AVALIAÇÃO DA IMUNOGENICIDADE DE PROTEÍNAS RECOMBINANTES DE
M. HYOPNEUMONIAE
EVALUATION OF IMUNOGENICITY OF RECOMBINANT PROTEINS OF M.
HYOPNEUMONIAE
Fisch, Andressa1; Galli, Vanessa1; Simionatto, Simone1; Marchioro, Silvana B.1; Gomes,
Charles K.1; Dellagostin, Odir A.1*
Resumo
Mycoplasma hyopneumoniae é o agente etiológico da Pneumonia Enzoótica Suína (PES),
doença contagiosa que gera grandes perdas no setor suinícola. As bacterinas utilizadas na
profilaxia da PES apresentam alto custo de produção devido ao crescimento fastidioso do M.
hyopneumoniae. A tecnologia do DNA recombinante pode ser utilizada na produção de
antígenos recombinantes para avaliação quanto ao potencial uso como nova vacina.Neste
estudo,sete proteínas recombinantes de M. hyopneumoniaeforam clonadas e expressas em E.
coli e avaliadas quanto a imunogenicidade em camundongos,isoladas ou em associação.
Palavras chave - Mycoplasma hyopneumoniae, proteína recombinante, imunogenicidade
Summary
Mycoplasma hyopneumoniae is the etiologic agent of Porcine Enzootic Pneumonia, a
contagious disease that causes major losses in the pig industry. The bacterins used in the
prophylaxis
of PES
has high
production
costdue
to
the fastidious growth of
M. hyopneumoniae. Recombinant DNA technology can be used in the production
of recombinant antigens for evaluation regarding its potential use as a new vaccine. In this
study, recombinant proteins of M. hyopneumoniae have been cloned and expressed in E. coli
and evaluated for immunogenicity in mice, isolated or in association.
Key words - Mycoplasma hyopneumoniae, recombinant protein, immunogenicity
Pneumonia Enzoótica Suína (PES) é uma doença respiratória contagiosa,causada pela
infecção com Mycoplasmahyopneumoniae,que acomete suínos no mundo todo, causando
grandes perdas econômicas ao setor suinícola. Embora existam vacinas comerciais
(bacterinas) usadas no controle desta doença, as mesmas não são produzidas no Brasil e
apresentam um elevado custo de produção (ROSS, 1999), pois o crescimento in vitro do M.
hyopneumoniae é fastidioso e requer um meio de cultura bastante rico (KOBISH e FRIIS,
1996).Em virtude disso, alternativas para a profilaxia da PES tem sido desenvolvidas,
incluindo a utilização da tecnologia de DNA recombinante.Este trabalho teve por objetivo
avaliar a imunogenicidade das seguintesproteínas recombinantes secretadas de M.
hyopneumoniae: MHP0107, MHP0272, MHP0487, MHP0372, MHP0418, MHP443 e
MHP0660.
Os alvos foram amplificados por PCR a partir do DNA genômico de M.
hyopneumoniae7448, sendoos alvos MHP0418 e MHP0372 previamente submetidos à
mutagênese sítio-dirigida,onde códons TGA foram substituídos por códons TGG (Simionatto
et al, 2009). Os fragmentos resultantes foram clonados no vetor pAE com promotor para
expressão em E. coli, e posteriormente transformados por eletroporação em E. coli TOP 10.
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Laboratório de Biologia Molecular – CDTec/UFPel
*Autor para correspondência: Odir A. Dellagostin, Laboratório de Biologia Molecular, Núcleo de Biotecnologia,
CDTec - Universidade Federal de Pelotas, Campus universitário S/N; Cx Postal 354; 96010-900; Pelotas - RS;
Brazil; [email protected]
Os clones recombinantes foram caracterizados através da digestão com enzimas de restrição e
transformados por eletroporação em cepa de expressão E. coli BL21 (DE3) RIL.
A expressão e purificação das proteínas foram realizadas conforme descrito por Galli
et al (2011).
Para avaliação da imunogenicidade, onze grupos de 5 camundongos BALB/c fêmeas
com 8 a 10 semanas de vida, foram imunizados com:1 - MHP0107; 2 - MHP0272; 3 MHP0418, 4 - MHP0487; 5 - MHP0443; 6 - MHP0660; 7 - MHP0372; 8 - associação das
proteínasMHP70418, MHP0487 e MHP0443 (Mix1); 9 - associação das proteínas MHP0418,
MHP0660 e MHP0372 (Mix2); 10 - 100 µL de salina 0,85% (controle negativo); e 11 - 100
µL da vacina comercial RespiSure® (Pfizer) (controle positivo). Para os grupos 1 a 7 foram
utilizados 50 µg das vacinas recombinantes, e para os grupos 8 e 9, utilizou-se 16,6 µg de
cada proteína. Hidróxido de alumínio (15%) foi utilizado como adjuvante. Foram
administradas duas doses por via intramuscularcom intervalo de 21 dias entre elas.O sangue
dos animais foi coletado do sino retro-orbital em zero (soro pré-imune)e 105 dias pósinoculação (soro imune). O soro foi obtido através de centrifugação e armazenado a -20 ºC.
No dia 105 os animais foram sacrificados. Todos os animais foram mantidos durante o
experimento de acordo com as recomendações do Comitê de Ética em Experimentação
Animal da Universidade Federal de Pelotas.
A produção de anticorpos contra as proteínas recombinantes no soro dos camundongos
imunizados foi verificada por ELISA indireto. Placas de 96 cavidades foram sensibilizadas
com 100 ng de cada proteína recombinante diluídas em tampão carbonato-bicarbonato (pH
9,6). O soro dos camundongos imunizados foi diluído 1:50; utilizou-se anticorpo anti-IgG de
camundongo conjugado com peroxidase (1:4000). O soro dos animais imunizados com
vacinas constituídas de associação de proteínas (Mix1 e Mix2) também foi confrontado com
uma mistura baseada em quantidades equimolares destas proteínas, além de serem
confrontados com cada uma das proteínas individualmente, visando avaliar a contribuição de
cada proteína em cada uma das duas vacinas.
Através do ELISA (Figura 1), verificou-se a produção de anticorpos específicos contra
as proteínas em questão aos 105 dias pós-imunização, sendo esta resposta estatisticamente
superior ao soro pré-imune. Os grupos inoculados com salina e bacterina não apresentaram
anticorpos contra estas proteínas (dados não apresentados). As proteínas MHP0443 e
MHP0372 foram as principais responsáveis pela resposta imune observada em animais
imunizados com as formulações contendo combinações de proteínas (Figura 1B). Embora a
resposta humoral induzida pela associação de proteínas não tenha diferido estatisticamente da
resposta induzida por estas duas proteínas individualmente (MHP0443 e MHP0372), é
possível que a produção de anticorpos distintos proporcionado pela presença de outras
proteínas na formulação auxilie na proteção contra o agente infeccioso. Porém, outros estudos
são necessários para comprovar esta hipótese.
As diferenças estatísticas encontradas entre os grupos imunizados com as proteínas
recombinantes, tanto isoladas quanto em mix, do grupo inoculado com solução salina
(controle negativo) indicam a capacidade destas em induzir a formação de anticorpos
específicos, atestando seu potencial imunogênico. As proteínas MHP0443 e MHP0372
apresentaram níveis mais elevados de indução de anticorpos tanto quando administradas de
forma isolada quanto ao serem associadas com outras proteínas.
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Figura 1. Avaliação da imunogenicidade em camundongos de proteínas recombinantes de M.
hyopneumoniaedeterminada por ELISA indireto.A. Soro de animais imunizados (diluídos 1:50) com as proteínas
recombinantes confrontados com as proteínas individuais correspondentes.B. Soro de animais imunizados com
as associações de proteínas Mix1 e Mix2 confrontados com o mix de proteínas e com as proteínas individuais
correspondentes.Os dados referem-se à subtração da densidade óptica (492 nm) individual referente ao dia 105
pela densidade óptica individual referente ao dia 0. Letras diferentes indicam diferença estatística (P<0,01) entre
tratamentos pelo teste de Tukey.
Referências Bibliográficas
GALLI, V. Resposta imune induzida por antígenos de Mycoplasma hyopneumoniae avaliados
como vacina de DNA ou subunidade recombinante. 2011. 105p. Dissertação (Mestrado em
Biotecnologia) – Programa de Pós Graduação em Biotecnologia. Universidade Federal de
Pelotas, Pelotas.
KOBISH, M.; FRIIS, N. F. Swinemycoplasmoses. Res. Sci. Tech. Off. Int. Epiz.
v.
15, p.1569-1605. 1996.
ROSS, R.F. Mycoplasmal diseases. In: STRAW B.E., D’ALLAIRE S., MENGELING W.L.,
TAYLOR D.J. Diseases of Swine. Iowa State University Press, Ames, Cap.36, p.495–505,
1999.
SIMIONATTO, S.; MARCHIORO, S. B.; GALLI V.; HARTWIG, D. D.; CARLESSI, R. M.;
MUNARI, F. M.; LAURINO, J. P.; CONCEIÇÃO, F. R.; DELLAGOSTIN, O. A. Cloning
and purification of recombinant proteins of Mycoplasma hyopneumoniae expressed in
Escherichia coli. Protein Expression and Purification, v.79, i.1, p.101-105, 2009.
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