M OD ULAÇ ÃO D A FUNÇ ÃO NE UR ONAL
POR PR OTEÍNAS QUINASE S E FOSFATASE S
Claudio Marcos Teixeira de Queiroz
Pós-graduando do Departamento de Fisiologia
Escola Paulista de Medicina – Universidade Federal de São Paulo
RESUMO
A morfologia de uma célula é determinada não somente pelos tipos
protéicos por ela expressos, mas também pela concentração, forma e localização
dessas proteínas. A fisiologia de uma célula, por sua vez, pode ser compreendida
ao se observar o funcionamento dessas proteínas, sua ativação e inativação, sua
síntese, movimentação e biotransformação. Neste trabalho procuraremos destacar
a atividade das proteínas quinase, que catalisam reações de fosforilação e das
proteínas fosfatases, que catalisam reações de desfosforilação. A fosforilação,
adição de um radical fosfato (PO32-) a uma proteína, resulta na alteração de sua
conformação espacial (estrutura terciária). Logo, a adição desta carga
eletronegativa promove a modificação da função da proteína, podendo, portanto,
ativá-la ou desativá-la. Tais reações podem ser reguladas por sistemas de
segundos mensageiros ou por ligantes extracelulares (no caso de fatores tróficos e
hormônios), além de poderem ser potencializadas depois de determinados padrões
de estimulação (por exemplo, um estímulo prolongado e intermitente ou mesmo
uma associação de múltiplos estímulos <IMAGEM 13>). Assim, acredita-se que os
processos de fosforilação/ desfosforilação possibilitam o aparecimento de uma
“memória” molecular dentro da célula e que esta por sua vez, participaria
ativamente dos processos de plasticidade neuronal.
O PROCESSO DE FOSFORILAÇÃO
Os principais determinantes da morfologia e do funcionamento de uma
célula são as proteínas por ela expressa. Dentre essas proteínas estão as proteínas
quinase e as proteínas fosfatases. Aproximadamente 4% de todos os genes
codificam proteínas deste tipo (enzimas capazes de adicionar/retirar um radical
fosfato de um substrato), sendo que 20% de todas as proteínas sintetizadas em
uma célula servem como substrato para essas enzimas <IMAGEM 2>. A fosforilação
pode rapidamente modificar a função de proteínas e enzimas, sem
necessariamente modificar os níveis de suas expressões. Desta forma, as células
apresentam normalmente um “potencial bioquímico”, ou seja, um estado de
Trabalho apresentado para conclusão do curso de Neuroquímica do Programa de Pós-graduação em
Neurologia Experimental da Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP). As informações contidas nesse
trabalho podem ser utilizadas livremente desde que citada a fonte.
E-mail: [email protected]
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equilíbrio dinâmico entre três entidades: as proteínas quinase e fosfatase (ativadas
ou desativadas) e os substratos protéicos (fosforilados ou desfosforilados) <IMAGEM
1>. Com esse sistema de controle, múltiplos sinais provenientes de diferentes
sinapses podem ser integrados, variando o estado de fosforilação das proteínas
desde o mínimo possível até praticamente o máximo de fosforilação. Este é um
processo bidirecional que pode sofrer ainda uma potenciação ou inibição em
relação ao steady-state bioquímico da célula. Tais modificações são sugeridas
como um dos possíveis alicerces dos processos de plasticidade celular observados
no sistema nervoso central.
FOSFORILAÇÃO E O FLUXO DE INFORMAÇÃO NO SISTEMA NERVOSO CENTRAL
A atividade das proteínas quinase pode ser regulada tanto pelo sistema de
segundos mensageiros como também por estímulos extracelulares (fatores
tróficos, por exemplo) <IMAGEM 4>. Em geral, as quinases reguladas por segundos
mensageiros adicionam o radical fosfato em resíduos de serina (Ser) e/ou treonina
(Thr) enquanto que as quinases ligadas a receptores atuam através da fosforilação
de resíduos de tirosina (Tyr) <IMAGEM 3>. Dentre todas as diferentes células que
constituem um organismo, as do sistema nervoso apresentam a maior capacidade
e concentração de proteínas capazes de catalisar reações de fosforilação. Como
base nesta informação podemos especular que tais processos podem estar
diretamente relacionados com o fluxo de informação no sistema nervoso central,
implicados na comunicação entre os diferentes tipos celulares deste tecido.
O estado de fosforilação celular depende do grau de ativação (ou
inativação) das proteínas quinase e fosfatase, da afinidade dessas enzimas por
seus respectivos substratos, além da concentração e disponibilidade da quinase,
fosfatase e proteína alvo; conceitos esses da farmacologia básica. Assim, a
fosforilação e a desfosforilação das proteínas apresentam alguns princípios em
comum entre si, independente do sistema que a ativa. Primeiramente as proteínas
quinase apresentam uma atividade bastante promíscua, ou seja, são
multifuncionais, podendo ser ativadas por diferentes classes de estímulo e agindo
em diferentes tipos de substratos. Deste conceito deriva a segunda característica
comum desta classe de substâncias, a relevância do posicionamento espacial
(discutido abaixo). Para que as proteínas quinase (ou fosfatase) possam ser
ativadas, elas devem estar próximas das regiões produtoras de segundos
mensageiros (no caso das Ser/Thr quinases) ou muito próximas a membrana (no
caso das Tyr quinase). Em terceiro lugar, o sistema de fosforilação permite uma
grande amplificação do sinal, uma vez que uma única molécula pode fosforilar
muitos substratos. Além disso, alguns sistemas de quinase podem fosforilar as
“enzimas irmãs” (processo denominado de autofosforilação) que se encontram no
estado desfosforilado. Em quarto lugar, os sistemas de quinases podem interagir
entre si, com uma via favorecendo ou até mesmo ativando uma outra cascata de
fosforilação. Em último lugar, os sistemas de quinase funcionam como quinases
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cognitivas, ou seja, uma quinase capaz de memória molecular. Esta memória
molecular potencia a atividade da quinase, sendo que uma menor concentração de
segundo mensageiro já é suficiente para produzir o mesmo grau de ativação da
quinase que na situação de equilíbrio.
LOCALIZAÇÃO ESPACIAL REGULA A AÇÃO DAS PROTEÍNAS QUINASE E
FOSFATASE
As proteínas quinase e fosfatase estão freqüentemente posicionadas
espacialmente perto de seus respectivos substratos ou são translocadas para seus
substratos após a ativação com o intuito de aumentar a velocidade e a
especificidade em resposta à estimulação proveniente dos neurotransmissores. O
uso de proteínas-âncoras, que sustentam o posicionamento das proteínas quinase
e fosfatase, acarreta o aparecimento de algumas características: [1] aumento da
freqüência de fosforilação/ desfosforilação quando as quinases/ fosfatases estão
próximas ao substrato, aumentando conseqüentemente a especificidade da
quinase/ fosfatase; [2] aumento da razão sinal/ ruído para substratos localizados a
uma certa distância das proteínas quinase/ fosfatase; e [3] uma fosforilação basal
significante para substratos localizados muito próximos às proteínas-âncoras.
PROTEÍNAS QUINASE DEPENDENTES DE AMPc
Os neurotransmissores que estimulam a formação de AMPC <IMAGEM 5>
exercem seus efeitos intracelulares principalmente através da ativação das
proteínas quinase dependentes de AMPC (PKA). As PKA são proteínas tetraméricas,
sendo que duas subunidades funcionam como regiões reguladoras da atividade
das outras duas subunidades, as catalíticas <IMAGEM 6>. Assim, a ligação de quatro
moléculas de AMPC, duas moléculas para cada subunidade reguladora, diminuem a
afinidade existente entre as subunidades reguladora e catalítica, levando a
dissociação entre ambas e conseqüentemente a ativação das subunidades
catalíticas. Nesta configuração, as subunidades catalíticas podem fosforilar
proteínas (nos resíduos de Ser e Thr) tais como a CREB (proteína reguladora da
expressão gênica), a tirosina hidroxilase (enzima envolvida com a síntese de
catecolaminas), a MAP-2 (proteína associada a microtúbulo do tipo 2, envolvida
com a definição da morfologia celular), entre outras <IMAGEM 11 e 12>.
CÁLCIO-CALMODULINA QUINASES
Muitos dos efeitos intracelulares do Ca2+ são mediados pela calmodulina,
sendo que os efeitos do complexo Ca2+-calmodulina (CaM) são obtidos através da
fosforilação/ desfosforilação de proteínas. Diferentemente do sistema de
fosforilação despendente de AMPC, o sistema de fosforilação CaM pode ser tanto
específico como multifuncional. A miosina de cadeia leve quinase (MLCK) só é
capaz de fosforilar (em resíduos de Ser e Thr) as cadeias leves de miosina, sendo
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portanto extremamente específica. Já as CaM quinase I, II e IV possuem a
capacidade de fosforilar um amplo espectro de substratos, dentre eles a sinapsina
I, canais de cálcio, a Ca2+-ATPase, fatores de transcrição e receptores
glutamatérgicos,
apresentando
portanto
características
de
quinases
multifuncionais. Essas quinases são ativadas com o aumento da concentração
intracelular de Ca2+, proveniente tanto de canais de cálcio localizados na
membrana plasmática quanto de canais sensíveis ao inositol trifosfato (IP3)
presentes na membrana do retículo endoplasmático liso <IMAGEM 8>.
As CaM quinases são encontradas em todos os tecidos, porém os neurônios
apresentam uma grande quantidade dessas quinases, representando
aproximadamente 2% de todas as proteínas presentes no hipocampo (para a CaM
quinase do tipo II). A CaM quinase do tipo II é a principal quinase estudada neste
grupo <IMAGEM 7>. Ela é uma enzima multimérica, consistindo de 10 a 12
subunidades derivadas de quatro genes homólogos (α, β, γ, δ) que codificam
diferentes isoformas da quinase (variando de 54 kDa a 65 kDa por subunidade).
Ao contrário da PKA, as CaM quinases apresentam em um único polipeptídeo os
subdomínios reguladores e catalíticos. A regulação destas quinases por processos
de autofosforilação representa um importante aspecto destes tipos de agentes
fosforiladores e será abordado neste trabalho mais adiante, quando será discutida
a propriedade cognitiva dos sistemas de quinases e fosfatases.
PROTEÍNAS QUINASE ASSOCIADAS AO SISTEMA DE SINALIZAÇÃO DO INOSITOL
FOSFATO
As proteínas quinase C, ou PKC, são proteínas quinase relacionadas ao
sistema de sinalização intracelular do inositol fosfato. As PKC são Ser/Thr quinases,
com múltiplas funções, dentre elas, exocitose e endocitose de vesículas sinápticas,
plasticidade neuronal, expressão gênica e regulação do crescimento e ciclo celular.
Esta família de proteínas quinase é ativada por dois tipos de sinalizadores
intracelulares: o diacilglicerol (DAG), produzido pela ação da fosfolipase C sobre
lipídios de membrana (no caso, o fosfatidilinositol 4,5-difosfato) e o Ca2+,
produzido pela ação do IP3 (o outro produto da ação da fosfolipase C) sobre canais
de Ca2+ localizados no retículo endoplasmático liso <IMAGEM 8>. Ao contrário da PKA,
as PKC são enzimas monoméricas, ou seja, um único polipeptídio contém os
domínios reguladores e catalíticos. Assim como visto para outras quinases, a
ligação dos segundos mensageiros ao domínio regulador promove o deslocamento
do domínio autoinibidor, levando a ativação reversível do domínio catalítico.
PROTEÍNAS TIROSINA QUINASE
Proteínas quinase que fosforilam resíduos de Tyr em proteínas-chave
participam em numerosos processos celulares, estando normalmente associadas
com a regulação do crescimento e da diferenciação celular <IMAGEM 9>.
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Normalmente a transdução de sinal pela via das proteínas tirosina quinase (PTK)
envolve múltiplas fosforilações, de diferentes tipos de aminoácidos (Tyr, Ser e
Thr).
Existem duas classes de PTK. A primeira família inclui aquelas proteínas que
são ativadas pela ligação de substâncias localizadas no meio extracelular à
receptores específicos localizados na membrana plasmática (fazem parte desta
classe os fatores de crescimento e as neurotrofinas). A segunda família
compreende as quinases solúveis, localizadas no citoplasma e ativadas
indiretamente por ligantes extracelulares. Assim, a ativação das PTK se diferencia
enormemente das Ser/Thr quinases pois as primeiras não dependem da produção
de um segundo mensageiro. Assim, as PTK são independentes da produção de
segundos mensageiros, sendo ativadas imediatamente após a ligação do estímulo
extracelular com o receptor da PTK.
PROTEÍNAS FOSFATASES
As proteínas fosfatases envolvidas na sinalização neuronal são classificadas
em dois tipos: as fosfoserinas-fosfotreoninas fosfatases (PSPs) e as fosfotirosinas
fosfatases (PTPs). Essas proteínas são enzimas que catalisam a hidrólise da ligação
éster do aminoácido fosforilado, formando assim, um fosfato inorgânico e uma
proteína desfosforilada. As fosfatases controlam todos os processos celulares das
proteínas quinase, incluindo a neurotransmissão, a excitabilidade neuronal, a
expressão gênica, a síntese protéica, a plasticidade neuronal e o crescimento
celular. As PSPs são as principais fosfatases encontradas nas células. Elas são
normalmente multifuncionais e podem ser classificadas em seis grupos: 1, 4, 5,
2A, 2B e 2C. Essa classificação está de acordo com os substratos por elas
atacados, seus inibidores e no recrutamento por outras substâncias <IMAGEM 10>.
Dentre todas essas fosfatases, somente a fosfatase-2B (ou calcineurina) responde
diretamente à um segundo mensageiro (aumento da concentração intracelular de
Ca2+). Todas as outras são ativadas quando fosforiladas pelas próprias proteínas
quinase.
MEMÓRIA MOLECULAR E QUINASES COGNITIVAS
A habilidade dos três maiores sistemas de quinase (PKA, CaM quinase II e
PKC) cerebrais em iniciar e manter alterações sinápticas que suportem funções
cognitivas, como o aprendizado e a memória, requer a modificação persistente
dessas proteínas. Assim, essas quinases são consideradas quinases cognitivas
porque [1] são capazes de sustentar seus estados de ativação mesmo após o
desaparecimento da sinalização de segundos mensageiros e [2] seus substratos
modulam a plasticidade sináptica.
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Determinados padrões de estimulação das fibras musgosas que inervam os
neurônios da região de CA3 no hipocampo (estrutura cerebral envolvida com
processos de memória e aprendizado) podem levar ao aparecimento de uma
potenciação de longa duração. Tal processo é dependente das PKA. Assim, a
estimulação elétrica dessas fibras promove um aumento dos níveis intracelulares
de AMPC, dentre outros segundos mensageiros (como o Ca2+, por exemplo), que
atuando sobre os domínios reguladores da PKA causam a dissociação desta
subunidade da subunidade catalítica. Caso esse estímulo persista por muito tempo
ou seja facilitado por outra via de neurotransmissão, as subunidades reguladoras
podem sofrer a ação de proteases <IMAGEM 6>. Essas proteases irão diminuir a razão
entre as subunidades reguladoras/ catalíticas, permitindo que subunidades
catalíticas fiquem livres por um longo período (pois não existem subunidades
reguladoras suficientes para inativar as subunidades catalíticas). Assim, a atividade
da PKA permanece presente mesmo após a cessação do estímulo (i.e., aumento
dos níveis de AMPC). A ativação prolongada da PKA possibilita que as subunidades
catalíticas possam migrar para a região intranuclear e assim, induzir a expressão
gênica. Dentre os genes induzidos pela PKA encontram-se aqueles responsáveis
por sintetizar novas proteases que irão facilitar a degradação das subunidades
reguladoras. Podemos observar, portanto, a modificação do estado de “equilíbrio
bioquímico” de uma célula por eventos anteriores, caracterizando assim a memória
molecular de uma via de fosforilação.
A CaM quinase tipo II é a quinase mais estudada dentre aquelas
dependentes de Ca2+ e que apresentam memória molecular, porque esta enzima
possui a capacidade de se autofosforilar e as proteínas por ela fosforiladas
participam da plasticidade neuronal (i.e., sinapsina I) <IMAGEM 11>. Assim, estímulos
de baixa freqüência levam a ativação submáximas da quinase a cada estímulo,
enquanto que estímulos de alta freqüência resultam em um maior recrutamento
das subunidades da quinase, tornando-a mais ativa e autônoma em relação ao seu
sistema de segundo mensageiro (CaM). Em estímulos de alta freqüência, o
intervalo entre as ondas de Ca2+ é muito pequeno para permitir a desfosforilação
ou a dissociação entre a calmodulina e as subunidades da quinase. Deste modo,
aquelas subunidades fosforiladas (e, portanto ativas, capazes de realizar uma
reação de fosforilação) podem fosforilar as subunidades vizinhas <IMAGEM 7>. Assim,
esta quinase pode ser catalogada como uma quinase cognitiva porque apresenta
processos de memória molecular (autofosforilação) e seus substratos alvos são
proteínas envolvidas na plasticidade sináptica (sinapsina I).
As PKC também podem ser convertidas em um formato que é
independente, ou autônoma, de seus segundos mensageiros e por isso podem ser
descritas como quinases cognitivas. Os mecanismos pelos quais essa família de
quinase é considerada uma quinase cognitiva estão pouco elucidados, porém
experimentos demonstram a participação desta classe de substâncias em
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processos como a potenciação de longa duração, sendo sugeridos a participação
dos receptores NMDA e AMPA, ambos substratos desta classe de quinase.
POR QUE DOIS CONJUNTOS DE AMINOÁCIDOS FORAM SELECIONADOS COMO
ALVOS PARA FOSFORILAÇÃO?
Existem três tipos de aminoácidos que podem sofrer a adição de um radical
fosfato, sendo as quinases responsáveis por essa reação divididas em duas
classes, as PSPs (Ser/Thr quinases) e as PTPs (Tyr quinases). Conforme visto
anteriormente, as PSPs são quinases envolvidas com processos plásticos de célula
e são ativadas por diferentes sistemas de segundos mensageiros. Já as PTPs são
quinases envolvidas com processos de crescimento e diferenciação celular. Assim,
as conseqüências da perda de especificidade de uma reação de fosforilação por
uma PSPs pode afetar a atividade metabólica de uma célula ou mesmo a função
sináptica de um neurônio, mas seguramente não irá iniciar processos irreversíveis
e globais como o crescimento e a diferenciação celular. A conseqüência de
estímulos impróprios entre os dois sistemas de quinase pode ser observado no
aparecimento de tumores, onde provavelmente estímulos “corriqueiros” são
responsáveis por induzir a expressão de oncogenes.
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Novembro de 2000.