Anais do IX Seminário de Iniciação Científica, VI Jornada de Pesquisa e Pós-Graduação
e Semana Nacional de Ciência e Tecnologia
UNIVERSIDADE ESTADUAL DE GOIÁS
19 a 21 de outubro de 2011
ANÁLISE QUÍMICA E BIOLÓGICA DA CASCA DO FRUTO DA
PITHECOCTENIUM CRUCIGERUM (BIGNONIACEAE)
Samantha Martins Aniz Guimarães1, Maísa Borges Costa1, Luciana Machado Ramos1.
Universidade Estadual de Goiás – Unidade Universitária de Ciências Exatas e
Tecnológicas (UnUCET), 75110-390, Brasil
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[email protected]
Palavras-chave: Pithecoctenium crucigerum, pente-de-macaco, Bignoniaceae.
1 Introdução
Os produtos naturais são os meios mais antigos empregados no tratamento de
enfermidades (FUCK et. al. 2005), devido à facilidade do acesso as mesmas, e principalmente,
devido ao conhecimento da população sobre a eficácia terapêutica desses vegetais. Tal
conhecimento contribui para a divulgação da importância das plantas medicinais, promovendo o
aumento de estudos nessa área (MACIEL, 2002).
O desenvolvimento dessas pesquisas deve-se ao fato de já se conhecer várias substâncias
bioativas isoladas, e também à expectativa de descobrir outros princípios ativos (FLOGLIO et.
al., 2006). Sendo o Brasil, um lugar de destaque para a realização desse tipo de estudo, pois
agrega a maior biodiversidade do mundo (CALIXTO, 2003).
Entre as diversas famílias de plantas estudadas pode-se destacar a Bignoniaceae. As
espécies dessa família podem ser encontradas em regiões tropicais e subtropicais, podendo
algumas, ser encontradas em climas temperados (GOMES, 2006).
Diante dessas considerações, dados etnobotânicos de espécies do gênero Bignoniaceae,
acompanhados de testes de prospecção fitoquímica, revelaram que as plantas desta família
apresentam uma vasta fonte de metabólitos secundários bioativos, atraindo cada vez o interesse
de estudo de vários grupos de pesquisa.
As substâncias químicas mais comuns nesta família são as naftoquinonas, que apresentam
várias atividades biológicas (MAZZA et. al., 2000).
A Pithecoctenium crucigerum, representante dessa família, é uma trepadeira lenhosa que
pode formar cipós de até 10 cm de diâmetro. Possui flores tubulosas branco-amareladas com
cerca de 7 cm de comprimento, seus frutos são secos e na parte externa cheios de espinhos
grossos, o que fornece o nome comum de “pente-de-macaco”(Disponível em:
http://caliandradocerradogo.blogspot.com/2010/09/pente-de-macaco.html).
Revisões bibliográficas evidenciam que há pouquíssimas pesquisas relacionadas a esta
espécie. Em especial podemos citar Von Poser e colaboradores, que no ano de 2000 isolaram os
iridóides glicosilados do caule da P. crucigerum (HOSTETTMANN et. al.,2000).
O ensaio de toxicidade sobre a Artemia salina é um dos ensaios que podem ser utilizados
no monitoramento de extratos vegetais (ARAUJO, 2010), e foi desenvolvido para encontrar
constituintes bioativos nos extratos das plantas. Esse ensaio também pode ajudar a mostrar a
toxicidade de um extrato com atividade moluscicida contra peixes e pequenos crustáceos
(MAGALHÃES, 2005).
Esse método também é utilizado no isolamento de componentes com atividade biológica
presentes nos extratos vegetais (KRISHNARAJU,2005) e tem sido inserido nas pesquisas que
envolvem, além do isolamento, a purificação e elucidação estrutural, com o objetivo de
colaborar com o estudo fitoquímico das plantas (ARAÚJO, 2010). E o fato de ser um ensaio
biológico rápido, simples e de baixo custo, favorece a sua utilização em diversas pesquisas com
plantas medicinais (RESENDE, 2001).
Os ensaios apresentam uma relação sobre toxidade da Artemia salina com as atividades
biológicas de substâncias e extratos de plantas farmacologicamente ativos, como por exemplo:
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atividades antifúngicas, antiviral, antioxidante, antimicrobiana, tripanocida e antitumoral.
Também é muito utilizado para o isolamento de compostos biologicamente ativos de extratos de
plantas (KRISHNARAJU, 2005).
A atividade do composto é avaliada como significativa quando o valor da dose necessária
pra matar 50% das larvas é inferior a 1000 μg/mL (FRANA, 2002). Desse modo significa que o
composto analisado pode ser tolerado pelo organismo, e precisa de outros testes para detalhar a
sua atuação (STEFANELLO, 2006).
2 MATERIAIS E MÉTODOS
2.1 Materiais e reagentes utilizados
* Materiais cromatográficos:
Cromatofolhas de Alumínio de sílica gel 60 F254 MERC, Sílica gel 60 (230 – 700 Mesh)
MERCK e Solventes P.A.
* Equipamentos
Evaporador rotativo (Quimis); Bomba à vácuo (Solab); Balança analítica (Gehaka); Estufa
(Solotest); Banho-maria (Marconi aparelho para laboratório), Câmara escura UV (CIENLAB);
Medidor de pH (Digimed).
2.2 Material botânico
Frutos de Pithecoctenium crucigerum foram coletados na Chácara Taquaral no município
de Santa Rosa de Goiás pela manhã e as exicatas identificadas por profissionais foram
depositadas no herbário da Unidade Universitária de Ciências Exatas e Tecnológicas da
Universidade Estadual de Goiás.
2.2.1 Separação, Secagem e Moagem
Após a coleta, a casca do fruto foi separada da entrecasca por meio de raspagem, e
posteriormente o material foi seco e moído.
2.2.2 Obtenção dos extratos brutos
O EBH, o EBB e o EBE, foram preparados através de extrações exaustivas, com um
método de maceração, a partir de 100 g do material triturado. Em seguida, colocou-se em um
erlenmeyer, adequadamente isolados com papel de filme e cobertos com papel alumínio para
proteger contra luz, e adicionou-se inicialmente 300 mL dos respectivos solventes. Deixou-se
então, todos esses extratos em repouso por no mínimo um dia, depois disso, trocou-se os
respectivos solventes. Em cada troca, filtrou-se os extratos, transferiu-se os solventes filtrados
para frascos âmbar separados e então adicionou-se mais solvente nos erlenmeyers que
continham os extratos. As trocas dos solventes foram feitas até total extração dos componentes
químicos da casca.
Posteriormente, o material bruto foi concentrado em evaporador rotativo para retirada do
solvente e obtenção dos extratos brutos hexânicos (EBH), extratos brutos etanólicos (EBE),
extratos brutos butanólicos (EBB).
2.2.3 Partição dos Extratos Brutos Etanólicos e dos Extratos Brutos Butanólicos
Após a evaporação dos solventes dos extratos, fez-se a partição do EBE e do EBB.
Colocou-se MeOH/H2O 20% juntamente com o extrato seco. Após dissolvê-los foi feita
uma extração descontínua com uma repetição de aproximadamente cinco vezes para todos os
solventes de diferentes polaridades. Esse procedimento foi iniciado com um solvente de menor
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polaridade para maior. Foram usados hexano, clorofórmio, diclorometano, acetato de etila e
butanol.
Depois de obtidas todas as frações do EBE e do EBB, evaporou-se cada uma através do
evaporador rotativo, e obteve-se a massa de cada fração.
2.3 Identificações dos Metabólitos Secundários de P. crucigerum
A prospecção fitoquímica foi realizada para a identificação dos metabólitos secundários
presentes no EBH, no EBB, nas fr. Hex, CHCl3, AcOEt e But do EBE, nas fr. Hex, DCM do
EBB e na fr. Hidroalcoólica de EBB com AcOEt, baseado no Manual para Análise Fitoquímica
de Extratos Vegetais (Barbosa, 2004).
Foram realizados os seguintes testes: saponina espumídica; ácidos orgânicos; açúcares
redutores; polissacarídeos; proteínas e aminoácidos; fenóis e taninos; flavonoides; alcaloides;
catequinas; sesquiterpenoslactonas e outras lactonas; esteróides e triterpenóides.
2.4 Cromatografia em Placa Preparativa
Os extratos brutos e frações que apresentaram boa separação dos componentes, ou seja,
Fatores de Retenção (Rf) relativamente distantes foram submetidos à Cromatografia Preparativa,
com eluente determinado pelos testes em Cromatografia em Camada Delgada.
As amostras submetidas à cromatografia preparativa foram: Fr. Hex, Fr. DCM 1 e 2 do
EBB, Fr. Hidroálcoolica de EBB com AcOEt, e as Fr. Hex, AcOEt e Fr. But do EBE.
As placas foram preparadas com aplicação da suspensão de sílica para placas preparativas
MACHEREY- NAGEL e água destilada em placas de vidro de dimensões 20 cm x 20 cm. Após
aplicação, as placas foram ativadas em estufa a 100°C por 1 hora.
Pesaram-se 2 mg de cada amostra, que, em seguida, foram aplicadas nas Placas
Preparativas com ajuda de capilar e eluídas em cuba contida do eluente já definido por CCD.
Após eluição, as placas foram reveladas em Câmara UV com comprimento de onda igual
a 254 nm, raspadas conforme revelação e lavadas com o respectivo eluente. As frações obtidas,
com Rfs calculados, foram pesadas, submetidas à Cromatografia em Camada Delgada e reunidas
conforme a proximidade do fator de retenção.
3. Resultados e discussões
3.1 Massa Obtida do Extrato Bruto Hexânico, do Extrato Bruto Etanólico e do Extrato
Bruto Butanólico
No presente trabalho optou-se por empregar a técnica de extração por maceração,
utilizando como solvente o etanol. A escolha desta técnica foi baseada na pureza do solvente em
questão. Devido ao fato do mesmo não ter sido submetido a técnicas de purificação, para evitar
a formação de artefatos que podem ser formados a partir da combinação impureza mais
aquecimento.
Foram utilizados 100 g da casca da planta e as massas dos extratos brutos secos totais,
foram obtidas após a evaporação do solvente: EBH
(0,71 g), EBE (12,56 g) e no EBB não
obteve-se massa significativa.
3.1 Classe de metabólitos secundários identificados
Após realizado os testes descritos acima, os seguintes metabólitos foram identificados:
saponina espumídica, ácidos orgânicos, açúcares redutores, taninos catéquicos, flavonóides,
alcalóides, catequinas, esteróides e triterpenóides. Em todos os extratos brutos e frações
estudadas foi verificada a presença de pelo menos um metabólito secundário, exceto a fr. Dcm
amarela, obtida da partição do EBB, na qual, todos os testes fitoquímicos realizados
demonstraram-se negativos.
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3.2 Cromatografia em Camada Delgada das Frações Obtidas da Cromatografia em Placas
Preparativas
Através da realização da CCD foi possível observar as frações com eluição semelhante
para que fossem reunidas.
Logo, todos os produtos obtidos das frações em que se realizou a cromatografia em placas
preparativas foram reunidos, pois apresentaram eluição semelhante, exceto os da fr. DCM 2 do
EBB, de onde foram obtidas duas outras frações, com eluição diferente.
Todas as frações foram pesadas para que fosse analisado com quais frações seria feito o
bioensaio com Artemia salina e seus Rf’s foram calculados: Fr. Hex do EBB: Rf 0,947 (0,07 g);
Fr. Dcm 1 do EBB: Rf 0,916 (0,06 g); Fr. Dcm 2 do EBB: Rf 0,948 (0,02 g); Fr. De AcOEt do
EBE: Rf 1(0,1 g) e Fr. But do EBE: Rf 0,921 (0.02g).
Os Rf’s da fração DCM 2 do EBB cuja massa foi 0,003 g, da Fr. Hidroalcoólica de EBB
com AcOEt e da fr. Hex do EBE não foram calculados devido às pequenas massas obtida dos
mesmos, as quais não foram suficientes para a realização do teste de toxicidade frente à Artemia
salina.
3.3 Avaliação citotóxica
A análise de toxicidade dos extratos frente à Artemia salina demonstrou, após o tempo de
24 horas de incubação, a sobrevivência de todos os microcrustáceos no branco, e a mortalidade
da A. salina em alguns extratos, confirmando o potencial biológico dos mesmos. Os dados de
DL50 foram obtidos a partir do cálculo estatístico PROBITO.
Os dados de DL50 evidenciaram que os extratos obtidos das frações com diclorometano
(do EBB) e as frações hexânicas (do EBH) apresentaram atividade frente à Artemia salina. São
necessários estudos de maior precisão para que seja possível elucidar qual o tipo de atividade
biológica, ou as possíveis estruturas químicas dos agentes responsáveis por tais atividades.
Empregando outro critério de classificação dos extratos com base nos níveis de CL 50, a
saber: CL50 < 80 μg/ mL, altamente tóxicos; entre 80 μg/ mL e 250 μg/ mL, moderadamente
tóxico; e CL50 > 250 μg/ mL, com baixa toxicidade ou não tóxico (Pereira, 2006)
Como resultado de toxicidade, foram encontrados os seguintes valores: Fr. Dcm 1 do
EBB (156, 0633 ppm), Fr. Dcm 2 do EBB (106,4569 ppm); Fr. 14 do EBH (50,80392
ppm); Fr. 15 – 23 do EBH (209,0629 ppm), Fr. 25 – 28 do EBH (417,0057 ppm), Fr. 29 – 33 do
EBH (86,41001 ppm).
4. Conclusões
Na prospecção fitoquímica, a casca do fruto da P. crucigerum evidenciou a presença dos
seguintes metabólitos secundários: saponina espumídica, ácidos orgânicos, açúcares redutores,
taninos catéquicos, flavonoides, alcaloides, catequinas, esteroides e triterpenoides. Em todos os
extratos brutos e frações estudadas foi verificada a presença de pelo menos um metabólito
secundário, exceto a fr. Dcm amarela, obtida da partição do EBB, na qual, todos os testes
fitoquímicos realizados demonstraram-se negativos.
Para a avaliação de toxicidade frente à Artemia salina, as frações Dcm verde 1 do EBB,
Dcm amarela do EBB, 14 do EBH e 29 – 33 do EBH apresentaram um valor de DL50 inferior a
1000 ppm, caracterizando assim a toxicidade destas amostras frente a Artemia salina.
Diante desses resultados, observa-se a importância e a necessidade de ser realizado um
estudo aprofundado da espécie P. crucigerum, visando avaliar outras atividades, isolar e
elucidar os possíveis compostos presentes na planta.
5. Referências
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larvas de Artemia salina Leach. de extrato obtido de frutos de Solanum lycocarpum A. St.-Hill
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