goiás, p.359, 1999.
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