TRANSFERIBILIDADE DE PRIMERS SSR DE Cucumis melo
PARA Luffa cylindrica
Alves, E.O.(1); Silveira, L.M.(1); Nunes, G.H.S.(1); Nascimento, E.C.(2);
Carvalho, K.K.A.(1); Oliveira, G.D.C.(3); Antonio, R.P.(2)
[email protected]
(1)
Universidade Federal Rural do Semi-Árido - UFERSA, Mossoró - RN, Brasil;
(2)
Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária - EMBRAPA, Mossoró - RN, Brasil;
(3)
Biotecnologista, Mossoró - RN, Brasil.
RESUMO
Dentre as espécies da família Cucurbitáceae, a bucha vegetal (Luffa cylindrica) vem
despertando a atenção por apresentar uma ampla variabilidade genética e por ser
utilizada para fins econômicos como esponja para banho, de louça, na limpeza geral e
no artesanato. Dessa maneira, o objetivo do presente estudo foi analisar a
transferibilidade de primers microssatélites desenvolvidos para melão (Cucumis melo)
em acessos de L. cylindrica. Foram utilizados dois genótipos de bucha pertencente a
coleção de cucurbitáceas da UFERSA. A extração do DNA genômico foi de acordo
com o método CTAB. Após a extração foram escolhidos 28 primers desenvolvidos
para C. melo, os quais foram utilizados nas reações de amplificação de PCR. Os géis
foram analisados de acordo com a presença “1” ou ausência “0” de transferibilidade
dos primers de C. melo para L. cylindrica. Foi observado que dos 28 primers
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escolhidos 21 foram considerados transferíveis, obtendo assim um percentual de
transferibilidade de 75%. Dessa forma, verificou-se que houve uma taxa significativa
de primers transferíveis de C. melo para L. cylindrica, o qual auxiliará em estudos
genéticos dessa espécie. Esse estudo acarretou na otimização do tempo investido em
relação a busca e ao desenho de primers realizados em estudos com L. cylindrica.
Palavras-chaves: Biotecnologia Vegetal, Marcador Molecular, Bucha vegetal.
Tema de interesse: Biologia Molecular
INTRODUÇÃO
A família Cucurbitaceae é formada por cerca de 118 gêneros que
contém em torno de 825 espécies com distribuição significativa em
solos tropicais (PRIORI et al., 2010). Entre as principais espécies
cultivadas destaca-se a abóbora (Cucurbita moschata), melão (C.s melo
L.), melancia (Citrullus lanatus) e o pepino (Cucumis sativus), dentre
outros representantes importantes para o agronegócio empresarial
brasileiro e na agricultura familiar (FERREIRA; DINIZ, 2007).
Uma das espécies dessa família que está despertando a atenção é a
bucha vegetal (L. cylindrica) por apresentar uma ampla variabilidade
genética e podendo ser utilizada para fins econômicos. Essa espécie
pertence ao gênero Luffa que é formado por sete espécies sendo à L.
cylindrica a mais conhecida e utilizada (FERREIRA et al., 2010).
Conforme Carvalho (2007), a bucha vegetal pertence ao grupo que é
conhecido como “Plantas industriais” assim como outras da mesma
família. Na comercialização a bucha se destaca por possuir um conjunto
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de fibras finas sendo utilizada como esponja de banho auxiliando na
higiene pessoal, dessa forma a bucha se torna mais procurada por
consumidores por ser natural, biodegradável e não poluente derrubando
assim suas competidoras que são feitas com materiais sintéticos. Pode
ser ainda usada no artesanato e tem se mostrado bastante importante
como produto medicinal (LEITE et al., 2007; CARVALHO, 2007).
A bucha vegetal vem sendo uma das espécies mais estudadas devido
apresentar uma ampla variabilidade genética, a qual possui alta
importância econômica (ASSIS, 2006). Buscando o aumento na
produtividade e uma boa qualidade na espécie programas de
melhoramento vem sendo realizados (AGUIAR, 2012). No entanto,
para seleção de algumas características esses programas podem levar
muitos anos. Uma ferramenta que pode acelerar esses programas de
melhoramento são os marcadores moleculares que de acordo com
Aguiar (2012) podem ser definidos como todo e qualquer fenótipo
molecular oriundo de um gene expresso ou de segmento específico do
DNA. Dentre vários tipos de marcadores moleculares os microssatélites
ou SSR (Simple Sequence Repeats) são os mais informativos, indicado
para uma análise genômica detalhada, pois são codominantes e possui
um alto grau de polimorfismo, além de necessitar apenas de uma
pequena quantidade de DNA pela técnica PCR (Polymerase Chain
Reaction) (RITSCHEL et al., 2004).
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Apesar
do
alto
custo
no
desenvolvimento
de
marcadores
microssatélites, a análise de transferibilidade desses marcadores de uma
espécie para outra do mesmo gênero ou de gêneros diferentes é bastante
propício, podendo se visualizar uma afinidade entre as mesmas (LEITE
et al., 2007). Muitas transferências de primers microssatélites de melão
tiveram resultados positivos, havendo transferibilidade para plantas
como a abóbora e melancia. Observando-se que esse método pode ser
empregado de forma a economizar tempo e estudos da variabilidade da
bucha vegetal (RITSCHEL et al., 2004; LEITE et al., 2007; PEIXOTO
et al., 2009).
Dessa maneira, o objetivo do presente estudo foi analisar a
transferibilidade de primers microssatélites desenvolvidos para C. melo
em acessos de L. cylindrica.
MATERIAL E MÉTODOS
Coleta e extração do material
Foram utilizados dois genótipos de bucha, escolhidos ao acaso, da
coleção de cucurbitáceas da Universidade Federal Rural do Semi-Árido
– UFERSA, campos Mossoró.
As sementes foram plantadas e cultivadas em casa de vegetação até a
germinação de suas folhas. Essas foram coletadas e procedeu-se o
processo de extração do DNA genômico de acordo com o protocolo
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Doyle e Doyle (1990).
Reação da Polimerase em Cadeia (PCR)
Após a extração foram escolhidos 28 primers (CMMS 1-3, CMMS 2-3,
CMMS 3-2, CMMS 4-3, CMMS 12-6, CMMS 15-4, CMMS 22-2,
CMMS 24-3, CMMS 30-3, CMMS 33-1, CMMS 33-2, CMMS 34-8,
CMMS 34-10, CMMS 35-4, CMMS 35-5, CMBR 16, CMBR 44,
CMBR 83, CMBR 95, CMBR 98, CMBR 109, CMBR 111, CMGAN 3,
CMAGN 68, CMCT 505, CMAGN 32, CMGA 165, CSAT 425)
desenvolvidos para C. melo, os quais foram utilizados nas reações de
amplificação. Essas foram feitas em um volume total de 10 µL,
contendo 10 mM (pH 8,3) de Tris-HCl, 50 mM de KCl, 2,5 mM de
MgCl2, 0,25 mM de cada dNTP, 250 µM de cada dos primers SSR de
acordo com DANTAS (2011), 0,5 U de Taq DNA polimerase e,
aproximadamente, 10 ng de DNA.
As amostras foram diluídas em água ultrapura e padronizadas em 10
ng/µL para serem utilizadas nas análises de microssatélites. Em seguida,
seguiu-se com as amplificações, as quais foram realizadas em
termociclador de acordo com o seguinte programa: 94°C por 2 min,
seguida de 40 ciclos de 94°C por 30 seg, a temperatura de anelamento
variou de 45, 50, 60°C por 1 min, 72°C por 1 min, extensão final de
72°C por 4 min e redução a 15°C.
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Para verificar a qualidade da amplificação, cada amostra foi corada com
3 µL de azul de bromofenol, e aplicadas em gel de agarose a 3% em
TBE 1X (EDTA 2 mM e Tris-borato 90 mM). Após a eletroforese a 80
V, os géis foram banhados com brometo de etídio (10 mg/mL) e as
bandas foram fotodocumentadas sob luz ultravioleta em sistema de
fotodocumentação.
Análise dos resultados
Os géis foram analisados de acordo com a presença “1” ou ausência “0”
de transferibilidade dos primers de melão para bucha.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Foi observado que dos 28 primers escolhidos 21 foram considerados
transferíveis (Tabela 2). Dentre os primers transferíveis analisaram-se
as temperaturas e a qualidade da amplificação, sendo observado que dos
21 primers testados, 17 foram transferíveis a uma temperatura de
anelamento de 50ºC. Desses, CMMS 4-3 e CMMS34-10, obtiveram um
resultado de amplificação sem necessitar de otimização. Porém, os
primers CMMS 33-2 e CMMS 34-10 foram otimizados para uma
temperatura de 60ºC (Tabela 2).
O padrão de bandas amplificadas encontra-se entre 200 a 750 pares de
base. O percentual obtido de primers transferíveis foi de 75%, sendo
superior aos 31, 25%, ao estudo obtido por Leite et al., (2007). Esse
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resultado mostra um percentual considerável de genes em comum entre
essas espécies, fazendo com que haja uma diminuição econômica
considerável em pesquisas nessa área, facilitando assim o uso de um
mesmo primer em estudos de diversidade genética em mais de uma
espécie de uma mesma família.
Peixoto et al., (2009) também analisaram o percentual de primers de C.
melo transferíveis e otimizados para L. cylindrica, os quais obtiveram
um resultado significativo. Dessa forma, foi dada a continuidade das
análises em otimização desses primers em L. cylindrica para a
utilização em estudos posteriores.
Tabela 1: Análise da transferibilidade de primers desenvolvidos para C. melo para L.
cylindrica.
Primer
CMMS 1-3
CMMS 2-3
CMMS 3-2
CMMS 4-3
CMMS 12-6
45ºC
*
*
*
*
*
Temperatura de anelamento
50ºC
60ºC
0
*
1
1
1
*
1
*
1
*
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CMMS 15-4
CMMS 22-2
CMMS 24-3
CMMS 30-3
CMMS 33-1
CMMS 33-2
CMMS 34-8
CMMS 34-10
CMMS 35-4
CMMS 35-5
CMBR 16
CMBR 44
CMBR 83
CMBR 95
CMBR 98
CMBR 109
CMBR 111
CMAGN 3
CMAGN 68
CMCT 505
CMAGN 32
CMGA 165
CSAT 425
‘*’ – Não houve teste; ‘0’
*
1
*
*
1
1
*
1
*
*
1
1
*
1
1
*
1
1
*
1
*
*
1
1
*
1
1
*
1
*
1
*
*
1
*
*
0
0
*
1
1
*
1
1
*
1
0
*
1
0
*
0
*
*
1
1
*
0
*
*
0
*
*
0
*
*
0
*
*
– Não houve transferibilidade; ‘1’ – Houve
transferibilidade.
CONCLUSÃO
1 – Houve uma taxa significativa de primers transferíveis de C. melo
para L. cylindrica, o qual auxiliará em estudos genéticos dessa espécie;
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2 – Esse estudo acarretou na otimização do tempo investido em
relação a busca e ao desenho de primers que poderiam ser realizados
em estudos com L. cylindrica.
REFERÊNCIAS
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melhoramento genético de plantas. In: I Ciclo de Palestras sobre o Uso
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Fitotecnia:
Área
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