Universidade do Vale do Paraíba
Instituto de Pesquisa e Desenvolvimento
PATRÍCIA KAREN DE OLIVEIRA
“ANÁLISE DA COMPOSIÇÃO BIOQUÍMICA DA PELE POR ESPECTROSCOPIA
RAMAN”
São José dos Campos, SP
2011
Patrícia Karen de Oliveira
“ANÁLISE DA COMPOSIÇÃO BIOQUÍMICA DA PELE POR ESPECTROSCOPIA
RAMAN”
Dissertação apresentada ao Programa de PósGraduação em Engenharia Biomédica da Universidade
do Vale do Paraíba, como complementação dos créditos
necessários para obtenção do título de Mestre em
Engenharia Biomédica.
Orientador: Prof. Dr. Leandro José Raniero
Co- Orientador: Prof. Dr. Airton A. Martin
São José dos Campos, SP
2011
PATRICIA KAREN DE OLIVEIRA
"ANÁLrsE DA coMposrÇÃo BIoeuÍMIc DÀ PELEPoR EsPEcrRoscoPrA RAMAN"
Dissertaçãoaprovada como requisito paÌcial à obtençãodo grau de Mestre cÍn Engeúaria
ern Engeúaria Biomédica,do Instituto de Pesquisa
Biomédica,do Progama de Pós-Graduação
e Desenvolvimentoda Universidad€do Vale do Paraíba,SãoJosédos Campos,SP,pela seguinte
bancaexaminadora:
Prof.Dr. AIRTON A. MARTIN (UNIVAP)
Prof. Dr. LEANDRO JOSE RANIf,RO íUNIVAP)
PTOf.DÌA. EDILÉIA BAGATIN (I.JNIFESP)
Prcf. Dra. SandmMaria Fonsecada Costa
DiretoÌ do IP&D
Univap
SãoJosédosCampos, 21 de janeio de 2ol1'.
Dedico
primeiramente, não só o meu trabalho mas também
toda minha vida a Deus, presente em todos os momentos me
dando forças e sabedoria para a realização deste trabalho.
Aos meus pais: Helena e João Roberto que são “gigantes”, que
me colocaram nos ombros para que eu pudesse crescer e ver
novos horizontes, com muito amor e apoio nos momentos
difíceis desta caminhada. Abriram as portas do meu futuro,
sacrificaram seus sonhos em favor dos meus, sem nada pedir,
nem reclamar. Sempre do meu lado me ensinaram a viver com
dignidade e fizeram com que me tornasse um ser humano cheio
de virtudes.
Vocês presenciaram todos os meus esforços nessa conquista,
apoiaram minhas decisões e testemunharam minha dedicação.
Ás vezes esqueci-me de agradecer a vocês, que são meus pais
maravilhosos, o meu reconhecimento e agradecimento.
Ao meu amado noivo Leonardo, que sempre esteve presente ao
longo desta jornada, sempre me apoiando, incentivando e
compreendendo toda renúncia necessária.
A Paula minha querida irmã, pelas orações, incentivo,
companheirismo e carinho em busca sempre do melhor para
mim.
AGRADECIMENTOS
A Deus, pelo dom inexplicável da vida, por iluminar e encaminhar todos os meus
passos e permitir um relacionamento harmonioso com as pessoas que devo toda minha
gratidão pela realização deste trabalho.
Aos meus pais pela oportunidade e pela confiança que sempre depositaram em mim.
Ao Prof. Dr. Leandro José Raniero e Airton A. Martin pela orientação neste trabalho.
Agradeço pela confiança em mim depositada, paciência e total compreensão pelas minhas
limitações intelectuais e principalmente por permitir meu crescimento acadêmico.
A Profª Priscila Fávero por toda compreensão e disponibilidade em me orientar em
todos os momentos e me atender nos domingos de manhã.
A Doutoranda Maira Gaspar Tosato pela prontidão que sempre me atendia,
principalmente na medida dos aminoácidos, conversas e conselhos.
A querida Juliana Chaves Piva pelas conversas e desabafos que juntas tivemos.
Rani pela colaboração no processamento dos dados.
Ao Dr. Karl Jalkanen por todas as ajudas e sublimes informações prestadas me
auxiliando nos momentos mais difíceis da execução deste trabalho.
Prof. Nilton Syogo Arakawa pelos desenhos dos aminoácidos.
Profª. Maria Angélica por toda paciência para me ensinar como cultivar as células e
por disponibilizar seu laboratório.
Carol pela companhia e conselhos durante o ano em que moramos juntas e desculpome pelas vezes que deixei a desejar.
A todos do LEVB, Profª. Renata, Maiara, João Lucas, Magno, Rodrigo e Jéssica que
contribuíram de forma direta ou indireta para realização do meu trabalho.
Bibliotecária Rúbia pela paciência e compromisso com a formatação final deste
trabalho.
Secretárias do IP&D Ivone e Neuza por sempre me auxiliarem com muita disposição
sempre que solicitadas.
Enfim, agradeço a todos que de alguma maneira contribuíram para confecção deste
trabalho.
PEGADAS NA AREIA
Um dia eu tive um sonho...
Sonhei que estava andando na praia com o Senhor
e no céu passavam cenas da minha vida.
Para cada cena que passava, percebi que eram
deixados dois pares de pegadas na areia:
um era meu e o outro era do Senhor.
Quando a última cena da minha vida passou diante de nós,
Olhei para trás, para as pegadas na areia,
e notei que muitas vezes, no caminho da minha vida,
havia apenas um par de pegadas na areia.
Notei também que isso aconteceu nos momentos
mais difíceis e angustiantes da minha vida.
Isso aborreceu-me então perguntei ao Senhor:
- Senhor, tu me disseste que, tendo eu resolvido te seguir,
Tu andarias sempre comigo, em todo o caminho?
Contudo, notei que durante as maiores atribulações do meu viver,
havia apenas um par de pegadas na areia.
Não compreendo porque nas horas em que eu mais necessitava de ti,
Tu me deixaste sozinho.
O Senhor respondeu:
- Minha querida filha, jamais te deixaria
nas horas de provas e sofrimento.
Quando viste na areia apenas um par de pegadas, eram as minhas
Foi ai que eu te carreguei no colo.
“ANÁLISE DA COMPOSIÇÃO BIOQUÍMICA DA PELE POR ESPECTROSCOPIA
RAMAN”
RESUMO
O envelhecimento cutâneo é um processo biológico complexo, contínuo que se
caracteriza por alterações celulares e moleculares, com diminuição progressiva da capacidade
de homeostase do organismo. Ele pode ser dividido em: Extrínseco e Intrínseco. Com os
avanços tecnológicos, surgiram as metodologias não invasivas, cientificamente comprovadas
e não traumáticas aplicadas nos estudos destes dois processos de envelhecimento cutâneo,
impulsionando assim um interesse marcante por pesquisas nesta área. A aplicação dessas
metodologias tem revolucionado a área cosmética, pois os profissionais que nela atuam têm
conseguido avaliar de maneira quantitativa ou, melhor, comprovar cientificamente os efeitos
dos produtos cosmecêuticos. Recentemente a espectroscopia Raman Confocal tem sido
aplicada para a medição da profundidade na pele in vivo e vários trabalhos têm relatado
tentativas de aplicação desta técnica para obter informações sobre a pele. Neste contexto, o
objetivo deste estudo foi identificar por espectroscopia Raman alguns dos principais
constituintes do fator de hidratação natural da pele. Como objetivos secundários, buscamos:
identificar do estrato córneo alguns desses constituintes em espectros Raman de pele em
diferentes profundidades e correlacionar os picos existentes da pele com alguns dos
constituintes entre as diferentes faixas etárias e profundidade. O estudo foi realizado em 32
voluntárias, sendo 11 para o Grupo A, 11 para o grupo B e 10 para o Grupo C, composto com
as faixas etárias de 20 – 23 anos, 39 – 42 anos e 59 – 62 anos, respectivamente. De cada
grupo foi feita a média dos espectros de pele tirados em 3 profundidade diferentes 0 µm, 30
µm e 60 µm. Diante dos resultados obtidos pode-se concluir que a espectroscopia Raman foi
efetiva na caracterização dos compostos bioquímicos que compõe a pele e é uma técnica
completamente não invasiva excepcionalmente adequada para estudos de concentrações
moleculares. Houve correlação entre espectros coletados in vivo e alguns dos constituintes do
fator de hidratação natural da pele. E o Grupo C: apresentou maior área espectral: no pico
809 cm-1 atribuído à presença de tirosina; no pico 875 cm-1 atribuído à presença de ácido
pirrolidônico; no pico 930 cm-1 atribuído a presença de colesterol e carotenóides; no pico
1637 cm-1 atribuído à presença de amida I, o grupo C, apresentou uma menor área espectral.
Palavras – Chaves: Pele, espectroscopia Raman, hidratação, NMF, melanina, anti-oxidante,
colágeno.
“DETERMINATION OF THE BIOCHEMICAL COMPOSITION OF SKIN BY
RAMAN SPECTROSCOPY”
ABSTRACT
Skin aging is a complex biological process characterized by continuous cellular and
molecular alterations with a progressive degradation in the capacity to maintain homeostasis.
Skin aging can be divided into its intrinsic and extrinsic mechanisms. Along with
technological advances have come scientifically proven and non-traumatic noninvasive
techniques that have been applied in studies of the intrinsic and extrinsic processes of skin
aging. This has created and allowed a marked interest and increase in fundamental molecular
level research in this area. The application of these new methodologies has revolutionized the
cosmetic area. Professionals working in both fundamental and applied skin research are able
and required to assess and prove both quantitatively, as well as qualitatively, the scientific
claims made about the effects that the cosmetic products have on skin. Recently confocal
Raman spectroscopy has been used to measure the Raman spectra of various components in
the skin at various depths. Several in vivo studies have reported attempts to obtain information
about the skin from Raman spectra. Following up on those works, the objective of this study
was to identify by Raman spectroscopy some of the major components of the natural
moisturizing factor of the skin. A secondary objective was to then monitor the concentration
and conformations of these identified constituents in the stratum corneum of the skin as a
function of depth by using confocal Raman spectroscopy. Additionally, we sought to identify
and correlate specific bands in the Raman spectra of the constituents of the skin in different
age groups as a function of depth to further understand the aging process of the skin in these
different groups. The study involved 32 volunteers: 11 in Group A (between the ages of 20
and 23), 11 in group B (between the ages of 39 and 42), and 10 in Group C (between the ages
of 59 and 62). The spectra of the skin at three different depths (0 micrometers, 30
micrometers, and 60 micrometers) was measured for each individual in each group and
subsequently averaged. Based on these results, which are consistent with those obtained from
other independent studies, one can conclude that Raman spectroscopy is effective in the
characterization of biochemical compounds that make up the skin. In addition, it is a
completely noninvasive technique uniquely suited for studies involving the molecular
concentrations of various constituents in the skin and the effect various cosmetic products
have on them. Finally, a number of correlations between the spectra collected in vivo and in
vitro with some of the constituents of the natural moisturizing factor of the skin was observed.
A number of bands had larger average integrated areas, for example the peak at 809 cm-1
attributed to the presence of tyrosine, the peak at 875 cm-1 attributed to the presence of
pyrrolidone carboxylic acid (PCA); while other peaks had smaller integrated areas, for
example the peaks at 930 cm-1 attributed to the presence of cholesterol and carotenoids, and
the peak at 1637 cm-1 attributed to the presence of amide I band in proteins. These
observations were found for individuals from Group C and appear to be biomarkers of the
aging process.
Key - words: Skin, Raman spectroscopy, hydration, MFN, melanin, anti-oxidant, collagen.
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
FIGURA 1: Esquema da anatomia da pele
6
FIGURA 2: Imagem da Cultura de Queratinócitos
7
FIGURA 3: Camadas da epiderme
8
FIGURA 4: Esquema da anatomia da pele
10
FIGURA 5: Imagem da Cultura de Melanócitos
10
FIGURA 6: Imagem da Cultura de Fibroblasto
12
FIGURA 7: Estrutura dos Principais Constituintes do Estrato Córneo
16
FIGURA 8: Diagrama do Microscópio Confocal
19
FIGURA 9: Diagrama do Microscópio Raman Confocal
19
FIGURA 10: Sonda Confocal Jobin Yvon
27
FIGURA 11: Espectro Raman de Fenilalanina
29
FIGURA 12: Espectro Raman de Glicina
30
FIGURA 13: Espectro Raman de Isoleucina
31
FIGURA 14: Espectro Raman de Lisozima
32
FIGURA 15: Espectro Raman de Ornitina
33
FIGURA 16: Espectro Raman de Prolina
34
FIGURA 17: Espectro Raman de Àcido Aspártico
35
FIGURA 18: Espectro Raman de PCA
36
FIGURA 19: Espectro Raman de Serina
37
FIGURA 20: Espectro Raman de Valina
38
FIGURA 21: Espectro Raman de Treonina
39
FIGURA 22: Espectro Raman de Histidina
40
FIGURA 23: Espectro Raman de Alanina
41
FIGURA 24: Espectro Raman de Citrulina
42
FIGURA 25: Espectro Raman de Arginina
43
FIGURA 26: Espectro Raman Médio Característico da superfície da pele
44
FIGURA 27: Média dos Espectros do Grupo A
47
FIGURA 28: Média dos Espectros do Grupo B
48
FIGURA 29: Média dos Espectros do Grupo C
49
FIGURA 30: Valor da área dos três grupos, nas três profundidades na faixa:
50
781– 849
FIGURA 31: Valor da área dos três grupos, nas três profundidades na faixa:
51
849 – 887
FIGURA 32: Valor da área dos três grupos, nas três profundidades na faixa:
53
887 – 1005
FIGURA 33: Valor da área dos três grupos, nas três profundidades na faixa:
54
1005 – 1087
FIGURA 34: Valor da área dos três grupos, nas três profundidades na faixa:
55
1087 – 1167
FIGURA 35: Valor da área dos três grupos, nas três profundidades na faixa:
56
1167 – 1225
FIGURA 36: Valor da área dos três grupos, nas três profundidades na faixa:
57
1225 – 1355
FIGURA 37: Valor da área dos três grupos, nas três profundidades na faixa:
58
1355 – 1483
FIGURA 38: Valor da área dos três grupos, nas três profundidades na faixa:
1483 – 1707
59
LISTA DE TABELAS
TABELA 1: PKa Conforme Dawson
17
TABELA 2: Modos Vibracionais Aproximados da Fenilalanina
29
TABELA 3: Modos Vibracionais Aproximados da Glicina
30
TABELA 4: Modos Vibracionais Aproximados da Isoleucina
31
TABELA 5: Modos Vibracionais Aproximados da Lisozima
32
TABELA 6: Modos Vibracionais Aproximados da Ornitina
33
TABELA 7: Modos Vibracionais Aproximados da Prolina
34
TABELA 8: Modos Vibracionais Aproximados do Ácido Aspártico
35
TABELA 9: Modos Vibracionais Aproximados do PCA
36
TABELA 10: Modos Vibracionais Aproximados da Serina
37
TABELA 11: Modos Vibracionais Aproximados da Valina
38
TABELA 12: Modos Vibracionais Aproximados da Treonina
39
TABELA 13: Modos Vibracionais Aproximados da Histidina
40
TABELA 14: Modos Vibracionais Aproximados da Alanina
41
TABELA 15: Modos Vibracionais Aproximados da Citrulina
42
TABELA 16: Modos Vibracionais Aproximados da Arginina
43
TABELA 17: Modos Vibracionais Aproximados da Pele
45
TABELA 18: Cálculo das Áreas Integradas Sob a Curva do Espectro do Grupo
47
A nas profundidades: 0 μm, 30 μm, 60 μm.
TABELA 19: Cálculo das Áreas Integradas Sob a Curva do Espectro do Grupo
48
B nas profundidades: 0 μm, 30 μm, 60 μm.
TABELA 20: Cálculo das Áreas Integradas Sob a Curva do Espectro do Grupo
C nas profundidades: 0 μm, 30 μm, 60 μm.
49
LISTA DE ABREVIATURA E SIGLAS
CaF2: Fluoreto de cálcio
CCD: Charge Coupled Device
CEP: Comitê de Ética em Pesquisa
IP&D: Instituto de Pesquisa e Desenvolvimento
NMF: Fator de Hidratação Natural
PBS: Tampão Fosfato Salino
PCA: Ácido Pirrolidona Carboxílico
m: micro metro
SUMÁRIO 1
INTRODUÇÃO................................................................................................................20
2
REVISÃO DE LITERATURA ........................................................................................23
2.1 Anatomia da Pele................................................................................................................23
2.1.1
Epiderme.............................................................................................................24
2.1.2
Derme .................................................................................................................28
2.1.3
Hipoderme ..........................................................................................................29
2.1.4
Pele e o Processo do Envelhecimento ................................................................29
2.1.5
Aminoácidos.......................................................................................................30
2.2 Espectroscopia Raman........................................................................................................34
2.3 Espectroscopia Raman Confocal ........................................................................................35
2.4 Espectroscopia Raman no estudo de pele...........................................................................37
3
OBJETIVOS.....................................................................................................................40
4
MATERIAIS ....................................................................................................................41
5
MÉTODOS.......................................................................................................................43
5.1 Procedimento Experimental - Medida Raman dos Aminoácidos.......................................43
5.2 Procedimento Experimental - Medida Raman “in vivo”..................................................43
6
RESULTADOS E DISCUSSÃO .....................................................................................45
6.1 Espectros Base dos Aminoácidos ......................................................................................45
6.1.1 Fenilalanina .............................................................................................................46
6.1.2 Glicina .....................................................................................................................47
6.1.3 Isoleucina.................................................................................................................48
6.1.4 Lisozima ..................................................................................................................49
6.1.5 Ornitina....................................................................................................................50
6.1.6 Prolina......................................................................................................................50
6.1.7 Ácido aspártico ........................................................................................................51
6.1.8 PCA .........................................................................................................................53
6.1.9 Serina .......................................................................................................................54
6.1.10 Valina ....................................................................................................................55
6.1.11 Treonina.................................................................................................................56
6.1.12 Histidina ................................................................................................................57
6.1.13 Alanina ..................................................................................................................58
6.1.14 Citrulina .................................................................................................................59
6.1.15 Arginina .................................................................................................................60
6.2 Espectro Raman da Superfície da Pele ..............................................................................61
6.3 Média dos Espectros do Grupo A: 0 µm, 30 µm, 60 µm. ..................................................63
6.4 Média dos Espectros do Grupo B: 0 µm, 30 µm, 60 µm...................................................65
6.5 Média do Espectro do Grupo C: 0 µm, 30 µm, 60 µm......................................................66
6.6 Análise das áreas por faixas espectrais correlacionadas às faixas etárias e
profundidades............................................................................................................................67
6.6.1 Faixa: 781 – 849 (cm-1) ...........................................................................................67
6.6.2
Faixa: 849 – 887 (cm-1) ......................................................................................68
6.6.3
Faixa: 887 – 1005 (cm-1) ....................................................................................69
6.6.4
Faixa: 1005 – 1087 (cm-1) ..................................................................................70
6.6.5
Faixa: 1087 – 1167 (cm-1) ..................................................................................71
6.6.6
Faixa: 1167 – 1225 (cm-1) ..................................................................................72
6.6.7
Faixa: 1225 – 1355 (cm-1) ..................................................................................73
6.6.8
Faixa: 1355 – 1483 (cm-1) ..................................................................................74
6.6.9 Faixa: 1483 – 1707 (cm-1) .......................................................................................75
7
CONCLUSÃO..................................................................................................................77
REFERÊNCIAS .......................................................................................................................18
1
INTRODUÇÃO
A indústria de beleza mundial tem um crescimento médio de 9% ao ano e fatura cerca
de R$16 bilhões de dólares. O Brasil ultrapassou a França e já é o terceiro do “ranking"
mundial, liderado pelos Estados Unidos e Japão. Tudo isso se deve a busca incessante pela
máxima aproximação do padrão de beleza e jovialidade (VALENÇA, NASCIMENTO,
GERMANO 2010; VIEIRA, LAPLANE, 2001).
Isso porque com o passar dos anos, a pele apresenta um declínio de todas as suas
funções e este é o motivo pelo aumento das vendas de produtos cosmecêuticos, na busca pela
beleza já que as alterações macroscópicas e histológicas são evidentes no processo de
envelhecimento cutâneo.
O envelhecimento cutâneo é um processo biológico complexo, contínuo que se
caracteriza por alterações celulares e moleculares, com diminuição progressiva da capacidade
de homeostase do organismo. Podendo ser dividido em:

Intrínseco ou cronológico: é o natural inevitável, relacionado a fatores genéticos,
encurtamento progressivo dos telômeros até um tamanho crítico (quando a célula entra
em apoptoses) (RABE et al 2006); caracterizado por atrofia da pele e rugas finas, por
afetar principalmente as fibras elásticas (BAGATIN, 2008).

Extrínseco ou fotoenvelhecimento: depende da relação do fototipo e a exposição solar
continua e sem proteção, caracterizado por rugas profundas, ceratose, pele espessada,
amarelada, seca, telangiectasias, queratoses e melanoses. As modificações decorrentes
da exposição prolongada e cumulativa a radiação ultravioleta, levam ao
fotoenvelhecimento, comprometendo assim as áreas do corpo constantemente
expostas e pode ser evitado (BAGATIN, 2008).
Os fatores que propiciam o envelhecimento cutâneo precoce são aproximadamente:
50% estilo de vida (fotodano, fumo, álcool, exposição solar, profissão), 20% são as causas
ambientais (climas quentes, secos, ventos), e 30% a herança genética (modificações
bioquímicas, moleculares, estresse oxidativo e proteases) (TRUEB 2005).
Recentes avanços têm beneficiado tanto médicos dermatologistas como os
profissionais que trabalham no desenvolvimento de produtos cosmecêuticos. Antes do
emprego de metodologias não invasivas, a dermatologia e suas áreas de atuação baseavam-se,
na maioria das vezes, na observação clínica e também métodos invasivos, que muitas vezes
causam desconforto aos pacientes. Com o avanço da tecnologia contam com o auxilio de
ferramentas não invasivas, cientificamente comprovadas e não traumáticas, não envolvendo
qualquer agressão ou desconforto. A aplicação dessas metodologias tem revolucionado a área
cosmética, pois os profissionais que nela atuam têm conseguido avaliar de maneira
quantitativa ou, melhor, comprovar cientificamente os efeitos dos produtos cosmecêuticos
(LEONARDI, GASPAR, CAMPOS, 2002).
Várias dermatoses têm sido estudadas, como xerose e até as formas mais graves de
psoríase. Existe uma necessidade de técnicas que proporcionem um conhecimento sobre os
constituintes do NMF da pele. O uso de métodos não invasivos é importante no estudo da
pele, em seu estado natural, sem afetar sua integridade, morfologia ou composição molecular.
Com a espectroscopia Raman essas medições podem ser feitas e sem afetar sua integridade
(CASPERS, NIJSSEN, PUPPELS, 2004).
A técnica de espectroscopia Raman in vivo permite a identificação, caracterização, em
tempo real das alterações bioquímicas decorrentes dos processos degenerativos dos tecidos
vivos, nos estudos dos principais constituintes da pele, como, proteínas, lipídeos e água
(MARROT, MEUNIER 2008; SCHROEDER, HAENDELER, KRUTMANN 2008).
Recentemente a espectroscopia Raman tem sido aplicada para a medição da
profundidade na pele in vivo e vários estudos relatam a aplicação desta técnica para obter
informações sobre a pele (EGAWA, TAGAMI, 2008).
Muitos dermatologistas, cientistas e empresas de cosméticos têm interesse na
avaliação da concentração de água no estrato córneo, do chamado fator de hidratação natural
ou NMF e lipídios. No entanto, informações sobre a concentração de água em função da
profundidade no estrato córneo não podem ser obtidos sem utilizar um método invasivo. Por
outro lado, os atuais progressos em técnicas de espectroscopia Raman permitiram obter
informações sobre a composição molecular in vivo da pele usando um método não invasivo.
A espectroscopia tem sido utilizada para a avaliação quantitativa e qualitativa de água, além
de controlar a da profundidade de penetração (EGAWA, TAGAMI, 2007).
As principais vantagens do uso da espectroscopia Raman confocal que permitem sua
disseminação no mercado são elas: a não necessidade de preparação da amostra, a ótima
resolução espacial. Assim a técnica é útil em vários domínios como na indústria cosmética,
farmacêutica e pesquisas acadêmicas e tem uma grande perspectiva de crescimento em longo
prazo.
Entretanto, para se obter uma avaliação qualitativa ou mesmo semi-quantitativa das
alterações no NMF por espectroscopia Raman confocal, é necessário ter disponível os
espectros bases dos principais constituintes do NMF para que possam adquirir estas
referências espectrais.
2
REVISÃO DE LITERATURA
2.1 Anatomia da Pele
A pele é o maior órgão do corpo humano por sua extensão e peso, correspondendo a
cerca de 20% da massa corporal total, indispensável à vida e apresenta as seguintes funções:
revestir o corpo, barreira entre os meios interno e externo, conservar os fluidos corporais,
impedir a penetração de microorganismos, absorver a radiação ultravioleta, participar na
síntese da vitamina D, além de desempenhar um papel fundamental nos mecanismos de
termorregulação e vigilância imunológica (JOHNSON, WOLFF, 2008 ).
Existem dois tipos de pele que podem variar de 1 mm a 4 mm de espessura, a pele
glabra caracterizada por camada espessa de queratina (regiões palmares e plantares) e a pele
pilificada que é mais fina e recobre o restante do corpo. A pele é composta por 3 camadas:
epiderme, formada por tecido epitelial; derme formada por tecido conjuntivo e hipoderme que
é a camada inferior contendo gordura conforme ilustrado na figura 1 (WOLF, 2008). A
epiderme humana apresenta camadas com complexa organização. O estrato córneo é a mais
superficial responsável pela das função de barreira (DARLENSKI et al 2009).
Figura 1: Esquema da anatomia da pele
Fonte: www.afh.bio.br/sentidos/sentidos10.asp
2.1.1 Epiderme
A epiderme é a camada externa da pele com espessura variável tendo como célula
principal os queratinócitos (visualizados na figura 2) que ao se moverem em direção à
superfície, sofrem alterações na forma e composição molecular. Por último, sofrem uma
transição para uma camada de células achatadas, que é o estrato córneo. O estrato córneo tem
espessura de 10-15 µm, exceto nas regiões palmares e plantares onde pode ser 10 vezes mais
espesso. Apesar de sua espessura o estrato córneo constitui uma barreira altamente eficiente
contra a perda de água e de proteção contra agressões químicas e microbianas. O principal
constituinte do estrato córneo é a queratina, que representa 80% do seu peso seco (CASPERS,
LUCASSENY, PUPPLES, 2003).
Os queratinócitos têm como função prover uma camada de proteção (figura 2) e
produção de alguns compostos. Eles são células epidérmicas primárias de formato irregular
que sintetizam grande número de fatores de crescimento, proteínas e enzimas (WOLFF,
2008).
Figura 2: Imagem da Cultura de queratinócitos
Fonte: Autora
A epiderme está disposta em camadas distintas conforme ilustrado na figura 3:
 Junção dermoepidérmica: Atua como suporte para epiderme, com espessura de 60 nm
a 140 nm de colágeno.
 Camada basal: que contém células germinativas que por divisão mitótica
proporcionam os queratinócitos das camadas superiores;
 Camada espinhosa: composta de cinco a seis camadas de queratinócitos, as pontes
intercelulares que ligam as células adjacentes são chamadas desmossomos;
 Camada Granulosa: é a camada mais superficial da porção nucleada da epiderme;
 Camada Córnea: (visualizada na figura 3 e 4) acima da transição abrupta entre as
células nucleadas da camada granulosa composta por células planas e anucleadas;
 Lâmina Lúcida: camada de transição entre as células granulosas e os corneócitos,
presente apenas em algumas áreas corporais (JOHNSON, WOLFF, 2008 ).
Na camada basal da epiderme, as células proliferam, e diferenciam-se perdendo
organelas celulares e transformando-se química e fisicamente em células resistentes
cornificadas, os corneócitos. No estrato córneo, os corneócitos são incorporados na matriz
lipídica intercelular. Após a extrusão de corpos lamelares na interface entre o estrato
granuloso e estrato córneo, os lipídios são metabolizados e formam a matriz lipídica
intercelular (BOUWSTRA et al 2008).
Figura 3: Camadas da Epiderme
Fonte: http:// ltc.nutes.ufrj.br/toxicologia/imagens/estrutura-epiderme.gif
O estrato córneo é composto por:
 Queratina: é a principal proteína da epiderme.
 Lipídeos: a maioria dos lipídeos da pele é encontrada na epiderme. Os lipídeos do
estrato córneo são compostos principalmente de colesterol (25%), ceramidas (50%) e
ácidos graxos (15%) e outros tipos de lipídeos em quantidades menores.
 Água: é responsável pela flexibilidade da pele e se ausente provoca fissuras e
rachaduras. Em uma série de estudos a quantidade de água no estrato córneo tem sido
relacionada com a condição da pele seca.
 NMF: é responsável pela manutenção do nível de hidratação do estrato córneo. É uma
mistura de aminoácidos, derivados de aminoácidos e sais específicos, produzido
exclusivamente pelas células do estrato córneo. Os constituintes químicos são
altamente solúveis em água e higroscópicos, absorvem a água da atmosfera mesmo em
umidade relativa baixa. Isso permite a manutenção dos níveis de água mesmo em
ambiente extremamente seco. A filagrina é a única fonte de aminoácidos dos
componentes do NMF. A proteína precursora NMF é chamada de profilagrina e é
encontrada na camada espinhosa e granulosa da epiderme. Após a permeabilidade de
água na barreira epidérmica, a filagrina é hidrolisada e convertida em NMF em um
processo abrupto que ocorre na parte inferior das poucas camadas de células do estrato
córneo. A conversão de filagrina em NMF é um processo enzimático que, como
muitos outros são influenciados pelo nível de hidratação.
O teor de água no estrato córneo esta entre 10 e 20%. A retenção de água é essencial
para manter sua flexibilidade e prover a hidratação necessária às enzimas envolvidas em
vários aspectos de função e maturação do estrato córneo (CASPERS 2003).
O conteúdo de água, por sua vez, segue um gradiente, diminuindo conforme se
aproxima da superfície. As camadas mais profundas contêm aproximadamente 65-70% de
água enquanto as mais externas contêm aproximadamente 10-15%. A maior parte esta na
derme ligada à glicosaminoglicanas, em particular, ao àcido hialurônico e ao sulfato de
condroitina. A derme e a epiderme são compostas por aproximadamente 70% de água
(DARLENSKI et al 2009).
A função do estrato córneo depende da presença de umidificantes, especialmente
constituintes do fator de hidratação natural. Quando as células epidérmicas morrem e se
transformam em estrato córneo, as proteínas são degradadas em aminoácidos e transportadas
para o estrato córneo. Cerca de metade do NMF é formada por aminoácidos e ácido
carboxílico pirrolidona (PCA) derivado do glutamato (CASPERS 2003).
Figura 4: Esquema da anatomia da Pele
Fonte: www.sobiologia.com.br/figuras/Reinos3/epiderme.gif
Dentre os principais constituintes do NMF encontram – se o ácido carboxílico
pirrolidona (PCA), ácido urocânico, lactato, uréia, serina, glicina, arginina, ornitina, citrulina,
alanina, histidina, fenilalanina (HARDING, WATKINSON, RAWLINGS 2000).
A segunda maior população de células na epiderme são os melanócitos grandes,
dendritícos e localizados na camada basal, conforme ilustrado na figura 5. Sua função é
produzir melanina que protege as células da radiação ultravioleta. Eles transportam a
melanina aos queratinócitos através dos dendritos.
Figura 5: Imagem da Cultura de melanócitos
Fonte: Autora
As células de Langerhans têm um importante papel no sistema imune da pele. A
cultura primária destas células é menos estável que a de queratinócitos e melanócitos e,
portanto, menos utilizada como modelo in vitro (MAJMUDAR; SMITH, 1998).
2.1.2 Derme
A camada interna, a derme, possui entre 1 - 4 mm de espessura sendo composta de
tecido conjuntivo (fibras colágenas e elásticas envoltas por substância fundamental amorfa), e
outras estruturas incluindo nervos, vasos sanguíneos, vasos linfáticos e glândulas está
localizada entre a epiderme e a hipoderme, é responsável pela resistência mecânica e
elasticidade da pele. Os folículos pilossebáceos e glândulas sudoríparas se abrem na
epiderme, também se localizam na derme.
A região que une a epiderme e a derme se une é chama de junção dermo-epidérmica.
Nesta área, a epiderme se projeta em direção à derme, formando as cristas epidérmicas como
mostrado na figura 4, que aumentam a superfície de contato entre as 2 camadas, facilitando a
nutrição das células epidérmicas pelos vasos sanguíneos da derme.
Descrevem-se na derme duas camadas, de limites pouco distintos, que são a derme
papilar, mais superficial; e a derme reticular, mais profunda.
 Derme papilar: delgada, constituída por tecido conjuntivo frouxo, seu nome relacionase ao fato dela penetrar nas papilas dérmicas. Nesta camada existem fibrilas especiais
de colágeno, que se inserem na mesma membrana basal e penetram profundamente na
derme. Estas fibrilas têm a função de unir a derme à epiderme.
 Derme reticular: mais espessa constituída por tecido conjuntivo denso. Ambas as
camadas contêm muitas fibras elásticas, responsáveis, em parte, pela elasticidade da
pele. Além dos vasos sanguíneos e linfáticos, e dos nervos, também são encontradas
na derme as seguintes estruturas, derivadas da epiderme: pêlos, glândulas sebáceas e
sudoríparas, e unhas (JUNQUEIRA; CARNEIRO, 1999).
Os Fibroblastos são as células em maior número nesta camada. São largamente
utilizados na cultura celular devido a sua alta capacidade de crescimento, quando comparada a
outras linhagens celulares. São células maiores que os queratinócitos, de formato alongado,
com terminações pontiagudas. A função principal dos fibroblastos é sintetizar proteínas da
matriz extracelular, como o colágeno, fibronectina, elastina e proteoglicanos além das
enzimas de sua degradação, como a colagenase, elastase e outras metaloproteinases da matriz
(CASPERS; LUCASSEN; PUPPLES, 2003).
Figura 6: Imagem da Cultura de fibroblastos
Fonte: Autora
2.1.3 Hipoderme
A hipoderme mostrada na figura 1, também chamada de tecido celular subcutâneo, é a
porção mais profunda da pele. Formada por tecido conjuntivo frouxo que envolve células
gordurosas (adipócitos) e formam lóbulos de gordura. É a camada responsável pelo
deslizamento da pele sobre as estruturas na qual se apóia. Dependendo da região e do grau de
nutrição do organismo, a hipoderme poderá ter uma camada variável de tecido adiposo que,
quando desenvolvida, constitui o panículo adiposo. Como a gordura é um bom isolante
térmico, o panículo adiposo proporciona proteção contra o frio. (JUNQUEIRA; CARNEIRO
1999).
2.1.4
Pele e o Processo do Envelhecimento
Alguns estudos verificaram que com o processo de envelhecimento existem alterações
tanto na histologia como na fisiologia da pele tais como: afinamento da epiderme,
achatamento da junção dermoepidérmica, redução da celularidade na derme, redução da
sinuosidade do trajeto da epiderme ao longo do comprimento da superfície dérmica,
aplanamento da derme papilar. Os melanócitos aumentam em número e tamanho, enquanto as
células de Langerhans diminuem e tem sua função comprometida. A derme, ao contrário da
pele apenas cronologicamente envelhecida, apresenta maior número de fibroblastos,
mastócitos e histiócitos, caracterizando o processo inflamatório denominado heliodermatite
ou dermato-heliose. No fotoenvelhecimento ocorre: elastose solar, com substituição das fibras
colágenas maduras por colágeno de aspecto basofílico (degeneração basofílica do colágeno)
na derme papilar e reticular, fragmentação das fibras elásticas e modificações na estrutura e
composição das fibrilas de ancoragem, proteoglicanas e glicosaminoglicanas (MANELAAZULAY et al 2010).
2.1.5 Aminoácidos
Os aminoácidos são uns dos principais constituintes do NMF, sendo as unidades
estruturais básicas das proteínas. Um α-aminoácido é constituído de um grupamento amino,
uma carboxila, um átomo de hidrogênio e um grupamento R diferenciado, todos eles ligados a
um átomo de carbono α. Eles diferem uns dos outros através de suas cadeias laterais ou
grupos R. Este átomo de carbono é chamado de α por ser adjacente à carboxila ácida
(STRYER, 1996).
O átomo de carbono α é assim um centro quiral devido ao arranjo tetraédrico das
orbitais de ligação ao redor do carbono α dos aminoácidos, duas disposições espaciais
distintas são chamadas estereoisômeros. Os estereoisômeros de todos os compostos quirais
são designados pela letra L (de levorrotatório que significa “esquerdo”) e pela letra D (de
destrorrotatório que significa “direito”). Os símbolos L e D referem-se à configuração
absoluta dos quatro substituintes ao redor do átomo de carbono quiral.
Os aminoácidos nas moléculas protéicas são sempre L-estereoisômeros os Daminoácidos são encontrados nas paredes de células bacterianas.
Os aminoácidos em soluções aquosas estão ionizados e podem agir como ácidos ou
bases. Aqueles α – aminoácidos, que têm um único grupo amino e um único grupo carboxila,
cristalizam-se de soluções aquosas neutras como espécies totalmente ionizadas conhecidas
como “zwitterions” (palavra alemã para “íons híbridos”), cada um tendo uma carga negativa e
uma positiva. Estes íons permanecem estacionários, isto é, não migram quando colocados em
um campo elétrico.
Os aminoácidos podem ser classificados de acordo com o grupo R:
 Grupo R Apolares (hidrofóbica), Alifáticos: Os grupos R nesta classe de aminoácidos
são apolares e hidrofóbicas. As cadeias de alanina, valina, leucina, isoleucina tendem a
se agrupar dentro de proteínas e a estabilização das proteínas é estruturada por meio de
interações hidrofóbicas. A glicina tem a estrutura mais simples, apesar de formalmente
apolar, a sua cadeia lateral muito pequena não faz real contribuição para a interação
hidrofóbica. A prolina tem uma cadeia lateral alifática, com uma estrutura distinta
cíclica. O grupo amino secundário de resíduos de prolina tem conformação rígida, que
reduz estruturalmente a flexibilidade das regiões que o contém.
 Grupo R Aromáticos: fenilalanina, tirosina e triptofano, com as suas cadeias laterais
aromáticas, são relativamente apolares. Todos podem participar de interações
hidrofóbicas. O grupo hidroxila da tirosina pode formar pontes de hidrogênio, e é um
importante grupo funcional de algumas enzimas. Tirosina e triptofano são
significativamente mais polares do que a fenilalanina. Triptofano e tirosina, num grau
muito menor que a fenilalanina, absorvem a luz ultravioleta. Isso explica a forte
absorção de luz por proteínas no comprimento de onda 280 nm, uma propriedade
explorada por investigadores na caracterização de proteínas.
 Grupo R, Polar sem carga: O grupo R desses aminoácidos são os mais solúveis em
água, ou mais hidrofílicos, que os aminoácidos apolares, porque eles contêm um grupo
funcional que forma pontes de hidrogênio com a água. Esta classe de aminoácidos
inclui serina, treonina, cisteína, asparagina e glutamina. A polaridade da serina e
treonina é devido aos grupos hidroxila; a cisteína pelo grupo sulfidrila e a asparagina e
glutamina pelo grupo amida. Asparagina e glutamina são os outros dois aminoácidos
encontrados também em proteínas, aspartato e glutamato, respectivamente, aos quais
asparagina e glutamina são facilmente hidrolisados por ácido ou base.

Grupo R Carregado positivamente: os aminoácidos em que os grupos R tem uma
carga positiva e significativa com pH 7.0 são a lisina, arginina e histidina.

Grupo R Carregado negativamente: os dois aminoácidos com grupos R com uma
carga líquida negativa em ph 7.0 são aspartato e glutamato, cada qual com um
segundo grupo carboxila.
Os mais hidrofílicos dos grupos R são aqueles que são carregados positivamente ou
negativamente.
A ornitina e a citrulina também são aminoácidos encontrados em células com uma
variedade de funções, mas derivadas de proteínas e merecem uma atenção especial porque são
intermediários importantes na biossíntese da arginina e no ciclo da uréia (NELSON, COX,
2008; STRYER 1996).
A figura 7 mostra as estruturas dos principais constituintes encontrados no estrato
córneo:
COO+NH3
H
C
CH2
CH2
COO-
CH2
+NH3
H
C
HN
O
-OOC
CH2
H
O
C
CH2
C
HC
CH
HC
CH
COO+NH3
C
C
H
H
(a)
(b)
HN
C
HC
CH
HC
CH
H
C
H
COO-
CH2
C
+NH3
CH2
H
C
CH2OH
O
(c)
(d)
(e)
COOCOO-
+NH3
C
H
+NH3
CH2
COO+NH3
COOC
HC
NH
N
CH2
CH2
CH2
+NH3
C
(f)
CH2
CH2
CH2
NH
NH
NH2
O
H
CH3
CH
H
CH2
CH2
H
C
C
O
(g)
NH2
(h)
O
H2N
N+H2
(i)
NH2
(j)
O
N
OH
H3C
OH
HO
HN
(k)
(l)
Figura 7: Estrutura dos principais constituintes do NMF do estrato córneo: (a) Fenilalanina, (b) Glicina, (c)
Ornitina, (d) Ácido Carboxílico da Pirrolidona, (e) Serina, (f) Histidina, (g) Alanina, (h) Citrulina, (i) Arginina,
(j) Uréia, (k) Ácido Urocânico, (l) Lactato.
Fonte: Autora
A tabela 1 mostra as propriedades e convenções associadas com alguns dos
aminoácidos e outros constituintes do NMF, sendo o pka o grau de acidez dos aminoácidos
segundo Nelson e Cox (2008) e Sanz-Nebot et al (2002).
Tabela 1: Os pka conforme Nelson e Cox (2008) e Sanz-Nebot et al (2002).
PK1
PK2
PKR
PI
- COOH
- NH+3
R Group
Arginina
2.17
9.04
12.48
10.76
Aspartato
1.88
9.60
3.65
2.77
Histidina
1.82
9.17
6.00
7.59
Treonina
2.11
9.62
-
5.87
Serina
2.21
9.15
-
5.68
Fenilalanina
1.83
9.13
-
5.48
Isoleucina
2.36
9.68
-
6.02
Valina
2.32
9.62
-
5.97
Prolina
1.99
10.96
-
6.48
Alanina
2.34
9.69
-
6.01
Glicina
2.34
9.60
-
5.97
Ornitina
1.71
8.69
10.76
-
Ácido Carboxílico da Pirrolidona
3.32
-
-
-
Ácido Urocânico
5.8
3.5
-
-
Lisozima
-
-
-
11
Citrulina
2.39
9.58
-
-
2.2 Espectroscopia Raman
A espectroscopia Raman foi demonstrada pela primeira vez, em 1928, por
Chandrasekhara Venkata Raman, após experimentos em que iluminava diferentes meios com
lâmpadas de mercúrio. A luz espalhada pela amostra era analisada pelo espectrógrafo que
apresentava bandas diferentes do espectro da luz de mercúrio. Desta forma Chandrasekhara
Venkata Raman concluiu que as freqüências representavam as vibrações das moléculas da
amostra. Se a energia do fóton incidente é inalterada após colisão com uma molécula, o fóton
espalhado tem a mesma freqüência que o fóton incidente – este efeito é conhecido como
Rayleigh ou espalhamento elástico. Quando a energia é transferida a partir da molécula para o
fóton, ou vice-versa, o fóton espalhado tem maior ou menor energia que o fóton incidente,
este é o espalhamento inelástico ou espalhamento Raman. Estes efeitos foram descritos em
1928 por C.V.Raman, pelo qual recebeu o Prêmio Nobel. A diferença entre a freqüência
incidente e a luz espalhada denomina-se espalhamento Raman. Se o fóton tem uma freqüência
maior e, portanto, menor energia do que a luz incidente, este efeito é conhecido como StokesRaman. Assim, o espectro Raman, é um método baseado no espalhamento inelástico da luz e
fornece informações em nível molecular da composição bioquímica do composto em análise.
(MOVASAGHI, REHMAN, REHMAN, 2007; APELDOORN et al, 2005).
2.3 Espectroscopia Raman Confocal
O primeiro microscópio confocal foi inventado em 1955 e patenteado em 1957 por
Marvin Minsky, estudante de pós-doutorado da Universidade de Harvard (USA). Ele
acreditava que toda a luz espalhada poderia ser bloqueada antes de entrar na objetiva do
microscópio. De acordo com seu ponto de vista, um microscópio ideal seria aquele que
conseguisse medir o espalhamento da luz apenas de um único ponto da amostra. Dentro deste
contexto, Marvin Minsky, instalou uma fenda circular após a fonte de luz; a pequena abertura
refocalizava a luz na objetiva, e, assim, iluminava apenas um único ponto na amostra. Deste
modo o espalhamento de luz de outros elementos não existiria mais, a quantidade de luz
espalhada seria reduzida por um número de ordens de grandeza, sem afetar o brilho do foco.
Uma segunda fenda foi colocada entre a objetiva e o plano da imagem para rejeitar qualquer
raio de luz que estivesse fora de foco, funcionando como um filtro de frequência espacial. O
princípio do microscópio confocal idealizado por Minsky é mostrado no diagrama da Figura
8.
Figura 8: Diagrama do microscópio confocal
Fonte: Autora
A microscopia confocal pode ser associada com diferentes técnicas, tal como:
Absorção,
Reflexão,
Transmissão,
Emissão,
Fotoluminescência,
Fluorescência
ou
Espectroscopia Raman (figura 9, diagrama esquemático do microscópio confocal utilizado
nesta dissertação). Dentre estas, a Espectroscopia Raman tem-se recentemente destacado.
Amostra
4
Objetiva
3
5
2
2
Câmera
Legenda:
1 - Fibra
2 - Lente
3 - Espelho
4 - Espelho móvel
5 - Separador de feixe
1
2
1
espectrômetro
2
1
Laser
Luz Visível
Figura 9: Diagrama do microscópio Raman confocal Jobin Yvon
Fonte: manual do equipamento
A sonda Microscópica Confocal é composta por fibras, lentes, espelhos, câmera e por
uma objetiva. As fibras são responsáveis por guiar o laser até a sonda e também levar o sinal
espalhado da amostra até o espectrômetro. As lentes e os espelhos são necessários para fazer o
caminho óptico dentro do microscópio e o acoplamento dos sinais nas fibras e objetiva. A
câmera serve para visualizar a superfície da amostra em análise. O diagrama esquemático do
funcionamento do microscópio confocal é mostrado na figura 9.
2.4 Espectroscopia Raman no estudo de pele
A espectroscopia Raman é hoje rotineiramente utilizada em estudos de pele in vivo. A
capacidade de medir a composição química da pele sem nenhum dano invasivo a torna uma
ferramenta valiosa e, portanto, muito aceita (VAN DER POL; CASPERS, 2008; MÉLOT et
al, 2009).
As diferentes camadas da pele (estrato córneo, epiderme, derme) podem ser
identificadas. A Microscopia Raman confocal in vivo é uma ferramenta em potencial que
pode substituir a biópsia (CASPERS, LUCASSEN, PUPPLES, 2003). Caspers et al (2003)
realizaram um estudo com espectroscopia Raman confocal como um método não – invasivo
para obter informações detalhadas sobre a composição molecular da pele in vivo e in vitro.
Eles analisaram semi – quantativamente a concentração dos principais aminoácidos livres que
constituem o NMF (serina, glicina, pirrolidona, arginina, ornitina, citrulina, alanina, histidina,
etc). Esta análise permitiu a obtenção de informações dos compostos em amostras in vivo. A
determinação do perfil dos constituintes do NMF foi realizada na região espectral de 400 –
2000 cm-1.
Chrit et al (2005) realizaram um estudo na pele de voluntários saudáveis com o
objetivo de avaliar o potencial da espectroscopia Raman confocal in vivo . Os autores
utilizaram uma micro-sonda acoplada em que fibra óptica é um laser de 633 nm. Examinaram
mudanças na composição molecular e na estrutura do estrato córneo, a partir de diferentes
sítios anatômicos e camadas da pele. Principais variações espectrais foram detectadas nas
seguintes regiões: 800-900 cm-1 (aminoácidos); 1200-1290 cm-1 (proteínas); e de 1030 a 1130
cm-1, 1300-1450 cm-1, e 2800 a 2900 cm-1 (lipídios). Esses achados resultam de alterações no
estrato córneo nos componentes naturais tais como hidratação, lipídios, proteínas.
O laser de titânio safira utilizado na espectroscopia do Raman dispersivo por fibra
óptica com comprimento de onda de 785 nm permite uma boa penetração da luz na pele,
minimiza a fluorescência e não causa qualquer degradação térmica ou fotoquímica. A
potência do laser focalizada sobre a amostra foi mantida a 50 mW, o que não destrói amostras
biológicas (TFAYLI et a,l 2007).
Já na técnica FT-Raman o laser de excitação é de 1064 nm, a profundidade de
penetração chega a aproximadamente 1 a 4 mm na pele, ou seja, a penetração chega até a
derme (CARNIOL, SADICK 2007).
O padrão de segurança internacional prescreve os limites máximos admissíveis de
exposição de laser para a pele, que são dependentes do comprimento de onda da luz e a
duração da exposição. O máximo permitido de exposição para a pele são os limites que não
apresentam risco de dano, ou seja, instrumento em limite de 30 mW para o laser de excitação
com comprimento de onda de 785 nm e 20 mW para o de 671 nm (VAN DER POL;
CASPERS, 2008).
Pudney, Melot e Caspers (2007) calcularam o perfil de concentração de água e a
concentração dos constituintes do NMF no limite entre o estrato córneo e a epiderme. Ao
chegar a uma profundidade de 30% onde foi encontrado o teor máximo do NMF e uma
profundidade segundo a qual a concentração de água é de 55% em massa, são obtidos dois
locais espaçados. Esta abordagem permitiu uma estimativa sistemática da localização do
limite, para cada ponto de medição individual.
Já no estudo de Chrit, Bastien e Sockalingum (2006), foi estudada a eficácia de um
creme hidratante em 26 voluntárias, brancas e de pele seca. Elas receberam o creme no
antebraço com um emoliente sem agente de hidratação e um tratamento com 3% de glicerol
contendo o creme. Uma medida controle foi incluída. Observaram que o creme com glicerol
induziu um aumento significativo no conteúdo de água em comparação com os valores basais
em todas as profundidades entre 0 e 20 µm, já que a 15 µm está situado a interface do estrato
córneo e epiderme.
Em 2000, Caspers et al realizaram um estudo in vivo sobre a concentração de água na
pele, em função da profundidade. Observaram que a concentração de água é baixa no estrato
córneo (15-30%) e aumenta drasticamente no limite entre o estrato córneo e a epiderme
(localizado 10 – 15 μm abaixo da superfície da pele) onde atinge uma concentração de cerca
de 70%.
Esta informação foi confirmada em 2001, por Caspers e colaboradores onde observouse um aumento na concentração de água abaixo da superfície da pele indica a interface estrato
córneo e epiderme, mas o estiramento O–H da água só é visível numa larga banda espectral
centrada em torno de 3.450 cm-1. A partir do estudo de Caspers concluiu-se que uma rápida
diminuição do teor NMF (região de 1398 cm
-1
no espectro de pele) é um marcador
alternativo para identificar a interface estrato córneo - epiderme.
Em 2006, Matsumoto et al apresentaram os resultados da distribuição de água na pele
em áreas não tratadas até uma profundidade de 200 µm, em dois grupos constituídos de 20
voluntários japoneses com faixas etárias médias de 64 anos e de 27 anos.
Surpreendentemente, não houve diferenças no perfil de concentração de água no estrato
córneo e epiderme entre estes dois grupos.
Rawlings e Harding (2004) demonstraram uma zona de filagrina estável existente na
parte inferior da camada córnea, onde a barreira de água da epiderme é formada. A conversão
de filagrina em NMF é acima dessa zona, perto da superfície da pele.
Os perfis de
concentração mostram que para a maioria dos componentes do NMF concentram de 0 a 70
μm abaixo da superfície da pele. Entre 70 e 50 μm as concentrações aumentaram
significativamente e de 50 a 10 μm abaixo da superfície da pele as concentrações
permanecem constantes. Isto sugere que, para esta profundidade em particular, a conversão de
filagrina em NMF tem lugar entre 50 e 70 μm abaixo da superfície da pele. A pele
envelhecida tem níveis menores de NMF do que a de jovens, refletindo, principalmente, a
redução da formação natural de profilagrina.
3
OBJETIVOS
Este estudo teve como objetivo a caracterização individual dos principais constituintes
que compõem o fator de hidratação natural da pele humana, por espectroscopia Raman. A
caracterização da pele humana em diferentes profundidades e faixas etárias, por meio da
espectroscopia Raman confocal. Então, os espectros da pele e os espectros dos principais
constituintes que compõem o fator de hidratação natural foram correlacionados.
4
MATERIAIS
O projeto foi desenvolvido no Laboratório de Espectroscopia Vibracional Biomédica
na Universidade do Vale do Paraíba, após a aprovação pelo Comitê de Ética em Pesquisa
(CEP) do Instituto de Pesquisa e Desenvolvimento (IP&D) sob o protocolo de número
I033CEP/2009.
Os principais constituintes do fator de hidratação natural da pele (NMF) foram
comprados individualmente da empresa Sigma Aldrich, com alto grau de pureza. Sendo eles:
Ácido Carboxílico da Pirrolidona, Arginina, Ornitina, Citrulina, Glicina, Serina, Histidina,
Alanina, Lisozima, Prolina, Ácido aspártico, Treonina, Valina, Isoleucina e Fenilalanina. Os
espectros Raman foram analisados e as atribuições das bandas foram feitas de acordo com a
literatura.
As medidas in vivo da pele foram feitas em 32 voluntárias. A execução deste estudo
foi aprovada pelo Comitê de Ética em Pesquisa da Universidade do Vale do Paraíba seguindo
as Diretrizes e Normas Regulamentadoras de Pesquisa Envolvendo Seres Humanos, conforme
Resolução nº 196/96 do Conselho Nacional de Saúde sob o protocolo nº H48/CEP/2008.
As voluntárias foram selecionadas segundo os critérios de exclusão:

Histórico de patologias epidérmicas e dérmicas,

Histórico de irritação ou sensibilidade a produtos cosméticos,

Voluntárias sob qualquer tipo de tratamento intensivo para envelhecimento,

Voluntárias que apresentassem necessidade de alteração medicamentosa durante o
período de estudo,

Grávidas e/ou lactante.
Após a seleção, elas foram divididas em três grupos em função de sua faixa etária,
independentemente do fototipos da pele (classificação de Fitzpatrick ), sendo eles: Grupo A
de 20 – 23 anos com 11 voluntárias; Grupo B de 39 – 42 anos com 11 voluntárias; e Grupo C
de 59 – 62 anos com 10 voluntárias. Em todos os grupos, as peles das voluntárias foram
medidas três vezes, em pontos diferentes, para cada profundidade de 0 µm (superfície), 30 µm
e 60 µm. Portanto, os espectros Raman apresentados serão a média destes três pontos em sua
respectiva profundidade.
Os espectros Raman da pele foram divididos em 9 regiões espectrais. O cálculo da
área de cada região levou em consideração uma determinada biomolécula, sendo elas:

Região 1: 781 – 849 (cm-1): pico em 809 cm-1 Tirosina

Região 2: 849 – 887 (cm-1): pico em 875 cm-1  Ácido Pirrolidônico

Região 3: 887 – 1005 (cm-1): pico em 930 cm-1  Colesterol e carotenóides

Região 4: 1005 – 1087 (cm-1): pico em 1041 cm-1  Lipídeos

Região 5: 1087 – 1167 (cm-1): pico em 1139 cm-1 Lipídeos

Região 6: 1167 – 1225 (cm-1): pico em 1216 cm-1  Tirosina e Fenilalanina

Região 7: 1225 – 1355 (cm-1): pico em 1283 cm-1  Amida III

Região 8: 1355 – 1483 (cm-1): pico em 1441 cm-1  Lipídeos e Proteínas

Região 9: 1483 – 1707 (cm-1): pico em 1637 cm-1 amida I
Depois de obtidos os espectros dos constituintes do NMF e os espectros de pele das
voluntárias foram feitas a correlação da prolina e do ácido carboxílico da pirrolidona e
também se analisou as alterações em relação a faixa etária e profundidade.
5
MÉTODOS
5.1 Procedimento Experimental - Medida Raman dos Aminoácidos
A fonte de excitação foi um laser com comprimento de onda igual a 785 nm (Sacher
Laser Technik). A potência máxima de saída no laser foi de 110 mW e a potência na amostra
igual a 25 mW. O Espectrômetro foi o PiActon Spectra Pro 2500i, acoplado a um detector de
CCD (Charge Coupled Device) resfriado por nitrogênio líquido. A resolução espectral do
sistema é de 7 cm-1 e a grade de difração utilizada foi a de 300 gr/mm.
Para melhor acomodação dos aminoácidos, estes foram colocados em um porta
amostras e a medida foi feita em duas regiões e posteriormente calculou-se a média dos
espectros. O tempo total de integração foi igual à 120 segundos, ou seja, 60 segundos e 2
acumulações em cada ponto da amostra, e com exceção do ácido carboxílico da pirrolidona
que teve tempo de 20 segundos e 2 acumulações para cada ponto.
Após a obtenção dos espectros, fizeram-se a subtração da fluorescência utilizando uma
rotina matemática do software Matlab 6.1. Nesta rotina, pode-se determinar o grau do
polinômio e a faixa espectral de interesse. Desta forma foi escolhido polinômio de grau 6 e a
região espectral entre 750 cm-1 a 1800 cm-1 para a linha de base (que é a faixa espectral de
análise para a grade de 300 gr/mm). Uma vez tendo os espectros com a fluorescência
subtraída realizou-se a normalização e cálculo da média dos espectros utilizando o programa
Origin 7.5.
5.2 Procedimento Experimental - Medida Raman “in vivo”
Antes de iniciar as avaliações da pele, a voluntária ficou em ambiente climatizado a
23ºC e umidade relativa de aproximadamente 51% durante 15 minutos e fez-se a assepsia do
local com algodão embebido em 1,0 ml de álcool etílico 97%.
As avaliações da pele foram realizadas no Laboratório de Espectroscopia Vibracional
Biomédica da Univap por uma sonda Raman Confocal Jobin Yvon utilizando um laser de
785nm como energia de excitação e uma objetiva de 50X (Figura 9 e 10). O sinal Raman foi
coletado por um CCD acoplado a um espectrômetro PiActon Spectra Pro 2500i. A potência
na pele foi de aproximadamente 27mW, as medidas foram feitas com 4 acumulações de 30
segundos. A coleta do sinal Raman foi realizada nas profundidades de 0, 30, 60 µm na parte
inferior do antebraço com 3 espectros em cada região (conforme indicado na figura 10).
A fluorescência foi subtraída por ajuste de curva polinomial de grau 6 e os espectros
resultantes foram normalizados em relação ao modo vibracional das proteínas / lipídeos em
1445 cm-1.
Figura 10: Sonda Confocal Jobin Yvon utilizando um laser de 785 nm como energia de excitação e uma
objetiva de 50X (LEVB).
6
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Os resultados e discussões serão apresentados em duas partes. A primeira são os
espectros Raman dos principais constituintes do NMF, em sua forma pura. Na segunda serão
analisados os espectros da pele e a identificação das principais biomoléculas nas faixas
espectrais na qual foram divididos.
6.1 Espectros Base dos Aminoácidos
Embora tenham sido analisados 14 aminoácidos e uma enzima, apenas alguns deles
puderam ser associados ao processo de envelhecimento da pele. Os espectros do ácido
carboxílico da pirrolidona (PCA) e da prolina foram de extrema importância na identificação
de alguns picos que puderam ser correlacionados com o processo de envelhecimento.
Além disso, existe um interesse considerável na capacidade do PCA e seus derivados
de hidratar o estrato córneo, utilizando produtos cosméticos contendo o sal sódico deste
composto com a função de melhorar a pele seca e escamosa (WALTERS; ROBERTS, 2008).
Paralelamente, estudaram-se alguns picos da prolina visto que esta exerce forte influencia na
constituição do colágeno (PHILLIPS et al 1994).
As figuras 11 a 25 mostram os espectros Raman obtidos dos principais constituintes
do NMF e as tabelas 2 a 16 as atribuições de suas bandas (substâncias puras, comerciais).
Embora os espectros possuam vários picos, as tabelas mostram apenas os picos identificados
na literatura. Para uma caracterização completa do espectro é necessário, através de
programas, simular os movimentos vibracionais das moléculas destes compostos.
1001.69
6.1.1 Fenilalanina
0.8
1600.795
1441.14
1406.657
1311.944
1340.364
1158.987
1033.512
912.377
0.2
953.641
0.4
1215.565
0.6
827.114
Intensidade (u.a)
1.0
0.0
800
1000
1200
1400
1600
1800
-1
Deslocamento Raman (cm )
Figura 11: Espectro Base de Fenilalanina
Fonte: Autora
Tabela 2 – Modos Vibracionais Aproximados da Fenilalanina por Espectroscopia Raman
( MARY.; SASIREKHA; RAMAKRISHNAN, 2005 ).
Faixa (cm-1)
Atribuições
827
912
1001
1033
Deformação Simétrica [ NO3]Estiramento C - C
Deformação no plano do anel fenil
Estiramento Simétrico [NO3]- ; Anel aromático fenil no
plano
Deformação no plano do anel fenil grupo CH
Deformação fora de fase do anel Fenil grupo CH;
Torção CH2
Deformação assimétrica [NH3]+; Estiramento no
quadrante do anel fenil
1158
1215
1600
892.536
6.1.2 Glicina
1328.68
0.8
1674.954
1499.746
0.2
1133.078
0.4
1576.908
1405.01
1434.589
0.6
1044.076
Intensidade (u.a)
1.0
0.0
800
1000
1200
1400
-1
1600
Deslocamento Raman (cm )
Figura 12: Espectro Base de Glicina
Fonte: Autora
Tabela 3 – Modos Vibracionais Aproximados da Glicina por Espectroscopia Raman
(BARAN; RATAJCZAK, 2007).
Faixa (cm-1)
892
1328
1434
1674
Atribuições
Estiramento Simétrico do Grupo CCN
Torção CH2
Deformação do grupo CH2
Deformação Assimétrica de NH3
1800
1328.68
1352.024
1624.575
1391.811
1509.452
0.2
1268.191
1089.627
0.4
1186.491
825.285
854.464
0.6
1134.809
923.17
991.055
0.8
1029.986
1.0
Intensidade (u.a)
1446.048
6.1.3 Isoleucina
0.0
800
1000
1200
1400
1600
-1
Deslocamento Raman (cm )
Figura 13: Espectro Base de Isoleucina
Fonte: Autora
Tabela 4 – Modos Vibracionais Aproximados da Isoleucina por Espectroscopia Raman
(NEMEC; MICKA, 2001).
Faixa (cm-1)
1089
1134
1352
1391
1446
Atribuições
Balanço CH3
Estiramento C- C
Deformação CH, NH
Estiramento C- O; Torção de CH2
Deformação assimétrica do CH3
1800
982.169
6.1.4 Lisozima
0.8
0.6
0.4
1072.151
0.2
1155.54
870.812
Intensidade (u.a)
1.0
0.0
800
1000
1200
1400
-1
1600
Deslocamento Raman (cm )
Figura 14: Espectro Base de Lisozima
Fonte: Autora
Tabela 5 – Modos Vibracionais Aproximados da Lisozima por Espectroscopia Raman
(MOVAGASHI; REHMAN; REHMAN, 2007)
Faixa (cm-1)
870
982
1155
Atribuições
Estiramento C – C
Estiramento C – C; β folha; deformação = CH (lipídeos)
Estiramento C – C
1800
935.737
6.1.5 Ornitina
1414.887
1616.66
1254.658
1517.528
0.2
1685.911
1082.643
989.279
0.4
1115.738
901.563
0.6
1333.691
872.625
0.8
777.551
Intensiade (u.a)
1.0
0.0
800
1000
1200
1400
1600
1800
-1
Deslocamento Raman (cm )
Figura 15: Espectro Base de Ornitina
Fonte: Autora
Tabela 6 – Modos Vibracionais Aproximados da Ornitina por Espectroscopia Raman (VIA et
al 2006.)
Faixa (cm-1)
935
1414
1508
6.1.6 Prolina
Atribuições
Estiramento C - C
Estiramento Simétrico COO
Deformação simétrico N- H
897.954
1624.575
1450.952
1375.269
1283.376
1242.789
1174.475
985.725
1548.103
0.2
951.853
0.4
1082.643
0.6
1038.797
843.54
0.8
792.281
Intensidade (u.a)
1.0
0.0
800
1000
1200
1400
1600
-1
Deslocamento Raman (cm )
Figura 16: Espectro Base de Prolina Fonte: Autora
Tabela 7 – Modos Vibracionais Aproximados da Prolina por Espectroscopia Raman
( ZHANG et al 2008; MOVAGASHI, REHMAN, REHMAN 2007).
Faixa (cm-1)
843
897
1038
1082
1174
1242
1283
1450
Atribuições
Balanço CH2
Balanço NH
Sacudida CH2
Carboidratos resíduos de colágeno; ácidos nucléicos
Tirosina, fenilalanina, deformação C – H
Amida III, β folha
Diferença em quantidades de colágeno
Deformação CH2
6.1.7 Ácido aspártico
1800
1414.887
1333.691
935.737
872.625
1616.66
1252.964
1506.219
0.2
1115.738
991.055
0.4
1551.311
0.6
1692.162
1082.643
0.8
777.551
Intensidade (u.a)
1.0
0.0
800
1000
1200
1400
1600
1800
-1
Deslocamento Raman (cm )
Figura 17: Espectro Base de Ácido Aspártico
Fonte: Autora
Tabela 8 – Modos Vibracionais Aproximados do Ácido Aspártico por Espectroscopia Raman
(RAJKUMAR; RAMAKRISHNAN; RAJARAM, 1998)
Faixa (cm-1)
872
935
1082
1252
1414
1692
Atribuições
Deformação assimétrica NO3
Estiramento C – C
Estiramento Simétrico C – N
Torção CH
Deformação CH
Deformação assimétrica NH3+
901.563
6.1.8 PCA 1.0
0.6
1222.384
980.39
0.2
1082.643
1454.219
0.4
1022.928
Intensidade (u.a)
0.8
0.0
800
1000
1200
1400
1600
1800
-1
Deslocamento Raman (cm )
Figura 18: Espectro Base de PCA
Fonte: Autora
Tabela 9 – Modos Vibracionais Aproximados do PCA por Espectroscopia Raman (BILLES;
GEIDEL, 1997)
Faixa (cm-1)
901
980
1082
1290
1454
Atribuições
Estiramento do anel; Deformação do anel CH
Deformação do anel CH
Deformação do anel CH; Deformação do grupo metil CH
Estiramento do anel; Deformação do anel CH
Deformação do anel CH
854.464
6.1.9 Serina
1323.664
1089.627
0.2
1460.746
1418.176
969.706
919.575
0.4
1220.68
0.6
1126.149
1010.554
0.8
812.473
Intensidade (u.a)
1.0
0.0
800
1000
1200
1400
1600
-1
Deslocamento Raman (cm )
Figura 19: Espectro Base de Serina
Fonte: Autora
Tabela 10 – Modos Vibracionais Aproximados da Serina por Espectroscopia Raman
(JARMELO et al 2007, MOVAGASHI, REHMAN, REHMAN 2007).
Faixa (cm-1)
612
812
854
969
1220
1323
1418
1460
1624
Atribuições
Deformação COOBalanço COOEstiramento Cα – C
Estiramento CN
Amida III
Guanina
Estiramento simétrico COODeformação CH2
Deformação assimétrica NH3+
1800
1450.952
944.696
1.0
1626.157
1509.452
1268.191
1186.491
1065.146
1029.986
901.563
0.4
1124.415
0.6
1393.463
0.8
849.004
Intensidade (u.a)
1347.03
6.1.10 Valina
0.2
0.0
800
1000
1200
1400
1600
Deslocamento Raman (cm-1)
Figura 20: Espectro Base de Valina
Fonte: Autora
Tabela 11 – Modos Vibracionais Aproximados da Valina por Espectroscopia Raman
(PANDIARAJAN et al 2005, MOVAGASHI, REHMAN, REHMAN, 2007)
Faixa (cm-1)
944
1065
1347
1450
1626
Atribuições
Estiramento simétrico ClO2
Estiramento simétrico C –N
Deformação β C – H
Deformação CH2
Deformação simétrica H2O
1800
1114.001
870.812
930.355
1638.793
1548.103
1454.219
1251.27
0.2
1189.919
1040.557
0.4
1597.616
0.6
1414.887
0.8
905.17
Intensidade (u.a)
1.0
1340.364
6.1.11 Treonina
0.0
1000
1200
1400
1600
1800
-1
Deslocamento Raman (cm )
Figura 21: Espectro Base de Treonina
Fonte: Autora
Tabela 12 – Modos Vibracionais Aproximados da Treonina por Espectroscopia Raman
(PAWLUKOJC et al 2001).
Faixa (cm-1)
1114
1251
1340
1414
1454
1548
1597
1638
Atribuições
Balanço CH3
Deformação OH
Balanço CH
Deformação simétrica NH3
Deformação assimétrica CH3
Deformação assimétrica NH3
Deformação assimétrica NH3
Estiramento assimétrico CO2
1318.645
6.1.12 Histidina
0.8
1640.37
1570.52
1406.657
1431.31
1498.127
1271.569
1227.492
1174.475
1061.64
971.488
923.17
0.2
854.464
0.4
1089.627
1114.001
1143.456
0.6
806.973
Intensidade (u.a)
1.0
0.0
800
1000
1200
1400
1600
1800
-1
Deslocamento Raman (cm )
Figura 22: Espectro Base de Histidina
Fonte: Autora
Tabela 13 – Modos Vibracionais Aproximados da Histidina por Espectroscopia Raman
(PETROSYAN, 2007; MOVAGASHI; REHMAN; REHMAN, 2007).
Faixa (cm-1)
Atribuições
971
1061
1318
1406
1640
Estiramento C – C
Deformação no plano C – C
Guanina (anel aromático de bases de DNA/RNA); deformação
C – H; Amida III α - hélice
Estiramento simétrico COOEstiramento assimétrico COO-, Amida I
1358.675
0.8
0.0
800
1596.026
1460.746
1409.951
1234.296
1146.911
1114.001
1019.395
0.4
0.2
1303.557
0.6
919.575
Intensidade (u.a)
1.0
850.825
6.1.13 Alanina
1000
1200
1400
1600
-1
Deslocamento Raman (cm )
Figura 23: Espectro Base de Alanina
Fonte: Autora
Tabela 14 – Modos Vibracionais Aproximados da Alanina por Espectroscopia Raman
( ROSADO; DUARTE; FAUSTO, 1997).
Faixa (cm-1)
773
850
919
1019
1114
1303
1409
1469
Atribuições
Estiramento CN
Estiramento C-COO
Balanço NH3
Balanço CH3
Balanço CH3
Torção CH2
Estiramento simétrico COO
Deformação assimétrica CH3
1800
1450.952
1342.032
1296.838
1065.146
991.055
0.2
1632.479
1491.645
1576.908
1418.176
0.4
1254.658
1174.475
941.114
0.6
908.775
0.8
854.464
Intensidade (u.a)
1.0
1120.946
6.1.14 Citrulina
0.0
800
1000
1200
1400
1600
1800
-1
Deslocamento Raman (cm )
Figura 24: Espectro Base de Citrulina
Fonte: Autora
Tabela 15 – Modos Vibracionais Aproximados da Citrulina por Espectroscopia Raman
(JINNAH; SASIREKHA; RAMAKRISHNAN, 2005; MOVAGASHI; REHMAN;
REHMAN, 2007).
Faixa (cm-1)
854
941
1065
1120
1296
1342
1450
1576
1710
Atribuições
Anel aromático tirosina
Modo esqueletal (polissacarídeos, amilose)
Ácido palmítico, ácido graxos
Banda forte C – O
Deformação CH2
Guanina (DNA/RNA), Deformação CH
Deformação CH2
Ácido nucléico
Estiramento C=O
982.169
6.1.15 Arginina
1189.919
1268.191
1029.986
0.4
923.17
1311.944
0.6
1439.503
1079.148
0.8
867.183
Intensidade (u.a)
1.0
801.468
0.2
0.0
800
1000
1200
1400
1600
-1
Deslocamento Raman (cm )
Figura 25: Espectro Base de Arginina
Fonte: Autora
Tabela 16 – Modos Vibracionais Aproximados da Arginina por Espectroscopia Raman
(PETROSYAN; SUKIASYAN, 2008; MOVAGASHI, REHMAN, REHMAN 2007).
Faixa (cm-1)
923
982
1079
Atribuições
COOHEstiramento C - C
Estiramento C – N
1800
6.2 Espectro Raman da Superfície da Pele
A figura 26 mostra o espectro médio característico da superfície da pele dividido em
nove regiões e cada região com um pico que foi levado em consideração e a biomolécula
correspondente.
Figura 26: Espectro Raman Médio característico da superfície da pele
De acordo com a tabela 17 as bandas centradas aproximadamente em 808 cm-1,
839 cm-1, 1217 cm-1 e 1591 cm-1, correspondem à presença de tirosina na pele que é
responsável pela síntese de melanina. A presença da enzima tirosinase, concentrada no
aparelho de golgi dos melanócitos é responsável pela produção de tirosina. O pigmento é
originado a partir da polimerização do aminoácido tirosina por intermédio da ação da
tirosinase, a qual passa de um aminoácido incolor a um pigmento castanho. A tirosina
polimerizada deposita-se em vesículas denominadas melanossomas, as quais se deslocam
pelos prolongamentos citoplasmáticos dos melanócitos, sendo transferidos para os
queratinócitos através de um processo de secreção citócrina (de célula para célula). Os
grânulos de melanina permanecem no citoplasma dos queratinócitos (OLIVEIRA, ROCHA,
GUILLO, 2004).
O pico centrado em 874 cm-1 refere-se à presença de ácido pirrolidônico, que é um dos
principais constituintes do NMF da pele (CASPERS, 1999; PENTEADO, 2008; TFAYLI et
al 2007).
Tabela 17: Modos Vibracionais da Pele (CASPERS, 1999; PENTEADO, 2008; TFAYLI et
al 2007).
POSIÇÃO DO
ESTRUTURA
ATRIBUIÇÃO
808
δ(CCH) alifático
Tirosina
839
δ(CCH) aromático
Tirosina
874
v (CC); v (CN), PCA
Ác. Pirrolidônico
930
v (CC) α- hélice
Carotenóides e colesterol
985
δ(CCH)
Oleofinas
1040
v (CC) cadeia random
Lipídeos
1141
v (CC) cadeia trans
Lipídeos
PICO (cm-1)
1217
Tirosina e Phe
1249
δ(CH2) wag; δ(CN)
Amida III desordem
1283
v (CN), δ(NH)
Amida III α- hélice
1293
δ(CH2)
1398
δ(CH3)
NMF
1440
δ(CH2)
Lipídeos e Proteínas
1557
v (C=C)
Oleofinas
1591
v (C=C)
Oleofinas, Tirosina e Phe
1636
v (C=O)
Amida I α- hélice
v: estiramento; δ: deformação
Em 930cm-1 é atribuída a presença de carotenóides na pele. Lademann et al (2009)
demonstraram um método não invasivo para a determinação in vivo de carotenóides na pele
humana e observaram que os indivíduos com altos níveis de carotenóides têm menos sulcos e
rugas que aqueles com menores níveis de antioxidantes. Os carotenóides não podem ser
produzidos pelo organismo, eles precisam ser incorporados na dieta rica em frutas e legumes.
Em 985 cm-1, 1040 cm-1 e 1141 cm-1 atribui-se à presença de lipídeos e colesterol na
pele que exercem uma importante função de barreira no estrato córneo, e sua integridade e
organização são fundamentais para prevenir o aumento da perda de água transepidérmica
(CASPERS, 1999; PENTEADO, 2008; TFAYLI et al 2007).
Os picos centrados em 1249 cm-1, 1283 cm-1 e 1293 cm-1 referem-se à banda de
Amida III que é relacionada ao precursor do colágeno (procolágeno) (CASPERS, 1999;
PENTEADO, 2008; TFAYLI et al 2007).
Em 1398 cm-1 encontra-se o pico do NMF o qual é composto por moléculas de baixo
peso molecular, higroscópicas, prevenindo assim a evaporação da água. Essas moléculas são
principalmente aminoácidos, o ácido pirrolidônico carboxílico, lactato de sódio, ácido lático e
uréia (CASPERS, 1999; PENTEADO, 2008; TFAYLI et al 2007).
A banda de 1440 cm-1 refere-se à presença de lipídeos e proteínas na pele que
apresentam como função impermeabilizar a pele prevenindo perda de água (CASPERS, 1999;
PENTEADO, 2008; TFAYLI et al 2007).
Em 1557 cm-1 e 1591 cm-1 encontram-se as oleofinas, fenilalanina e tirosina,
respectivamente (CASPERS, 1999; PENTEADO, 2008; TFAYLI et al 2007).
O pico posicionado em 1636 cm-1 é referente à amida I atribuída ao colágeno
(MOVAGASHI, REHMAN, REHMAN 2007). Os modos vibracionais característicos da
amida I são estiramento C=O, com menor contribuição de deformação de N – H (CHOI;
CHO, 2009).
6.3 Média dos Espectros do Grupo A: 0 µm, 30 µm, 60 µm.
As áreas dos espectros médios foram calculadas em diferentes regiões, e cada região
corresponde a biomoléculas com funções na pele. As atribuições de cada pico e banda
encontram-se figura 26 e Tabela 17.
Os cálculos de área fornecem informações sobre o aumento ou diminuição relativa na
quantidade de distintas biomoléculas da pele. A figura 27 mostra a média dos espectros do
grupo A nas três profundidades.
Intensidade (u.a.)
1.2
Profundidade
m
m
m
0.9
0.6
0.3
0.0
800
1000
1200
1400
1600
1800
-1
Deslocamento Raman (cm )
Figura 27: Média dos Espectros do Grupo A
Tabela 18: Cálculo das áreas integradas sob a curva do espectro do Grupo A nas
profundidades: 0 µm, 30 µm e 60 µm.
Regiões
(GRUPO A)
1
2
3
4
5
6
7
8
9
Faixa
Espectral
781 - 849
849 - 887
887 - 1005
1005 - 1087
1087 - 1167
1167 - 1225
1225 - 1355
1355 - 1483
1483- 1707
0 µm
3,37±1,01
0,79±0,11
9,33±1,02
8,07±0,76
7,34±1,03
2,72±0,52
33,38±1,23
47,97±8,42
107,78±6,29
Profundidade
30 µm
3,72±0,94
1,12±0,17
11,75±0,98
7,78±0,49
4,69±0,82
1,98±0,38
35,92±1,47
50,03±8,78
118,51±9,04
60 µm
3,37±0,78
1,26±0,19
12,32±0,89
8,77±0,46
5,26±0,61
1,68±0,21
34,58±1,52
51,12±9,70
116,60±11,52
6.4 Média dos Espectros do Grupo B: 0 µm, 30 µm, 60 µm.
A figura 28 mostra a média dos espectros do grupo B nas três profundidades.
1.4
Intensidade (u.a.)
1.2
Profundidade
0 m
30 m
60 m
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
0.0
800
1000
1200
1400
-1
Deslocamento Raman (cm )
1600
1800
Figura 28: Média dos Espectros do Grupo B
Tabela 19: Cálculo das áreas integradas sob a curva do espectro do Grupo B nas
profundidades: 0 µm, 30 µm e 60 µm.
Regiões
(GRUPO B)
1
2
3
4
5
6
7
8
9
Faixa
Espectral
781 - 849
849 - 887
887 - 1005
1005 - 1087
1087 - 1167
1167 - 1225
1225 - 1355
1355 - 1483
1483- 1707
0 µm
2,96±0,43
2,11±0,26
9,50±0,61
7,33±0,47
6,54±0,62
2,61±0,35
36,73±1,31
53,37±9,44
102,97±5,87
Profundidade
30 µm
3,48±0,41
1,54±0,24
10,41±1,01
6,64±0,64
5,76±1,22
1,91±0,44
36,34±1,63
52,25±9,94
107,76±8,33
60 µm
3,36±0,33
1,32±0,24
12,77±1,63
7,87±0,50
5,45±0,91
1,70±0,24
34,33±1,15
50,79±11,37
110,97±5,68
6.5 Média do Espectro do Grupo C: 0 µm, 30 µm, 60 µm.
A figura 29 mostra a média dos espectros do grupo C nas três profundidades.
1.4
Intensidade (u.a.)
1.2
1.0
Profundidade
0 m
30 m
60 m
0.8
0.6
0.4
0.2
0.0
800
1000
1200
1400
1600
1800
-1
Deslocamento Raman (cm )
Figura 29: Média dos Espectros do Grupo C
Tabela 20: Cálculo das áreas integradas sob a curva do espectro do Grupo C nas
profundidades: 0 µm, 30 µm e 60 µm.
Regiões
(GRUPO C)
1
2
3
4
5
6
7
8
9
Faixa
Espectral
781 - 849
849 - 887
887 - 1005
1005 - 1087
1087 - 1167
1167 - 1225
1225 - 1355
1355 - 1483
1483- 1707
0 µm
4,91±0,42
2,25±0,44
11,65±1,13
9,47±0,93
7,39±0,96
5,31±0,79
39,83±1,98
50,85±6,75
105,60±6,63
Profundidade
30 µm
5,54±1,35
2,46±0,49
13,93±1,09
10,77±1,36
6,98±1,64
5,46±1,25
37,49±2,03
44,19±6,29
106,12±5,96
60 µm
4,80±0,63
1,85±0,31
15,10±1,45
10,60±1,58
6,82±1,34
4,19±0,74
36,13±1,08
46,13±9,60
116,53±10,77
Os dados obtidos pelo cálculo das áreas para cada região espectral, profundidade e grupos
são melhores visualizados nos gráficos abaixo.
6.6 Análise das áreas por faixas espectrais correlacionadas às faixas etárias e
profundidades.
6.6.1 Faixa: 781 – 849 (cm-1)
A figura 30 mostra os valores de área calculados para os três grupos nas três
profundidades estudadas. A barra indica o desvio padrão e o ponto o valor da área média,
onde a linha, meramente ilustrativa, mostra a tendência das áreas em função da profundidade.
A área de maior valor acontece em 30 μm para os três grupos.
Grupos:
A
B
C
6.5
6.0
Área (u.a.)
5.5
5.0
4.5
4.0
3.5
3.0
2.5
0
10
20
30
40
Profundidade (m)
50
60
Figura 30: Valor da área dos três grupos, nas três profundidades.
O grupo C apresenta uma área em torno de 50% maior que o grupo A e 58% em
relação ao grupo B. Esses valores foram encontrados através da diferença relativa para a
profundidade de 30 μm em todas as faixas do espectro de pele nos 3 grupos etários.
Nota-se também a existência de uma convergência entre o grupo A e B em 60 μm. No
entanto, não é possível afirmar que esta convergência permaneça para profundidades maiores
de 60 μm e constata-se que a área em A é maior que em B e menor que em C.
Nessa faixa espectral o pico principal levado em consideração foi o 809 cm-1 atribuído
à presença de tirosina, relacionado à melanina na pele e, conforme mostrado na figura 30, o
grupo C apresentou uma área maior que os demais. Este efeito pode estar relacionado ao
aumento da idade que leva a uma maior concentração desse pigmento, podendo ser
responsável pelas manchas e hipercromias (NICOLETTI et al 2002).
6.6.2
Faixa: 849 – 887 (cm-1)
A figura 31 mostra os valores de área calculados para os três grupos nas três
profundidades estudadas. A barra indica o desvio padrão e o ponto o valor da área média,
onde a linha, meramente ilustrativa, mostra a tendência das áreas em função da profundidade.
O grupo C apresenta uma área em torno de 120% maior que o grupo A e 59% em
relação ao grupo B a 30 μm, ou seja, a área em B é maior em A e menor que em C.
Grupos:
A
B
C
3.0
Area (u.a)
2.5
2.0
1.5
1.0
0.5
0
10
20
30
40
50
60
Profundidade (m)
Figura 31: Valor da área dos três grupos, nas três profundidades.
Nessa faixa espectral o pico levado em consideração foi o 875 cm-1 atribuído à
presença de ácido pirrolidônico na pele. Conforme mostrado na figura 31 o grupo C
apresentou uma área maior que os demais, sendo que o ácido pirrolidônico é um dos
principais constituintes do NMF e com o aumento da idade a pele torna-se mais seca. A
incidência e gravidade da xerose aumenta com a idade (ENGELKE et al., 1997; BERRY;
CHARMEIL;GOUJON,1999). Contrariando os resultados desta pesquisa Harding, Watkinson
e Rawlings (2000), relatam que a pele envelhecida tem níveis menores de NMF, refletindo,
principalmente, a redução da produção do NMF devido à reduzida síntese de profilagrina.
Provavelmente a redução do NMF determina o declínio da função barreira relacionada com a
idade (RAWLINGS, HARDING, 2004).
6.6.3
Faixa: 887 – 1005 (cm-1)
A figura 32 mostra os valores de área calculados para os três grupos nas três
profundidades estudadas. A barra indica o desvio padrão e o ponto o valor da área média,
onde a linha, meramente ilustrativa, mostra a tendência das áreas em função da profundidade.
Vale salientar que para as bandas 781- 849 cm-1 e 849- 887cm-1 o grupo C apresentava
um tendência de uma curvatura e agora apresenta-se na forma de uma reta crescente. Os
grupos A e B têm tendências semelhantes porque apresentam dois pontos que se interceptam,
e mais uma vez o grupo C apresentou uma área maior que os demais grupos,
aproximadamente 18% maior que o A e 34% maior que B, ou seja, a área em A é próxima a
de B e menor que C.
17
16
15
Grupos:
A
B
C
Area (u.a.)
14
13
12
11
10
9
8
0
10
20
30
40
50
60
Profundidade (m)
Figura 32: Valor da área dos três grupos, nas três profundidades.
Nessa faixa, o pico levado em consideração foi o 930 cm-1 atribuído à presença de
colesterol e carotenóides, e observa-se que de acordo com o aumento da profundidade,
aumenta área do pico em consideração, o que se deve à maior concentração na derme.
Considerando a faixa etária, os carotenóides deveriam ter uma maior concentração nos grupos
A e B e não no grupo C já que este tipo de antioxidante representa a defesa do organismo.
Nesta região é observado o pico em 901 cm-
1
do PCA refere-se ao estiramento e
deformação do anel CH (BILLES.; GEIDEL, 1997). Nos grupos A, B e C observa-se que a
área aumentou nessa região com o aumento da profundidade.
Observa-se que, de acordo com o aumento da idade, há um aumento da área sob a
curva. Os achados de HARDING et al (2003) contrariam os resultados encontrados, pois
estudando seres humanos com idades entre 20 e 70 anos, por meio do emprego da técnica da
remoção do estrato córneo com fitas adesivas, foi observada a diminuição da concentração de
PCA no estrato córneo com o aumento da idade.
6.6.4
Faixa: 1005 – 1087 (cm-1)
A figura 33 mostra os valores de área calculados para os três grupos nas profundidades
estudadas. A barra indica o desvio padrão e o ponto o valor da área média, onde a linha,
meramente ilustrativa, mostra a tendência das áreas em função da profundidade.
No gráfico da figura 33, o grupo C volta a apresentar uma curvatura negativa. Os
grupos B e C apresentam curvaturas positivas dispostas de forma aproximadamente paralela,
ou seja, não se verifica uma convergência para pontos próximos à superfície e nem da
profundidade de 60 µm.
12
11
Grupos:
A
B
C
Area (u.a.)
10
9
8
7
6
0
10
20
30
40
Profundidade (m)
50
60
Figura 33: Valor da área dos três grupos, nas três profundidades.
O grupo C apresenta uma área em torno de 38% maior que A e 62% maior que B, isso
significa que a área em A é maior que B e menor que C.
Nessa faixa o pico levado em consideração foi o 1041 cm-1 atribuído à presença de
lipídeos. Pode-se observar um aumento da área de acordo com a profundidade. E segundo
Bowstra et al (1998) as pessoas mais velhas apresentariam uma diminuição de lipídeos no
estrato córneo que se deve a limitações funcionais que ocorrem na pele, incluindo o "turn
over" celular reduzido na epiderme, que resulta na deficiência funcional das células
envelhecidas, e conseqüentemente diminuição da síntese de lipídeos.
6.6.5
Faixa: 1087 – 1167 (cm-1)
A figura 34 mostra os valores de área calculados para os três grupos nas três
profundidades estudadas. A barra indica o desvio padrão e o ponto o valor da área média,
onde a linha, meramente ilustrativa, mostra a tendência das áreas em função da profundidade.
O grupo C apresenta uma área em torno de 49% maior que A e 21% maior que B,
constatando que a área em B é maior que em A e menor que em C.
9.0
Grupos:
A
B
C
8.5
8.0
Area (u.a.)
7.5
7.0
6.5
6.0
5.5
5.0
4.5
4.0
3.5
0
10
20
30
40
50
Profundidade (m)
Figura 34: Valor da área dos três grupos, nas três profundidades.
60
Nessa faixa o pico levado em consideração foi o 1139 cm-1 atribuído à presença de
lipídeos. Acredita-se que o grupo C apresenta uma área maior que os demais, pois com o
aumento da idade o tecido epitelial perde uma parte de suas reservas nutricionais e capacidade
de adaptação e torna-se mais vulnerável às agressões do meio ambiente. A diminuição da sua
flexibilidade o torna frágil (MIQUEL et al 1985) ele sofre alteração da composição tecidual
corpórea, com redução da massa magra, que tem maior atividade metabólica, e aumento da
quantidade de tecido adiposo, metabolicamente menos ativo (ALENCAR, 1992).
6.6.6
Faixa: 1167 – 1225 (cm-1)
A figura 35 mostra os valores de área calculados para os três grupos nas três
profundidades estudadas. A barra indica o desvio padrão e o ponto o valor da área média,
onde a linha, meramente ilustrativa, mostra a tendência das áreas em função da profundidade.
A figura 35 mostra que a função da área apresenta valores e tendências semelhantes
quando se avalia os grupos A e B, especialmente para profundidades acima de 30 µm, e o
Grupo C apresenta curvatura com uma área 176% maior que A e 163% maior que B, ou seja,
a área em A é próxima a área em B e menor que a área em C.
6.5
Grupos:
A
B
C
6.0
5.5
Area (u.a.)
5.0
4.5
4.0
3.5
3.0
2.5
2.0
1.5
0
10
20
30
40
50
Profundidade (m)
Figura 35: Valor da área dos três grupos, nas três profundidades.
60
Nessa faixa o pico levado em consideração foi o 1216 cm-1 atribuído à presença de
tirosina e fenilalanina. A fenilalanina é um aminoácido essencial que é hidroxilado em
tirosina e, a tirosina por sua vez é relacionada à melanina. O aumento da idade leva a uma
maior concentração desse pigmento no grupo C (NICOLETTI et al 2002).
6.6.7
Faixa: 1225 – 1355 (cm-1)
A figura 36 mostra os valores de área calculados para os três grupos nas três
profundidades estudadas. A barra indica o desvio padrão e o ponto o valor da área média,
onde a linha, meramente ilustrativa, mostra a tendência das áreas em função da profundidade.
O grupo C apresenta uma função aproximadamente retilínea, o grupo A apresenta
curvatura e B uma constante seguida de declínio negativo. O grupo C apresenta uma área 4%
maior que o grupo A e 3% maior que o grupo B.
42
Grupos:
A
B
C
Area (u.a.)
40
38
36
34
32
0
10
20
30
40
50
60
Profundidade (m)
Figura 36: Valor da área dos três grupos, nas três profundidades.
Observa-se uma redução muito pequena da diferença das áreas de C com relação à B e
A em comparação com as diferenças anteriores. Constata-se que a área em B é maior que a
área em A e menor que a área em C.
Nessa faixa o pico levado em consideração foi o 1283 cm-1 atribuído à presença de
amida III, onde se evidencia a banda do aminoácido prolina, que se refere à diferença nas
quantidades do colágeno (MOVAGASHI, REHMAN, REHMAN 2007). As moléculas de
prolina e hidroxiprolina forman ¼ dos aminoácidos do colágeno (CASPERS et al. 1999). No
grupo A o maior valor da área encontra-se na profundidade de 30 μm; no grupo B nas
profundidades de 0 e 30 μm os valores são muito próximo, e maiores que o valor da
profundidade de 60 μm; no grupo C a profundidade de 60 μm apresenta o menor valor e 0 μm
apresenta o maior valor.
Nota-se que o maior valor encontrado da área sob a curva foi no grupo C e na
profundidade de 0 μm. Infere-se que isso ocorra devido ao grupo amino secundário de
resíduos de prolina que tem conformação rígida, reduzindo estruturalmente a flexibilidade das
regiões contendo prolina (NELSON, COX, 2008). Como o grupo C é o de indivíduos de
maior faixa etária pode-se associar as alterações do envelhecimento com a maior área sob a
curva. A epiderme é fina e tem a renovação celular mais lenta, resultando em menor
resistência aos danos externos (LAUBE, 2004).
6.6.8
Faixa: 1355 – 1483 (cm-1)
A figura 37 mostra os valores de área calculados para os três grupos nas três
profundidades estudadas. A barra indica o desvio padrão e o ponto o valor da área média,
onde a linha, meramente ilustrativa, mostra a tendência das áreas em função da profundidade.
Grupos:
A
B
C
65
Area (u.a)
60
55
50
45
40
35
0
10
20
30
40
50
60
Profundidade (m)
Figura 37: Valor da área dos três grupos, nas três profundidades.
O grupo C apresenta-se como uma curvatura positiva ao passo que A e B são retas,
sendo A crescente e B decrescente. O grupo C é 11,7% menor que o grupo A e 15% menor
que o grupo B, ou seja, a área A é maior que em C e menor que em B. Nessa faixa o pico
levado em consideração foi o 1441 cm-1 atribuído à presença de lipídeos e proteínas.
Na epiderme, ocorrem alterações estruturais significativas como – afinamento de todas
as camadas, variando de 10 a 50% entre os 30 e 80 anos. A análise histológica da epiderme
permite constatar que o afinamento da pele está relacionado à diminuição dos queratinócitos,
sem alteração no estrato córneo (BOISNIC, BLANCHET, 2005). Os queratinócitos
aumentam de tamanho com a idade, enquanto a filagrina epidérmica, responsável pela união
dos feixes de queratina, e os lipídios intercelulares, especialmente as ceramidas, diminuem.
Esse decréscimo provoca aumento da secura e da descamação da pele, além de modificações
de sua função de barreira (BOISNIC, BLANCHET, 2005; HADSHIEW, ELLER,
GILCHREST, 2000).
6.6.9 Faixa: 1483 – 1707 (cm-1)
A figura 38 mostra os valores de área calculados para os três grupos nas três
profundidades estudadas. A barra indica o desvio padrão e o ponto o valor da área média,
onde a linha, meramente ilustrativa, mostra a tendência das áreas em função da profundidade.
130
125
Grupos:
A
B
C
Area (u.a.)
120
115
110
105
100
95
0
10
20
30
40
50
60
Profundidade (m)
Figura 38: Valor da área dos três grupos, nas três profundidades.
O grupo C é 10% menor que o grupo A e 1,5% menor que o grupo B, ou seja, a área
em B é próxima a de C e menor que a de A.
Nessa faixa o pico levado em consideração foi o 1637 cm-1 atribuído à presença de
amida I atribuída ao colágeno (MOVAGASHI, REHMAN, REHMAN 2007) e o grupo C é o
que apresenta menor porcentagem, possivelmente devido à menor concentração em
indivíduos com maior idade. Na epiderme envelhecida ocorre o achatamento da junção da
dermo-epidérmica com diminuição das fibras de ancoragem, especialmente de colágeno
(SILVA, CARNEIRO, 2001; BOISNIC, BLANCHET, 2005; TZAPHLIDOU, 2004). A
degradação do colágeno predomina sobre sua síntese, com o aumento das ligações cruzadas e
desorganização das fibras (HADSHIEW, ELLER, GILCHREST, 2000).
7
CONCLUSÃO
A espectroscopia Raman foi efetiva na caracterização dos compostos bioquímicos que
compõe a pele, sendo uma técnica completamente não invasiva excepcionalmente adequada
para estudos de concentrações moleculares.
Houve correlação entre espectros coletados in vivo e alguns dos constituintes do NMF da
pele, onde:
Grupo C: apresentou maior área espectral:
- No pico 809 cm-1 atribuído à presença de tirosina;
- No pico 875 cm-1 atribuído à presença de ácido pirrolidônico;
- No pico 930 cm-1 atribuído à presença de colesterol e carotenóides.
O pico 1441 cm-1 atribuído à presença de lipídeos e proteínas o grupo C foi o que apresentou
uma menor área já que na epiderme envelhecida ocorrem alterações estruturais da pele.
No pico 1637 cm-1 atribuído à presença de amida I, o grupo C, apresentou uma menor área,
possivelmente devido à menor concentração em indivíduos com maior idade já que na
epiderme envelhecida ocorre diminuição das fibras de ancoragem, especialmente de colágeno.
8 TRABALHOS FUTUROS
As sugestões de trabalhos futuros são:
 Simulação do espectro da pele por meio dos espectros Raman dos aminoácidos
medidos, utilizando métodos de regressão linear;
 Quantificação do percentual destes aminoácidos na pele, pelo ajuste da curva teórico e
as medidas dos espectros in vivo;
 Avaliar a penetração de produtos cosmecêuticos na pele, por meio do ajuste do
espectro teórico da pele ao medido.
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