OPINIÃO
USO DA CULTURA DE CÉLULAS EM TESTES DIAGNÓSTICOS LABORATORIAIS EM
MEDICINA E BIOLOGIA
The use of cell culture in laboratory diagnostic tests in medicine
and biology
Maria de Fátima Lima de Assis1, Elizabeth Conceição de Oliveira Santos 2,
Iracina Maura de Jesus 3, Maria Izabel de Jesus 3, Walber Victor de Moraes
Pinto4, Renato Lopes Fernandes Medeiros 4, Dorotéa de Fátima Lobato da Silva 5
RESUMO
A cultura de células, iniciada nos primórdios do século XIX, vem sendo cada vez
mais adaptada à manutenção do metabolismo fundamental celular in vitro,
permitindo o desenvolvimento da maioria das funções fisiológicas básicas inerentes
a uma célula e ao conjunto delas (tecido). A permanência da informação genética
trazida do organismo que lhe deu origem, faz com que as células em cultura
correspondam a um modelo biológico “vivo” para um número cada vez maior de
testes laboratoriais aplicados aos campos da Medicina e da Biologia. O advento
da Biologia Molecular e o esclarecimento do papel das células-tronco no
desenvolvimento do organismo tornaram a cultura de células uma ferramenta
fundamental na elucidação e solução de problemas, visando a melhoria da qualidade
de vida dos indivíduos, como, também, o aprimoramento da manutenção de
espécies animais e vegetais. Este trabalho tem o objetivo de mostrar a importância
do uso das culturas de células, chamando a atenção para a biodiversidade intra e
inter-específica, observada principalmente na região Amazônica, como também
para a adaptabilidade das células in vitro.
PALAVRAS-CHAVE
Técnicas de cultura celular, técnicas de cultura de tecidos, bancos de tecidos
ABSTRACT
Cell culture techniques, initiated in the early XIX century, evolved to increasingly
being able to maintain the basic cell metabolism in vitro, allowing the development of
most inherent basic cell and tissue physiological functions. The maintenance of the
organism genetic information, makes cells culture to correspond to an “alive” biological
1
Citogeneticista. Consultora da UNESCO/IEC/SVS/MS. End. Rua Veiga Cabral nº 618, Cidade Velha,
Belém - PA - CEP: 66023-630. E-mail: [email protected]
2
Virologista. Diretora do Instituto Evandro Chagas/SVS/MS.
3
Especialista em Vigilância e Saúde Ambiental. Instituto Evandro Chagas/SVS/MS.
4
Mestre em Biologia de Agentes Infecciosos e Parasitários. Consultor da UNESCO/IEC/SVS/MS.
5
Mestre em Genética Molecular. Consultora da UNESCO/IEC/SVS/MS.
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MARIA DE FÁTIMA LIMA DE ASSIS, ELIZABETH CONCEIÇÃO DE OLIVEIRA SANTOS, IRACINA MAURA
JESUS, MARIA IZABEL DE JESUS, WALBER VICTOR DE MORAES PINTO, RENATO LOPES FERNANDES
MEDEIROS, DOROTÉA DE FÁTIMA LOBATO DA SILVA
DE
model for a increasingly number of laboratorial tests, applied to the fields of Medicine
and Biology. The advent of Molecular Biology and the clarification of the role of stem
cells in the development of the organism, had promoted the use of cell culture as a
basic tool for the elucidation solution of problems aiming at improving the quality of
life of the individuals as well as, the maintenance of vegetables and animal species.
The objective of this work is to show the importance of the use of cell cultures, calling
attention to the biodiversity intra and inter-species observed in the Amazon region, as
well as for the adaptability of the cells in vitro.
KEY WORDS
Cell culture techniques; tissue culture techniques; tissue banks
1. UM POUCO DE HISTÓRIA
O desenvolvimento de monocamadas celulares a partir de pequenas amostras
de tecidos humanos, de animais e de plantas teve início no século XIX, com
aplicação nos campos experimentais da Bioquímica e da Microbiologia. Os
primeiros estudos, no início de 1800, foram voltados para definições e hipóteses
sobre a origem e a forma da célula. Em 1878, Claude Bernard destacou a
importância do meio ambiente interno na regulação das atividades dos tecidos
vivos. Em sua concepção, o ambiente não é somente o produto do metabolismo
do tecido, mas a atuação deste produto no próprio tecido, regulando suas atividades.
Nesta linha, Friedrich Daniel Von Recklinghausen, em 1866, manteve células
sangüíneas de anfíbio em recipientes estéreis, sob uma variedade de condições,
por volta de 35 dias, na tentativa de esclarecer o quanto o meio ambiente é
afetado pela célula ou a célula é afetada pelo meio ambiente. O primeiro
experimento com cultura de tecido organizado foi feito por Wilhelm Roux, em
1885, quando transferiu a placa neural de um embrião de galinha para uma
solução salina aquecida, provando que o fechamento do tubo neural é uma
função primária de seu constituinte celular e não um efeito mecânico direto por
pressão exercida pelas estruturas adjacentes, como se supunha anteriormente.
Dois anos depois, em 1887, J. Arnold cultivou leucócitos, implantando sob a pele
e na cavidade abdominal de um sapo fragmentos da parte central de uma planta
umedecidos com humor aquoso do mesmo tipo de animal, os quais foram invadidos
por leucócitos. Em seguida, os fragmentos foram transferidos para discos contendo
humor aquoso ou solução salina, tendo sido possível a observação dos leucócitos
durante alguns dias. Esse experimento foi o início dos estudos de mitose e a prova
de que as células podiam sobreviver fora de um corpo animal.
Em 1898, C. A. Ljunggren manteve, durante algumas semanas, fragmentos de
pele humana em líquido ascítico. Em 1903, J. Jolly completou estudos mais detalhados
sobre sobrevivência celular e divisão de leucócitos fora do organismo original.
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Ross G. Harrison, em 1907, cultivando em linfa de anfíbio adulto fragmentos
de medula espinhal de girino, demonstrou visualmente a origem da fibra de tecido
nervoso, ao transplantar os fragmentos para outros locais do corpo do embrião,
mostrando que na parede da fibra sempre se desenvolvia tecido vivo e organizado,
e que essas células estavam relacionadas à formação do axon. Sua técnica de
observação foi com a gota do material em lamínula, recobrindo uma lâmina
escavada. Com este trabalho, Harrison foi reconhecido como o inventor da cultura
de tecidos, evidenciando a grande utilidade da cultura para o estudo de elementos
estruturais de organismos superiores, ao mesmo tempo que instituiu o método de
gota pendente, para análise.
Em 1910, M. T. Burrows introduziu o uso da técnica de plasma clot. Nesta
época, com o prosseguimento das técnicas modernas de cultivo iniciadas por
Harrison, em 1907, a cultura de tecidos enfrentou o problema da contaminação
bacteriana. Alexis Carrel, em 1912, levou para o laboratório de cultura as técnicas
de assepsia utilizadas em salas de cirurgia. Carrel trabalhou durante 30 anos com
subcultura de fibroblastos de pinto sem nenhum incidente de contaminação,
postulando que células animais podem ser cultivadas in vitro com sucesso. Em
1928, H. B. Maitland desenvolveu pela primeira vez um método de tecido em
cultura voltado principalmente para cultura de vírus. Por volta de 1934, A. Carrel
e G. O. Gey cultivaram fragmentos de tecidos em garrafas e tubos. O advento
dos antibióticos em 1940 ajudou consideravelmente na simplificação de várias
técnicas de cultura de células, em decorrência do controle da contaminação
microbiológica, sendo de grande valia em técnicas com utilização de vírus. Com
P. R. White em 1946, teve início o crescimento de tecido animal em meio sintético,
com composição conhecida (revisão em Parker, 1961; Wasley & May, 1970).
Esse novo avanço no cultivo de células permitiu a formulação de uma
variedade de meios de cultura, acrescidos de substâncias responsáveis pelo
melhor desenvolvimento celular in vitro, possibilitando, deste modo, o cultivo de
células da maioria dos tecidos e órgãos, tanto de animal quanto de vegetal, que
atualmente são mantidas vivas em condição permanente, à temperatura baixíssima
de -170 ºC, em nitrogênio líquido
2. A CULTURA DE TECIDOS COMO MODELO EXPERIMENTAL BIOLÓGICO (IN VITRO) EM
TESTES E DIAGNÓSTICOS LABORATORIAIS
A descoberta da estrutura do DNA por Watson e Crick, em 1953, como
um polímero “gigante” que contém as instruções – o código genético –
responsáveis pela formação de um organismo, revolucionou o estudo da
Biologia, definindo a célula como uma unidade complexa, capaz de armazenar
toda a informação necessária para o desenvolvimento biológico de um ser vivo,
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tanto animal quanto vegetal. O fato de termos exemplares de células isoladas ou
organizadas em mono ou múltiplas camadas, desenvolvendo-se fora de seu
habitat natural (in vitro), ampliou sobremaneira a área técnica em relação a
estudos experimentais, antes restritos apenas a modelos vivos. Porém, como
todo suporte técnico, é possível estabelecermos algumas vantagens (Tabela 1)
e desvantagens (Tabela 2) acerca do uso da cultura de tecidos em testes biológicos,
bioquímicos e fisiológicos.
Apesar das críticas sobre a validade das células em cultura como modelo
biológico “vivo” com função fisiológica, por freqüentemente não expressarem as
propriedades características das células que lhe deram origem, devido a trocas no
ambiente celular quando in vitro (Freshney, 2000), as células em cultura, pelo fato
de manterem o genoma e os mecanismos fundamentais de proliferação (mitoses),
representam, sim, um modelo experimental vivo considerado, em muitos testes,
substituto do modelo animal, preservando primordialmente a vida e as espécies,
em diversas situações experimentais.
Tabela 1
Vantagens da cultura de tecidos.
Fonte: Freshney (2000).
Atualmente, células em cultura são requisitadas para estudos em todos os
ramos da Biologia, principalmente devido à diversidade de suas origens, representada
pela variedade de tecidos em cultura de animais e plantas que se encontram
criopreservados, assim como pela variação de órgãos cujas células podem ser
cultivadas, abrindo um universo de estudos no campo da Biomedicina. Neste
contexto, podemos referir alguns trabalhos que seguem a linha experimental
avançando cada vez mais para a elucidação de questionamentos impossíveis de
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serem testados em organismos vivos: Estudos sobre citotoxidade de enterotoxinas
bacterianas em linhagem CHO – fibroblasto de ovário de hamster (Begum et al.,
2006); em linhagem VERO – rim do macaco verde africano Cercopitheccus
aethiops (Coelho et al., 2000); em linhagem HT-29 – células de cólon humano e
em cultura primária de cartilagem da orelha de morcego (Souza et al., 1999).
Tabela 2
Limitações da cultura de tecidos.
Fonte: Freshney (2000).
A ação da toxina bacteriana é de extrema gravidade às populações humanas,
tornando-se mais preocupante quando essas populações estão expostas a um
ambiente com suspeita de contaminação biológica. Em áreas vulneráveis à
contaminação química, a resposta celular mostra os efeitos citológicos e fisiológicos
que ocorrem no indivíduo exposto à contaminação, podendo chegar inclusive a
apoptose da célula, dependendo da dose do agente contaminante e do tempo de
exposição (Herculano et al., 2003).
Em estudos de câncer, as culturas de tecidos têm tido um papel fundamental
no esclarecimento de diagnósticos e auxílio no tratamento de vários tipos de
neoplasias, tanto nos casos comprovadamente hereditários, como na síndrome
Li-Fraumeni (Shay et al., 1995), quanto em casos isolados (Hara et al., 1996;
Arsura et al., 2000).
No campo da Virologia, o uso da cultura de células teve início em 1913,
quando Steinhard, Israeli e Lambert demonstraram que o vírus da vaccinia (varíola)
permanecia ativo durante mais de um mês, quando inoculado em células de
córnea de coelho ou de preá (Cavea), em cultura (Parker, 1961). Desde essa época,
a cultura de tecidos continua como importante suporte laboratorial para a
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identificação de uma grande variedade de vírus, tanto da família viral quanto do
tipo específico, através da resposta citológica, característica de cada grupo
(Kobune et al., 1990; Bitko et al., 2004; Rajala et al., 2005).
3. TERAPIA CELULAR COM CÉLULAS-TRONCO EMBRIONÁRIAS E ADULTAS
A potencialidade celular, ou seja, a capacidade e possibilidade de diferenciação
das células se manifesta em âmbito natural de acordo com a ordem hierárquica
de seu desenvolvimento, podendo ser classificada em: totipotentes, pluripotentes
e multipotentes. As totipotentes são células capazes de formar um indivíduo
completo, visto que têm a capacidade de produzir tecido embrionário e extraembrionário. O zigoto é uma célula que faz parte deste grupo por ser capaz de
originar um organismo completo. Em rato, a mórula também é totipotente até
o estágio de oito células. As células pluripotentes podem diferenciar-se em
tecidos procedentes de qualquer das três capas embrionárias. Nesta categoria,
estariam as células provenientes da massa celular interna do blastocisto; não
são capazes de formar um indivíduo total por ausência do trofoblasto, podendo
originar todos os tipos de células e tecidos do organismo. As células
multipotentes são as que têm a capacidade de diferenciar-se em vários
tipos celulares procedentes da mesma capa embrionária, podendo formar
diferentes tipos celulares, mas não todos.
Nos últimos anos, a Medicina tem-se voltado para esse tipo especial de célula,
cujo conhecimento, há algum tempo, vem sendo cada vez mais ampliado, e seu
significado traduz-se em um grande avanço em terapias de casos com necessidade
extrema de resolução. Essas células, mantidas em cultura, são conhecidas como
células-mãe, células-precursoras, células-progenitoras, células-estaminais ou célulastronco (Ramírez & Balea, 2004).
A célula-tronco embrionária deriva do embrião de mamífero em fase de
blastocisto e possui a capacidade de gerar qualquer célula diferenciada, quando
em um organismo hospedeiro ou meio de cultura adequado. Já a célula-tronco
adulta ou célula-tronco somática, com capacidade de diferenciar-se unicamente
em células do tecido de origem, atualmente tem mostrado que, em determinadas
condições, são capazes de diferenciar-se em células de diversos tecidos, como
podemos destacar as células-tronco adultas hematopoiéticas, capazes de diferenciarse em diversos tecidos como: endotélio, músculo cardíaco, músculo estriado,
hepatócitos, neurônios, pele e intestino (Ramírez & Balea, 2004).
Essa potencialidade de diferenciação com atividade fisiológica correspondente
ao tecido diferenciado, aliada à grande capacidade de multiplicação in vitro das
células-tronco, sejam embrionárias ou adultas, levou a consideráveis perspectivas
em todos os campos da Medicina e da Biologia, principalmente na Medicina
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Regenerativa em qualquer nível, desde a regeneração tecidual e de órgãos, até a
regeneração em nível sistêmico.
4. PERSPECTIVAS DO USO DE CULTURA DE TECIDO NA ELUCIDAÇÃO DE PROBLEMAS
RELACIONADOS À SAÚDE PÚBLICA NA REGIÃO AMAZÔNICA BRASILEIRA
O Instituto Evandro Chagas, órgão da Secretaria de Vigilância em Saúde/
Ministério da Saúde, localizado na área metropolitana de Belém – PA, região
Amazônica, em 70 anos de atividade tornou-se uma instituição de referência
nacional e internacional em saúde pública. Há 10 anos, mantém na seção de
Meio Ambiente (SAMAM) um acervo de células cultivadas e preservadas a -170 ºC
em nitrogênio líquido, disponíveis para uso em testes e diagnósticos laboratoriais
nas áreas de Medicina e Biologia.
A maior importância desse banco de células é ser composto, principalmente,
por culturas primárias ou subculturas primárias oriundas de biópsias de diversos
tecidos e órgãos de animais da Amazônia, e também de tecidos humanos como
prepúcio, córnea, esclera, cordão umbilical, placenta e células do canal de
pré-molar decíduo.
No banco de células da SAMAM, apesar da diversidade de espécies e de
órgãos em culturas primárias criopreservadas, o estoque genético de cada espécie
é mantido, uma vez que cada cultura é oriunda de apenas uma biopsia. O método
empregado é o de dissecção do explante primário (op. cit. Freshney, 2000), sem
interferência de enzimas. Portanto, cada informação genética preservada é
inerente a um único genoma. Esta particularidade garante estudos que necessitem
da expressão gênica, função que tem uma variação em nível interindividual.
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