PROGRAMA EQ-ANP
Processamento, Gestão e Meio Ambiente na Indústria
do Petróleo e Gás Natural
AVALIAÇÃO DA ECOTOXICIDADE DE
SOLOS CONTAMINADOS POR
HIDROCARBONETOS
Débora de Barros
Projeto de Final de Curso
Orientadora
Prof. Denize Dias de Carvalho, D.Sc.
Co-orientador
Sandro José Baptista, M.Sc.
Fevereiro de 2007
i
AVALIAÇÃO DA ECOTOXICIDADE DE SOLOS
CONTAMINADOS POR HIDROCARBONETOS
Débora de Barros
Projeto de Final de Curso submetido ao Corpo Docente do Programa Escola de
Química/Agência
Nacional
de Petróleo,
Gás
Natural
e
Biocombustíveis
–
Processamento, Gestão e Meio Ambiente na Indústria de Petróleo e Gás Natural, como
parte dos requisitos necessários para a obtenção do grau de Engenheiro Químico com
ênfase na área de Petróleo e Gás Natural - Tratamento de Resíduos e Meio Ambiente.
Aprovado por:
________________________________________
Lídia Yokoyama, D.Sc.
________________________________________
Selma Gomes Ferreira Leite, D.Sc.
________________________________________
Mauro dos Santos de Carvalho, D.Sc.
Orientada por:
_________________________________________
Profº Denize Dias de Carvalho, D.Sc.
______________________________
Sandro José Baptista, M.Sc.
Rio de Janeiro, RJ - Brasil.
Fevereiro de 2007
i
FICHA CATALOGRÁFICA
Barros, Débora de.
Avaliação da ecotoxicidade de solos contaminados por hidrocarbonetos / Débora
de Barros. Rio de Janeiro: UFRJ / EQ. 2007.
ix, 52 p.; il.
(Monografia) – Universidade Federal do Rio de Janeiro, Escola de Química,
2007.
Orientadora: Prof. Denize Dias de Carvalho, D.Sc. e Co-orientador: Sandro José
Baptista, M.Sc.
1. Ecotoxicidade. 2. Minhocas. 3. Atividade Desidrogenásica. 4. Monografia.
(Graduação – UFRJ/EQ). 5. Denize Dias de Carvalho e Sandro José Baptista.
I. Título.
ii
“Tudo tem seu tempo e até certas manifestações mais vigorosas e originais entram
em voga ou saem de moda. Mas a sabedoria tem uma vantagem: é eterna”.
Baltasar Gracián
iii
AGRADECIMENTOS
Especialmente à Professora Denize Dias de Carvalho pelo incentivo, simpatia
e presteza durante o andamento do projeto.
Ao co-orientador Sandro José Baptista pelo seu espírito inovador, pelos
esclarecimentos e auxílios durante a execução do projeto.
A Agência Nacional do Petróleo - ANP que contribuiu para que este
trabalho se realizasse, por meio do Programa de Recursos Humanos da ANP para
o Setor de Petróleo e Gás – PRH-ANP/MCT, em particular ao PRH 13, da Escola
de Química - Processamento, Gestão e Meio Ambiente na Indústria do Petróleo e
Gás Natural.
Ao professor Mauro dos Santos de Carvalho do Instituto de Química, por
todos
os
ensinamentos,
amizade,
incentivo,
parceria,
compreensão
e
principalmente pela grande participação na minha formação.
Às amigas Nina Kátia e Juliana Labre pela colaboração durante a execução
dos experimentos.
Ao professor Marcio José Estillac de Melo Cardoso do Instituto de Química
pela amizade durante os três anos de Iniciação Científica no Departamento de
Físico Química.
Às amigas de laboratório, Ana Isabel Ribeiro e Rafaele Albuquerque, pela
colaboração e presteza durante o período de realização dos experimentos.
Ao Laboratório de Tecnologia Ambiental da Escola de Química - LTA por
conceder suas instalações para a realização dos experimentos deste projeto.
À Cristina Lima do LTA pela atenção, presteza e amizade.
iv
Resumo do Projeto Final apresentado à Escola de Química como parte dos requisitos
necessários para obtenção do grau de Engenheiro Químico com ênfase na área de
Petróleo e Gás Natural - Tratamento de Resíduos e Meio Ambiente.
AVALIAÇÃO DA ECOTOXICIDADE DE SOLOS CONTAMINADOS POR
HIDROCARBONETOS
Débora de Barros
Fevereiro, 2007.
Orientador (es): Denize Dias de Carvalho, D.Sc.
Sandro José Baptista, M. Sc.
O desenvolvimento de critérios ecotoxicológicos para a avaliação da qualidade
do solo é uma importante alternativa, tanto para determinação dos níveis aceitáveis de
compostos químicos tóxicos, assim como, para o planejamento e execução de
estratégias de processos de biorremediação. A necessidade de remediação de locais
contaminados por hidrocarbonetos de petróleo tem aumentado consideravelmente.
Associado a este fato, existe a necessidade da determinação de parâmetros de
ecotoxicidade para definição da qualidade aceitável do solo para o restabelecimento do
equilíbrio do ecossistema (CHAPMAN, 1991).
Este projeto objetiva o estudo de testes ecotoxicológicos para avaliação da sua
aplicabilidade em solos contaminados com derivados de petróleo. Estes testes além de
baixos custos têm se mostrado eficientes na avaliação da ecotoxidade e no planejamento
de estratégias de remediação (DORN, 1998). Foram estudados ensaios com bactérias,
onde foi avaliada a atividade desidrogenásica, o crescimento de plantas, avaliada por
ensaios de germinação de sementes e ensaios de mortalidade de uma espécie de
minhocas (Eisenia foetida).
A partir dos resultados obtidos, pode-se avaliar a resposta dos três testes para
diferentes níveis de contaminação, podendo este resultado ser utilizado no sítio em que
se deseja avaliar o grau de contaminação. Os resultados demonstraram diferentes
capacidades de adaptação dos testes ao sítio contaminado com diferentes concentrações.
Em situações com baixas concentrações de contaminação, por exemplo, o melhor teste
para avaliar o grau desta contaminação é o teste de mortalidade de minhocas da espécie
Eisenia foetida, devido à sensibilidade a contaminação demonstrada nos ensaios
realizados neste projeto.
Deste modo, o presente trabalho apresenta levantamentos importantes para o
melhoramento dos procedimentos experimentais utilizados. Além de oferece subsídios
para que se possa construir um sistema de avaliação de ecotoxicidade capaz de
responder às necessidades nacionais na área de monitoramento ambiental
v
Abstract of a Final Project presented to Escola de Química/UFRJ as partial fulfillment
of the requirements for the degree of chemical engineer with emphasis on Petroleum
and Natural Gas – Environment and Waste Treatment.
EVALUATION OF THE ECOTOXICITY OF SOILS CONTAMINATED FOR
HYDRO-CARBONS
Débora de Barros
February, 2007
Supervisors: Denize Dias de Carvalho, D.Sc.
Sandro José Baptista, M.Sc.
The development of toxicology’s criteria for the evaluation of the quality of the
ground is an important alternative, as much for determination of the acceptable toxic
chemical composite levels as well as for the planning and execution of strategies of
bioremediation processes. The necessity of remediation of places contaminated for oil
hydrocarbons has increased considerably. For this the necessity of the determination of
parameters of ecotoxicity and for definition of the acceptance quality of the ground for
the reestablishment of the balance of the ecosystem exists (CHAPMAN, 1991).
The main aim of this project was to study of toxicology’s tests in order to
evaluate the applicability in contaminated soil with derivatives of petroleum. These tests
beyond low cost if have shown efficient in the evaluation of the ecotoxicity and the
planning of remediation strategies (DORN, 1998). The assays with bacteria (test of
desidrogenase activity), plants (test of germination and growth of seeds) and
earthworms (test of mortality) had been studied in order to evaluate the effect of the
contaminant in the different levels of the organisms.
From the results, which can be determined the best one of the three tests, could
be used in the small farm where if it desires to evaluate the contamination degree. The
results had demonstrated different capacities of adaptation of the tests to the small farm
contaminated with different concentrations. In situations with low concentrations of
contamination, for example, the best test to evaluate the degree of this contamination is
the test of mortality of earthworms of the Eisenia foetida species, due to sensitivity the
contamination demonstrated in the assays carried through in this project.
In this way, the present work offers important subsidies for the improvement of
the used experimental procedures. Moreover, this work can offer subsidies in order to
construct a system of evaluation of ecotoxicity that can be able to answer the national
needs in the area of environmental monitoring.
vi
ÍNDICE
Capítulo I – Introdução
1
Capítulo II – Revisão Bibliográfica
2
II. 1- O solo
2
II. 1.1 - Constituição do solo
5
II. 1.2 - Textura Solo
6
II. 2- A importância dos Microrganismos do Solo
8
II. 3- O papel desempenhado pelas Minhocas no Solo
9
II. 4- A importância da germinação das Plantas no Solo
11
II. 5- O emprego de testes biológicos em solos contaminados
14
Capítulo III – Materiais e Métodos
16
III. 1- Solos utilizados
16
III. 2- Contaminantes avaliados
16
III. 3- Teste da taxa de mortalidade de minhocas
17
III. 4- Atividade Desidrogenásica
18
III.5 - Sementes utilizadas
20
III. 6- Teste de Germinação de Sementes
21
Capítulo IV – Resultados e Discussão
27
IV. 1- Resultados dos testes realizados com solo argiloso
27
IV.2 - Resultados dos testes de atividade desidrogenásica
41
Capítulo V – Conclusões e Perspectivas
46
Referências Bibliográficas
48
vii
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 1: Esquema que apresenta as interações que existem no solo.
2
Figura 1: Representação do processo de formação de um solo
3
Figura 2: Horizontes do Perfil de Solo
4
Figura 3: Diagrama de Textura
7
Figura 5: Formação de um macroporo
8
Figura 6: Foto do Minhocário
18
Figura 7: Foto das amostras com minhocas
18
Figura 8: Foto da preparação das placas de Petri
22
Figura 9: Foto da estufa de acondicionamento das placas
22
Figura 10: Gráfico da média da mortalidade de minhocas da contaminação com diesel
28
Figura 11: Gráfico da média da mortalidade de minhocas da contaminação com gasolina
30
Figura 12: Gráfico comparativo da média da mortalidade de minhocas com contaminação com
diesel x gasolina
32
Figura 13: Gráfico com a média do número de sementes germinadas com 10% diesel
34
Figura 14: Gráfico com a média do número de sementes germinadas com 20% diesel
35
Figura 45: Gráfico com a média do número de sementes germinadas com 30% diesel
36
Figura 56: Gráfico com a média do número de sementes germinadas com 40% diesel
37
Figura 67: Gráfico com a média do número de sementes germinadas com 50% diesel
37
Figura 78: Gráfico do Índice de Germinação de sementes contaminadas com diesel
39
Figura 19: Foto da comparação entre os resultados de atividade desidrogenásica do solo
argiloso “virgem” e o inóculo
42
Figura 20: Gráfico da curva padrão da atividade desidrogenásica
43
Figura 21: Foto com alguns resultados de atividade desidrogenásica
44
Figura 22: Gráfico da Atividade Desidrogenásica com diferentes concentrações de diesel
45
viii
ÍNDICE DE TABELAS
Tabela 1: Os Mecanismos Microbianos no Solo
10
Tabela 2: Média dos resultados obtidos na caracterização do solo argiloso
27
Tabela 3: Média dos resultados do teste com minhocas da contaminação com diesel
28
Tabela 4: Média dos resultados do teste da contaminação com gasolina
30
Tabela 5: Comparação do teste com minhocas com contaminação com diesel e gasolina
31
Tabela 6: Média dos dados obtidos da germinação de sementes com 10% diesel
33
Tabela 7: Média dos dados obtidos da germinação de sementes com 20% diesel
35
Tabela 8: Média dos dados obtidos da germinação de sementes com 30% diesel
36
Tabela 9: Média dos dados obtidos da germinação de sementes com 40% diesel
37
Tabela 10: Média dos dados obtidos da germinação de sementes com 50% diesel
38
Tabela 11: Média dos índices de germinação com contaminação de diesel
39
Tabela 12: Resultados das análises complementares
42
Tabela 13: Dados obtidos para a construção da curva padrão
43
Tabela 24: Média dos dados obtidos na atividade desidrogenásica
44
ix
Capítulo I: Introdução
O desenvolvimento de critérios ecotoxicológicos para a avaliação da
qualidade do solo é uma importante alternativa, tanto para determinação dos níveis
aceitáveis de compostos químicos tóxicos assim como para o planejamento e
execução de estratégias de processos de biorremediação. A necessidade de
remediação de locais contaminados por hidrocarbonetos e derivados de petróleo
tem aumentado consideravelmente. Para isto existe a necessidade da determinação
de parâmetros de ecotoxicidade para definição da qualidade aceitável do solo para o
restabelecimento do equilíbrio do ecossistema.
Na determinação dos parâmetros de ecotoxicidade é importante o
desenvolvimento de ensaios rápidos e de baixo custo, que podem ser bastante úteis
para diversas aplicações, incluindo a identificação de solos contaminados e o
desenvolvimento de estratégias de remediação desses solos. No Brasil há uma
grande deficiência de desenvolvimento e aplicação desses ensaios.
O objetivo do presente trabalho é a aplicação de testes de ecotoxicidade em
solos envolvendo atividade desidrogenásica, testes de germinação de sementes e o
uso de minhocas da espécie Eisenia foetida, visando à sua aplicação na avaliação de
solos contaminados com hidrocarbonetos derivados de petróleo.
1
Capítulo II: Revisão Bibliográfica
II.1- O Solo
O solo é um corpo natural, que é representado pela parte superficial
intemperizada da crosta terrestre, não consolidada, que contém matéria orgânica,
inorgânica e seres vivos. No solo se desenvolvem vegetais que através das raízes
obtém a água e os nutrientes de que necessitam. O solo é resultante das interações
da litosfera, hidrosfera, atmosfera e biosfera. Entretanto, deve-se levar em
consideração a contribuição antrópica, que esquematicamente é descrita segundo a
Figura 1.
Figura 1: Esquema que apresenta as interações que existem no solo.
Fonte: Site 1
A formação de um solo pode ser resultante da ação conjunta dos agentes
intempéricos sobre os restos minerais depositados e enriquecidos de detritos
orgânicos. Tem-se início no momento em que as rochas entram em contato com o
meio ambiente e começam a sofrer transformações (ANDRADE, 2001).
No entanto, sem os organismos, os solos não seriam formados. Mesmo
com a intemperização físico-química das rochas matrizes, os terrenos formados não
teriam nenhuma fertilidade, visto que há necessidade de nitrogênio e estruturas de
carbono para que a vida se estabeleça. Segundo COUTINHO (1999), as
cianobactérias são consideradas como colonizadores primários do solo, pela sua
capacidade de fixar carbono e nitrogênio da atmosfera através dos processos de
2
fotossíntese e fixação biológica de nitrogênio, respectivamente. Sendo assim,
fungos e bactérias terão recursos para se desenvolver e liberar nutrientes dos
minerais do solo, como o fósforo, cálcio e ferro. A disponibilidade de água
permitirá o crescimento de plantas no solo formado, que ao serem decompostas
gerarão matéria orgânica que reterão nutrientes, liberando-os lentamente para os
próximos colonizadores.
A figura 2 a seguir ilustra o processo de formação de um solo, mostrando a
contribuição da rocha intemperizada e dos componentes orgânicos.
Componentes inorgânicos
(rocha mãe)
Componentes orgânicos
(resíduos animais e vegetais)
Intemperismo
Decomposição
Solução
H2PO4-, K+, Ca+2, Mg+2, Na+
Micronutrientes
Formação de argila
Mineralização
CO2, NH3,SO4-2,H2PO4 Micronutrientes
Humificação
Adsorvidos
absorvidos lavados
Decomposição da argila
Colóides da argila
(Caolinita, ilita, montmorilonita,
sexquioxidos)
Catabolismo dos húmus
Colóides orgânicos
(Compostos húmicos de baixo e
alto peso molecular )
Complexo
argila – húmus
(Regulação da disponibilidade de nutrientes, meio para trocas de ar e água)
Figura 2: Representação do processo de formação de um solo
Fonte: Site 1
3
Os solos possuem horizontes ou camadas relativamente homogêneas
paralelas à superfície que são ambientes distintos e podem ser subdivididos
(RESENDE et al., 2002). Os vários horizontes componentes de um perfil de solo
nem sempre são evidentes e têm limites bem definidos. O solo é formado sob a
ação de fatores (agentes externos) e processos (agentes internos) que interferem em
sua diferenciação e caracterização, e com propriedades distintas dos corpos que
atuaram em sua evolução.
A Figura 3 apresenta esquematicamente os principais horizontes do perfil
de um solo.
Figura 3: Horizontes do Perfil de Solo
Fonte: Site 2
Segundo RESENDE et al. (2002), quanto mais intensa for a atuação dos
organismos e do clima, maior será a energia empregada na liberação dos nutrientes
da rede cristalina, na remoção dos nutrientes da solução do solo para os oceanos e
na transformação dos minerais secundários (minerais de argila) em outros mais
estáveis, de menor capacidade de troca catiônica e maior capacidade de adsorção
aniônica. Dessa maneira, é sobre esse material geológico que se desenvolve o
verdadeiro solo, resultante da ação dos agentes pedogenéticos.
4
II.1.1- Constituição do Solo
O solo pode ser considerado como um sistema multicomponente,
integrado pelas fases: sólida, líquida e gasosa. Essas três fases são representadas
no solo da seguinte maneira: a fase sólida constitui a matriz do solo, a fase líquida
consiste na solução do solo e a fase gasosa é a atmosfera do solo (FERREIRA &
DIAS JR., 2001).
A fase gasosa do solo localiza-se no interior dos poros, competindo com a
água pelo mesmo espaço. É uma fase descontínua e variável, devido às reações
químicas e à atividade biológica. Esta fase apresenta os mesmos componentes que o
ar atmosférico, com diferenças quantitativas, por exemplo:
ar atmosférico:
21% O2
0,035% CO2
78% N2
ar no solo:
19% O2
0,90% CO2
79% N2
A composição da fase gasosa do solo é variável devido à respiração das
raízes e de outros organismos, por causa da decomposição da matéria orgânica e de
reações que consomem O2 e liberam CO2.
De um modo geral, os sintomas de falta de O2 (amarelecimento das folhas,
por exemplo) aparecem quando a concentração de O2 nos poros é menor que 15%.
Acima de 21% parece não haver benefício em aumentar-se a concentração de O2. É
da fase líquida ou solução do solo que as plantas retiram a água necessária ao seu
metabolismo. Quando o teor de água atinge um limite mínimo, o solo retém o
líquido e as plantas não conseguem mais retirar a água e murcham. (SITE 1).
A solução do solo contém nutriente e outros elementos não essenciais
dissolvidos, na forma iônica, em concentração variável, dependendo do tipo de solo
e do teor de umidade. Estabelece-se, contudo, um equilíbrio entre a forma iônica
solúvel e a correspondente retirada na fase sólida, principalmente nas partículas
coloidais, numa forma denominada “trocável”. Os íons da solução do solo são
disponíveis às plantas.
A fase sólida, ou melhor, denominada particulada, é formada pelos
constituintes minerais e orgânicos. A fração mineral inclui todos os minerais:
primários e secundários. A fração orgânica compreende os restos vegetais e
animais, em variados estados de decomposição.
5
A fração orgânica do solo é uma mistura complexa de tecidos vivos ou
mortos e de substâncias orgânicas transformadas ou em seu estado original. São
materiais complexos e em constante transformação, mas que podem ser separados
em frações distintas (MOREIRA & SIQUEIRA, 2002). Segundo MACHADO
(1999), aproximadamente 98% do carbono orgânico do solo encontra-se como
matéria orgânica morta, principalmente na forma de húmus (80-90%). A fração
viva geralmente não ultrapassa de 4% do carbono orgânico. Desse percentual, 510% são raízes, 60-80% são microrganismos e de 15-30% representam os
macrorganismos.
II.1.2- Textura Solo
A textura do solo constitui-se numa das características físicas mais estáveis
e representa a distribuição quantitativa das partículas do solo quanto ao tamanho. A
grande estabilidade faz com que a textura seja considerada elemento de grande
importância na descrição, identificação e classificação do solo. A textura do solo
confere alguma qualidade ao solo, no entanto, sua avaliação apresenta conotação
prioritariamente quantitativa. Areia, silte e argila são as três frações texturais do
solo que apresentam amplitudes de tamanho variáveis em função do sistema de
classificação adotado (FERREIRA & DIAS JR., 2001). A Figura 4 apresenta o
diagrama de textura baseado no sistema de classificação do Departamento de
Agricultura dos Estados Unidos (USDA).
6
CASCALHOS
2
Muito Grossa
Grossa
2-1
1-0,5
AREIA (mm)
Média
0,5-0,25
Fina
Muito Fina
0,25-0,1
0,1-0,05
SILTE
ARGILA
0,05->0,002
>0,002
Figura 4: Diagrama de Textura Adotado pela Sociedade Brasileira de Ciência do
solo
Fonte: RESENDE et al. (2002), FERREIRA & DIAS JR. (2001).
No solo, as frações silte e areia, sob a ação do intemperismo transformam-se
em argila. Os minerais resistentes permanecem sob a forma de areia. A fração silte,
que é a intermediária, é o ponto da instabilidade, ou seja, de uma maneira geral, os
solos mais novos são os que apresentam alto teor de silte e já os mais velhos e
comuns da paisagem brasileira, tais como os Latossolos, apresentam um teor
mínimo (ANDRADE, 2001). A fração silte pode ser um indicador do grau de
intemperização de um solo ou do potencial dele de conter minerais primários
facilmente intemperizáveis, ou seja, daqueles que tem condições de fornecerem
nutrientes (RESENDE et al., 2002).
As propriedades das argilas são muitas; entre as principais se encontram as
associadas com reações de adsorção, troca iônica, propriedades eletrocinéticas e
eletroquímicas. Essas propriedades se fundamentam nas características coloidais, de
superfície e de carga elétrica que apresentam estes minerais.
7
As argilas apresentam importância nos solos por apresentarem cargas
negativas e, em menores proporções positivas que podem reter tanto cátions como
ânions, dentre os quais se apresentam elementos nutrientes (Ca2+, Mg2+, K+, NH4+,
PO43-, SO42-, etc). Ademais, devido as suas características de expansão e contração,
as argilas influem nas características físicas do solo, como a porosidade (macro e
micro), infiltração, permeabilidade, difusibilidade térmica, densidade, etc. Sendo
assim, quanto maior o teor de argila, maior a área específica do solo e maior a
intensidade de fenômenos como retenção de água, capacidade de troca, resistência à
erosão e fixação de fósforo (ANDRADE, 2001).
Essas partículas primárias (argila, silte e areia) de diferentes tamanhos e
formatos resultam na existência de espaços vazios ou poros entre as mesmas,
formando partículas maiores, agregados e macroporos (Figura 5) dando ao solo a
sua estrutura.
Figura 5: Formação de um macroporo
Fonte: Resende at al., 2002.
Pode-se definir a estrutura do solo como sendo um agregado de partículas
em unidades compostas ou agrupadas. Os tipos de estrutura encontrados podem ser
sob a forma de grânulos, grumos, blocos, prismas, colunas e laminar.
A formação da estrutura do solo envolve processos distintos, mas
complementares. O tipo de estrutura de um determinado solo é conseqüência de
fatores de formação do solo que podem influenciar o aparecimento de uma dada
estrutura.
De acordo com FERREIRA & DIAS JR. (2001), a estrutura do solo é de
fundamental importância, pois regula processos como aeração, armazenamento e
circulação de água, penetração de raízes, disponibilidade de nutrientes, atividade
macro e microbiológicas e temperatura do solo.
8
II.2- A importância dos Microrganismos do Solo
A presença de microrganismos em determinado solo é função das
condições ambientais dominantes. A viabilidade de um microrganismo em qualquer
habitat é função da extensão e rapidez de suas respostas fisiológicas às condições
ambientais predominantes. O tamanho e forma das células refletem as condições
ambientais, visto que em condições de nutrição reduzida à razão superfície/volume
aumenta, as células ficam mais alongadas formando às vezes filamentos de modo a
aumentar a superfície de contato com o solo e ter maior acessibilidade a nutrientes.
Entretanto, em condições de seca ocorre o inverso. (MOREIRA & SIQUEIRA,
2002).
Os microrganismos ocupam em torno de 0,5% do espaço poroso do solo,
porém esta porcentagem aumenta significativamente no solo rizosférico devido ao
aumento na disponibilidade de substrato. As bactérias, que têm geralmente
diâmetro menor que 0,5µm, se localizam nos pellets fecais das minhocas existentes,
na matéria orgânica, nos poros e no interior de agregados e os fungos, nos poros e
fora dos agregados. A ocupação dos poros é função de seu tamanho e conteúdo de
água. Poros com alguns micrômetros (2-6µm) são adequados para entrada de
bactérias enquanto fungos necessitam de poros maiores que elas (MOREIRA &
SIQUEIRA, 2002).
A atividade biológica no solo e os processos bioquímicos correspondentes
são agentes muito importantes. A porção viva desse sistema é representada
principalmente por microrganismos (bactérias, actinomicetos e algas), raízes de
plantas e de animais viventes (meso e macrofauna) do solo. A Tabela 1 apresenta os
mecanismos pelos quais os microrganismos do solo influenciam as transformações
e ciclagem dos nutrientes no solo. Observa-se que os microrganismos são
importantes fatores que influenciam na formação do solo. Esses organismos
influenciam na degradação de matéria orgânica, na quantidade deste material
acumulado no solo, no grau de ciclagem de nutrientes, no crescimento da vegetação
via relação simbiótica e na agregação de partículas do solo (DRAGUN, 1998).
9
Tabela 1: Os Mecanismos Microbianos no Solo.
Mecanismo
Mobilização
Imobilização
Produção de
Metabólitos
Produção de Enzimas
Alteração no pH
Oxi-redução
Alteração da
Solubilidade
Redução Bioquímica
Produção de Toxinas
Simbiose Radicular
Efeito/Importância
Liberação de nutrientes imobilizados nos restos vegetais e outros
materiais orgânicos depositados no solo e na própria matéria orgânica
nativa através da mineralização.
Imobilização na biomassa microbiana e substâncias químicas.
Produção e excreção de substâncias quelantes e/ou complexantes que
atuam na solubilidade e mobilidade de vários elementos no sistema
solo-planta.
Reações enzimáticas de oxi-redução que controlam a solubilidade de
vários compostos ou elementos.
Transformações indiretas provocadas por modificações no pH do
solo.
Redução de formas oxidadas de vários nutrientes, em condições de
baixa aeração.
Produção de ácidos orgânicos e inorgânicos com ação solubilizadora
de compostos inorgânicos.
Transformações bioquímicas específicas, como a desnitrificação e
redução de sulfato, que resultam na perda de nutrientes na forma
gasosa.
Produção de compostos tóxicos que poluem o ambiente,
representando ameaças à saúde pública e reduzindo o crescimento das
plantas.
Fixação biológica do nitrogênio atmosférico, formação de micorrizas
e outras associações benéficas com as raízes.
Fonte: MOREIRA & SIQUEIRA (2002).
Em função das características do solo, os organismos com metabolismos
distintos conseguem conviver lado a lado, interagindo em estado de equilíbrio
dinâmico, muitas vezes com relações de dependência essenciais para sua
sobrevivência, proporcionando condições ideais para uma biodiversidade
extremamente elevada (MOREIRA & SIQUEIRA, 2002).
Para utilização em testes de ecotoxidade recomenda-se que dentre diversas
opções de testes, seja dada preferência àqueles que apliquem microrganismos que
habitam o solo (ALEXANDER & ALEXANDER, 2000).
Em trabalho bastante recente DAWSON et al, 2006, testaram uma gama de
ensaios biológicos com o objetivo de determinar quais dentre eles poderiam ser
utilizados para diferenciar solos contaminados em diferentes níveis com
hidrocarbonetos. Os testes foram realizados partindo-se de um solo oriundo de um
posto de gasolina, ao qual foram aplicados vários possíveis procedimentos de
remediação. Os resultados mostraram que os ensaios que melhor discriminaram os
tratamentos de remediação aplicados ao solo foram: teor de carbono da biomassa
microbiana, respiração basal e respiração induzida pelos substratos glutamina e
10
ácido maleico, atividade desidrogenásica, Índice de condição em 14 dias para
Eisenia foetida, Índice de condição e alteração de massa e germinação de sementes
de mostarda. Dentre os testes que apresentaram melhores resultados encontra-se a
atividade desidrogenásica e o método com aplicação de minhocas, o que confirma o
potencial de aplicação dos testes estudados no presente projeto.
II.3- O papel das Minhocas no Solo
O papel desempenhado pelas minhocas nos solos, seja por suas galerias ou
pelos excrementos, reveste-se de suma importância, de vez que sua intervenção é
importante e decisiva para a formação do húmus natural, componente
imprescindível às terras férteis. Elas modificam profundamente as características
físicas do solo, misturando seus horizontes e aumentando a aeração, a drenagem e o
poder de retenção de água e de substâncias úteis. Em suas dejeções, concentram-se
nutrientes necessários ao crescimento dos vegetais, como nitrogênio, fósforo,
potássio e cálcio, dentre outros (MOTTER et al., 1990). A criação de minhocas tem
despertado o interesse de muitos produtores, em função do baixo investimento
inicial, necessidade de pouco espaço físico e da possibilidade de proporcionar
atraentes taxas de retorno. O húmus pode ser utilizado na própria propriedade ou,
ainda, no paisagismo e jardinagem, floricultura, fruticultura e outros (MARTINEZ,
1995).
Segundo CALVERT (1979), o processo utilizado na coleta de minhocas,
quando produzidas em larga escala, pode ser um fator limitante desta atividade. Na
minhocultura comercial, o processo de separação é a etapa mais trabalhosa e deve
ser feita com muito cuidado, em razão da fragilidade das minhocas, evitando danos
e, mesmo, a redução drástica de sua população.
Os métodos mais usados são: a separação manual, a migratória e a
mecânica. A separação manual e a migratória são mais indicadas quando se
pretende comercializar as minhocas como matrizes ou iscas, porém a separação
manual é um processo que requer mão-de-obra intensiva, influenciando a
atratividade econômica da minhocultura; e a migratória, apesar de resultar em
menor índice de lesões, estresse e morte, requer um tempo maior na separação das
minhocas, podendo chegar a dias e, ainda assim, não se obter pleno sucesso na
11
separação, o que torna necessária a implementação de métodos complementares
(RIGHI, 1989). A separação mecânica, apropriada para grandes produtores, não é
indicada para coleta de matrizes ou de iscas vivas para pesca, pois as minhocas
podem sofrer ferimentos ou até morrer, mas é recomendada, no entanto, para
colheita destinada à alimentação animal e/ou produção de húmus, pois possibilita
processar grande quantidade de substrato em menor tempo (SENAR, 1994).
A minhoca mais utilizada nos teste de ecotoxicidade é a vermelha-daCalifórnia ou minhoca de esterco (Eisenia foetida), esta preferência deve-se a sua
habilidade em converter resíduos orgânicos pouco decompostos em material
estabilizado, extraordinária proliferação e rápido crescimento. As minhocas são
hermafroditas, o que significa que apresentam órgão reprodutor masculino e
feminino no mesmo indivíduo. No entanto necessitam de dois indivíduos para que
ocorra a reprodução (CALVERT, 1979).
Após a cópula e a conseqüente troca de gametas masculino ocorre a
fecundação. Cerca de quatro dias depois, dá-se a formação dos casulos, uma
espécie de bolsa que se forma a partir do clitelo. O clitelo é uma região mais
espessa que se situa na porção anterior da minhoca, sendo facilmente visível nas
adultas.
O casulo contém as reservas nutritivas para o desenvolvimento do embrião,
que leva de 14 a 44 dias, com uma média de 23 dias, ocorrendo então a eclosão das
minhocas-filhas. Cada casulo pode dar origem a um número de minhocas que varia
de 1 a 9, com freqüência média de 3 minhocas por casulo (VENTER &
REINECKE, 1988).
Em condições favoráveis, as minhocas-filhas atingem a maturidade sexual e
com completa formação do clitelo, dentro de 40 a 60 dias, quando então estarão
aptas à reprodução.
II.4- A importância da germinação das Plantas no Solo
As plantas são muitos importantes e de grande utilidade, pois liberam o
oxigênio necessário para a existência humana, além de enriquecer o solo e torná-lo
mais fértil e produtivo através das folhas e ramos que caem.
Além da sua importância vital, as plantas já vêm sendo utilizadas há anos na
biorremediação de sedimentos, água e solos contaminados. Recentemente, esta
12
técnica de biorremediação para solos contaminados, tem sido desenvolvida e
tornou-se uma área intensa de estudos científicos (ADAM, 2002).
Com relação à técnica de germinação de plantas, existe um consenso entre
os pesquisadores, que a temperatura para a germinação não apresenta um valor
específico. Para a maioria das espécies tropicais, a temperatura ótima de
germinação encontra-se entre 15 ºC e 30ºC. De maneira geral, temperaturas abaixo
da ótima reduzem a velocidade de germinação, resultando em alteração da
uniformidade de emergência das sementes, talvez em razão do aumento do tempo
de exposição ao ataque de patógenos. Por outro lado, temperaturas acima da ótima
aumentam a velocidade de germinação, embora somente as sementes mais
vigorosas consigam germinar (IPEF, 1998).
Os estudos de germinação são conduzidos por exposição direta da semente à
substância teste usando uma solução ou um suporte embebido na solução, como por
exemplo, papel de filtro. Para a avaliação do teste de germinação e crescimento das
raízes pode-se analisar tanto a taxa de germinação quanto o alongamento das raízes
(ou os dois).Duas grandes vantagens desse teste são o seu baixo custo e
simplicidade, pois não requer equipamentos sofisticados. Além disso, há a
vantagem de se necessitar de pouca quantidade de amostra. Por estes motivos,
muitos autores têm optado em utilizar esse teste para avaliar a influência da
contaminação na germinação de sementes.
Muitas espécies de plantas, incluindo repolho, cebola, tomate, pepino,
cevada e alface têm sido utilizadas nos testes de germinação e crescimento das
raízes. Esta última é recomendada por órgãos americanos e europeus como USEPA
(United
States
Enviromental
Protection
Agency),
FDA
(Federal
Drug
Administration), ASTM (American Society for Testing and Materials) e OECD
(Organization for Economic Cooperation and Development), sendo, portanto a
semente adotada neste projeto para a avaliação da sua germinação.
II.5- O emprego de testes ecotoxicológicos em solos contaminados
O conhecimento dos efeitos de poluentes químicos nos ecossistemas tem
recebido considerável atenção nos últimos anos. Dentre os métodos para
determinação do nível de contaminação encontram-se os que consistem na
13
utilização de organismos que têm contato direto com a matriz sólida do solo. Os
ensaios de toxicidade devem ser conduzidos de modo apropriado, utilizando uma
quantidade limitada de espécies, de compostos biológicos a serem identificados e
de rotas de exposição. Se esses fatores forem escolhidos cuidadosamente e os
resultados forem interpretados de forma investigativa, é possível o estabelecimento
de correlações adequadas.
Em um modelo conceitual de toxicidade do solo, organismos de diferentes
níveis tróficos podem estar expostos aos compostos tóxicos de duas formas:
diretamente através dos contaminantes ligados ao solo ou através da água
intersticial. Enquanto a relevância ecológica desses efeitos está fora de discussão,
outros parâmetros, como o crescimento microbiano pode ser considerado para
propósitos específicos (JUNG et al., 1995). Além disso, alguns autores (KÖRDEL
& HUND-RINKE, 2001) têm realizado testes de fitotoxicidade para avaliar a
qualidade dos ecossistemas solo - águas subterrâneas.
Atualmente, as análises toxicológicas são conduzidas em um nível de
organismo individual. Mas, ensaios envolvendo três níveis de organismos são
necessários para fornecer informações a respeito da estabilidade de populações com
níveis elevados de organização, como sobrevivência, crescimento e reprodução
(CHAPMAN, 1991). Se um organismo for capaz de preencher todas essas funções
integrativas, então ele não foi adversamente afetado pela contaminação.
Os dados de fitotoxicidade são comumente utilizados no desenvolvimento
de critérios de qualidade de águas, na avaliação de toxicidade de efluentes
industriais, e para a obtenção do registro de produtos químicos comerciais (REIS,
2003). A fitotoxicidade depende da composição química do meio, e pode ser devida
a substâncias orgânicas e inorgânicas, que causam alteração na salinidade,
desordem nutricional e/ou alterações metabólicas enzimáticas ou hormonais
(ORTEGA, 1996).
A germinação é um fenômeno biológico que pode ser considerado pelos
botânicos como a retomada do crescimento do embrião, com o subseqüente
rompimento do tegumento pela radícula. Entretanto, para os tecnologistas de
sementes, a germinação é definida como a emergência e o desenvolvimento das
estruturas essenciais do embrião, manifestando a sua capacidade para dar origem a
uma planta normal, sob condições ambientais favoráveis (IPEF, 1998).
14
A avaliação da germinação das sementes é efetuada pelo teste de
germinação, conduzida em laboratório sob condições controladas e por meio de
métodos padronizados. Muitos autores têm optado em utilizar esse teste para avaliar
a fitotoxicidade de metais pesados e compostos fenólicos (WONG, 1995), lodos de
estação de tratamento de efluentes e resíduos sólidos urbanos (PASCUAL, 1997), e
composto orgânico (WONG, 1995; PASCUAL, 1997).
Porém, para a realização de um teste completo no solo devem ser incluídos
organismos como nematóides e anelídeos. Vários experimentos vêm sendo
conduzidos para avaliar a toxicidade de substâncias químicas a anelídeos, tais
como: Eisenia foetida e para identificar poluentes que podem prejudicar o
crescimento e a reprodução dessas espécies tão valiosas para o ecossistema do solo.
Um outro ensaio de toxicidade é baseado na taxa de mortalidade de Eisenia foetida,
uma pequena minhoca avermelhada com menos de 10 cm de comprimento,
encontrada em adubos e esterco. Esse organismo vem sendo largamente utilizado
na avaliação da toxicidade de diversas substâncias, fornecendo um extenso banco
de dados (YERUSHALM et al., 2003).
15
Capítulo III: Materiais e Métodos
Este capítulo apresenta os materiais utilizados nos experimentos realizados
neste projeto, assim como as metodologias utilizadas em cada teste de
ecotoxicidade.
III.1 – Solos utilizados:
Foram utilizados dois tipos de solos, um solo predominantemente argiloso
(38% areia, 8% silte e 54% argila) proveniente da cidade de Duque de Caxias na
realização dos testes de mortalidade de minhocas e de germinação de sementes. E
um solo Franco Argilo Arenoso para os testes de atividade desidrogenásica. Esta
mudança foi necessária devido ao lento crescimento de bactérias heterotróficas
totais, que são necessárias à detecção do método utilizado nos testes de atividade
desidrogenásica com o solo argiloso. O solo substituído e que foi utilizado nos
testes de atividade desidrogenásica, possui características predominantemente
arenosas (60% areia, 6% silte e 34% argila). O solo denominado neste projeto como
inóculo aeróbio, foi desenvolvido a partir de um solo natural, proveniente de
Guararema / SP, contaminado acidentalmente por óleo cru, onde os microrganismos
foram bioestimulados por adição de solução nutriente Bushnell Haas (SIGMA
1997) e de óleo diesel comercial como fonte de carbono. A concentração de
contaminante final no inóculo aeróbio desenvolvido no laboratório foi de 3% mL/g
de óleo diesel.
III.2 – Contaminantes avaliados:
Os contaminantes utilizados no teste de mortalidade de minhocas e na
germinação de sementes foram diesel e gasolina provenientes do posto de gasolina
da BR Distribuidora localizado na Ilha do Fundão. Para o teste de atividade
desidrogenásica foi utilizado apenas o diesel como contaminante, devido à
contaminação prévia do inoculo aeróbio com óleo diesel.
16
III.3- Teste da taxa de mortalidade de minhocas:
O método é baseado na contagem da mortalidade de minhocas em solos
com diferentes graus de contaminação. Foi utilizada a minhoca vermelha-daCalifórnia ou minhoca de esterco (Eisenia foetida) para a realização dos testes.
Preparação das amostras de solo:
Foram pesados e misturados 200g de solo e 20g de esterco. A relação de
esterco utilizada foi de 10%, segundo a metodologia adaptada da “Organization for
Economic Cooperation and Development (OECD)” - Guia para Testes Químicos
nº207 (OECD - 1984).
Procedimento de contaminação:
A contaminação foi feita por adição direta de diesel ou gasolina às amostras
de solo, seguida de homogeneização. As concentrações aplicadas foram calculadas
pela relação entre o volume do contaminante puro e a massa de amostra de solo.
Acondicionamento das minhocas nas amostras de solo:
Foram separadas 10 minhocas para cada amostra de solo. Estas foram
colocadas em uma peneira, lavadas e em seguida adicionadas às amostras de solo.
Estas amostras foram acondicionadas em vidros com dimensões equivalentes aos da
metodologia utilizada (OECD) que foram envoltos com papel, na tentativa de se
aproximar do sítio natural das minhocas. Os recipientes de vidros com as amostras
de solo e as minhocas foram tampados com perfex e elásticos. As amostras foram
acondicionadas em local seco e com temperatura ambiente (~25ºC).
17
Quantificação do método:
Após 7 dias de acondicionamento realizou-se a contagem das minhocas
sobreviventes, após o contato com o contaminante utilizado.
Material:
-Frascos de vidro
-Perfex
-Elásticos
- Minhocário
As Figuras 6 e 7 mostram respectivamente o minhocário e os recipientes de
vidro que foram utilizados para armazenar as minhocas com os solos contaminados.
Figura 6: Foto do Minhocário
Figura 7: Foto das amostras com minhocas
O minhocário foi desenvolvido no laboratório segundo a metodologia
adaptada (OECD), com dimensão, nutrientes e monitoramento segundo indicado no
Guia para Testes Químicos da OECD (1984). Os vidros utilizados para o
acondicionamento das amostras, seguem o padrão utilizado na literatura
especializada (OECD) quanto à altura e largura.
III.4- Atividade Desidrogenásica:
O método é baseado na estimativa da taxa de redução de TTC
(trifeniltetrazolium clorídrico) a TPF (trifenil formazam) nos solos após incubação
a 30ºC por 24 h. O TTC funciona como um aceptor artificial de elétrons, sendo,
18
portanto um dos métodos mais frequentemente usado para estimar a atividade
desidrogenase no solo.
TTC + 2H+ + 2e- ! TPF + HCl
Preparação das Amostras:
Foram pesados 5g de solo e adicionou-se 5mL de solução de TTC.
Solo utilizado:
Foi utilizado o inóculo aeróbio cuja umidade foi monitorada e controlada
em torno de 20% e a temperatura mantida em 25ºC. O pH foi corrigido carbonato
de cálcio e mantido próximo à neutralidade. O crescimento do inóculo foi
acompanhado pela contagem de bactérias heterotróficas totais. No início das
análises o inóculo já havia sido desenvolvido no laboratório e possuía
aproximadamente 105 bactérias heterotróficas totais/ g de solo. Foi efetuada a
caracterização deste solo com análises complementares como: teor de
hidrocarbonetos totais de petróleo (TPH), pH, teor de umidade, teor de fósforo
total, teor de nitrogênio total e teor de matéria orgânica.
Preparo do Frasco Controle:
Foram pesados 5g de solo e adicionou-se 5mL de solução tampão tris –
HCl.
Preparação da solução TTC:
Dissolve-se 1,5 g de TTC em 80 mL de solução tampão tris-HCl e
completa-se o balão volumétrico de 100mL.
Preparação da solução de Tris – HCl:
Dissolve-se 12,1 g de tris (hidroximetil)-aminometano em 700mL de água
destilada e ajusta-se o pH de acordo com a característica do solo utilizado. O pH
19
do solo é cerca de 6,5 segundo metodologia adaptada (ALEF & NANNIPIERRE,
1995), ajustou-se o pH para 7,6 com carbonato de cálcio e completou-se o volume a
1000 mL.
Acondicionamento das amostras:
As amostras foram acondicionadas em estufa a 30ºC por 24 h.
Medição espectrofotométrica:
Adiciona-se 25 mL de metanol em cada frasco com amostra, em seguida
agita-se levemente os frascos e transfere-se o conteúdo para tubos de centrífugas.
Mantêm as amostras por 15 minutos na centrífuga com velocidade de 150 rpm.
Filtram-se as amostras com algodão e em seguida é realizada a leitura em
espectrofotômetro a 485 nm.
Construção da curva padrão:
Dissolve-se 0,1 g de TPF em 80mL de metanol e em seguida completa-se o
volume a 100mL. Foram feitas diluições desta solução padrão em 0,01 a 0,05 g/l. A
curva padrão foi feita com TPF em metanol e a leitura é dada em TPF µg/mL.
Material:
- Frascos âmbar (30mL) com tampas
- Estufa a 30ºC
- Solução tampão tris-HCl (100mM)
- Solução de TTC
- Metanol
- Algodão
- Funil
- Espectrofotômetro
III.5– Sementes utilizadas:
As sementes utilizadas nos ensaios de germinação foram de alface crespa
(Lactuca sativa) - Grand Rapids TBR (Isla Pak), provenientes do comércio varejista
20
do Município do Rio de Janeiro. Com o objetivo de se garantir uma uniformidade
na qualidade das sementes adquiridas no comércio, adquiriram-se todas as sementes
utilizadas neste projeto num único estabelecimento comercial especializado no
comércio de produtos agropecuários.
III.6 - Teste de Germinação de Sementes:
O método é baseado na taxa de redução do crescimento das radículas (das
sementes germinadas) com o aumento da concentração de contaminante utilizado.
Após 5 dias, realiza-se a contagem do número de sementes germinadas e mede-se o
tamanho das radículas (YERUSHALMI et al.,2003).
Preparação da solução teste:
Foram pesados 10g de solo previamente contaminado e misturados a 50 mL
de água destilada.
Preparação das diluições:
Foram preparadas 5 diluições a partir de 1 mL da solução teste. Estas
diluições (1:10) são feitas em cinco tubos de ensaio contendo 9mL de água
destilada em cada tubo, adiciona-se 1mL da solução teste no tubo (1ºdiluição) e em
seguida adiciona-se 1mL da 1º diluição no tubo (2º diluição) e assim
sucessivamente até o tubo da 5º diluição.
Preparação das sementes:
As sementes foram lavadas com uma solução 0,1% de NaClO por 20
minutos sob agitação.
Posteriormente, as mesmas foram lavadas com água
destilada por 10 minutos sob agitação e secas em papel de filtro.
Preparação das placas de Petri:
Foram colocados 2 mL de cada diluição em placas de vidro contendo um
papel de filtro número 5 cada. Colocaram-se 10 sementes em cada placa.
21
Figura 8: Foto da preparação das placas de Petri
Preparação das placas de Petri de controle:
Foram preparadas duas placas de controle em duplicata: Controle positivo
(água destilada) e Controle negativo (solução de acido Bórico-80mgB/l).
Colocaram-se 10 sementes em cada placa.
Acondicionamento das placas:
As placas foram acondicionadas em estufa (30ºC).
22
Figura 9: Foto da estufa de acondicionamento das placas
Fórmula utilizada:
- Percentual de Índice de Germinação = (percentual de germinação das sementes)
x (percentual de crescimento das raízes) / 100
Onde:
- percentual de germinação de sementes = (nº de sementes germinadas/ nº de
sementes totais) x 100
- percentual de crescimento das raízes = (média dos tamanhos das radículas nas
amostras/ média dos tamanhos das radículas no branco (amostra com H2O)) x 100
III.7 - Análises Complementares nos solos:
•
TPH (Hidrocarbonetos Totais de Petróleo)
Este método tem sido o mais específico para análise de solo contaminado
com óleo. Utiliza-se neste método como solvente o S-316 para extrair o óleo do
solo e um espectrofotômetro de infravermelho (OCMA-350), para a leitura da
amostra (HORIBA,1995). O equipamento opera numa faixa de comprimento de
onda de 3,38 a 3,50 µm, capaz de medir as configurações CH (3,38 µm), CH2
(3,42 µm) e CH3 (3,50 µm) (EPA,2001).
Procedimento experimental:
Pesa-se 0,1g de solo seco e adiciona-se 30 mL de solvente S-316. A
extração é feita a frio por banho de ultra-som durante 30 minutos. Após a extração,
a solução é filtrada em papel de filtro Whatman nº 40 com 2 g de sílica gel. Em
seguida, faz-se a leitura no equipamento OCMA-350.
23
•
Teor de Fósforo Total
O teor de fósforo total é medido segundo metodologia adaptada para o solo
estudado segundo adaptação JARAMILLO (1996).
Procedimento experimental:
Pesa-se 13 gramas de solo e adiciona-se 91 mL de solução extratora,
contendo fluoreto de amônio 1 N em solução ácida diluída (HCl). Finalidade:
extrair do solo as formas de fósforo facilmente solúveis em meio ácido, assim como
grande parte dos fosfatos de cálcio e uma fração dos fosfatos de alumínio e ferro
devido à formação de complexos com os íons metálicos quando se encontram em
solução ácida.
Após 24 horas de contato entre o solo e a solução extratora, o extrato
obtido é centrifugado, filtrado em membrana Millipore (0,45 µm de poro). Em
seguida, adiciona-se 35 mL do extrato, 10 mL de uma solução de molibdato
vanadato (1 N) e o volume é completado para 50 mL. Após 10 minutos, é feita a
leitura da absorbância no espectrofotômetro no comprimento de onda de 450 nm. A
concentração de fósforo total é obtida de acordo com curva-padrão previamente
preparada, empregando-se KH2PO4 como padrão. O teor de fósforo é calculado de
acordo com a Equação 1.
C
*V
P =  extrato extratora
 m solo *1.000



(Equação 1)
Onde:
P = teor de fósforo no solo [g/Kg]
Cextrato = concentração de fósforo total [mg/L]
Vextratora = volume utilizado da solução extratora [mL]
msolo = massa de solo [g]
1000 = fator de conversão
•
Teor de Matéria Orgânica:
24
O teor de matéria orgânica presente nas amostras de solo consiste num
procedimento indireto por meio do qual se determina o teor de carbono da matéria
orgânica. Esta quantificação é realizada por combustão úmida, empregando-se o
ácido crômico como oxidante (resultante da reação do dicromato de potássio com o
ácido sulfúrico). O dicromato de potássio residual, que permanece após a reação de
oxidação, é titulado com uma solução de sulfato ferroso 0,5 N. Segundo a
metodologia, 77% do carbono total da matéria orgânica é oxidado nas condições do
ensaio, obtendo-se uma aproximação aceitável do conteúdo de carbono orgânico no
solo. Para a conversão de matéria orgânica a carbono, considera-se que 58% da
matéria orgânica é formada por carbono orgânico (JARAMILLO, 1996). Um ensaio
em branco é feito sem a adição de solo, para se descontar qualquer carbono
orgânico presente nos reagentes.
O cálculo do teor de matéria orgânica (% p/p) das amostras de solo foi
realizado segundo a Equação 2
 V
% MO = Vdicromato * 1 −  amostra
  Vbranco

  * K


(Equação 2)
Onde:
%MO = teor de matéria orgânica
Vdicromato = volume de dicromato de potássio utilizado [mL]
Vamostra = volume de sulfato ferroso 0,5 N utilizado na titulação da
amostra [mL]
Vbranco = volume de sulfato ferroso 0,5 N utilizado na titulação do
branco [mL]
K = N*(0,003/0,77)*(100/m)*1,72
1,72 = fator de conversão do carbono na matéria orgânica
Sendo que:
N = normalidade da solução de dicromato de potássio
0,003 = miliequivalente grama do carbono
m = massa da amostra de solo [g]
0,77 = fator de conversão (77% do carbono total da matéria
orgânica é oxidado)
25
•
pH
O pH do solo é medido através do método potenciométrico padrão.
Utiliza-se um medidor de pH previamente calibrado com solução tampão (pH 7,0 e
4,0).
Procedimento experimental:
Pesa-se 10g de solo e adiciona-se 25 mL de água destilada. Agita-se por
10 minutos e mede-se o pH real do solo.
•
Teor de Umidade Total
A determinação do teor de umidade total é realizada através de método
gravimétrico, empregando a balança IV2000 Gehaka, que utiliza um sistema de
secagem por infravermelho e fornece automaticamente o teor de água presente na
amostra.
•
Teor de Nitrogênio Total
A determinação de nitrogênio nas amostras de solo, consiste em uma
modificação do método de Kjeldahl para que a análise inclua os nitratos presentes
na amostra, de acordo com JARAMILLO (1996).
Procedimento experimental:
O nitrogênio orgânico e os nitratos são convertidos a sulfato de amônio,
destilados e coletados em ácido bórico. Em seguida, procede-se a titulação com
solução de HCl 0,1 N, utilizando-se vermelho de metila como indicador. Um ensaio
em branco, sem adição de solo, é feito para eliminar a possível interferência
causada pela presença de nitrogênio nos reagentes utilizados.
O teor de nitrogênio é calculado de acordo com a Equação 3.
%N = (
V HCl
amostra
− V HCl
m
branco
) * 0,1 * 1,4
(Equação 3)
26
Onde:
%N = teor de nitrogênio na amostra [% p/p]
VHClamostra = volume de HCl gasto para titular as amostras de solo [mL]
VHClbranco = volume de HCl gasto para titular o branco [mL]
m = massa de solo amostrada [g]
0,1 = normalidade de HCl
1,4 = fator de conversão
Capítulo V: Resultados e Discussão:
Este capítulo contém os resultados obtidos ao longo dos experimentos e que
serão apresentados de acordo com o tipo de solo utilizado em cada teste.
V.1- Resultados dos testes realizados com solo argiloso:
Caracterização do solo argiloso:
Primeiramente, foi necessária a caracterização do solo argiloso utilizado nos
testes. A Tabela2 apresenta os valores correspondentes ao solo argiloso utilizado
nos testes de mortalidade de minhocas e na germinação de sementes.
Tabela 2: Média dos resultados obtidos na caracterização do solo argiloso
pH
Teor de umidade (%)
Matéria Orgânica (g /kg solo)
TPH (g / kg solo)
P (mg / kg solo)
N (g / kg solo)
4,5 ± 0,1
13,9 ± 0,3
30,5 ± 2,5
1,23 ± 0,01
2±1
0,28 ± 0,02
Ao compararmos os valores obtidos (Tabela 2), com a classificação da
literatura especializada (JARAMILLO, 1996), observa-se que o solo argiloso
utilizado nos ensaios de mortalidade de minhocas e na germinação de sementes
27
encontra-se: rico em matéria orgânica, pobre em fósforo e com médios teores de
nitrogênio.
Ensaios com minhocas:
Os ensaios com minhocas foram realizados com a finalidade de determinar
uma faixa de concentração do contaminante que seja letal para a espécie de
minhoca utilizada. Os ensaios foram realizados em triplicata. A Tabela 3 apresenta
a média dos resultados dos ensaios de mortalidade de minhocas com diferentes
concentrações de diesel e seus respectivos erros. A Figura 10 apresenta o gráfico
com os resultados.
Tabela 3: Média dos resultados do teste com minhocas da contaminação com
diesel
Contaminação diesel (%)
Média do número de
indivíduos sobreviventes
0,00
10 ± 0
0,05
10 ± 0
0,06
9±1
0,07
8±1
0,08
7±1
0,09
6±1
0,10
5±1
0,20
4±1
0,30
3±0
0,40
2±1
0,50
1±1
28
12
Número de minhocas sobreviventes
10
8
6
4
2
0
0,05
0,06
0,07
0,08
0,09
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
% Diesel
Figura 10: Gráfico da média da mortalidade de minhocas da contaminação com
diesel
Dentre as concentrações estudadas, a partir de 0,06 % mL/g ocorre o início
da mortalidade das minhocas e esta sofre acréscimo com pequenos incrementos da
concentração do contaminante. A concentração onde ocorre o início da mortalidade
é definida neste trabalho como concentração inicial letal (CIL). Para o diesel o
valor da CIL foi igual a 0,06% mL/g. Segundo DORN (1998) um parâmetro
importante para o teste de mortalidade de minhocas é a determinação da
concentração letal para 50% da população (CL50), que foi de 0,1% mL/g de diesel.
Encontrada a CIL, buscou-se quantificar a concentração de TPH que
representava esta concentração, realizou-se a análise de TPH. Segundo o Criteria
Working Group (1998), TPH é um dos parâmetros freqüentemente usado para a
avaliação de uma contaminação proveniente de um vazamento de petróleo.
O Criteria Working Group (1998), sugere que a resposta de TPH não pode
ser usada para estimar quantitativamente o risco à saúde. As mesmas concentrações
de TPH podem representar composições muito diferentes de hidrocarbonetos e,
consequentemente, riscos diferentes à saúde humana e ao ambiente. Como foi visto
anteriormente, TPH é a soma de todos os hidrocarbonetos presentes na amostra, ou
29
seja, tem-se a soma da concentração total de hidrocarbonetos presentes na amostra
e não a concentração de cada classe ou dos hidrocarbonetos presentes.
. O Criteria Working Group (1998) considera TPH como sendo uma
ferramenta que pode ser usada para três finalidades: (i) identificação de uma
contaminação; (ii) avaliação do grau de contaminação; e (iii) avaliação do
progresso de uma remediação.
O teor de hidrocarbonetos totais de petróleo obtido quando a concentração
de diesel no testes de mortalidade de minhocas é de 0,06% mL/g (CIL) é de 1,71 ±
0,01 g/kg. Ao compararmos o resultado do teste de TPH para o solo argiloso
virgem (Tabela 4) com o solo contaminado com a CIL, observa-se um aumento de
aproximadamente 39 % de hidrocarbonetos totais de petróleo, que provavelmente
são os responsáveis pelo início da mortalidade das minhocas.
A seguir, apresenta-se a média dos resultados do teste da mortalidade de
minhocas com solo contaminado com gasolina na Tabela 4.
Tabela 4: Média dos resultados do teste com a contaminação de gasolina
Média
Contaminação
gasolina (%)
0,07
0,10
0,30
0,40
0,50
0,70
0,90
10 ± 0
10 ± 0
8±1
1±2
0±0
0±0
0±0
30
12
N• de minhocas sobreviventes
10
8
6
4
2
0
0,07
0,10
0,30
0,40
0,50
0,70
0,90
% Gasolina
Figura 11: Gráfico da média da mortalidade de minhocas da contaminação com
gasolina.
A partir dos resultados pôde-se observar que uma queda aguda no número
de minhocas sobreviventes quando o contaminante é a gasolina, quando há o
aumento da concentração do contaminante de 0,3 % mL/g para 0,4% mL/g. Tal fato
pode ser sustentado pela formação de uma atmosfera tóxica nesta faixa de
concentração YOUN-JOO AN (2004).. Isto ocorre devido ao alto teor de
compostos orgânicos voláteis (COV’s) presentes na gasolina que possui uma alta
pressão de vapor (CATALUÑA 2005).
Comparando-se estes resultados com os de contaminação com diesel, podese concluir que o incremento da mortalidade com o aumento da concentração de
diesel no solo é bem menos drástico do que com a gasolina. Isto pode ser
sustentado pela diferença de difusão dos contaminantes no solo.
Da Figura 11, pode-se concluir que a partir de 0,5% mL/g de gasolina no
solo argiloso, torna-se inviável a sobrevivência para minhocas da espécie Eisenia
foetida. Além disso, pode-se inferir que a CIL encontra-se na faixa de 0,3% mL/g
de gasolina para o solo argiloso. Na tentativa de inferir o teor de hidrocarbonetos
totais de petróleo possui o ensaio com 0,3% mL/g de gasolina. Para a concentração
de 0,3% mL/g de gasolina, a media dos ensaios de TPH realizados foi igual a 3,39±
0,02 g/kg.
31
Verifica-se que o teor de hidrocarbonetos totais de petróleo aumentou em
aproximadamente 176 % com relação ao solo virgem.
Tabela 5 apresenta a comparação entre a contaminação com diesel e gasolina em
diferentes concentrações para a mortalidade de minhocas da espécie Eisenia
foetida.
Tabela 5: Comparação do teste com minhocas com contaminação com diesel e
gasolina
%
Contaminante
0,07
Minhocas
Minhocas
sobreviventes sobreviventes
diesel
gasolina
9±1
10 ± 0
0,10
5±1
10 ± 0
0,30
3±0
8±1
0,50
1±1
0±0
12
N• de minhocas sobreviventes
10
8
Diesel
Gasolina
6
4
2
0
0,07
0,1
0,3
0,5
% Contaminante
Figura 12: Gráfico comparativo da média da mortalidade de minhocas com
contaminação com diesel x gasolina.
32
A Figura 12 demonstra o decréscimo proporcional de minhocas
sobreviventes da contaminação com diesel (fração mais pesada derivada do
Petróleo quando comparada com a gasolina) e a queda acentuada das minhocas
sobreviventes a partir de 0,3% mL/g de gasolina. Tal afirmativa pode ser sustentada
possivelmente pela dificuldade de difusão do contaminante pelo solo além da
influência da atmosfera dos compostos orgânicos voláteis (COV’s) (YOUN-JOO
2004). Sendo assim, há maior dificuldade de contato com contaminantes mais
pesados, especialmente quando estes estão em concentrações muito reduzidas.
Um trabalho específico merece menção, pois confirma uns dos resultados
obtidos neste projeto. SHAEFER & JULIANE, 2006, testaram a eficiência da
utilização das minhocas e, ou aditivos orgânicos como biorremediação (degradação
de TPH) de solos com contaminação moderada e onde procedimentos nãobiológicos não são economicamente viáveis. Os resultados mostraram que a
atividade das minhocas é efetiva na biorremediação e no aumento da atividade
microbiana e que a adição de matéria orgânica, por sua vez, apesar de aumentar a
atividade microbiana, não mostrou, entretanto efeito significativo na redução dos
níveis de TPH. Portanto, é ressaltada aqui a relevância da determinação das
concentrações limites da ecotoxicidade para as minhocas, para que seja possível o
delineamento de ações de biorremediação baseados nas vantagens da utilização
desses organismos.
Ensaios de germinação de sementes:
Os ensaios de germinação de sementes em solo argiloso tiveram por
finalidade determinar o quanto à contaminação do solo por diesel e gasolina
prejudica a germinação e consequentemente o crescimento das plantas. A
contaminação do solo foi realizada três dias antes do início do ensaio. A Tabela6
apresenta a média do número de sementes germinadas com 10% mL/g de diesel e
os seus respectivos erros.
33
Tabela 6: Média dos dados obtidos da germinação de sementes com 10% mL/g
diesel
Média do número de
sementes germinadas
10 ± 1
9±1
9±1
10 ± 0
10 ± 1
9±2
10 ± 0
9±2
Placa
solução teste (10%)
1ºdiluição (1%)
2ºdiluição (0,1%)
3ºdiluição (0,01%)
4ºdiluição (0,001%)
5ºdiluição (0,0001%)
H2O
H3BO3
12
Nº de sementes germinadas
10
8
6
4
2
3
H3BO
H2 O
ição
5ºdilu
ição
4ºdilu
ição
3ºdil
u
ição
2ºdil
u
ição
1ºdil
u
soluç
ão te
ste
0
Figura 13: Gráfico com a média do número de sementes germinadas com 10%
mL/g diesel
A partir da Tabela 6, verificou-se que todas as sementes germinaram na
solução teste e que 10% mL/g de Contaminação de diesel no solo argiloso não
influencia na germinação de sementes do tipo Lactuca sativa.
Nesse ensaio pode-se verificar além do crescimento das radículas, o
aparecimento de folhas. Porém o que causou certa estranheza e deve ser ressaltado
foi o alto número de sementes germinadas no acido bórico, que foi utilizado como
34
um controle negativo. O controle negativo quanto ao número de sementes
germinadas, realmente não foi como o esperado, pois a metodologia empregada não
especificou a concentração do ácido bórico e provavelmente a concentração de 80
mg/l não foi suficiente para inibir a germinação. Porém o controle negativo
funcionou com relação ao crescimento das radículas, pois nas sementes germinadas
não ocorreu o crescimento das mesmas na maioria das sementes.
A partir da Figura 13, fica caracterizada que a contaminação de 10% mL/g
de diesel no solo argiloso não foi suficiente para afetar a germinação das sementes
de alface.
Tabela 7: Média dos dados obtidos da germinação de sementes com 20% mL/g
diesel
Placa
solução teste (20%)
1ºdiluição (2%)
2ºdiluição (0,2%)
3ºdiluição (0,02%)
4ºdiluição (0,002%)
5ºdiluição (0,0002%)
H2O
H3BO3
Média do
número de
sementes
germinadas
9±1
9±2
10 ± 1
9±2
10 ± 1
10 ± 1
10 ± 0
9±1
35
12
Nº de sementes germinadas
10
8
6
4
2
3
H3B
O
H2O
5ºdil
uiçã
o
4ºdil
uiçã
o
3ºdil
uiçã
o
2ºdilu
ição
1ºdilu
ição
solu
ção
teste
0
Figura 14: Gráfico com a média do número de sementes germinadas com 20%
mL/g diesel
De acordo com a Figura 14, a contaminação de 20% mL/g de diesel no solo
argiloso, não influencia quanto ao número de sementes germinadas. Porém,
verificou-se que há uma redução de aproximadamente 10% quanto ao crescimento
das radículas.
Os resultados de contaminação com 30% mL/g de diesel estão apresentados
a seguir.
Tabela 8: Média dos resultados da germinação de sementes com 30% mL/g diesel
Placa
solução teste (30 %)
1ºdiluição (3 %)
2ºdiluição (0,3 %)
3ºdiluição (0,03 %)
4ºdiluição (0,003 %)
5ºdiluição (0,0003%)
H2O
H3BO3
Média do número
de sementes
germinadas
8±0
10 ± 0
9±1
9±1
8±2
10 ± 0
10 ± 2
9±1
36
12
Nº de sementes germinadas
10
8
6
4
2
3
H3B
O
H2O
5ºd
ilui
ção
4ºd
ilui
ção
3ºd
ilui
ção
2ºd
ilui
ção
1ºd
ilui
ção
sol
uç
ão
tes
te
0
Figura 15: Gráfico com a média do número de sementes germinadas com 30% diesel
De acordo com a Tabela 8, a concentração de 30% mL/g de diesel afeta
tanto o número de sementes germinadas quanto no crescimento das radículas; que
apresentaram uma redução de aproximadamente 25%. A Figura 15 demonstra a
interferência da contaminação de diesel no solo argiloso com relação ao número de
sementes germinadas. E novamente as amostras de controle negativo germinaram,
mas não apresentaram radícula. Na Tabela 9 estão apresentados os resultados do
teste de germinação com 40% mL/g diesel.
Tabela 9: Média dos resultados da germinação de sementes com 40% mL/g diesel
Placa
solução teste (40%)
1ºdiluição (4%)
2ºdiluição (0,4%)
3ºdiluição (0,04%)
4ºdiluição (0,004%)
5ºdiluição (0,0004%)
H2O
H3BO3
Média do número
de sementes
germinadas
5±2
9±2
8±1
9±0
10 ± 0
9±2
10 ± 0
8±2
37
Constatou-se a partir da Tabela 9, que uma contaminação de 40% mL/g de
diesel no solo argiloso reduziu em 50% o número de sementes germinadas e
também reduziu em 50% o crescimento das radículas. Da Figura 16 observa-se a
queda de 50% no número de sementes germinadas na solução teste com 40% mL/g
de diesel
12
Nº de sementes germinadas
10
8
6
4
2
3
H3B
O
H2O
5ºdil
uiçã
o
4ºdil
uiçã
o
3ºdilu
ição
2ºdil
uiçã
o
1ºdil
uiçã
o
solu
ção
teste
0
Figura 16: Gráfico com a média do número de sementes germinadas com 40%mL/g diesel
Na Tabela 10 estão apresentados os resultados obtidos nos testes de sementes com
50% mL/g diesel.
Tabela 10: Média dos dados obtidos da germinação de sementes com 50% mL/g
diesel
Placa
solução teste (50%)
1ºdiluição (5 %)
2ºdiluição (0,5 %)
3ºdiluição (0,05 %)
4ºdiluição (0,005 %)
5ºdiluição (0,0005%)
H2O
H3BO3
Média do número de
sementes germinadas
2±2
8±1
9±1
9±2
8±2
9±2
10 ± 0
8±1
38
A partir da Tabela 10 verifica-se que em 98% das placas não há germinação
de sementes de alface quando a concentração de diesel atinge os 50% mL/g. Nesta
concentração há uma redução do crescimento das radículas de aproximadamente 90
% nas sementes que germinaram.
12
Nº de sementes germinadas
10
8
6
4
2
H3BO
3
H2O
ição
5ºdilu
ição
4ºdilu
ição
3ºdilu
ição
2ºdilu
ição
1ºdilu
soluç
ão te
s
te
0
Figura 17: Gráfico com a média do número de sementes germinadas com 50% diesel
A partir da Figura 17 observa-se redução de 98% quanto ao número de
sementes germinadas na solução teste com 50 % mL/g de diesel. Na Tabela 11
estão apresentados os índices de germinação em relação ao percentual de
contaminação de diesel.
Tabela 11: Média dos índices de germinação com contaminação de diesel
%
diesel
10
20
30
40
50
Índice de Germinação
(%)
80 ± 3
46 ± 3
34 ± 0
32 ± 3
2±3
39
De acordo com a Tabela 11, com40 % mL/g de diesel no solo
argiloso torna-se inviável a germinação de sementes do tipo Lactuca sativa. A
Figura 18 abaixo, mostra a queda brusca no índice de germinação quando a
contaminação está acima de 40% de diesel.
90
80
Indice de Germinação
70
60
50
40
30
20
10
0
10
20
30
40
50
% Diesel
Figura 18: Gráfico do Índice de Germinação de sementes contaminadas com diesel.
Durante o período de experimentos, houve dificuldades com os testes de
germinação de sementes de alface com a gasolina como contaminante. Na primeira
tentativa experimental, a solução evaporou em todas as placas consequentemente
nenhuma semente germinou. Na segunda tentativa, foi modificada a temperatura no
controlador de temperatura da estufa e verificou-se que a solução não evaporou,
porém nenhuma semente germinou novamente. Possivelmente, o problema era
proveniente das sementes utilizadas, pois as mesmas já se encontravam em uso e
poderiam ter sofrido influência da umidade. Uma nova embalagem com sementes
foi utilizada. Desta vez as placas que se encontravam na parte superior da estufa
germinaram sem problemas, porém as placas encontradas na parte inferior da
estufa, a solução evaporou e consequentemente as sementes não germinaram.
Devido às variações citadas anteriormente com o teste de germinação utilizando a
40
gasolina como contaminante, pode-se verificar a sensibilidade da germinação das
sementes de alface com a variação de temperatura, o que está de acordo com
descrito por DORN, 1998.
Sendo assim, alguns trabalhos específicos merecem menção, pois
confirmam os resultados obtidos neste projeto. ADAM & DUNCAN, 2002
mostraram que a resposta aos testes de germinação apresentaram grande
variabilidade em função das espécies vegetais utilizadas e que a fração volátil
parece desempenhar grande influência no retardamento da emergência e na redução
do percentual de germinação. O diesel remanescente no solo também apresenta
efeito inibidor na germinação pelo impedimento das trocas de água e oxigênio entre
a semente. GONG et al 2000, investigaram o processo de germinação em testes
ecotoxicológicos, estudando a influência das espécies utilizadas, do manejo da
adição de água e do método de avaliação. Também neste trabalho foi evidenciada a
necessidade de controle das condições experimentais e da variabilidade dos
resultados da avaliação e sua dependência do método empregado. SMITH et al,
2005, testaram o efeito de PAHs (hidrocarbonetos aromáticos policíclicos) na
germinação e subseqüente crescimento de folhas e legumes. Neste estudo, assim
como em outros, a ausência de correlação entre a qualidade da germinação e o
crescimento subseqüente das espécies testadas foi atribuída a uma forte
dependência das condições experimentais, onde a volatilidade, o grau de toxidez
específico e a concentração de cada substância contaminante apresentam grande
relevância.
HERNANDEZ et al (2006) testaram os efeitos tóxicos de diesel, gasolina e
óleo cru aplicando duas concentrações de cada contaminante (5 e 10%) em dois
tipos de solos, um arenoso e outro argiloso. Os experimentos foram realizados à
temperatura e capacidade de retenção de água controlada entre 50 e 70%, sendo
monitorados por seis meses após a contaminação. Foram monitorados o teor de
carbono da biomassa microbiana, a atividade enzimática e a fitotoxidade. Os efeitos
tóxicos foram mais intensos no solo arenoso e o contaminante que causou maiores
prejuízos nas propriedades monitoradas foi a gasolina. Também foi encontrado que
o solo argiloso e com maior teor de matéria orgânica foi menos afetado por este
tipo de contaminação.
Esses trabalhos confirmam as dificuldades específicas inerentes aos testes
de germinação, indicando que este método necessita de um maior investimento em
41
controle e seleção específica dos cultivares em função do tipo de solo e
contaminação em estudo.
V.2- Resultados dos testes de atividade desidrogenásica
Antes de iniciarem as análises, foi preparado o solo de partida, com a
tentativa de se estimular a atividade microbiana no solo argiloso “virgem” e a partir
daí iniciar o processo de contaminação para avaliar o efeito do aumento da
concentração de diesel neste solo. A preparação deste solo “virgem” consistiu em:
ajuste de pH com adição de carbonato de cálcio, adição de fertilizante e solução
nutriente Bushnell Haas, e controle de umidade. Contudo, após esse período de
preparo do solo “virgem” não foi possível o desenvolvimento de bactérias
heterotróficas totais suficientes para a detecção do método. Em função disto,
adotou-se como solo de partida para os testes de atividade desidrogenásica um
“inóculo” que já havia sido desenvolvido no laboratório há 4 anos, que será
caracterizado a seguir. Abaixo segue a Figura 19 com a comparação entre a
atividade do solo argiloso “virgem” representado nos potes de número 3, 4, 5 e 6 e
o “inóculo” representado nos potes número 1 e 2.
Figura 19: Foto da comparação entre os resultados de atividade desidrogenásica do solo
argiloso “virgem” e o inóculo.
42
Caracterização do inoculo aeróbio:
Para o teste de atividade desidrogenásica utilizou-se um solo já
bioestimulado e desenvolvido há 4 anos no Laboratório de Tecnologia Ambiental
(LTA/EQ/UFRJ). Na Tabela 12 são apresentados os resultados da caracterização do
inóculo.
Tabela 12: Resultados das análises complementares
Testes realizados com o inóculo
Resultados
pH
6,06 ± 0.1
Teor de Fósforo Total (mg / kg solo)
103 ± 0,008
Teor de Matéria Orgânica (g /kg solo)
67,71 ± 3,57
Teor de Umidade (%)
10,2 ± 0.2
Nitrogênio (g / kg solo)
1,66 ± 0,26
TPH (g / kg solo)
8,94 ± 0,26
Bactérias heterotróficas totais
105 ± 0
Construção da curva padrão da atividade desidrogenásica:
A curva padrão foi construída para transformar a leitura da absorbância (nm) em
TPF (g/l), sendo os dados apresentados na Tabela 13 e a curva na Figura 20.
Tabela 13: Dados obtidos para a construção da curva padrão
TPF
(g/l)
Abs
(nm)
0
0
0,01
0,436
0,02
0,887
0,03
1,301
0,04
1,746
43
A Tabela 13 apresenta os valores obtidos para a construção da curva padrão
que foi feita com TPF em metanol e as respectivas diluições.
Curva Padrão da Atividade Desidrogenásica
0,045
0,04
y = 0,0229x - 6E-05
2
R = 0,9999
0,035
TPF (g/L)
0,03
0,025
0,02
0,015
0,01
0,005
0
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
1,6
1,8
2
Abs (nm)
Figura 20: Gráfico da curva padrão da atividade desidrogenásica
A Figura 20 apresenta a curva padrão e a sua equação da reta
correspondente.
A Tabela 14 demonstra a evolução dos resultados com a variação da
concentração de diesel nas amostras e seus respectivos erros.
Tabela 14: Média dos dados obtidos na atividade desidrogenásica
% diesel
Abs (nm)
TPF (g/l)
0,00
0,05
0,10
0,60
6,00
9,00
12,00
15,00
1,999
1,924
1,900
1,835
1,719
1,531
1,504
1,017
0,046 ± 0,005
0,044 ± 0,002
0,044 ± 0,002
0,042 ± 0,006
0,039 ± 0,000
0,035 ± 0,002
0,034 ± 0,003
0,023 ± 0,001
44
A Figura 21 mostra respectivamente da direita para esquerda os resultados
em duplicata dos ensaios de atividade desidrogenásica com as concentrações de
0 %, 0,05 % , 0,1 % de diesel. Pode-se observar a intensa coloração de todas as
amostras com as concentrações baixas de diesel.
Figura 21: Foto com alguns resultados de atividade desidrogenásica
A
Figura
22
apresenta
a
variação
da
atividade
desidrogenásica.
0,057
0,052
TPF (g/l)
0,047
0,042
0,037
0,032
0,027
0,022
0,00
0,05
0,10
0,60
6,00
9,00
12,00
15,00
% Diesel
Figura 22: Gráfico da atividade desidrogenásica com diferentes concentrações de
diesel
45
Em concentrações baixas de diesel, (0,05% mL/g - 0,60 % mL/g) ocorreu
redução de apenas 9% da atividade enzimática em relação ao solo original (Figura
21). A concentração foi então aumentada até que uma variação significativa
pudesse ser observada. A partir da concentração de 6,0% mL/g, observou-se uma
queda de 16% da atividade desidrogenásica. Da concentração de 6,0% mL/g até
12% mL/g de diesel, ocorreu uma redução de 26% da atividade original. Com 15%
mL/g de diesel houve redução de 50% da atividade desidrogenásica.
Os resultados obtidos reproduziram, de maneira geral, o que foi observado
em experimentos similares divulgados na literatura, indicando que os métodos
utilizados poderão ser utilizados na avaliação de solos contaminados.
Capítulo V: Conclusões & Perspectivas
Os resultados dos testes mortalidade de minhocas forneceram os valores de
concentração inicial letal (CIL) para o diesel igual a 0,06% mL/g e a concentração
letal para 50% da população (CL50) foi igual a 0,1% mL/g para o solo argiloso. Em
relação à contaminação com gasolina, no mesmo solo, o valor da CIL encontra-se
na faixa de 0,3% mL/g. Os resultados mostraram que a gasolina atuou de maneira
mais severa na mortalidade das minhocas do que o diesel, quando há o aumento da
concentração do contaminante de 0,3 % mL/g para 0,4% mL/g.
Ficou caracterizado que a contaminação de 10% mL/g de diesel no solo
argiloso não foi suficiente para afetar a germinação das sementes, nem o
crescimento das radículas de alface Lactuca sativa. A concentração de 20% mL/g
de diesel no solo argiloso, também não influenciou o número de sementes
germinadas. Porém, verificou-se que há uma redução de aproximadamente 10%
quanto ao crescimento das radículas. A partir da concentração de 30% mL/g, o
diesel reduziu em 20% o número de sementes germinadas e em aproximadamente
25% o crescimento das radículas. A partir da concentração 50% mL/g de diesel
houve 98% de inibição da germinação de sementes de alface. Nesta concentração,
dentre as radículas que germinaram, ocorreu uma redução do crescimento de
aproximadamente 90 %.
46
Nos testes de atividade desidrogenásica, com o inóculo aeróbio, em
concentrações de diesel de 0,05% mL/g até 0,60 % mL/g ocorreu redução de 9% da
atividade enzimática do solo original. A partir da concentração de 6,0 % mL/g
observou-se uma queda de 16% da atividade desidrogenásica. Da concentração de
6,0% mL/g até 12% mL/g de diesel, ocorreu uma redução de 26% da atividade
original e com 15% mL/g de diesel houve redução de 50% da atividade
desidrogenásica.
O presente trabalho confirmou o fato já bem documentado de que as
conseqüências da contaminação de solos por produtos químicos são diretamente
correlacionadas com a toxidez, a concentração e potencial de volatilização do
contaminante. No caso de contaminação com petróleo e seus derivados há um
grande número de substâncias com potencial tóxico para o ambiente e que
apresentam uma ampla faixa de volatilidade. Os bioensaios empregados neste
trabalho estão relacionados entre os mais indicados na detecção e monitoramento
de contaminação por hidrocarbonetos derivados de petróleo, assim como podem ser
empregados em processos onde a biorremediação encontra viabilidade técnicoeconômica.
Este trabalho abordou três testes de ecotoxicidade para avaliar solos
contaminados com hidrocarbonetos. A partir dos resultados obtidos, pode-se
determinar qual o melhor dos três testes, poderá ser utilizado no sítio em que se
deseja avaliar o grau de contaminação. Os resultados demonstraram diferentes
capacidades de adaptação dos testes ao sítio contaminado. Em situações com baixas
concentrações de contaminação, por exemplo, o melhor teste para avaliar o grau
desta contaminação é o teste de mortalidade de minhocas da espécie Eisenia
foetida, devido à sensibilidade a contaminação demonstrada nos ensaios realizados.
Deste modo, o presente trabalho oferece subsídios importantes para o
melhoramento dos procedimentos experimentais utilizados. Também fica indicado
que outros métodos correlatos podem ser adicionados, de forma que possa ser
construído um sistema de avaliação de ecotoxicidade capaz de responder às
necessidades nacionais na área de monitoramento ambiental.
47
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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