ENGINEERING ARTICULAR CARTILAGE USING NEWLY DEVELOPED CARRAGEENAN BASED HYDROGELS
ABSTRACT
Articular cartilage holds specific functionality in the human body creating smooth gliding areas and
allowing the joints to move easily without pain. However, due to its avascular nature and to the low
metabolic activity of the constituent cells-the chondrocytes, cartilage has a low regenerative potential.
The current surgical options to treat damaged cartilage are not long lasting and involve frequent
revisions. Tissue engineering may provide an alternative approach for cartilage repair, involving the use
of hydrogels which can act as a temporary artificial matrix for encapsulated cells, supporting their
growth and inducing the extracellular matrix (ECM) production. The use of hydrogels is regarded as
advantageous for cartilage tissue engineering because they provide similar environment to the native
ECM where cells reside. Up to date, many different hydrogel systems based on natural polymers have
been developed for cartilage regeneration. Among these systems, marine polysaccharides origin
hydrogels have received increasing attention since they are seen as an inexpensive potential source of
material with owing to their specific characteristics and composition.
In the present PhD thesis it was investigated the potential of carrageenan, a sulphated polysaccharide
that can be extracted from red algae, as an alternative hydrogel for cartilage regeneration.
Carrageenans offer appealing assets for cell encapsulation/delivery, derived from their chemical
composition and gelation process.
Therefore, the main aims of this thesis were:
- develop and characterize different blends of carrageenan with alginate, processed into different
formats;
- study the chondrogenic differentiation of stem cells loaded in κ-carrageenan hydrogels;
- asses the viability, proliferation and chondrogenic potential of different cell types, laden in κcarrageenan hydrogels;
- evaluate the effect of cryopreservation methods on the viability and chondrogenic differentiation of
stem cells encapsulated in κ-carrageenan hydrogels;
- study the in vitro and in vivo biocompatibility of κ-carrageenan hydrogels.
In the first part of this thesis, different formulations of alginate and carrageenan hydrogels and different
processing parameters were considered in order to determine the best conditions required to achieve
the most adequate response in terms of the mechanical stability, cell viability and functionality of the
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developed systems. The morphology, size and structure of the hydrogels and their degradation
behavior and mechanical properties were evaluated as well as their cytotoxicity and ability to
encapsulate chondrocytes. The results obtained indicated that the different formulations, both in the
form of beads and fibers have considerable potential as cell-carrier materials for cell delivery in tissue
engineering/regenerative medicine applications. The results obtained in this study also showed that
κappa carrageenan is more suitable for the proposed application than ιota carrageenan.
Subsequently, further studies were designed to assess the ability of κappa-carrageenan hydrogels to
support the chondrogenic differentiation of human adipose derived stem cells (hASCs). Moreover, the
chondrogenic potential of hASCs encapsulated in κ-carrageenan hydrogels was compared to hydrogels
laden with other cell types, namely human primary (nasal) chondrocytes (hNCs) and a chondrocytic cell
line (ATDC5). The in vitro cellular behavior of the encapsulated cells within κ-carrageenan hydrogel was
analyzed after different culturing periods by mechanical tests and using biochemical assays as well as
cytohistological and real time RT-PCR analysis.
The results from the analysis of the cells encapsulated in the developed systems indicated that κcarrageenan hydrogels support the viability, proliferation and chondrogenic differentiation of hASCs.
Interestingly, the mechanical analysis demonstrated an increase in stiffness and in the viscoelastic
properties of κ-carrageenan gels with encapsulated hASCs along the time in culture with chondrogenic
media, as compared to hydrogels without cells or cell laden hydrogels cultured in basal media.
Furthermore, these studies have also demonstrated that the 3 types of cells encapsulated in κcarrageenan hydrogels showed good cellular viability and proliferation up to 21 days of culture and the
cell laden hydrogels showed to be positive for specific cartilage markers. Nevertheless, the results also
showed that hASCs embedded in κ-carrageenan hydrogels proliferate faster and exhibit higher
expression levels of the typical cartilage markers analysed as compared to hNCs or ATDC5 cells. Based
on this data, it was possible to conclude that κ-carrageenan hydrogel provides a good support for
culture and differentiation of encapsulated cells and that hASCs may provide an advantageous
alternative to primary chondrocytes, currently used in clinical treatments of cartilage defects/diseases.
These bioengineered constructs are anticipated to participate in a cartilage regeneration strategy
providing temporary habitation for cell survival, proliferation and production of extracellular matrix
which is expected to replace the hydrogel, enhancing the regeneration of native tissues in clinical
settings. Nevertheless, the time span needed for obtaining a functional cartilage substitute using tissue
engineering strategies, together with the need for specific patient oriented constructs stimulated our
interest for assessing the possibility of developing of ―off-the shelf‖ products, based on
cryopreservation, that would provide clinical substitute available as needed and could be adapted to an
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autologous immediate solution for the patient. Therefore, the following experiments were planned to
examine the effects of cryopreservation on the chondrogenic differentiation characteristics of hASCs
encapsulated in κ-carrageenan hydrogels. The results obtained show that the hydrogels withstand the
cryopreservation with dimethyl sulfoxide, maintaining their structural integrity, while assisting cells
proliferation and chondrogenic potential after cryopreservation. Thus, cell encapsulation systems of
natural based hydrogels seem to be an interesting approach for the preservation of cartilage tissue
engineered products.
The final stage of the work developed involved studies on the in vitro and in vivo biocompatibility of κcarrageenan hydrogels. The in vitro cytotoxicity of the hydrogels was evaluated under standard tests
using the L929 cell line, and chemiluminescence assays were performed using human
polymorphonuclear cells. The in vivo study was accomplished by the subcutaneously implantation of
carrageenan hydrogels discs in Wistar rats for up to 15 days. The obtained findings indicated that κcarrageenan hydrogels induced a reduced and insignificant signal concerning the detection of
superoxide and hydroxyl anions and seems to induce a low inflammatory response and thus, can be
further studied to be used in target biomedical applications.
Moreover, a recent preliminary in vivo study showed that loading κ-carrageenan with cells previously
exposed to chondrogenic medium led to higher stability of the construct in vivo (rat subcutaneous
model) as compared
to hydrogels cultured in basal media or hydrogels without cells. Such
accomplishment is probably related to an increase in the extracellular matrix deposition which may
result in progressive increase of the mechanical properties, in agreement with the results obtained in
the in vitro studies performed with κ-carrageenan.
Overall, the work developed under this thesis allowed to conclude that κ-carrageenan hydrogels laden
with human adipose derived stem cells show a great potential to be tailored to specific applications in
cartilage tissue regeneration approaches.
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Desenvolvimento de novos hidrogéis baseados em carragenina para aplicação em engenharia de
cartilagem articular
RESUMO
A cartilagem articular desempenha funções específicas no corpo humano criando áreas de
deslizamento lisas e quase sem atrito que permitem a movimentação das articulações sem causar dor.
No entanto, devido à sua natureza avascular e a reduzida atividade metabólica das células que a
constituem condrócitos, possui um potencial de regeneração baixo. As atuais opções cirúrgicas para o
tratamento da cartilagem danificada não são duradouras e geralmente obrigam a repetição de
procedimentos e/ou recorrência dos sintomas. A engenharia de tecidos proporciona uma abordagem
alternativa na regeneração da cartilagem, envolvendo o uso de hidrogéis que atuam como uma matriz
artificial temporária para encapsular células, suportar a sua proliferação e produção de matriz
extracelular. O uso de hidrogéis é considerado vantajoso na engenharia de tecido cartilagíneo, uma vez
que estes proporcionam um ambiente similar ao da matriz extracelular onde as células nativas
residem. Até à data, foram desenvolvidos vários hidrogéis com base em polímeros naturais para
regenerar cartilagem. Entre estes, os polissacáridos de origem marinha têm recebido atenção
crescente já que são considerados uma fonte barata e praticamente inesgotável de material, e também
pelas suas características e composição.
Nesta tese de doutoramento foi investigado o potencial da carragenina, um polissacárido sulfatado
extraído das algas vermelhas, como hidrogel alternativo para regeneração de cartilagem. As
carrageninas possuem aributos apelativos para o encapsulamento/libertação de células, dada a sua
composição química e processo de gelificação.
Assim, os principais objetivos desta tese foram:
- desenvolver e caracterizar diferentes misturas de carragenina com alginato, processadas de
diferentes formas;
- estudar a diferenciação condrogénica de células estaminais encapsuladas/cultivadas em hidrogéis de
κ-carragenina;
- avaliar a viabilidade, proliferação e potencial condrogénico de diferentes tipos celulares encpasuladas
em hidrogéis de κ-carragenina;
- analisar o efeito de métodos de criopreservação na viabilidade e capacidade de diferenciação
condrogénica de células estaminais encapsuladas em hidrogéis de κ-carragenina;
- investigar a biocompatibilidade in vitro e in vivo de hidrogéis de κ-carragenina.
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Na primeira parte desta tese, foram consideradas diferentes formulações de hidrogéis de alginato e
carragenina, bem como diferentes parâmetros de processamento de forma a determinar as condições
ótimas para obter a resposta mais adequada em termos de estabilidade mecânica, viabilidade celular
e funcionalidade dos sistemas desenvolvidos.
A morfologia, tamanho e estrutura dos hidrogéis, a sua degradação e propriedades mecânicas foram
avaliadas, bem como a sua citotoxicidade e capacidade de mantera viabilidade de durante o
encapsulamento de condrócitos. Os resultados obtidos indicaram que diferentes formulações, quer sob
a forma de esferas quer sob a forma de fibras, possuem um potencial considerável como sistemas de
encapsulamento/libertação de células em aplicações de engenharia de tecidos/medicina regenerativa.
Os resultados obtidos revelaram que a κapa-carragenina é mais adequada para a aplicação proposta
do que a ιota-carragenina.
Consequentemente, os estudos posteriores foram planeados para avaliar a capacidade dos hidrogéis
de κ-carragenina de suportar a diferenciação condrogénica de células estaminais humanas derivadas
de tecido adiposo (hASCs). Para além disso, o potencial condrogénico de hASCs encapsuladas em κcarragenina foi comparado com o de hidrogéis semeados com outros tipos celulares, nomeadamente
condrócitos (nasais) primários humanos (hNCs) e uma linha celular condrocítica (ATDC5). O
comportamento celular in vitro das células encapsuladas foi investigado após diferentes períodos de
cultura, através de testes mecânicos, ensaios bioquímicos, citohistologia e RT-PCR.
Os resultados destes ensaios indicaram que os hidrogéis de κ-carragenina mantêm a viabilidade,
proliferação e diferenciação condrogénica das hASCs. Interessantemente, a análise mecânica mostrou
um aumento das propriedades mecânicas dos géis de κ-carragenina contendo hASCs encapsuladas,
ao longo do tempo de cultura com meio condrogénico, quando comparados com os géis sem células
ou géis com células mas em meio basal.
Os resultados demonstraram igualmente que os três tipos celulares encapsulados em hidrogéis de κcarragenina mantiveram boa viabilidade celular e proliferação até aos 21 dias de cultura, e os géis
semeados com as células expressaram positivamente marcadores específicos de cartilagem.
No entanto, os resultados mostraram que as hASCs encapsuladas na κ-carragenina proliferaram mais
rapidamente e exibiram níveis de expressão de marcadores típicos de cartilagem mais elevadoss do
que os observados em hNCs e ATDC5. Com base nestes dados foi possível concluir que o hidrogel de
κ-carragenina providencia um bom suporte para a cultura e diferenciação de células nele
encapsuladas, e que as hASCs podem ser uma alternativa vantajosa aos condrócitos primários usados
atualmente em tratamentos clínicos de defeitos/patologias da cartilagem.
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Antecipa-se que estes hidrogéis possam ser utilizados em estratégias de regeneração de cartilagem,
providenciando habitat temporário para as células encapsuladas, aseegurando a sua viabilidade,
proliferação e produção de matriz extracelular, que deverá substituir o hidrogel, intensificando a
regeneração do tecido nativo em situações clínicas. Apesar das vantagens, é necessario um certo
tempo para obter um substituto funcional da cartilagem com este tipo de abordagens de engenharia
de tecidos, há uma clara necessidadede produtos "off-the-shelf", que possam ser imediatamente
disponibilizados e adaptados a uma solução autóloga para o paciente. Isto pode ser evantualmente
conseguido recorrendo a métodos baseados na criopreservação. Por este motivo, as experiências
seguintes foram planeadas para examinar os efeitos da criopreservação na diferenciação condrogénica
característica das hASCs encapsuladas em κ-carragenina. Os resultados obtidos mostraram que o
hidrogel suporta a criopreservação com dimetilsulfóxido (DMSO) mantendo a sua integridade estrutural
e a capacidade de manter a proliferação e diferenciações celulares. O último estádio do trabalho
desenvolvido envolveu estudos in vitro e in vivo de biocompatibilidade dos hidrogéis de κ-carragenina.
A citotoxicidade dos hidrogéis foi avaliada por ensaios standards utilizando uma linha celular (L929) e
por ensaios de quimoluminescência com células polimorfonucleadas humanas. O estudo in vivo
envolveu a implantação subcutânea de discos de κ-carragenina em ratos Wistar durante 15 dias. Os
resultados obtidos demosntraram que os hidrogéis de κ-carragenina induziram uma resposta
insignificante na detecção de aniões superóxido e hidroxil, bem como resposta inflamatória mínima
podendo ser estudados para aplicações biomédicas.
Um estudo preliminar recente, in vivo revelou que a κ-carragenina semeada com células prédiferenciadas em meio condrogénico apresenta maior estabilidade in vivo (modelo de implante
subcutâneo em rato), comparando com géis previamente cultivados com meio basal ou géis sem
células. Este facto deve-se muito provavelmente ao aumento de deposição de matriz extracelular que
pode resultar no aumento das propriedades mecânicas, em concordância com os resultados obtidos in
vitro.
Resumindo, o trabalho desenvolvido e apresentado nesta tese, permitiu concluir que os hidrogéis de κcarragenina encapsulados com células humanas derivadas do tecido adiposo, revelam grande
potencial para serem adaptados a aplicações específicas de terapias de regeneração de cartilagem.
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