Manual
JBS Kit de Iniciação para a Cristalização
Proteica
Cat. No.
Quantidade
CS-401PT
1 Kit
forem geometricamente
cristalização da proteína.
favoráveis,
ocorre
a
Somente para uso in vitro
Garantia válida para 12 meses
Conservar a 4°C
Introdução e Teoria da Cristalização
Atualmente existem dois métodos principais para a
determinação da estrutura tridimensional de
proteínas: Espectroscopia de Ressonância Magnética
Nuclear (RMN) e cristalografia de raios-X. RMN
possibilita a determinação da estrutura atômica de
proteínas com um limite de peso molecular em torno
de 25000 Da (25 kDa, o equivalente a
aproximadamente 220 amino ácidos), enquanto que
o método de raios-X é mais apropriado para a
determinação de estruturas proteicas maiores ou de
complexos macromoleculares. Os estudos pioneiros
das estruturas cristalográficas da mioglobina (1950) e
hemoglobina (1955) foram premiados com o Premio
Nobel de Química em 1962. Esse reconhecimento
demonstra não somente a importância
da
cristalografia de raios-X, mas também aponta a
emergente biologia estrutural como um campo
essencial para a ciência no geral.
O primeiro passo na determinação de uma estrutura
cristalográfica, e frequentemente o mais difícil, é o
crescimento de cristais proteicos de tamanhos
suficientemente grandes para a realização do
experimento. Um cristal é um arranjo periódico
tridimensional de blocos, que no nosso caso, são
moléculas proteicas, dispostos de maneira regular.
Como é possível a obtenção de cristais partindo de
uma molécula tão complexa como moléculas
proteicas?
A fim de se alcançar a forma cristalina partindo de
uma solução proteica, a solubilidade das moléculas
deve ser diminuída. Por via de regra, a redução da
solubilidade leva à formação de um precipitado
proteico amorfo. No entanto, se condições
apropriadas forem selecionadas de tal maneira que
se formem regiões complementares na superfície de
moléculas adjacentes, interações específicas podem
acontecer entre essas moléculas. Se essas interações
Fig. 1: Diagrama esquemático de fases de uma
mistura proteína-precipitante
O processo de cristalização é caracterizado por dois
passos: (1) nucleação e (2) crescimento do cristal.
Ambos os passos podem acontecer na zona
supersaturada do diagrama de fases, se as condições
corretas forem selecionadas (ver Fig.1). De acordo
com a Fig.1, há necessidade da formação de uma
solução supersaturada de proteína-precipitante, o que
ocorre quando moléculas se mantêm dissolvidas em
solução numa concentração maior do que a
solubilidade em condições normais.
Infelizmente é necessário um nível maior de
supersaturação para a nucleação do que para o
crescimento do cristal, o que dificulta o controle
individual desses parâmetros. A área de nucleação
também é chamada de zona lábil, enquanto que a
área de crescimento do cristal é conhecida como
zona metaestável. A nucleação requere que a solução
proteica esteja localizada na zona lábil, que é
também onde o crescimento rápido de cristais
ocorre. Portanto, mantendo-se a solução proteica por
muito tempo nessa zona acarretará no crescimento
rápido de muitos núcleos cristalinos e a produção
excessiva de cristais pequenos. Já que é interessante
a obtenção de cristais suficientemente grandes (c.a.
0,5 mm de largura), deve-se evitar a formação de
muitos núcleos. Isso significa que a mistura proteínaprecipitante deve alcançar a zona de nucleação
lentamente para que os núcleos em formação tenham
tempo para crescer.
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Proteica
A transição de uma solução estável para uma solução
supersaturada acontece quando se varia a proporção
proteína-precipitante de acordo com o diagrama de
fase. Para tanto, aumenta-se a concentração de
proteína ou do precipitante (eixos vertical e horizontal
na Fig. 1). Os processos físicos que geram essa
mudança na concentração são diálise ou difusão,
ambos caracterizados pelo transporte de matéria de
um meio para o outro. O método de difusão por
vapor tem se mostrado muito adequado para a
cristalização de proteínas.
Esse tipo de experimento, também chamado pelo
método de gota pendurada, está ilustrado na Figura
2. A solução proteína-precipitante se encontra em
uma gota suspendida na parte inferior de uma
lamínula. O tamanho da gota pode variar de 0,5 a
20 µl. A solução do poço (ca. 1 ml), que se encontra
no recipiente debaixo da gota, contém uma alta
concentração de precipitante, e portanto, uma
pressão de vapor inferior à solução proteica. Durante
o decorrer do experimento, vapor de água originário
da gota se difunde para a solução precipitante do
poço. Dessa maneira, a concentração proteínaprecipitante na gota aumenta e, em condições
apropriadas, a cristalização da proteína ocorrerá em
dias ou semanas. Esse sistema de gota pendurada
sobre uma solução precipitante no poço permite que
o equilíbrio termodinâmico seja alcançado lentamente
com o passar do tempo.
Quais Materiais
Precipitante?
são
Utilizados
como
Em princípio qualquer material de tenha influencia
sobre a solubilidade da proteína pode ser utilizado
como precipitante, contanto que não desnature a
proteína em elevadas concentrações.
É possível caracterizar os diferentes precipitantes mais
utilizados em cristalização de acordo com os efeitos
que exercem sobre a solução proteica. Os
precipitantes comumente usados são sais, polímeros
orgânicos, álcoois e eventualmente água pura.
Sais como (NH4)2SO4, NaCl, LiCl, KH2PO4, etc.,
mudam a forca iônica da solução. A Figura 3 a
variação da solubilidade de proteínas em função da
forca iônica do meio.
Fig. 3: Dependência da solubilidade (S) em função
da forca iônica (I)
Fig. 2: Experimento de cristalização por difusão de
vapor pelo método da gota pendurada
A área à esquerda do máximo da solubilidade é
denominada de “salting-in”, em que a solubilidade
aumenta devido ao aumento da constante dielétrica
do solvente. A área à direita é denominada de
“salting-out”, onde a solubilidade decresce devido à
competição das cargas do precipitante com as cargas
de superfície da proteína por moléculas de água do
meio, diminuindo assim o estado de hidratação geral
da proteína.
Precipitantes orgânicos como etanol, metanol,
propanol,
MPD
(2-metil-2,4-pentanediol)
ou
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Proteica
acetonitrila, reduzem a solubilidade da proteína por
diminuírem a constante dielétrica do solvente.
Polímeros orgânicos funcionam da mesma maneira,
como os PEGSs (polietilenoglicois), que podem ser
encontrados nos diversos pesos moleculares (de 400
a 20.000 Da).
Outro parâmetro importante que influencia a
solubilidade das proteínas é o valor do pH da
solução. Geralmente, a solubilidade proteica é mais
baixa no seu ponto isoelétrico (IEP), já que nesse
ponto sua carga total é zero.
Devido à grande variedade de parâmetros que
podem influenciar a cristalização, e como geralmente
se dispõe de uma pequena quantidade de amostra
proteica, fica praticamente impossível testar todas as
combinações dos parâmetros existentes. Portanto, é
extremamente necessário se planejar uma estratégia
que permita a obtenção dos resultados desejados de
uma maneira rápida e sem se fazer uso de muito
material.
Características dos Cristais Proteicos
Em princípio, os cristais proteicos são formados da
mesma maneira que os cristais de pequenas
moléculas ou cristais de sal, seguindo as mesmas
regras de empacotamento molecular e simetria. No
entanto, existem diferenças fundamentais que
abrangem desde propriedades mecânicas e óticas até
composição. Cristais proteicos são delicados e
geralmente contem de 30% a 70% de água, a maior
parte de forma desordenada dentro do cristal.
A integridade do cristal é mantida devido às
interações entre as moléculas proteicas enquanto que
o espaço entre essas moléculas é preenchido por
água ou moléculas do tampão. Consequentemente, as
moléculas de proteína se encontram dentro do cristal
em um meio praticamente natural, ou seja, aquoso.
Dessa maneira, sua estrutura nativa (arranjo
conformacional que confere sua função ou atividade)
é conservada, o que pode ser facilmente
demonstrado através da realização de ensaios
enzimáticos em sua forma cristalina. Em alguns casos,
a forma cristalina reflete até mesmo sua forma natural
de reserva, como no caso da insulina.
Kit de Iniciação para a Cristalização
Proteica da JBS
O Kit de Iniciação para a Cristalização da Jena
Bioscience oferece todo o material necessário para
analisar a nucleação e crescimento de cristais,
partindo-se de uma proteína exemplo (lisozima da
clara de ovo) e usando-se o método de difusão de
vapor em gota pendurada. Para tanto, variações
graduais de pH em função de concentrações
crescentes do precipitante (NaCl) foram desenhadas
a fim de se visualizar diretamente os efeitos dessas
duas variáveis em termos de nucleação, morfologia e
tamanho final do cristal. Além disso, no kit também
está incluído todo o material para a cristalização da
lisozima pelo método em “batch”, onde a solução de
cristalização é misturada diretamente com a proteína
sem se aplicar difusão de vapor para se equilibrar a
concentração das soluções.
Composição do Kit:
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
2 placas de cristalização 24-well SuperClearTM
para o método em gota pendurada
1 seringa com 5 ml de graxa de silicone para a
selagem dos poços da placa
100 lamínulas para cristalização
1 lamina
20 ml de solução precipitante NaCl, 20% (m/v)
4x 3 ml de tampão de 250 mM acetato de sódio
nos pHs de 4,0, 4,4, 4,8 e 5,2 cada um
200 µl de solução de lisozima em água (20
mg/ml)
1 ml de solução de cristalização para a
cristalização pelo método em “batch” (30%
(m/v) de PEG 5000-MME, 1 M de NaCl, 50
mM de acetato de sódio em um pH de 4,4)
Materiais Necessários nao Inclusos neste Kit:
1.
2.
3.
4.
5.
6.
Pipetas Eppendorf ou similares, com capacidade
de pipetagem de 1 a 500 µl
Ponteiras de tamanhos correspondente
Água destilada ou deionizada
Uma pinca
Local de armazenamento com temperatura
controlada (20–22 °C)
Um microscópio com poder de ampliacao de 50100x para a observacao dos cristais
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Proteica
sobre seu poço correspondente
(Fig. 2).
Pressione levemente o centro da lamínula com os
dedos (ou qualquer outro objeto macio) para que
o poço seja selado hermeticamente pela graxa
de silicone.
Protocolo de Realização do Experimento
Segundo o Método de Gota Pendurada
No experimento em gota pendurada (Fig. 2), a
lisozima é cristalizada equilibrando-se a solução de
cristalização do poço (selado com a graxa de
silicone) com a gota de proteína diluída em uma gota
de solução de cristalização. Para tanto, utiliza-se
como solução precipitante o sistema acetato de
sódio/NaCl, possibilitando a visualização da
dependência cristalização no valor do pH e
concentração de acetato de sódio/NaCl.
O
experimento se realiza em um valor de pH entre 4,0
a 5,2 em combinação com uma concentração de
NaCl entre 4% a 9%.
O Experimento:
1. Selagem da placa de cristalização: aplicar a
graxa de silicone sobre a superfície circular de
cada poço utilizando a seringa do kit. A
aplicação deve ser homogênea e evitar a
formação de bolhas ou o espalhamento da graxa
sobre a placa.
2. Pipetar em cada poço a solução de cristalização
de acordo com o esquema da Figura 4: o volume
total em cada poço é de 1 ml, sendo a
concentração final do tampão, depois da adicao
da solução precipitante e de água, de 50 mM.
Atenção: antes de começar a pipetar, certifiquese de que a placa está corretamente orientada
através da linha (A-D) e da coluna (1-6) no canto
superior esquerdo.
3. Pipetagem da gota para a cristalização: pipetar
1 µl de solução proteica mais 1 µl de solução do
poço sobre uma lamínula circular. Pipetar cada
linha (A-D) separadamente. Primeiro pipete a
gota de solução proteica no centro da lamínula e
depois adicione a gota de solução do poço. Para
tanto, a ponta da ponteira é cuidadosamente
colocada sobre a superfície da gota de proteína
e a solução precipitante é dispensada sem a
formação de bolhas. A ponteira deve ser trocada
antes de pipetar a próxima gota para que não
haja contaminação cruzada.
4. Selagem dos poços: com a ajuda de uma pinça,
cada lamínula é invertida e colocada gentilmente
Conservar as placas preparadas em um lugar de
temperatura constante (20-22°C). Para a observação
das gotas no microscópio é recomendável a remoção
da tampa da placa. Ao ajustar a objetiva do
microscópio, tomar cuidado para não haver contato
com a graxa. Procure observar toda a profundidade
da gota proteica através do microscópio. Luz
polarizada pode também ser usada para a
diferenciação entre precipitado amorfo e material
cristalino, já que cristais são capazes de transmitir a
luz polarizada.
A Figura 5 mostra o aspecto das gotas no
microscópio (aumento de 40x) depois de 20 horas. O
esquema de numeração das coordenadas (A-D, 1-6) é
correspondente ao da placa preparada.
Pode-se observar claramente que o número de cristais
aumenta com o aumento da concentração de NaCl.
A concentração ótima para o crescimento de cristais
de qualidade é alcançada na concentração de NaCl
logo abaixo da máxima, de acordo com o diagrama
de fases mostrado na Fig. 1 (para maiores
informações, veja a relação entre nucleação e
crescimento do cristal na introdução deste manual).
Pode-se notar também a nucleação diminui com o
aumento do valor de pH, o que significa uma
diminuição no número de cristais em pH mais
elevados.
Protocolo de Realização do Experimento
Segundo o Método “Batch”
Para o experimento pelo método “batch”, a gota
proteica também é misturada com a gota de solução
de cristalização na lamínula, porém, a composição
dessa solução precipitante foi otimizada de tal
maneira que a cristalização da proteína tem início
imediato.
Depois de aproximadamente 20 minutos, cristais
pequenos já podem ser vistos no microscópio, e
crescem rapidamente nos próximos minutos. Nesse
tipo de experimento em específico, os cristais crescem
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Proteica
mais rapidamente em comparação com o
experimento anterior pelo método em gota
pendurada.
O Experimento:
1. Pipetar a solução de cristalização para a
cristalização pelo método em “batch” em uma
lamínula.
2. Pipetar 2 µl da solução proteica sobre a gota de
solução precipitante.
Agora observe a gota no microscópio. A razão entre
o volume de solução de cristalização/proteína
também pode ser alterada a fim de se observar
diferenças na velocidade de crescimento de cristais e
no número total de cristais formados.
Agradecimentos
Estamos agradecidos ao Dr. Manfred Weiss como
autor da ideia original e por sua assistência na
elaboração deste kit. Grande parte deste manual foi
baseada nas instruções experimentais do Dr. Weiss.
Direitos Autorais
Todas as figuras incluídas neste manual são e se
mantêm propriedade registrada © do Dr. Manfred S.
Weiss.
É proibida a reprodução total ou parcial deste
manual sem a autorização expressa e por escrito da
Jena Bioscience GmbH.
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250 mM Acetato de Sódio
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20 % NaCl
Concentração
final
4%
50 mM
pH 4,0
5%
6%
7%
8%
9%
200 µl
600 µl
200µl
250 µl
550 µl
200µl
300 µl
500 µl
200µl
350 µl
450 µl
200µl
400 µl
400 µl
200µl
450 µl
350 µl
200µl
50 mM
pH 4,4
200 µl
600 µl
200µl
250 µl
550 µl
200µl
300 µl
500 µl
200µl
350 µl
450 µl
200µl
400 µl
400 µl
200µl
450 µl
350 µl
200µl
50 mM
pH 4,8
200 µl
600 µl
200µl
250 µl
550 µl
200µl
300 µl
500 µl
200µl
350 µl
450 µl
200µl
400 µl
400 µl
200µl
450 µl
350 µl
200µl
50 mM
pH 5,2
200 µl
600 µl
200µl
250 µl
550 µl
200µl
300 µl
500 µl
200µl
350 µl
450 µl
200µl
400 µl
400 µl
200µl
450 µl
350 µl
200µl
— 20 % de NaCl
— 250 mM de Acetato de Sódio
— Água Destilada
Fig. 4: Esquema de pipetagem segundo o método de gota pendurada
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1
2
3
4
5
6
A
B
C
D
Fig. 5: Aparência das gotas de cristalização segundo o método de gota pendurada depois de 20 horas (ampliação de 40x)
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