ENZIMAS
Universidade Agrícola
Uppsala - Suécia
Julho - 2003
W.J.Melo
W.J.Melo
Cinética Enzimática
EFEITO DA CONCENTRAÇÃO DO SUBSTRATO
! Como avaliar?
! Realiza-se experimento com as seguintes características:
#A varios tubos de ensaio, colocam-se a mesma concentração da enzima em estudo.
#Adiciona-se, a cada tubo, uma concentração diferente
do substrato, partindo-se de um tubo em que não se coloca subs trato (testemunha ou branco).
#Incuba-se por um certo tempo em um pH e uma temperatura ideal.
#Mede-se a quantidade de produto formado ou a de substrato que sobrou.
#Com os resultados obtidos, elabora-se um gráfico em
sistema cartesiano.
W.J.Melo
CINÉTICA ENZIMÁTICA
EFEITO DA CONCENTRAÇÃO DO SUBSTRATO
T1
T2
T3
T4
T5
Enzima
Tampão
adicionar substrato
Substrato
H2O
S1
S2
Temperatura
Tempo t
S3
S4
incubar
Medir Substrato
ou
Produto
GRÁFICO
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CINÉTICA ENZIMÁTICA
EFEITO DA CONCENTRAÇÃO DO SUBSTRATO
Vmax
60
-
40
-
20
0
Vmax
2
I
0
I
I
32
64
96
concentração do substrato
I
128
KM
W.J.Melo
ATIVIDADE DA UREASE NO SOLO
EFEITO DA CONCENTRAÇÃO DO SUBSTRATO
Longo & Melo (2005)
W.J.Melo
Cinética Enzimática
CINÉTICA ENZIMÁTICA - CONCEITOS
!Equação de Michaelis-Mentem
#Equação que descreve a velocidade de uma reação enzimatica em função da concentraçao do substrato.
!Velocidade máxima
#Qantidade máxima de produto formado por unidade
de tempo e por unidade de enzima nas mesmas condições experimentais.
!Constante de Michaelis (K M)
#Concentração de substrato que determina que a velocidade de uma ração enzimática ocorra com a metade da
velocidade máxima.
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Cinética Enzimática
CINÉTICA ENZIMÁTICA
EFEITO DA CONCENTRAÇÃO DO SUBSTRATO
#Equação de Michaelis-Menten
’
’
A velocidade de reação das enzimas não alostéricas segue a equação de Michaelis-Menten
A velocidade da reação em um ponto qualquer
é dada pela equação
V=
Vmax S
KM + S
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Cinética Enzimática
A EQUAÇÃO DE MICHAELIS-MENTEN
V=
Vmax*[S]
KM + [S]
!V= velocidade da reação
!Vmax= velocidade máxima da reação
!S= concentração do substrato
!K M= constante de Michael
#Indica a concentração do substrato que deter-mina que
a velocidade da reção seja a metade da velocidade máxima.
#Reflete a afinidade entre a enzima e o substrato
’
Quanto menor K M, maior afinidade.
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Cinética Enzimática
A EQUAÇÃO DE MICHAELIS-MENTEN
INTERPRETAÇÃO
!Para baixas concentrações de substrato, a velocidade da
reação aumenta linearmente com o aumento da concentração do substrato.
#Esta é uma reação de primeira ordem.
!Para concentrações intermediárias do substrato o aumento
da velocidade não é linear com o aumento da concentração do substrato.
#Esta é uma reação de segunda ordem.
!Para altas concentrações do substrato, a velocidade da
reação não se altera com o aumento da concentração do
substrato.
’ Esta é uma reação de ordem zero
’ O sítio ativo está saturado pelo substrato
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Cinética Enzimática
A EQUAÇÃO DE LINEWEAVER-BURKE
!Lineweaver e Burke trabalharam com os inversos da
velocidade e da concentração do substrato.
!Verificaram que, ao plotarem o inverso da concentração do substrato (eixo x) com o inverso da velocidade (eixo y), obtinha-se uma equação de reta.
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Cinética Enzimática
A EQUAÇÃO DE LINEWEAVER-BURKE
1
Vmax
-
Y=aX + b
b= 1/Vmax
Se Y=0, X=-1/K M
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Cinética Enzimática
EFEITO DA TEMPERATURA
!Efeitos da temperatura
#Aumenta a velocidade da reação.
#Causa desnaturação da proteína enzimática.
#A conjugação dos dois efeitos determina o comportamento da velocidade em função da temperatura.
#No caso de enzimas do solo, o efeito é m pouco diferente, devido à proteção dos colóides do solo.
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CINÉTICA ENZIMÁTICA
EFEITO DA TEMPERATURA
Vmax
I
I
I
I
I
I
Temperatura
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ATIVIDADE DA UREASE NO SOLO
EFEITO DA TEMPERATURA
LVef
30 20 10 40
0
0
LVd
I
I
10
20
Longo & Melo (2005)
I
I
I
I
30 40 50 60
Temperatura ( oC)
I
I
70
80
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Cinética Enzimática
CINÉTICA ENZIMÁTICA
EFEITO DO pH
!Desnaturação da proteína enzimática
#Em pH muito baixo ou muito alto, tende a ocorrer a desnaturação da proteína enzimática, resultando em uma
diminuição na atividade catalítica.
!A curva de resposta da velocidade da reação enzimática tende a assumir a forma de um sino, mas é variável em
função do tipo de enzima.
!As enzimas do solo apresentam um comportamento diferente, em função da interação com os colóides do solo.
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CINÉTICA ENZIMÁTICA
EFEITO DO pH
Vmax
pH
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ATIVIDADE DA UREASE NO SOLO
EFEITO DO pH
12 10 8 6 4 2 -14
0
2,2
LVef
LVd
I
I
I
I
I
I
3,2
4,2
5,2
6,2
7,2
8,2
pH
Longo & Melo (2005)
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Cinética Enzimática
CINÉTICA ENZIMÁTICA
EFEITO DA CONCENTRAÇÃO DA ENZIMA
!A velocidade de uma reação enzimática aumenta com o
aumento da concentração da enzima.
!Condição
#Não haver falta de substrato
#As demais condições são as ideais para a atividade da
enzima
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EFEITO DA CONCENTRAÇÃO DA ENZIMA
E
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Cinética Enzimática
CINÉTICA ENZIMÁTICA
EFEITO DA LUZ
!Algumas enzimas, caso da redutase do nitrato, são sensíveis à presença da luz.
!Quando isto ocorre, há necessdade de se traba-lhar na
ausência da luz.
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Enzimas
UNIDADES PARA EXPRESSAR A ATIVIDADE
ENZIMÁTICA
!Quantidade do substrato ou da enzima
#Pode ser expressa em miligrama, micrograma, mol, milimol.
#A unidade do SI é o mol.
!Quantidade da enzima
#Pode ser expressa em quantidade do material que contém
a enzima (por exemplo g de solo), quantidade de proteína, quantidade de enzima, número de moléculas enzimáticas.
!Tempo de incubação
#Pode ser expresso em horas, minutos ou segundos.
!Deve-se usar unidades do Sistema Internacional (SI).
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Enzimas
UNIDADES PARA EXPRESSAR A ATIVIDADE
ENZIMÁTICA
!Katal (kat)
#Unidade definida pela EC (Enzyme Comission) em 1961.
#É derivada do SI para expressar a atividade catalítica das
enzimas.
#Seu uso é recomendado pela Conferência Geral de Pesos
e Medidas (outubro de 1999).
#1 kat equivale à transformação de 1 mol do substrato ou
a formação de 1 mol do produto em 1 segundo.
Kat
mol/segundo
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Enzimas
FORMAS DE EXPRESSAR A ATIVIDADE
ENZIMÁTICA
!Unidade Internacional (IU ou U)
#Definida pela International Union of Biochemistry (1964)
#Atividade que catalisa a transformação de 1 micromol do
substrato ou a produção de 1 micromol do produto em 1
minuto sob condições padrões.
#U - micromol/minuto
1 kat= 6x10 7 U
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Enzimas
FORMAS DE EXPRESSAR A ATIVIDADE
ENZIMÁTICA
!Atividade específica
#Atividade que representa a massa ou o número de moles de substrato transformado ou do produto formado
por umidade de enzima ou do material que a contém e
por unidade de tempo.
#Exemplo
’
Na hidrólise total do amido
< Atividade= mg de glicose/g de folha * hora
< Atividade= kat/mg folha
< Atividade= kat/mg de proteína
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Enzimas
FORMAS DE EXPRESSAR A ATIVIDADE
ENZIMÁTICA
!Atividade molar ou molecular
#É o antigo turnover.
#Expressa a quantidade de substrato transformado
ou de produto produzido por molécula de enzima
ou por sítio ativo.
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Metabolismo Intermediário de X
X
E1
a
E2
b
E3
c
E4
En
...
d
... Y
X= substrato
Y= produto
a, b, c, d= metabólitos
E1, E2, ... E n= enzimas
E1= enzima reguladora
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Metabolismo
CONCEITOS
! Sistema e ambiente
#Em termodinâmica, sistema é a matéria contida dentro
de uma região definida. Ambiente, por seu turno, é
a matéria que resta no universo.
! Energia livre
#Símbolo: F ou G
#Conceito
’
Quantidade de energia existente em um sistema.
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Metabolismo
CONCEITOS-ENERGIA LIVRE
! Avaliação
#A energia livre de um sistema pode ser avaliada em uma bomba calorimétrica.
! Constância
#A energia livre de um sistema é constante (1ª lei da termodinâmica).
! Variação em uma reação química
#É a diferença entre a energia dos produtos e dos reagentes, independentemente do caminho seguido.
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Metabolismo
A
B
reagente
produto
E = Ep - Ei
E = variação de energia do sistema
Ep= energia dos produtos
Ei= energia do substrato inicial
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Metabolismo
CONCEITOS
! Entropia
#Símbolo: S
#Diz respeito ao grau de organização de um sistema.
#Quanto mais desorganizado é um sistema, maior sua
entropia.
! Entalpia
#Símbolo: H
#Diz respeito ao conteúdo de energia interna de um
sistema.
’ A unidade no SI é o J/mol
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Metabolismo
CONCEITOS
! Expontaneidade das reações
#Uma reação somente ocorre expontaneamen-te se
a soma das entropias do sistema e do ambiente aumentar.
#Uma reação em que a entropia do sistema diminui pode ocorrer, desde que a entropia do ambiente aumente.
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Metabolismo
CONCEITOS
! Energia de ativação
#É a quantidade de energia que se necessita fornecer
ao substrato para que o mesmo atinja a barreira energética da transformação.
! Reação endergônica
#É a que ocorre com consumo de energia.
#A energia do produto é maior que a do substrato.
#A variação de energia é positiva.
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Metabolismo
CONCEITOS
! Reação exergônica
#É aquela que ocorre com liberação de energia.
#A energia do produto é menor que a do substrato.
#A variação de energia é negativa.
#A energia liberada pode ser perdida na forma de
calor ou usada para realização de trabalho.
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TIPOS DE REAÇÕES
Ebt
Ey1
a
Ex
b
Ey2
X
-
E
a= reação endergônica b= reação exergônica
Y1
+
E
Y2
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