COMPARAÇÃO DAS TÉCNICAS ANALÍTICAS CG-EM E CLAE-EM
NA DETERMINAÇÃO DE ANFETAMINAS E SEUS METABÓLITOS
EM MATRIZES BIOLÓGICAS
Rebecca Farah Valente
Especialista em Química e Farmácia Forense – PUC-GO/IFAR
[email protected]
Alex Fabiano C. Campos
Orientador, Prof. Doutor, Universidade de Brasília
[email protected]
Resumo
Matrizes biológicas, como os fluidos corporais, vêm sendo utilizadas na análise de presença de drogas de abuso.
A urina é comumente utilizada em testes rotineiros, mas meios alternativos estão estabelecendo-se como fontes
de análise. Cabelo, suor e fluidos orais são exemplos de matrizes que têm atingido um nível satisfatório de
credibilidade científica em seu uso. A identificação e a quantização de drogas de abuso em matrizes biológicas
têm sido amplamente realizadas através dos métodos de separação e detecção analíticos de cromatografia
gasosa-espectroscopia de massa (CG-EM) e cromatografia líquida de alta eficiência-espectroscopia de massa
(CLAE-EM). O objetivo desta revisão é apresentar essas técnicas de análise aplicadas à determinação de
anfetaminas e seus derivados em matrizes biológicas.
Palavras-Chave: matrizes biológicas; CG-EM; CLAE-EM; anfetamina.
INTRODUÇÃO
A entrada de drogas ilícitas no país por meio do tráfico de drogas é uma questão de
segurança pública, mas que adentra o campo da saúde. Não há como desvincular o uso de
drogas ilícitas da repressão ao tráfico de drogas e legislações concernentes. O Brasil conta
com políticas nacionais de drogas e legislações que reconhecem a diferença entre traficante,
usuário e dependente, e admitem a necessidade de tratamento diferenciado para cada,
garantindo o tratamento público para aqueles com problemas relacionados ao uso de drogas.
De acordo com dados do Escritório das Nações Unidas sobre Drogas e Crimes (UNODC), a
população mundial é de aproximadamente 6,6 bilhões de pessoas. Estima-se que 4,8% destas
já fizeram uso de drogas em algum momento da vida. A população entre 15 e 64 anos que
apresenta uso problemático de drogas representa 0,6% da população mundial. Deste
percentual, 3,9% são usuárias de maconha; 0,4% de cocaína e derivados; 0,8% de
estimulantes como anfetaminas. (GOLDMAN et al., 2010)
Anfetamina, dextroanfetamina, metanfetamina e seus vários sais, pertencem ao grupo
denominado anfetaminas. Suas propriedades químicas e efeitos são tão semelhantes, que
usuários assíduos têm dificuldade em diferenciá-las. Anfetaminas, frequentemente chamadas
de “rebite” e “bola”, são drogas psicotrópicas estimulantes sintéticas. Uma bastante conhecida
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é o 3,4-metilenodimetoximetanfetamina (MDMA), popularmente chamada de “ecstasy”. A
metanfetamina (MA), que geralmente é administrada por via oral, tem sido consumida na
forma fumada, bem como o “crack” (derivado da cocaína), recebendo o nome de “ice”. Os
efeitos, especialmente da MA, são semelhantes aos da cocaína, mas seu início é lento e sua
duração é longa. Em contraste com a cocaína, que é rapidamente removida do cérebro e é
quase completamente metabolizada, a MA permanece no sistema nervoso central por mais
tempo, e uma grande porcentagem da droga permanece inalterada no corpo, produzindo
efeitos estimulantes prolongados. Os efeitos comumente verificados são os de aumento da
atividade cardíaca e da pressão sanguínea, além de propiciar o surgimento de comportamentos
anormais, tais como: agressividade, irritação, delírio persecutório. Dependendo da dose e da
sensibilidade do usuário, verifica-se o surgimento de paranóias e alucinações, auditivas e
visuais. Estes sintomas psicóticos podem persistir até depois de interrompido o uso da droga.
O chamado “flashback” é a ocorrência de episódios espontâneos, repetitivos ou recorrentes,
marcados pelos sintomas originalmente causados pelo consumo da substância, mas que
ocorrem tempos após o último uso da droga. (DRUGS OF ABUSE, 2005)
De acordo com Diniz (2006), o MDMA, depois de ingerido, é enzimaticamente
metabolizado em cinco metabólitos principais: 3,4-dihidroximetanfetamina (HHMA), 4hidroxi-3-metoximetafetamina (HMMA), 4-hidroxi-3-metoxianfetamina (HMA), metileno3,4-dioxianfetamina (MDA) e 3,4-dihidroxianfetamina (HHA). O MDMA é comercializado
na forma de sal, com ponto de fusão de aproximadamente 148-149 °C. Por se tratar de uma
molécula quiral, apresenta enantiômeros que possuem afinidades díspares com as enzimas
responsáveis por seu metabolismo, apresentando diferentes velocidades de conversão em seus
metabólitos, e efeitos desiguais no organismo. O MDMA e seus metabólitos apresentam
sínteses que geram impurezas características consoantes com seus métodos de preparação. A
análise destas impurezas permite indicar a localização geográfica do laboratório de síntese e
rota de distribuição, o que possibilita o combate ao tráfico de drogas. Os métodos de análise
mais recorrentes são os de cromatografia gasosa ou líquida com espectrometria de massas.
Skoog (2009) ensina que a cromatografia é um método bastante utilizado na
separação, identificação e determinação de misturas complexas, a exemplo das anfetaminas e
seus metabólitos em matrizes biológicas. Nas separações cromatográficas, a amostra é
transportada por uma fase móvel - um gás, um líquido ou um fluído supercrítico - e forçada a
passar por uma fase estacionária no interior de uma coluna. As duas fases são escolhidas de
modo que os componentes da amostras difundam-se nas fases móvel e estacionária de forma
variada. Os componentes que possuem maior afinidade com a fase estacionária permanecem
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retidos nesta por mais tempo, diminuindo sua velocidade com relação ao fluxo da fase móvel.
Contrapartida, os componentes que possuem menor afinidade com a fase estacionária movemse mais rapidamente. As diferentes velocidades de migração dos componentes da amostra
permitem a separação destes em bandas ou zonas discretas.
Usualmente, um espectrômetro de massas (EM) é utilizado como detector nas técnicas
cromatográficas. Quando se emprega a cromatografia gasosa, esta combinação é chamada de
CG-EM. O EM é acoplado ao final da coluna cromatográfica, de onde os componentes
previamente separados emergem diretamente para a câmara de ionização. As fontes de
ionização mais comumente utilizadas são as de impacto de elétrons e de ionização química.
As moléculas dos componentes são, então, fracionadas e seguem para o analisador de massas,
onde são detectadas e identificadas. Geralmente, quadrupolos e armadilhas de íons são
utilizados como analisadores de massas. (SKOOG, 2009)
O entendimento das técnicas de análise empregadas na determinação de drogas de
abuso e da preparação da amostra que se quer analisar é de extrema importância. A presente
demanda por resultados rápidos, precisos e exatos justifica o aprimoramento de técnicas, para
que sejam cada vez menos trabalhosas e dispendiosas. Faz-se necessário, portanto, um estudo
das limitações e do alcance destas técnicas. Neste contexto, objetiva-se, com esta revisão
bibliográfica, apresentar e discutir os principais métodos de análise de anfetaminas e seus
metabólitos empregados na atualidade.
METODOLOGIA
Com a proposta de verificar a eficiência e eficácia de métodos de análise, foi
selecionado um conjunto de dez artigos com enfoque nas técnicas de cromatografia gasosa
(CG) e cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE), associadas à espectroscopia de massa
(EM). Maior importância foi dada aos resultados no que diz respeito aos métodos aplicados,
identificando suas diferenças e seus potenciais analíticos.
Nas análises em que se fez uso da CG, as separações ocorreram através de colunas
capilares DB-5 (fenildimetilpolisiloxano: 5% de radical fenil e 95% de radical metil), DB-1ms
(dimetilpolisiloxano: 100% de radical metil) e ZB-50 (fenildimetilpolisiloxano: 50% de
radical fenil e 50% de radical metil), DB-17ms (fenildimetilpolisiloxano: 50% de radical fenil
e 50% de radical metil), HP-5ms (fenildimetilpolisiloxano: 5% de radical fenil e 95% de
radical metil), DB-35ms (fenildimetilpolisiloxano: 35% de radical fenil e 65% de radical
metil) como fases estacionárias. As polaridades das colunas variaram de apolar à polaridade
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intermediária. O gás hélio foi utilizado como fase móvel. Rampas de aquecimento foram
utilizadas, em que a temperatura é aumentada gradativamente. Os intervalos de temperatura
foram: 100 – 210°C (DB-5); 70 – 195°C (DB-1ms) e 100 – 275°C (ZB-50); 70 – 320°C (DB17ms); 100 – 310°C (HP-5ms); 70 – 300°C (DB-35ms). As amostras analisadas – cabelo,
sangue, urina e cérebro – passaram por uma preparação. Injetou-se alíquotas de 1-3µL das
amostras derivatizadas no sistema CG-EM para análise. (W. R. GRACE & CO, 2010;
KOLBRICH; LOWE; HUESTIS, 2008; MENG et al., 2009; PETERS et al., 2005; PIRNAY;
ABRAHAM; HUESTIS, 2006; SCHEIDWEILER; BARNES; HUESTIS, 2008)
No uso da CLAE, as separações ocorreram através de colunas empacotadas de fase
reversa C18 (octadecilsilano) e 300-SCX (ácido sulfônico como ligante). Todas as corridas em
CLAE ocorreram em temperaturas entre 22 – 40°C de forma isocrática ou por gradiente de
eluição. As amostras utilizadas nestes experimentos foram: cordão umbilical (coluna C 18 com
eluição isocrática polar); fluidos orais (coluna C18 com eluição por gradiente, aumentando a
polaridade); sangue (coluna C18 com eluição por gradiente, aumentando a polaridade); e
sangue (coluna 300-SCX com eluição isocrática polar). Para estas análises, as amostras foram
preparadas, sem a necessidade de tornarem-se voláteis ou termoestáveis, uma vez que esta
técnica não requer tal comportamento. As alíquotas injetadas no sistema CLAE-EM variaram
de acordo com a amostra e com o tratamento aplicado. Não houve qualquer menção à pressão
aplicada à coluna empacotada durante a eluição dos solutos. (BADAWI et al., 2009; BJØRK
et al., 2009; JONES et al., 2009; MUELLER et al., 2009; SERGI et al., 2008)
Uma vez separados os componentes das amostras, iniciou-se o processo de detecção e
identificação destes. Para a CLAE a ionização do eluato ocorreu via eletronebulização.
Enquanto que para a CG, ocorreu por impacto de elétrons e ionização química. Todos os
instrumentos EM utilizados possuíam quadrupolos como seletores de massas, onde os íons
foram selecionados antes de atingir o detector. Padrões internos deuterados análogos aos
componentes que se queria detectar foram adicionados às amostras.
FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA
Wong e Tse (2005) relatam que matrizes biológicas são misturas complexas que têm
sido amplamente utilizadas na análise de abuso de drogas, e oferecem diferentes informações
sobre tempo e extensão da exposição do usuário. O método utilizado para análise de drogas
depende dos resultados que se quer obter e das drogas que se quer encontrar. As técnicas
podem ser utilizadas sequencialmente para detecção, identificação e quantificação de drogas
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presentes em matrizes biológicas. A maneira como a droga é administrada, sua dosagem e sua
metabolização estão fortemente relacionadas com a presença e quantidade da droga e/ou seus
metabólitos na amostra analisada. O método de separação de maior importância e mais
empregado no teste de drogas de abuso é a cromatografia.
Cromatografia Gasosa – Espectrometria de Massas
Cromatografia gasosa é definida como um método físico-químico de separação, em
que a amostra é vaporizada e, em seguida, injetada no interior de uma coluna, entrando em
contato com duas fases: móvel e estacionária. Colunas capilares, devido sua alta eficiência,
são comumente utilizadas como fases estacionárias e são responsáveis pela retenção dos
analitos da amostra. A fase móvel, gás de arraste, não interage com a amostra: serve apenas
para eluir os componentes – deslocamento do soluto pela fase estacionária. Os tempos de
retenção dependem das forças de interação do analito com a fase estacionária. Quão menor a
afinidade dos componentes pela fase estacionária, mais rapidamente estes são eluidos da
coluna. O oposto ocorre com aqueles que possuem maior afinidade. O controle da temperatura
da coluna é requisito básico para a obtenção de resultados precisos. A temperatura ótima
depende do ponto de ebulição da amostra e do grau de separação que se almeja. Diversas
variáveis químicas e físicas influenciam na qualidade da separação, a qual é determinada pela
resolução da eluição. (ALEXIOU et al., 2006; HARRIS, 2005; SKOOG, 2009)
A escolha da coluna cromatográfica deve estar em consonância com as características
dos componentes analisados para que uma boa resolução seja obtida. As colunas capilares são
geralmente constituídas de sílica fundida e revestidas com poliamida. Seu diâmetro está
relacionado com a vazão do gás de arraste e seu comprimento, com o número de pratos que
possui. Essas características são determinantes na eficiência da coluna. O tempo de retenção
para um analito em uma coluna depende do seu tempo de residência na fase estacionária, o
qual está relacionado com a natureza química desta. Para separar diversos componentes da
amostra, seus tempos de residência devem ser suficientemente diferentes para uma separação
bem definida. Isso implica que os analitos devem apresentar algum grau de compatibilidade
com a fase estacionária. Portanto, colunas polares são compatíveis com analitos polares e
colunas apolares, com analitos apolares. (ALEXIOU et al., 2006; HARRIS, 2005; MOREAU;
SIQUEIRA, 2008; SKOOG, 2009)
As fases estacionárias do tipo hidrocarboneto e dialquil siloxano são apolares,
enquanto que as fases do tipo poliéster e que contém os grupos funcionais –CN (cianeto), –
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CO (carbonila) e –OH (hidroxila) são altamente polares. As aminas (-NH2) são analitos
polares. Geralmente a polaridade da fase estacionária deve ser compatível com aquela dos
componentes da amostra. Quando a compatibilidade é adequada, a ordem de eluição é
determinada pelo ponto de ebulição do eluentes. Em colunas apolares e intermediárias,
espera-se que a anfetamina e a metanfetamina possuam maiores tempos de retenção que seus
metabólitos, tendo em vista que estes são mais polares que seus precursores. (ALEXIOU et
al., 2006; HARRIS, 2005; MOREAU; SIQUEIRA, 2008; SKOOG, 2009)
A fase móvel deve ser quimicamente inerte e pura. O gás hélio é a fase móvel mais
utilizada, pois é compatível com a maioria dos detectores. O argônio, o nitrogênio e o
hidrogênio também são empregados como gases de arraste. Para obter-se alta eficiência da
coluna, é necessário que a amostra seja do tamanho adequado e seja introduzida por uma zona
estreita de vapor. A injeção lenta ou de volumes muito grandes de amostras causa
alargamento do pico e baixa resolução. A preparação das amostras, para que possam produzir
respostas aceitáveis, é realizada pela extração – diminuindo o número de interferentes. Os
componentes de interesse – droga de abuso e seus metabólitos – estão em matrizes biológicas,
fazendo-se necessário um tratamento distinto para cada tipo de amostra analisada. A
derivatização da amostra deve possibilitar a extração dos analitos sem deterioração ou perda
do material. Separações mais rápidas podem ser obtidas utilizando-se o gás hidrogênio como
fase móvel, por ser utilizado em vazões superiores ao valor ótimo, sem muita perda de
resolução. Porém, o gás hidrogênio não pode ser usado com detector de espectrometria de
massa, pois causa a dispersão do óleo da bomba de vácuo no detector. A vazão das colunas
capilares é geralmente baixa, podendo, ao final da coluna, ser acoplada diretamente a câmara
de ionização do espectrômetro de massas. (ALEXIOU et al., 2006; HARRIS, 2005; SKOOG,
2009)
Para evitar condensação dos componentes e tempo de análise muito longo, a
temperatura da coluna deve ser ajustada para que a temperatura permaneça constante e
elevada, ou que aumente progressivamente ao longo da corrida cromatográfica. A
programação linear de temperatura é bastante utilizada para melhor separação dos picos dos
componentes de amostra que não apresenta boa resolução em condições isotérmicas. Na
rampa, a temperatura da coluna é elevada durante a separação para aumentar a pressão de
vapor do soluto e diminuir os tempos de retenção dos últimos componentes eluidos. Em
corridas isotérmicas, os compostos mais voláteis emergem próximos, e os menos voláteis às
vezes nem eluem da coluna. Uma elevação excessiva da temperatura deve ser evitada, já que
pode provocar a decomposição do analito e da fase estacionária. Para analitos que não
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suportam altas temperaturas, a corrida cromatográfica pode ser auxiliada pela programação de
pressão. Aumentar a pressão de entrada, aumenta a vazão da fase móvel e diminui os tempos
de retenção. (ALEXIOU et al., 2006; HARRIS, 2005; SKOOG, 2009)
De acordo com Pedroso et al. (2009), a separação multidimensional (CG-CG), onde a
amostra é submetida sequencialmente a diferentes processos de eluição, tem se tornado
conveniente para análise de matrizes complexas. Os sistemas CG-CG consistem em duas
colunas capilares conectadas em série, adaptadas por um modulador. Espécies que coeluem na
primeira etapa podem ser separadas na segunda eluição, sobretudo se os mecanismos de
separação das etapas forem independentes e diferentes. Uma combinação comum consiste em
uma coluna apolar ou pouco polar, e outra mais seletiva (polar) – ajuste que depende dos
analitos na amostra. A seletividade da segunda coluna garante que os analitos de volatilidade
próxima, contidos em cada fração, sejam retidos distintamente, dependendo do tipo e
magnitude das interações específicas entre eles e a fase estacionária seletiva. A segunda
coluna deve ser curta o suficiente para que o material coletado e posteriormente reinjetado
seja completamente eluído antes que a próxima fração seja nela introduzida. A modulação
destas colunas garante que as bandas cromatográficas destes sistemas sejam de dez (10) a
cinquenta (50) vezes mais estreitas que em CG unidimensional. Este estreitamento propicia
um aumento significativo da detectabilidade: ao invés de eluir como um pico largo e pouco
intenso, cada analito elui como uma série de picos estreitos e intensos, sendo facilmente
detectados.
Os espectrômetros de massas, como detectores em cromatografia gasosa, têm sido
amplamente utilizados na análise de drogas de abuso por serem extremamente sensíveis. Com
o monitoramento seletivo de íons, um componente em um cromatograma complexo, onde os
compostos estão pouco separados, pode ser facilmente medido. Os analitos, na forma gasosa,
eluem diretamente da coluna CG para a câmara de ionização do espectrômetro de massas,
onde são bombardeados por um feixe de elétrons. As colisões entre espécies carregadas e as
moléculas do analito fornecem energia às moléculas, deixando-as no estado excitado. A
relaxação – decaimento energético não emissivo – frequentemente ocorre pela fragmentação
de parte dos íons moleculares para produzir íons com massas menores. Íons positivos
produzidos pelo impacto de elétrons são atraídos através da fenda de entrada do espectrômetro
de massas, onde são selecionados de acordo com suas razões massa/carga e apresentados na
forma de um espectro de massa. Neste, o maior pico é denominado pico base e os demais
picos são calculados a partir de sua altura. A concentração dos íons é proporcional à altura dos
picos do espectro. (ALEXIOU et al., 2006; HARRIS, 2005; SKOOG, 2009)
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O aspecto do espectro de massas depende do método de ionização empregado. No
caso da CG-EM, onde os componentes que eluem da coluna encontram-se na forma gasosa, a
ionização é realizada por fontes de fase gasosa: impacto de elétrons, ionização química e
ionização por campo. Essas fontes, divididas em fontes duras e moles, são geralmente restritas
à ionização de compostos termicamente estáveis (pontos de ebulição inferiores a 500°C). Esta
exigência limita as fontes gasosas aos compostos com massas moleculares menores que
aproximadamente 103 Da. As fontes de ionização duras fornecem energia suficiente às
moléculas do analito para deixá-las em um estado de energia altamente excitado. A relaxação
envolve a ruptura de ligações, produzindo fragmentos de íons que possuem razões
massa/carga menores que do íon molecular – radical que possui a mesma massa molecular da
molécula em questão. Inúmeros picos surgem no espectro com fonte dura, fornecendo
informações úteis sobre grupos funcionais e, portanto, informações estruturais sobre o analito.
As fontes de ionização moles causam pouca fragmentação. Assim, o espectro de massas
obtido com estas fontes geralmente consiste no pico do íon molecular e em outros poucos
picos, caso existam, fornecendo informações exatas sobre a massa molecular da molécula ou
das moléculas do analito. Nas análises de anfetaminas e seus metabólitos, que eluem em
temperaturas abaixo de 350°C – o que permite o uso de fontes gasosas –, foram usadas as
fontes de impacto de elétrons (EI) e de ionização química (CI). (ALEXIOU et al., 2006;
HARRIS, 2005; SKOOG, 2009)
O impacto de elétrons é uma fonte dura. Um filamento aquecido de tungstênio ou
rênio emite um feixe de elétrons energéticos, acelerados por um potencial de 70 eV entre a
fonte emissora e o anodo, que bombardeia as moléculas do analito. As trajetórias dos elétrons
e das moléculas descrevem um ângulo reto e interceptam-se próximo ao centro da fonte, onde
ocorrem a colisão e a ionização. Os produtos primários são íons positivos monocarregados,
formados quando elétrons energéticos aproximam-se suficientemente das moléculas para que
ocorra a perda de elétrons por repulsão eletrostática. A pequena massa e a alta energia cinética
desses elétrons causam pouco aumento na energia de translação das moléculas que sofrem
impacto, mas levam a estados vibracionais e rotacionais altamente excitados. Uma relaxação
seguinte ocorre com elevada fragmentação, produzindo grande número de íons positivos (íons
filhos) de várias massas, menores que a do íon molecular. Dependendo da eficiência da
fragmentação o íon molecular não é preservado. As colisões do íon molecular com a molécula
do analito podem produzir íons com massas maiores que a do analito. Em pressões normais da
amostra, existe uma única reação importante em que este fato é observado: quando da colisão
transfere-se um átomo de hidrogênio ao íon para produzir um íon molecular protonado – sua
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quantidade depende da concentração dos reagentes. (ALEXIOU et al., 2006; HARRIS, 2005;
SKOOG, 2009)
Na ionização química, fonte mole, os átomos gasosos da amostra são ionizados por
colisões com íons produzidos por bombardeamento eletrônico de um excesso de gás reagente.
Geralmente, íons positivos são usados, mas ionização química com íons negativos é
ocasionalmente utilizada com analitos que contêm átomos muito eletronegativos. O reagente
gasoso, geralmente metano, é introduzido na região de ionização e reage quase que
exclusivamente com as moléculas do reagente. Outros reagentes, incluindo propano,
isobutano e amônia, são usados para ionização química, produzindo espectros ligeiramente
diferentes para dado analito. As reações envolvem, basicamente, a transferência de próton e
de hidreto nas colisões. (ALEXIOU et al., 2006; HARRIS, 2005; SKOOG, 2009)
Os íons positivamente carregados são acelerados para o analisador, que os separa de
acordo com as razões massa/carga apresentadas, devendo, idealmente, ser capaz de distinguir
minúsculas diferenças de massa. Além disso, deve permitir a passagem de um número
suficiente de íons para produzir correntes iônicas que sejam prontamente medidas. O
analisador utilizado para as drogas de abuso em questão foi o quadrupolo, o mais comumente
utilizado por ser mais compacto, de menor custo e mais robusto que os demais. Para a
obtenção de espectros de massas com este dispositivo, os íons são acelerados para o espaço
entre as barras do quadrupolo por uma diferença de potencial, onde apenas íons que têm
valores massa/carga em um intervalo limitado alcançam o transdutor: fotomultiplicadora.
(ALEXIOU et al., 2006; HARRIS, 2005; SKOOG, 2009)
Na análise quantitativa de espécies moleculares com EM, as concentrações dos
analitos são obtidas diretamente das alturas dos picos do espectro. Resultados mais exatos
podem ser obtidos com a adição de uma quantidade fixa de padrão interno às soluções das
amostras, que tende a reduzir incertezas originadas no preparo e na introdução da amostra,
que são a principal fonte de erros indeterminados. Um tipo conveniente de padrão interno é
um análogo estável do analito marcado isotopicamente por um ou mais átomos de deutério,
carbono-13 ou nitrogênio-15 em sua estrutura molecular. Nas análises em questão, padrões
internos deuterados foram utilizados. Assume-se que, durante a análise, as moléculas
marcadas comportam-se da mesma maneira que as não-marcadas. O espectrômetro de massas
distingue as duas facilmente. (ALEXIOU et al., 2006; HARRIS, 2005; SKOOG, 2009)
Cromatografia Líquida – Espectrometria de Massas
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Em cromatografia líquida de alta eficiência, efetua-se a separação dos componentes da
mistura de acordo com a natureza da fase móvel, fase estacionária e a natureza dos
componentes analisados. Nesta técnica, são utilizadas colunas recheadas de pequena extensão
como fase estacionária, em temperatura constante para garantir maior reprodutibilidade da
análise. O tamanho das partículas da fase estacionária influencia muita a eficiência da coluna.
Quão menores forem as partículas, menor a altura do prato, maior a eficiência da coluna:
aumento da resolução. Partículas pequenas aumentam a resolução, pois promovem uma vazão
mais uniforme através da coluna e uma diminuição da distância através da qual o soluto tem
que se difundir na fase móvel. (CIOLA, 1998; HARRIS, 2005; SKOOG, 2009)
Os tipos de cromatografia líquida dependem da polaridade das fases estacionária e
móvel. Quando aquela é altamente polar e esta relativamente apolar, a cromatografia é de fase
normal; quando aquela é apolar e esta relativamente polar, é de fase reversa. As análises
revisadas utilizaram apenas colunas de fase reversa e de troca iônica, que é um subgrupo da
cromatografia de fase reversa, na qual as espécies fracamente ionizáveis são separadas.
Cromatografia de fase reversa é a mais utilizada em separações por CLAE, e sua principal
vantagem é a possibilidade de usar como fase móvel a água: solvente barato, não-tóxico e
compatível com solutos biológicos. Possui capacidade de eliminar cauda dos picos, pois a
fase estacionária tem poucos sítios que podem adsorver fortemente um soluto. Além disso, a
transferência de massa é rápida com fases estacionárias apolares. Na cromatografia de par
iônico, um sal contendo um contra-íon orgânico grande, como um íon amônio quaternário, é
adicionado à fase móvel. O contra-íon forma um par iônico não carregado com um íon do
soluto de carga oposta na fase móvel. Esse par iônico se liga à fase estacionária apolar,
resultando em uma diferença no tempo de retenção dos solutos, baseada na afinidade do par
iônico pelas duas fases. (CIOLA, 1998; HARRIS, 2005; SKOOG, 2009)
Uma CLAE bem-sucedida requer um equilíbrio adequado das forças intermoleculares
entre os três participantes ativos do processo de separação: o soluto, a fase móvel e a fase
estacionária. No processo de eluição, as moléculas do solvente competem com as moléculas
do soluto por sítios na fase estacionária. A eluição pode ser isocrática, em que apenas um
solvente (ou mistura de solventes de composição constante) é utilizado; e por gradiente, em
que há variação contínua na composição do solvente. Esta é bastante utilizada quando a
eluição dos componentes não ocorre rápido o suficientemente utilizando-se um único
solvente. Na cromatografia de fase reversa com eluição por gradiente, conforme a composição
do solvente varia a polaridade também é alterada: a força do eluente diminui quando o
solvente se torna mais polar. Na eluição por gradiente, os picos se mantêm praticamente da
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mesma largura e, geralmente, a análise é mais rápida. Isso acarreta uma maior sensibilidade
da técnica. (CIOLA, 1998; HARRIS, 2005; SKOOG, 2009)
Um espectrômetro de massas acoplado à CLAE ajuda bastante na identificação das
espécies à medida que elas eluem da coluna cromatográfica. Entretanto, existem alguns
contratempos no acoplamento CLAE-EM: uma amostra no estado gasoso é necessária para a
espectrometria de massa, enquanto que a saída de uma coluna cromatográfica líquida é
constituída de um soluto dissolvido em um solvente. Técnicas de ionização por dessorção são
utilizadas para amostras não-voláteis ou termicamente instáveis, pois dispensam a
volatilização seguida de ionização das moléculas gasosas do analito. Em vez disso, energia
em diversas formas é introduzida na amostra líquida ou sólida causando a formação direta dos
íons gasosos. Os espectros são simplificados e consistem, frequentemente, apenas do íon
molecular ou do íon molecular protonado. As fontes mais comuns de ionização são
eletronebulização e ionização química à pressão atmosférica. (CIOLA, 1998; HARRIS, 2005;
SKOOG, 2009)
A ionização química à pressão atmosférica utiliza o aquecimento e um fluxo de gás
nitrogênio para converter a fase líquida eluída em um aerossol, pelo qual o solvente e o
analito evaporam, dando origem a novos íons pela reação em fase gasosa entre íons e
moléculas. Uma alta diferença de potencial é aplicada a uma agulha de metal posicionada no
percurso do aerossol e uma descarga elétrica contínua se forma em torno da agulha, injetando
elétrons no aerossol, onde uma sequência de reações pode produzir íons positivos e negativos.
Frequentemente há pouca fragmentação para fornecer informação estrutural além da massa
molecular. (CIOLA, 1998; HARRIS, 2005; SKOOG, 2009)
A técnica utilizada nas análises das anfetaminas e seus metabólitos foi a
eletronebulização, que ocorre em pressão e temperatura atmosféricas. Uma solução da
amostra é bombeada a uma vazão de poucos microlitros por minuto através da agulha capilar
de aço inoxidável, mantida a vários kilovolts com relação ao eletrodo cilíndrico que a
circunda. A nuvem carregada resultante, constituída de finas gotículas, passa através de um
capilar de dessolvatação, onde ocorre a evaporação do solvente e a ligação da carga às
moléculas do analito. Com a eliminação do solvente por evaporação, as partículas se tornam
cada vez menores e suas densidades de carga aumentam até que a tensão superficial não possa
mais suportar a carga – limite de Rayleigh. Ocorre a chamada explosão Coulombica, e a gota
divide-se em gotículas menores carregadas multiplamente. Isto permite que valores das razões
massa/carga sejam suficientemente pequenos para torná-los detectáveis com instrumento de
quadrupolo com resolução de 1500 ou menor. Essa técnica pode ser prontamente adaptada à
12
introdução direta da amostra proveniente de colunas de CLAE. (CIOLA, 1998; HARRIS,
2005; SKOOG, 2009)
A combinação CLAE-EM proporciona alta seletividade, uma vez que picos não
resolvidos podem ser isolados monitorando-se um valor de massa selecionado. Esta técnica
pode fornecer uma impressão digital do eluato, sem necessidade de recorrer ao tempo de
retenção, além de fornecer massa molar, informação estrutural e análises quantitativas exatas.
O acoplamento sequencial de espectrômetros de massas tem sido bastante empregado na
análise de matrizes biológicas: urina, sangue, cabelo, fluídos orais, proporcionando: maior
grau de sensibilidade, diminuição da interferência de contaminantes e auxílio na identificação
estrutural das moléculas. O processo mais utilizado em EM-EM é a ligação múltipla de
quadrupolos, atribuindo uma função separada a cada um. (HARRIS, 2005; WONG; TSE,
2005)
EM-EM no espaço é normalmente descrito por três quadrupolos, que são utilizados
para analisar a amostra em série. O primeiro filtra os íons do analito, permitindo apenas a
passagem de íons com a razão massa/carga desejada. A fragmentação do íon escolhido
(precursor) ocorre no segundo quadrupolo pelo impacto com moléculas do gás de colisão para
a formação dos íons produto, que podem ser verificados pelo terceiro quadrupolo ou podem
atingir seletivamente o detector. Alternativamente, há o EM-EM no tempo, em que se usa a
armadinha de íons como analisador de massa. Após a expulsão de todos os íons da armadilha
de íons, exceto o precursor desejado, ocorre a fragmentação de íons com valores massa/carga
que ressoam com a tensão aplicada para gerar íons produto. As várias etapas da EM-EM
eliminam praticamente toda contaminação por compostos indesejados que podem coeluir da
coluna. Essas características ajudam a desvendar estruturas moleculares complexas e elevar a
confiança de identificação. (WONG; TSE, 2005)
DISCUSSÃO
Os artigos revisados analisaram as seguintes matrizes biológicas: plasma sanguíneo
(BJØRK et al., 2009; KOLBRICH; LOWE; HUESTIS 2008; MUELLER et al., 2009;
PETERS et al., 2005; SCHEIDWEILER; BARNES; HUESTIS, 2008; SERGI et al., 2008),
urina (PIRNAY; ABRAHAM; HUESTIS, 2006), fluidos orais (BADAWI et al., 2009; SERGI
et al., 2008), cabelo (MENG et al., 2009), cérebro (SCHEIDWEILER; BARNES; HUESTIS,
2008) e cordão umbilical (JONES et al., 2009).
13
De acordo com Moreau e Siqueira (2008), matrizes menos convencionais que sangue e
urina têm sido utilizadas: cabelo, unha e saliva. Materiais queratinizados como cabelo e unhas
são extremamente úteis, devido sua capacidade de expressar exposições pregressas à análise.
Cada matriz possui peculiaridades, vantagens e desvantagens. A estabilidade dos analitos no
material biológico indica a possibilidade de análise. As matrizes biológicas analisadas não
apresentaram interferências relevantes nos sinais de resposta dos analitos e, quando relatadas,
mantinham-se consistentes nas réplicas de análise.
Os resultados enfatizaram a derivatização e o método de extração das amostras para a
análise simultânea de anfetaminas (AMP) e seus metabólitos mais comuns (MA, MDA,
MDEA, MDMA) para CG-EM e CLAE-EM. A CLAE é apontada como técnica preferencial
para determinação de drogas em algumas matrizes. A complexidade das matrizes e as
características dos analitos requerem preparação da amostra – livre de impurezas, interferente
e com melhor sensibilidade, linearidade e seletividade analítica. (SEBBEN, 2007)
Os métodos de extração mais usados são: extração líquido-líquido (ELL) e extração
em fase sólida (SPE), que foi o mais empregado. A SPE apresenta uma grande variedade de
fases extratoras, que possibilita diferentes tipos de interações com os analitos. Assim, são
favorecidos: a seletividade e a especificidade; a remoção de interferentes; e a diminuição do
consumo de solventes. A SPE apresenta algumas desvantagens quando comparada à ELL:
alto custo e o maior número de etapas de operação - condicionamento, lavagem, eluição e
maior tempo necessário para evaporação do solvente. A ELL é considerada um método
clássico de preparo de amostras. Sua eficiência depende da afinidade do soluto pelo solvente
extrator, da razão das fases e do número de extrações. Apresenta a vantagem de ser simples e
poder usar diversos tipos de solvente. Suas desvantagens são: consumo de solventes orgânicos
de alta pureza; exposição do analista a compostos tóxicos; várias etapas para sua execução e
formação de emulsão entre as fases; e uso de grandes volumes de amostras e de solventes, o
que resulta na perda do analito. (KAR, 2005; SEBBEN, 2007)
Derivatização é, portanto, a transformação de um composto químico em outro com a
finalidade de melhorar o perfil cromatográfico; aumentar a estabilidade térmica e a
volatilidade do analito; melhorar a especificidade, precisão e sensibilidade do método;
diminuir a polaridade dos compostos; e evitar a perda do analito por adsorção à coluna ou por
decomposição térmica. O aumento do peso molecular resultante do procedimento de
derivatização pode ser benéfico, pois gera íons mais específicos para o analito. No que diz
respeito às anfetaminas, os íons bases apresentados são de baixo peso molecular, inespecíficos
e comuns a diversas aminas. Pela derivatização, a estrutura química do analito é modificada
14
através da substituição dos hidrogênios livres ativos por outros que impeçam as ligações do
tipo hidrogênio e, consequentemente, o padrão de fragmentação do novo composto também é
alterado. (KLAASSEN, 2001; LANÇAS, 1993; SUPELCO, 2007 apud SEBBEN, 2007)
Apesar de compostos com grupamentos amino serem suficientemente voláteis para
injeção direta no CG-EM, os grupos polares –NH2 podem adsorver na coluna cromatográfica
e gerar picos não gaussianos – concentrações muito baixas dos analitos podem ocasionar a
eliminação destes. A escolha do sistema de solventes reflete diretamente na eficiência do
método, devendo ser compatível com aquele empregado na extração. Devido ao caráter
predominantemente básico das anfetaminas, as amostras geralmente compreendem compostos
orgânicos de alta e média polaridade, em meio básico, embora algumas matrizes tenham sido
manipuladas em meio ácido. Nem sempre a droga precursora é encontrada na amostra, sendo
os metabólitos a única indicação de sua exposição. O meio básico favorece a extração de
analitos básico, enquanto o meio ácido favorece a extração de analitos ácidos da matriz.
(KLAASSEN, 2001; SUPELCO, 2007 apud SEBBEN, 2007)
Os analitos foram identificados por seus tempos de retenção nos métodos
cromatográficos. As características das anfetaminas e seus metabólitos explicam o uso de
colunas cromatográficas apolares e de polaridades intermediárias em CG. Devido à polaridade
dos grupos amino e ao gradual aumento da polaridade dos metabólitos, colunas altamente
polares acarretariam maior tempo de retenção dos analitos, causando alargamento das bandas,
baixas eficiência e resolução. Em colunas apolares os tempos de retenção dos metabólitos
foram superiores àqueles em colunas de polaridades intermediárias. Porém, essa defasagem
pode ser devido à espessura e ao comprimento das colunas, e não às características dos
analitos. O comprimento da coluna de polaridade intermediária era a metade do comprimento
da coluna apolar, alteração que permitiu modificações na eficiência das separações dos
componentes. Metabólitos de anfetaminas possuem maior polaridade, portanto deveriam
apresentar menor tempo de retenção em colunas apolares do que nas de polaridades
intermediárias. (ALEXIOU et al., 2006; SKOOG, 2009)
Nas análises com eluição isocrática polar e eluição por gradiente com aumento da
polaridade em CLAE, a anfetamina foi detectada (com exceção da análise de sangue em
coluna 300-SCX com eluição isocrática polar – a qual não buscava sua detecção) bem como
seus metabólitos – quantidade maior de metabólitos é revelada em eluição por gradiente. Isto
pode ser explicado pela capacidade de moderar a interação dos metabólitos com a fase móvel
pelo gradual aumento da polaridade, possibilitando uma melhor separação dos analitos. Tratase de técnica de eluição vastamente empregada já que muitas drogas de abuso são usadas
15
concomitantemente. Ambas as técnicas cromatográficas se mostraram sensíveis para a análise
de anfetaminas e seus metabólitos, tendo apresentado baixo limite de detecção (LOD) em
todas as análises. (ALEXIOU et al., 2006; SKOOG, 2009)
A quantificação dos componentes por EM baseou-se na intensidade dos picos de
resposta em função dos padrões deuterados adicionados às amostras. Há uma tendência no
uso de espectrômetros de massas acoplados quando da utilização de CLAE, possibilitando
maior resolução do espectro e maior rapidez. A EM-EM é potencialmente mais sensível por
apresentar menor ruído químico, porém apresenta maior custo do equipamento. Os limites de
quantização (LOQ) se mostraram suficientes. Alguns metabólitos apresentaram LOQs
maiores, podendo haver relação com a metabolização da droga precursora e a disponibilidade
dos metabólitos. (SKOOG, 2009)
CONSIDERAÇÕES FINAIS
A contínua evolução do conhecimento acerca da detecção de drogas de abuso em
matrizes biológicas demanda um aprimoramento de técnicas e uso de matrizes menos
corruptíveis.
Do ponto de vista químico, as técnicas de análise apresentam sensibilidade suficiente
para a detecção de drogas de abuso. A grande diferença está na derivatização das amostras e
possível necessidade de acoplamento sequencial de detectores para a quantificação dos
analitos de interesse. A resposta de ambos os métodos apresenta resultados significativamente
confiáveis para anfetaminas e seus metabólitos, bem como outras drogas.
Do ponto de vista social, tendo em vista que as drogas de abuso têm se tornado um
assunto/problema de saúde pública, a escolha da matriz biológica de análise passa a ter grande
importância. Apesar de a urina e o sangue serem as matrizes mais utilizadas, o cabelo e a unha
são os mais indicados para análises e, consequentemente, para formulação de políticas
públicas. Matrizes queratinizadas possibilitam a detecção do uso abusivo de drogas em uma
janela bem mais ampla que na urina e no sangue, que possuem janelas muito estritas, além de
serem menos invasivos, como supra indicado. A história conexa ao uso de entorpecentes
permite que medidas sejam tomadas de forma a combater um grande problema da sociedade
contemporânea.
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