Como Purificar
Pesquisa
PROTEÍNAS?
O exemplo das defensinas antifúngicas de ervilha
Marcius S. Almeida
Departamento de Bioquímica Médica,
Instituto de Ciências Biomédicas,
Universidade Federal do Rio de Janeiro, RJ,
[email protected]
Eleonora Kurtenbach
Departamento de Bioquímica Médica,
Instituto de Ciências Biomédicas,
Universidade Federal do Rio de Janeiro, RJ,
árias doenças decorrem da
modificação da estrutura e/
ou da atividade de diferentes proteínas. Atualmente,
o tratamento dessas doenças é baseado na inibição ou na ativação
da(s) enzima(s) em questão ou de
receptor(es), através da interação destas com o princípio ativo presente nos
medicamentos.
Figura 1 – Coluna de troca catiônica em sistema de leito expandido utilizada para clarificação de meio de cultura contendo uma defensina recombinante de ervilha que possui atividade antifúngica, expressa heterologamente
em P.pastoris (Almeida e cols., 2001). O meio de cultura (50 ml) é diluído
2x; o pH ajustado para 3,0 (a maioria das proteínas assumirão carga líquida
positiva, pois possuem pI maior do que 3,0) e aplicado, com fluxo ascendente, em uma coluna contendo 95 mL de resina Toyopearl SP-650 M, previamente equilibrada com citrato de sódio 20 mM, pH 3,0. O material não
ligado, como sais e leveduras é eluído com o mesmo tampão e, finalmente,
as proteínas ligadas são eluídas com fluxo descendente de tampão HEPES
50 mM pH 8,0. A absorbância do eluído é monitorada a 280 nm (linha
cheia) e o pH de cada fração verificado com tiras de indicador de pH (linha
pontilhada). A seta indica a regeneração da coluna através da passagem de
NaCl 1 M. O pico que possui a atividade antifúngica (que contém a defensina recombinante) é marcado com um asterisco. No gráfico, também é apresentada esquematicamente, a coluna utilizada nesse sistema
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Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 24- janeiro/fevereiro 2002
Em muitos casos, as preparações
protêicas são usadas diretamente na
terapêutica. Essas proteínas podem ser
obtidas a partir de sua fonte natural,
como é o caso da albumina, obtida a
partir do plasma humano, ou a partir de
sua produção em organismos geneticamente modificados, sendo rotuladas genericamente de proteínas recombinantes.
Tanto para o estudo da atividade de
uma enzima frente a substâncias passíveis de ser usadas em formulações terapêuticas, como para o uso direto como
medicamento, existe a necessidade de
purificação da proteína de interesse,
uma vez que qualquer célula contém
milhares de proteínas diferentes, que
apresentam uma ampla faixa de atividade biológica.
Atualmente, o meio científico vive a
denominada Era Pós-Genômica. Após o
seqüenciamento de diversos genes de
diferentes organismos, incluído o genoma humano completo (Lander e cols.,
2001), começa uma busca frenética,
para a determinação da atividade das
proteínas codificadas para cada um dos
genes descritos, a fim de inferir sua
função biológica e, finalmente, correlacioná-las com diversas doenças. Esse
grande desafio para a ciência é denominado de proteoma, quando o objetivo é
a análise e posterior caracterização das
proteínas expressas em uma determinada situação de um grupo de células ou
de genoma estrutural; quando o enfoque é a análise da estrutura tridimensional de diferentes proteínas, com a
finalidade de se inferir sua atividade
biológica através de análises de homologia estrutural. Para ambos os casos, é
necessária a obtenção das proteínas de
interesse com alto grau de pureza.
Tipicamente, o processo de purificação de uma proteína é composto por
múltiplas etapas cuidadosamente definidas, que têm como fundamento a
forma, é razoável minimizar
distinção das proteínas
as condições oxidantes do
com base na seqüência
meio, por exemplo, através
de aminoácidos, no conda adição de agentes reduteúdo de carboidratos e
tores, como o β-mercaptoede lipídeos-estrutura tritanol, ou, simplesmente, se
dimensional, e na sua atievitando a formação excesvidade biológica, entre
siva de bolhas. Muitas vezes
outras características desas proteínas são instáveis
sas macromoléculas. Esse
quando estão em solução
processo deve ser associmuito diluídas ou muito conado com o acompanhacentradas, por exemplo, abaimento de alguma caracxo de 10 µM ou acima de 1
terística marcante da promM, respectivamente (Deutsteína como, por exemcher, 1990).
plo, sua atividade (ativiO requerimento inicial
dade proteolítica da trompara a purificação de uma
bina) ou sua coloração
proteína é a liberação da
(citocromo C que possui
mesma de sua fonte natural,
coloração vermelha). As
como, por exemplo, do encromatografias em coludosperma de sementes ou
na de gel, filtração ou
de células que a expressam
adsorção (Deutscher,
heterologamente. Essa fra1990), são os sistemas
ção é denominada de extramais utilizados para a disto bruto. Os tecidos são getinção entre proteínas e,
ralmente triturados ou moíapesar de existir uma lódos e as bactérias, as levedugica no emprego desses
Figura 2 – Esquema geral da purificação de duas defensinas
ras ou as células animais
métodos, geralmente a
(Psd1 e Psd2) de sementes de ervilha que possuem atividaprovenientes de cultura são
otimização de um protode antifúngica (Almeida e cols., 2000). Em cada fração é
lisadas por sonicação, variacolo de purificação enverificada a presença de atividade antifúngica. Uma fração
ções repentinas de pressão e
volve muita experimencontendo Lectinas (proteínas com afinidade por açúcares) se
osmolaridade, forte agitação
tação do tipo tentativa e
liga à resina Sephadex G-75 (composta de um polímero
na presença de esferas de
erro, especialmente pelo
glicídico) e é deslocada somente após a lavagem com soluvidro ou por enzimas citolífato de que mesmo quanticas. Se a proteína desejada
do se conhece as caracção de glicose. Os asteriscos indicam as frações com atividaestá restrita a uma organela
terísticas físico-químicas
de antifúngica. A purificação das defensinas é acompanhada
em particular, como núcleo,
das proteínas a serem
por eletroforese em gel de poliacrilamida (Fig. 5)
mitocôndria ou até ligada a
purificadas, é muitas vemembrana plasmática, uma
zes imprevisível o compurificação substancial é obtida a partir
portamento delas no decorrer do propassa, muitas vezes, no decorrer de anos
cesso de purificação. Nesse caso, durane o protocolo final deverá ser resultado do isolamento dessas estruturas celulares, geralmente por centrifugação difete a purificação, não raramente ocorrem dos seguintes compromissos, definidos
rencial em gradiente de sacarose, percomudanças na estrutura das proteínas, no desenho do processo: custo, velocill, etc. O uso de detergentes não iônicos
que podem provocar desde pequenas
dade e pureza.
(triton X, tween, etc.) facilita a liberação
alterações nas suas características físidas proteínas, especialmente quando
co-químicas até modificação ou perda
CONSIDERAÇÕES INICIAIS
estas se encontram no interior de orgade sua atividade biológica.
nelas. Muito freqüentemente, são incluO grande desafio dos processos de
É essencial considerar que, na maiopurificação de proteínas é o exaustivo ria dos casos, as proteínas são macro- ídos diversos aditivos durante a obtenção do extrato bruto, com o intuito de
trabalho para se encontrarem as melhomoléculas muito frágeis, ou seja, sofrem
evitar a degradação química ou enzimáres estratégias, e, se for o caso, a adefacilmente alterações físico-químicas que
tica da proteína de interesse, uma vez
quação da metodologia para a escala de
levam a modificação ou perda de sua
que, no ato da destruição celular, são
produção pretendida, garantindo que o
atividade. Até mesmo a exposição a
liberados vários compostos altamente
produto final tenha todas as caracterís- temperaturas moderadas (como 37oC)
pode causar lenta e gradativa desnatu- oxidantes como o peróxido de hidrogêticas necessárias para seu uso, seja em
ração de algumas proteínas. As proteí- nio (H2O2) ou enzimas proteolíticas.
humanos, ou para diagnóstico, ou uso
Aditivos comumente utilizados são os
veterinário ou para processos analíticos nas também são sensíveis à oxidação,
especialmente as citoplasmáticas, que agentes redutores como o β-mercaptode interesse para a pesquisa básica,
se encontrem, naturalmente, em um
etanol, estabilizantes como o glicerol e
como o estudo da estrutura tridimensimeio com potencial redutor relativainibidores de proteases como o ácido
onal da proteína por ressonância magetileno-diamino-tetraacético (EDTA), um
nética nuclear de alta resolução ou mente alto e que possuam resíduos de
inibidor de enzimas dependentes de
cristalografia por Raios-X. Tudo isso se cisteína passíveis de ser oxidados. Dessa
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nantes adsorvem na resina, enquanto as
células saem pela parte superior da
coluna, uma vez que a tela existente na
parte superior da coluna é aberta o
suficiente para permitir a saída dos restos celulares e de outras partículas que
estiverem presentes; 3 – lavar a resina de
baixo para cima, com o tampão de
lavagem, para remoção dos restos celulares e das proteínas que não se adsorveram na resina; 4 – eluir a proteína de
interesse invertendo-se o fluxo pela
coluna, ou seja, com o leito sedimentado, como em uma cromatografia convencional; 5 – por fim, a coluna é limpa
e regenerada para um novo uso.
A ESCOLHA DOS MÉTODOS
DE PURIFICAÇÃO
Figura 3 – Cromatograma de filtração em gel usada num dos passos intermediários da purificação das defensinas de semente de ervilha (Almeida e cols.,
2000). O precipitado protéico F2 (600 mg) é dissolvido em água destilada
(para 8 ml finais), filtrado e aplicado em uma coluna (1,6 x 100 cm) empacotada com gel Sephadex G-75 Superfine. As amostras são eluídas com tampão
Tris-Cl 25 mM pH 7,5 a um fluxo de 0,7 ml/min. A absorbância a 280 nm
(linha sólida) e a atividade antifúngica (linha pontilhada) das frações coletadas
são monitoradas. Frações contendo proteínas de baixo peso molecular e alta
atividade antifúngica são agrupadas (F-PII) para posterior purificação por
HPLC. No gráfico, é representada uma partícula de gel usada nesse tipo de
cromatografia , onde os poros são indicados em preto
íons metálicos divalentes.
Em alguns casos, esse passo inicial
não é necessário, como, por exemplo,
quando proteínas recombinantes expressas na levedura Pichia pastoris são
secretadas para o meio de cultura, um
sistema cada vez mais usado para se
obter grande quantidade de proteínas já
em solução aquosa (Almeida e cols.,
2001).
O passo seguinte consiste na clarificação da amostra. Essa etapa representa
um grande problema a ser solucionado
especialmente em purificações de grande escala ou em escala industrial. Na
maioria das vezes, utilizam-se técnicas
de centrifugação ou de filtração. Ainda
assim, tais técnicas podem não resolver
o problema de clarificação da sua amostra, trazendo uma série de transtornos
como a obtenção de uma solução ainda
particulada, entupimento das membranas de filtração, manipulação de um
grande volume num tempo excessivamente longo e custo elevado. Pensando
nesses transtornos, foram desenvolvidas resinas cromatográficas que, ao contrário das convencionais, permitem a
adsorção de amostras contendo materiais particulados e/ou células. Esse novo
conceito é conhecido como sistema de
leito expandido (Janson e Rydén, 1998)
e, como ilustrado na Figura 1, consiste
basicamente em: 1 - equilibrar a fase
estacionária (resina adsorvente) na forma expandida, com o tampão de equilíbrio; 2 – aplicar a amostra contendo as
células, no sentido de baixo para cima,
no leito estabilizado. Dessa forma, a
proteína de interesse e alguns contami-
Antes de dar prosseguimento à purificação da proteína a partir do extrato
bruto definido acima, deve-se planejar a
estratégia a ser utilizada, onde, além da
estabilidade da proteína, devemos também considerar os seguintes itens (Ho,
e cols., 2000):
· aplicação final do produto:
humano, veterinário, diagnóstico, etc.
· escala de manufatura necessária à demanda do produto
purificado.
. eficiência do processo, geralmente expresso em termos de
enriquecimento e recuperação
da proteína de interesse 1.
· viabilidade econômica, levando-se em conta o gasto envolvido em cada técnica de purificação.
· existência de facilidades de
produção, devendo ser considerada, a preexistência de
material necessário à terceirização da produção, etc.
· adequação às especificações
determinadas pela farmacopéia
de referência, Ministério da
Saúde e órgãos reguladores.
O esquema ideal de purificação vai
depender não só das características da
proteína de interesse, como já citado
antes, mas também das características
dos contaminantes presentes no extrato
bruto. A linha geral a se seguir em um
O enriquecimento (E) é dado pela equação E = AEF/AEB, onde AEF é a atividade específica da fração e AEO é a atividade
específica no extrato bruto de proteínas, ambos expressos em Unidades/mg proteína total. A recuperação (Rec) é dada
pela equação Rec(%) = [EnzF]/[EnzB] x 100, onde EnzF se refere à quantidade de enzima obtida em cada passo de
purificação e EnzB à quantidade de enzima encontrada no extrato bruto, geralmente expressas em Unidades ou mg de
enzima. Um passo de purificação eficiente proporciona um aumento no enriquecimento da enzima sem diminuir muito
sua recuperação. Uma Unidade de enzima representa a conversão de 1 µM de substrato por minuto (Deutscher, 1990).
1
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palmente, a faixa de peso
molecular a ser separado)
que apresenta poros de
uma determinada faixa de
tamanho. Moléculas com
diâmetro molecular 3 menor do que o do poro serão
capazes de penetrar na resina, percorrendo então um
caminho mais sinuoso e
maior do que as moléculas
que apresentam diâmetro
molecular superior ao do
poro, que não seriam retiOs primeiros passos de
das (Figura 3). No caso do
purificação geralmente
exemplo escolhido neste
são aqueles que possuartigo foi possível separar
em um menor poder de
Figura 4 – Cromatografia de fase reversa em sistema de
basicamente uma fração
resolução, porém que
HPLC para purificar duas defensinas antifúngicas de secontendo proteínas de alto
permitem o tratamento
mentes de ervilha (Psd1 e Psd2) (Almeida e cols., 2000).
peso molecular (Pico I) de
de grande quantidade
A fração F-PII (280 µg) obtida da cromatografia de filtrauma fração contendo prode material como a diáção em gel é aplicada em uma coluna de fase reversa
teínas com baixo peso molise, através de memsemipreparativa C8-VYDAK, previamente equilibrada
lecular (Pico II) utilizanbrana com porosidade
com 0,1% (v/v) de TFA e 22,5% (v/v) de acetonitrila. As
do-se uma coluna de gel
inferior ao tamanho da
proteínas retidas são eluídas com um gradiente linear
filtração Sephadex G-75.
proteína de interesse; a
Como observado na Figudesnaturação por calor,
crescente de concentração de acetonitrila (22,5 – 35 %
ra 3, proteínas apresentanquando a enzima de in(v/v)) e, finalmente, liofilizadas
do atividade antifúngica
teresse é estável a alta
são eluídas junto ao Pico
temperatura (geralmenII, aqui denominada F-PII. As
aumento considerável de temperate acima de 70oC), ou a precipitação com grande concentração de
colunas de adsorção possuem,
tura. Além disso, a solução final
etanol, acetona, sais inorgânicos,
em suas matrizes, grupamentos
não apresenta alta densidade, facietc., que perturbam a distribuição
químicos responsáveis pela intelitando a obtenção do precipitado
de cargas e grupamentos hidrofóração com a proteína. Incluemprotéico após centrifugação. Esse
bicos das proteínas, aumentam a
se nesse caso as matrizes que
primeiro passo na purificação de
constante dielétrica da água e/ou
possuem grupamentos ionizados
proteínas tem como vantagem
diminuem a quantidade efetiva de
(carregados positivamente ou neaumentar a concentração de promoléculas de solvente disponíveis
gativamente) nas cromatografiteína na amostra e/ou preparar a
devido à mobilização deste em
as de troca iônica; que apresenamostra para ser aplicada em uma
suas camadas de solvatação. Podetam grupamentos hidrofóbicos
cromatografia.
se, inclusive, induzir uma precipi(geralmente hidrocarbonetos li(II) Esta é a fase mais eficiente da
tação fracionada das proteínas preneares) nas cromatografias de
purificação de proteínas, uma vez
sentes no extrato bruto adicionanfase reversa ou interação hidroque se exploram diferentes caracdo-se sais para concentrações fifóbica e que possuem ligantes
terísticas físico-químicas das pronais definidas e, posteriormente,
específicos (como Ni+2, hepariteínas. Muito freqüentemente comna, glutationa) nas chamadas croseparando-se o precipitado protéipreende o uso de diferentes técnimatografias de afinidade. As proco formado em cada concentração
cas de cromatografia em coluna
teínas retidas na coluna são elude sal do sobrenadante que conque são classificadas de acordo
ídas gradualmente e, o que é
tém aquelas com maior capacidacom a característica protéica selemais importante, seletivamente,
de de solvatação. O sulfato de
cionada (Tabela I). A filtração em
através da passagem de um graamônio é um dos agentes precipigel consiste na passagem de uma
diente de concentração de uma
tantes amplamente usados nessa
solução proteíca em uma coluna
substância que compete pela lietapa. Apresenta como caracteríspreenchida com uma resina (o tipo
gação da proteína com os grupaticas a capacidade de precipitar
de resina especifica a resolução 2,
a velocidade do processo e, princimentos químicos da resina (por
irreversivelmente as proteínas sem
processo de purificação pode
ser dividida em três fases indicadas abaixo (Janson e
Rydén, 1998; Deutscher,
1990). Neste artigo, usaremos como exemplo a purificação de duas defensinas antifúngicas purificadas a partir
de semente de ervilhas. A
Figura 2 apresenta o esquema de purificação utilizado
(Almeida e cols., 2000).
(I)
A resolução (R) de uma coluna cromatográfica está diretamente relacionada com a separação obtida (S - determinada em
unidades de volume ou tempo) entre dois picos de amostra eluídas de uma coluna cromatográfica e inversamente
proporcional à largura de cada pico (L – determinada em unidades de volume ou tempo). Dessa forma: R = S/L. Quando
R > 1,2, diz-se que se obteve uma separação com resolução a nível da linha de base (Janson e Rydén, 1998).
3
O diâmetro molecular está diretamente relacionado com o peso molecular das substâncias, incluídas as proteínas. Para
uma proteína globular (formato mais próximo de uma esfera do que um bastão, por exemplo) de 5.5 kDa, seu diâmetro
molecular é de, aproximadamente, 30 Å.
2
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exemplo: sais para as
resinas de troca iôniDurante a fase II de purica, solventes orgânificação, devem-se levar em
cos para fase reversa e
conta os seguintes itens: 1 –
solução contendo lipara uma purificação mais
gante específico para
eficiente, é aconselhável a
as de afinidade). Na
escolha de técnicas que exFigura 4, apresentaplorem seqüencialmente dimos, como exemplo,
ferentes propriedades físicoo último passo cromaquímicas das proteínas; 2 – a
tográfico aplicado na
atividade da proteína deve
purificação das defenser acompanhada em todos
sinas de ervilha. Nesse
os passos de purificação, ascaso, as defensinas
sim como a quantidade total
(Psd1 e Psd2) são elude proteína, uma vez que
ídas separadamente de
esses parâmetros, em conuma coluna de fase Figura 5 – Análise do conteúdo protéico dos passos de
junto, são cruciais para a avareversa por meio de
liação da eficiência da purifipurificação de duas defensinas de ervilha (Psd1 – 5,5 kDa
um gradiente com
cação. A atividade da proteíe Psd2 – 5,9 kDa) por eletroforese em gel de poliacrilamiconcentrações cresna deve ser verificada pelo
da 18 %, na presença de SDS e β-mercaptoetanol (Almeida método mais simples e sensícentes de um solvente
orgânico (Acetonitri- e cols., 2000). As proteínas são visualizadas por incorporavel possível. A quantificação
ção de prata. Amostra 1, padrão de peso molecular; amosla).
protéica pode ser estimada
(III) A fase final inclui, tra 2, extrato bruto; amostra 3, fração precipitada com sulpela absorção de luz na faixa
geralmente, um único fato de amônio F2; amostras 4 e 5, frações de proteínas de
do ultravioleta (209-295 nm)
4
ou através do uso de subspasso, que retira quais- alto peso molecular (PI) e, de baixo peso molecular (FPII),
respectivamente
eluídas
da
cromatografia
de
filtração
tâncias que ou se ligam a
quer contaminantes
proteínas (como o corante
que porventura ainda em gel Sephadex G75 SF; amostras 6 e 7, Psd1 e Psd2
Azul de Coomassie) ou reaestejam presentes na eluídas da cromatografia de fase reversa C8 em sistema de
gem com essas, resultando
amostra . Pode ser uma HPLC, último passo de purificação dessas defensinas
em um produto colorido
liofilização que permi(como o sulfato de cobre II
ta a retirada de contapresente no Reagente de Lowry). Essas
minantes voláteis sob baixas prespequeno diâmetro (por exemplo,
sões (em torno de 15 bar); uma
20 Å), forçada por pressão, entre duas últimas são técnicas mais específicas, porém mais trabalhosas; 3 – a puridiálise para excluir sais ou outras
outras técnicas. No exemplo adoficação também pode ser acompanhada
moléculas não voláteis da solução
tado as defensinas Psd1 e Psd2
usando-se anticorpos específicos, tanto
protéica, ultrafiltração, que encereluídas da coluna de fase-reversa
por “Dot Blotting” como por “Western
ra o mesmo propósito que a diálisão liofilizadas com vistas a elimise, porém tem como princípio a
nar a acetonitrila e o ácido trifluo- Blotting” 5; especialmente no caso de
proteínas cuja atividade não seja cofiltração da solução de proteína
racético (TFA) usado no processo
nhecida, 4 – o conteúdo protéico de
por uma membrana com poros de
cromatográfico.
4
Proteínas absorvem luz na faixa do ultravioleta por duas vias principais: em torno de 280 nm, ocorre a absorção por
grupamentos aromáticos presentes na cadeia lateral do triptofano, tirosina e fenilalanina e, em torno de 210 nm, ocorre
a absorção de luz pelas ligações amídicas da proteína, conhecidas especificamente como ligações peptídicas (Deutscher,
1990).
5
Técnicas onde se avalia a presença de uma proteína por reconhecimento do anticorpo primário feito especificamente
para tal proteína. A revelação é feita usando-se um anticorpo secundário que reconheça a porção FAB do anticorpo primário
e que esteja conjugado geralmente a uma enzima que participe de uma reação onde um de seus produtos apresente
coloração. O “Dot Blotting” diferencia-se do “Western Bloting”, pois, no primeiro caso, a amostra a ser analisada é aplicada
simplesmente em um suporte (geralmente membrana de nitrocelulose); já no segundo caso, a amostra provém de um gel
de eletroforese, de onde as amostras são transferidas para o suporte por ação de um campo elétrico.
6
Na eletroforese sob condições desnaturantes, as proteínas inicialmente são tratadas com um detergente aniônico (SDS
– dodecil-sulfato de sódio), que se liga não covalentemente às proteínas tornando-as espécies negativamente carregadas,
além de desenovelá-las. Essas proteínas tratadas são então aplicadas no início de um gel (que funcionará como uma espécie
de peneira molecular) e, finalmente, submetidas a um campo elétrico que impulsionará tais proteínas através do gel.
Proteínas de grande peso molecular farão em percurso menor que proteínas de menor peso molecular. Na eletroforese
bidimensional, as proteínas são aplicadas em um gel com formato bem alongado que possua um gradiente de pH
(estabelecido por eletrólitos anfotéricos previamente submetidos à eletroforese) e submetidas a um campo elétrico que
as impulsionará até a faixa do gel que possua o pH igual ao pI (ponto isoelétrico) de cada proteína. Nesse ponto, as proteínas
pararão de migrar no gel, pois assumirão carga média nula. Finalmente, esse gel é colocado de lado no início de outro gel
para separar por eletroforese as proteínas de diferentes pesos moleculares. Em ambas as técnicas, a proteína é evidenciada,
na maioria dos casos, por coloração com Azul de Coomassie ou pela impregnação de Prata.
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Tipo de
Cromatografia
Gel Filtração
Característica da
Proteína
Volume molecular
Troca Iônica
Carga
Interação
Hidrofóbica
Fase Reversa
Hidrofobicidade
Afinidade
Especificidade à
ligantes
Hidrofobicidade
Condição Inicial
da Amostra
Volume da amostra
<5% do volume da
coluna
Baixa concentração
iônica
Eluentes
Qualquer solução
aquosa
Soluções salinas ou
com pHs distintos
da condição inicial
Soluções com baixa
Alta concentração
concentração salina
de sal
Não pode conter altas Solvente orgânico
concentrações de sais
Condições específicas Alta concentração de
ligante ou sais
para ligação
Condição Final da
Amostra
Amostra diluída em
eluente
Custo
Amostra concentrada
em solução salina
++
Amostra concentrada
em solução salina
Amostra sem sais em
solventes voláteis
Amostra concentrada
contendo ou não
ligante
++
+
+++
+++
Tabela I – Classificação das técnicas de cromatografia líquida de acordo com a característica físico-química que é explorada das proteínas. A condição inicial necessária para a realização da técnica, os eluentes mais comuns e as condições em
que a solução de proteína ficará após sua eluição da coluna são citados. O custo geral do processo é classificado levandose em conta os valores aproximados das colunas e dos acessórios geralmente empregados em cada técnica
todas as etapas deve ser avaliado por
eletroforese unidimensional (Figura 5)
ou bidimensional em gel de poliacrilamida 6. Através dessas análises é possível
verificar se a amostra se encontra no
grau de pureza desejado, ou se novos
passos de purificação serão necessários;
5 - é comum sacrificar razoavelmente a
recuperação da proteína em prol de um
grande enriquecimento; desse modo,
uma boa prática é iniciar a purificação
com passos simples e com menor resolução, que geralmente são baratos e de
maior capacidade, e, no decorrer do
processo, ir aumentando a seletividade
e a resolução dos passos de purificação,
que são mais caros e possuem menor
capacidade; 6 – procure manter o processo de purificação o mais simples
possível, de maneira que barateiem e
encurtem o processo, além de aumentarem a recuperação da proteína em questão.
QUALIFICAÇÃO DA PUREZA
Para se atestar a pureza final da
proteína, podem ser usadas várias técnicasque apresentem sensibilidades variadas.
Uma das maiores provas de que a
proteína está livre de contaminantes
protéicos é obtida por seqüenciamento
peptídico automático, onde se deve
identificar apenas uma seqüência. Podese identificar outras impurezas além das
de natureza protéica por espectrometria
de massa, onde deve constar apenas um
íon molecular (ou os derivados de sua
clivagem), e/ou por ressonância magnética nuclear de alta resolução, onde
devem ser identificados apenas os sinais
de ressonância da proteína.
Existem diversas outras técnicas analíticas bem mais simples e baratas para
se atestar com boa certeza a pureza da
amostra. O procedimento mais comum
é a eletroforese em gel de poliacrilamida
(Figura 5), que é um método rápido e
sensível, especialmente se o gel for
corado por impregnação de prata (sensibilidade de até 10 ng de proteína por
banda), porém não tão confiável, pois
separa as proteínas apenas por um tipo
de característica físico-química (peso
molecular). Outro procedimento muito
empregado é a eletroforese bidimensional, que já é muito mais confiável, pois
distingue as proteínas de duas maneiras
diferentes (peso molecular e ponto isoelétrico).
Adicionalmente, a pureza da amostra pode ser indicada com ótima confiabilidade por algum tipo de cromatografia em coluna quando realizado em
sistemas de HPLC, que dispõem de
diversos detectores altamente sensíveis
(como detectores tipo “diode array”,
que determinam a absortividade do eluído da coluna em todo espectro de luz
visível e de ultravioleta). Esse último
método carrega a vantagem de poder
ser um passo final da purificação da
amostra.
Em resumo, deve-se ter em mente
que não existe um protocolo definido
para purificação de proteínas. É necessário desenvolver um protocolo específico, utilizando-se os diversos métodos
de purificação existentes de uma forma
coerente com as características do material de onde se deseja purificar a
proteína de interesse, as propriedades
da própria proteína e sua finalidade.
AGRADECIMENTOS
Agradecemos a Katia S. Cabral, Luis
E. Diaz, Melissa A.F. Silva e Roberto P.
Campelo por valiosas sugestões e pela
verificação ortográfica.
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
Almeida, M.S., Cabral, K.M.S., Zingali,
R.B., & Kurtenbach, E. (2000). Characterization of two novel defense
peptides from pea (Pisum sativum)
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278-286, doi: 10.1006/abbi.2000.1824.
Almeida, M.S., Cabral, K.M.S, Medeiros,
L.N., Valente, A.P., almeida, F.C.L.,
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